ES2959867T3 - Nuevos antígenos de la gripe - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos antígenos de influenza, nuevas composiciones inmunogénicas o de vacunas, así como a usos y métodos para producir dichos antígenos y composiciones. En particular, la invención se refiere a formas recombinantes de hemaglutinina (HA) y su uso en composiciones de vacunas para la prevención de infecciones por el virus de la influenza. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos antígenos de la gripe

Campo técnico

La presente invención se refiere a nuevos antígenos de la gripe, nuevas composiciones inmunogénicas, así como a usos y métodos para producir dichos antígenos y composiciones. En particular, la invención se refiere a formas recombinantes de hemaglutinina (HA) para la prevención de infecciones por el virus de la gripe.

Antecedentes de la invención

Los virus de la gripe son uno de los virus más ubicuos presentes en el mundo, que afecta tanto a los seres humanos como al ganado. La gripe produce una carga económica, morbilidad e incluso mortalidad que son significativas. Hay tres tipos de virus de la gripe: A, B y C. El virus de la gripe comprende dos antígenos de superficie predominantes, las glucoproteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), que aparecen como picos en la superficie de las partículas. Son estas proteínas de superficie, particularmente las HA, las que determinan la especificidad antigénica de los subtipos de gripe.

La HA es una proteína trimérica compuesta por un ectodominio de subunidades idénticas, cada una de las cuales contiene dos polipéptidos, HA1 y HA2, unidos por un enlace disulfuro. Cada monómero se expresa inicialmente como HA0, y posteriormente es escindido por las proteasas del huésped en subunidades HA1 y HA2 que se unen a través de un enlace disulfuro. La HA se puede dividir funcionalmente en dos dominios, la cabeza globular y el tallo. La cabeza globular se compone de parte de HA1 y la estructura del tallo se compone de porciones de HA1 y todo de HA2 (Haiet al,J. Virol, 201286(10): 5774-5781).

La vacunación desempeña un papel fundamental en el control de las epidemias y pandemias de gripe. Muchas vacunas contra la gripe se elaboran mediante métodos que implican el resurtido, la adaptación y el crecimiento de los virus en huevos de gallina. Sin embargo, existen limitaciones con estos métodos existentes. No todas las cepas del virus de la gripe crecen bien en los huevos y deben adaptarse o construirse resurtidos virales. Los cambios en la HA durante la fabricación pueden conducir a cepas que difieran de las cepas circulantes y que puedan ofrecer niveles subóptimos de protección. Otro inconveniente es que las personas con alergias al huevo pueden mostrar hipersensibilidad a las proteínas residuales del huevo en las vacunas a base de huevo. Además, los métodos basados en huevos dependen de un suministro ininterrumpido de huevos, que puede ser susceptible a interrupciones en el suministro, como enfermedades en las aves de corral. Existe la necesidad de producir vacunas utilizando métodos que no dependan del suministro de huevos y donde la producción de proteínas de la vacuna se controle más rigurosamente que en los métodos basados en huevos.

Las formas recombinantes de HA (rHA) producidas en las células de cultivo se han propuesto como una fuente alternativa de antígeno para las vacunas contra la gripe a la procedente de los huevos. Sin embargo, se han encontrado problemas para mantener la inmunogenicidad y una estructura cuaternaria regular del rHA utilizando estos métodos. Por lo tanto, todavía se necesitan métodos alternativos de suministro de antígenos para las vacunas contra la gripe, que aborden los desafíos existentes.

Krammeret al(PLoS ONE, 2012 7(8): e43603) describió la estabilización de epítopos conformacionales en el dominio del tallo de la hemaglutinina recombinante soluble usando un dominio de trimerización.

Breve descripción de la invención

Se determinó con esfuerzos previos para producir rHA que se formaron grandes agregados de la proteína recombinante que no son aceptables para los propósitos de producción de vacunas. Además, la estructura correcta de la roseta, una forma multinumérica de la estructura básica del trímero de HA, no siempre se formó correctamente. Los inventores han hecho un antígeno de hemaglutinina recombinante (rHA) que incorpora un dominio de trimerización heteróloga como un foldón, así como una señal hidrofóbica que es el dominio transmembranal de HA y el dominio extracelular (ECD). El rHA producida por los inventores es capaz de formar la estructura correcta de la roseta sin grandes agregados y mantiene la inmunogenicidad. Estas propiedades funcionales hacen que el rHA sea potencialmente útil para el tratamiento y/o la prevención de la infección y/o enfermedad de la gripe.

En consecuencia, en un primer aspecto de la invención, se proporciona un antígeno recombinante de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe que comprende el dominio extracelular de HA, una señal hidrofóbica que es un dominio transmembranal de HA (TMD), y un dominio de trimerización heterólogo, en donde el antígeno de la HA carece del dominio intracelular de la hemaglutinina de la gripe y el antígeno de la HA recombinante forma estructuras de rosetain vivoy/oin vitro.

En un aspecto adicional, se proporciona un polinucleótido que codifica un antígeno de hemaglutinina recombinante como se describió anteriormente.

En otro aspecto se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno recombinante como se definió anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional, se proporciona la composición inmunogénica descrita anteriormente para su uso en medicina.

Incluso en otro aspecto se proporciona la composición inmunogénica descrita anteriormente para su uso en la prevención y/o vacunación contra la enfermedad de la gripe.

En aún otro aspecto se proporciona la composición inmunogénica descrita anteriormente para su uso en la prevención y/o vacunación contra la gripe causada por un clado diferente al clado al que pertenece el dominio extracelular del antígeno de la HA descrito anteriormente.

Incluso en otro aspecto, se proporciona un métodoin vitropara producir un antígeno recombinante, como se ha definido anteriormente, que comprende la expresión de un polinucleótido descrito anteriormente en una célula eucariota, como una célula de mamíferos, por ejemplo, una célula CHO, o una célula de insecto, que comprende además la purificación/aislamiento del rHA de la célula eucariótica

Breve descripción de las figuras

Figura 1:Se muestra el diseño de ECD-Foldón y ECD-TMD-Foldón utilizado en los ejemplos. A. ECD- Foldón es la molécula inicial, compuesta por la señal de secreción gp67, el ectodominio de HA (ECD), un sitio de escisión de trombina (TCS), el foldón del dominio de trimerización y una cola de histidina (para facilitar la purificación). B. ECD-TMD-Foldón ha sido diseñado insertando el dominio transmembranal de HA (T<m>) entre el ectodominio y el dominio Foldón.

Figura 2:Se muestran las secuencias de aminoácidos de ECD-Foldón y ECD-TMD-Foldón utilizadas en los ejemplos. A. ECD-Foldón es la molécula inicial, y ECD-TMD-Foldón se ha diseñado insertando el dominio transmembranal de HA (TM) entre el dominio extracelular de HA y el dominio de Foldón de ECD-Foldón. Para obtener información, también se muestra la secuencia de aminoácidos de la molécula HA de longitud completa de la misma cepa que se ha utilizado como comparador en este estudio.

Figura 3A, 3B y 3C:Micrografías electrónicas que muestran la aparición en solución de ECD-Foldón, ECD-TMD-Foldón y HA recombinante de longitud completa, respectivamente.

Figura 4:Se inmunizaron ratones en los días 0 y 21 con ECD-Foldón (6 o 24 gg), ECD-TMD-Foldón (1,5, 6 o 24 gg), un antígeno de la HA recombinante de longitud completa (1,5, 6 o 24 gg), A/Indonesia/05/2005 dividido (1,5 gg) o PBS. Se tomó sangre los días 21 y 42 (3 semanas después de las inmunizaciones) y se midieron los niveles de anticuerpos anti-A/Indonesia/05/2005 en sueros de ratón mediante ELISA. El número entre paréntesis indica el número de ratones en el grupo.

Figura 5:Se inmunizaron ratones los días 0 y 21 con ECD-Foldón (6 o 24 gg), ECD-TMD-Foldón (1,5, 6 o 24 gg), un antígeno de la HA recombinante de longitud completa (1,5, 6 o 24 gg), A/Indonesia/05/2005 dividido (1,5 gg) o PBS. Se tomó sangre los días 21 y 42 (3 semanas después de las inmunizaciones) y se midieron los niveles de anticuerpos anti-A/Indonesia/05/2005 en sueros de ratón mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI). Los números entre paréntesis indican el número de ratones en el grupo.

Figura 6:Se inmunizaron ratones los días 0 y 21 con ECD-Foldón (6 o 24 gg), ECD-TMD-Foldón (1,5, 6 o 24 gg), un antígeno de la HA recombinante de longitud completa (1,5, 6 o 24 gg), A/Indonesia/05/2005 dividido (1,5 gg) o PBS. Se tomó sangre los días 21 y 42 (3 semanas después de las inmunizaciones) y se midieron los niveles de anticuerpos neutralizantes anti-A/Indonesia/05/2005 en sueros de ratón mediante ensayo de neutralización. Los números entre paréntesis indican el número de ratones en el grupo.

Figura 7:Se inmunizaron ratones los días 0 y 21 con ECD-Foldón (6 o 24 gg), ECD-TMD-Foldón (1,5, 6 o 24 gg), un antígeno de la HA recombinante de longitud completa (1,5, 6 o 24 gg), A/Indonesia/05/2005 dividido (1,5 gg) o PBS. Se tomó sangre los días 21 y 42 (3 semanas después de las inmunizaciones) y se midieron los niveles de anticuerpos anti-A/Indonesia/05/2005 en sueros de ratón mediante ELISA y ensayo de hemaglutinación. El gráfico muestra las relaciones entre los valores de ELISA y HI. Los números entre paréntesis indican el número de ratones en el grupo. El asterisco (*) indica que no se pudo calcular la relación, ya que al menos uno de los dos valores estaba por debajo del punto de corte del ensayo.

Figura 8:Se inmunizaron ratones los días 0 y 21 con ECD-Foldón (6 o 24 gg), ECD-TMD-Foldón (1,5, 6 o 24 gg), un antígeno de la HA recombinante de longitud completa (1,5, 6 o 24 gg), A/Indonesia/05/2005 dividido (1,5 gg) o PBS. Se tomó sangre los días 21 y 42 (3 semanas después de las inmunizaciones) y se midieron los niveles de anticuerpos anti-A/Indonesia/05/2005 en sueros de ratón mediante ELISA y los niveles de anticuerpos neutralizantes mediante ensayo de neutralización. El gráfico muestra las relaciones entre ELISA y los valores neutralizantes. El número entre paréntesis indica el número de ratones en el grupo. El asterisco (*) indica que no se pudo calcular la relación, ya que al menos uno de los dos valores estaba por debajo del punto de corte del ensayo.

Descripción detallada

Aquí se proporciona un antígeno recombinante de la hemaglutinina (rHA) del virus de la gripe que comprende o consiste en el dominio extracelular de HA (ectodominio, ECD), una señal hidrófoba que es un dominio transmembranal HA (TMD) y un dominio de trimerización heteróloga.

Virus de la gripe recombinante HA (rHA)

Un rHA comprende o está codificado por uno o más ácidos nucleicos que se derivan de un ácido nucleico que fue construido artificialmente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender, o ser codificado por, un ácido nucleico clonado formado por la unión de ácidos nucleicos heterólogos.

El rHA incluye secuencias derivadas de hemaglutinina (como ECD y TMD) y puede incluir otras secuencias no derivadas de hemaglutinina, por ejemplo, un dominio de trimerización heteróloga no derivado de hemaglutinina. Usualmente, las secuencias derivadas de la hemaglutinina están en el orden en que aparecen en la hemaglutinina derivada naturalmente y el dominio de trimerización ocurre hacia el extremo terminal C, o hacia este, por ejemplo, en la mitad terminal C del rHA/C terminal a el ECD. El rHA de la invención, en particular, puede consistir o comprender del ECD de HA seguido de un TMD de HA, seguido de un dominio de trimerización heterólogo, en ese orden, en donde el dominio de trimerización se encuentra en la mitad C-terminal del rHA/ C-terminal a el ECD.

El antígeno rHA de la invención puede fusionarse o contener otros polipéptidos distintos de ECD, TMD y del dominio de trimerización. La secuencia que codifica el polipéptido adicional incluye opcionalmente otras características como un enlace flexible entre las secuencias derivadas de HA y otras secuencias heterólogas de aminoácidos. Los enlazadores pueden facilitar el plegado independiente de los dominios HA y otras secuencias heterólogas. El enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos que se sintetiza como parte de una proteína de fusión recombinante. En otras realizaciones, un enlazador químico se utiliza para conectar subsecuencias producidas sintética o recombinantemente. Tales enlazadores flexibles son conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Además de los enlazadores flexibles, o alternativamente, las proteínas de fusión incluyen opcionalmente subsecuencias de polipéptidos de proteínas que no están relacionadas con la hemaglutinina, por ejemplo, una secuencia con afinidad a un anticuerpo conocido para facilitar la purificación y/o detección de afinidad. Tales dominios de detección y facilitación de la purificación incluyen, pero no se limitan a péptidos quelantes de metales como los tractos de polihistidina y los módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación de metales inmovilizados y dominios de proteína A que permiten la purificación de inmunoglobulina inmovilizada. Los ejemplos incluyen secuencias de fusión heterólogas que codifican etiquetas gD, epítopos c-Myc, etiquetas de polihistidina, proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP), proteína beta-galactosidasa o glutatión S transferasa o cualquier otra secuencia útil para la detección o purificación de la proteína de fusión expresada en una célula o sobre ella. Preferiblemente, la secuencia de polipéptidos adicional es una etiqueta de polihistidina, como una etiqueta de seis histidina. La inclusión de una secuencia de enlace escindible entre el dominio de purificación (por ejemplo, etiqueta de polihistidina) y el antígeno rHA puede ser útil para facilitar la purificación. Por ejemplo, un sitio de escisión enzimática, como un sitio de escisión de trombina, puede incluirse entre el polipéptido adicional y el resto de las secuencias de rHA. Una secuencia de enlace escindible, por ejemplo, un sitio de escisión enzimática, como un sitio de escisión de trombina, puede incluirse alternativa o adicionalmente entre el dominio de trimerización y el resto de las secuencias de rHA. Esto puede permitir que el dominio de trimerización se elimine en el rHA final. Por lo tanto, el antígeno rHA de la invención puede consistir o comprender (en orden) el ECD de HA, un TMD de HA, un dominio de trimerización heterólogo, una etiqueta de purificación (por ejemplo, etiqueta de polihistidina) y, opcionalmente, una secuencia de enlace escindible i) entre la etiqueta de purificación y el resto del rHA y/o ii) entre el dominio de trimerización y el TMD DE HA.

El gen o construcción que codifica el antígeno rHA puede incluir un péptido señal. Normalmente, el péptido señal es apropiado para la célula huésped en la que se expresa el rHA. En una realización, la secuencia natural del péptido señal en la hemaglutinina se elimina y se reemplaza con un péptido señal del baculovirus, por ejemplo la señal de secreción gp67 (Whitfordet al1989, J Virol. 63, 1393-1399), para una expresión adecuada en células de insectos. El gen que contiene el antígeno rHA y el péptido señal de baculovirus se puede introducir en un vector de expresión de baculovirus de modo que el promotor del baculovirus dirija la transcripción de las proteínas de fusión en células de insectos infectadas. El péptido señal dirige la traducción del antígeno rHA en la vía de glucosilación de las células de insecto y no está presente en la proteína madura.

En consecuencia, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno rHA de la invención puede consistir o comprender la secuencia que codifica el ECD de HA, un TMD de HA, un dominio de trimerización heterólogo (por ejemplo, foldón), una etiqueta de purificación (por ejemplo, etiqueta de polihistidina) y un péptido señal (por ejemplo, un péptido de baculovirus), como en el orden: un péptido señal (por ejemplo, un péptido señal de baculovirus), el ECD de HA, un TMD de HA, un dominio de trimerización heterólogo (por ejemplo, foldón), una etiqueta de purificación (por ejemplo, etiqueta de polihistidina). Como otro ejemplo, el ácido nucleico que codifica el antígeno rHA de la invención puede consistir o comprender la codificación de secuencia (en orden): un péptido señal (por ejemplo, un péptido señal de baculovirus), el ECD de HA, un TMD de HA, una secuencia de enlace escindible (por ejemplo, TCS), un dominio de trimerización heteróloga (por ejemplo, foldón), una etiqueta de purificación (por ejemplo, etiqueta de polihistidina).

Las secuencias de HA (por ejemplo, ECD y TMD) del antígeno rHA pueden ser de cualquier tipo o subtipo 5 (por ejemplo, H1 a H16) de la cepa de la gripe. En una realización, la secuencia HA del antígeno de la HA es de una cepa seleccionada del grupo que consiste en: cepa subtipo H1, una H2, una H3, una H5, una H7 y una H9. Preferiblemente, el antígeno de la HA es de una cepa H5. Las secuencias de ECD y TMD pueden provenir de la misma fuente/cepa/tipo/subtipo de gripe.

En algunas realizaciones, la HA tiene una secuencia que es idéntica a la HA de una cepa pandémica. Por cepa pandémica, se entiende un nuevo virus de la gripe contra el cual la gran mayoría de la población humana no tiene inmunidad. Normalmente, la OMS identifica y difunde tales cepas pandémicas. Las cepas pandémicas adecuadas son, por ejemplo, H5N1, H9N2, H7N7, H7N9, H2N2, H7N1, H7N3, H10N7, H5N2 Y H1N1. Alternativamente, la secuencia de HA es idéntica o se deriva de la HA que tiene lugar de forma natural de una cepa no pandémica. Por ejemplo, las cepas no pandémicas pueden ser cepas identificadas por la OMS como cepas circulantes del virus de la gripe estacional o cepas identificadas por la OMS como que tienen el potencial de causar una epidemia para la temporada de gripe subsiguiente. Tales cepas pueden ser, por ejemplo, 1) cepas de gripe H1N1, H3N2 tipo A y 2) una o dos cepas de gripe tipo B (por ejemplo, de los linajes Victoria y/o Yamagata).

Por ejemplo, el antígeno rHA de la invención puede comprender i) una secuencia de aminoácidos que comprende el ECD de HA (por ejemplo, SEQ ID NO: 7), ii) secuencia de aminoácidos que comprende un TMD DEHa(por ejemplo, SEQ ID NO: 5) y iii) el dominio de trimerización heteróloga (foldón) mostrado en SEQ ID NO: 9 o un derivado de esta secuencia que mantiene la capacidad de inducir a los monómeros rHA para formar trímeros. En particular, el ECD de HA puede derivarse de un virus H5 (por ejemplo, un virus H5N1), como el que se muestra en el SEQ ID NO: 7. Tanto el ECD como el TMD de HA pueden derivarse del virus H5, como el virus H5N1. Por ejemplo, el antígeno rHA puede incluir i) SEQ ID NO: 7, y ii) SEQ ID NO: 5 o derivado del mismo que conserva la capacidad de orientar los trímeros de HA en estructuras de roseta y mantiene la inmunogenicidad de HA. En particular, el antígeno rHA puede comprender o constar de la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno rHA puede comprender i) ácido nucleico que codifica el ECD de HA (por ejemplo, SEQ ID NO: 8), ii) secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, SEQ ID NO: 6) que codifica elt Mdde HA o una derivada de esta secuencia que codifique unt Mdque conserva la capacidad de orientar los trímeros de HA en estructuras de roseta y mantiene la inmunogenicidad de HA y iii) SEQ ID NO: 10 foldón de codificación o un derivado de esta secuencia que mantiene la capacidad de inducir monómeros rHA expresados para formar trímeros.

La secuencia ECD y/o TMD puede derivarse de un virus H5, por ejemplo, un virus H5N1. Por ejemplo, en una realización, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno rHA comprende i) SEQ ID NO: 8, y ii) SEQ ID NO: 6, o un derivado de esta secuencia que codifica un TMD que conserva la capacidad de orientar los trímeros de HA en estructuras de roseta y mantiene la inmunogenicidad de HA. En particular, el ácido nucleico que codifica el antígeno rHA de la invención puede consistir o comprender la secuencia de ácidos nucleicos que se muestra en el SEQ ID NO: 2.

En otro caso, el ácido nucleico que codifica el antígeno rHA de la invención puede comprender cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica un ECD de HA, cualquier secuencia que codifica un<t>M<d>de HA y la secuencia de foldón mostrada en SEQ ID NO: 10 o una derivada de esta secuencia que mantiene la capacidad de inducir monómeros rHA expresados para formar trímeros. En otro caso, el ácido nucleico que codifica el antígeno rHA de la invención puede comprender i) cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica un ECD de HA, ii) cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de trimerización heterólogo y iii) SEQ ID NO: 6 que codifica el TMD de HA o derivado de esta secuencia que codifica un TMD que conserva la capacidad de orientar los trímeros de HA en estructuras de roseta y mantiene la inmunogenicidad de HA. En otro caso, el ácido nucleico que codifica el rHA de la invención puede comprender i) SEQ ID NO: 8 que codifica el ECD de HA, ii) cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio de trimerización heterólogo y iii) cualquier ácido nucleico que codifica un TMD de HA. En otro caso aún más, el ácido nucleico que codifica el antígeno rHA de la invención puede comprender i) cualquier secuencia que codifica un ECD de HA, ii) la secuencia de foldón mostrada en SEQ ID NO: 10 o un derivado de esta secuencia que mantiene la capacidad de inducir monómeros rHA expresados para formar trímeros y iii) cualquier ácido nucleico que codifique un TMD de HA.

El antígeno recombinante de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe carece del dominio intracelular de la hemaglutinina de la gripe, por ejemplo, el dominio intracelular representado por SEQ ID NO: 3. También se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno recombinante de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe que carece de secuencia que codifica el dominio intracelular de la hemaglutinina de la gripe, por ejemplo, el dominio intracelular representado por el SEQ ID NO: 4.

Dominio extracelular (ECD)

El componente del dominio extracelular (o ectodominio, ECD) de HA está presente en la proteína HA de tipo silvestre en la superficie celular. El rHA de la invención puede comprender un ECD de longitud completa. En algunas realizaciones, el ECD puede ser una variante o derivado de la proteína HA de tipo silvestre (por ejemplo, que contiene sustituciones o adiciones de aminoácidos).

El ECD incluye las regiones de HA para las que se desea dirigir una respuesta inmune. Tales regiones pueden incluir epítopos conservados y/o variables conocidos de hemaglutinina que provocan anticuerpos neutralizantes después de la vacunación. Preferiblemente, el ECD es capaz de plegarse correctamente para interactuar en un ensayo de hemaglutinación.

Por ejemplo, el ECD puede consistir o comprender la región HA1 y HA2 de HA. Alternativamente, el ECD puede consistir o comprender la región de cabeza y tallo de HA.

El término “HA1” se refiere a la región de la proteína HA incluidos residuos de aminoácidos de aproximadamente 1 -330 del dominio extracelular de la proteína HA. HA1 comprende todos los residuos que son N-terminal al péptido de división HA1/HA2 de la proteína precursora HA0, incluyendo el dominio de unión al receptor de la proteína HA.

El término “HA2” se refiere a la región de la proteína HA incluido residuos de aminoácidos de aproximadamente 331-504 del polipéptido de hemaglutinina HA0. Cabe destacar que estos residuos dentro de la cadena HA2 se numeran comúnmente independientemente de los de HA1, de modo que HA2 residuos pueden numerarse consecutivamente 1-174. La cadena HA2 comprende todos los residuos que son C-terminal al péptido de división HA1/HA2 de la proteína precursora HA0, incluyendo el péptido hidrófobo responsable de la inserción dentro de la membrana de la célula huésped durante el proceso de fusión de la membrana.

El término “tallo HA” se refiere a la región de la proteína HA incluido residuos de aproximadamente 1 -42 y 274-330 de la cadena HA1, así como residuos (1-174) de la cadena HA2. El tallo se encuentra en la región membranaproximal de la HA, directamente debajo del dominio de esterasa vestigial de la cabeza globular HA1.

El término cabeza HA se refiere a una región de cabeza globular de la proteína HA excluido el dominio transmembranal y cualquier región intracelular, que está compuesta por parte de HA1 y que contiene un bolsillo de unión de ácido siálico que media la unión del virus a la célula huésped. Véase, por ejemplo, Haiet al(1 viral, 201286(10): 5774-5781).

La numeración de la secuencia de aminoácidos del ECD es consecutiva desde el terminal amino (N-) hasta el residuo terminal carboxilo (C-), de tal manera que la posición 1 corresponde al residuo en el N- terminal de cada subdominio en la HA de tipo silvestre que se encuentra en los viriones. Como tal, cualquier residuo de ingeniería adicional en el N-terminal, como las secuencias heterólogas descritas aquí, y aquellos introducidos como parte de la estrategia de expresión o para fines de solubilización o purificación, se numeran en orden inverso (LE. de -C) a N-terminal) desde la posición 1, comenzando por la posición 0 (por ejemplo, 0, -1, -2, etc.).

La secuencia ECD puede derivarse de cualquier tipo o subtipo (por ejemplo, H1 a H16) de la cepa de la gripe. En una realización, la secuencia HA ECD es de una cepa seleccionada del grupo que consiste en: Una cepa HL, una H2, una H3, una H5, una H7 y una cepa de subtipo H9. Preferiblemente, el ECD es de una cepa H5 como una cepa H5N1.

Por ejemplo, el ECD de HA puede comprender o constar de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7. Codificación de ácidos nucleicos El ECD de HA puede comprender o constar de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en el SEQ ID NO: 8.

El término “señal hidrófoba” se refiere a un tramo de al menos 5 o al menos 6 aminoácidos hidrófobos, o se refiere a una estructura general donde los aminoácidos hidrófobos están expuestos en la superficie. Las señales hidrófobas pueden ser naturales o artificiales. Las señales hidrófobas naturales están presentes en las proteínas transmembranal celulares o virales. Cualquier señal hidrofóbica natural o artificial debe conservar la función original en la proteína, por ejemplo, en el caso de proteínas HA, la señal hidrofóbica debe tener la capacidad de orientar los trímeros HA en estructuras de roseta. La señal hidrófoba presente naturalmente en las proteínas HA se denomina dominio transmembranal .

Dominio transmembranal (TMD)

El dominio transmembranal puede consistir o comprender un TMD de longitud completa a partir de una proteína HA de tipo silvestre o un derivado de la misma. Cualquier derivado del mismo debe conservar la capacidad de orientar los trímeros de HA en estructuras de roseta y mantener la inmunogenicidad de HA. La estructura adecuada de la roseta se puede detectar utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, como la microscopía electrónica.

El dominio transmembranal también puede derivarse de cualquier tipo o subtipo (por ejemplo, H1 a H16) de la cepa de la gripe. En una realización, la secuencia de TMD de HA es de una cepa seleccionada del grupo que consiste en: una H1, una H2, una H3, una H5, una H7 y una cepa H9. Preferiblemente, el TMD es de una cepa H5 como una cepa H5N1. El TMD puede derivarse de la misma deformación o de una deformación diferente a las secuencias ECD. El TMD puede ser homóloga o heteróloga a el ECD. Por ejemplo, el TMD de HA puede comprender o constar de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 o un derivado de esta secuencia que conserva la capacidad de orientar los trímeros de HA en estructuras de roseta y mantiene la inmunogenicidad de HA. Codificación de ácidos nucleicos El TMD de HA puede comprender o constar de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en el SEQ ID NO: 6 o un derivado de esta secuencia que codifica un TMD que conserva la capacidad de orientar los trímeros de HA en estructuras de roseta y mantiene la inmunogenicidad de HA.

Dominio de clasificación

Un dominio de trimerización adecuado es aquel que induce a los monómeros rHA a formar trímeros. Preferiblemente, el dominio de trimerización es o se deriva del dominio de trimerización natural de T4 fago fibritina “foldón”. Se puede utilizar una secuencia de foldón de 29 aminoácidos que forma una estructura de [3-hélice que comprende el término C del dominio de fibritina del bacteriófago T4. Otros dominios de trimerización adecuados incluyen cloranfenicol acetil transferasa (CAT) y un motivo de trimerización con cremallera de leucina derivado del activador de transcripción de levadura GCN4. Preferiblemente, el dominio de trimerización, como el foldón, se coloca en el término C del dominio extracelular HA y TMD (por ejemplo, el dominio STEM). Normalmente, el dominio de trimerización se fusiona a través de una región de enlace corto con la secuenciaHa .La región entre el dominio de trimerización y la secuencia de HA puede incluir una secuencia de enlace escindible, por lo que es posible aislar la secuencia de HA de la trimerización en etapas posteriores. Por lo tanto, la secuencia HA (que incluye el ECD y el TMD) puede vincularse (por ejemplo, en orden), opcionalmente a través de una secuencia de enlace, a una secuencia heteróloga que comprende un sitio de fragmentación de proteasa, el dominio de trimerización y una etiqueta de purificación como la etiqueta de histidina para ayudar en la purificación. Estos dominios heterólogos de trimerización pueden estar vinculados a las secuencias de HA mediante técnicas conocidas en la técnica, como la clonación molecular.

Por ejemplo, el dominio de trimerización puede comprender o constar de la secuencia de aminoácidos foldón que se muestra en SEQ ID NO: 9 o una derivada de esta secuencia que mantiene la capacidad de inducir a los monómeros RHA para formar trímeros. Codificación de ácidos nucleicos El dominio de trimerización puede constar o comprender el NÚM. DE ID de SEQ: 10 o un derivado de esta secuencia que mantiene la capacidad de inducir monómeros de rHA expresados para formar trímeros, por ejemplo, según se evalúe mediante microscopía electrónica.

Métodos de preparación de rHA

El uso de la tecnología de ADN recombinante para producir vacunas contra la gripe ofrece varias ventajas. Esto incluye evitar los pasos de adaptación y paso de virus infecciosos en los huevos y la producción de proteínas más altamente purificadas en condiciones más seguras y controladas más rigurosamente. Además, no se debe incluir ningún paso de inactivación de virus. Se puede utilizar cualquier sistema de clonación y expresión adecuado para producir de forma recombinante el antígeno rHA.

Las secuencias de nucleótidos que codifican los antígenos rHA de la invención pueden ser sintetizadas, y/o clonadas y expresadas de acuerdo con técnicas bien conocidas por los presentes en la técnica, véase, por ejemplo, Sambrook,et al,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos se optimizarán para una célula huésped receptora en particular utilizando metodologías estándar. Por ejemplo, un construcción de ADN que codifica una secuencia de hemaglutinina puede optimizarse para su expresión en otros huéspedes, por ejemplo, bacterias, células de mamíferos o insectos. Las células huésped adecuadas pueden incluir células bacterianas comoE. coli,células fúngicas como la levadura, células de insectos como Drosophila S2, Spodoptera Sf9, Sf00+ o Hi-5 y células animales como CHO.

Las secuencias de hemaglutinina se pueden producir mediante métodos recombinantes estándar conocidos en la técnica, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR con transcriptasa inversa, la ingeniería inversa o el ADN se pueden sintetizar. Para PCR, los cebadores pueden prepararse utilizando secuencias de nucleótidos de hemaglutinina que están disponibles en bases de datos disponibles públicamente. Las construcciones de polinucleótidos pueden ensamblarse a partir de casetes de PCR y clonarse secuencialmente en un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en una célula huésped.

Un vector recombinante puede introducirse en la célula huésped mediante inyección, transfección o electroporación u otros métodos (por ejemplo, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación). También están disponibles reactivos comerciales de transfección como la lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA).

El antígeno rHA se puede recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos conocidos en la técnica, incluida la cromatografía de intercambio de aniones y/o cationes, y la cromatografía de afinidad. Técnicas como SDS-PAGE se pueden utilizar para analizar fracciones de proteína eluidas a partir de estas técnicas de separación/purificación. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y no se presentarán en detalle aquí.

El plegado adecuado del antígeno rHA se puede determinar, por ejemplo, utilizando el ensayo de hemaglutinación de glóbulos rojos, por la capacidad de la proteína para unirse a un receptor de la gripe, mediante pruebas de inmunogenicidad de 10 en un animal huésped y/o determinación de la capacidad de la proteína para asumir una estructura cuaternaria adecuada, como la formación de rosetas.

Preferiblemente se utiliza un sistema de expresión de baculovirus, que se describe a continuación.

Sistema de expresión de baculovirus

Cuando se utiliza un sistema de expresión de baculovirus, el antígeno rHA de interés junto con cualquier secuencia heteróloga (por ejemplo, secuencias HA junto con el dominio de trimerización) se puede insertar en un vector de expresión de baculovirus. Los baculovirus recombinantes que expresan genes extraños se pueden hacer por recombinación homóloga entre el ADN del baculovirus y los plásmidos que contienen el inserto, utilizando técnicas bien conocidas. La inserción puede, por ejemplo, hacerse de modo que el inserto esté bajo el control de transcripción del promotor poliedro, el promotor del baculovirus.

Ejemplo de vectores de expresión de baculovirus incluyendo un vector derivado del bien caracterizado virus de poliedrosis nuclearAutographa californica(AcNPV) que se replica eficientemente en células de insectos cultivados susceptibles.

Cualquier célula huésped de insecto adecuada se puede utilizar para producir el antígeno de la HA recombinante, incluyendo pero no limitado a las células Sf900+, Sf9 o Hi-5. Preferiblemente, la célula huésped del insecto es Sf9 o Hi-5. Las células se pueden propagar con un medio de cultivo y condiciones de cultivo que se sabe que son adecuadas para la célula huésped seleccionada. Las células pueden propagarse, por ejemplo, en monocapa o en cultivo de suspensión libre.

La proteína RHA puede entonces aislarse de las células huésped usando métodos bien conocidos en la técnica.

Por ejemplo, el cultivo celular puede centrifugarse, el sobrenadante se recoge y se ejecuta a través de columnas de intercambio aniónico y/o catiónico apropiadas para purificar la proteína. Se pueden utilizar técnicas como SDS-PAGE y/o inmunotransferencia para comprobar la identidad e integridad de las proteínas. Una fracción de interés que contiene rHA puede ser purificada aún más, por ejemplo, pasando a través de una columna de níquel para que rHA mostrando una etiqueta de histidina se une al níquel en la columna.

El alcance de la trimerización y/o la multimerización (por ejemplo, la formación de rosetas) puede probarse, por ejemplo, mediante el entrecruzamiento de HA con el uso de un agente reticulante adecuado y, a continuación, el uso de técnicas de migración de geles, como bien se conoce en la técnica. Otras técnicas incluyen microscopía electrónica o técnicas basadas en espectroscopia que también son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Formación Rosette

En una realización, el antígeno rHA de la presente invención se encuentra en forma de rosetas. Las rosetas constan de multímeros de los trímeros HA que tienen una estructura similar a una roseta. Las rosetas son visibles, por ejemplo, en un microscopio electrónico. También se pueden utilizar técnicas más cuantitativas para medir la formación de rosetas, incluida la filtración en gel y las técnicas basadas en espectroscopía. Las rosetas generalmente comprenden 20-100 trímeros/partícula HA. El tamaño de partícula de las estructuras de roseta varía de 20-40 nanómetros (nm) de longitud. Sedimentos HA como roseta compuesta de 5-6 trímeros sobre el intervalo de pH 7,4-7,5 (Remetaet al2002, Biochem. 41,2044-2054). Se cree que las porciones C-terminal hidrófilas de los trímeros HA se concentran juntas en una región central de la cual las regiones hidrotróficas se reproducen como una estructura de copo de nieve o roseta.

Composición inmunogénica

En otro aspecto, se proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno de la HA de la invención y un portador médicamente aceptable.

En una realización, dicha composición comprende además un adyuvante. Preferiblemente, el adyuvante es un adyuvante de emulsión de aceite en agua. Los adyuvantes de emulsión de aceite en agua, como MF59 o AS03 son bien conocidos en la técnica y se describen a continuación.

En una realización, la composición es monovalente, es decir, solo comprende una HA de gripe. En realizaciones alternativas, la composición es multivalente, es decir, comprende múltiples antígenos del virus de la gripe. Por ejemplo, la composición puede ser bivalente, trivalente o cuadrivalente, por ejemplo, puede contener dos o tres cepas estacionales con el rHA de la invención.

Adyuvante

En una realización, una composición inmunogénica de la invención comprende un adyuvante. En particular, el adyuvante puede ser una emulsión, como una emulsión de aceite en agua. Opcionalmente, otros inmunoestimulantes pueden estar presentes en la emulsión de aceite en agua. En una realización específica, una emulsión de aceite en agua comprende un aceite metabolizable, aceite no tóxico como escualeno o escualano, opcionalmente un tocol como tocoferol en particular alfa tocoferol y un emulsionante (o surfactante) como el surfactante no iónico polioxietileno sorbitán monooleato (TWEEN-80TM). Se pueden utilizar mezclas de surfactantes, como mezclas de polioxietileno sorbitán monooleato/trioleato de sorbitán, o mezclas de polioxietileno sorbitán monooleato/t-octilfenoxipolietioxioxietanol.

Los tocoles (por ejemplo, la vitamina E) también se utilizan en emulsiones de aceite adyuvantes (EP0382271B1; US5667784; WO95/17210). Los tocoles utilizados en emulsiones de aceite (opcionalmente emulsiones de aceite en agua) pueden formularse como se describe en US5650155A; US5667784A; EP0382271B1, en el sentido de que los tocoles pueden ser dispersiones de gotitas de tocol, opcionalmente compuestos por un emulsionante, opcionalmente de menos de 1 micrones de diámetro. Alternativamente, los tocoles pueden usarse en combinación con otro aceite, para formar la fase de aceite de una emulsión de aceite. Aquí se describen ejemplos de emulsiones de aceite que pueden utilizarse en combinación con el tocol, como los aceites metabolizables descritos anteriormente. En una emulsión de aceite en agua, el aceite y el emulsionante deben estar en un portador acuoso. El portador acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato o un tampón citrato. Un ejemplo de una emulsión de aceite en agua que contiene tocol es AS03.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, como escualeno, Tween 80 y opcionalmente alfa tocoferol. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85TM y/o lecitina.

En un aspecto, la emulsión de aceite en agua tiene una de las siguientes composiciones:

- De 0,5 a 11 mg de escualeno, de 0,05 a 5 % de polioximetileno sorbitán monooleato (TWEEN-80™ o POLISORBATO 80™) y opcionalmente, de 2 a 12 % de alfa-tocoferol; o

- Aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0,5 % de polioxietileno sorbitán monooleato (TWEEN-80TM o POLISORBATO 80TM) y aproximadamente 0,5 % de trioleato de sorbitán (SPAN 85TM). Este adyuvante se llama MF59.

Un adyuvante alternativo que puede utilizarse con las composiciones, vacuna o antígeno según la presente invención, comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina (por ejemplo, QS21) presentada en forma de liposoma y lipopolisacárido (por ejemplo, 3D-MPL), opcionalmente, incluyendo un esterol (colesterol). En una realización, el adyuvante comprende o consiste en una saponina (por ejemplo, QS21) presentada en forma de un liposoma, un lípido derivado como 3D-MPL y un esterol (por ejemplo, colesterol). Los liposomas contienen adecuadamente un lípido neutro, por ejemplo, fosfatidilcolina, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) o dilauril fosfatidilcolina. Los liposomas también pueden contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de la estructura del liposoma-QS21 para los liposomas compuestos de lípidos saturados. Un ejemplo de tal adyuvante es AS01, que comprende 3D- MpL y QS21 en una forma apagada con colesterol, y se puede hacer como se describe en WO96/33739. Se pueden utilizar las formas AS01B o AS01E de este adyuvante. El adyuvante AS01 B comprende liposomas, que a su vez comprenden dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), colesterol y 3D-MPL (en una cantidad de aproximadamente 1000 microgramos DOPC, 250 microgramos de colesterol y 50 microgramos de 3D-MPL por dosis de vacuna), QS21 (50 microgramos/dosis), tampón de NaCI de fosfatos y agua hasta un volumen de 0,5 ml.

El adyuvante AS01E comprende los mismos ingredientes que AS01 B pero a una concentración más baja en una cantidad de aproximadamente 500 microgramos DOPC, 125 microgramos de colesterol, 25 microgramos de 3D-MPL y 25 microgramos de QS21, tampón de NaCI de fosfato y agua hasta un volumen de 0,5 ml.

Pauta posológica de vacunación, dosificación y criterios de eficacia

Adecuadamente, las composiciones inmunogénicas para su uso de acuerdo con la presente invención son una dosis inyectable estándar de 0,5 ml en la mayoría de los casos, y contienen 15 pg o menos, de componente de antígeno de hemaglutinina de una cepa del virus de la gripe, medida por inmunodifusión radial única (SRD) (J.M. Woodetal:J. M Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Woodetal.,J Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). Adecuadamente, el volumen de dosis de la vacuna será de 0,25 a 1 ml, en particular un volumen de dosis de vacuna estándar de 0,5 ml o 0,7 ml. Se realizará una ligera adaptación del volumen de dosis de forma rutinaria en función del concentrador de HA) en la muestra a granel original y dependiendo también de la vía de administración con dosis más pequeñas administradas por vía intranasal o intradérmica. Adecuadamente dichas composiciones inmunogénicas para su uso según la invención contienen una cantidad baja de antígeno de la HA, por ejemplo, cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14 pg de HA por cepa del virus de la gripe o que no exceda de 15 pg de HA por cepa. Dicha cantidad baja de HA puede ser lo más baja posible, siempre que permita formular una vacuna que cumpla con la norma internacional, por ejemplo, la UE o la FDA, para su eficacia, tal y como se detalla a continuación (véase la Tabla 1 y los parámetros específicos establecidos). Una cantidad baja adecuada de HA es de 1 a 7,5 pg de HA por cepa del virus de la gripe, adecuada de 3,5 a 5 pg, como 3,75 o 3,8 pg de HA por cepa del virus de la gripe, usualmente alrededor de 5 pg de HA por cepa del virus de la gripe. Otra cantidad adecuada de HA es de 0,1 a 5 pg de HA por cepa del virus de la gripe, adecuada de 1,0 a 2 pg de HA por cepa del virus de la gripe, como 1,9 pg de HA por cepa del virus de la gripe.

El medicamento antigripal (por ejemplo, la composición inmunogénica) de la invención cumple adecuadamente ciertos criterios internacionales para las vacunas. Las normas se aplican internacionalmente para medir la eficacia de las vacunas contra la gripe.

Las variables serológicas se evalúan según los criterios de la Agencia Europea para la Evaluación de Medicamentos de Uso Humano (CHMP/BWP/214/96, Comité de Medicamentos Patentados (CPMP). Nota para la armonización de los requisitos para las vacunas contra la gripe, 1997. Circular CHMP/BWP/214/96 N°96-0666:1-22) para ensayos clínicos relacionados con los procedimientos anuales de concesión de licencias de vacunas contra la gripe (Tabla a continuación).

Tabla 1: Criterios CHMP

* La tasa de seroconversión se define como la proporción de sujetos en cada grupo que tienen una valoración de protección posterior a la vacunación > 1:40. La tasa de seroconversión es el % de sujetos que tienen una valoración de HI antes de la vacunación de <1:10 y >1:40 después de la vacunación. Sin embargo, si la valoración inicial es >1:10, entonces debe haber al menos un aumento de cuatro veces en la cantidad de anticuerpos después de la vacunación.

** El factor de conversión se define como el aumento del pliegue en las valoraciones medias geométricos (GMT) de HI en suero después de la vacunación, para cada cepa de vacuna.

*** La tasa de protección se define como la proporción de sujetos que fueron seronegativos antes de la vacunación y tienen una valoración de HI (protector) posterior a la vacunación > 1:40 o que fueron seropositivos antes de la vacunación y tienen un aumento significativo de 4 veces en la valoración posterior a la vacunación; normalmente se acepta como protección indicativa.

Los requisitos son diferentes para las poblaciones adultas (18-60 años) y las poblaciones de edad avanzada (>60 años). Para las vacunas interpandémicas contra la gripe, al menos una de las evaluaciones (factor de seroconversión, tasa de seroconversión, tasa de seroprotección) debe cumplir los requisitos europeos, para todas las cepas de gripe incluidas en la vacuna. La proporción de valoraciones iguales o superiores a 1:40 se considera más relevante porque se espera que estas valoraciones sean la mejor correlación de protección (Beyeret al.(1998) Clin Drug Invest 15:1).

Las composiciones que deben utilizarse de acuerdo con la presente invención cumplen adecuadamente al menos uno de estos criterios para la cepa del virus de la gripe incluida en la composición (un criterio es suficiente para obtener la aprobación), adecuadamente al menos dos, o usualmente al menos los tres criterios de protección. Adecuadamente, la(s) respuesta(s) anterior(s) se obtiene(n) después de una dosis, o después de dos dosis.

Uso médico

En una realización adicional, el antígeno de la HA o la composición inmunogénica que comprende dicho antígeno se utiliza en medicina, como para su uso en la prevención o vacunación contra la gripe, por ejemplo, administrada a una persona (por ejemplo, sujeto) en riesgo de infección por gripe.

En una realización aún más, el antígeno de la HA o la composición inmunogénica que comprende dicho antígeno se utiliza en la prevención de la gripe causada por un clado diferente al clado en donde se basó el antígeno de la HA. Por ejemplo, un antígeno H5N1 clado 1 HA podría utilizarse para la protección contra la gripe causada por un virus no clado 1, por ejemplo, un virus H5N1 clado 2.

Por lo tanto, un método de prevención y/o tratamiento contra la enfermedad de la gripe, puede emplear la administración de un antígeno o composición inmunogénica como se describe en este documento a una persona que lo necesite, por ejemplo, a una persona (por ejemplo, un sujeto) en riesgo de infección por la gripe, por ejemplo, una persona de edad avanzada (50 años o más, especialmente de 65 años o más).

En una realización del método o uso descrito anteriormente, se administran menos de 15 microgramos, como de 3,75 a 10 microgramos de HA por dosis.

El rHA de la invención puede encontrar uso en una dosis inferior a 10 microgramos, o inferior a 8 microgramos, o de 1 a 7,5 microgramos, o de 1-5 microgramos de rHA en un régimen de vacunación para la prevención de la gripe, en donde las secuencias de hemaglutinina son de, o derivado de una cepa de gripe identificada por una organización internacional como la OMS que monitorea los brotes de virus de la gripe, como asociados con un brote de pandemia o como que tienen el potencial de asociarse con un futuro brote de pandemia.

Vías de administración

La composición de la invención puede administrarse por cualquier vía de administración adecuada, como intradérmica, mucosa (por ejemplo, intranasal), oral, intramuscular o subcutánea. Otras rutas de entrega son bien conocidas en la técnica.

La vía de administración intramuscular es particularmente adecuada para la composición adyuvada de la gripe. La composición de acuerdo con la invención puede presentarse en un contenedor de monodosis, o alternativamente, un contenedor de multidosis, especialmente adecuado para una vacuna pandémica. En este caso, puede haber un conservante antimicrobiano como el tiomersal para evitar la contaminación durante el uso. Una concentración de tiomersal de 5 gg/0,5 ml dosis (es decir, 10 gg/ml) o 10 gg/0,5 ml dosis (es decir, 20 gg/ml) está adecuadamente presente. Se podría utilizar un dispositivo de administración IM adecuado, como un dispositivo de inyección de líquido sin aguja, por ejemplo el Biojector 2000 (Bioject, Portland, OR). Alternativamente, un dispositivo de lápiz inyector, tal como se utiliza para la administración en el hogar de epinefrina, podría usarse para permitir la autoadministración de la vacuna. El uso de estos dispositivos de entrega puede ser especialmente adecuado para campañas de inmunización a gran escala, como las que se requerirían durante una pandemia.

La administración intradérmica es otra ruta adecuada. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para la administración intradérmica, por ejemplo, dispositivos de aguja corta. Tales dispositivos son bien conocidos en la técnica. Las vacunas intradérmicas también pueden administrarse mediante dispositivos que limiten la longitud efectiva de penetración de una aguja en la piel, como los descritos en los artículos WO99/34850 y EP1092444, incorporados aquí por referencia, y sus equivalentes funcionales. También son adecuados los dispositivos de inyección de chorro que suministran vacunas líquidas a la dermis a través de un inyector de chorro líquido o a través de una aguja que perfora el estrato córneo y produce un chorro que llega a la dermis. También son adecuados los dispositivos de entrega de polvo balístico / partículas que utilizan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel a la dermis. Además, las jeringas convencionales se pueden utilizar en el método clásico mantoux de administración intradérmica.

Otra vía de administración adecuada es la vía subcutánea. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para la administración subcutánea, por ejemplo, la aguja clásica. Adecuadamente, se utiliza un servicio de inyector de chorro sin aguja. Tales dispositivos son bien conocidos en la técnica. Adecuadamente dicho dispositivo está precargado con la formulación líquida de la vacuna.

Alternativamente, la vacuna se administra por vía intranasal. Usualmente, la vacuna se administra localmente 16 en el área nasofaríngea, adecuadamente sin ser inhalada en los pulmones. Es deseable utilizar un dispositivo de administración intranasal que administre la formulación de la vacuna al área nasofaríngea, sin o sustancialmente sin que ingrese a los pulmones.

Los dispositivos adecuados para la administración intranasal de las vacunas según la invención son los dispositivos de pulverización. Entre los dispositivos de pulverización nasal disponibles comercialmente se incluyen AccusprayTM (Becton Dickinson). Los nebulizadores producen un spray muy fino que puede ser fácilmente inhalado en los pulmones y por lo tanto no llega eficientemente a la mucosa nasal. Por lo tanto, no se prefieren los nebulizadores. Los dispositivos de pulverización adecuados para uso intranasal son dispositivos para los que el rendimiento del dispositivo no depende de la presión aplicada por el usuario. Estos dispositivos se conocen como dispositivos de umbral de presión. El líquido se libera de la boquilla sólo cuando se aplica una presión umbral. Estos dispositivos hacen que sea más fácil lograr un spray con un tamaño de gota regular. Los dispositivos de umbral de presión adecuados para su uso con la presente invención son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en WO 91/13281 y EP 311863 B y EP 516636, incorporados aquí como referencia. Estos dispositivos están disponibles comercialmente en Pfeiffer GmbH y también se describen en Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999.

Alternativamente, la vía de vacunación epidérmica o transdérmica también se contempla en la presente invención.

La enseñanza de todas las referencias en la presente solicitud, incluidas las solicitudes de patentes y las patentes concedidas, se incorporan completamente por referencia. Cualquier solicitud de patente a la que esta solicitud reclame prioridad se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad en la forma descrita en el presente para publicaciones y referencias.

Para evitar dudas, los inventores pretenden que los términos “que comprende”, “comprende” y “comprendido” sean sustituibles opcionalmente por los términos “que consiste en”, “comprende de” y “comprendido de”, respectivamente, en todos los casos.

La invención se describirá más detalladamente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, no limitantes:EJEMPLOS

Ejemplo 1: Diseño y construcción del antígeno de hemaglutinina (HA) ECD-TMD-Foldón

El antígeno de hemaglutinina (HA) se modificó en base a una proteína HA nativa de la cepa A/Indonesia/05/2005 H5N1. En el N-terminal, el péptido señal HA fue reemplazado por gp67, que es una secuencia de señal codificada por baculovirus muy efectiva para la secreción de proteínas (Whitfordet al1989, J Virol. 63, 1393-1399). Dominio transmembranal (TMD), necesario para la formación de roseta, así como foldón del dominio de trimerización (del bacteriófago T4 fibritina) (Meieret al2004, 1 mol. Biol. 344, 1051-1069), necesarios para la trimerización de monómeros HA, fueron aguas abajo de la secuencia HA (ECD). Finalmente, se añadió una etiqueta poli-HIS en el C-terminal para facilitar la purificación del antígeno recombinante.

La Figura 1 muestra la composición del construcción inicia el ECD-Foldón y el de ECD-TMD-Foldón. ECD-Foldón fue un regalo del Centro para el Control de Enfermedades (CDC, Atlanta, EE.UU.). Este construcción fue incorporado en el plásmido pAcGP67, un vector de transferencia de baculovirus que contiene la secuencia de señales gp67 frente al ECD-Foldón. ECD-Foldón fue utilizado como plantilla para preparar el otro construcción y fue producido por primera vez por la transformación de células electrocompetentes TOP10Escherichia coli(Tecnologías de Vida). El ADN plasmídico de ECD-Foldón fue purificado por Maxiprep (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó para construir ECD-TMD-Foldón mediante la inserción de la TM entre ECD y Foldón por mutagénesis dirigida al sitio. Para eso, un megacebador fue generado por primera vez por PCR. Los cebadores consistieron en secuencias complementarias al vector pAcGP67 junto con secuencias TM, y la plantilla fue de longitud completa HA de la cepa A/Indonesia/05/2005 en plásmido TOPO. Después de la reacción de PCR, el megacebador se purificó en gel de agarosa con un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Se realizó una reacción consecutiva a la mutagénesis en las siguientes condiciones: 7,5 pl 10 x tampón de reacción, 2 pl dNTP (10 mM), plantilla de ADN de 100 ng que contiene ECD-Foldón; 150 ng de Megacebador, 2 pl de ADN PfuUltra h F (2,5 U/pl), para un volumen total de 50 pl. Las condiciones de PCR fueron de 95 °C durante 1 min y luego 5 ciclos que constaron de 50 s a 95 °C, 1 min a 52 °C, 22 min a 68 °C, seguidos de 13 ciclos que constaron de 50 s a 95 °C, 1 min a 55 °C, y 22 min a 68 °C. A partir de entonces, la plantilla de ADN fue removida por digestión Dpn I (Promega). El producto de la PCR se utilizó para transformar TOP10 células electrocompetentes. Se realizó el procedimiento de purificación Miniprep en colonias positivas y se confirmó la validez de la construcción mediante secuenciación. La Figura 2 revela las secuencias completas de aminoácidos de ECD-Foldón y ECD-TMD-Foldón. También se muestra la secuencia de la molécula de HA recombinante de longitud completa que se ha utilizado como comparador, particularmente en estudios de inmunogenicidad.

Ejemplo 2: Producción y purificación de ECD-TMD-Foldón

El construcción fue insertado en baculovirus. Para ello, las células Hi-5 en el medio SF-900 II que contenía 264 g/l de NaCI se sembraron en una placa de 6 pocillos a una concentración de 1 x 106 células/pocillo. Cincuenta ng del plásmido de transferencia que contenía la secuencia ECD-TMD-Foldón se mezclaron con 20 ng de BAC vector 3000 y 100 pl de reactivo de Celfectina (tecnología LIFE; cat 10362-010) en medio SF-900 II e incubaron durante 30 min Luego, se agregaron 800 pl de medio a la mezcla de transfección y la solución se distribuyó entre los pozos. Después de 5 h de incubación, la mezcla fue removida y reemplazada con 2 ml de medio. La incubación se produjo a 27 °C durante 4 días.

Las células y el medio se recogieron de las placas de 6 pocillos, se transfirieron en tubos de centrífuga y se centrifugaron para separar las células del medio que contenía virus. El sobrenadante se utilizó para infectar las células Hi-5. Los clones positivos se seleccionaron en función de la expresión de proteínas recombinantes (comprobada por inmunotransferencia tipo Western) y se utilizaron para generar reservas de virus.

Para purificar ECD-TMD-Foldón, un total de 5-10 litros de una suspensión de células Hi-5 (ajustado a 2 x 106 células/ml en SF500 frascos de batido) fue infectado con baculovirus modificado por ECD-TMD-Foldón con una multiplicidad de infección = 1. La cosecha ocurrió 56-65 h después de la infección. La suspensión se centrifugó a 200 x g durante 30 min y el sobrenadante se descartó. A continuación, se añadieron 200-250 ml de tampón que contenía 1 % Tritón X100 a cada pellet para una incubación de 30 minutos a 4 °C en una placa de agitación para volver a suspender el pellet. La suspensión se centrifugó a 10000 x g durante 25 min y se mantuvo el sobrenadante que contenía ECD-TMD-Foldón. El ECD-TMD-Foldón recombinante se purificó a partir del sobrenadante mediante cromatografía de intercambio iónico a través de una columna de intercambio aniónico (Q sepharose Fast Flow, Amersham) seguida de una columna de intercambio catiónico (SP sepharose Fast Flow, Amersham). La molécula recombinante unida en la columna SP se eluyó por cambio de pH (5,9 a 7,2) y cambio de molaridad (NaCI 150 mM). Se utilizó electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) para identificar las fracciones de interés que contienen la molécula recombinante diana. Finalmente, un grupo de las fracciones interesantes seleccionadas se ejecutó a través de una columna de níquel para purificar aún más ECD-TMD-Foldón que muestra una etiqueta poli-HIS capaz de unir el níquel. El tampón de equilibrio fue de 50 mM de Tris, pH 8,0 NaCI - 150 mM e imidazol 10 mM. Las fracciones se eluyeron con concentraciones crecientes de imidazol. Las fracciones de interés se seleccionaron después de la ejecución en SDS-PAGE. El imidazol se eliminó por diálisis y la concentración de la muestra se ajustó a 1 mg/ml.

Ejemplo 3: Caracterización (incluida la formación de rosetas) de ECD-TMD-Foldón

Después de la purificación, se compararon los HA, ECD-Foldón y ECD-TMD-Foldón de longitud completa por microscopía electrónica (EM). Las muestras se prepararon para el análisis de tinción negativa EM de acuerdo con un método de tinción negativa estándar de dos pasos utilizando ácido fosfotúngstico como agente de contraste. Se aplicó una descarga de brillo en las rejillas para mejorar la adsorción del material en las rejillas.

Brevemente, una rejilla de níquel (malla 400) con película de formvar recubierta de carbono flotó en una gota de la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la adsorción del material. Se ha eliminado el exceso de solución. La rejilla se flotó brevemente en una gota de agua destilada para eliminar el exceso de sal y luego se transfirió en una gota de mancha preparada de la siguiente manera: 2 % (p/v) de fosfotungstato de Na en agua suplementada con trehalosa al 1 % (p/v). La rejilla se secó después de s. El material se dejó secar completamente y se examinó por microscopía electrónica de transmisión bajo un LEO Zeiss EM9120 a 100 kV.

Los resultados se muestran en las figuras 3A, 3B y 3C. ECD-Foldón apareció como estructuras de aproximadamente 10 nm. En contraste, tanto las microfotografías HA como las ECD-TMS-Foldón de longitud completa mostraron componentes que oscilaban entre 10 y 50 nm. Esto indica que ECD-TMD-Foldón puede ensamblarse como una estructura trimérica y puede formar roseta, de manera similar a HA de longitud completa.

Ejemplo 4: ECD-TMD-Foldón es inmunogénico y provoca anticuerpos neutralizantes

El principal inconveniente del construcción ECD-Foldón fue su muy pobre inmunogenicidad, en comparación con el antígeno de la HA dividido. Uno de los factores críticos para la inmunogenicidad de los antígenos recombinantes de HA es la posibilidad de oligomerizar y formar rosetas. La formación de rosetas resulta de la interacción de varias moléculas HA a través de su dominio transmembranal . Por lo tanto, el dominio transmembranal se ha insertado en ECD-Foldón con el objetivo de permitir la formación de roseta y aumentar la inmunogenicidad, dando como resultado el construcción ECD-TMD-Foldón.

Evaluar la inmunogenicidad de las diferentes construcciones en ratone hembra C57BI/6 (8-10 semanas de edad; 5, 10 o 11 ratones/grupo)) fueron inmunizados en los días 0 y 21 con ECD-Foldón (6 o 24 gg), ECD-TMD-Foldón (1,5, 6 o 24 gg), HA recombinante de longitud completa (1,5, 6 o 24 gg), antígeno dividido A/Indonesia/05/2005 (1,5 gg) o control negativo de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Todos los antígenos fueron adyuvados con AS03, un sistema adyuvante que contiene o-tocoferol y escualeno en una emulsión de aceite en agua (Gargonet al2012, Expert. Rev. Vaccines 11,349-366). Se tomó sangre los días 21 (3 semanas después de la dosis I) y 42 (3 semanas después de la dosis II).

Los anticuerpos anti-A/Indonesia/05/2005 se determinaron mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Para ello, las placas de microvaloración se cubrieron durante la noche con antígeno dividido A/Indonesia/05/2005 (1 gg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco [DPBS]) a 4 °C. Después de la saturación de los sitios específicos por un tampón de saturación (sin suero), se añadieron diluciones seriadas de dos veces de los sueros de ratón a los pocillos y se incubaron durante 1,5 h a 37 °C. Las diluciones se realizaron en el búfer de saturación. Después de lavar los pocillos con PBS-Tween al 0,1 %, se añadió el anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (Sigma, A5278) e incubó durante 1 h a 37 °C. Los anticuerpos unidos se revelaron mediante la adición del sustrato de peroxidasa ortofenilendiamina en presencia de peróxido de hidrógeno durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 2 N y las placas se leyeron en un lector de placas de microvaloración. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Se observó que ECD-TMD-Foldón es más inmunogénico que ECD-Foldón, pero no provoca niveles tan altos de anticuerpos como el antígeno dividido correspondiente.

Las respuestas inmunitarias humorales también se evaluaron mediante la medición de valoraciones de anticuerpos contra la inhibición de la hemaglutinación (HI). El día anterior al ensayo, se añadieron 50 gl de enzima destructora del receptor (RDE; filtrado de cólera; Sigma C-8772), diluidos al 25 % en DPBS, a 12,5 gl de muestra de suero de ratón y la mezcla se incubó 18 h a 37 °C. Luego, se añadieron 37,5 gl de citrato de sodio al 2,5 % a la mezcla e incubaron 30 min a 56 °C, y se añadió DPBS para un volumen total de 125 pl. Después de la centrifugación, el sobrenadante se diluyó l/10 veces y las diluciones dobles seriadas del mismo se pipetearon en una microplaca. A cada pocillo se añadieron 25 gl de una suspensión de virus (4 UHA en DPBS) para una incubación de 30 min a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 50 gl de eritrocitos equinos (1 % en DPBS) e incubaron durante 1,5-2 h a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la Figura 5. Todos los grupos ECD-TMD-Foldón, HA recombinante de longitud completa y antígeno dividido fueron diferentes de los dos grupos ECD-Foldón y no diferentes entre sí 3 semanas después de la segunda inmunización (ANOVA de una sola dirección seguida por Tuckey-HSD posprueba).

La funcionalidad de los anticuerpos inducidos por la inmunización se evaluó mediante un ensayo de neutralización de la gripein vitro.Para ello, la muestra de suero de ratón se diluyó en serie dos veces y las diluciones se dejaron caer en una placa de microvaloración (100 pl/pocillo). A las muestras se añadieron 50 pl de solución viral (2000 TCID50/ml) y se incubó la mezcla durante 1,5 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, se añadieron 100 pl de suspensión celular de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (2,4 x 105 células/medio de cultivo celular MI) por pocillo. La placa de microvaloración se colocó en una incubadora (35 °C con 5 % de CO2) durante 5-7 días. Después de la incubación, 50 pl de los sobrenadantes de cada pocillo se transfirieron a otra placa de microvaloración. A cada pocillo se añadieron 50 pl de eritrocitos de pollo (0,5 % en PBS) e incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la Figura 6. Todos los grupos ECD-TMD-Foldón, HA recombinante de longitud completa y antígeno dividido fueron diferentes de los dos grupos ECD-Foldón y no diferentes entre sí 3 semanas después de la segunda inmunización (ANOVA unidireccional seguida de Tuckey-HSD después de la prueba).

Las figuras 7 y 8 muestran las actividades neutralizantes y de HI, respectivamente, en relación con los niveles de anticuerpos. Las relaciones para ECD-TMS-Foldón están en el mismo intervalo que las relaciones obtenidas para el antígeno dividido.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un antígeno recombinante de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe que comprende el dominio extracelular (ECD) de HA, una señal hidrófoba que es un dominio transmembranal (TMD) de HA, y un dominio de trimerización heterólogo, en donde el antígeno de la HA carece del dominio intracelular de la hemaglutinina de la gripe y el antígeno de la HA recombinante forma estructuras de rosetain vivoy/oin vitro.

2. El antígeno de la HA de la reivindicación 1 que además comprende una etiqueta His y/o un sitio de escisión de la enzima tal como un sitio de escisión de trombina.

3. El antígeno de la HA de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde:

(a) la hemaglutinina es de una cepa H1, H2, H3, H5, H7 o H9,

b) el dominio transmembranal de HA es heterólogo al dominio extracelular de dicha HA,

(c) la hemaglutinina es de una cepa H5,

(d) i) el ECD de HA consiste o comprende SEQ ID NO: 7, ii) el TMD de HA consiste o comprende SEQ ID NO: 5 y iii) el dominio de trimerización consiste o comprende SEQ ID NO: 9 y/o

(e) el antígeno de la HA comprende la secuencia de SEQ ID NO:1.

4. Un polinucleótido que codifica un antígeno de hemaglutinina como se describe en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4 que comprende i) SEQ ID NO: 8, ii) SEQ ID NO: 6 y iii) SEQ ID NO:10.

6. El polinucleótido de la reivindicación 4 que comprende SEQ ID NO:2.

7. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además un adyuvante, en donde opcionalmente el adyuvante es un adyuvante de emulsión de aceite en agua.

9. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7 o 8, en donde la composición es multivalente o monovalente.

10. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en medicina.

11. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en la prevención o la vacunación contra la enfermedad de la gripe.

12. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en la prevención y/o vacunación contra la gripe causada por un clado diferente al clado al que pertenece el dominio extracelular del antígeno de la HA.

13. Un métodoin vitropara producir un antígeno como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende expresar un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en una célula eucariota, como una célula de mamíferos, por ejemplo, una célula CHO, o una célula de insecto, que además comprende purificar/aislar la HA recombinante de la célula eucariota.