CN107001434A - 新型粉尘螨蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新型的粉尘螨蛋白质以及使用其的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断药、预防药和治疗药等。选自以下的(a)～(c)中的粉尘螨蛋白质或其片段肽。(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。(c)由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。

Description

新型粉尘螨蛋白质
技术领域
本发明涉及源自粉尘螨的新型蛋白质以及该蛋白质的利用。
背景技术
作为过敏性疾病的代表性疾病，可以列举花粉症等的过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性支气管哮喘、特应性皮肤炎等，但近年来，日本的这些过敏性疾病的患病率日趋增加。已知特应性支气管哮喘、特应性皮肤炎的发病原因的大部分是由包括螨虫的虫体、螨虫的排泄物、霉、宠物等动物的毛等在内的室内灰尘造成的，但是已知特别是在源自室内生存的尘螨的过敏原发挥了重要的作用。(非专利文献1)。
在室内生存的代表性的尘螨绝大多数由粉尘螨(Dermatophagoides Farinae，以下简称为“Der f”))和屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus，以下简称为“Der p”))构成。已知这些尘螨在温暖且湿润的条件下繁殖得最好，而在高气密化、高隔热化的建筑物增加的现代，一年中室内被保持在适于尘螨的条件的机会增大，其生存数量也增大。可以认为这是过敏性疾病的增加的原因的一个因素。
在这些过敏性疾病的治疗中，使用抗组胺药、类固醇系抗炎症药、抗白三烯药、脱颗粒抑制药、Th2细胞因子抑制药等，但所有都限于对症疗法。然而，近年来，以皮下过敏原免疫疗法(SCIT)、舌下过敏原免疫疗法(SLIT)为代表的过敏原免疫疗法相继开发。过敏原免疫疗法是通过在体内逐次少量投与过敏原来控制对于过敏原的免疫应答的治疗法，被认为这是目前能够根治过敏性疾病的唯一的方法。
在过敏原免疫疗法的开发中，关于作为原因的过敏原的研究和理解是必不可少的。例如，在日本被认为生存数量多的粉尘螨虫体和排泄物中被报告有被称为Der f1、Derf2、Der f3的抗原性高的过敏原，而且已经被克隆(非专利文献2、3)。另外，根据过去的报告，已知螨虫过敏的患者80％以上具有对这些抗原任意1种以上特异性的IgE(非专利文献4)。此外，也积极进行着粉尘螨过敏原的探索研究，对于以螨虫为原因的过敏性疾病的预防和治疗要求更加有用的新型过敏原蛋白质(非专利文献5)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Korsgaard J,et al.,Allergy,53：77-83,1998
非专利文献2：Dilworth RJ,et al.,Clinical and Experimental Allergy,21：25-32,1991
非专利文献3：Yuuki T.et al.,Jpn.J.Allegol.,39(6)：557-561,1990
非专利文献4：Heymann PW,et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,83：1055-1067,1989
非专利文献5：Thomas WR,et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.,129：1-18,2002
发明内容
发明所要解决的课题
本发明涉及提供新型的粉尘螨蛋白质、以及使用其的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断药、预防药和治疗药等。
用于解决课题的方法
本发明的发明人为了解决上述课题而进行研究的结果，从粉尘螨排泄物中，成功获得了与源自以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者的血清中的IgE显示高的反应性、分子量110kDa附近的新的蛋白质，而且发现其作为以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断药、预防药、治疗药有用。
即，本发明涉及以下的1)～14)。
1)选自以下的(a)～(c)中的粉尘螨蛋白质或其片段肽。
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
(c)由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
2)编码选自以下的(a)～(c)中的粉尘螨蛋白质或其片段肽的聚核苷酸。
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
(c)由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
3)选自以下的(d)～(f)中的聚核苷酸。
(d)由序列号1所示的碱基序列构成的聚核苷酸。
(e)与由与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的聚核苷酸在严格条件下杂交、编码具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质的聚核苷酸。
(f)由与序列号1所示的碱基序列具有90％以上的同一性的碱基序列构成、且编码具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质的聚核苷酸。
4)以上述1)的粉尘螨蛋白质或其片段肽为有效成分的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂。
5)以上述1)的粉尘螨蛋白质或其片段肽为有效成分的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断药。
6)与上述1)的粉尘螨蛋白质或其片段肽结合的结合蛋白质。
7)如上述6)所述的结合蛋白质，其为抗体分子。
8)如上述6)所述的结合蛋白质，其为单克隆抗体。
9)上述1)的粉尘螨蛋白质或其片段肽用于制造以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂的使用。
10)上述1)的粉尘螨蛋白质或其片段肽用于制造以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断药的使用。
11)如上述1)所述的粉尘螨蛋白质或其片段，其用于以肽粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗。
12)如上述1)所述的粉尘螨蛋白质或其片段，其用于以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断。
13)一种以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗方法，其中，对患者投与上述1)的粉尘螨蛋白质或其片段肽。
14)一种以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断方法，其中，对被测试者投与上述1)的粉尘螨蛋白质或其片段肽。
发明的效果
本发明的粉尘螨蛋白质由于与源自以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者的血清中的IgE显示高的反应性，所以能够在以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断、预防和治疗中利用。该粉尘螨蛋白质是与公知的粉尘螨过敏原、特别是Der f1(分子量约27kDa)、Der f2(分子量约15kDa)、Der f3(分子量约29kDa)不同的蛋白质，因此通过将它们组合，能够成为更有用的过敏原免疫疗法。
附图说明
图1是用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)解析粉尘螨粗提取液和粗纯化物(用利用FPLC的阴离子交换色谱分级)得到的图。
图2是表示使用以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者(RAST Score≥2)5名的血清的纯化过敏原特异性的IgE抗体效价的分析结果的图。
图3是表示使用以粉尘螨为原因的过敏患者疾病(2名)的末梢血的过敏原活性评价(嗜碱性粒细胞上的CD203c表达增强)的结果的图。图中百分数表示解析对象细胞中的P4门(gate)内分布(population)。
具体实施方式
粉尘螨蛋白质
本发明的粉尘螨蛋白质是选自以下的(a)～(c)中的蛋白质、或其片段肽。
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
(c)由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
(a)的由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质为由粉尘螨，通过利用FPLC的阴离子交换色谱分级(fraction)后，通过超滤法除去100kDa以下的蛋白而进行分离、纯化的蛋白质，具有以下的性质。
i)与以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者的血清中IgE显示结合反应。
ii)将以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者的嗜碱性粒细胞活化。
iii)由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量为约110kDa。
因此，该蛋白质是与以Der f1(分子量约27kDa)、Der f2(分子量约15kDa)、Der f3(分子量约29kDa)为代表的公知的粉尘螨过敏原不同的(非专利文献5)、新型的粉尘螨蛋白质。
在本发明的粉尘螨蛋白质中，只要具有粉尘螨过敏原活性，则包括由在该序列号2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质(上述(b))。作为包含这样的氨基酸序列的粉尘螨蛋白质，可以列举例如具有序列号2所示的氨基酸序列的粉尘螨蛋白质的同种型等。其中，被缺失、取代或添加的多个氨基酸是指例如1～10个、更优选1～5个氨基酸。另外，上述的添加包括在两末端的1～数个氨基酸的添加。
本说明书中，“过敏原”是指引起过敏性疾病的原因物质。另外，所谓“粉尘螨过敏原活性”不仅包括与肥大细胞上的IgE结合、对特应性的人引起速发型过敏反应的活性(DeWeck,AL.et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.,146:177-189,2008)，还包括仅与血清中的IgE结合的活性(参照实施例2(i))。
另外，本发明的粉尘螨蛋白质中，只要具有粉尘螨过敏原活性，则还包括将相当于序列号2所示的氨基酸序列的序列适当比对时，由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白质构成的蛋白质((上述(c))。
其中，与序列号2所示的氨基酸序列的同一性优选为95％以上，更优选为98％以上。该氨基酸序列的同一性例如能够适用使用BLAST(国家生物信息中心基本局部比对搜索工具，Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for BiologicalInformation)，以可选参数为初期设定值进行计算的方法。
另外，本发明的粉尘螨蛋白质可以为融合蛋白质质这样的较大蛋白质的一部分。其中，作为融合蛋白质中所添加的序列，可以列举例如多重组氨酸残基那样有助于纯化的序列、确保重组生产时的稳定性的添加序列等。
本发明的粉尘螨蛋白质可以仅是过敏原活性所必须的区域的片段肽。例如，优选列举包含特别是由以粉尘螨为原因的过敏患者疾病的T细胞所特异性识别的表位(T细胞表位)的部分片段。与HLA II类分子结合并抗原提呈的肽的长度，从肽解析的结果(Chicz,R.M.et al.,J.Exp.Med.,178:27-47,1993)来看，可以认为由约10～34的氨基酸残基构成，因此至少包含1个T细胞表位的片段也包括这样长度的肽。
T细胞表位能够通过利用10mer～20mer左右的重叠肽的研究、例如Jahn-SchmidB.J.et al.,Allergy Clin Immunol.126(5):1068-71,2010、Sone,T,et al.,J.Immunol.,161:448-457,1998等中记载的方法来鉴定。
编码粉尘螨蛋白质的聚核苷酸
本发明的聚核苷酸编码上述粉尘螨蛋白质或其片段肽，优选列举(d)由序列号1所示的碱基序列构成的聚核苷酸、(e)与由与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的聚核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质的聚核苷酸、(f)由与序列号1所示的碱基序列具有90％以上的同一性的碱基序列构成、且编码具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质的聚核苷酸。
(e)和(f)的聚核苷酸包括(d)的聚核苷酸的变异体。该变异体包括天然的等位基因变异体、使用该领域中公知的变异诱发技术能够生成的天然不存在的变异体。
本发明的聚核苷酸不仅包括双链DNA，还包括构成其的正义链和反义链等各种单链DNA、RNA。反义链能够作为探针等利用。DNA包括例如由克隆、化学合成技术或它们的组合所得到的cDNA、基因组DNA等。此外，本发明的聚核苷酸中，除了本发明的编码多肽的碱基序列以外，还可以包括非翻译区(UTR)的序列、载体序列(包含表达载体序列)等的碱基序列。
这里，所谓严格条件，可以列举例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Second Edition,J.Sambrook et.al,1989)中记载的条件等。即，可以列举在含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt和100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中，与探针一起，在65℃恒温8～16小时，使其杂交的条件等。
另外，与序列号1所示的碱基序列的同一性优选为95％以上，更优选为98％以上。该碱基序列的同一性能够适用例如使用BLAST、将可选参数作为初期设定值进行计算的方法。
编码粉尘螨蛋白质的聚核苷酸的取得
编码本发明的粉尘螨蛋白质的聚核苷酸能够由粉尘螨克隆，作为克隆方法，可以列举已知的方法，例如使用鸟枪法、PCR法进行的方法。
例如，制备与本发明的聚核苷酸的碱基序列的一部分特异性杂交的探针，使用该探针对于基因组DNA文库或cDNA文库进行筛选即可。作为这样的探针，只要为与本发明的聚核苷酸或其互补链的至少一部分特异性杂交的探针，则可以使用任何序列和长度的探针。
另外，本发明的聚核苷酸也能够通过用适当的原理取得与包含本发明的聚核苷酸的一部分或全部的聚核苷酸杂交的序列来获得。例如，可以列举使用包含上述的本发明的聚核苷酸的一部分的聚核苷酸作为引物进行的PCR法、使用包含上述的本发明的聚核苷酸的一部分的聚核苷酸作为探针的方法。
例如，使用PCR等扩增手段的方法，能够通过从本发明的聚核苷酸的5'侧和3'侧的序列(或其互补序列)中分别制备引物，使用这些引物以基因组DNA(或cDNA)等为模板进行PCR等扩增反应，将两引物之间所夹的DNA区域扩增，由此大量取得包含该聚核苷酸的DNA片段。
另外，本发明中提供的聚核苷酸例如也能够通过利用定向或随机的变异导入法等方法，改变由序列号1所示的碱基序列构成的聚核苷酸来制作。
这里，在定向地导入变异时的变异计划例如能够通过参考聚核苷酸序列上的特征性序列来进行。另外，作为随机地导入变异的方法，可以列举例如PCR法、利用突变原处理的方法。作为定向地导入变异的方法，可以列举部位特异性的突变诱导法，更具体而言，能够使用例如Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km试剂盒(TakaraBio)等进行。另外，也能够使用重组PCR法(PCR protocols,Academic Press,New York,1990)。
粉尘螨蛋白质的制造
本发明的粉尘螨蛋白质能够从粉尘螨分离纯化而得到。分离纯化方法没有特别限定，例如将粉尘螨提取液使用凝胶过滤、离子交换色谱法、亲和色谱等现有公知的方法分离、纯化即可。
另外，也能够将通过在适当的载体中插入本发明的聚核苷酸所制作的重组载体导入宿主细胞，使粉尘螨蛋白质在细胞内或细胞外表达，来采取。
用于插入本发明的聚核苷酸的载体只要能够在大肠杆菌、枯草杆菌等细菌、酵母或动物细胞等宿主中复制，就没有特别限定，可以列举例如质粒DNA、噬菌体DNA等。表达载体的构建所使用的载体DNA可以使用广泛普及的容易获得的载体。例如可以列举pUC19(Takara Bio)、pTV118N(Takara Bio)、pMAMneo(Clontech)、pGEX(GE Healthcare)、pET160(Invitrogen)、pDEST(Invitrogen)等。
在使用该重组载体转化宿主时，能够使用原生质体法、感受态细胞法、电穿孔法等进行。作为宿主，没有特别限制，能够使用所有宿主，例如能够使用动物、源自动物的细胞、植物、源自植物的细胞、微生物等。
所得到的转化体使用包含能够利用的碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基在适当的条件下培养即可。能够从这样得到的培养液中，通过一般的方法进行蛋白质的收集、纯化，得到本发明的粉尘螨蛋白质。
以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗
本发明的粉尘螨蛋白质或其片段肽与源自以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者的血清中IgE显示高的反应性，因此能够作为以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂，能够向患者给药，并用于以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗。
这里，以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗，具体是指对粉尘螨的特异性抗原为原因的所有过敏性疾病的预防或治疗，作为该过敏性疾病，可以列举例如特应性支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮肤炎等。
该以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗可以列举例如对以粉尘螨为原因的过敏性疾病的过敏原免疫疗法。
另外，本发明的粉尘螨蛋白质为与以现有公知的Der f1、Der f2为代表的过敏原不同的蛋白质，因此通过与它们组合，能够成为更加有用的过敏原免疫疗法。
使用本发明的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂作为过敏原免疫疗法剂的情况下，优选将粉尘螨蛋白质、或其片段肽直接或者干燥后制成粉末状，或者根据需要通过常规方法添加一般使用的各种添加剂、例如稳定剂、赋形剂、助溶剂、乳浊剂、缓冲剂、止痛剂、保存剂、着色剂等，调制成复方制剂。
例如，能够将粉末状的被纯化的粉尘螨蛋白质溶解到添加了苯酚的生理盐水中，用作过敏原免疫疗法用抗原的原液。
在使用本发明的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂作为过敏原免疫疗法剂的情况下，在投与时，能够包含具有免疫赋活作用的佐剂。作为佐剂，能够列举例如完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant(CFA))、不完全弗氏佐剂(IncompleteFreund's adjuvant(IFA))、明矾、脂质A、单磷酰脂质A、卡介苗BCG(Bacillus-Calmette-Guerrin)等的细菌制剂、CpG-DNA、dsRNA等的核酸、结核菌素等的细菌成分制剂、钥孔血蓝蛋白或酵母甘露聚糖等的天然高分子物质、胞壁酰三肽和胞壁酰二肽或它们的衍生物、明矾(alum)、非离子性嵌段共聚物、白细胞介素2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage colony stimulating Factor)(GM-CSF)、干扰素－α(IFN-α)、干扰素－β(IFN-β)等的细胞因子等，能够使用它们中的1种或组合2种以上使用。佐剂也可以与本发明的粉尘螨蛋白质、或其片段肽以混合状态、或作为乳液同时投与使用。
本发明的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂能够通过通常的给药途径例如经皮、经粘膜、经口、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、滴鼻等的给药方法进行。配合给药形态，可以制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、含片、舌下片、糖浆剂、注射剂、栓剂、吸入剂、经皮吸收剂、滴眼剂、滴鼻剂、鼻腔内喷雾剂、湿布剂、湿敷剂、软膏、乳剂、霜剂等的各种剂型的制剂。
本发明的以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂的给药量和给药次数根据给药途径、症状等的不同而不同，例如能够以每1次给药量为约0.1μg～100mg的范围的方式适当选择，以每周1次到数次左右给药。
以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断
本发明的粉尘螨蛋白质或其片段肽能够成为以粉尘螨为原因的过敏性疾病诊断药、具体而言对于以粉尘螨为原因的过敏性疾病的皮内反应诊断药，通过将其少量注射到被测试者的皮内，能够掌握生物体对于粉尘螨的过敏状态、免疫状态，用于抗原的确定、疾病的诊断。
在作为皮内反应诊断试剂使用的情况下，将通过上述方法取得的本发明的粉尘螨蛋白质或其片段肽例如进行干燥后制成粉末状，将其溶解于含有苯酚的生理盐水中，稀释使用。
与粉尘螨蛋白质或其片段肽结合的结合蛋白质
与本发明的粉尘螨蛋白质或其片段肽结合的结合蛋白质是能够与本发明的粉尘螨蛋白质或其片段肽特异性结合的蛋白质。作为结合蛋白质，可以列举例如免疫球蛋白(IgA、IgD、IgG、IgM、IgY等)、Fab段、F(ab')2段、单链抗体段(scFv)、单域抗体等(Carter,PJ.,Nat.Rev.Immunol.,6：343-357,2006)的抗体分子、Affibody、DARPins、Avimer等的抗体样分子，作为抗体分子，可以列举多克隆抗体、单克隆抗体(小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等)，但不限定于这些。
上述结合蛋白质能够使用各种公知的方法制作，制作方法没有特别限定。
上述结合蛋白质能够在表达本发明的粉尘螨蛋白质的生物体或其组织或者细胞的鉴定等中利用。例如，能够用于测定大气中或室内的空间或人的粘膜中的粉尘螨蛋白质的有无等。该测定能够通过公知的免疫学方法进行，例如能够通过ELISA法进行。
另外，也能够用于以粉尘螨为原因的过敏性疾病的治疗。
以下，利用实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受这些实施例限定。
实施例
实施例1源自粉尘螨的蛋白质的纯化
将长时间饲养螨虫后的培养基加湿干燥，通过180μm的筛后，分散在phosphatebuffered saline(磷酸盐缓冲溶液，PBS)中，立即通过53μm的筛，去除不溶物。将分散有排泄物的PBS在37℃静置2小时，提取可溶性成分。在4℃以5,000rpm离心30分钟，将上清分离，用分级分子量12,000-14,000的透析膜透析2天，去除低分子成分。将其使用离心浓缩器(Vivaspin 20、MWCO 10kDa)浓缩，得到粗提取物。
在粗提取物中加入10倍量的20mM Tris-HCl(pH9.0)后，上样于阳离子柱(Vivapure S Maxi M)，离心(500g、5分)后，回收洗脱组分。将洗脱组分上样于阴离子色谱柱(Uno Q 1mL、Bio-Rad)，以0～1M的NaCl梯度使其洗脱。回收含有目标蛋白质的组分，使用离心浓缩器(Vivaspin 6、MWCO 100kDa)去除低分子组分，得到纯化蛋白质。将纯化蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)解析的结果表示在图1中。
实施例2纯化抗原的过敏原活性确认
(i)与以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者血清IgE的反应性的确认
制备本发明蛋白质以及已知的螨虫抗原(Der f1)20μg/mL溶液，以成为1μg/50μL/孔的方式添加在Maxisorp 96孔板(Nunc)中后，在4℃静置一晩，由此使抗原固相化。第二天将板清洗后，添加含有1％牛血清白蛋白的PBS，在室温静置1小时，由此实施封闭。在板清洗后，添加5倍稀释的患者血清，在室温静置2小时。作为阴性对照，使用市售的人AB型血清(CELLect(R)Human AB serum；MP Biomedicals)。板清洗后，添加以含有1％牛血清白蛋白的PBS稀释7000倍的2次抗体(HRP标记山羊抗人IgE抗体、Novus)，室温静置40分钟。清洗板后，用TMB Substrate Reagent Set(TMB底物试剂盒)(BD Biosciences)通过室温静置以遮光状态实施20分钟TMB显色。结束后，通过添加1N硫酸，使显色停止，微孔板检测器测定波长450nm的吸光度。将其结果表示在图2中。
(ii)以粉尘螨为原因的过敏性疾病患者嗜碱性粒细胞的活化
已知在被过敏原刺激的嗜碱性粒细胞中，CD203c的表达增强(De Weck,AL.etal.,Int.Arch.Allergy Immunol.,146:177-189,2008)。根据该原理，使用Allergenicity试剂盒(Beckman Coulter)，分析患者血液中的嗜碱性粒细胞活化。在肝素采血的全血100μL中加入本发明蛋白质过敏原溶液(最终浓度1～100ng/ml)20μL和包含CD3-PC7、CRTH2-FITC和CD203c-PE的抗体混合物20μL，在37℃孵育15分钟。加入反应停止液100μL和溶血固定液2mL，在室温反应10分钟。离心(200x g、5分钟)之后，去除上清，加入磷酸缓冲液(PBS)3mL，再离心。去除上清后，将细胞悬浮于加有0.1％甲醛的PBS，利用流式细胞仪(FACScanto、BD Biosciences)测定。对于所得到的数据，以CD3-PC7阴性且CRTH2-FITC阳性为指标，选择血球中的嗜碱性粒细胞，分析CD203c的表达强度。将其结果表示于图3。与仅添加PBS时相比，确认到添加过敏原时的CD203c的表达增强。
实施例3碱基序列和氨基酸序列的确定
＜部分内部氨基酸序列的确定＞
为了明确本发明蛋白质内部的部分氨基酸序列，对利用蛋白酶有限酶解得到的片段进行解析。将纯化蛋白50μg进行SDS-PAGE后，将分子量110kDa条带附近的凝胶切碎，在1mL的纯化水中进行搅拌、清洗(20分钟×2次)。添加300μL的7mol/L胍/0.5mol/L Tris-HCl/0.01mol/L EDTA(pH8.5)和10μL的2-巯基乙醇，进行氮置换和超声波处理后，通过在室温静置2小时进行还原。接着，添加10μL的4-乙烯基吡啶，在进行氮置换和超声波处理(1分钟)之后，在室温静置30分钟，由此进行烷基化。将反应液废弃后，新加入1mL的0.1vol％三氟乙酸，确认为酸性后，搅拌1小时。将溶液废弃，在1mL的0.025mol/L碳酸氢铵/50vol％乙腈中搅拌(20分钟×2次)。将溶液废弃，在1mL的乙腈中搅拌5分钟后，将溶液废弃，用离心蒸发器将凝胶减压干燥固化。将溶解于0.025mol/L碳酸氢铵的赖氨酰内肽酶以酶/底物比1/20添加，在冰上静置，使凝胶膨润1小时。追加0.025mol/L碳酸氢铵，使溶液完全浸透凝胶，之后再在37℃反应17小时，回收反应液([1]液)。为了提取肽，在剩余的凝胶中添加100μL的0.1vol％三氟乙酸/50vol％乙腈，搅拌20分钟后，回收提取液([2]液)。进而在100μL的乙腈中搅拌20分钟后，回收提取液([3]液)。将[1]～[3]液混合并减压浓缩后，加入反相高效液相层析(XBridge C18)，以乙腈0～80重量％的梯度进行洗脱、分级。收集主要的2个肽，利用蛋白测序(Procise 492cLC；Applied Biosystems)进行N末端氨基酸序列解析的结果，得到了Thr-Asp-Asp-Phe-Phe-Pro-Tyr-Ala-Ser-Asp-Glu-His-Ala-Tyr-Trp-Thr-Gly-Tyr-Phe-Thr〔部分氨基酸序列1(序列号3)〕和Gln-Gly-Asp-Tyr-Val-Glu-Phe-Asp-Phe-Val-Val-Gly-Pro-Ile-X-Val〔部分氨基酸序列2(序列号4)〕。
＜粉尘螨RNA的提取＞
从在液体氮中冻结的粉尘螨中，使用RNeasy Mini kit(Qiagen)按照以下的操作提取RNA。对粉尘螨10mg，加入600μL Buffer RLT，通过18G注射针进行破碎。将粉尘螨悬浊液加入到QIAshredder旋转柱(Qiagen)进行离心(15000rpm 2分钟)，回收穿柱液。在回收的RNA溶液中添加70％乙醇水溶液600μL后，添加于RNeasy Mini柱中，进行离心(10000rpm 15秒)。进而将柱用Buffer RW1 350μL清洗后，用RNase-Free DNase set(Qiagen)进行DNase处理。将柱用Buffer RW1350μL清洗后，按照RNeasy Mini Kit的操作说明进行RNA的纯化。纯化后，添加RNase Free H2O 30μL，回收总RNA(Total RNA)。
＜粉尘螨cDNA的制作＞
从所得到的总RNA中，使用Superscript III First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR(Invitrogen)合成cDNA。将总RNA 3μg悬浮于8μL的纯化水中，加入oligo(dT)201μL、10mM dNTP 1μL后，在65℃孵育5分钟。在冰上冷却2分钟后，加入10X RT buffer 2μL、25mM MgCl2 1μL、0.1M DTT 2μL、RNaseOUT(40U/μl)1μL、SuperScript III ReverseTranscriptase 1μL并混合。在50℃孵育50分钟后，在85℃进行5分钟处理，停止反应。
＜cDNA序列的确定＞
由所得到的部分氨基酸序列3、4设计简并引物。作为相当于部分氨基酸序列3的正义引物，设计Primer 1及其下游的Primer 2。同样作为相当于部分氨基酸序列4的反义引物，设计Primer 3及其上游的Primer 4。使用这些引物，以螨虫cDNA为模板，进行利用KODFx neo(TOYOBO)的巢式PCR。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶(NACALAI TESQUE)上电泳后，将包含扩增的条带的凝胶片段用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)纯化。纯化的PCR产物使用Primer 2、Primer 4的引物进行利用KOD Fx neo的PCR，将PCR产物用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)纯化。纯化后，使用BigDyeXterminator Kit(Applied Biosystems)和DNA测序仪(3130xl；Applied Biosystems)分析碱基序列，取得中间序列。
接着，为了分析3'侧序列，使用5'/3'RACE kit 2nd generation(Roche)，制作在3'末端添加了锚序列的粉尘螨cDNA。使用根据由中间序列得到的序列设计的Primer 5、Primer 6的2阶段的引物，进行利用KOD Fx neo的巢式PCR。分析所得到的PCR产物的碱基序列，取得3'末端序列。
通过中间序列和3'末端序列的解析，取得1850bp的部分序列。对与该部分序列具有相同性的蛋白质利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库进行检索，结果得知，与Capitella teleta(海蠕虫)的假定蛋白CAPTEDRAFT_151096(GenBank:ELT89240.1)的相同性为37％，与Lottia gigantean(霸王莲花青螺)的假定蛋白LOTGIDRAFT_207233(GenBank:ESO84761.1)的相同性为40％，与Amphimedon queenslandica(大堡礁海绵)的PREDICTED:lysosomal alpha-mannosidase-like(溶酶体α-甘露糖苷酶样)(NCBIReference Sequence:XP_003383866.1)的相同性为47％。因此，分析ELT89240.1、ESO84761.1、XP_003383866.1之间的相同序列，设计对于在N末端附近氨基酸序列一致的区域的简并引物Primer 7、Primer 8。利用由中间序列设计的Primer 9、Primer 10和Primer7、Primer 8，从粉尘螨cDNA使用KOD Fx neo实施巢式PCR。分析所得到的PCR产物的碱基序列，取得5'侧的部分序列。
进而为了分析5'侧序列，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司)实施5'RACE法。将粉尘螨总RNA使用NucleoTrap mRNA mini(Macherey-Nagel)纯化粉尘螨polyA mRNA。使用纯化的polyA mRNA用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒取得在5'末端包含接头序列的cDNA。
对该cDNA用由5′侧部分序列设计的Primer 11用PrimeStar HSDNA聚合酶(TakaraBio)进行降落PCR。关于反应条件，按照SMARTerRACE cDNA扩增试剂盒的操作说明。分析所得到的PCR产物的碱基序列，由此取得直到5′侧末端的序列。
[表1]
使用引物
Primer 1 5’-CNG AYG AYT TYT TYC CNT AYG-3’ 序列号5
Primer 2 5’-GAY GAR CAY GCN TAY TGG A-3′ 序列号6
Primer 3 5’-AAR TCR AAY TCN ACR TAR TCN C-3’ 序列号7
Primer 4 5’-RAA YTC NAC RTA RTC NCC YTG-3’ 序列号8
Primer 5 5’-GTT GGT CAT AAA GGA CAA CG-3’ 序列号9
Primer 6 5’-TCG GTA TCG TTC AAG AAG TA-3’ 序列号10
Primer 7 5’-GTN CCN CAY ACN CAY GAY G-3’ 序列号11
Primer 8 5’-NCA YGA YGA YGT NGG NTG G-3’ 序列号12
Primer 9 5’-TTG TGG CCA CAC TTT TAC GTC CAG-3′ 序列号13
Primer 10 5’-CCA TTG CTT CAC GTA ATC TT-3’ 序列号14
Primer 11 5’-AGC CAT TTC CCG GGA ATG ACC AAA TG-3’ 序列号15
表中R＝A+G、Y＝C+T、N＝A+T+G+C的混合碱基
编码本发明的粉尘螨蛋白质的cDNA由3006bp的ORF构成。由碱基序列推定的氨基酸数为1002aa。根据信号序列预测软件(SignalP 4.1、http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的解析，最初的27个氨基酸为信号肽。因此，作为天然物的本发明的粉尘螨蛋白质的氨基酸数为975aa，由该氨基酸序列预测的本发明的粉尘螨蛋白质的分子量为113.5kDa。该预测分子量与SDS-PAGE的分子量约110kDa一致。
使用NCBI的BLAST检索进行由所确定的碱基序列推定的氨基酸序列的相同性检索，结果显示与以Der f1、Der f2为代表的已知的Der f由来过敏原没有相同性，为新型的蛋白质。
序列表
<110> 大鹏药品工业株式会社
<120> 新型粉尘螨蛋白质
<130> TH0094
<150> JP 2014-244038
<151> 2014-12-02
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3006
<212> DNA
<213> 粉尘螨
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3006)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(81)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (82)..(3006)
<400> 1
atg gat tat cat aat cta tca tta ttg gtg gtg gct cta ttg tct gtg 48
Met Asp Tyr His Asn Leu Ser Leu Leu Val Val Ala Leu Leu Ser Val
-25 -20 -15
acc ata ttc aca aca att caa caa tct gaa tcg gtt gtt att aaa gtg 96
Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gln Gln Ser Glu Ser Val Val Ile Lys Val
-10 -5 -1 1 5
gaa aat ctg cca gaa cgt tgt gat tat tca caa tgt cca aaa tgg gat 144
Glu Asn Leu Pro Glu Arg Cys Asp Tyr Ser Gln Cys Pro Lys Trp Asp
10 15 20
cct aat gat att aat gta cat ttg gtg gcc cat aca cat gat gat gtt 192
Pro Asn Asp Ile Asn Val His Leu Val Ala His Thr His Asp Asp Val
25 30 35
ggt tgg tta aaa acg gtg gaa caa tat tat tat ggc cta aaa aat gat 240
Gly Trp Leu Lys Thr Val Glu Gln Tyr Tyr Tyr Gly Leu Lys Asn Asp
40 45 50
att caa cgt gcc gga gtg caa tat att ttg gat aca gta att gaa gaa 288
Ile Gln Arg Ala Gly Val Gln Tyr Ile Leu Asp Thr Val Ile Glu Glu
55 60 65
tta ata cgt aat aaa caa cga cgt ttt att tat gtt gag att gca ttc 336
Leu Ile Arg Asn Lys Gln Arg Arg Phe Ile Tyr Val Glu Ile Ala Phe
70 75 80 85
ttt tgg aaa tgg tgg caa gaa caa gat gaa gat caa cgt atg atc gta 384
Phe Trp Lys Trp Trp Gln Glu Gln Asp Glu Asp Gln Arg Met Ile Val
90 95 100
cga gaa tta gta cgt act gga caa ttg gaa ttt att aat ggt ggc tgg 432
Arg Glu Leu Val Arg Thr Gly Gln Leu Glu Phe Ile Asn Gly Gly Trp
105 110 115
tca atg cca gat gaa gca gca aca cat tat aat tca ctt att gat caa 480
Ser Met Pro Asp Glu Ala Ala Thr His Tyr Asn Ser Leu Ile Asp Gln
120 125 130
tct aca tgg ggt cta aga caa ttg aat gat aca ttc ggt aaa tgt ggt 528
Ser Thr Trp Gly Leu Arg Gln Leu Asn Asp Thr Phe Gly Lys Cys Gly
135 140 145
cat cca aaa gta aca tgg caa att gat cca ttt ggt cat tcc cgg gaa 576
His Pro Lys Val Thr Trp Gln Ile Asp Pro Phe Gly His Ser Arg Glu
150 155 160 165
atg gct aat ctt tat gca cag atg ggt tat gat gca tta ttt ttt gca 624
Met Ala Asn Leu Tyr Ala Gln Met Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Phe Ala
170 175 180
cgt caa gat tat caa gat cgt gaa aat cgt atg aca aat cgt aaa ttg 672
Arg Gln Asp Tyr Gln Asp Arg Glu Asn Arg Met Thr Asn Arg Lys Leu
185 190 195
gaa cat gta tgg caa gga tca gat gat ctt ggt act gct ggt gat ata 720
Glu His Val Trp Gln Gly Ser Asp Asp Leu Gly Thr Ala Gly Asp Ile
200 205 210
ttc act ggt atg atg ttt agt ggt tat gga cct att gaa ttc aat tgg 768
Phe Thr Gly Met Met Phe Ser Gly Tyr Gly Pro Ile Glu Phe Asn Trp
215 220 225
gat ata aca aat ggc ccc gaa gat gct gtt gtt gat aat cct gag tca 816
Asp Ile Thr Asn Gly Pro Glu Asp Ala Val Val Asp Asn Pro Glu Ser
230 235 240 245
gaa gaa tat aat gtt ccg gat aaa ata cga cgt ttt gtg gaa aaa gca 864
Glu Glu Tyr Asn Val Pro Asp Lys Ile Arg Arg Phe Val Glu Lys Ala
250 255 260
aaa tat ttt gca cag tat tat gca aca aat cat ttt atg ttt cca atg 912
Lys Tyr Phe Ala Gln Tyr Tyr Ala Thr Asn His Phe Met Phe Pro Met
265 270 275
ggt acg gat ttt caa tat ggt gat gca cat aca tgg ttt aaa aat ctg 960
Gly Thr Asp Phe Gln Tyr Gly Asp Ala His Thr Trp Phe Lys Asn Leu
280 285 290
gat aaa ttg atc aaa gct gta aat aat gct gga aaa ggt gtt cgg gca 1008
Asp Lys Leu Ile Lys Ala Val Asn Asn Ala Gly Lys Gly Val Arg Ala
295 300 305
ttc tat tca aca cca tca tgc tat gca cgt gca tta tat gaa acg aat 1056
Phe Tyr Ser Thr Pro Ser Cys Tyr Ala Arg Ala Leu Tyr Glu Thr Asn
310 315 320 325
cgt aca tgg acc acg aaa aca gat gat ttt ttt ccc tat gca tca gat 1104
Arg Thr Trp Thr Thr Lys Thr Asp Asp Phe Phe Pro Tyr Ala Ser Asp
330 335 340
gaa cat gca tat tgg act gga tat ttc acc agt aga ccg gct tta aaa 1152
Glu His Ala Tyr Trp Thr Gly Tyr Phe Thr Ser Arg Pro Ala Leu Lys
345 350 355
cgt atg gaa cgt atg ggc aat aat cta tta caa gca tgt aaa caa ttg 1200
Arg Met Glu Arg Met Gly Asn Asn Leu Leu Gln Ala Cys Lys Gln Leu
360 365 370
gat att ttg gcc gga aat gat gga cgt ttt gaa atg aat ata aca aga 1248
Asp Ile Leu Ala Gly Asn Asp Gly Arg Phe Glu Met Asn Ile Thr Arg
375 380 385
tta cgt gaa gca atg ggt gtc atg caa cat cat gat gct gta acc gga 1296
Leu Arg Glu Ala Met Gly Val Met Gln His His Asp Ala Val Thr Gly
390 395 400 405
acg gaa aaa caa cat gtt gca ttt aat tat gca aaa atg tta gat tca 1344
Thr Glu Lys Gln His Val Ala Phe Asn Tyr Ala Lys Met Leu Asp Ser
410 415 420
gca atg cta caa tgt cgt cat gta att agt gaa tca tat cga aag tta 1392
Ala Met Leu Gln Cys Arg His Val Ile Ser Glu Ser Tyr Arg Lys Leu
425 430 435
ttt cca aca caa aca aaa gaa cag cat gaa ttt tgt cca tat tta aat 1440
Phe Pro Thr Gln Thr Lys Glu Gln His Glu Phe Cys Pro Tyr Leu Asn
440 445 450
ata agt tca tgt cct tca aca gaa atg ggt gaa tca cgt acg ata cat 1488
Ile Ser Ser Cys Pro Ser Thr Glu Met Gly Glu Ser Arg Thr Ile His
455 460 465
ctt tat aat cca ctt ggt cat cgt tta gtg aat cga aca ata cgt gta 1536
Leu Tyr Asn Pro Leu Gly His Arg Leu Val Asn Arg Thr Ile Arg Val
470 475 480 485
cct gta aag gat ggt tat tat tat caa gtt cgt gac caa aat gat cat 1584
Pro Val Lys Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gln Val Arg Asp Gln Asn Asp His
490 495 500
tca ata cct gct gtt ttg ata tca ata cca gaa ttt gtt cgt aaa att 1632
Ser Ile Pro Ala Val Leu Ile Ser Ile Pro Glu Phe Val Arg Lys Ile
505 510 515
cct gga cgt aaa agt gtg gcc aca aaa gaa tta gta ttc cgt gta cct 1680
Pro Gly Arg Lys Ser Val Ala Thr Lys Glu Leu Val Phe Arg Val Pro
520 525 530
att att gaa tca ctt ggt ata cgt aga ttt cat atg att gcc act aaa 1728
Ile Ile Glu Ser Leu Gly Ile Arg Arg Phe His Met Ile Ala Thr Lys
535 540 545
gaa aaa caa cag gat tca gct gtt gaa atc caa gga gaa aaa ttt gtt 1776
Glu Lys Gln Gln Asp Ser Ala Val Glu Ile Gln Gly Glu Lys Phe Val
550 555 560 565
ggt cat aaa gga caa cga ttt caa ctt aaa gat ggt ttg att att gaa 1824
Gly His Lys Gly Gln Arg Phe Gln Leu Lys Asp Gly Leu Ile Ile Glu
570 575 580
ttt gat tct aat gga aaa att gca aca atg act cga aat aat caa tcg 1872
Phe Asp Ser Asn Gly Lys Ile Ala Thr Met Thr Arg Asn Asn Gln Ser
585 590 595
ata tcg ata tcg aat gaa ttc cgt ttg ttt cat ggt gct gat att ggt 1920
Ile Ser Ile Ser Asn Glu Phe Arg Leu Phe His Gly Ala Asp Ile Gly
600 605 610
cgt cat tca ggt gcc tat att ttc cgt cca agt gaa cag aaa act ttt 1968
Arg His Ser Gly Ala Tyr Ile Phe Arg Pro Ser Glu Gln Lys Thr Phe
615 620 625
cct gtc aca gaa aaa atg gaa gca aca ttg tat gta gat caa aaa ttc 2016
Pro Val Thr Glu Lys Met Glu Ala Thr Leu Tyr Val Asp Gln Lys Phe
630 635 640 645
ggt atc gtt caa gaa gta cat caa caa ttt gat tca ttt gtt ggt caa 2064
Gly Ile Val Gln Glu Val His Gln Gln Phe Asp Ser Phe Val Gly Gln
650 655 660
atc ata cga ttg gat aaa caa ggt gat tat gtg gaa ttt gat ttt gtt 2112
Ile Ile Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asp Tyr Val Glu Phe Asp Phe Val
665 670 675
gtt gga cca att cca gtg gat gat cta att ggt aaa gaa atc att aca 2160
Val Gly Pro Ile Pro Val Asp Asp Leu Ile Gly Lys Glu Ile Ile Thr
680 685 690
cga tat agt acg aat ctt gca aat gat gaa aca ttc ttt acc gat tca 2208
Arg Tyr Ser Thr Asn Leu Ala Asn Asp Glu Thr Phe Phe Thr Asp Ser
695 700 705
aat ggt cga caa atg tta cga aga cgt tgg aat tat cgt cca tca tgg 2256
Asn Gly Arg Gln Met Leu Arg Arg Arg Trp Asn Tyr Arg Pro Ser Trp
710 715 720 725
aaa tat gaa atc gaa gaa cca gta tcg ggt aat tat tat ccg gtt aat 2304
Lys Tyr Glu Ile Glu Glu Pro Val Ser Gly Asn Tyr Tyr Pro Val Asn
730 735 740
tca cgt att gct att cgt gat gat aga aaa tca ttg cag atg aca att 2352
Ser Arg Ile Ala Ile Arg Asp Asp Arg Lys Ser Leu Gln Met Thr Ile
745 750 755
atg act gat cga tca caa ggt ggt tca tta tca cct gaa caa att aat 2400
Met Thr Asp Arg Ser Gln Gly Gly Ser Leu Ser Pro Glu Gln Ile Asn
760 765 770
ggc agc gtt gat cta atg gta cat cgt cgt tta tta cat gat gat tat 2448
Gly Ser Val Asp Leu Met Val His Arg Arg Leu Leu His Asp Asp Tyr
775 780 785
ttt ggt gtc gat gaa cca tta aat gaa cca ggt gtt gat ggt cat ggc 2496
Phe Gly Val Asp Glu Pro Leu Asn Glu Pro Gly Val Asp Gly His Gly
790 795 800 805
ata gtt ata cgt ggc aga cat tta tta cta tta gat aca ttg gaa aaa 2544
Ile Val Ile Arg Gly Arg His Leu Leu Leu Leu Asp Thr Leu Glu Lys
810 815 820
gct gcc gaa aaa cat cgt cca ctt gca cag gaa atg ttt atg gag cca 2592
Ala Ala Glu Lys His Arg Pro Leu Ala Gln Glu Met Phe Met Glu Pro
825 830 835
att att agt ttt aca tca tcg atg gag aaa aat cag cca ata tat aag 2640
Ile Ile Ser Phe Thr Ser Ser Met Glu Lys Asn Gln Pro Ile Tyr Lys
840 845 850
gga tta acg aaa gat ctg cct gga aat gtt cat ctt ctt acc ctg gaa 2688
Gly Leu Thr Lys Asp Leu Pro Gly Asn Val His Leu Leu Thr Leu Glu
855 860 865
caa tgg cat tca aaa cgt tat cta tta cgt ctt gaa cat ttt tat caa 2736
Gln Trp His Ser Lys Arg Tyr Leu Leu Arg Leu Glu His Phe Tyr Gln
870 875 880 885
cgt ttt gaa gat cca tca ttg agt aat cca gcc act gta tcg tta cgc 2784
Arg Phe Glu Asp Pro Ser Leu Ser Asn Pro Ala Thr Val Ser Leu Arg
890 895 900
cat tta ttt caa tca ttt gaa ata act gcc gtt gaa gaa tta acg ctt 2832
His Leu Phe Gln Ser Phe Glu Ile Thr Ala Val Glu Glu Leu Thr Leu
905 910 915
ggt gca aat caa ccg ata tca gcg ttg aaa aat cgt tta caa tat cgt 2880
Gly Ala Asn Gln Pro Ile Ser Ala Leu Lys Asn Arg Leu Gln Tyr Arg
920 925 930
tat att aga cca tta aat gag caa caa tca tcg atc ata acg gat cca 2928
Tyr Ile Arg Pro Leu Asn Glu Gln Gln Ser Ser Ile Ile Thr Asp Pro
935 940 945
ata att gaa ggt gaa aat ttc gat att cat ctt gaa ccg atg cag ata 2976
Ile Ile Glu Gly Glu Asn Phe Asp Ile His Leu Glu Pro Met Gln Ile
950 955 960 965
cgt aca ttt tta atc gat att aaa cga aat 3006
Arg Thr Phe Leu Ile Asp Ile Lys Arg Asn
970 975
<210> 2
<211> 1002
<212> PRT
<213> 粉尘螨
<400> 2
Met Asp Tyr His Asn Leu Ser Leu Leu Val Val Ala Leu Leu Ser Val
-25 -20 -15
Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gln Gln Ser Glu Ser Val Val Ile Lys Val
-10 -5 -1 1 5
Glu Asn Leu Pro Glu Arg Cys Asp Tyr Ser Gln Cys Pro Lys Trp Asp
10 15 20
Pro Asn Asp Ile Asn Val His Leu Val Ala His Thr His Asp Asp Val
25 30 35
Gly Trp Leu Lys Thr Val Glu Gln Tyr Tyr Tyr Gly Leu Lys Asn Asp
40 45 50
Ile Gln Arg Ala Gly Val Gln Tyr Ile Leu Asp Thr Val Ile Glu Glu
55 60 65
Leu Ile Arg Asn Lys Gln Arg Arg Phe Ile Tyr Val Glu Ile Ala Phe
70 75 80 85
Phe Trp Lys Trp Trp Gln Glu Gln Asp Glu Asp Gln Arg Met Ile Val
90 95 100
Arg Glu Leu Val Arg Thr Gly Gln Leu Glu Phe Ile Asn Gly Gly Trp
105 110 115
Ser Met Pro Asp Glu Ala Ala Thr His Tyr Asn Ser Leu Ile Asp Gln
120 125 130
Ser Thr Trp Gly Leu Arg Gln Leu Asn Asp Thr Phe Gly Lys Cys Gly
135 140 145
His Pro Lys Val Thr Trp Gln Ile Asp Pro Phe Gly His Ser Arg Glu
150 155 160 165
Met Ala Asn Leu Tyr Ala Gln Met Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Phe Ala
170 175 180
Arg Gln Asp Tyr Gln Asp Arg Glu Asn Arg Met Thr Asn Arg Lys Leu
185 190 195
Glu His Val Trp Gln Gly Ser Asp Asp Leu Gly Thr Ala Gly Asp Ile
200 205 210
Phe Thr Gly Met Met Phe Ser Gly Tyr Gly Pro Ile Glu Phe Asn Trp
215 220 225
Asp Ile Thr Asn Gly Pro Glu Asp Ala Val Val Asp Asn Pro Glu Ser
230 235 240 245
Glu Glu Tyr Asn Val Pro Asp Lys Ile Arg Arg Phe Val Glu Lys Ala
250 255 260
Lys Tyr Phe Ala Gln Tyr Tyr Ala Thr Asn His Phe Met Phe Pro Met
265 270 275
Gly Thr Asp Phe Gln Tyr Gly Asp Ala His Thr Trp Phe Lys Asn Leu
280 285 290
Asp Lys Leu Ile Lys Ala Val Asn Asn Ala Gly Lys Gly Val Arg Ala
295 300 305
Phe Tyr Ser Thr Pro Ser Cys Tyr Ala Arg Ala Leu Tyr Glu Thr Asn
310 315 320 325
Arg Thr Trp Thr Thr Lys Thr Asp Asp Phe Phe Pro Tyr Ala Ser Asp
330 335 340
Glu His Ala Tyr Trp Thr Gly Tyr Phe Thr Ser Arg Pro Ala Leu Lys
345 350 355
Arg Met Glu Arg Met Gly Asn Asn Leu Leu Gln Ala Cys Lys Gln Leu
360 365 370
Asp Ile Leu Ala Gly Asn Asp Gly Arg Phe Glu Met Asn Ile Thr Arg
375 380 385
Leu Arg Glu Ala Met Gly Val Met Gln His His Asp Ala Val Thr Gly
390 395 400 405
Thr Glu Lys Gln His Val Ala Phe Asn Tyr Ala Lys Met Leu Asp Ser
410 415 420
Ala Met Leu Gln Cys Arg His Val Ile Ser Glu Ser Tyr Arg Lys Leu
425 430 435
Phe Pro Thr Gln Thr Lys Glu Gln His Glu Phe Cys Pro Tyr Leu Asn
440 445 450
Ile Ser Ser Cys Pro Ser Thr Glu Met Gly Glu Ser Arg Thr Ile His
455 460 465
Leu Tyr Asn Pro Leu Gly His Arg Leu Val Asn Arg Thr Ile Arg Val
470 475 480 485
Pro Val Lys Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gln Val Arg Asp Gln Asn Asp His
490 495 500
Ser Ile Pro Ala Val Leu Ile Ser Ile Pro Glu Phe Val Arg Lys Ile
505 510 515
Pro Gly Arg Lys Ser Val Ala Thr Lys Glu Leu Val Phe Arg Val Pro
520 525 530
Ile Ile Glu Ser Leu Gly Ile Arg Arg Phe His Met Ile Ala Thr Lys
535 540 545
Glu Lys Gln Gln Asp Ser Ala Val Glu Ile Gln Gly Glu Lys Phe Val
550 555 560 565
Gly His Lys Gly Gln Arg Phe Gln Leu Lys Asp Gly Leu Ile Ile Glu
570 575 580
Phe Asp Ser Asn Gly Lys Ile Ala Thr Met Thr Arg Asn Asn Gln Ser
585 590 595
Ile Ser Ile Ser Asn Glu Phe Arg Leu Phe His Gly Ala Asp Ile Gly
600 605 610
Arg His Ser Gly Ala Tyr Ile Phe Arg Pro Ser Glu Gln Lys Thr Phe
615 620 625
Pro Val Thr Glu Lys Met Glu Ala Thr Leu Tyr Val Asp Gln Lys Phe
630 635 640 645
Gly Ile Val Gln Glu Val His Gln Gln Phe Asp Ser Phe Val Gly Gln
650 655 660
Ile Ile Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asp Tyr Val Glu Phe Asp Phe Val
665 670 675
Val Gly Pro Ile Pro Val Asp Asp Leu Ile Gly Lys Glu Ile Ile Thr
680 685 690
Arg Tyr Ser Thr Asn Leu Ala Asn Asp Glu Thr Phe Phe Thr Asp Ser
695 700 705
Asn Gly Arg Gln Met Leu Arg Arg Arg Trp Asn Tyr Arg Pro Ser Trp
710 715 720 725
Lys Tyr Glu Ile Glu Glu Pro Val Ser Gly Asn Tyr Tyr Pro Val Asn
730 735 740
Ser Arg Ile Ala Ile Arg Asp Asp Arg Lys Ser Leu Gln Met Thr Ile
745 750 755
Met Thr Asp Arg Ser Gln Gly Gly Ser Leu Ser Pro Glu Gln Ile Asn
760 765 770
Gly Ser Val Asp Leu Met Val His Arg Arg Leu Leu His Asp Asp Tyr
775 780 785
Phe Gly Val Asp Glu Pro Leu Asn Glu Pro Gly Val Asp Gly His Gly
790 795 800 805
Ile Val Ile Arg Gly Arg His Leu Leu Leu Leu Asp Thr Leu Glu Lys
810 815 820
Ala Ala Glu Lys His Arg Pro Leu Ala Gln Glu Met Phe Met Glu Pro
825 830 835
Ile Ile Ser Phe Thr Ser Ser Met Glu Lys Asn Gln Pro Ile Tyr Lys
840 845 850
Gly Leu Thr Lys Asp Leu Pro Gly Asn Val His Leu Leu Thr Leu Glu
855 860 865
Gln Trp His Ser Lys Arg Tyr Leu Leu Arg Leu Glu His Phe Tyr Gln
870 875 880 885
Arg Phe Glu Asp Pro Ser Leu Ser Asn Pro Ala Thr Val Ser Leu Arg
890 895 900
His Leu Phe Gln Ser Phe Glu Ile Thr Ala Val Glu Glu Leu Thr Leu
905 910 915
Gly Ala Asn Gln Pro Ile Ser Ala Leu Lys Asn Arg Leu Gln Tyr Arg
920 925 930
Tyr Ile Arg Pro Leu Asn Glu Gln Gln Ser Ser Ile Ile Thr Asp Pro
935 940 945
Ile Ile Glu Gly Glu Asn Phe Asp Ile His Leu Glu Pro Met Gln Ile
950 955 960 965
Arg Thr Phe Leu Ile Asp Ile Lys Arg Asn
970 975
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 粉尘螨
<400> 3
Thr Asp Asp Phe Phe Pro Tyr Ala Ser Asp Glu His Ala Tyr Trp Thr
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Thr
20
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 粉尘螨
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa 可以是任何自然产生的氨基酸
<400> 4
Gln Gly Asp Tyr Val Glu Phe Asp Phe Val Val Gly Pro Ile Xaa Val
1 5 10 15
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Y=C+T
<400> 5
cngaygaytt yttyccntay g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Y=C+T
<400> 6
gaygarcayg cntaytgga 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> N=A+T+G+C
<400> 7
aartcraayt cnacrtartc nc 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> R=A+G
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Y=C+T
<400> 8
raaytcnacr tartcnccyt g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
gttggtcata aaggacaacg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
tcggtatcgt tcaagaagta 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Y=C+T
<400> 11
gtnccncaya cncaygayg 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Y=C+T
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> N=A+T+G+C
<400> 12
ncaygaygay gtnggntgg 19
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
ttgtggccac acttttacgt ccag 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
ccattgcttc acgtaatctt 20
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
agccatttcc cgggaatgac caaatg 26

Claims (14)

1.一种粉尘螨蛋白质或其片段肽，其特征在于：
其为选自以下的(a)～(c)中的粉尘螨蛋白质或其片段肽：
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质，
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质，
(c)由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
2.一种聚核苷酸，其特征在于：
编码选自以下的(a)～(c)中的粉尘螨蛋白质或其片段肽：
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质，
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质，
(c)由与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成、且具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质。
3.一种聚核苷酸，其特征在于：
其为选自以下的(d)～(f)中的聚核苷酸：
(d)由序列号1所示的碱基序列构成的聚核苷酸，
(e)与由与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的聚核苷酸在严格条件下杂交、编码具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质的聚核苷酸，
(f)由与序列号1所示的碱基序列具有90％以上的同一性的碱基序列构成、且编码具有粉尘螨过敏原活性的蛋白质的聚核苷酸。
4.一种以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂，其特征在于：
以权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽为有效成分。
5.一种以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断药，其特征在于：
以权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽为有效成分。
6.一种与权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽结合的结合蛋白质。
7.如权利要求6所述的结合蛋白质，其特征在于：
其为抗体分子。
8.如权利要求6所述的结合蛋白质，其特征在于：
其为单克隆抗体。
9.权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽用于制造以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂的使用。
10.权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽用于制造以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断药的使用。
11.如权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽，其特征在于：
用于在以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗中使用。
12.如权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽，其特征在于：
用于在以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断中使用。
13.一种以粉尘螨为原因的过敏性疾病的预防或治疗方法，其特征在于：
对患者投与权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽。
14.一种以粉尘螨为原因的过敏性疾病的诊断方法，其特征在于：
对被测试者投与权利要求1所述的粉尘螨蛋白质或其片段肽。
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