KR20210007977A - 진드기 알레르기 치료를 위한 핵산 - Google Patents

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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

[과제] 진드기 알레르기 치료에 유용하다고 기대되는 핵산을 제공한다. [해결수단] 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열, LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열, Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열을 순번대로 포함하는 핵산으로서, 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

Description

진드기 알레르기 치료를 위한 핵산
본 발명은 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다고 기대되는 핵산이며, 예를 들어 진드기 알레르기 치료에 유용하다고 기대되는 핵산에 관한 것이다.
진드기 알레르기는 진드기 유래의 알레르겐에 반응하여 일어나는 알레르기 질환이다. 알레르기 질환은, 1) 체내에 도입된 알레르겐이 항원 제시 세포에 탐식되어 나이브 T 세포로 항원 제시되고, 2) 나이브 T 세포가 Th2 세포로 분화되고, 3) Th2 세포 등의 면역 세포로부터 IL-4 등의 사이토카인이 산생되고, 4) IL-4에 의해 B 세포가 IgE를 산생하고, 5) 알레르겐에 결합한 IgE가 마스트 세포에 결합함으로써 야기된다. 알레르기 질환 환자에 있어서는, IFN-γ 등을 산생하는 Th1 세포가 관여하는 Th1형 면역과 IL-4 등을 산생하는 Th2 세포가 관여하는 Th2형 면역의 길항이 Th2형 우위로 되어, Th2형의 염증 면역 반응이 일어나고 있는 것이 알려져 있다(Middleton's Allergy Seventh edition Principles & Practice, 2009). 이와 같이 IFN-γ는 Th1형 면역의 지표로, IL-4는 Th2형 면역의 지표로 사용될 수 있다. 또한, 마우스에 있어서는, IFN-γ가 활성화된 B 세포에 있어서의 IgG2a 아이소타입에 대한 우선된 클래스 스위치를 일으키게 하는 한편, 다른 모든 아이소타입에 대한 응답을 억제한다. 즉 IgG2a도 Th1형 면역의 지표로 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-4 결손 마우스에서는 IgG2a의 산생이 촉진되고, IFN-γ 결손 마우스에서는 IgG2a 산생이 억제되는 것이 알려져 있다(Arthritis Res., 2002, Vol.4, p.54-58). 또한, 알레르겐 면역 요법의 작용 메커니즘에, B 세포로부터 산생되는 항체가 관여하고 있다는 보고도 존재한다. 예를 들어, 인간에 있어서는, IgG는 알레르겐에 결합하는 IgE에 길항하여, 알레르겐-IgE 복합체 형성을 저해하고, 마스트 세포로부터의 히스타민 유리를 저해하는 것이 알려져 있다(J Allergy Clin Immunol., 2017, Vol.140, p.1485-1498).
현재에 이르기까지 진드기 알레르기에 대한 복수의 면역 요법의 개발이 진행되어 왔다(J Allergy Clin Immunol., 2013, Vol.132, p.1322-1336; WO2014/195803; Expert Rev Vaccines., 2014, Vol.13, p.1427-1438). 또한, 진드기 알레르기에 관련된 알레르겐으로서, Der p 1, Der p 2, Der p 7, Der p 23 등(특허문헌 1, 특허문헌 2, 비특허문헌 1)이 알려져 있다. 그러나, 예를 들어 피하 면역 요법(subcutaneous immunotherapy(SCIT)) 및 설하 면역 요법(sublingual immunotherapy(SLIT))은 아나필락시스의 가능성이나 수년에 미치는 긴 치료 기간 등의 과제를 안고 있다.
핵산 백신의 기술의 하나로서, 리소좀 관련 막 단백질(lysosome-associated membrane protein; LAMP)을 이용한, 알레르기 치료를 위한 핵산 백신이 연구되고 있다. 그리고, LAMP 패밀리의 멤버인 LAMP-1 및 크립토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica)의 알레르겐인 Cry J1 및/또는 Cry J2를 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 플라스미드가 구축되었다(특허문헌 3, 비특허문헌 2). 그리고, 그러한 플라스미드는 아나필락시스의 원인이 되는 전신에 대한 유리 알레르겐 방출을 일으키지 않고, Th1형의 면역 반응을 유도하는 것이 보고되어 있다. 또한, LAMP-1 및 피너츠의 알레르겐인 Ara H1, Ara H2 및 Ara H3을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 플라스미드는, 마우스 모델에서 IgE의 산생을 완화하였음이 보고되어 있다(특허문헌 4). 진드기 알레르기의 분야에 있어서는, Der p 1 및 LAMP-1의 막 관통 도메인 및 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 백신이 구축되어 있다(특허문헌 5, 비특허문헌 3). 그러나, 복수의 진드기 알레르겐 항원, 그리고 LAMP-1의 세포 소기관 내 안정화 도메인 및 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 포함하는, 진드기 알레르기 치료를 위한 핵산 백신은 아직 보고되어 있지 않다.
국제 공개 번호 1988/010297호 국제 공개 번호 2007/124524호 국제 공개 번호 2013/187906호 국제 공개 번호 2015/200357호 국제 공개 번호 2004/019978호
「클리니컬 앤드 익스페리멘틀 알레르기(Clinical & Experimental Allergy)」, (영국), 1995; 25: 416-422 「저널 오브 이뮤놀로지 리서치(Journal of Immunology Research)」, (이집트), 2016; Article ID 4857869 「백신(Vaccine)」, (네덜란드), 2006; 24(29-30): 5762-5771
본 발명의 과제는 진드기 알레르기 치료에 유용하다고 기대되는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 진드기 알레르기 치료를 위한 핵산의 제작에 있어서 상당한 창의 검토를 거듭한 결과, LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드를 제작하고(실시예 1), 해당 플라스미드로부터 키메라 단백질이 발현되는 것을 확인하고(실시예 2), 해당 플라스미드를 투여한 마우스에 있어서 Th1형 면역 반응이 유도되는 것을 발견하였다(실시예 3, 실시예 4). 이들의 결과, 진드기 알레르기 치료에 유용하다고 기대되는 핵산을 제공하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 [1] 내지 [17]에 관한 것이다.
[1]
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
[2]
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
[3]
시그널 펩티드가 LAMP의 시그널 펩티드인, [1] 또는 [2]에 기재된 핵산.
[4]
막 관통 도메인이 LAMP의 막 관통 도메인인, [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 핵산.
[5]
시그널 펩티드가 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하고, 세포 소기관 내 안정화 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하고, 알레르겐 도메인이, 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인이고, 막 관통 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하고, 엔도솜/리소좀 표적 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는, [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 핵산.
[6]
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서,
해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
[7]
a) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는
b) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
[8]
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
[9]
[1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
[10]
[8]에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
[11]
[1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 핵산으로 형질 전환된 숙주 세포.
[12]
[1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 핵산으로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 핵산을 생산하는 방법.
[13]
[10]에 기재된 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물.
[14]
진드기 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, [13]에 기재된 의약 조성물.
[15]
[10]에 기재된 발현 벡터의 예방 유효량 또는 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 진드기 알레르기를 예방 또는 치료하는 방법.
[16]
진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, [10]에 기재된 발현 벡터.
[17]
진드기 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, [10]에 기재된 발현 벡터의 사용.
본 발명의 핵산은 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 핵산을 마우스에 투여하였을 때 유도되는 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7 특이적 IgG2a 산생을 도시한 도면이다. 종축은 450nm의 흡광도, 횡축은 각 투여군을 나타낸다. 수평선은 산술 평균값을 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 핵산을 투여한 마우스의 비세포를 Der p 1 단백질, Der p 2 단백질, Der p 7 단백질 또는 Der p 23 단백질로 자극하였을 때의 IFN-γ 산생을 도시한 도면이다. 종축은 배양 상청 중 IFN-γ 농도(pg/mL), 횡축은 각 투여군을 나타낸다. 수평선은 산술 평균값을 나타낸다. 점선은 정량 하한값(LLOD)을 나타낸다.
도 3은, 본 발명의 핵산을 투여한 마우스의 비세포를 Der p 1 단백질, Der p 2 단백질, Der p 7 단백질 또는 Der p 23 단백질로 자극하였을 때의 IL-4 산생을 도시한 도면이다. 종축은 배양 상청 중 IL-4 농도(pg/mL), 횡축은 각 투여군을 나타낸다. 수평선은 산술 평균값을 나타낸다. 점선은 정량 하한값(LLOD)을 나타낸다.
이하에, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
<본 발명의 핵산>
본 발명의 핵산에는, 이하의 특징을 갖는 핵산이 포함된다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
본 발명에 있어서, 핵산이란, 뉴클레오티드가 중합하여 생긴 임의의 길이의 염기 서열을 포함하는 고분자이다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA, RNA 또는 그들의 개변된 핵산이다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 DNA이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 발현 벡터에 내장된 핵산이다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 플라스미드 벡터에 내장된 핵산이다.
본 명세서에 있어서, 「키메라 단백질」이란, 유전자 재조합 기술을 이용하여 2개 이상의 유전자를 융합시킨 염기 서열에 의해 코드되는 단백질을 의미한다. 본 발명의 핵산은 시그널 펩티드, LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인, Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인, 막 관통 도메인 그리고 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 이 순번대로 포함하는 키메라 단백질(이하, 「본 발명에 관한 키메라 단백질」이라고 함)을 코드하는 염기 서열을 포함한다.
LAMP는 당업자에게 주지된 단백질이다(J Biol Chem., 1991, Vol.266, p.21327-21330). 본 명세서에 있어서 LAMP란 특별히 한정되지 않지만, LAMP-1, LAMP-2, CD63/LAMP-3, DC-LAMP 및 LIMP II, 그리고 그들의 호몰로그, 오르토로그, 파라로그, 변이체 및 개변체를 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, LAMP는 LAMP-1이다. 본 발명 있어서의 LAMP의 유래 동물은 특별히 한정되지 않지만, 일 실시 형태에 있어서 LAMP는 인간 LAMP이다. 일 실시 형태에 있어서, 인간 LAMP는 인간 LAMP-1이다. 인간 LAMP-1의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 380으로 나타나는 아미노산 서열의 C 말단에, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1005부터 1040으로 나타나는 아미노산 서열이 결합된 아미노산 서열을 들 수 있다.
시그널 펩티드의 일반적인 구조는 당업자에게 주지이다(Annu Rev Biochem., 2003, Vol.72, p.395-447). 시그널 펩티드는 단백질의 수송 및 국재화를 지시하는 기능을 갖는다. 본 발명에 있어서 사용되는 시그널 펩티드로서는, 단백질의 수송 및 국재화를 지시하는 기능을 갖는 한, 임의의 적절한 시그널 펩티드를 선택하는 것이 가능하다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 시그널 펩티드는 LAMP의 시그널 펩티드이다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 시그널 펩티드는, LAMP-1의 시그널 펩티드이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 시그널 펩티드는, 이하의 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함한다.
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열.
본 명세서에 있어서의 「동일성」이란, EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res., 2015, Vol.43, p.W580-W584; https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)을 사용하여, 디폴트로 준비되어 있는 파라미터에 의해 얻어진 Identity의 값을 의미한다. 상기 파라미터는 이하와 같다.
Gap Open Penalty=10
Gap Extend Penalty=0.5
Matrix=EBLOSUM62
End Gap Penalty=false
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 시그널 펩티드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함한다.
LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인의 서열은 당업자에게 주지이다(국제 공개 번호 2013/187906호). LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인은, 알레르겐 도메인을 단백질 분해 효소, 저pH, 그리고 그 밖의 단백질을 불안정화시키는 물질 및 조건으로부터 보호하는 기능을 갖는다. 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인으로서는, 알레르겐 도메인을 단백질 분해 효소, 저pH, 그리고 그 밖의 단백질을 불안정화시키는 물질 및 조건으로부터 보호하는 기능을 갖는 한, 임의의 적절한 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 선택하는 것이 가능하다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인은, LAMP-1의 세포 소기관 내 안정화 도메인이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인은, 이하의 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서 사용되는 알레르겐 도메인은, 알레르겐으로서 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 포함한다. Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7은 진드기에 관찰될 수 있는 알레르겐이다(국제 공개 번호 1988/010297호; 국제 공개 번호 2007/124524호; Clin Exp Allergy., 1995, Vol.25, p.416-422). 본 발명에 있어서 사용되는 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7은 항원성을 갖는 한, 그들의 변이체여도 된다. 임의의 단백질이 항원성을 갖는 것은, 예를 들어 동물에 투여함으로써 그 단백질에 대한 항체 산생이나 T 세포 응답이 야기되는 것을 관찰함으로써 확인할 수 있다(Bioanalysis., 2012, Vol.4, p.397-406). 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7은 시그널 펩티드가 결실되어 있다.
일 실시 형태에 있어서, Der p 1은, 이하의 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열.
일 실시 형태에 있어서, Der p 1은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, Der p 2는, 이하의 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열.
일 실시 형태에 있어서, Der p 2는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, Der p 23은, 이하의 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열.
일 실시 형태에 있어서, Der p 23은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, Der p 7은, 이하의 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열.
일 실시 형태에 있어서, Der p 7은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 알레르겐 도메인은, Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 임의의 순번으로 포함한다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 알레르겐 도메인은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 이 순번으로 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 알레르겐 도메인은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함한다.
막 관통 도메인의 일반적인 구조는 당업자에게 주지이다(Annu Rev Biochem., 2007, Vol.76, p.125-140). 막 관통 도메인은 단백질을 생체막에 계류시키는 기능을 갖는다. 본 발명에 있어서 사용되는 막 관통 도메인으로서는, 단백질을 생체막에 계류시키는 기능을 갖는 한, 임의의 적절한 막 관통 도메인을 선택하는 것이 가능하다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 막 관통 도메인은 LAMP의 막 관통 도메인이다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 막 관통 도메인은, LAMP-1의 막 관통 도메인이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 막 관통 도메인은, 이하의 (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 2개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 막 관통 도메인은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함한다.
LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인의 구조는 당업자에게 주지이다(국제 공개 번호 1994/017192호). LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인은, 단백질을 리소좀에 수송하는 기능을 갖는다. 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인으로서는, 단백질을 리소좀에 수송하는 기능을 갖는 한, 임의의 적절한 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 선택하는 것이 가능하다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인은, LAMP-1의 엔도솜/리소좀 표적 도메인이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열에 있어서 1개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 관한 키메라 단백질에 있어서, 시그널 펩티드, LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인, 알레르겐 도메인에 포함되는 각 알레르겐, 막 관통 도메인 및 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인은 직접 연결되어 있어도 되고, 또는 링커 펩티드를 통하여 간접적으로 연결되어 있어도 된다. 사용되는 링커 펩티드는, 당업자에게 적절하게 선택될 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 당해 링커 펩티드는 10개 이하의 아미노산을 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인과 알레르겐 도메인의 사이, 각 알레르겐의 사이, 및 알레르겐 도메인과 막 관통 도메인의 사이에 사용되는 링커 펩티드는, LeuGlu, GlyGlyGlyGly 및 GluPheThr로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커 펩티드이다. 일 실시 형태에 있어서, 막 관통 도메인과 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인의 사이에 사용되는 링커 펩티드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1029부터 1036까지의 아미노산 서열을 포함하는 링커 펩티드이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
LAMP의 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
LAMP의 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
LAMP-1의 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP-1의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
LAMP-1의 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP-1의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1029부터 1036까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
LAMP의 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
LAMP의 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
LAMP-1의 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
LAMP-1의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
LAMP-1의 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
LAMP-1의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1029부터 1036까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
본 발명의 핵산은, 본 발명에 관한 키메라 단백질을 코드하고, 해당 핵산이 인간 또는 동물에 투여된 경우에, Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 한, 특별히 한정되지 않는다. 어떤 핵산이 인간 또는 동물에 투여된 경우에, 해당 핵산이 상기 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는지 여부는, 예를 들어 실시예 3 및/또는 실시예 4에 기재된 방법으로 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산은, 해당 핵산이 인간 또는 동물에 투여된 경우에, Th1 세포 우위의 면역 반응을 유도하는 작용을 갖는 핵산이어도 된다. 어떤 핵산이 인간 또는 동물에 투여된 경우에, 해당 핵산이 Th1 세포 우위의 면역 반응을 유도하는 작용을 갖는지 여부는, 예를 들어 실시예 4에 기재된 방법으로 확인할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90％, 92％, 94％, 96％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질, 또는 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산이며,
해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
a) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는
b) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서,
해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
a) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는
b) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이하의 핵산이다:
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
일 실시 형태에 있어서, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열이란, 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열이다.
본 발명의 핵산은, 그의 염기 서열에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은, 당해 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성 방법으로서는, 국제 공개 번호 90/07861호에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산은, 한번 합성된 후에는, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 복제될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은, 후술하는 <본 발명의 핵산을 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산할 수 있는 핵산>에 기재된 방법으로 복제하는 것이 가능하다.
<본 발명의 발현 벡터>
본 발명의 발현 벡터에는, 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
본 발명의 핵산으로부터 키메라 단백질을 발현시키기 위해 사용하는 발현 벡터로서는, 동물 세포 중에서 본 발명의 핵산으로부터 키메라 단백질을 발현시킬 수 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산으로부터 키메라 단백질을 발현시키기 위해 사용하는 발현 벡터는, 인간 체내에 있어서 키메라 단백질을 발현시키기 위해 사용할 수 있는 발현 벡터이다. 본 발명에 사용하는 발현 벡터로서는, 예를 들어 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노 수반 바이러스) 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 사용하는 발현 벡터는 플라스미드 벡터이다. 본 명세서에 있어서, 「플라스미드」란, 플라스미드 벡터를 의미한다.
본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 핵산에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포에서 본 발명의 핵산으로부터 키메라 단백질을 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어 CMV(cytomegalovirus(시토메갈로 바이러스)), RSV(respiratory syncytial virus(호흡기 세포융합 바이러스)), SV40(simian virus(유인원 바이러스) 40) 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor(신장 인자)) 1α 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터에 포함되는 프로모터는 CMV 프로모터이다. 본 발명의 발현 벡터는 개시 코돈 및 종지 코돈을 포함할 수 있다. 이 경우, 인핸서 서열, 비번역 영역, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는 이하의 핵산을 포함하는 발현 벡터이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는 이하의 핵산을 포함하는 발현 벡터이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1029부터 1036까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는 이하의 핵산을 포함하는 발현 벡터이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는 이하의 핵산을 포함하는 발현 벡터이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1029부터 1036까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, 서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
<본 발명의 숙주 세포>
본 발명의 숙주 세포에는, 본 발명의 핵산으로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, 플라스미드 벡터인 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
본 발명의 핵산으로 형질 전환되는 숙주 세포로서는, 특별히 한정되지 않지만, 핵산의 복제에 사용할 수 있는 세포인 한, 당해 분야에서 공지된 세포를 선택할 수 있다.
핵산의 복제에 사용할 수 있는 숙주 세포로서는, 예를 들어 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들어, 동물 세포(예를 들어, CHOK1SV 세포 등), 곤충 세포(예를 들어, Sf9 등), 세균(대장균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등)를 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 대장균을 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 형질 전환 자체는, 공지된 방법으로 실시할 수 있다.
<본 발명의 핵산을 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산할 수 있는 핵산>
본 발명의 핵산을 생산하는 방법에는, 본 발명의 핵산 또는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 핵산 또는 발현 벡터를 생산하는 방법이 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산을 생산하는 방법은, 본 발명의 핵산으로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 본 발명의 핵산을 복제하는 공정을 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산을 생산하는 방법은, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 본 발명의 발현 벡터를 복제하는 공정을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산을 생산하는 방법에 사용되는 숙주 세포는 대장균이다. 대장균의 배양에는 적절한 배지, 예를 들어 LB 배지, M9 배지, Terrific Broth 배지, SOB 배지, SOC 배지, 또는 2×YT 배지 등을 선택할 수 있다. 또한, 당해 대장균의 배양은, 탄소(자화 가능한 탄소 화합물이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 글리세린 등의 폴리올류, 또는 피루브산, 숙신산 혹은 시트르산 등의 유기산류), 질소(대장균이 이용 가능한 질소 화합물이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 카제인 가수분해물, 대두박 알칼리 추출물, 또는 암모니아 혹은 그의 염), 무기물 및 무기 이온(특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 인산염, 탄산염, 황산염, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 철, 망간 및 아연), 비타민원 그리고 소포제 등이 적정 농도로 제어된 환경에서 행할 수 있다. 또한, 배양의 제어에는 pH, 온도, 교반, 공기류, 용존 산소 등의 파라미터의 제어가 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 배양의 조건은, pH가 6.7 내지 7.5, 온도가 20 내지 37℃ 및 교반 속도가 200 내지 300rpm의 범위이다.
본 발명의 핵산을 생산하는 방법은, 회수한 배양액으로부터 라이세이트(용균액)를 얻는 공정을 포함해도 된다. 라이세이트는, 예를 들어 회수한 배양액을 알칼리 용해법 또는 보일링법으로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 라이세이트를 얻는 공정에는, 최종적인 용해물을 멸균 여과하는 공정을 포함해도 된다.
본 발명의 핵산을 생산하는 방법은, 추가로 라이세이트로부터 핵산 또는 발현 벡터를 정제하는 공정을 포함해도 된다. 라이세이트로부터의 핵산 또는 발현 벡터의 정제에는, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수 상호 작용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 라이세이트로부터 핵산 또는 발현 벡터를 정제하는 공정에는 한외 여과 및/또는 투석 여과를 하는 공정을 포함해도 된다. 또한, 정제 공정의 최종 처치로서, 멸균 여과를 하는 공정을 포함해도 된다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은, 본 발명의 핵산을 생산하는 방법에 의해 생산된 핵산이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 핵산을 생산하는 방법에 의해 생산된 발현 벡터이다.
<본 발명의 의약 조성물>
본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 핵산, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 본 발명의 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 사용되고 있는 부형제, 즉 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 사용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들어 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있으며, 정맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육 내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화 시에는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 핵산 또는 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다.
본 발명의 핵산 또는 발현 벡터의 투여량은, 환자의 증상 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형 등에 따라 다르지만, 예를 들어 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용할 수 있다. 또한, 그러한 투여량에 대응하는 양의 본 발명의 핵산 또는 발현 벡터를 첨가하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로부터 선택되는 알레르겐에 기인하는 알레르기의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 진드기 알레르기의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 핵산을 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 핵산의 예방 유효량 또는 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 알레르기를 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 핵산이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 본 발명의 핵산의 사용이 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 상기 알레르기는 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 기인하는 알레르기이다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 상기 알레르기는 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 반응하는 항체를 갖는 알레르기 환자가 이환되어 있는 알레르기이다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 상기 알레르기는 진드기 알레르기이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 이하의 핵산 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 이하의 핵산 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이다.
본 발명에는, 본 발명의 발현 벡터를 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 발현 벡터의 예방 유효량 또는 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 알레르기를 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 발현 벡터가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 본 발명의 발현 벡터의 사용이 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 상기 알레르기는 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 기인하는 알레르기이다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 상기 알레르기는 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 반응하는 항체를 갖는 알레르기 환자가 이환되어 있는 알레르기이다. 또한, 일 실시 형태에 있어서, 상기 알레르기는 진드기 알레르기이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 이하의 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 이하의 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이다:
키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은, 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물이다.
본 발명에 대하여 더 이해를 얻기 위해 참조하는 특정 실시예를 여기에 제공하지만, 이들은 예시 목적으로 하는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
<실시예>
[실시예 1: LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드의 구축]
서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열(즉, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열)을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 시그널 펩티드(서열 번호 2의 1부터 27까지의 아미노산 서열)를 코드하는 염기 서열, LAMP-1의 세포 소기관 내 안정화 도메인(서열 번호 2의 28부터 380까지의 아미노산 서열)을 코드하는 염기 서열, Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인(서열 번호 2의 383부터 1002까지의 아미노산 서열)을 코드하는 염기 서열, LAMP-1의 막 관통 도메인(서열 번호 2의 1006부터 1028까지의 아미노산 서열)을 코드하는 염기 서열, 그리고 LAMP-1의 엔도솜/리소좀 표적 도메인(서열 번호 2의 1037부터 1040까지의 아미노산 서열)을 코드하는 염기 서열)를 구축하였다. 당해 플라스미드는, 일본 특허 제5807994호의 서열 번호 6에 기재된 플라스미드의 Eco RI-Xho I 사이트에, 서열 번호 1의 염기 번호 1147부터 3006까지의 염기 서열(Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열)의 5' 말측에 Xho I 인식 서열, 3' 말측에 Eco RI 인식 서열을 부가한 합성 DNA를 삽입함으로써 구축할 수 있다. 구축한 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드로 대장균을 형질 전환하고, 액체 배양을 행하였다. 배양액을 원심하여 균체를 회수하고, 일반적인 플라스미드 추출 정제법(미니프렙법)에 준한 방법으로, 증폭시킨 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드를 얻었다.
[실시예 2: LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 키메라 단백질의 발현]
인간 태아 신장 유래 293T 세포주를 사용하여 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 키메라 단백질(서열 번호 1로 나타나는 염기 서열이 코드하는 아미노산 서열(즉 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열)을 포함하는 키메라 단백질)의 시험관 내 발현을 평가하였다.
(1) 세포 배양 및 플라스미드 도입
인간 태아 신장 유래 293T 세포(Thermo Fisher Scientific사 Cat. HCL4517)를, 10％ 소 태아 혈청(Hyclone사, Cat. SH30070.03) 및 100배 희석의 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 15070063)을 포함하는 D-MEM 배지(Sigma-Aldrich사, Cat. D5796)에서, 3×105 세포/웰이 되도록 6웰 플레이트(IWAKI사, Cat. 3810-006)에 파종하였다. 파종한 세포를 37℃, 5％ CO2 존재 하에서 밤새 배양 후, LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드: Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific사 Cat. 11668027)=2.5(㎍):10(μL)의 혼합액을 첨가하였다. 또한 37℃, 5％ CO2 존재 하에서 밤새 배양 후, 배지를 제거하고 PBS로 1회 세정 후, 웨스턴 블로팅을 행하였다.
(2) 웨스턴 블로팅
전처리: 세포를 프로테아제 인히비터(Sigma-Aldrich사 Cat. 1873580)를 포함하는 RIPA 버퍼(Pierce사 Cat. 89900)로 용해하고, 20000×g, 5분간의 원심 후의 상청의 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 농도가 200㎍/mL가 되도록 프로테아제 인히비터를 포함하는 PBS로 희석한 세포 용해액 5μL에, 100mM DTT를 포함하는 LDS 샘플 버퍼(Thermo Fisher Scientific사 Cat. NP0007) 5μL를 첨가하고, 70℃에서 10분간 가열 처리하였다.
SDS-PAGE: NuPAGE(등록 상표) MOPS SDS Running 버퍼(Thermo Fisher Scientific사, Cat. NP0001) 및 NuPAGE(등록 상표) 4-12％ Bis-Tris Gel(Thermo Fisher Scientific사, Cat. NP0323)을 사용하여, 전술한 전처리를 실시한 세포 용해액을 해당 Gel에 적용시켜, 200V의 정전압에서 전기 영동을 행하였다.
블로팅: SDS-PAGE 후의 Gel에 PVDF 멤브레인(Thermo Fisher Scientific사 Cat. LC2005)을 접촉시키고, 20％ 메탄올 함유 NuPAGE(등록 상표) Transfer 버퍼(Thermo Fisher Scientific사, Cat. NP0006)를 채운 XCell II Blot Module(Thermo Fisher Scientific사, Cat. EI9051) 중에서, 180mA로 90분간 통전하여 블로팅을 행하였다.
블로킹: Blocking One(나칼라이 테스크사, Cat. 03953-95)에 통전 후의 멤브레인을 침지하고, 실온에서 1시간 진탕하였다.
1차 항체: Anti-human LAMP1 항체(Sino biological사, Cat. 11215-RP01)를, 10％ Blocking One을 포함하는 TBS Tween-20 버퍼(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 28360)에 1000배 희석이 되도록 첨가하였다. 이 버퍼에 멤브레인을 침지하고, 4℃에서 밤새 진탕하였다.
2차 항체: TBS Tween-20 버퍼로 멤브레인을 세정하였다. Anti-rabbit IgG(H+L chain) pAb-HRP(MBL사, Cat. 458)를, 10％ Blocking One을 포함하는 TBS Tween-20 버퍼에 3000배 희석이 되도록 첨가하였다. 이 버퍼에 멤브레인을 침지하고, 실온에서 1시간 진탕하였다.
검출: TBS Tween-20 버퍼로 멤브레인을 세정하였다. ECL prime western blotting detection reagent(GE Healthcare사, Cat. RPN2232)에 멤브레인을 침지하고, LumiVision PRO 400EX(아이싱 세키 가부시키가이샤)로 화상을 검출하였다. 당해 화상에 있어서, 키메라 단백질에 해당하는 anti-human LAMP1 항체에 반응하는 밴드가 검출되었다.
상기 시험 결과, 인간 태아 신장 유래 293T 세포주에 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에서의 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 키메라 단백질이 발현되는 것이 확인되었다.
[실시예 3: LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드 투여에 의한 IgG2a의 산생 유도]
생체 내에 있어서의 항체 산생 유도의 평가를 행하였다. 각 군 8예로서, 투여 개시 시 7주령의 BALB/c 자성 마우스(니혼 찰스 리버사)의 귀에 50㎍의 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드를 포함하는 PBS 용액 25μL를 일주일마다 3회 피내 투여하고(0, 7 및 14일째), 최종 투여 1주일 후에 채혈하여 혈장 샘플을 취득하였다(21일째). 비교 대조로서, LAMP-Der p 23-Der p 7-Der p 2-Der p 1 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 380까지의 아미노산 서열(이하, 실시예 3 및 4에 있어서, LAMP-1의 N 말단이라고 함)을 코드하는 염기 서열, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23(이하, 실시예 3 및 4에 있어서, Der p 23 도메인이라고 함), 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7(이하, 실시예 3 및 4에 있어서, Der p 7 도메인이라고 함), 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2(이하, 실시예 3 및 4에 있어서, Der p 2 도메인이라고 함), 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1(이하, 실시예 3 및 4에 있어서, Der p 1 도메인이라고 함)을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고 서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1040까지의 아미노산 서열(이하, 실시예 3 및 4에 있어서, LAMP-1의 C 말단이라고 함)을 코드하는 염기 서열), 그리고 LAMP-Der p 1-Der p 2 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 N 말단을 코드하는 염기 서열, Der p 1 도메인 및 Der p 2 도메인을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고 LAMP-1의 C 말단을 코드하는 염기 서열)와 LAMP-Der p 23-Der p 7 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 N 말단을 코드하는 염기 서열, Der p 23 도메인 및 Der p 7 도메인을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고 LAMP-1의 C 말단을 코드하는 염기 서열)의 혼합물, 그리고 LAMP-Der p 1 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 N 말단을 코드하는 염기 서열, Der p 1 도메인을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 및 LAMP-1의 C 말단을 코드하는 염기 서열), LAMP-Der p 2 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 N 말단을 코드하는 염기 서열, Der p 2 도메인을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 및 LAMP-1의 C 말단을 코드하는 염기 서열), LAMP-Der p 7 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 N 말단을 코드하는 염기 서열, Der p 7 도메인을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 및 LAMP-1의 C 말단을 코드하는 염기 서열), 및 LAMP-Der p 23 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 N 말단을 코드하는 염기 서열, Der p 23 도메인을 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열, 및 LAMP-1의 C 말단을 코드하는 염기 서열)의 혼합물을 준비하였다. 또한, 비교 대상의 각 플라스미드는, 실시예 1에 기재된 방법과 마찬가지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 50㎍의 상기 플라스미드 및 플라스미드 혼합물을 포함하는 PBS 용액 25μL, 또는 25μL의 PBS를 마우스에 투여하였다. 항체값의 측정은 100배 또는 1000배 희석의 혈장 샘플을 사용하여 ELISA법에 의해 실시하고, 450nm의 흡광도를 측정하였다. ELISA 측정은, 테스트 플레이트로서 F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE(Nunc사, Cat. 439454)를 사용하여, 일반적인 ELISA법에 준하여 행하였다. 정제 단백질인 Der p 1(Indoor biotechnologies사, NA-DP1-1, lot: 38052), 정제 단백질인 Der p 2(Indoor biotechnologies사, NA-DP2-1, lot: 36118), 재조합 정제 단백질인 Der p 7(Indoor biotechnologies사, RP-DP7-1, lot: 34033) 또는 재조합 정제 단백질인 Der p 23(Sysmex사, UniProtKB: A0A0K2DQU8)을 PBS로 1㎍/mL로 조제하고, 테스트 플레이트에 50μL/웰로 첨가하여 4℃에서 밤새 정치하였다. 테스트 플레이트를 세정 버퍼(PBS Tween-20 버퍼, Thermo Fisher Scientific사, Cat. 28352)를 사용하여 3회 세정한 후에 1％ BSA(Sigma-Aldrich사, Cat. A8022)를 포함하는 PBS를 100μL/웰로 첨가하고, 실온에 1시간 정치하였다. 세정 버퍼를 사용하여 3회 세정한 후에, 1％ BSA 함유 PBS로 100배 또는 1000배 희석한 혈장 샘플을 50μL/웰로 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 세정 버퍼를 사용하여 3회 세정한 후에, 1％ BSA를 포함하는 PBS로 50000배 희석한 2차 항체 Goat anti-mouse IgG2a HRP Conjugated(Bethyl Laboratories사, Cat. A90-107P)를 50μL/웰로 첨가하고, 테스트 플레이트를 실온에서 1시간 정치하였다. 세정 버퍼를 사용하여 3회 세정한 후에, 기질 용액인 TMB Microwell Peroxidase Substrate System(세라케어사, Cat. 50-76-03)을 50μL/웰로 첨가하고, 차광하여 실온에서 15분간 정치하였다. 반응 정지액(2N H2SO4)을 50μL/웰로 첨가하고, 450nm의 흡광도를 측정하였다.
상기 시험 결과, LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드(Der p1-p2-p23-p7)를 마우스에 투여함으로써, Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7 특이적 IgG2a의 산생이 검출되었다(도 1). 한편 LAMP-Der p 23-Der p 7-Der p 2-Der p 1 플라스미드(Der p23-p7-p2-p1), LAMP-Der p 1-Der p 2 플라스미드와 LAMP-Der p 23-Der p 7 플라스미드의 혼합물(Der p1-p2+Der p23-p7), 그리고 LAMP-Der p 1 플라스미드, LAMP-Der p 2 플라스미드, LAMP-Der p 7 플라스미드 및 LAMP-Der p 23 플라스미드의 혼합물(4 plasmid mix(플라스미드 혼합물))을 마우스에 투여해도 Der p 1 특이적 IgG2a의 산생은 검출되지 않았다. 또한, LAMP-Der p 1-Der p 2 플라스미드와 LAMP-Der p 23-Der p 7 플라스미드의 혼합물(Der p1-p2+Der p23-p7)의 마우스에 대한 투여에서는, Der p 2 특이적 IgG2a도 산생이 검출되지 않았다. 즉 플라스미드에 코드된 모든 알레르겐에 특이적인 IgG2a의 산생이 검출된 것은 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드뿐이었다. 이상의 결과에 의해, 시험한 플라스미드 중, LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드만이, 플라스미드에 코드된 모든 알레르겐에 대하여 Th1 면역 응답을 유도하고, 활성화된 B 세포의 IgG2a 아이소타입에 대한 클래스 스위치를 일으키는 것이 시사되었다.
[실시예 4: LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드에 의한 IFN-γ 및 IL-4의 산생 유도]
LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드를 투여한 마우스로부터 채취한 비세포를, 알레르겐으로 자극하였을 때의 사이토카인 산생 유도의 평가를 행하였다. 63일째에, 실시예 3에서 사용한 마우스, 및 실시예 3과 마찬가지의 프로토콜로 컨트롤 플라스미드(이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터: LAMP-1의 N 말단을 코드하는 염기 서열, 및 LAMP-1의 C 말단을 코드하는 염기 서열)를 투여한 마우스로부터, 일반적인 방법에 따라 비세포를 조제하였다. 또한, 컨트롤 플라스미드는, 일본 특허 제5807994호의 서열 번호 6에 기재된 플라스미드의 Eco RI-Xho I 사이트를 삭제함으로써 제작할 수 있다. 비세포를, 10％ 소 태아 혈청(Hyclone사, Cat. SH30070.03) 및 100배 희석의 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 15070063)을 포함하는 RPMI-1640 배지(Sigma-Aldrich사, Cat. R8758)에서, 8×105 세포/웰이 되도록 96웰 플레이트(IWAKI사, Cat. 3860-096)에 파종하였다. Der p 1(Indoor biotechnologies사, NA-DP1-1, lot: 38052), Der p 2(Indoor biotechnologies사, NA-DP2-1, lot: 36118), Der p 7(Indoor biotechnologies사, RP-DP7-1, lot: 34033) 및 Der p 23(Sysmex사, UniProtKB: A0A0K2DQU8)을 최종 농도가 각각 3, 3, 3 및 1.3㎍/mL가 되도록 첨가하였다. 37℃, 5％ CO2 하에서 72시간 배양을 행하였다. 배양 상청 중의 IFN-γ 및 IL-4의 농도를 ELISA법에 의해 측정하였다. IFN-γ의 측정에는 0.1％ BSA 및 0.05％ Tween 20을 함유하는 TBS로 10배 희석한 상청 샘플을 사용하고, IL-4의 측정에는 상청 원액 샘플을 사용하였다. ELISA 측정의 테스트 플레이트로서는 F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE(Nunc사, Cat. 439454)를 사용하였다. 마우스 IFN-γ DuoSet ELISA(R&D 시스템즈사, Cat. DY485) 및 마우스 IL-4 DuoSet ELISA(R&D 시스템즈사, Cat. DY404)를 사용하여 첨부 프로토콜에 준거하여 행하였다. 상기 시험 결과, 50㎍의 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드(Der p1-p2-p23-p7)를 마우스에 3회 투여함으로써, 진드기 유래 알레르겐 특이적인 IFN-γ 산생이 유도되었다(도 2). 또한 LAMP-Der p 23-Der p 7-Der p 2-Der p 1 플라스미드(Der p23-p7-p2-p1), LAMP-Der p 1-Der p 2 플라스미드와 LAMP-Der p 23-Der p 7 플라스미드의 혼합물(Der p1-p2+Der p23-p7), 그리고 LAMP-Der p 1 플라스미드, LAMP-Der p 2 플라스미드, LAMP-Der p 7 플라스미드 및 LAMP-Der p 23 플라스미드의 혼합물(4 plasmid mix)을 마우스에 3회 투여한 경우라도, 동등한 진드기 유래 알레르겐 특이적인 IFN-γ 산생이 유도되었다. 한편, 50㎍의 LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드(Der p1-p2-p23-p7)를 3회 투여한 마우스에서는, 진드기 유래 알레르겐 특이적인 IL-4 산생은 정량 하한값이었다(도 3). LAMP-Der p 23-Der p 7-Der p 2-Der p 1 플라스미드(Der p23-p7-p2-p1), LAMP-Der p 1-Der p 2 플라스미드와 LAMP-Der p 23-Der p 7 플라스미드(Der p1-p2+Der p23-p7)의 혼합물, 그리고 LAMP-Der p 1 플라스미드, LAMP-Der p 2 플라스미드, LAMP-Der p 7 플라스미드 및 LAMP-Der p 23 플라스미드의 혼합물(4 plasmid mix)을 마우스에 3회 투여한 경우라도 진드기 유래 알레르겐 특이적인 IL-4 산생은 정량 하한값 이하였다.
상기 시험 결과, LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드, LAMP-Der p 23-Der p 7-Der p 2-Der p 1 플라스미드, LAMP-Der p 1-Der p 2 플라스미드와 LAMP-Der p 23-Der p 7 플라스미드의 혼합물, 그리고 LAMP-Der p 1 플라스미드, LAMP-Der p 2 플라스미드, LAMP-Der p 7 플라스미드 및 LAMP-Der p 23 플라스미드의 혼합물은, Th1 세포 우위의 면역 응답을 유도하는 것이 시사되었다.
본 발명의 핵산은 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 핵산을 생산하는 방법은, 상기 핵산을 생산하는 데 유용하다.
[서열표 프리텍스트]
이하의 서열표의 숫자 표제 <223>에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는, 서열표의 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열은, LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 의해 코드되는 아미노산 서열이다. 또한, 서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열은, LAMP-Der p 1-Der p 2-Der p 23-Der p 7 플라스미드의 염기 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Nucleic acid for treatment of mite allergy <130> A19002A00 <150> JP2018-091963 <151> 2018-05-11 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding a chimeric protein <220> <221> CDS <222> (1)..(3123) <400> 1 atg gcg ccc cgc agc gcc cgg cga ccc ctg ctg ctg cta ctg ctg ttg 48 Met Ala Pro Arg Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 ctg ctg ctc ggc ctc atg cat tgt gcg tca gca gca atg ttt atg gtg 96 Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Ala Met Phe Met Val 20 25 30 aaa aat ggc aac ggg acc gcg tgc ata atg gcc aac ttc tct gct gcc 144 Lys Asn Gly Asn Gly Thr Ala Cys Ile Met Ala Asn Phe Ser Ala Ala 35 40 45 ttc tca gtg aac tac gac acc aag agt ggc cct aag aac atg acc ctt 192 Phe Ser Val Asn Tyr Asp Thr Lys Ser Gly Pro Lys Asn Met Thr Leu 50 55 60 gac ctg cca tca gat gcc aca gtg gtg ctc aac cgc agc tcc tgt gga 240 Asp Leu Pro Ser Asp Ala Thr Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Cys Gly 65 70 75 80 aaa gag aac act tct gac ccc agt ctc gtg att gct ttt gga aga gga 288 Lys Glu Asn Thr Ser Asp Pro Ser Leu Val Ile Ala Phe Gly Arg Gly 85 90 95 cat aca ctc act ctc aat ttc acg aga aat gca aca cgt tac agc gtc 336 His Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Arg Asn Ala Thr Arg Tyr Ser Val 100 105 110 cag ctc atg agt ttt gtt tat aac ttg tca gac aca cac ctt ttc ccc 384 Gln Leu Met Ser Phe Val Tyr Asn Leu Ser Asp Thr His Leu Phe Pro 115 120 125 aat gcg agc tcc aaa gaa atc aag act gtg gaa tct ata act gac atc 432 Asn Ala Ser Ser Lys Glu Ile Lys Thr Val Glu Ser Ile Thr Asp Ile 130 135 140 agg gca gat ata gat aaa aaa tac aga tgt gtt agt ggc acc cag gtc 480 Arg Ala Asp Ile Asp Lys Lys Tyr Arg Cys Val Ser Gly Thr Gln Val 145 150 155 160 cac atg aac aac gtg acc gta acg ctc cat gat gcc acc atc cag gcg 528 His Met Asn Asn Val Thr Val Thr Leu His Asp Ala Thr Ile Gln Ala 165 170 175 tac ctt tcc aac agc agc ttc agc cgg gga gag aca cgc tgt gaa caa 576 Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Phe Ser Arg Gly Glu Thr Arg Cys Glu Gln 180 185 190 gac agg cct tcc cca acc aca gcg ccc cct gcg cca ccc agc ccc tcg 624 Asp Arg Pro Ser Pro Thr Thr Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ser Pro Ser 195 200 205 ccc tca ccc gtg ccc aag agc ccc tct gtg gac aag tac aac gtg agc 672 Pro Ser Pro Val Pro Lys Ser Pro Ser Val Asp Lys Tyr Asn Val Ser 210 215 220 ggc acc aac ggg acc tgc ctg ctg gcc agc atg ggg ctg cag ctg aac 720 Gly Thr Asn Gly Thr Cys Leu Leu Ala Ser Met Gly Leu Gln Leu Asn 225 230 235 240 ctc acc tat gag agg aag gac aac acg acg gtg aca agg ctt ctc aac 768 Leu Thr Tyr Glu Arg Lys Asp Asn Thr Thr Val Thr Arg Leu Leu Asn 245 250 255 atc aac ccc aac aag acc tcg gcc agc ggg agc tgc ggc gcc cac ctg 816 Ile Asn Pro Asn Lys Thr Ser Ala Ser Gly Ser Cys Gly Ala His Leu 260 265 270 gtg act ctg gag ctg cac agc gag ggc acc acc gtc ctg ctc ttc cag 864 Val Thr Leu Glu Leu His Ser Glu Gly Thr Thr Val Leu Leu Phe Gln 275 280 285 ttc ggg atg aat gca agt tct agc cgg ttt ttc cta caa gga atc cag 912 Phe Gly Met Asn Ala Ser Ser Ser Arg Phe Phe Leu Gln Gly Ile Gln 290 295 300 ttg aat aca att ctt cct gac gcc aga gac cct gcc ttt aaa gct gcc 960 Leu Asn Thr Ile Leu Pro Asp Ala Arg Asp Pro Ala Phe Lys Ala Ala 305 310 315 320 aac ggc tcc ctg cga gcg ctg cag gcc aca gtc ggc aat tcc tac aag 1008 Asn Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gln Ala Thr Val Gly Asn Ser Tyr Lys 325 330 335 tgc aac gcg gag gag cac gtc cgt gtc acg aag gcg ttt tca gtc aat 1056 Cys Asn Ala Glu Glu His Val Arg Val Thr Lys Ala Phe Ser Val Asn 340 345 350 ata ttc aaa gtg tgg gtc cag gct ttc aag gtg gaa ggt ggc cag ttt 1104 Ile Phe Lys Val Trp Val Gln Ala Phe Lys Val Glu Gly Gly Gln Phe 355 360 365 ggc tct gtg gag gag tgt ctg ctg gac gag aac agc ctc gag act aac 1152 Gly Ser Val Glu Glu Cys Leu Leu Asp Glu Asn Ser Leu Glu Thr Asn 370 375 380 gca tgc tcc att aac ggt aat gct ccc gcc gag att gat ctg cgc caa 1200 Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln 385 390 395 400 atg aga acc gtt aca ccc ata agg tca gga gta gcc gct acg gaa tca 1248 Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser 405 410 415 gca tac ctg gct tac aga aac cag tct ctg gac ctt gca gaa cag gaa 1296 Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu 420 425 430 ctg gtg gac tgc gca tca cag cac aac gga tgt cac ggg gac acc ata 1344 Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Asn Gly Cys His Gly Asp Thr Ile 435 440 445 ccc aga ggg atc gag tat atc cag cac aat ggc gta gtg cag gaa agc 1392 Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser 450 455 460 tac tat agg tat gtc gcg cga gag caa agc tgt agg cgc cct aac gca 1440 Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala 465 470 475 480 cag cgt ttc gga atc tcc aat tac tgc cag atc tat ccg caa aac gtt 1488 Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Gln Asn Val 485 490 495 aac aaa atc cgt gaa gca ctg gcc caa acc cat agc gcc ata gct gtc 1536 Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val 500 505 510 atc atc ggt atc aaa gat ctg gat gcc ttt cgg cac tac gat gga agg 1584 Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg 515 520 525 act att ata cag cgc gac aat ggg tac cag ccc aat tat cac gca gtg 1632 Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val 530 535 540 aac att gtg gga tat agc aat gcg caa ggt gtc gat tac tgg atc gtc 1680 Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val 545 550 555 560 cgc aac tcc tgg gac aca aat tgg ggc gac aat ggc tat ggc tac ttt 1728 Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe 565 570 575 gct gcc aat att gac ctc atg atg ata gag gag tat ccg tac gtc gtg 1776 Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val 580 585 590 atc ctt ggc ggc ggc gga gat cag gta gac gtt aag gat tgc gct aac 1824 Ile Leu Gly Gly Gly Gly Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn 595 600 605 cat gag atc aag aaa gtc ttg gtg cca ggc tgt cat ggc tct gag cct 1872 His Glu Ile Lys Lys Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 610 615 620 tgc att atc cat cgc ggg aag cct ttt cag ctt gaa gcc gtc ttt gaa 1920 Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu 625 630 635 640 gcc aac cag aac acc aag acg gcc aaa atc gag atc aag gct agc att 1968 Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile 645 650 655 gat ggg ctg gaa gtc gac gtt cca ggc att gac cca aac gcc tgt cac 2016 Asp Gly Leu Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His 660 665 670 tac atg aag tgc cct ctg gtg aaa ggg cag cag tac gac ata aag tac 2064 Tyr Met Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr 675 680 685 acc tgg aat gtg cct aaa atc gcc cca aaa tct gag aat gtg gtg gtt 2112 Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val 690 695 700 aca gtg aaa gtg atg ggc gat gac gga gtt ttg gcc tgt gcc ata gca 2160 Thr Val Lys Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala 705 710 715 720 acc cat gct aag att agg gac ggc ggt ggt ggg gcg aat gat aac gat 2208 Thr His Ala Lys Ile Arg Asp Gly Gly Gly Gly Ala Asn Asp Asn Asp 725 730 735 gac gac ccc aca act act gta cat cct acc acc aca gaa caa ccg gat 2256 Asp Asp Pro Thr Thr Thr Val His Pro Thr Thr Thr Glu Gln Pro Asp 740 745 750 gat aag ttt gaa tgc cca agc aga ttc ggt tat ttc gcg gat cca aag 2304 Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg Phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys 755 760 765 gat cct cac aag ttc tac att tgc tca aac tgg gag gca gtg cat aaa 2352 Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys 770 775 780 gac tgt ccc ggc aat act cgg tgg aat gag gac gag gaa act tgt acc 2400 Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr 785 790 795 800 ggc ggt gga gga gat cca atc cac tat gac aag ata aca gaa gaa atc 2448 Gly Gly Gly Gly Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile 805 810 815 aat aag gct gtg gat gag gct gtt gcc gcc atc gaa aag tcc gag aca 2496 Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr 820 825 830 ttc gat ccc atg aaa gtc ccc gac cac agc gac aag ttt gaa cgg cac 2544 Phe Asp Pro Met Lys Val Pro Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His 835 840 845 att gga att atc gac ctg aaa ggg gaa ctc gac atg cgg aac att cag 2592 Ile Gly Ile Ile Asp Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gln 850 855 860 gtt aga ggc ctc aaa cag atg aaa cga gtt ggg gat gct aat gtg aag 2640 Val Arg Gly Leu Lys Gln Met Lys Arg Val Gly Asp Ala Asn Val Lys 865 870 875 880 agt gag gat ggg gtg gtg aag gca cat ctg ctc gta ggg gtc cat gac 2688 Ser Glu Asp Gly Val Val Lys Ala His Leu Leu Val Gly Val His Asp 885 890 895 gat gtg gtc agt atg gag tat gat ctg gcc tac aaa ctc ggt gat ttg 2736 Asp Val Val Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu Gly Asp Leu 900 905 910 cac ccc aat aca cac gta atc agt gac att cag gac ttt gtg gtg gag 2784 His Pro Asn Thr His Val Ile Ser Asp Ile Gln Asp Phe Val Val Glu 915 920 925 ctg tct ctg gaa gtt tcc gag gag gga aac atg acc ctg act tcc ttc 2832 Leu Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr Ser Phe 930 935 940 gag gtg cga cag ttc gca aac gtc gtg aat cac att gga ggc ctg tct 2880 Glu Val Arg Gln Phe Ala Asn Val Val Asn His Ile Gly Gly Leu Ser 945 950 955 960 att ctg gat cct atc ttt gcc gtg ttg agt gac gtg ctg aca gcg atc 2928 Ile Leu Asp Pro Ile Phe Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Thr Ala Ile 965 970 975 ttc caa gac acg gtc aga gcc gag atg acc aaa gtg ctc gct cca gcc 2976 Phe Gln Asp Thr Val Arg Ala Glu Met Thr Lys Val Leu Ala Pro Ala 980 985 990 ttc aag aag gag ctt gag cgg aac aac cag gaa ttc acg ctg atc ccc 3024 Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn Asn Gln Glu Phe Thr Leu Ile Pro 995 1000 1005 atc gct gtg ggt ggt gcc ctg gcg ggg ctg gtc ctc atc gtc ctc 3069 Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu 1010 1015 1020 atc gcc tac ctc gtc ggc agg aag agg agt cac gca ggc tac cag 3114 Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln 1025 1030 1035 act atc tag 3123 Thr Ile 1040 <210> 2 <211> 1040 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Ala Pro Arg Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Ala Met Phe Met Val 20 25 30 Lys Asn Gly Asn Gly Thr Ala Cys Ile Met Ala Asn Phe Ser Ala Ala 35 40 45 Phe Ser Val Asn Tyr Asp Thr Lys Ser Gly Pro Lys Asn Met Thr Leu 50 55 60 Asp Leu Pro Ser Asp Ala Thr Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Cys Gly 65 70 75 80 Lys Glu Asn Thr Ser Asp Pro Ser Leu Val Ile Ala Phe Gly Arg Gly 85 90 95 His Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Arg Asn Ala Thr Arg Tyr Ser Val 100 105 110 Gln Leu Met Ser Phe Val Tyr Asn Leu Ser Asp Thr His Leu Phe Pro 115 120 125 Asn Ala Ser Ser Lys Glu Ile Lys Thr Val Glu Ser Ile Thr Asp Ile 130 135 140 Arg Ala Asp Ile Asp Lys Lys Tyr Arg Cys Val Ser Gly Thr Gln Val 145 150 155 160 His Met Asn Asn Val Thr Val Thr Leu His Asp Ala Thr Ile Gln Ala 165 170 175 Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Phe Ser Arg Gly Glu Thr Arg Cys Glu Gln 180 185 190 Asp Arg Pro Ser Pro Thr Thr Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ser Pro Ser 195 200 205 Pro Ser Pro Val Pro Lys Ser Pro Ser Val Asp Lys Tyr Asn Val Ser 210 215 220 Gly Thr Asn Gly Thr Cys Leu Leu Ala Ser Met Gly Leu Gln Leu Asn 225 230 235 240 Leu Thr Tyr Glu Arg Lys Asp Asn Thr Thr Val Thr Arg Leu Leu Asn 245 250 255 Ile Asn Pro Asn Lys Thr Ser Ala Ser Gly Ser Cys Gly Ala His Leu 260 265 270 Val Thr Leu Glu Leu His Ser Glu Gly Thr Thr Val Leu Leu Phe Gln 275 280 285 Phe Gly Met Asn Ala Ser Ser Ser Arg Phe Phe Leu Gln Gly Ile Gln 290 295 300 Leu Asn Thr Ile Leu Pro Asp Ala Arg Asp Pro Ala Phe Lys Ala Ala 305 310 315 320 Asn Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gln Ala Thr Val Gly Asn Ser Tyr Lys 325 330 335 Cys Asn Ala Glu Glu His Val Arg Val Thr Lys Ala Phe Ser Val Asn 340 345 350 Ile Phe Lys Val Trp Val Gln Ala Phe Lys Val Glu Gly Gly Gln Phe 355 360 365 Gly Ser Val Glu Glu Cys Leu Leu Asp Glu Asn Ser Leu Glu Thr Asn 370 375 380 Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln 385 390 395 400 Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser 405 410 415 Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu 420 425 430 Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Asn Gly Cys His Gly Asp Thr 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Ile 645 650 655 Asp Gly Leu Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His 660 665 670 Tyr Met Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr 675 680 685 Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val 690 695 700 Thr Val Lys Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala 705 710 715 720 Thr His Ala Lys Ile Arg Asp Gly Gly Gly Gly Ala Asn Asp Asn Asp 725 730 735 Asp Asp Pro Thr Thr Thr Val His Pro Thr Thr Thr Glu Gln Pro Asp 740 745 750 Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg Phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys 755 760 765 Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys 770 775 780 Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr 785 790 795 800 Gly Gly Gly Gly Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile 805 810 815 Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr 820 825 830 Phe Asp Pro Met Lys Val Pro Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His 835 840 845 Ile Gly Ile Ile Asp Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gln 850 855 860 Val Arg Gly Leu Lys Gln Met Lys Arg Val Gly Asp Ala Asn Val Lys 865 870 875 880 Ser Glu Asp Gly Val Val Lys Ala His Leu Leu Val Gly Val His Asp 885 890 895 Asp Val Val Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu Gly Asp Leu 900 905 910 His Pro Asn Thr His Val Ile Ser Asp Ile Gln Asp Phe Val Val Glu 915 920 925 Leu Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr Ser Phe 930 935 940 Glu Val Arg Gln Phe Ala Asn Val Val Asn His Ile Gly Gly Leu Ser 945 950 955 960 Ile Leu Asp Pro Ile Phe Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Thr Ala Ile 965 970 975 Phe Gln Asp Thr Val Arg Ala Glu Met Thr Lys Val Leu Ala Pro Ala 980 985 990 Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn Asn Gln Glu Phe Thr Leu Ile Pro 995 1000 1005 Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu 1010 1015 1020 Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln 1025 1030 1035 Thr Ile 1040 <210> 3 <211> 6127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A vector comprising nucleic acid encoding a chimeric protein <400> 3 ccgcctaatg agcgggcttt tttttcttag ggtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac 60 tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgag 120 ccccgtatcc ggccgtccgc cgtgatccat gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt 180 gtgcgacgtc agacaacggg ggagtgctcc ttttggcttc cttccccttc ttccgcttcc 240 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 300 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 360 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 420 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 480 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 540 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 600 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 660 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 720 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 780 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 840 tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 900 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 960 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1020 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1080 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1140 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1200 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tcctgcaaac cacgttgtgg 1260 tagaattggt aaagagagtc gtgtaaaata tcgagttcgc acatcttgtt gtctgattat 1320 tgatttttgg cgaaaccatt tgatcatatg acaagatgtg tatctacctt aacttaatga 1380 ttttgataaa aatcattagg taccccggct ctagatggca tgacattaac ctataaaaat 1440 aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 1500 cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 1560 gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca 1620 tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta 1680 aggagaaaat accgcatcag attggctatt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata 1740 atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat tgattattga 1800 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 1860 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 1920 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 1980 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 2040 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 2100 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 2160 ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 2220 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 2280 gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 2340 tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 2400 gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggct 2460 cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt 2520 cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt 2580 ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc 2640 agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctagttctc tcgttaactt 2700 aatgagacag atagaaactg gtcttgtaga aacagagtag tcgcctgctt ttctgccagg 2760 tgctgacttc tctcccctgg gcttttttct ttttctcagg ttgaaaagaa gaagacgaag 2820 aagacgaaga agacaaaccg tcgtcgacat ggcgccccgc agcgcccggc gacccctgct 2880 gctgctactg ctgttgctgc tgctcggcct catgcattgt gcgtcagcag caatgtttat 2940 ggtgaaaaat ggcaacggga ccgcgtgcat aatggccaac ttctctgctg ccttctcagt 3000 gaactacgac accaagagtg gccctaagaa catgaccctt gacctgccat cagatgccac 3060 agtggtgctc aaccgcagct cctgtggaaa agagaacact tctgacccca gtctcgtgat 3120 tgcttttgga agaggacata cactcactct caatttcacg agaaatgcaa cacgttacag 3180 cgtccagctc atgagttttg tttataactt gtcagacaca caccttttcc ccaatgcgag 3240 ctccaaagaa atcaagactg tggaatctat aactgacatc agggcagata tagataaaaa 3300 atacagatgt gttagtggca cccaggtcca catgaacaac gtgaccgtaa cgctccatga 3360 tgccaccatc caggcgtacc tttccaacag cagcttcagc cggggagaga cacgctgtga 3420 acaagacagg ccttccccaa ccacagcgcc ccctgcgcca cccagcccct cgccctcacc 3480 cgtgcccaag agcccctctg tggacaagta caacgtgagc ggcaccaacg ggacctgcct 3540 gctggccagc atggggctgc agctgaacct cacctatgag aggaaggaca acacgacggt 3600 gacaaggctt ctcaacatca accccaacaa gacctcggcc agcgggagct gcggcgccca 3660 cctggtgact ctggagctgc acagcgaggg caccaccgtc ctgctcttcc agttcgggat 3720 gaatgcaagt tctagccggt ttttcctaca aggaatccag ttgaatacaa ttcttcctga 3780 cgccagagac cctgccttta aagctgccaa cggctccctg cgagcgctgc aggccacagt 3840 cggcaattcc tacaagtgca acgcggagga gcacgtccgt gtcacgaagg cgttttcagt 3900 caatatattc aaagtgtggg tccaggcttt caaggtggaa ggtggccagt ttggctctgt 3960 ggaggagtgt ctgctggacg agaacagcct cgagactaac gcatgctcca ttaacggtaa 4020 tgctcccgcc gagattgatc tgcgccaaat gagaaccgtt acacccataa ggtcaggagt 4080 agccgctacg gaatcagcat acctggctta cagaaaccag tctctggacc ttgcagaaca 4140 ggaactggtg gactgcgcat cacagcacaa cggatgtcac ggggacacca tacccagagg 4200 gatcgagtat atccagcaca atggcgtagt gcaggaaagc tactataggt atgtcgcgcg 4260 agagcaaagc tgtaggcgcc ctaacgcaca gcgtttcgga atctccaatt actgccagat 4320 ctatccgcaa aacgttaaca aaatccgtga agcactggcc caaacccata gcgccatagc 4380 tgtcatcatc ggtatcaaag atctggatgc ctttcggcac tacgatggaa ggactattat 4440 acagcgcgac aatgggtacc agcccaatta tcacgcagtg aacattgtgg gatatagcaa 4500 tgcgcaaggt gtcgattact ggatcgtccg caactcctgg gacacaaatt ggggcgacaa 4560 tggctatggc tactttgctg ccaatattga cctcatgatg atagaggagt atccgtacgt 4620 cgtgatcctt ggcggcggcg gagatcaggt agacgttaag gattgcgcta accatgagat 4680 caagaaagtc ttggtgccag gctgtcatgg ctctgagcct tgcattatcc atcgcgggaa 4740 gccttttcag cttgaagccg tctttgaagc caaccagaac accaagacgg ccaaaatcga 4800 gatcaaggct agcattgatg ggctggaagt cgacgttcca ggcattgacc caaacgcctg 4860 tcactacatg aagtgccctc tggtgaaagg gcagcagtac gacataaagt acacctggaa 4920 tgtgcctaaa atcgccccaa aatctgagaa tgtggtggtt acagtgaaag tgatgggcga 4980 tgacggagtt ttggcctgtg ccatagcaac ccatgctaag attagggacg gcggtggtgg 5040 ggcgaatgat aacgatgacg accccacaac tactgtacat cctaccacca cagaacaacc 5100 ggatgataag tttgaatgcc caagcagatt cggttatttc gcggatccaa aggatcctca 5160 caagttctac atttgctcaa actgggaggc agtgcataaa gactgtcccg gcaatactcg 5220 gtggaatgag gacgaggaaa cttgtaccgg cggtggagga gatccaatcc actatgacaa 5280 gataacagaa gaaatcaata aggctgtgga tgaggctgtt gccgccatcg aaaagtccga 5340 gacattcgat cccatgaaag tccccgacca cagcgacaag tttgaacggc acattggaat 5400 tatcgacctg aaaggggaac tcgacatgcg gaacattcag gttagaggcc tcaaacagat 5460 gaaacgagtt ggggatgcta atgtgaagag tgaggatggg gtggtgaagg cacatctgct 5520 cgtaggggtc catgacgatg tggtcagtat ggagtatgat ctggcctaca aactcggtga 5580 tttgcacccc aatacacacg taatcagtga cattcaggac tttgtggtgg agctgtctct 5640 ggaagtttcc gaggagggaa acatgaccct gacttccttc gaggtgcgac agttcgcaaa 5700 cgtcgtgaat cacattggag gcctgtctat tctggatcct atctttgccg tgttgagtga 5760 cgtgctgaca gcgatcttcc aagacacggt cagagccgag atgaccaaag tgctcgctcc 5820 agccttcaag aaggagcttg agcggaacaa ccaggaattc acgctgatcc ccatcgctgt 5880 gggtggtgcc ctggcggggc tggtcctcat cgtcctcatc gcctacctcg tcggcaggaa 5940 gaggagtcac gcaggctacc agactatcta gtaaggatct ttttccctct gccaaaaatt 6000 atggggacat catgaagccc cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt 6060 tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact cggaaggaca taagggcggc 6120 cgctagc 6127

Claims (17)

  1. (삭제)
  2. 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 염기 서열은 이하의 염기 서열을 순번대로 포함하는 염기 서열인 핵산:
    시그널 펩티드를 코드하는 염기 서열,
    LAMP의 세포 소기관 내 안정화 도메인을 코드하는 염기 서열,
    Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7을 순번대로 포함하는 알레르겐 도메인을 코드하는 염기 서열,
    막 관통 도메인을 코드하는 염기 서열, 그리고
    LAMP의 엔도솜/리소좀 표적 도메인을 코드하는 염기 서열.
  3. 제2항에 있어서, 시그널 펩티드가 LAMP의 시그널 펩티드인 핵산.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 막 관통 도메인이 LAMP의 막 관통 도메인인 핵산.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩티드가 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 27까지의 아미노산 서열을 포함하고, 세포 소기관 내 안정화 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 번호 28부터 380까지의 아미노산 서열을 포함하고, 알레르겐 도메인이, 서열 번호 2의 아미노산 번호 383부터 594까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 599부터 727까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 2, 서열 번호 2의 아미노산 번호 732부터 800까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 23 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 805부터 1002까지의 아미노산 서열을 포함하는 Der p 7을 포함하는 알레르겐 도메인이고, 막 관통 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 번호 1006부터 1028까지의 아미노산 서열을 포함하고, 엔도솜/리소좀 표적 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 번호 1037부터 1040까지의 아미노산 서열을 포함하는 핵산.
  6. 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서,
    해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
  7. a) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는
    b) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 해당 핵산은 Der p 1, Der p 2, Der p 23 및 Der p 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 Th1형 면역을 유도하는 작용을 갖는 핵산.
  8. 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  10. 제8항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  11. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 핵산으로 형질 전환된 숙주 세포.
  12. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 핵산으로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 핵산을 생산하는 방법.
  13. 제10항에 기재된 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 진드기 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물인 의약 조성물.
  15. 제10항에 기재된 발현 벡터의 예방 유효량 또는 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 진드기 알레르기를 예방 또는 치료하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 진드기 알레르기의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 발현 벡터.
  17. 진드기 알레르기의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 제10항에 기재된 발현 벡터의 사용.
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