JPWO2019216394A1 - ダニアレルギー治療のための核酸 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ダニアレルギー治療に有用であると期待される核酸を提供する。【解決手段】 シグナルペプチドをコードする塩基配列、LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列を順番に含む核酸であって、キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、医薬組成物の有効成分として有用であると期待される核酸であり、例えばダニアレルギー治療に有用であると期待される核酸に関する。
ダニアレルギーは、ダニ由来のアレルゲンに反応して起こるアレルギー疾患である。アレルギー疾患は、1)体内に取り込まれたアレルゲンが抗原提示細胞に貪食されてナイーブT細胞に抗原提示され、2)ナイーブT細胞がTh2細胞へと分化し、3)Th2細胞等の免疫細胞からIL−4等のサイトカインが産生され、4)IL−4によってB細胞がIgEを産生し、5)アレルゲンに結合したIgEがマスト細胞に結合することによって引き起こされる。アレルギー疾患患者においては、IFN−γ等を産生するTh1細胞が関与するTh1型免疫とIL−4等を産生するTh2細胞が関与するTh2型免疫の拮抗が、Th2型優位になり、Th2型の炎症免疫反応が起こっていることが知られている(Middleton’s Allergy Seventh edition Principles & Practice、2009)。このように、IFN−γはTh1型免疫の指標に、IL−4はTh2型免疫の指標に、使用され得る。また、マウスにおいては、IFN−γが活性化されたB細胞におけるIgG2aアイソタイプへの優先したクラススイッチを起こさせている一方で、他のすべてのアイソタイプへの応答を抑制する。すなわちIgG2aもTh1型免疫の指標に使用され得る。例えば、IL−4欠損マウスではIgG2aの産生が促進され、IFN−γ欠損マウスではIgG2a産生が抑制されることが知られている(Arthritis Res.、2002、Vol.4、p.54−58)。また、アレルゲン免疫療法の作用メカニズムに、B細胞から産生される抗体が関与しているという報告も存在する。例えば、ヒトにおいては、IgGはアレルゲンに結合するIgEに拮抗して、アレルゲン−IgE複合体形成を阻害し、マスト細胞からのヒスタミン遊離を阻害することが知られている(J Allergy Clin Immunol.、2017、Vol.140、p.1485−1498)。
現在に至るまで、ダニアレルギーに対する複数の免疫療法の開発が進められてきた(J Allergy Clin Immunol.、2013、Vol.132、p.1322−1336;WO2014/195803;Expert Rev Vaccines.、2014、Vol.13、p.1427−1438)。また、ダニアレルギーに関連するアレルゲンとして、Der p 1、Der p 2、Der p 7、Der p 23等(特許文献1、特許文献2、非特許文献1)が知られている。しかしながら、例えば、皮下免疫療法(subcutaneous immunotherapy(SCIT))及び舌下免疫療法(sublingual immunotherapy(SLIT))は、アナフィラキシーの可能性や数年に及ぶ長い治療期間等の課題を抱えている。
核酸ワクチンの技術の1つとして、リソソーム関連膜タンパク質(lysosome−associated membrane protein;LAMP)を利用した、アレルギー治療のための核酸ワクチンが研究されている。そして、LAMPファミリーのメンバーであるLAMP−1及びクリプトメリア・ジャポニカ(Cryptomeria japonica)のアレルゲンであるCry J1及び/又はCry J2を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドが構築された(特許文献3、非特許文献2)。そして、そのようなプラスミドは、アナフィラキシーの原因となる全身への遊離アレルゲン放出を起こさず、Th1型の免疫反応を誘導することが報告されている。また、LAMP−1並びにピーナッツのアレルゲンであるAra H1、Ara H2及びAra H3を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドは、マウスモデルでIgEの産生を緩和したことが報告されている(特許文献4)。ダニアレルギーの分野においては、Der p 1並びにLAMP−1の膜貫通ドメイン及びエンドソーム/リソソーム標的ドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸を含むワクチンが構築されている(特許文献5、非特許文献3)。しかしながら、複数のダニアレルゲン抗原、並びに、LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメイン及びエンドソーム/リソソーム標的ドメインを含む、ダニアレルギー治療のための核酸ワクチンは、未だ報告されていない。
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「ワクチン(Vaccine)」、(オランダ)、2006;24(29−30):5762−5771
本発明の課題は、ダニアレルギー治療に有用であると期待される核酸を提供することにある。
本発明者らは、ダニアレルギー治療のための核酸の作製において相当の創意検討を重ねた結果、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを作製し(実施例1)、該プラスミドからキメラタンパク質が発現することを確認し(実施例2)、該プラスミドを投与したマウスにおいてTh1型免疫反応が誘導されることを見出した(実施例3、実施例4)。これらの結果、ダニアレルギー治療に有用であると期待される核酸を提供し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の[1]〜[17]に関する。
[1]
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
[2]
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
[3]
シグナルペプチドがLAMPのシグナルペプチドである、[1]又は[2]に記載の核酸。
[4]
膜貫通ドメインがLAMPの膜貫通ドメインである、[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸。
[5]
シグナルペプチドが配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなり、細胞小器官内安定化ドメインが配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなり、アレルゲンドメインが、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインであり、膜貫通ドメインが配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなり、エンドソーム/リソソーム標的ドメインが配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなる、[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸。
[6]
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、
該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
[7]
a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
[8]
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
[9]
[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
[10]
[8]に記載の核酸を含む発現ベクター。
[11]
[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
[12]
[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸を生産する方法。
[13]
[10]に記載の発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[14]
ダニアレルギーの予防又は治療用医薬組成物である、[13]に記載の医薬組成物。
[15]
[10]に記載の発現ベクターの予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、ダニアレルギーを予防又は治療する方法。
[16]
ダニアレルギーの予防又は治療に使用するための、[10]に記載の発現ベクター。
[17]
ダニアレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、[10]に記載の発現ベクターの使用。
[1]
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
[2]
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
[3]
シグナルペプチドがLAMPのシグナルペプチドである、[1]又は[2]に記載の核酸。
[4]
膜貫通ドメインがLAMPの膜貫通ドメインである、[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸。
[5]
シグナルペプチドが配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなり、細胞小器官内安定化ドメインが配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなり、アレルゲンドメインが、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインであり、膜貫通ドメインが配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなり、エンドソーム/リソソーム標的ドメインが配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなる、[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸。
[6]
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、
該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
[7]
a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
[8]
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
[9]
[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
[10]
[8]に記載の核酸を含む発現ベクター。
[11]
[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
[12]
[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸を生産する方法。
[13]
[10]に記載の発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[14]
ダニアレルギーの予防又は治療用医薬組成物である、[13]に記載の医薬組成物。
[15]
[10]に記載の発現ベクターの予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、ダニアレルギーを予防又は治療する方法。
[16]
ダニアレルギーの予防又は治療に使用するための、[10]に記載の発現ベクター。
[17]
ダニアレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、[10]に記載の発現ベクターの使用。
本発明の核酸は、ダニアレルギーの予防又は治療に使用できる。
以下に、本発明について詳述する。
<本発明の核酸>
本発明の核酸には、以下の特徴を有する核酸が含まれる:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
本発明の核酸には、以下の特徴を有する核酸が含まれる:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
本発明において、核酸とは、ヌクレオチドが重合してできた任意の長さの塩基配列からなる高分子である。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び/又はそれらの類縁体を包含し得る。本発明の核酸は、例えば、DNA、RNA又はそれらの改変された核酸である。1つの実施形態において、本発明の核酸は、DNAである。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、発現ベクターに組み込まれた核酸である。また、1つの実施形態において、本発明の核酸は、プラスミドベクターに組み込まれた核酸である。
本明細書において、「キメラタンパク質」とは、遺伝子組み換え技術を用いて2個以上の遺伝子を融合させた塩基配列によりコードされるタンパク質を意味する。本発明の核酸は、シグナルペプチド、LAMPの細胞小器官内安定化ドメイン、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメイン、膜貫通ドメイン並びにLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをこの順番に含むキメラタンパク質(以下、「本発明に関するキメラタンパク質」という)をコードする塩基配列を含む。
LAMPは当業者に周知のタンパク質である(J Biol Chem.、1991、Vol.266、p.21327−21330)。本明細書においてLAMPとは、特に限定されないが、LAMP−1、LAMP−2、CD63/LAMP−3、DC−LAMP及びLIMP II、並びに、それらのホモログ、オルソログ、パラログ、変異体及び改変体を含む。本発明の1つの実施形態において、LAMPはLAMP−1である。本発明おけるLAMPの由来動物は特に限定されないが、1つの実施形態において、LAMPはヒトLAMPである。1つの実施形態において、ヒトLAMPはヒトLAMP−1である。ヒトLAMP−1のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号2のアミノ酸番号1から380に示されるアミノ酸配列のC末端に、配列番号2のアミノ酸番号1005から1040に示されるアミノ酸配列が結合したアミノ酸配列が挙げられる。
シグナルペプチドの一般的な構造は当業者に周知である(Annu Rev Biochem.、2003、Vol.72、p.395−447)。シグナルペプチドはタンパク質の輸送及び局在化を指示する機能を有する。本発明において使用されるシグナルペプチドとしては、タンパク質の輸送及び局在化を指示する機能を有する限り、任意の適切なシグナルペプチドを選択することが可能である。1つの実施形態において、本発明において使用されるシグナルペプチドはLAMPのシグナルペプチドである。1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPのシグナルペプチドは、LAMP−1のシグナルペプチドである。
1つの実施形態において、本発明において使用されるシグナルペプチドは、以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなる。
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
本明細書における「同一性」とは、EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res.、2015、Vol.43、p.W580−W584;https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたIdentityの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Gap Open Penalty = 10
Gap Extend Penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
End Gap Penalty = false
Gap Open Penalty = 10
Gap Extend Penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
End Gap Penalty = false
1つの実施形態において、本発明において使用されるシグナルペプチドは、配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなる。
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインの配列は当業者に周知である(国際公開番号2013/187906号)。LAMPの細胞小器官内安定化ドメインは、アレルゲンドメインを、タンパク質分解酵素、低pH、並びに、その他のタンパク質を不安定化させる物質及び条件から保護する機能を有する。本発明において使用されるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインとしては、アレルゲンドメインを、タンパク質分解酵素、低pH、並びに、その他のタンパク質を不安定化させる物質及び条件から保護する機能を有する限り、任意の適切なLAMPの細胞小器官内安定化ドメインを選択することが可能である。1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインは、LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメインである。
1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインは、以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなる:
(a)配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
(a)配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインは、配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなる。
本発明において使用されるアレルゲンドメインは、アレルゲンとしてDer p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含む。Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7は、ダニに観察され得るアレルゲンである(国際公開番号1988/010297号;国際公開番号2007/124524号;Clin Exp Allergy.、1995、Vol.25、p.416−422)。本発明において使用されるDer p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7は、抗原性を有する限り、それらの変異体であってもよい。任意のタンパク質が抗原性を有することは、例えば動物に投与することでそのタンパク質に対する抗体産生やT細胞応答が惹起されることを観察することで確認することができる(Bioanalysis.、2012、Vol.4、p.397−406)。1つの実施形態において、本発明において使用されるDer p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7は、シグナルペプチドが欠失している。
1つの実施形態において、Der p 1は、以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなる:
(a)配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
(a)配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
1つの実施形態において、Der p 1は、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなる。
1つの実施形態において、Der p 2は、以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなる:
(a)配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
(a)配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
1つの実施形態において、Der p 2は、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなる。
1つの実施形態において、Der p 23は、以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなる:
(a)配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
(a)配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
1つの実施形態において、Der p 23は、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなる。
1つの実施形態において、Der p 7は、以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなる:
(a)配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
(a)配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
1つの実施形態において、Der p 7は、配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなる。
1つの実施形態において、本発明において使用されるアレルゲンドメインは、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を任意の順番で含む。また、1つの実施形態において、本発明において使用されるアレルゲンドメインは、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7をこの順番で含む。
1つの実施形態において、本発明において使用されるアレルゲンドメインは、配列番号2のアミノ酸番号383から1002までのアミノ酸配列からなる。
膜貫通ドメインの一般的な構造は当業者に周知である(Annu Rev Biochem.、2007、Vol.76、p.125−140)。膜貫通ドメインはタンパク質を生体膜に係留する機能を有する。本発明において使用される膜貫通ドメインとしては、タンパク質を生体膜に係留する機能を有する限り、任意の適切な膜貫通ドメインを選択することが可能である。1つの実施形態において、本発明において使用される膜貫通ドメインはLAMPの膜貫通ドメインである。1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPの膜貫通ドメインは、LAMP−1の膜貫通ドメインである。
1つの実施形態において、本発明において使用される膜貫通ドメインは、以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなる:
(a)配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列において1〜2個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
(a)配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列において1〜2個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列。
1つの実施形態において、本発明において使用される膜貫通ドメインは、配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる。
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインの構造は当業者に周知である(国際公開番号1994/017192号)。LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインは、タンパク質をリソソームに輸送する機能を有する。本発明において使用されるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインとしては、タンパク質をリソソームに輸送する機能を有する限り、任意の適切なLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインを選択することが可能である。1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインは、LAMP−1のエンドソーム/リソソーム標的ドメインである。
1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインは、配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列、又は、配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列において1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。
1つの実施形態において、本発明において使用されるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインは、配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなる。
本発明に関するキメラタンパク質において、シグナルペプチド、LAMPの細胞小器官内安定化ドメイン、アレルゲンドメインに含まれる各アレルゲン、膜貫通ドメイン及びLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインは、直接つながっていてもよく、又は、リンカーペプチドを介して間接的につながっていてもよい。使用されるリンカーペプチドは、当業者に適宜に選択され得る。1つの実施形態において、当該リンカーペプチドは10個以下のアミノ酸からなる。1つの実施形態において、LAMPの細胞小器官内安定化ドメインとアレルゲンドメインの間、各アレルゲンの間、及び、アレルゲンドメインと膜貫通ドメインの間に使用されるリンカーペプチドは、LeuGlu、GlyGlyGlyGly、及び、GluPheThrからなる群から選ばれるリンカーペプチドである。1つの実施形態において、膜貫通ドメインとLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインの間に使用されるリンカーペプチドは、配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるリンカーペプチドである。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMPのシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMPの膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMPのシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMPの膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMP−1のシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMP−1の膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMP−1のエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMP−1のシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMP−1の膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMP−1のエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMPのシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMPの膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMPのシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMPの膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMP−1のシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMP−1の膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMP−1のエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
LAMP−1のシグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
LAMP−1の膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMP−1のエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
本発明の核酸は、本発明に関するキメラタンパク質をコードし、該核酸がヒト又は動物に投与された場合に、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する限り、特に限定されない。ある核酸がヒト又は動物に投与された場合に、該核酸が上記アレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有するか否かは、例えば実施例3及び/又は実施例4に記載の方法で確認することができる。また、本発明の核酸は、該核酸がヒト又は動物に投与された場合に、Th1細胞優位の免疫反応を誘導する作用を有する核酸であってもよい。ある核酸がヒト又は動物に投与された場合に、該核酸がTh1細胞優位の免疫反応を誘導する作用を有するか否かは、例えば実施例4に記載の方法で確認することができる。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が、90%、92%、94%、96%、98%又は99%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が、90%、92%、94%、96%、98%又は99%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質、又は、配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸。
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質、又は、配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、
該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、
該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、
該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7に対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、
該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7に対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7に対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7に対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である:
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
1つの実施形態において、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番号1に示される塩基配列である。
本発明の核酸は、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明の核酸は、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開番号90/07861号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
本発明の核酸は、一度合成された後には、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に複製され得る。例えば、本発明の核酸は、後述の<本発明の核酸を生産する方法及び該方法により生産できる核酸>に記載の方法で、複製することが可能である。
<本発明の発現ベクター>
本発明の発現ベクターには、本発明の核酸を含む発現ベクターが含まれる。
本発明の発現ベクターには、本発明の核酸を含む発現ベクターが含まれる。
本発明の核酸からキメラタンパク質を発現させるために用いる発現ベクターとしては、動物細胞中で本発明の核酸からキメラタンパク質を発現できるものである限り、特に制限されるものではない。1つの実施形態において、本発明の核酸からキメラタンパク質を発現させるために用いる発現ベクターは、ヒト体内においてキメラタンパク質を発現させるために用いることのできる発現ベクターである。本発明に用いる発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス)等が挙げられる。1つの実施形態において、本発明に用いる発現ベクターは、プラスミドベクターである。本明細書において、「プラスミド」とは、プラスミドベクターを意味する。
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明の核酸からキメラタンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、CMV(cytomegalovirus)、RSV(respiratory syncytial virus)、SV40(simian virus 40)等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、EF(elongation factor)1αプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。1つの実施形態において、本発明の発現ベクターに含まれるプロモーターは、CMVプロモーターである。本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、エンハンサー配列、非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位等を含んでいてもよい。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、以下の核酸を含む発現ベクターである:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、以下の核酸を含む発現ベクターである:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、以下の核酸を含む発現ベクターである:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、以下の核酸を含む発現ベクターである:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1029から1036までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む発現ベクターである。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、配列番号1に示される塩基配列を含む核酸を含む発現ベクターである。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、配列番号3に示される塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターである。
<本発明の宿主細胞>
本発明の宿主細胞には、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞が含まれる。1つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。1つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、プラスミドベクターである本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
本発明の宿主細胞には、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞が含まれる。1つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。1つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、プラスミドベクターである本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
本発明の核酸で形質転換される宿主細胞としては、特に限定されないが、核酸の複製に使用し得る細胞である限り、当該分野で公知の細胞を選択することができる。
核酸の複製に使用し得る宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞等種々の細胞(例えば、動物細胞(例えば、CHOK1SV細胞等)、昆虫細胞(例えば、Sf9等)、細菌(大腸菌等)、酵母(サッカロマイセス属、ピキア属等)等)が挙げられる。1つの実施形態において、大腸菌を宿主細胞として使用することができる。形質転換自体は、公知の方法で実施することができる。
<本発明の核酸を生産する方法及び該方法により生産できる核酸>
本発明の核酸を生産する方法には、本発明の核酸又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸又は発現ベクターを生産する方法が含まれる。1つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の核酸を複製する工程を含む。1つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の発現ベクターを複製する工程を含む。
本発明の核酸を生産する方法には、本発明の核酸又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸又は発現ベクターを生産する方法が含まれる。1つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の核酸を複製する工程を含む。1つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の発現ベクターを複製する工程を含む。
1つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法に使用される宿主細胞は、大腸菌である。大腸菌の培養には、適切な培地、例えば、LB培地、M9培地、Terrific Broth培地、SOB培地、SOC培地、又は、2×YT培地等を選択することができる。また、当該大腸菌の培養は、炭素(資化可能な炭素化合物であれば特に限定されず、例えば、グリセリン等のポリオール類、又は、ピルビン酸、コハク酸若しくはクエン酸等の有機酸類)、窒素(大腸菌が利用可能な窒素化合物であれば特に限定されず、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、又はアンモニア若しくはその塩)、無機物及び無機イオン(特に限定されるものではないが、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン及び亜鉛)、ビタミン源並びに消泡剤等が適正濃度に制御された環境で行うことができる。また、培養の制御には、pH、温度、攪拌、空気流、溶存酸素等のパラメータの制御が含まれる。1つの実施形態において、培養の条件は、pHが6.7から7.5、温度が20から37℃、及び、攪拌速度が200から300rpmの範囲である。
本発明の核酸を生産する方法は、回収した培養液からライセート(溶菌液)を得る工程を含んでもよい。ライセートは、例えば、回収した培養液をアルカリ溶解法又はボイリング法で処理することで得ることができる。また、ライセートを得る工程には、最終的な溶解物を滅菌ろ過する工程を含んでもよい。
本発明の核酸を生産する方法は、さらに、ライセートから核酸又は発現ベクターを精製する工程を含んでもよい。ライセートからの核酸又は発現ベクターの精製には、イオン交換クロマトグラフィー及び/又は疎水相互作用クロマトグラフィーを用いることができる。ライセートから核酸又は発現ベクターを精製する工程には、限外ろ過及び/又は透析ろ過をする工程を含んでもよい。また、精製の工程の最終処置として、滅菌ろ過をする工程を含んでもよい。
1つの実施形態において、本発明の核酸は、本発明の核酸を生産する方法により生産された核酸である。
1つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を生産する方法により生産された発現ベクターである。
<本発明の医薬組成物>
本発明の医薬組成物には、本発明の核酸、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のベクター、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
本発明の医薬組成物には、本発明の核酸、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のベクター、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸又は発現ベクター、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
本発明の核酸又は発現ベクターの投与量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型等により異なるが、例えば、0.001mg/kg〜100mg/kg程度を用いることができる。また、そのような投与量に対応する量の本発明の核酸又は発現ベクターを添加して、製剤化することができる。
本発明の医薬組成物は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7から選択されるアレルゲンに起因するアレルギーの予防又は治療剤として用いることができる。また、本発明の医薬組成物は、ダニアレルギーの予防又は治療剤として用いることができる。
本発明には、本発明の核酸を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の核酸の予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、アレルギーを予防又は治療する方法が含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療に使用するための、本発明の核酸が含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の核酸の使用が含まれる。1つの実施形態において、上記アレルギーは、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに起因するアレルギーである。また、1つの実施形態において、上記アレルギーは、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに反応する抗体を有するアレルギー患者が罹患しているアレルギーである。さらに、1つの実施形態において、上記アレルギーは、ダニアレルギーである。
1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の核酸及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の核酸及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である。
本発明には、本発明の発現ベクターを含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の発現ベクターの予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、アレルギーを予防又は治療する方法が含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療に使用するための、本発明の発現ベクターが含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の発現ベクターの使用が含まれる。1つの実施形態において、上記アレルギーは、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに起因するアレルギーである。また、1つの実施形態において、上記アレルギーは、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに反応する抗体を有するアレルギー患者が罹患しているアレルギーである。さらに、1つの実施形態において、上記アレルギーは、ダニアレルギーである。
1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の核酸を含む発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の核酸を含む発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である:
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなるLAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなるLAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である。
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
[実施例1:LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドの構築]
配列番号3に示される塩基配列からなるLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列(すなわち、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列)を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のシグナルペプチド(配列番号2の1から27までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメイン(配列番号2の28から380までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメイン(配列番号2の383から1002までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、LAMP−1の膜貫通ドメイン(配列番号2の1006から1028までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、並びに、LAMP−1のエンドソーム/リソソーム標的ドメイン(配列番号2の1037から1040までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列)を構築した。当該プラスミドは、日本国特許第5807994号の配列番号6に記載のプラスミドのEco RI−Xho Iサイトに、配列番号1の塩基番号1147から3006までの塩基配列(Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列)の5’末側にXho I認識配列、3’末側にEco RI認識配列を付加した合成DNAを挿入することで構築することができる。構築したLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドで大腸菌を形質転換し、液体培養を行った。培養液を遠心し菌体を回収し、一般的なプラスミド抽出精製法(ミニプレップ法)に準じた方法で、増幅したLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを得た。
配列番号3に示される塩基配列からなるLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列(すなわち、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列)を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のシグナルペプチド(配列番号2の1から27までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、LAMP−1の細胞小器官内安定化ドメイン(配列番号2の28から380までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメイン(配列番号2の383から1002までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、LAMP−1の膜貫通ドメイン(配列番号2の1006から1028までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列、並びに、LAMP−1のエンドソーム/リソソーム標的ドメイン(配列番号2の1037から1040までのアミノ酸配列)をコードする塩基配列)を構築した。当該プラスミドは、日本国特許第5807994号の配列番号6に記載のプラスミドのEco RI−Xho Iサイトに、配列番号1の塩基番号1147から3006までの塩基配列(Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列)の5’末側にXho I認識配列、3’末側にEco RI認識配列を付加した合成DNAを挿入することで構築することができる。構築したLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドで大腸菌を形質転換し、液体培養を行った。培養液を遠心し菌体を回収し、一般的なプラスミド抽出精製法(ミニプレップ法)に準じた方法で、増幅したLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを得た。
[実施例2:LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7キメラタンパク質の発現]
ヒト胎児腎由来293T細胞株を用いてLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7キメラタンパク質(配列番号1に示される塩基配列がコードするアミノ酸配列(すなわち配列番号2に示されるアミノ酸配列)からなるキメラタンパク質)のin vitro発現を評価した。
ヒト胎児腎由来293T細胞株を用いてLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7キメラタンパク質(配列番号1に示される塩基配列がコードするアミノ酸配列(すなわち配列番号2に示されるアミノ酸配列)からなるキメラタンパク質)のin vitro発現を評価した。
(1)細胞培養及びプラスミド導入
ヒト胎児腎由来293T細胞(Thermo Fisher Scientific社 Cat.HCL4517)を、10%ウシ胎児血清(Hyclone社、Cat.SH30070.03)及び100倍希釈のペニシリン−ストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific社、Cat.15070063)を含むD−MEM培地(Sigma−Aldrich社、Cat.D5796)にて、3×105細胞/ウェルになるように6ウェルプレート(IWAKI社、Cat.3810−006)に播種した。播種した細胞を37℃、5%CO2存在下で一晩培養後、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド:Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific社 Cat.11668027)=2.5(μg):10(μL)の混合液を添加した。さらに37℃、5%CO2存在下で一晩培養後、培地を除去しPBSで一回洗浄の後、ウェスタンブロッティングを行った。
ヒト胎児腎由来293T細胞(Thermo Fisher Scientific社 Cat.HCL4517)を、10%ウシ胎児血清(Hyclone社、Cat.SH30070.03)及び100倍希釈のペニシリン−ストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific社、Cat.15070063)を含むD−MEM培地(Sigma−Aldrich社、Cat.D5796)にて、3×105細胞/ウェルになるように6ウェルプレート(IWAKI社、Cat.3810−006)に播種した。播種した細胞を37℃、5%CO2存在下で一晩培養後、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド:Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific社 Cat.11668027)=2.5(μg):10(μL)の混合液を添加した。さらに37℃、5%CO2存在下で一晩培養後、培地を除去しPBSで一回洗浄の後、ウェスタンブロッティングを行った。
(2)ウェスタンブロッティング
前処理:細胞をプロテアーゼインヒビター(Sigma−Aldrich社 Cat.1873580)を含むRIPAバッファー(Pierce社 Cat.89900)にて溶解し、20000×g、5分間の遠心後の上清のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度が200μg/mLになるようにプロテアーゼインヒビターを含むPBSで希釈した細胞溶解液5μLに、100mM DTTを含むLDSサンプルバッファー(Thermo Fisher Scientific社 Cat.NP0007)5μLを添加し、70℃で10分間加熱処理した。
SDS−PAGE:NuPAGE(登録商標) MOPS SDS Runningバッファー(Thermo Fisher Scientific社、Cat.NP0001)及びNuPAGE(登録商標) 4−12% Bis−Tris Gel(Thermo Fisher Scientific社、Cat.NP0323)を用いて、前述の前処理を施した細胞溶解液を該Gelにアプライし、200Vの定電圧で電気泳動を行った。
ブロッティング:SDS−PAGE後のGelにPVDFメンブレン(Thermo Fisher Scientific社 Cat.LC2005)を接触させ、20%メタノール含有NuPAGE(登録商標) Transferバッファー(Thermo Fisher Scientific社、Cat.NP0006)を満たしたXCell II Blot Module(Thermo Fisher Scientific社、Cat.EI9051)中にて、180mAで90分間通電し、ブロッティングを行った。
ブロッキング:Blocking One(ナカライテスク社、Cat.03953−95)に通電後のメンブレンを浸漬し、室温で1時間振盪した。
1次抗体:Anti−human LAMP1抗体(Sino biological社、Cat.11215−RP01)を、10%Blocking Oneを含むTBS Tween−20バッファー(Thermo Fisher Scientific社、Cat.28360)に1000倍希釈になるように加えた。このバッファーにメンブレンを浸漬し、4℃で一晩振盪した。
2次抗体:TBS Tween−20バッファーでメンブレンを洗浄した。Anti−rabbit IgG(H+L chain)pAb−HRP(MBL社、Cat.458)を、10%Blocking Oneを含むTBS Tween−20バッファーに3000倍希釈になるように加えた。このバッファーにメンブレンを浸漬し、室温で1時間振盪した。
検出:TBS Tween−20バッファーでメンブレンを洗浄した。ECL prime western blotting detection reagent(GE Healthcare社、Cat.RPN2232)にメンブレンを浸漬し、LumiVision PRO 400EX(アイシン精機株式会社)で画像を検出した。当該画像において、キメラタンパク質に該当するanti−human LAMP1抗体に反応するバンドが検出された。
前処理:細胞をプロテアーゼインヒビター(Sigma−Aldrich社 Cat.1873580)を含むRIPAバッファー(Pierce社 Cat.89900)にて溶解し、20000×g、5分間の遠心後の上清のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度が200μg/mLになるようにプロテアーゼインヒビターを含むPBSで希釈した細胞溶解液5μLに、100mM DTTを含むLDSサンプルバッファー(Thermo Fisher Scientific社 Cat.NP0007)5μLを添加し、70℃で10分間加熱処理した。
SDS−PAGE:NuPAGE(登録商標) MOPS SDS Runningバッファー(Thermo Fisher Scientific社、Cat.NP0001)及びNuPAGE(登録商標) 4−12% Bis−Tris Gel(Thermo Fisher Scientific社、Cat.NP0323)を用いて、前述の前処理を施した細胞溶解液を該Gelにアプライし、200Vの定電圧で電気泳動を行った。
ブロッティング:SDS−PAGE後のGelにPVDFメンブレン(Thermo Fisher Scientific社 Cat.LC2005)を接触させ、20%メタノール含有NuPAGE(登録商標) Transferバッファー(Thermo Fisher Scientific社、Cat.NP0006)を満たしたXCell II Blot Module(Thermo Fisher Scientific社、Cat.EI9051)中にて、180mAで90分間通電し、ブロッティングを行った。
ブロッキング:Blocking One(ナカライテスク社、Cat.03953−95)に通電後のメンブレンを浸漬し、室温で1時間振盪した。
1次抗体:Anti−human LAMP1抗体(Sino biological社、Cat.11215−RP01)を、10%Blocking Oneを含むTBS Tween−20バッファー(Thermo Fisher Scientific社、Cat.28360)に1000倍希釈になるように加えた。このバッファーにメンブレンを浸漬し、4℃で一晩振盪した。
2次抗体:TBS Tween−20バッファーでメンブレンを洗浄した。Anti−rabbit IgG(H+L chain)pAb−HRP(MBL社、Cat.458)を、10%Blocking Oneを含むTBS Tween−20バッファーに3000倍希釈になるように加えた。このバッファーにメンブレンを浸漬し、室温で1時間振盪した。
検出:TBS Tween−20バッファーでメンブレンを洗浄した。ECL prime western blotting detection reagent(GE Healthcare社、Cat.RPN2232)にメンブレンを浸漬し、LumiVision PRO 400EX(アイシン精機株式会社)で画像を検出した。当該画像において、キメラタンパク質に該当するanti−human LAMP1抗体に反応するバンドが検出された。
上記試験の結果、ヒト胎児腎由来293T細胞株にLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを導入することにより、細胞内でのLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7キメラタンパク質が発現することが確認された。
[実施例3:LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド投与によるIgG2aの産生誘導]
in vivoにおける抗体産生誘導の評価を行った。各群8例として、投与開始時7週齢のBALB/c雌性マウス(日本チャールス・リバー社)の耳に50μgのLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを含むPBS溶液25μLを1週間毎に3回、皮内投与し(0、7及び14日目)、最終投与1週間後に採血し血漿サンプルを取得した(21日目)。比較対照として、LAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:配列番号2のアミノ酸番号1から380までのアミノ酸配列(以下、実施例3及び4において、LAMP−1のN末端という)をコードする塩基配列、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23(以下、実施例3及び4において、Der p 23ドメインという)、配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7(以下、実施例3及び4において、Der p 7ドメインという)、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2(以下、実施例3及び4において、Der p 2ドメインという)及び、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1(以下、実施例3及び4において、Der p 1ドメインという)を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、配列番号2のアミノ酸番号1006から1040までのアミノ酸配列(以下、実施例3及び4において、LAMP−1のC末端という)をコードする塩基配列)、並びに、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 1ドメイン及びDer p 2ドメインを順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)とLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 23ドメイン及びDer p 7ドメインを順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)の混合物、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 1ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)、LAMP−Der p 2プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 2ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)、LAMP−Der p 7プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 7ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)、及び、LAMP−Der p 23プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 23ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)の混合物を準備した。なお、比較対象の各プラスミドは、実施例1に記載の方法と同様の方法により作製することができる。50μgの上記プラスミド及びプラスミド混合物を含むPBS溶液25μL、又は、25μLのPBSをマウスに投与した。抗体価の測定は100倍又は1000倍希釈の血漿サンプルを用いてELISA法により実施し、450nmの吸光度を測定した。ELISA測定は、テストプレートとしてF96 MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE(Nunc社、Cat.439454)を用い、一般的なELISA法に準じて行った。精製タンパク質であるDer p 1(Indoor biotechnologies社、NA−DP1−1、lot: 38052)、精製タンパク質であるDer p 2(Indoor biotechnologies社、NA−DP2−1、lot: 36118)、組換え精製タンパク質であるDer p 7(Indoor biotechnologies社、RP−DP7−1、lot: 34033)又は組換え精製タンパク質であるDer p 23(Sysmex社、UniProtKB:A0A0K2DQU8)をPBSで1μg/mLに調製し、テストプレートに50μL/ウェルで添加し4℃で一晩静置した。テストプレートを洗浄バッファー(PBS Tween−20バッファー、Thermo Fisher Scientific社、Cat.28352)を用いて3回洗浄した後に1%BSA(Sigma−Aldrich社、Cat.A8022)を含むPBSを100μL/ウェルで添加し、室温に1時間静置した。洗浄バッファーを用いて3回洗浄した後に、1%BSA含有PBSで100倍又は1000倍希釈した血漿サンプルを50μL/ウェルで添加し、室温で1時間静置した。洗浄バッファーを用いて3回洗浄した後に、1%BSAを含むPBSで50000倍希釈した二次抗体Goat anti−mouse IgG2a HRP Conjugated(Bethyl Laboratories社、Cat.A90−107P)を50μL/ウェルで添加し、テストプレートを室温で1時間静置した。洗浄バッファーを用いて3回で洗浄した後に、基質溶液であるTMB Microwell Peroxidase Substrate System(セラケア社、Cat.50−76−03)を50μL/ウェルで添加し、遮光して室温で15分間静置した。反応停止液(2N H2SO4)を50μL/ウェルで添加し、450nmの吸光度を測定した。
in vivoにおける抗体産生誘導の評価を行った。各群8例として、投与開始時7週齢のBALB/c雌性マウス(日本チャールス・リバー社)の耳に50μgのLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを含むPBS溶液25μLを1週間毎に3回、皮内投与し(0、7及び14日目)、最終投与1週間後に採血し血漿サンプルを取得した(21日目)。比較対照として、LAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:配列番号2のアミノ酸番号1から380までのアミノ酸配列(以下、実施例3及び4において、LAMP−1のN末端という)をコードする塩基配列、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23(以下、実施例3及び4において、Der p 23ドメインという)、配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7(以下、実施例3及び4において、Der p 7ドメインという)、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2(以下、実施例3及び4において、Der p 2ドメインという)及び、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1(以下、実施例3及び4において、Der p 1ドメインという)を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、配列番号2のアミノ酸番号1006から1040までのアミノ酸配列(以下、実施例3及び4において、LAMP−1のC末端という)をコードする塩基配列)、並びに、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 1ドメイン及びDer p 2ドメインを順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)とLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 23ドメイン及びDer p 7ドメインを順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)の混合物、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 1ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)、LAMP−Der p 2プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 2ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)、LAMP−Der p 7プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 7ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)、及び、LAMP−Der p 23プラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、Der p 23ドメインを含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)の混合物を準備した。なお、比較対象の各プラスミドは、実施例1に記載の方法と同様の方法により作製することができる。50μgの上記プラスミド及びプラスミド混合物を含むPBS溶液25μL、又は、25μLのPBSをマウスに投与した。抗体価の測定は100倍又は1000倍希釈の血漿サンプルを用いてELISA法により実施し、450nmの吸光度を測定した。ELISA測定は、テストプレートとしてF96 MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE(Nunc社、Cat.439454)を用い、一般的なELISA法に準じて行った。精製タンパク質であるDer p 1(Indoor biotechnologies社、NA−DP1−1、lot: 38052)、精製タンパク質であるDer p 2(Indoor biotechnologies社、NA−DP2−1、lot: 36118)、組換え精製タンパク質であるDer p 7(Indoor biotechnologies社、RP−DP7−1、lot: 34033)又は組換え精製タンパク質であるDer p 23(Sysmex社、UniProtKB:A0A0K2DQU8)をPBSで1μg/mLに調製し、テストプレートに50μL/ウェルで添加し4℃で一晩静置した。テストプレートを洗浄バッファー(PBS Tween−20バッファー、Thermo Fisher Scientific社、Cat.28352)を用いて3回洗浄した後に1%BSA(Sigma−Aldrich社、Cat.A8022)を含むPBSを100μL/ウェルで添加し、室温に1時間静置した。洗浄バッファーを用いて3回洗浄した後に、1%BSA含有PBSで100倍又は1000倍希釈した血漿サンプルを50μL/ウェルで添加し、室温で1時間静置した。洗浄バッファーを用いて3回洗浄した後に、1%BSAを含むPBSで50000倍希釈した二次抗体Goat anti−mouse IgG2a HRP Conjugated(Bethyl Laboratories社、Cat.A90−107P)を50μL/ウェルで添加し、テストプレートを室温で1時間静置した。洗浄バッファーを用いて3回で洗浄した後に、基質溶液であるTMB Microwell Peroxidase Substrate System(セラケア社、Cat.50−76−03)を50μL/ウェルで添加し、遮光して室温で15分間静置した。反応停止液(2N H2SO4)を50μL/ウェルで添加し、450nmの吸光度を測定した。
上記試験の結果、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド(Der p1−p2−p23−p7)をマウスに投与することにより、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7特異的IgG2aの産生が検出された(図1)。一方LAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド(Der p23−p7−p2−p1)、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミドとLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミドの混合物(Der p1−p2 + Der p23−p7)、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド、LAMP−Der p 2プラスミド、LAMP−Der p 7プラスミド、及び、LAMP−Der p 23プラスミドの混合物(4 plasmid mix)をマウスに投与しても、Der p 1特異的IgG2aの産生は検出されなかった。また、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミドとLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミドの混合物(Der p1−p2 + Der p23−p7)のマウスへの投与では、Der p 2特異的IgG2aも産生が検出されなかった。すなわちプラスミドにコードされた全てのアレルゲンに特異的なIgG2aの産生が検出されたのはLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドだけであった。以上の結果により、試験したプラスミドのうち、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドのみが、プラスミドにコードされた全てのアレルゲンについてTh1免疫応答を誘導し、活性化されたB細胞のIgG2aアイソタイプへのクラススイッチを起こすことが示唆された。
[実施例4:LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドによるIFN−γ及びIL−4の産生誘導]
LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを投与したマウスから採取した脾細胞を、アレルゲンで刺激した際のサイトカイン産生誘導の評価を行った。63日目に、実施例3で使用したマウス、及び、実施例3と同様のプロトコールでコントロールプラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)を投与したマウスから、一般的な方法に従い脾細胞を調製した。なお、コントロールプラスミドは、日本国特許第5807994号の配列番号6に記載のプラスミドのEco RI−Xho Iサイトを削除することで作製することができる。脾細胞を、10%ウシ胎児血清(Hyclone社、Cat.SH30070.03)及び100倍希釈のペニシリン−ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific社、Cat.15070063)を含むRPMI−1640培地(Sigma−Aldrich社、Cat.R8758)にて、8×105細胞/ウェルになるように96ウェルプレート(IWAKI社、Cat.3860−096)に播種した。Der p 1(Indoor biotechnologies社、NA−DP1−1、lot: 38052)、Der p 2(Indoor biotechnologies社、NA−DP2−1、lot: 36118)、Der p 7(Indoor biotechnologies社、RP−DP7−1、lot: 34033)及びDer p 23(Sysmex社、UniProtKB:A0A0K2DQU8)を最終濃度がそれぞれ3、3、3及び1.3μg/mLになるように添加した。37℃、5%CO2下で72時間培養を行った。培養上清中のIFN−γ及びIL−4の濃度をELISA法により測定した。IFN−γの測定には0.1% BSA及び0.05% Tween 20を含有するTBSで10倍希釈した上清サンプルを用い、IL−4の測定には上清原液サンプルを用いた。ELISA測定のテストプレートとしては、F96 MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE(Nunc社、Cat.439454)を用いた。マウスIFN−γ DuoSet ELISA(R&Dシステムズ社、Cat.DY485)及びマウスIL−4 DuoSet ELISA(R&Dシステムズ社、Cat.DY404)を用いて添付プロトコールに準拠して行った。上記試験の結果、50μgのLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド(Der p1−p2−p23−p7)をマウスに3回投与することで、ダニ由来アレルゲン特異的なIFN−γ産生が誘導された(図2)。またLAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド(Der p23−p7−p2−p1)、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミドとLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミドの混合物(Der p1−p2 + Der p23−p7)、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド、LAMP−Der p 2プラスミド、LAMP−Der p 7プラスミド、及び、LAMP−Der p 23プラスミドの混合物(4 plasmid mix)をマウスに3回投与した場合でも、同等のダニ由来アレルゲン特異的なIFN−γ産生が誘導された。一方、50μgのLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド(Der p1−p2−p23−p7)を3回投与したマウスでは、ダニ由来アレルゲン特異的なIL−4産生は定量下限値であった(図3)。LAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド(Der p23−p7−p2−p1)、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミドとLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミド(Der p1−p2 + Der p23−p7)の混合物、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド、LAMP−Der p 2プラスミド、LAMP−Der p 7プラスミド、及び、LAMP−Der p 23プラスミドの混合物(4 plasmid mix)をマウスに3回投与した場合でもダニ由来アレルゲン特異的なIL−4産生は定量下限値以下であった。
LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドを投与したマウスから採取した脾細胞を、アレルゲンで刺激した際のサイトカイン産生誘導の評価を行った。63日目に、実施例3で使用したマウス、及び、実施例3と同様のプロトコールでコントロールプラスミド(以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター:LAMP−1のN末端をコードする塩基配列、及び、LAMP−1のC末端をコードする塩基配列)を投与したマウスから、一般的な方法に従い脾細胞を調製した。なお、コントロールプラスミドは、日本国特許第5807994号の配列番号6に記載のプラスミドのEco RI−Xho Iサイトを削除することで作製することができる。脾細胞を、10%ウシ胎児血清(Hyclone社、Cat.SH30070.03)及び100倍希釈のペニシリン−ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific社、Cat.15070063)を含むRPMI−1640培地(Sigma−Aldrich社、Cat.R8758)にて、8×105細胞/ウェルになるように96ウェルプレート(IWAKI社、Cat.3860−096)に播種した。Der p 1(Indoor biotechnologies社、NA−DP1−1、lot: 38052)、Der p 2(Indoor biotechnologies社、NA−DP2−1、lot: 36118)、Der p 7(Indoor biotechnologies社、RP−DP7−1、lot: 34033)及びDer p 23(Sysmex社、UniProtKB:A0A0K2DQU8)を最終濃度がそれぞれ3、3、3及び1.3μg/mLになるように添加した。37℃、5%CO2下で72時間培養を行った。培養上清中のIFN−γ及びIL−4の濃度をELISA法により測定した。IFN−γの測定には0.1% BSA及び0.05% Tween 20を含有するTBSで10倍希釈した上清サンプルを用い、IL−4の測定には上清原液サンプルを用いた。ELISA測定のテストプレートとしては、F96 MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE(Nunc社、Cat.439454)を用いた。マウスIFN−γ DuoSet ELISA(R&Dシステムズ社、Cat.DY485)及びマウスIL−4 DuoSet ELISA(R&Dシステムズ社、Cat.DY404)を用いて添付プロトコールに準拠して行った。上記試験の結果、50μgのLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド(Der p1−p2−p23−p7)をマウスに3回投与することで、ダニ由来アレルゲン特異的なIFN−γ産生が誘導された(図2)。またLAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド(Der p23−p7−p2−p1)、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミドとLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミドの混合物(Der p1−p2 + Der p23−p7)、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド、LAMP−Der p 2プラスミド、LAMP−Der p 7プラスミド、及び、LAMP−Der p 23プラスミドの混合物(4 plasmid mix)をマウスに3回投与した場合でも、同等のダニ由来アレルゲン特異的なIFN−γ産生が誘導された。一方、50μgのLAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド(Der p1−p2−p23−p7)を3回投与したマウスでは、ダニ由来アレルゲン特異的なIL−4産生は定量下限値であった(図3)。LAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド(Der p23−p7−p2−p1)、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミドとLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミド(Der p1−p2 + Der p23−p7)の混合物、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド、LAMP−Der p 2プラスミド、LAMP−Der p 7プラスミド、及び、LAMP−Der p 23プラスミドの混合物(4 plasmid mix)をマウスに3回投与した場合でもダニ由来アレルゲン特異的なIL−4産生は定量下限値以下であった。
上記試験の結果、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミド、LAMP−Der p 23−Der p 7−Der p 2−Der p 1プラスミド、LAMP−Der p 1−Der p 2プラスミドとLAMP−Der p 23−Der p 7プラスミドの混合物、並びに、LAMP−Der p 1プラスミド、LAMP−Der p 2プラスミド、LAMP−Der p 7プラスミド、及び、LAMP−Der p 23プラスミドの混合物は、Th1細胞優位の免疫応答を誘導することが示された。
本発明の核酸は、ダニアレルギーの予防又は治療に有用であることが期待される。また、本発明の核酸を生産する方法は、前記核酸を生産するのに有用である。
以下の配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号1で示される塩基配列は、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7キメラタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列は、配列番号1によりコードされるアミノ酸配列である。また、配列番号3で示される塩基配列は、LAMP−Der p 1−Der p 2−Der p 23−Der p 7プラスミドの塩基配列である。
Claims (17)
- キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。 - キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸:
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
LAMPの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
LAMPのエンドソーム/リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。 - シグナルペプチドがLAMPのシグナルペプチドである、請求項1又は2に記載の核酸。
- 膜貫通ドメインがLAMPの膜貫通ドメインである、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸。
- シグナルペプチドが配列番号2のアミノ酸番号1から27までのアミノ酸配列からなり、細胞小器官内安定化ドメインが配列番号2のアミノ酸番号28から380までのアミノ酸配列からなり、アレルゲンドメインが、配列番号2のアミノ酸番号383から594までのアミノ酸配列からなるDer p 1、配列番号2のアミノ酸番号599から727までのアミノ酸配列からなるDer p 2、配列番号2のアミノ酸番号732から800までのアミノ酸配列からなるDer p 23及び配列番号2のアミノ酸番号805から1002までのアミノ酸配列からなるDer p 7を含むアレルゲンドメインであり、膜貫通ドメインが配列番号2のアミノ酸番号1006から1028までのアミノ酸配列からなり、エンドソーム/リソソーム標的ドメインが配列番号2のアミノ酸番号1037から1040までのアミノ酸配列からなる、請求項1〜4のいずれかに記載の核酸。
- 配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、
該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。 - a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Der p 1、Der p 2、Der p 23及びDer p 7からなる群から選ばれるアレルゲンに対するTh1型免疫を誘導する作用を有する、核酸。 - 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項8に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸を生産する方法。
- 請求項10に記載の発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- ダニアレルギーの予防又は治療用医薬組成物である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項10に記載の発現ベクターの予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、ダニアレルギーを予防又は治療する方法。
- ダニアレルギーの予防又は治療に使用するための、請求項10に記載の発現ベクター。
- ダニアレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、請求項10に記載の発現ベクターの使用。
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