JP2002512253A - 新規なダーマトファゴイデス属（ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）核酸分子、タンパク質、およびそれらの使用方法 - Google Patents

新規なダーマトファゴイデス属（ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）核酸分子、タンパク質、およびそれらの使用方法

Info

Publication number
JP2002512253A
JP2002512253A JP2000544687A JP2000544687A JP2002512253A JP 2002512253 A JP2002512253 A JP 2002512253A JP 2000544687 A JP2000544687 A JP 2000544687A JP 2000544687 A JP2000544687 A JP 2000544687A JP 2002512253 A JP2002512253 A JP 2002512253A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
nucleic acid
protein
acid molecule
map
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000544687A
Other languages
English (en)
Inventor
アン マッコール、キャサリン
ウ ハンター、シャーリー
アール． ウェーバー、エリック
Original Assignee
ヘスカ コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ヘスカ コーポレイション filed Critical ヘスカ コーポレイション
Publication of JP2002512253A publication Critical patent/JP2002512253A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、高分子のダーマトファゴイデス属（Dermatophagoides）タンパク質、同タンパク質をコードする核酸分子、ならびに同タンパク質より得られる治療用および診断用試薬に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は、高分子量のダーマトファゴイデス（Dermatophagoides）のタンパク
質、核酸分子、ならびに同タンパク質から得られる治療用および診断用試薬に関
する。
【０００２】 （発明の背景） 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性アレルギーの症状は、多くの動物を悩ませ
ている。動物の体内でＩｇＥ抗体が産生されると、例えば、アトピー疾患、喘息
、および鼻炎を初めとする病原性のＩｇＥ反応が誘発される。アレルゲンとは、
感受性を有する個体に病原性のＩｇＥ反応を誘発する能力をその特徴とするタン
パク質またはペプチドのことである。
【０００３】 家屋の埃（ハウスダスト）に付いているダニ（例えば、コナヒョウヒダニ（ダ
ーマトファゴイデス ファリネ、Dermatophagoides farinae）およびヤケヒョウ
ヒダニ（ダーマトファゴイデス テロニシヌス、Dermatophagoides pteronyssin
us）、それぞれＤｅｒｆおよびＤｅｒｐとする）のアレルゲンは、ＩｇＥ媒介性
病原に関する主な病原体である。先の研究者らは、ヒトのダストダニアレルゲン
に関する２つの大きなグループ、つまりグループＩ（ＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｐ
Ｉ）、分子量２５，０００）およびグループ２（ＤｅｒｆＩＩおよびＤｅｒｐＩ
Ｉ、分子量１４，０００）を確認している：チャップマン（Chapman ）ら、Alle
rgy 、第５２巻、３７−３７９頁、１９９７年にて研究されている。先の研究者
らは、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｆＩＩ、ＤｅｒｐおよびＤｅｒｐＩＩについては１９
９６年９月３日発行のトーマス（Thomas）らの米国特許第５，５５２，１４２号
、１９９５年１０月２４日発行のアンドウ（Ando）らの米国特許第５，４６０，
９７７号、１９９５年１０月２６日発行のチェン（Chen）らのＰＣＴ公開公報第
ＷＯ９５／２８４２４号、１９９５年７月１８日発行のトーマス（Thomas）らの
米国特許第５，４３３，９４８号、１９９３年３月４日発行のガーメン（Garmen
）らのＰＣＴ公開公報第ＷＯ９３／０８２７９号、またはチャップマン（Chapma
n ）の前掲の文献に、ＤｅｒｐＩＩＩについては１９９５年７月１５日発行のト
ーマス（Thomas ）らのＰＣＴ公開公報第ＷＯ９５／１５９７６号に、Ｄｅｒｐ
ＶＩＩについては１９９４年９月１５日発行のトーマス（Thomas）らのＰＣＴ公
開公報第ＷＯ９４／２０６１４号に、４０キロダルトン（ｋｄ）Ｄｅｒｆアレル
ゲンについては１９９５年４月１１日発行のオカ（Oka ）らの米国特許第５，４
０５，７５８号、１９９４年５月２４日発行のオカ（Oka ）らの米国特許第５，
３１４，９９１号に、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）である７０−ｋｄ
Ｄｅｒｆアレルゲンについては、アキ（Aki ）ら、J. Biochem. 、第１１５巻、
４３５−４４０頁、１９９４年、またはノウリ（Noli）ら、Vet. Immunol. Immu
nopath. 、第５２巻、１４７−１５７頁、１９９６年に、および９８−ｋｄ Ｄ
ｅｒｆパラミオシン様アレルゲンについては、チャイ（Tsai）ら、J. Allergy C
lin. Immunol. 、第１０２巻、２９５−３０３頁、１９９８年に、これらのアレ
ルゲンの核酸配列またはアミノ酸配列の少なくとも一方が開示されている。これ
らの発行された配列のいずれも、本発明のダニアレルギー核酸分子またはタンパ
ク質の存在を示さず、示唆せず、予想してもしていない。また、そのようなタン
パク質をイヌ、ネコ、またはヒトの血清中のＩｇＥ抗体との免疫反応性があるも
のとして関連づけることもなされていない。
【０００４】 ダニアレルギーの特定の検出方法および治療方法を提供する本発明の生産物お
よび方法は、当該技術分野において必要である。 （発明の概要） 本発明は分子量が約６０キロダルトン（ｋｄまたはｋＤ）、７０ｋＤ、または
約９８ｋＤから約１０９ｋＤまでの間である新規なタンパク質に関する。このよ
うなタンパク質はDermatophagoides属のダニのタンパク質アレルゲンの少なくと
も１つのエピトープを有し、本明細書ではＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と名
付ける。好ましいタンパク質は、Dermatophagoides farinaeまたはDermatophago
ides pteronyssius タンパク質である。本発明は、完全長または成熟タンパク質
の断片またはペプチドであるタンパク質や、任意のそのようなタンパク質の抗体
、ミメトープ、または突然変異タンパク質も提供する。
【０００５】 本発明は任意のそのようなタンパク質をコードする核酸分子と、その相補的配
列をも提供する。本発明はそのようなタンパク質、核酸分子、抗体、ミメトープ
、または突然変異タンパク質を得る方法や、それらの化合物を診断または治療の
用途で使用する方法も包含する。また本発明は、ダニアレルギーのイヌおよび／
またはネコのＩｇＥに結合する非タンパク質エピトープを含有する試薬およびそ
のようなエピトープに対して作製された抗体にも関する。また本発明は、そのよ
うな非タンパク質エピトープを含む治療用組成物またはアッセイキット、ならび
に、本発明の非タンパク質エピトープの使用を含めた、ダニに対するアレルギー
反応に感受性を示す動物を同定および／または脱感作する方法にも関する。
【０００６】 本発明の１つの実施形態は、以下の単離核酸分子のうちの少なくとも１つであ
る。（ａ）約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子であって、１ＸＳＳＣ
および０％ホルムアミドを含有する溶液中で約５０℃の温度にて、以下の核酸配
列：配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０
、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、ならびに配列番号
３３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列およびその相補的
配列のうちの少なくとも１つを有する核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子
、（ｂ）（ａ）の前記核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸分子
であって、前記断片は約１５以上のヌクレオチドを含む核酸分子。本発明はその
ような核酸分子を備えた組換え分子、組換えウイルス、および組換え細胞と、そ
れらの製造方法をも包含する。
【０００７】 本発明の別の実施形態は、以下の核酸分子のうちの少なくとも１つによりコー
ドされた単離タンパク質である。（ａ）約１５０以上のヌクレオチドを有する核
酸分子であって、１ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含有する溶液中で約５０
℃の温度にて、以下の核酸配列：配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、
配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、および配列番号３
３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列の相補的配列、のう
ちの少なくとも１つを有する核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子、（ｂ）
（ａ）の前記核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸分子であって
、前記前記断片は約１５以上のヌクレオチドを含む核酸分子。本発明の単離タン
パク質は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、以下のアミノ酸配列
：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番
号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号
２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および配列番
号４４、のうちの少なくとも１つを有するタンパク質をコードする核酸分子の相
補的配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされてもよい。また本発
明は、本発明のタンパク質と選択的に結合する抗体や、そのようなタンパク質ま
たは抗体の製造および使用方法も包含する。
【０００８】 本発明はダニに対するアレルギー反応を治療するための治療用組成物も包含す
る。そのような治療用組成物には、以下の脱感作化合物のうちの少なくとも１つ
が含まれる：（ａ）本発明の単離核酸分子、（ｂ）本発明の単離ダニアレルゲン
タンパク質、（ｃ）そのようなダニアレルゲンタンパク質のミメトープ、（ｄ）
そのようなダニアレルゲンタンパク質の突然変異タンパク質、（ｅ）そのような
ダニアレルゲンタンパク質の抗体、および（ｆ）そのようなダニアレルゲンタン
パク質のＩｇＥに対する結合阻害剤。また宿主動物のダニへのアレルギー反応を
脱感作させる方法も本発明に包含される。このような方法は、動物に本発明の治
療用組成物を投与する工程を含む。
【０００９】 本発明の１つの実施形態に、ダニに対して罹病性であるかまたはアレルギー反
応を示すかを試験するためのアッセイキットがある。このようなキットには、本
発明の単離タンパク質と動物が罹病性であるかまたはアレルギー反応を示すかを
確認する手段とが含まれる。この手段は、ダニに対して罹病性であるかアレルギ
ー反応を示す動物を同定するために同単離タンパク質を使用することを含む。本
発明は、ダニに対して罹病性であるかまたはアレルギー反応を示す動物を同定す
る方法も包含する。このような方法は、（ａ）本発明の単離タンパク質を動物の
抗体と接触させる工程と、（ｂ）タンパク質と抗体との間の免疫複合体の形成を
確認する工程であって、免疫複合体の形成は動物が罹病性であるかまたはそのよ
うなアレルギー反応を有することを示すものである工程とを含む。
【００１０】 本発明は、少なくとも以下の識別特性のうちの１つを有する非タンパク質エピ
トープを含有する試薬を包含する：（ａ）ペプチドのβ−除去に耐性のエピトー
プ、（ｂ）プロテイナーゼＫによる消化に耐性のエピトープ、および（ｃ）グリ
コシル化タンパク質を検出するよう設計された試験に対して反応性のエピトープ
。そのようなエピトープは、以下の抗体のうちの少なくとも１つに結合する：ダ
ニアレルギーのイヌ由来のイヌＩｇＥ、およびダニアレルギーのネコ由来のネコ
ＩｇＥ。そのような非タンパク質エピトープに選択的に結合する単離抗体や、そ
のようなエピトープの誘導体も包含される。
【００１１】 本発明は、本発明の非タンパク質エピトープを含む治療用組成物およびアッセ
イキットのみならず、本発明の非タンパク質エピトープの使用を含む、ダニに対
して罹病性であるかアレルギー反応を示す動物を同定および／または脱感作する
方法にも関する。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、約６０キロダルトン（ｋＤ）から約１０９ｋＤの範囲の分子量を有
し、Dermatophagoides属、特に、Dermatophagoides farinae属および／またはDe
rmatophagoides pteronyssius 属のダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも１
つのエピトープを有する単離タンパク質を提供する。そのようなタンパク質のこ
とを本明細書ではＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と称する。本発明はさらに、
ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ
タンパク質に対する抗体、およびＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質活性の阻害剤
を単離および同定する方法を包含する。本明細書に使用するように、単離Ｄｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質とは、 Dermatophagoides 属由来のＤｅｒＨＭＷ−ｍ
ａｐタンパク質、より好ましくはDermatophagoides farinaeおよび／またはDerm
atophagoides pteronyssius 由来のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のことを指
し、そのようなタンパク質は、天然起源から得ることもできるし、または、例え
ば、組換え核酸技術または化学合成を利用して製造することも可能である。本発
明には、このタンパク質および抗体を、ダニアレルゲンに対する病原を治療する
目的や以下に開示するような他の用途で、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と特
異的に結合する免疫グロブリンを検出する方法において使用することも包含され
る。本発明の生産物および方法は、動物の体液中の抗Ｄｅｒ−ｍａｐ抗体を検出
することができ、かつ疾患に関するＩｇＥまたはＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク
質の活性を阻害することができるため都合がよい。
【００１３】 本発明の１つの実施形態は、単離Dermatophagoidesアレルゲン組成物であり、
同アレルゲン組成物には、（ａ）（１）Dermatophagoides抽出物のうちの可溶性
タンパク質をゲルろ過する工程と、（２）排除されたタンパク質をゲルろ過カラ
ムから収集し、その排除タンパク質を陰イオン交換カラムに付す工程と、（３）
陰イオン交換カラムに結合したタンパク質を約０．３ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８で溶出し、Dermatophagoidesアレルゲン組成物を得る工程とから成る方法によ
って製造された組成物と、（ｂ）工程（ａ）により製造されたタンパク質のペプ
チドを含む組成物とが含まれ、同アレルゲン組成物はＩｇＥと結合する能力、Ｂ
リンパ球応答を刺激する能力、およびＴリンパ球応答を刺激する能力含めた生物
学的機能を有する組成物とが含まれる。そのようなDermatophagoidesアレルゲン
組成物を本明細書ではＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ組成物と称する。適当なゲルろ過カ
ラムには、約５０ｋＤから約１５０ｋＤの間の分子量を有するタンパク質を排除
することが可能な任意のゲルろ過カラムが含まれる。好ましいゲルろ過カラムに
は、セファクリル（Sephacryl ）Ｓ−１００カラムが含まれるが、これに限定さ
れるわけではない。適当な陰イオン交換カラムには、約ｐＩ６よりも低いｐＩを
有するタンパク質と結合することが可能な任意の陰イオン交換カラムが含まれる
。好ましい陰イオン交換カラムには、Ｑ−セファロースカラムが含まれるが、こ
れに限定されるわけではない。本明細書に使用するように、「Ｂリンパ球応答を
刺激する」とは、ある動物において本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐにより優先的
に誘発される体液性免疫反応を増大させることを指し、その動物におけるＢリン
パ球の活性に関する。本明細書に使用するように、「Ｔリンパ球応答を刺激する
」とは、ある動物において本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐにより優先的に誘発さ
れる細胞性免疫反応を増大させることを指し、その動物におけるＴリンパ球の活
性に関する。
【００１４】 本発明の１つの実施形態は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む単離タン
パク質である。「a またはan存在」という用語は、その存在が１または複数のあ
ることを指し、例えば、タンパク質（a protein ）、核酸分子（a nucleic acid
）、抗体（an antibody ）、阻害剤（an inhibitor）、化合物（a compound）、
または治療用組成物（a therapeutic composition ）とは、それぞれ「１または
複数のの、または「少なくとも１つの、１以上の」タンパク質、核酸分子、抗体
、阻害剤、化合物、または治療用組成物のことを指すことに留意すべきである。
それに関して、「a 」（または「an」）、「１または複数のの」および「少なく
とも１つの、１以上の」という言葉は、本明細書において置き換え可能に使用さ
れうる。また、「備える（comprising）」、「含む、包含する（including ）」
、および「有する（having）」という言葉が置き換え可能であることも留意すべ
きである。本発明によれば、単離されたまたは生物学的に純粋なタンパク質とは
、天然の環境から取り出されたタンパク質である。それに関して、「単離された
」および「生物学的に純粋な」というのは、タンパク質の精製の程度を必ずしも
反映していない。本発明の単離タンパク質は、天然起源から得ることも、組換え
ＤＮＡ技術を利用して製造することも、または化学合成により製造することも可
能である。
【００１５】 本明細書に使用するように、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質とは完全長のタ
ンパク質またはそのようなタンパク質の任意の同族体であり得る。本明細書に使
用するように、タンパク質とは当業者によって使用されるポリペプチドまたはペ
プチドであり得る。好ましくは、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＩｇＥ抗
体によって認識される少なくとも１つのエピトープを有するＤｅｒＨＭＷ−ｍａ
ｐタンパク質（すなわち本発明のタンパク質はＩｇＥ抗体と結合する）の少なく
とも一部を有し、動物の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の存在下でＢ
リンパ球の表面／またはＴ細胞受容体上に現れる抗体は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ
タンパク質に対するＩｇＥ媒介性病原の存在を示す証拠となる。
【００１６】 本発明のペプチドには、ＩｇＥに結合し、ダニアレルゲンに対して動物を脱感
作し、Ｂリンパ球応答を刺激し、および／またはＴリンパ球応答を刺激すること
が可能な本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が含まれる。好ましくは、本
発明のペプチドは、Ｂリンパ球エピトープまたはＴリンパ球エピトープを有する
。Ｂリンパ球エピトープを有するペプチドは抗体に結合することが可能である。
Ｔリンパ球エピトープを有するペプチドは、ペプチドがＴ細胞受容体を介してＴ
リンパ球を刺激できるような様式で、ＭＨＣ分子に結合することが可能である。
本発明によれば、Ｂリンパ球エピトープを有するペプチドは長さが約４残基から
約５０残基であり、好ましくは長さが約５残基から約２０残基である。本発明に
よれば、Ｔリンパ球エピトープを有するペプチドは長さが約４残基から約２０残
基であり、好ましくは長さが約８残基から約１６残基である。
【００１７】 同族体を含めた本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質に対するアレルギー反応を引き起こすそのタンパク質の能力に
よって直接的な方法で同定される。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質同族体の例
には、その同族体が天然ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するアレルギー反
応を引き起こす能力を有するようにアミノ酸が欠失されるか（例えば、ペプチド
のようにタンパク質を切り詰めた（truncated ）もの）、挿入されるか、転化さ
れるか、置換されるか、および／または誘導体にした（例えば、グリコシル化、
リン酸化、アセチル化、ミリスチン酸化、フェニル化、パルミチン酸化、アミド
化および／またはグリセロホスファチジルイノシトールの添加による）ＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐタンパク質が含まれる。
【００１８】 ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質同族体は、天然対立変異の結果としてまたは
天然突然変異の結果として生じたものであってもよい。また、本発明のＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐタンパク質同族体は、例えば、ランダムまたは標的突然変異誘発を
起こす古典的技術または組換え核酸技術を用いてタンパク質を直接修飾する技術
やタンパク質をコードする遺伝子を修飾する技術を当該技術分野における周知の
技術を用いて製造してもよいが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】 本発明の１つの実施形態は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配
列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列
番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、および
配列番号４５の核酸配列ならびにこれらの核酸配列のうちの任意のものの相補的
配列を有するＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子である。これらの核酸配列について本
明細書においてさらに説明する。例えば、配列番号１４の核酸配列は、本明細書
においてＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子核酸分子ｎＤｅｒｆ９８1752と示したｃＤ
ＮＡ（相補的ＤＮＡ）のコード鎖に由来する配列をあらわす。同核酸分子の製造
方法は実施例に開示している。核酸分子ｎＤｅｒｆ９８1752は、見かけ上完全長
のコード領域を有する。配列番号１４の相補的配列（本明細書に配列番号１６と
して示す）とは、鎖配列番号１４を有する鎖に相補的な鎖の核酸配列のことを指
し、これは当業者によって容易に決定可能である。同様に、本発明の任意の核酸
配列に相補的な核酸配列とは、配列が列挙された鎖と相補的な（すなわち、二重
らせんを形成可能な）核酸鎖の核酸配列のことを指す。核酸配列決定技術には全
く誤りがないというわけではないため、配列番号１４（および同様に本明細書に
示した他の核酸およびタンパク質配列）は本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパ
ク質をコードする核酸分子の見かけ上の核酸配列を示していることに留意する。
【００２０】 別の実施形態において、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子または核酸分子は、配列
番号１４または配列番号１６、もしくは本明細書に列挙した任意の他のＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐ核酸配列と同一ではないが類似の配列を有する対立変異型であり得
る。例えば、配列番号１４または配列番号１６を有するＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ遺
伝子の対立変異型とは、ゲノム中の配列番号１４および配列番号１６を含む遺伝
子と本質的に同じ座（または複数の座）に現れるが、例えば突然変異または組換
えにより天然の変異が起こったために、類似ではあるが同一ではない配列を有す
るようになった遺伝子である。自然淘汰では通常、機能に影響を与える変化に逆
らう選択が行われるため、対立変異型（すなわち列挙した核酸配列と類似または
同一の対立遺伝子）は通常、比較した遺伝子によりコードされたタンパク質と類
似の活性を有するタンパク質をコードする。遺伝子または核酸分子の対立変異型
は遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）を変更したり、
または形成過程にある転写物に代替スプライシングをしたりすることにより、代
替エキソンを並置させることも含み得る。対立変異型というものは当業者に周知
であり、Dermatophagoidesを初めとする所定のダストダニに自然に起こると期待
される。その理由は、それらのダニの各ゲノムが二倍体であり、有性生殖により
対立遺伝子の再構築が生じるためである。
【００２１】 本発明の１つの実施形態において、単離ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質はＤ
ｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする遺伝子とストリンジェントなハイブ
リッド形成条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる。本発明
のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の最小サイズは、対応する天然タンパク質を
コードする核酸分子の相補的配列と安定なハイブリッドを形成する（すなわち、
ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する）能力を有
する核酸分子によりコードされるのに十分なサイズである。そのようなタンパク
質をコードする核酸分子のサイズは、核酸の組成およびＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核
酸分子とその相補的核酸配列との間の相同性パーセントによる。ストリンジェン
トな条件下で安定なハイブリッドを形成するのに必要な相同性の程度は、相同な
配列が所定の核酸分子中に散在しているか所定の核酸分子上の特定の領域に集中
している（すなわち局在化している）かによって変化し得る。
【００２２】 ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする遺伝子と安定なハイブリッドを
形成することが可能な核酸分子の最小サイズは通常、核酸分子にＧＣが豊富に含
まれていれば少なくとも長さ約１２ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドであり
、核酸分子にＡＴが豊富に含まれていれば少なくとも長さ約１５から約１７塩基
である。本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質同族体をコードするのに使用
される核酸分子の最小サイズは長さ約１２から約１８ヌクレオチドであり、好ま
しくは長さは約１２ヌクレオチド、または約１５ヌクレオチド、または約１８ヌ
クレオチドである。本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質同族体の最小サイ
ズは長さ約４から約６アミノ酸である。本発明の核酸分子は遺伝子の部分、遺伝
子全体、または複数の遺伝子を含み得るため、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタ
ンパク質をコードする核酸分子の最大サイズには、実際の制限以外には制限がな
い。本発明の核酸分子によりコードされたタンパク質の好ましいサイズは、その
ようなタンパク質が完全長タンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質、また
はそのようなタンパク質の機能部分のいずれであることが望ましいかによって決
定される。好ましくは、本発明の核酸分子によりコードされたタンパク質の好ま
しいサイズは、免疫反応を引き起こすタンパク質の一部分であり、約３０のアミ
ノ酸、より好ましくは約３５アミノ酸、より好ましくは約４４アミノ酸の長さで
ある。
【００２３】 ストリンジェントなハイブリッド形成条件は核酸分子がハイブリッド形成する
遺伝子の形成された物理的性質に基づいて決定されると共に、数学的に定義し得
る。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は個々の当業者が異種の核酸分子
間の有意な類似性を同定するのを可能にする実験パラメータである。これらの条
件は、当業者に周知である。例えば、サンブルック（Sambrook）ら、１９８９年
、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labs Press
、およびマインコス（Meinkoth）ら、１９８４年、Anal. Biochem. 第１３８巻
、２６７−２８４頁を参照されたい。これらの引用文献に詳細に説明しているよ
うに、ハイブリッド形成条件の決定には、イオン強度（モル／リットルで、Ｍ）
、ハイブリッド形成温度（℃）、核酸らせん不安定化剤（ホルムアミド等）の濃
度、最短ハイブリッド二本鎖（ｎ）の平均長さ、および未知の核酸分子がハイブ
リッド形成する断片のＧ＋Ｃ組成を初めとする一連の変数の操作が含まれる。約
１５０以上のヌクレオチドの核酸分子の場合、それらの変数を標準的数式に入れ
て、所定の核酸分子の融解温度すなわちＴｍ を計算する。以下の式で定義する
ように、Ｔｍは２つの相補的な核酸分子鎖が解離して、２本の鎖の間で１００％
の相補性をとる温度である。
【００２４】 Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ｌｏｇＭ＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−５００／ｎ−
０．６１（％ホルムアミド） 約５０ヌクレオチドよりも小さい核酸分子の場合、ハイブリッドの安定性は解離
温度（Ｔｄ）によって形成される。解離温度は二本鎖の５０％が解離する温度と
して定義される。この小さな分子の場合、標準イオン強度における安定性は以下
の等式により形成される。
【００２５】 Ｔｄ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） Ｔｄより低い５℃という温度が、完全に対合する分子間のハイブリッド形成を検
出するために使用される。 所定の位置における塩基の非相補性を初めとする塩基の誤対合すなわち比較され
ている２つの核酸分子間の相違や、比較されている２つのいずれかの核酸分子上
の所定の位置において１または複数のの塩基が挿入されるか欠失したことによる
ギャップが、異なるサイズを有する核酸分子のＴｍまたはＴｄにいかに影響を及
ぼすかということも、当業者には周知である。例えば、Ｔｍは約１５０ｂｐより
も大きいハイブリッドに各々１％の誤対合塩基がある場合に約１℃減少し、Ｔｄ
は約５０ｂｐよりも小さいハイブリッドに各々誤対合塩基がある場合約５℃減少
する。約５０から約１５０塩基の間のハイブリッドに対する条件は、当業者に周
知の標準的実験方法を用いて、経験的にかつ過度の実験を行なわずに決定し得る
。このような簡単な方法により、当業者は（例えば、塩濃度、ホルムアミド濃度
または温度を変更することにより）ハイブリッド形成の条件を設定することが可
能となり、その結果、特定の％よりも少ない塩基誤対合を有する核酸ハイブリッ
ドのみがハイブリッドを形成する。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は
、約３０％以下の塩基誤対合（すなわち、約７０％以上の相同性）を有する分子
間のハイブリッド形成を許容する実験条件であるものとして当業者には一般に理
解されている。当業者は試験する所定の核酸分子が約５０ヌクレオチドよりも小
さいか大きいかを容易に決定でき、ゆえにハイブリッド形成条件のための適当な
式を選択できるため、当業者は核酸分子がストリンジェントなハイブリッド形成
条件下で所定の遺伝子とハイブリッド形成するかどうか、および同様に核酸分子
が所望量の塩基対誤対合を許容するよう設計された条件下でハイブリッド形成す
るかどうかを決定することが可能である。
【００２６】 ハイブリッド形成反応は、ハイブリッド形成させる核酸分子を、メンブレンを
初めとする固相支持体に取り付け、次にハイブリッド形成溶液中に懸濁させたプ
ローブと通常称される標識核酸分子とハイブリッド形成させることにより遂行さ
れる。一般的なハイブリッド形成反応技術の例には周知のサザンおよびノーザン
ブロッティング法が含まれるが、それらに限定されるわけではない。通常、実際
のハイブリッド形成反応はストリンジェントではない条件下、すなわち温度が低
くおよび／または塩濃度が高い条件下で行われ、次に所望のストリンジェンシー
を得るためにより高い温度および／またはより低い塩濃度でメンブレンを洗浄す
ることにより高いストリンジェンシーが達成される。
【００２７】 例えば、熟練技術者が長さが約１５０ｂｐのDermatophagoides farinaeおよび
／またはDermatophagoides pteronyssius 核酸分子とストリンジェントなハイブ
リッド形成条件下でハイブリッド形成する核酸分子を同定したい場合、以下の条
件が好ましくは使用され得る。Dermatophagoides farinaeＤＮＡおよびDermatop
hagoides pteronyssius ＤＮＡの平均Ｇ＋Ｃ含量は約３９％である。未知の核酸
分子を支持膜に取り付けて、１５０ｂｐプローブを例えば放射性標識で標識する
。ハイブリッド形成反応は、２ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で
、約３７℃の温度で（低ストリンジェンシー条件）にて行われ得る。異なる濃度
のＳＳＣの溶液は、２０ＸＳＳＣ（１リットルの水に１７５．３グラムＮａＣｌ
と約８８．２グラムのクエン酸ナトリウムを溶解、ｐＨ７）のストック溶液を希
釈して所望濃度のＳＳＣを得ることにより当業者は製造することが可能である。
高ストリンジェンシーなハイブリッド形成を達成するために、熟練技術者は３０
％塩基対誤対合までを許容のに必要な洗浄条件を計算するであろう。例えば、１
ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む洗浄溶液において、完全なハイブリッド
のＴｍは約８０℃である。
【００２８】 ８１．５℃＋１６．６ｌｏｇ（．１５Ｍ）＋（０．４１×３９）−（５００／
１５０）−（０．６１×０）＝８０．４℃ このように、約３０％塩基対の誤対合を有する核酸分子とのハイブリッド形成
を達成するには、ハイブリッド形成の洗浄が約５０℃の温度で遂行される。した
がって本明細書に開示した望ましい塩基対誤対合、式、およびＧ／Ｃの割合に基
づいてハイブリッド形成温度を追加計算することは、当業者の技術の範囲内にあ
る。例えば、本明細書に特定した配列を有する本発明の核酸分子に対してハイブ
リッド形成を試験する核酸分子は１５０ヌクレオチドよりも長くなるため、３０
％塩基対誤対合までを許容するハイブリッド形成反応のためのＴｍは５０℃から
大幅には変化しないことが当業者には理解される。
【００２９】 さらに、２つの核酸配列間の類似性の程度を決定する市販のコンピュータプロ
グラムの存在が当該技術分野において知られている。このようなコンピュータプ
ログラムには、ハイブリッド核酸分子間の相同性パーセントならびにギャップの
数および長さを決定する種々の既知の方法が含まれる。アミノ酸配列間および核
酸配列間の相同性パーセントを決定する好ましい方法には、核酸またはアミノ酸
配列を比較および解析するように設計された１または複数のの市販のコンピュー
タプログラムを利用した解析が含まれる。このようなコンピュータプログラムに
は、ＧＣＧ（商標）（ウィスコンシン州マディソン（Mad ison ）所在、Genetic
s Computer Group 社より入手可能）、ＤＮＡｓｉｓ（商標）（カリフォルニア
州サンブルーノ（San Bruno ）所在、Hitachi Software社より入手可能）、およ
びＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）（コネティカット州ニューヘーヴン（New Haven
）所在、Eastman Kodak Company 社より入手可能）が含まれるが、それらに限定
されるわけではない。アミノ酸配列間および核酸配列間の相同性パーセントを決
定する好ましい方法には、デフォールトパラメータを利用してＤＮＡｓｉｓ Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ２．１プログラムで最大対合させることによる比較機能（Compare
function）の使用が含まれる。
【００３０】 本発明の１つの実施形態は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を包含する。１
つの実施形態において本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質には、１２％ト
リス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元されると図１に示すように約９８ｋ
Ｄから約１０９ｋＤまでの分子量のバンドとして移動するタンパク質が含まれる
。図１のバンドは実施例１に詳細に記載した方法を用いて、タンパク質をDermat
aphagoides farinaeダニより採取した場合に得られる。好ましくは、本発明のＤ
ｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は約９０ｋＤから約１２０ｋＤの範囲、より好ま
しくは約９８ｋＤから約１０９ｋＤの範囲の分子量を有するタンパク質を含む。
本発明の好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ｍａｐＡおよびｍａｐＢ
を含むが、これらの同定については実施例の項に記載している。
【００３１】 別の実施形態において、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は１４％ト
リス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元されると図２に示すように約６０ｋ
Ｄの分子量のバンドとして移動するタンパク質を含む。図２のバンドは 実施例
９に詳細に記載した方法を用いて、タンパク質をDermataphgoides farinae ダニ
より採取した場合に得られる。好ましくは、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質は約６０ｋＤの分子量のタンパク質を含む。本発明の好ましいＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐタンパク質は、ｍａｐＤを含むが、この同定については実施例の項に
記載している。
【００３２】 別の実施形態において、好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、約５０
以上のヌクレオチドまたは約１５０以上ヌクレオチドである核酸分子であって、
好ましくは約４０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約
３５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約３０％以下の
塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約２５％以下の塩基対誤対合
を許容する条件下で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤対合を許容する条
件下で、より好ましくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より
好ましくは約１０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約
５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、配列番号１６、配列番号１９、配
列番号２２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５ならび
に配列番号３３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列および
その相補的配列から成る群より選択された核酸分子とハイブリッド形成する核酸
分子によりコードされたタンパク質を含む。
【００３３】 本発明の別の実施形態は以下の核酸分子から成る群より選択された核酸分子に
よりコードされたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む：約１５０以上のヌク
レオチドを有する核酸分子であって、１ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含有
する溶液中で、約５０℃の温度にて、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２
２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、ならびに配列
番号３３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列の相補的配列
から成る群より選択された核酸配列とハイブリッド形成する前記約１５０以上の
ヌクレオチドを有する核酸分子と、１５以上のヌクレオチドを含むそれらの核酸
分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸分子。
【００３４】 さらに別の本発明の好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１
４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０
、配列番号４３、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードする核酸配列の相補的配列の核酸配列を有する核酸分子に対して、好
ましくは約６０％以上同一、より好ましくは約６５％以上同一、より好ましくは
約７０％同一以上、より好ましくは約７５％以上同一、より好ましくは約８０％
以上同一、より好ましくは約８５％以上同一、より好ましくは約９０％以上同一
、およびより好ましくは約９５％以上同一な核酸分子によりコードされたタンパ
ク質を含み、そのようなタンパク質の断片もまた好ましい。本明細書に使用する
ように相同性パーセントはデフォールトパラメータを利用してＤＮＡｓｉｓ Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ２．１プログラムで最大対合させることによる比較機能（Compare
function）の使用により決定される。
【００３５】 さらなる好ましい本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番
号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号
２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３
３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４のアミノ酸配列
を有するタンパク質と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配
列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配
列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列
番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番
号４１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク質の同族体を備えたタン
パク質であって、そのような同族体が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配
列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配
列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列
番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番
号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号
３８、配列番号４１、配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して
免疫反応を誘発する少なくとも１つのエピトープを有するタンパク質とを含む。
同様に、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号
３７、配列番号４０、配列番号４３の核酸配列および／または配列番号３３のア
ミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子によって
、またはその同族体によってコードされたタンパク質が好ましい。
【００３６】 本発明の好ましい単離タンパク質は、以下の核酸分子のうちの少なくとも１つ
によりコードされたタンパク質である：ｎＤｅｒｆ９８1752、ｎＤｅｒｆ９８16 65 、ｎＤｅｒｆ９８1608、ｎＤｅｒｐ９８1621、ｎＤｅｒｐ９８1527、ｎＤｅｒ
ｐ９８1470、ｎＤｅｒｆ６０510 、またはそれらの核酸分子のうちの任意の核酸
分子の対立変異型。別の好ましい単離タンパク質は、配列番号１４、配列番号１
７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３
の核酸配列を有する核酸分子によりコードされるかまたはそれらの列挙した核酸
分子のうちの任意の核酸分子の対立変異型によりコードされたタンパク質である
。
【００３７】 配列番号１４の翻訳物、つまりｎＤｅｒｆ９８1752のコード鎖は、本明細書に
ＰＤｅｒｆ９８555 として示したように約５５５アミノ酸から成るタンパク質を
生じ、このアミノ酸配列は配列番号１５に示しており、配列番号１４のヌクレオ
チド１からヌクレオチド３までに亘って第１のインフレームコドンを採用する。
配列番号１４の相補鎖を本明細書に配列番号１６と示す。ＰＤｅｒｆ９８555 の
アミノ酸配列は配列番号１７で示したコード鎖および配列番号１９で示した相補
鎖を有する核酸分子ｎＤｅｒｆ９８1665によりコードされる。配列番号１５の解
析により、約１アミノ酸から約１９アミノ酸にわたるシグナルペプチドの存在が
示唆される。本明細書にＰＤｅｒｆに９８536 として示した予想の成熟タンパク
質は、配列を本明細書に配列番号２１として示した約５３６個のアミノ酸を含み
、かつ本明細書において配列番号２０つまりコード鎖、および配列番号２２つま
り相補鎖により示したｎＤｅｒｆ９８1608と称する核酸分子によりコードされる
。
【００３８】 配列番号３４の翻訳物、つまりｎＤｅｒｐ９８1621のコード鎖は、本明細書に
ＰＤｅｒｐ９８509 として示したように約５０９アミノ酸から成るタンパク質を
生じ、このアミノ酸配列は配列番号３５に示しており、配列番号３４のヌクレオ
チド１４からヌクレオチド１６までにわたる第１のインフレームコドンを採用す
る。配列番号３４の相補鎖を本明細書に配列番号３６と示す。ＰＤｅｒｐ９８50 9 のアミノ酸配列は配列番号３７で示したコード鎖および配列番号３９で示した
相補鎖を有する核酸分子ｎＤｅｒｐ９８1527によりコードされる。配列番号３５
の解析により、約アミノ酸１から約１９アミノ酸に亘ってシグナルペプチドの存
在が示唆される。本明細書にＰＤｅｒｐ９８490 として示した予想の成熟タンパ
ク質は、配列を本明細書に配列番号４１として示した約４９０個のアミノ酸を含
み、かつ本明細書において配列番号４０つまりコード鎖、および配列番号４２つ
まり相補鎖により示したｎＤｅｒｐ９８1470と称する核酸分子によりコードされ
る。
【００３９】 配列番号４３の翻訳物、つまりｎＤｅｒｆ６０510 のコード鎖、D.farinae ６
０−ｋＤ抗原タンパク質の一部をコードする核酸分子は本明細書にＰＤｅｒｆ６
０170 として示したように約１７０アミノ酸のタンパク質を生じ、このアミノ酸
配列は配列番号４４に示しており、配列番号４３のヌクレオチド１からヌクレオ
チド３までにわたる第１のインフレームコドンを採用する。配列番号４３の相補
的配列を本明細書に配列番号４５として示す。
【００４０】 本発明の好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＰＤｅｒｆ９８555 に
対して約４５％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約５５％以上、
より好ましくは約６０％以上、より好ましくは約６５％以上、より好ましくは約
７０％以上、より好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０％以上、より
好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、およびより好ましくは
約９５％同一なタンパク質を含む。より好ましいのは、ＰＤｅｒｆ９８555 、Ｐ
Ｄｅｒｆ９８536 、ＰＤｅｒｐ９８509 、ＰＤｅｒｐ９８490 、および／または
ＰＤｅｒｆ６０170 を含むＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、ＰＤｅｒｆ９８ 555 、ＰＤｅｒｆ９８536 、ＰＤｅｒｐ９８509 、ＰＤｅｒｐ９８490 、および
／またはＰＤｅｒｆ６０170 タンパク質をコードする核酸分子の対立変異型によ
ってコードされたタンパク質である。
【００４１】 本発明の他の好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、配列番号１、配列
番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列
番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１
３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４
、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、
配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配列番号４４のア
ミノ酸配列に対して約４５％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約
５５％以上、より好ましくは約６０％以上、より好ましくは約６５％以上、より
好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０
％以上、より好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ま
しくは約９５％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。より好ましいの
は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列
番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番
号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号
３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／ま
たは配列番号４４のアミノ酸配列を含むＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、配
列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配
列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１
２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３
、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、
配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および／または配
列番号４４のアミノ酸配列を含むＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする
核酸分子の対立変異型によってコードされたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質で
ある。
【００４２】 本発明の１つの実施形態において、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質はアミノ
酸配列配列番号１５、配列番号３５、および／または配列番号４４（アミノ酸配
列配列番号１５、配列番号３５、および／または配列番号４４から成るタンパク
質、それらの断片、融合タンパク質および多価タンパク質が含まれるがそれらに
限定されるわけではない）、およびアミノ酸配列配列番号１５、配列番号３５、
および／または配列番号４４を有するタンパク質をコードする核酸分子の対立変
異型によりコードされたタンパク質を含む。
【００４３】 １つの実施形態において、好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は長さ約
３５アミノ酸以上、好ましくは長さ約５０アミノ酸以上、より好ましくは長さ約
１００アミノ酸以上、より好ましくは長さ約２００アミノ酸以上、より好ましく
は長さ約２５０アミノ酸以上のアミノ酸配列を有する。この実施形態のうち、本
発明の好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は少なくとも配列番号１５の一
部分のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、好ましいＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質は完全長のタンパク質、すなわち完全長のコード領域によりコ
ードされたタンパク質を有する。
【００４４】 本発明のさらなる好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質はｎＤｅｒｆ９８ 1752 、ｎＤｅｒｆ９８1665、ｎＤｅｒｆ９８1608、ｎＤｅｒｐ９８1621、ｎＤｅ
ｒｐ９８1527、ｎＤｅｒｐ９８1470、およびｎＤｅｒｆ６０510 の少なくとも一
部を含む核酸分子によりコードされたタンパク質とそのような核酸分子の対立変
異型によりコードされたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質とを有する。
【００４５】 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３７、
配列番号４０、配列番号４３の少なくとも一部を含む核酸配列および／またはア
ミノ酸配列配列番号３３を含むタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分
子、ならびにこれらの核酸分子の対立変異型によりコードされたＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質も好ましい。
【００４６】 別の実施形態において、本発明の好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は
、約１２ヌクレオチド以上、好ましくは約１６ヌクレオチド以上、より好ましく
は約１８ヌクレオチド以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上、より好ま
しくは約２５ヌクレオチド以上、より好ましくは約５０ヌクレオチド以上、より
好ましくは約１００ヌクレオチド以上、より好ましくは約３５０ヌクレオチド以
上、より好ましくは約４５０ヌクレオチド以上、より好ましくは約５００ヌクレ
オチド以上、より好ましくは約８００ヌクレオチド以上を有する核酸分子により
コードされる。この実施形態の中に、ｎＤｅｒｆ９８1752、ｎＤｅｒｐ９８1621 、および／またはｎＤｅｒｆ６０510 の少なくとも一部またはこれらの核酸分子
の対立変異型によりコードされたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が含まれる。
さらに別の実施形態において、本発明の好ましいＤｅｒｍａｐタンパク質は、見
かけ上完全長のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐのコード領域を有する核酸分子、すなわち
見かけ上完全長のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子により
コードされる。
【００４７】 本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の１つの実施形態は、１または複数
のの融合セグメントに結合されるＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質含有ドメイン
を有する融合タンパク質である。本発明に使用するのに適当な融合セグメントに
は、タンパク質の安定性を向上させるセグメント、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパ
ク質に対する免疫反応を向上させる免疫増強剤として作用するセグメント、Ｄｅ
ｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するＩｇＥ応答を減少させるセグメント、およ
び／または（例えば、アフィニティクロマトグラフィーにより）ＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質の精製を支援するセグメントが含まれるが、それらに限定され
るわけではない。適当な融合セグメントは、所望の機能（例えば安定性の向上へ
の寄与、タンパク質に対する免疫原性増大への寄与、ＩｇＥ応答の減少、および
／またはタンパク質精製の簡略化）を有する任意のサイズのドメインであってよ
い。融合セグメントはタンパク質のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質含有ドメイ
ンのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に結合されて、開裂を受けてＤｅ
ｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を直接回収することを可能にし得る。融合タンパク
質は好ましくはＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質含有ドメインのカルボキシ末端
またはアミノ末端の少なくとも一方に結合された融合セグメントを含むタンパク
質をコードする融合核酸分子によって形質転換された組換え細胞を培養すること
により生産し得る。好ましい融合セグメントには、金属結合ドメイン（例えば、
ポリヒスチジンセグメント）免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、タンパク質
Ａ、タンパク質Ｇ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃ受容体、または補体タンパク質抗体結
合ドメイン）、糖結合ドメイン（例えば、マルトース結合ドメイン）、「標識（
tag ）」ドメイン（例えば−ガラクトシダーゼの少なくとも一部、連鎖球菌標識
ペプチド、モノクローナル抗体を初めとするドメインに結合する化合物を用いて
精製可能な他のドメイン）、および／またはリンカーおよび酵素ドメイン（例え
ば、リンカーによりＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合されるアルカリホス
ファターゼドメイン）が含まれる。より好ましい融合セグメントには、ポリヒス
チジンセグメントを初めとする金属結合ドメイン、マルトース結合ドメイン、フ
ロリダ州タンパ（Tampa ）所在のバイオメトラ社（Biometra）等より入手可能な
連鎖球菌標識ペプチド、およびファージＴ７Ｓ１０７ペプチドが含まれる。
【００４８】 別の実施形態において、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、動物を
１または複数ののアレルゲンから脱感作することを可能にする少なくとも１つの
さらなるタンパク質セグメントも有する。このような多価脱感作タンパク質は、
得られた核酸分子が動物をアレルゲンから脱感作する２つ以上の脱感作化合物を
含む多価脱感作化合物として発現されるような、互いに結合された２つ以上の核
酸ドメインを含む核酸分子により形質転換された細胞を培養することにより生産
することが可能である。
【００４９】 多価脱感作化合物の例としては、植物アレルゲン、動物アレルゲン、寄生生物
アレルゲン、または外部寄生生物アレルゲンを初めとする１または複数ののアレ
ルゲンによって引き起こされるアレルギーを脱感作する１または複数のの化合物
と結合された本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が含まれるが、それらに
限定されるわけではない。また、それらのアレルゲンしては牧草、ヒロハノウシ
ノケグサ（Meadow Fescue ）、カーリードック（Curly Dock）、オオバコ（plan
tain）、メキシカンファイヤーバシュ（Mexican Firebush）、シロザ（Lamb's Q
uarters ）、ビッグウィード（pigweed ）、ブタクサ（ragweed ）、セージ（sa
ge）、ニレ（elm ）、オナモミ（cocklebur ）、トネリコバカエデ（Box Elder
）、クルミ（walnut）、ハコヤナギ（cottonwood）、トネリコ（ash ）、カバ（
birch ）、シダー（cedar ）、オーク（oak ）、クワ（mulberry）、ゴキブリ（
cockroach ）、ダーマトファゴイデス属（Dermatophagoides）、アルテリナリア
属（Alternaria）、コウジカビ属（Aspergillus ）、クラドスポリウム属（Clad
osporium）、フザリウム属（Fusarium）、ヘルミントスポリウム属（Helminthos
porium）、ケカビ属（Mucor ）、アオカビ属（Penicillium ）、プルラリア属（
Pullularia）、クモノスカビ属（Rhizopus）および／または白癬菌属（Tricophy
ton ）由来の全身性アレルギー、蠕虫（helminths ）由来の寄生生物アレルゲン
、またはノミ、ダニ（ticks ）、ハエ、カ、チョウバエ（sand flies）、ブユ（
black flies ）、シラミバエ（horse flies ）、ツノサシバエ（horn flies）、
メクラアブ（deer flies）、ツェツェバエ（tsetse flies）、サシバエ（stable
flies）、蝿蛆症発症バエ（myiasis-causing flies ）およびヌカカ（biting g
nats）、アリ、クモ、シラミ、ダニ（mites ）および半翅類の昆虫を初めとする
蛛形（しゅけい）類（arachnids ）、昆虫類（insects ）およびヒル（leeches
）由来の外部寄生生物アレルゲンが含まれるが、それらに限定されるわけではな
い。
【００５０】 本発明は本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のミメトープも包含する。
本明細書に使用するように、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のミメト
ープとは、多くの場合ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を模倣した構造をそのミ
メトープが有するゆえにそのようなＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の活性（例
えば、結合してＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する免疫反応を引き起こす
能力）を模倣することが可能な、任意の化合物のことを指す。しかしながら、ミ
メトープはそのミメトープがＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の機能を模倣して
いる限り、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に類似の構造を有する必要はないこ
とに留意すべきである。ミメトープには、分解への感受性が減ぜられるよう修飾
されたペプチド、抗イディオタイプおよび／または触媒抗体、またはそれらの断
片、単離タンパク質の非タンパク質免疫原性部分（例えば炭水化物構造）、核酸
を初めとする合成または天然の有機または無機分子、および／または任意の他の
ペプチド模倣化合物が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。本発明の
ミメトープは本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に関するコンピュータ生
成構造を利用して設計することが可能である。ミメトープはヌクレオチド、ペプ
チドまたは他の有機分子を初めとする分子のランダムなサンプルを生成し、その
ようなサンプルを対応する結合相手（例えば、抗ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク
質抗体）を使用してアフィニティクロマトグラフィー技術によりスクリーニング
することによっても得ることが可能である。またミメトープは、例えば、合理的
薬物設計（rational drug d esign）によっても得ることが可能である。ある合
理的薬物設計のプロセスにおいて、本発明の化合物の三次元構造は、例えば核磁
気共鳴法（ＮＭＲ）またはＸ線結晶構造解析法により解析可能である。次にこの
三次元構造を利用して例えばコンピュータモデリング法により、ミメトープの予
測をすることが可能である。次に予測されたミメトープの構造を、例えば化学合
成法や組換えＤＮＡ技術によるか、または天然起源からミメトープを単離するか
により製造することが可能である。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のミメトー
プの特定の例には、抗イディオタイプ抗体、Ｓｅｌｅｘ（商標）法を用いて製造
したオリゴヌクレオチド、ペプチドライブラリーのランダムスクリーニングによ
り同定されたペプチド、およびファージ表示技術により同定されたタンパク質が
含まれる。好ましいミメトープは、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、
特に、免疫反応を引き起こすＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質のエピトープ、と
構造的および／または機能的に類似したペプチド模倣化合物である。
【００５１】 本発明は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の突然変異タンパク質も
包含する。本明細書に使用するように、突然変異タンパク質とは、所望のアミノ
酸残基が置換されるかまたは除去されたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の特定
の同族体のことを指す。本発明の好ましい突然変異タンパク質には、アミノ酸残
基が変更されることによりその突然変異タンパク質が治療用の容量で動物に投与
された場合にその動物によるアナフィラキシー反応が減少する、ＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質同族体が含まれる。さらに好ましい本発明の突然変異タンパク
質には、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の１または複数ののシステイン残基が
置換されるかまたは除去されたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質同族体が含まれ
る。突然変異タンパク質の製造方法は当業者に周知であると共に、本明細書に開
示されている。好ましくは、突然変異タンパク質は組換え技術を用いて製造され
る。
【００５２】 本発明の別の実施形態はＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む単離核酸分子で
ある。そのような核酸分子の識別特性については先に記載した。本発明の核酸分
子には単離天然ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子またはその同族体が含まれ、同族体
については以下により詳細に記載する。本発明の核酸分子は１または複数のの調
節領域、完全長のまたは部分長のコード領域、またはそれらの組み合わせを含み
得る。本発明の核酸分子の最小サイズは、別の核酸分子の相補的配列との安定な
ハイブリッドの形成（すなわちストリンジェントなハイブリッド形成条件下での
ハイブリッド形成）を可能にするのに十分なサイズである。
【００５３】 本発明によれば、単離核酸分子は自然環境から取り出された（すなわち、人的
操作を受けた）核酸分子であると共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡまたは
ＲＮＡのうちのいずれかの誘導体であってよい。そのようなものとして、「単離
」とは、核酸分子が精製された程度を反映していない。本発明の単離ＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐ核酸分子またはその同族体は、天然起源から単離されてもよいし、組
換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはクローニ
ング）または化学合成を利用して製造してもよい。単離ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核
酸分子およびその同族体には、例えば、天然対立変異型や、本発明のＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子の能力に実質的に干渉しないような
方法でヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または逆位により修飾を受け
た核酸分子が含まれる。
【００５４】 ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子の同族体は当業者に周知の多くの方法により製
造可能である。例えば、サンブルック（Sambrook）ら、１９８９年、Molecular
Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labs 出版や、サンブルッ
ク（Sambrook）ら、前掲の文献を参照されたい。例えば核酸分子は、部位特定突
然変異誘発、化学処理、制限酵素による開裂、核酸断片の連結反応、ＰＣＲ増幅
、オリゴヌクレオチド混合物の合成および混合物群の連結反応による核酸分子混
合物の混合物の「構築」、ならびにそれらの組合せを初めとする古典的な突然変
異誘発および組換えＤＮＡ技術を含めた種々の技術により修飾されるが、それら
に限定されるわけではない。核酸分子同族体はＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子と
のハイブリッド形成かＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子によりコードされたタンパ
ク質の機能（例えばＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の少なくとも１つのエピト
ープに対する免疫反応を誘発する能力またはＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ活性をもたら
す能力）をスクリーニングすることにより選択し得る。
【００５５】 対立変異型は一般に、対照の遺伝子によりコードされたタンパク質の活性と類
似の活性を有するタンパク質をコードする。対立変異型は、同遺伝子の５’また
は３’非翻訳領域に（例えば、調節制御領域に）変更を有し得る。対立変異型は
当業者に周知であり、ダストダニのゲノムが二倍体であるかおよび／または２以
上のダストダニのグループの中にあるため、所定のダストダニに見出されるもの
と期待される。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅中に製造された変異型のよ
うな実験室での操作による変異型も含むが、それに限定されるわけではない。
【００５６】 本発明の単離核酸分子は本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の少なくと
も１つをコードする核酸配列を有しうる。そのようなタンパク質の例は本明細書
に開示されている。「核酸分子」という熟語は主として物理的な核酸分子のこと
を指し、「核酸配列」という熟語は主として核酸分子のヌクレオチド配列のこと
を指す。この２つの熟語は、特にＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする
ことが可能な核酸分子または核酸配列に関して、互換的に用いることが可能であ
る。
【００５７】 本発明の好ましい核酸分子は、動物に投与されると、その動物をＤｅｒＨＭＷ
−ｍａｐアレルゲンにより引き起こされるアレルギー反応から脱感作することが
可能である。以下により詳細に開示するように、そのような核酸分子は、アンチ
センスＲＮＡ、三重らせんを形成可能な分子、リボゾーム、または他の核酸に基
づく薬剤化合物であってもよいし、またはそれらをコードするものであってもよ
い。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は脱感作タンパク質（例えば
、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質）をコードすると共に、その核酸分
子は例えば（すなわち、ＤＮＡ試薬として）直接投与されるかまたは組換えウィ
ルス試薬または組換え細胞試薬のような賦形剤にして動物に送達される。
【００５８】 本発明の１つの実施形態には、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で
ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ遺伝子とハイブリッド形成する単離核酸分子がある。スト
リンジェントなハイブリッド形成条件とは、本明細書に記載した標準的なハイブ
リッド形成条件のことを指す。本発明の好ましい核酸分子は、ストリンジェント
なハイブリッド形成条件下で配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４
、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１
０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８
、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配
列番号４１、および／または配列番号４４を有するアミノ酸配列を備えたタンパ
ク質をコードする遺伝子とハイブリッド形成する単離核酸分子を含む。本発明の
さらに好ましい核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４
、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１
０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８
、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配
列番号４１、および／または配列番号４４を有するアミノ酸配列を備えたタンパ
ク質をコードする核酸配列の相補的配列とストリンジェントなハイブリッド形成
条件下でハイブリッド形成する単離核酸分子を含む。
【００５９】 本発明のより好ましい核酸分子は、約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸
分子であって、１ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で、約５０℃の
温度にて、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号
３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５から成る群よ
り選択された核酸配列と、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を有する
タンパク質をコードする核酸配列およびその相補的配列とハイブリッド形成する
約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子から成る群より選択された単離核
酸分子を含む。
【００６０】 本発明は本明細書に開示した任意の核酸分子の断片をも包含する。本発明によ
れば、断片は任意の核酸分子または核酸配列を含み、そのサイズは本発明の配列
番号によって同定される配列よりも小さい長さと、本明細書に定義したオリゴヌ
クレオチドの最小サイズとの間の範囲に及び得る。例えば、本発明の断片のサイ
ズは、長さが約１７５２ヌクレオチドよりも小さくかつ１１ヌクレオチドよりも
大きい任意のサイズであり得る。
【００６１】 本発明の１つの実施形態において、好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は
、約５０以上のヌクレオチドまたは約１５０以上のヌクレオチドである単離核酸
分子を含むと共に好ましくは約４０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、
より好ましくは約３５％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましく
は約３０％以下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約２５％以
下の塩基対誤対合を許容する条件下で、より好ましくは約２０％以下の塩基対誤
対合を許容する条件下で、より好ましくは約１５％以下の塩基対誤対合を許容す
る条件下で、より好ましくは約１０％以下塩基対誤対合を許容する条件下で、よ
り好ましくは約５％以下塩基対誤対合を許容する条件下で、配列番号１４、配列
番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番
号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４２、配列番号
４３、配列番号４５、ならびに配列番号３３のアミノ酸配列を有するタンパク質
をコードする核酸配列、およびその相補的配列から成る群より選択された核酸分
子とハイブリッド形成する。
【００６２】 本発明の別の実施形態は、約１５０以上の塩基を有する核酸分子であって、同
核酸分子は１ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で約５０℃の温度に
て、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０
、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および／または配
列番号３３のアミノ酸配列を備えたタンパク質をコードする核酸配列およびその
相補的配列から成る群より選択された核酸配列とハイブリッド形成する。本発明
のさらなる好ましい核酸分子は、約１５０以上の塩基を有する単離核酸分子の断
片を有し、同核酸分子は、１ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含む溶液中で、
約５０℃の温度にて、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１
９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号１０
３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４
５、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を備えたタンパク質をコードす
る核酸配列およびその相補的配列から成る群より選択された核酸配列とハイブリ
ッド形成する。
【００６３】 本発明のさらなる好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、約５０以上のヌ
クレオチドまたは約１５０以上のヌクレオチドであって、配列番号１４、配列番
号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号
３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４
２、配列番号４３、配列番号４５、ならびに配列番号３３のアミノ酸配列を備え
たタンパク質をコードする核酸配列およびそれらの相補的配列から成る群より選
択された核酸配列と好ましくは約６０％以上同一、より好ましくは約６５％以上
同一、より好ましくは約７０％以上同一、より好ましくは約７５％以上同一、よ
り好ましくは約８０％以上同一、より好ましくは約８５％以上同一、より好まし
くは約９０％以上同一、より好ましくは約９５％以上同一な核酸配列を有する単
離核酸分子を含む。そのような核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片も好まし
い。相同性パーセントはデフォールトパラメータを利用してＤＮＡｓｉｓ Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ２．１プログラムで最大対合させることによる比較機能（Compare fu
nction）の使用により決定される。
【００６４】 本発明の１つの実施形態には、核酸分子ｎＤｅｒｆ1752、ｎＤｅｒｆ９８1665 およびｎＤｅｒｆ９８1608、ｎＤｅｒｐ９８1621、ｎＤｅｒｐ９８1527、ｎＤｅ
ｒｐ９８1470、および／またはｎＤｅｒｆ６０510 、またはそのような核酸分子
の対立変異型の全部または一部を含む核酸分子である。別の本発明の好ましい核
酸分子は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号
３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５の核酸配列お
よび／または配列番号３３のアミノ酸配列を備えたタンパク質をコードする核酸
配列、そのような核酸配列を有する核酸分子の対立変異型、ならびにそのような
核酸配列を有する核酸分子の同族体のうち少なくとも一部を含み、そのような同
族体は好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号
５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番
号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号
２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３
１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１
、配列番号４１、および／または配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク
質に対する免疫反応を引き起こす少なくとも１つのエピトープをコードするか、
同エピトープに相補的である。そのような核酸分子は、上記の配列番号に包含さ
れるものに加えて、完全長の遺伝子、完全長のコード領域、融合タンパク質をコ
ードする核酸分子、または多価保護化合物をコードする核酸分子等のヌクレオチ
ドを含み得るが、それらに限定されるわけではない。
【００６５】 １つの実施形態において、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、ＰＤｅ
ｒｆ555 、ＰＤｅｒｐ９８509 、および／またはＰＤｅｒｆ６０170 に約４５％
以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約５５％以上、より好ましくは
約６０％以上、より好ましくは約６５％以上、より好ましくは約７０％以上、よ
り好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８
５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％同一のタンパ
ク質をコードする。さらにより好ましいのは、ＰＤｅｒｆ555 、ＰＤｅｒｆ536 、ＰＤｅｒｐ９８509 、ＰＤｅｒｐ９８490 、および／またはＰＤｅｒｆ６０17 0 をコードする核酸分子、および／またはそのような核酸分子の対立変異型であ
る。
【００６６】 別の実施形態において、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、配列番号
１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号
７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配
列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列
番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番
号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４１、および／
または配列番号４４に約４５％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは
約５５％以上、より好ましくは約６０％以上、より好ましくは約６５％以上、よ
り好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８
０％以上、より好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好
ましくは約９５％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本発明
は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番
号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号
２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４１
、および／または配列番号４４、および核酸分子を発現する細胞のコドン利用特
性を調節するよう修正された核酸分子を含めたそれらの配列を有するタンパク質
をコードするＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子の対立変異型、の少なくとも一部を
有するタンパク質をコードするＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子も含む。
【００６７】 別の実施形態において、好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子は、少なくとも
長さ約３５アミノ酸以上、好ましくは長さ約５０アミノ酸以上、より好ましくは
長さ約１００アミノ酸以上、より好ましくは長さ約２００アミノ酸以上、より好
ましくは長さ約２５０アミノ酸以上を有するＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を
コードする。
【００６８】 当業者であれば、本発明のあるＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子の核酸配列が分
かれば、例えば、（ａ）これらの核酸分子の複製を作成すること、（ｂ）そのよ
うな核酸分子の少なくとも一部を含む核酸分子（例えば、完全長の遺伝子、完全
長のコード領域、調節制御配列、切り詰められたコード領域など）を得ること、
および（ｃ）他のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を得ることができる。そのよう
な核酸分子は、本発明の抗体による適当な発現ライブラリのスクリーニング、適
当なライブラリをスクリーニングするための本発明のオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いた伝統的なクローニング技術、および本発明のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いた適切なライブラリまたはＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む、様々な方法
によって得ることができる。スクリーニングを行うライブラリ、あるいは核酸分
子の増幅を行う元となっている好ましいライブラリには、Dermatophagoides far
inaeおよび／またはDermatophagoides pteronyssius ライブラリ、例えば本明細
書中の実施例において開示されるライブラリなどが含まれる。遺伝子をクローン
化および増幅する技術は、例えばサンブルック（Sambrook）らの文献中に開示さ
れている。
【００６９】 本発明は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下において、例えばＤｅ
ｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子または他のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子などからを
含む核酸分子を初めとする本発明の他の核酸分子、好ましくは長い核酸分子、の
相補領域とハイブリッド形成することのできるオリゴヌクレオチドである核酸分
子も包含している。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそ
のどちらかの誘導体のいずれであってもよい。そのようなオリゴヌクレオチドの
最小サイズは、オリゴヌクレオチドと、本発明の核酸分子上の相補的配列との間
に安定なハイブリッドが形成されるのに必要なサイズである。本発明の好ましい
オリゴヌクレオチドは、好ましくは約２００ヌクレオチド、より好ましく約１５
０ヌクレオチド、さらに好ましくは約１００ヌクレオチドの最大サイズを有して
いる。本発明は、例えば、核酸分子を同定するためのプローブとしても使用可能
なオリゴヌクレオチドも包含している。
【００７０】 本発明の１つの実施形態は、本発明の少なくとも１つの単離された核酸分子を
含む組換えベクターを包含し、核酸分子は宿主細胞に伝達することのできる任意
のベクターに挿入され得る。そのようなベクターは、異種核酸配列、すなわち、
天然においては本発明の核酸分子の近辺に見られず、好ましくは当該核酸分子の
由来する種以外の種に由来する核酸配列を含む。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａのいずれであってもよく、原核性または真核性のいずれであってもよく、典型
的にはウィルスまたはプラスミドである。組換えベクターは、本発明のＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐ核酸分子のクローニング、配列決定、および／または他の操作にお
いて用いることができる。
【００７１】 本明細書中で組換え分子と称する組換えベクターの１つのタイプは、発現ベク
ターに機能的に連結された本発明の核酸分子を含む。「機能的に連結された」と
いう表現は、核酸分子が、宿主細胞中に形質転換された場合に該核酸分子が発現
されうるように発現ベクターに挿入されていることをいう。本明細書中で用いる
発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、かつ特定の核酸分子を発
現させることのできるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベ
クターは宿主細胞内において複製を行うこともできる。発現ベクターは、原核性
または真核性のいずれであってもよく、通常ウィルスまたはプラスミドである。
本発明の発現ベクターは、細菌、菌類、内部寄生生物、昆虫、他の動物および植
物細胞を含む、本発明の組換え細胞内で機能する（すなわち遺伝子発現を指示す
る）任意のベクターを包含する。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌、酵母
、昆虫および他の哺乳動物細胞内、および好ましくは本明細書中に開示されるタ
イプの細胞内で、遺伝子発現を指示することができる。
【００７２】 特に、本発明の発現ベクターは、転写調節配列、翻訳調節配列、複製の開始点
、および、組換え細胞との適合性を有し本発明の核酸分子の発現を調節する他の
調節配列などの調節配列を含む。特に、本発明の組換え分子は転写調節配列を含
む。転写調節配列は、転写の開始、伸長および終結を調節する配列である。特に
重要な転写調節配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプ
レッサー配列など転写の開始を調節する配列である。適切な転写調節配列には、
本発明の組換え細胞の少なくとも１つの中で機能することのできる任意の転写調
節配列が含まれる。様々なそのような転写調節配列が当業者によって知られてい
る。好ましい転写調節には、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞内で機能する
ものが含まれ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌ
ｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ（ラムダｐL およびラムダｐR 、な
らびにそのようなプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７
ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファ
ージＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ−交配因子、ピチア（Pichia）アル
コールオキシダーゼ、アルファウィルスサブゲノムプロモータ（シンドビスウィ
ルスサブゲノムプロモータなど）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウィルス、タ
バコガ（Heliothis zea ）昆虫ウィルス、ワクシニアウィルス、ヘルペスウィル
ス、アライグマポックスウィルス、他のポックスウィルス、アデノウィルス、サ
イトメガロウィルス（中間初期プロモーターなど）、シミアンウィルス４０、レ
トロウィルス、アクチン、レトロウィルスの長い末端反復、ラウス肉腫ウィルス
、熱ショック、リン酸および硝酸転写調節配列、ならびに原核または真核細胞内
で遺伝子発現を制御することのできる他の配列などが挙げられるが、これらに限
定されるわけではない。さらなる適切な転写調節配列には、組織特異的プロモー
ターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、
インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が
含まれる。本発明の転写調節配列は、イヌまたはネコに天然に付随する天然に見
られる転写調節配列を含んでいてもよい。
【００７３】 本発明の組換えベクター中に含めるための適切かつ好ましい核酸分子は、本明
細書中に開示されている。組換えベクター、および特に組換え分子内に含めるた
めの好ましい核酸分子には、ｎＤｅｒｆ９８1752、ｎＤｅｒｆ９８1665、ｎＤｅ
ｒｆ９８1608、ｎＤｅｒｐ９８1621、ｎＤｅｒｐ９８1527、ｎＤｅｒｐ９８1470 、およびｎＤｅｒｆ６０510 、が含まれる。
【００７４】 本発明の組換え分子は、（ａ）発現された本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質を、同タンパク質を生産する細胞から分泌されるようにする分泌シグナル
（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）を含むか、および／または、（ｂ）
本発明の核酸分子を融合タンパク質として発現させるための融合配列を含んでい
てもよい。適切なシグナルセグメントの例には、本発明のタンパク質の分泌を指
示することのできる任意のシグナルセグメントが含まれる。好ましいシグナルセ
グメントには、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、インターフェロ
ン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性、およびウィルスエンベロー
プ糖タンパク質シグナル部分、ならびに天然のシグナル部分が含まれるが、これ
らに限定されるわけではない。融合セグメント核酸配列によってコードされる適
切な融合セグメントは、本明細書中に開示されている。さらに、本発明の核酸分
子は、コードされたタンパク質をプロテオソームに関する融合セグメント、例え
ばユビキノン融合セグメントなどに連結することもできる。組換え分子は、本発
明の核酸分子の核酸配列の周囲および／または内部に、介在配列および／または
非翻訳配列を含んでいてもよい。
【００７５】 本発明の別の実施形態は、本発明の１または複数の組換え分子によって形質転
換された宿主細胞を含む組換え細胞を包含する。核酸分子による細胞の形質転換
は、核酸分子を細胞中に挿入することのできる任意の方法によって達成すること
ができる。形質転換技術には、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロイ
ンジェクション、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合が含まれる
が、これらに限定されるわけではない。組換え細胞は、単細胞のままであっても
よいし、あるいは組織、器官、または多細胞有機体に成長するものであってもよ
い。本発明の形質転換された核酸分子は、染色体外に残っていてもよいし、ある
いは形質転換された（すなわち組換え）細胞の染色体内の１または複数の部位に
、それらの発現能力が維持されるようにして組み込まれてもよい。細胞を形質転
換するために用いられる好ましい核酸分子には、本明細書中に開示されるＤｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子が含まれる。細胞を形質転換するために用いられる特に
好ましい核酸分子には、ｎＤｅｒｆ９８1752、ｎＤｅｒｆ９８1665、ｎＤｅｒｆ
９８1608、ｎＤｅｒｐ９８1621、ｎＤｅｒｐ９８1527、ｎＤｅｒｐ９８1470、お
よびｎＤｅｒｆ６０510 、が含まれる。
【００７６】 形質転換を行うための適切な宿主細胞には、本発明の核酸分子によって形質転
換されうる任意の細胞が含まれる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞、ま
たは少なくとも１つの核酸分子（例えば、１または複数の本発明のタンパク質お
よび／または多価ワクチンの製造に有用な他のタンパク質をコードする核酸分子
）によってすでに形質転換されている細胞のいずれであってもよい。本発明の宿
主細胞は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を内在的に（すなわち、天
然に）生産できるものであってもよいし、あるいは少なくとも１つの本発明の核
酸分子によって形質転換された後に、そのようなタンパク質を生産できるような
ものであってもよい。本発明の宿主細胞は、少なくとも１つの本発明のタンパク
質を生産することのできる任意の細胞とすることができ、それには、細菌、菌類
（酵母を含む）、他の昆虫、他の動物および植物細胞が含まれる。好ましい宿主
細胞には、細菌、ミコバクテリア、酵母、寄生生物、昆虫および哺乳動物細胞が
含まれる。さらに好ましい宿主細胞には、サルモネラ（Salmonella）、エシェリ
シア（Escherichia ）、バチルス（Bacillus）、リステリア（Listeria）、サッ
カロマイセス（Saccharomyces ）、スポドプテラ（Spodoptera）、ミコバクテリ
ア（Mycobacteria）、トリコプルシア（Trichoplusia）、ＢＨＫ（幼ハムスター
腎）細胞、ＭＤＣＫ細胞（イヌヘルペスウィルス培養のための正常イヌ腎細胞系
）、ＣＲＦＫ細胞（ネコヘルペスウィルス培養のための正常ネコ腎細胞系）、Ｃ
Ｖ−１細胞（例えばアライグマポックスウィルスを培養するために用いられるア
フリカザル腎細胞系）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、およびＶｅｒｏ細
胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞は、大腸菌（E. coli ）Ｋ−１２誘導体を
含むエシェリシア・コリ（Escherichia coli）、サルモネラ・チピ（Salmonella
typhi）、ＵＫ−１x ３９８７およびＳＲ−１１x ４０７２などの弱毒株を含む
サルモネラ・チピムリウム（Salmonella typhimurium）、スポドプテラ・フルギ
ペルダ（Spodoptera frugiperda ）、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni ）
、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅ
ｒｏ細胞、および非腫瘍化マウス筋芽細胞Ｇ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１２４６）である。その他の適切な哺乳動物細胞宿主には、他の腎細胞系、他
の線維芽細胞系（例えば、ヒト、マウスまたはニワトリ胎児繊維芽細胞系）、ミ
エローマ細胞系チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞
、ＬＭＴＫ31細胞、および／またはＨｅＬａ細胞が含まれる。
【００７７】 組換え細胞は、好ましくは宿主細胞を１または複数の組換え分子によって形質
転換することによって作成され、前記組換え分子のそれぞれは、１または複数の
転写調節配列を含む発現ベクターに機能的に連結された１または複数の本発明の
核酸分子を含む。「機能的に連結された」という表現は、核酸分子が、宿主細胞
中に形質転換された場合に該核酸分子が発現されうるように発現ベクターに挿入
されていることをいう。
【００７８】 本発明の組換え分子は、形質転換すべき細胞内での核酸分子の発現を効果的に
調節することのできる少なくとも１つの任意の転写調節配列に機能的に連結され
た、上述の少なくとも１つの任意の核酸分子を含みうる分子であり、その例は本
明細書中に開示される。
【００７９】 本発明の組換え細胞は、本発明の少なくとも１つの任意のＤｅｒＨＭＷ−ｍａ
ｐ核酸分子によって形質転換された任意の細胞を包含する。適切かつ好ましいＤ
ｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子、ならびに細胞を形質転換するのに用いられる適切
かつ好ましい組換え分子は本明細書中に開示される。
【００８０】 組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内における核酸分子のコピー数、それ
らの核酸分子の転写効率、結果として得られる転写産物の翻訳効率、および翻訳
後修飾の効率などを操作することにより、形質転換された核酸分子の発現を高め
るためにを用いることができる。本発明の核酸分子の発現を高めるために有用な
組換え技術には、核酸分子を高コピー数プラスミドに機能的に連結すること、核
酸分子を１または複数の宿主細胞染色体に組み込むこと、プラスミドにベクター
安定配列を添加すること、転写調節シグナル（例えば、プロモーター、オペレー
ター、エンハンサー）を置換または修飾すること、翻訳調節シグナル（リボソー
ム結合部位、シャイン−ダルガルノ配列）を置換または修飾すること、本発明の
核酸分子を宿主細胞のコドンの選択性に対応するように修飾すること、転写を不
安定化する配列を削除すること、および発酵中に組換え細胞増殖を一時的に組換
え酵素生産から切り離す調節シグナルを利用することが含まれるが、これらに限
定されるわけではない。本発明の発現された組換えタンパク質の活性は、そのよ
うなタンパク質をコードする核酸分子を断片化、修飾または誘導体化することに
よって高めることができる。
【００８１】 本発明の単離ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、天然タンパク質の生産と回
収、組換えタンパク質の生産と回収、およびタンパク質の化学合成を含む様々な
方法によって生産させることができる。１つの実施形態において、本発明の単離
タンパク質は、タンパク質の生産に効果的な条件下において、タンパク質を発現
することのできる細胞を培養し、タンパク質を回収することによって生産される
。培養するのに好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。効果的な培養条件
には、タンパク質の生産を可能にする、有効な培地、バイオリアクター、温度、
ｐＨ、および酸素条件が含まれるが、これらに限定されるわけではない。有効な
培地とは、細胞が培養されて本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を生産す
るような任意の培地のことをいう。そのような培地は、典型的には、同化性のあ
る炭素、窒素およびリン酸源、および適当な塩、ミネラル、金属、および、ビタ
ミンなどの他の栄養素を有する水性培地からなる。本発明の細胞は、従来の発酵
バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイタープレート、および
ペトリ皿中で培養することができる。培養は、組換え細胞にとって適当な温度、
ｐＨおよび酸素含量において実施することができる。そのような培養条件は、当
業者の専門知識の範囲に含まれる。
【００８２】 生産のために用いられるベクターおよび宿主系に応じて、得られる本発明のタ
ンパク質は、組換え細胞内に残っていてもよいし、発酵培地中に分泌されてもよ
いし、大腸菌（E.coli）における細胞周辺腔などの２つの細胞膜間の空間に分泌
されてもよいし、あるいは細胞の外表面またはウィルス膜上に保持されてもよい
。「タンパク質の回収」という表現ならびに同様の表現は、タンパク質を含む全
発酵培地を回収することをいい、分離または精製のさらなる工程を含意する必要
はない。本発明のタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロ
マトグラフィー、クロマトフォーカシング、および分画可溶化（differential s
olubilization ）などを含むがそれらに限定されるわけではない、様々な標準的
なタンパク質精製技術を用いて精製することができる。本発明のタンパク質は、
「実質的に純粋な」形で回収されることが好ましい。本明細書中で用いる「実質
的に純粋な」とは、そのタンパク質を治療用組成物または診断用として有効に用
いることのできるような純度のことをいう。動物のための治療用組成物は、実質
的な毒性を一切示さずに、好ましくは治療を受けた動物を脱感作できる。
【００８３】 本発明はまた、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはそのミメトー
プに選択的に結合する単離された（すなわち、それらの天然の環境から取出され
た）抗体（すなわち、抗ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質抗体）も包含する。本
明細書中で用いる、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に「選択的に結合する」と
いう表現は、本発明の抗体のもつ、本発明の特定のタンパク質およびそのミメト
ープに優先的に結合する能力のことをいう。結合は、酵素イムノアッセイ（例え
ばＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイなどを含む当該技術における標準的な
様々な方法（例えば、サンブルックらの前掲の文献を参照のこと）を用いて測定
することができる。抗ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質抗体は、動物に免疫反応
を誘起するＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の一部分に好適に選択的に結合する
。
【００８４】 本発明の単離抗体は、体液（例えば血清など、ただし血清には限定されない）
中の抗体、または様々な程度まで精製された抗体を包含していてもよい。本発明
の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよい。その
ような抗体の機能的均等物、例えば抗体断片および遺伝子工学的に作成された抗
体（１つより多くのエピトープに結合することのできる一本鎖抗体またはキメラ
抗体を含む）などもまた本発明に包含される。
【００８５】 本発明の抗体を生産するための好ましい方法は、（ａ）動物に有効量の本発明
のタンパク質、ペプチドまたはそのミメトープを投与して抗体を産生させる工程
と、（ｂ）その抗体を回収する工程とを含む。他の方法において、本発明の抗体
は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の生産に関して上で開示したよう
な技術を用いて組換えによって生産される。特定のタンパク質またはミメトープ
に抗して産生された抗体は、診断アッセイにおける妨害や、治療用組成物中で用
いられた場合に副作用を引き起こすことのある他の物質に対する抗体に実質的に
混入されていないために、有利であると考えられる。
【００８６】 本発明の抗体は、本発明の範囲に含まれる様々な潜在的用途を有している。例
えば、そのような抗体は、（ａ）ダニアレルゲン、特にＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタ
ンパク質を検出するための道具として、（ｂ）発現ライブラリをスクリーニング
するための道具として、および／または（ｃ）タンパク質と他の混入物との混合
物から本発明の所望のタンパク質を回収するために用いることができる。本発明
の抗体は、例えば、ＤｅｒＨＭＷ−タンパク質に特異的に結合するＩｇＥへのＤ
ｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の結合を阻害し、免疫複合体の形成を阻害するこ
とによって、ダニアレルゲンに対する過敏反応を低減するためにも用いることが
できる。
【００８７】 本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質はキメラ分子中に含まれていてもよ
く、該キメラ分子は少なくとも、動物内において免疫反応を誘起するＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐタンパク質の一部分と、第２の分子とを含み、この第２の分子は、基
質に結合されていないＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と本質的に同様な様式、
ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質がＩｇＥに結合できるように、前記キメラ分子
の基質への結合を可能にする。適切な第２の分子の例には、免疫グロブリン分子
の一部分、または基質上に固定化可能な適切な結合相手を有する他のリガンド、
例えば、ビオチンとアビジン、金属結合性タンパク質と金属（例えばＨｉｓ）、
あるいは糖結合性タンパク質と糖（例えばマルトース）などが含まれる。
【００８８】 本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は製剤中に含まれていてもよく、こ
の製剤は本明細書中ではＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質製剤と称することにす
る。例えば、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパ
ク質を可溶化する緩衝液、および／または担体と組み合わされていてもよい。適
切な緩衝液および担体は、当業者によって知られている。適切な緩衝液の例には
、その緩衝液中において、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が機能して、Ｄｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と特異的に結合する抗体に選択的に結合できるような
任意の緩衝液、例えば、リン酸緩衝塩類溶液、水、生理的食塩水、リン酸緩衝液
、重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ
’−２−エタンスルホン酸緩衝塩類溶液）、ＴＥＳ緩衝液（トリス−ＥＤＴＡ緩
衝塩類溶液）、トリス緩衝液およびＴＡＥ緩衝液（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）な
どが含まれるが、これらに限定されるわけではない。担体の例には、高分子マト
リックス、トキソイド、およびウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンが含ま
れるが、これらに限定されるわけではない。担体は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質に混合することもできるし、あるいは、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質
の持つＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的に結合する抗体に選択的に結合
する能力を実質的に妨害しないようにして、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と
複合体化を形成（すなわち結合）することもできる。
【００８９】 本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク
質を含む細胞から生産すことも可能である。好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質−担持細胞には、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする
核酸分子を含む組換え細胞が含まれる。
【００９０】 さらに、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質製剤は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍ
ａｐタンパク質だけでなく、動物をアレルゲンに対して脱感作したり、ダニアレ
ルゲン病原を予防または治療するのに有用な１または複数のさらに別の抗原また
は抗体を含んでいてもよい。本明細書中で用いる「抗原」とは、抗体によって選
択的に結合されることのできる任意の分子のことをいう。本明細書中で用いる「
アレルゲン」とは、動物内でアレルギー反応に関与する抗体の産生を刺激する能
力を有する抗原のことをいう。本明細書中で用いる「第２の分子への第１の分子
の選択的結合」とは、第１の分子が第３の分子に結合する能力に比べて、第１の
分子が第２の分子に優先的に結合する（例えば、高い親和性、高い結合活性を有
する）能力のことをいう。第１の分子は必ずしも第２の分子の天然のリガンドで
ある必要はない。本発明のアレルゲンは、ダニに由来するものであることが好ま
しく、ダニ関連アレルゲンには、他の昆虫アレルゲンおよび植物アレルゲンが含
まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００９１】 本発明によれば、事実上どんな物質も抗原として作用して、抗体反応を誘起す
ることができる。すなわちエピトープとして機能することができる。例えば、抗
体は、タンパク質に結合された糖類および／または多糖類、いわゆるグリコシル
化タンパク質を含む炭水化物エピトープに応答して、産生される。しかしながら
、糖類および／または多糖類は、タンパク質が存在しなくても、抗原単独で作用
することもできる。内部の糖だけでなく、炭水化物部分の末端糖もエピトープと
しての機能を果たす。多糖類は分枝鎖として存在してもよく、その場合、エピト
ープは配列上は連続していないが、空間的には隣接する糖を含み得る。昆虫核酸
分子に由来する糖タンパク質上には、哺乳動物タンパク質には通常見られない特
殊な、昆虫特異的糖が存在していることがあり、これらの特殊な糖が、哺乳動物
免疫系によって認識されるエピトープを含むこともある。
【００９２】 本発明の１つの実施形態は、ダニに対してアレルギーを有する動物のＩｇＥと
結合し、ダニアレルゲンに対して動物を脱感作し、Ｂリンパ球応答を刺激し、お
よび／またはＴリンパ球応答を刺激することの可能な、非タンパク質エピトープ
を含む試薬である。本明細書中ではＤｅｒＮＰエピトープと称するそのようなエ
ピトープは、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の一部として存在しても
よいし、あるいは該タンパク質から単離されたものであってもよい。そのような
エピトープは、例えば、実施例１に従って製造されるコナヒョウヒダニ（D.fari
nae ）ＨＭＷ−ｍａｐ組成物中に含まれるタンパク質上に存在する。本発明のＤ
ｅｒＮＰエピトープは、その天然の起源から単離することもできるし、あるいは
合成によって製造することもできる。そのようなエピトープは、担体または他の
分子に連結されることもできるが、連結されなくてもよい。ＤｅｒＮＰエピトー
プは、以下の識別特性のうちの少なくとも１つを有している。すなわち、（ａ）
エピトープがペプチドのβ−除去に対して耐性である（ｂ）エピトープがプロテ
イナーゼ−Ｋによる消化に対して耐性である、および（ｃ）エピトープがグリコ
シル化タンパク質検出用に設計された試験に対して反応性がある。好ましいＤｅ
ｒＮＰエピトープは、そのような識別特性のすべてを有している。ＤｅｒＮＰエ
ピトープは、ダニに対してアレルギーを有するイヌまたはネコのＩｇＥに選択的
に結合することができる。理論とは結び付けられていないものの、ＤｅｒＮＰエ
ピトープは、Ｎ−結合性グリカンを見かけ上含まない炭水化物部分を含むと考え
られている。そのようなエピトープの構造的特性の同定は当業者によって決定さ
れることができる。１つの実施形態において、ＤｅｒＮＰエピトープに選択的に
結合する単離抗体が提供される。本発明はまた、ＤｅｒＮＰエピトープの誘導体
、すなわち、そのようなエピトープの活性を模倣し（例えば、ＤｅｒＮＰエピト
ープミメトープ）、天然の（すなわち天然に見られる）ＤｅｒＮＰエピトープに
対して産生された抗体に結合することのできる化合物も包含する。
【００９３】 本発明のＤｅｒＮＰエピトープを含む試薬は、本発明に従って様々な方法で使
用することができる。そのような試薬は、脱感作化合物であってもよいし、ある
いはダニアレルギー罹患性または感受性に対する試験を行うための検出試薬であ
ってもよい。１つの実施形態において、本発明の治療用組成物は、ＤｅｒＮＰエ
ピトープを含む試薬を含む。別の実施形態において、本発明のアッセイキットは
、ＤｅｒＮＰエピトープを含む試薬を含む。本発明の１つの実施形態は、ダニ対
するアレルギー反応に罹患性があるか、アレルギー反応を有する動物を同定する
ための方法である。そのような方法は、ＤｅｒＮＰエピトープを含む試薬を動物
の抗体に接触させる工程と、試薬と抗体の間での免疫複合体の形成を確認する工
程とを含み、ここで、免疫複合体の形成は当該動物が前記アレルギー反応に対し
て罹患性があるか、あるいはアレルギー反応を有しているかの指標となるもので
ある。本発明の別の実施形態は、ダニに対するアレルギー反応に対して、宿主動
物を脱感作するための方法である。そのような方法は、脱感作化合物としてＤｅ
ｒＮＰエピトープを含む試薬を含む治療用組成物を、動物に投与する段階を含む
。
【００９４】 本発明の別の実施形態は、ＤｅｒＮＰエピトープを欠損したＤｅｒＨＭＷ−ｍ
ａｐタンパク質である。理論には結び付けられていないものの、そのようなタン
パク質はＩｇＥへの結合能が低減されていると予測されるため、より良好な脱感
作化合物であると考えられている。そのようなタンパク質は、例えば、天然Ｄｅ
ｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質からＤｅｒＮＰエピトープを除去することにより、
あるいは、例えば大腸菌（E.coli）中で当該タンパク質を組換えによって生産さ
せることによって、製造することができる。
【００９５】 本発明の１つの実施形態は、動物がＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する
過敏症を有するかどうかを検出することができるインビボ（in vivo ）テストで
ある。本発明のインビボ過敏症テストは、ダニアレルゲンに対して罹患性がある
、またはアレルギーを有する動物を同定するために特に有用である。本発明の適
切なインビボ過敏症テストは、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはそのミメ
トープを含む有効量の製剤を投与（例えば、皮内注射または皮相掻爬）すること
を含む皮膚テストであり得るが、これに限定されるわけではない。本発明の皮膚
テストを実施するための方法は、当業者によって知られているものであり、本明
細書中で簡単に説明する。
【００９６】 インビボ皮膚テストにおいて用いる適切な製剤は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の同族体、および／またはＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐタンパク質のミメトープを含む。
【００９７】 本発明の皮膚テストにおいて用いるＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質製剤の適
切な量は、テストにおいて用いられる製剤のアレルゲン性および当該製剤を送達
すべき部位に応じて広範に変化しうることは、当業者によって理解される。本発
明の皮膚テストにおいて用いるＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の適切な量は、
製剤に対するアレルギー反応の結果として起こる検出可能な膨疹または硬化（硬
さ）などの反応を形成することのできる量を含む。本発明の皮膚テストにおいて
用いるＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の適切な量は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタ
ンパク質が約１×１０-8マイクログラム（μｇ）から約１００μｇ、より好まし
くは約１×１０-7マイクログラム（μｇ）から約１０μｇ、さらに好ましくは約
１×１０-6マイクログラム（μｇ）から約１μｇの範囲である。そのような量は
投与されるタンパク質のアレルゲン性に応じて変化することが当業者によって認
識される。
【００９８】 本発明によれば、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、免疫増強剤（
例えば、以下に詳細に定義する本発明の担体またはアジュバント）と組合されて
もよい。しかしながら、本発明の新規な側面は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ
タンパク質が特にイヌにおいて免疫増強剤の非存在下で過敏反応を誘起すること
ができる所である。
【００９９】 本発明の皮膚テストは、動物に対照溶液を投与することをさらに含む。対照溶
液は、陰性対照溶液（negative control solution ）および／または陽性対照溶
液（positive control solution ）を包含しうる。本発明の陽性対照標準溶液は
、動物に投与された場合に過敏反応を誘起することが知られている少なくとも１
つの化合物を有効量含有している。陽性対照標準溶液として用いる好ましい溶液
には、ヒスタミンが含まれるが、これに限定されるわけではない。本発明の陰性
対照標準溶液は、動物に投与された場合に過敏反応を誘起しないことが知られて
いる溶液から成るものであり得る。そのようなものとして、陰性対照標準溶液は
本質的に過敏反応を誘起することのできない化合物を有する溶液、または例えば
生理的食塩水など単純に製剤の調製に用いられる緩衝液から成るものであり得る
。好ましい陰性対照標準溶液の例は、フェノール処理された（phenolated）リン
酸緩衝塩類溶液（ノースカロライナ州、レノア（Lenoir）所在、Greer Laborato
ries社より入手可能）である。
【０１００】 本発明の１または複数の製剤に対する動物の過敏症は、１または複数の実験試
料と対照試料を動物に投与した結果として得られる反応を測定し（例えば、膨疹
の大きさ、硬化または硬さを当業者によって知られている技術を用いて測定）、
実験試料の反応を１つ以上の対照溶液を投与した場合に得られる反応と比較する
ことにより、評価することができる。皮内注射のための好ましい装置には、個々
の注射器が含まれる。掻爬のための好ましい装置には、多数の試料を同時に投与
することのできる装置が含まれる。動物の過敏症は、本発明の製剤を投与した場
合に得られた反応が、陰性対照標準溶液を投与した場合に得られた反応よりも大
きいかどうかを決定することにより、および／または、製剤の投与によって得ら
れた反応が、陽性対照標準溶液を投与した場合に得られた反応と少なくともほぼ
同じ大きさであるかどうかを決定することにより、評価することができる。その
ようなものとして、実験試料が動物に陽性対照標準試料を投与することによって
生じた膨疹と同等以上の大きさの反応を起こしていれば、その動物は実験試料に
対して過敏性であることになる。一方、実験試料が、動物に陰性対照標準試料を
投与した場合に起こる反応と同様の反応を起こしていれば、その動物は実験試料
に対して過敏性でないことになる。
【０１０１】 動物の過敏症を評価するための好ましい膨疹の大きさは、直径にして約１６ｍ
ｍ〜約８ｍｍ、より好ましくは約１５ｍｍ〜約９ｍｍ、さらに好ましくは約１４
ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲である。
【０１０２】 好ましくは、動物が本発明の製剤に対して即時型過敏反応を示す性質を有する
かどうかは、試料を投与してから約２分〜約３０分後、より好ましくは試料を投
与してから約１０分〜約２５分後、さらに好ましくが試料を投与してから約１５
分後に膨疹の大きさを測定することによって決定される。
【０１０３】 好ましくは、動物が本発明の製剤に対して遅延型過敏反応を示す性質を有する
かどうかは、試料を投与してから約１８時間〜約３０時間後、より好ましくは試
料を投与してから約２０時間〜約２８時間後、さらに好ましくが試料を投与して
から約２４時間後に膨疹の大きさを測定することによって決定される。遅延型過
敏反応は、当業者によって知られている技術を用いて上に定義した期間内の投与
部位における細胞湿潤物の範囲を測定するなど、他の技術を用いても測定するこ
とができる。
【０１０４】 好ましい実施形態において、本発明の皮膚テストは、動物の所定部位にＤｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む有効量の製剤を皮内注射することと、有効量の
対照溶液を同一動物の他の部位に皮内注射することとを含む。多数の部位におい
て同時に複数の試料を送達することができ、好ましくは多数の製剤の同時評価を
可能にする装置を使用することは、当業者の知識の範囲に含まれる。皮膚テスト
とともに用いる好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質には、完全長のタンパ
ク質が含まれる。好ましい陽性対照標準試料は、ヒスタミンを含む試料であって
もよい。好ましい陰性対照標準試料は、希釈剤を含む試料であってもよい。
【０１０５】 ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する過敏症を本発明の皮膚テストを用い
て試験するための適切かつ好ましい動物は、本明細書中に開示されている。本発
明の皮膚テストによって試験する特に好ましい動物には、ヒト、イヌ、ネコおよ
びウマが含まれるが、ヒト、イヌおよびネコがより好ましい。本明細書中で用い
る「イヌ」とは、飼い犬、野生の犬および動物園の犬を含むイヌ科のあらゆるメ
ンバーのことをいう。犬の例としては、飼い犬、野生の犬、キツネ、オオカミ、
ジャッカルおよびコヨーテが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本
明細書中で用いる「ネコ」とは、飼い猫、野生の猫、および動物園の猫を含むネ
コ科のあらゆるメンバーのことをいう。猫の例としては、飼い猫、ライオン、ト
ラ、ヒョウ、ピューマ、クーガー、ボブキャット、オオヤマネコ、ジャガー、チ
ーター、およびサーバルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本明
細書中で用いる「ウマ」とは、ウマ、ロバ、ラバおよびシマウマを含むウマ科の
あらゆるメンバーのことをいう。
【０１０６】 本発明の１つの実施形態は、インビトロ（in vitro）においてＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質と結合する抗体（本明細書中では抗ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質抗体と称する）を検出するための方法であり、この方法は、（ａ）単離さ
れたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗
体複合体形成に適した条件下において、抗ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質抗体
を含有すると推定される組成物と接触させる工程と、（ｂ）ＤｅｒＨＭＷ−ｍａ
ｐタンパク質：抗体複合体を検出することにより、抗体の存在を検出する工程と
を含む。そのようなＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体の存在は、そ
の動物がダニアレルゲンに対する抗体を産生していることを示すものである。検
出のための好ましい抗ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ抗体には、ＩｇＥまたはＩｇＧアイ
ソタイプを有する抗体が含まれる。検出のための好ましい抗ＤｅｒＨＭＷ−ｍａ
ｐ抗体には、イヌの抗体、ネコの抗体、ウマの抗体およびヒトの抗体が含まれる
が、イヌ、ネコおよびヒトの抗体が特に好ましい。
【０１０７】 本明細書中で用いる「接触させる」という用語は、この場合、抗体を含有する
と推定される組成物をＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に混入または混合するこ
とをいう。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と抗体の間での複合体の形成とは、
測定（すなわち検出）可能な安定な複合体を形成するために抗体に選択的に結合
する、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の能力のことをいう。本明細書中で用い
る「抗体に選択的に結合する」という用語は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタ
ンパク質の持つ、ある抗体には優先的に結合するが、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質に特異的に結合しない他の抗体とは実質的に結合しない能力のことをいう
。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と抗体との間の結合は、複合体の形成に最適
な条件下で実施されるが、そのような条件（例えば、適当な濃度、緩衝液、温度
、反応時間）、ならびに、そのような条件を最適化する方法は、当業者によって
知られており、その例は本明細書中に開示される。複合体形成条件の例は、例え
ばサンブルックらの前掲の文献にも開示されている。
【０１０８】 本明細書中で用いる「複合体形成を検出する」という用語は、何らかの複合体
が形成されているかどうかを測定する、すなわち、複合体の有無（すなわち存在
）を検定することをいう。複合体が形成されている場合は、形成された複合体の
量を測定することができるが、測定しなくてもよい。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質と組成物中の抗体との間の複合体形成、または選択的結合は、当該技術分
野における様々な標準的な方法（例えば、サンブルックらの前掲の文献を参照）
を用いて測定（すなわち、検出、決定）することができ、その例は本明細書中に
開示される。
【０１０９】 １つの実施形態において、本方法の抗体を含有すると推定される組成物は、動
物に由来する生物試料を包含する。適切な生物試料には、体液性組成物または細
胞性組成物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。体液とは、動物か
ら回収することのできる（すなわち得られる）あらゆる液体を意味し、その例と
しては、血液、血清、血漿、尿、涙、水性体液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、リ
ンパ液、鼻分泌物、乳汁および糞便が含まれるが、これらに限定されるわけでは
ない。そのような本方法の組成物は、免疫グロブリンの非ＩｇＥまたは非ＩｇＧ
アイソタイプのおよび／または液体中に存在するアルブミンなどの他のタンパク
質の少なくとも一部を除去するために前処理することができるが、必ずしも前処
理は必要でない。そのような除去には、体液をレクチンジャカリンなどの材料ま
たはＩｇＡ免疫グロブリンの定常部に特異的に結合する抗体（すなわち抗ＩｇＡ
アイソタイプ抗体）と接触させてＩｇＡ抗体を除去すること、および／または、
液体を例えばコンカナバリンＡまたはプロテインＧにそれぞれ暴露することによ
り、他の体液成分からＩｇＥまたはＩｇＧ抗体をアフィニティー精製することを
含んでいてもよいが、これらに限定されるわけではない。別の実施形態において
、組成物は液体中に含まれる免疫グロブリンを濃縮するために前処理された、回
収された体液を包含する。例えば、体液中に含まれる免疫グロブリンは、硫酸ア
ンモニウムを用いて他のタンパク質から沈殿させることもできる。本方法の好ま
しい組成物は血清である。
【０１１０】 別の実施形態において、本方法の抗体含有組成物は、ＩｇＥまたはＩｇＧを産
生する細胞を含む。そのような細胞は、細胞表面にＩｇＥまたはＩｇＧが結合さ
れているか、および／またはＩｇＥまたはＩｇＧを分泌することができる。その
ような細胞の例には、ミエローマ細胞が含まれる。ＩｇＥまたはＩｇＧは、細胞
の膜に直接結合されるか、あるいは細胞の表面に結合された分子（例えば抗原）
に結合されるかのいずれかによって、細胞表面に結合させることができる。
【０１１１】 複合体は、以下に示すアッセイの１または複数の使用を含む様々な方法によっ
て検出することができるが、これらのアッセイに限定されるわけではない。酵素
結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光ア
ッセイ、側方フローアッセイ（lateral flow assay）、凝集アッセイ、粒子に基
づくアッセイ（例えば、磁性粒子または、ラテックスやポリスチレンビーズなど
のプラスチックポリマー粒子を用いるもの。ただしこれらに限定されない。）、
免疫沈降アッセイ、ＢｉｏＣｏｒｅ（登録商標）アッセイ（例えば金コロイドを
用いるもの）、およびイムノブロットアッセイ（例えばウェスタンブロット）。
そのようなアッセイは、当業者によって周知である。アッセイは、それらの使い
方によって、定性的または定量的な結果を与えるように使用することができる。
凝集、粒子分離および免疫沈降などのいくつかのアッセイは、検出マーカーを必
要とせずに可視的に観察（例えば、目視またはデンシトメータまたは分光光度計
などの機械によって）することができる。
【０１１２】 他のアッセイにおいて、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する検出マーカ
ーを、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合された抗体に、あるいは、Ｄｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合された
抗体に選択的に結合する試薬に結合（すなわち付加）することにより（以下にさ
らに詳しく説明する）、複合体形成の検出が行いやすくなる。検出マーカーの例
には、放射性標識、酵素、蛍光標識、化学発光標識、発色団標識またはリガンド
が含まれるが、これらに限定されるわけではない。リガンドとは、他の分子に選
択的に結合する分子のことをいう。好ましい検出マーカーには、フルオレセイン
、放射性同位元素、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ビオ
チン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ）およびビオチン関連化合物またはアビジン関連化合物（例えば、ストレプ
トアビジン、またはピアーズ（Pierce社、イリノイ州、ロックフォールド（Rock
ford）所在）から入手可能なＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＮｅｕｔｒＡｖ
ｉｄｉｎなど）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１３】 １つの実施形態において、複合体は、抗体を含有すると推定される組成物を、
検出マーカーに結合されたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に接触させることに
よって検出される。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合する適切な検出マー
カーには、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識、発色団標識または
リガンドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。検出マーカーは、Ｄ
ｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が持つ、検出される抗体に結合する能力を阻害し
ないような方法で、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合される。
【０１１４】 別の実施形態において、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体は、抗
体を含有すると推定される組成物をＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に接触させ
た後、複合体を指標分子と接触させることによって検出される。本発明の適切な
指標分子には、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタ
ンパク質に結合した抗体のいずれかに結合することのできる分子が含まれる。そ
のようなものとして、指標分子は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合
体のどの部分が検出されるかに応じて、例えば抗原および抗体から成るものとす
ることができる。抗体である好ましい指標分子には、例えば、抗ＩｇＥ抗体、抗
ＩｇＧ抗体、およびＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質には結合し、抗体を含有す
ると推定される組成物中で同定される抗体とは異なるＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタン
パク質上のエピトープに結合することが知られている抗体が含まれる。好ましい
レクチンには、高マンノース基に結合するレクチンが含まれる。指標分子自体を
本発明の検出マーカーに付加することもできる。例えば、抗体をビオチン、ホー
スラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはフルオレセ
インに結合することもできる。
【０１１５】 １つの実施形態において、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体は、
該複合体を、ＩｇＥ抗体に選択的に結合する指標分子（本明細書中では抗ＩｇＥ
試薬と称する）またはＩｇＧ抗体に選択的に結合する指標分子（本明細書中では
抗ＩｇＧ試薬と称する）に接触させることにより、検出される。そのような抗Ｉ
ｇＥまたは抗ＩｇＧ抗体の例には、抗アイソタイプ抗体（例えば、ＩｇＥまたは
ＩｇＧの定常部に選択的に結合する抗体）である二次抗体、抗体結合性細菌表面
タンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、抗体結合性細胞（例
えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、多形核白血球、単核細胞、また
はマクロファージ細胞）、抗体結合性真核細胞表面タンパク質（例えば、Ｆｃレ
セプター）、および抗体結合性補体タンパク質が含まれるが、こられに限定され
るわけではない。好ましい指標分子には、抗イヌＩｇＥ抗体、抗イヌＩｇＧ抗体
、抗ネコＩｇＥ抗体、抗ネコＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体、および抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本明細書中で用いる抗
ＩｇＥまたは抗ＩｇＧ抗体は、完全な抗体だけでなく、ＩｇＥまたはＩｇＧのＨ
鎖定常部に選択的に結合することのできる該抗体のサブユニットまたは一部も包
含する。例えば、抗ＩｇＥ試薬または抗ＩｇＧ試薬は、Ｆａｂフラグメントまた
はＦ（ａｂ’）2 フラグメントを含んでいてもよく、そのどちらもジャンウェイ
（Janeway ）らの「免疫生物学−健康および疾病における免疫系」（Immunobiol
ogy, the Immune System in Health and Disease, Garland Publishing, Inc.,
NY, 1996）に詳細に説明されている。
【０１１６】 他の好ましい実施形態において、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合
体は、該複合体を、抗体を含有すると推定される組成物中の抗体がＤｅｒＨＭＷ
−ｍａｐタンパク質に結合するエピトープとは異なるエピトープにおいてＤｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に選択的に結合する指標分子と接触させることにより
、検出される。
【０１１７】 １つの実施形態において、複合体は溶液中で形成させ、かつ検出することがで
きる。別の実施形態において、複合体の１または複数のメンバーが基質上に固定
化されている（例えば、基質上に被覆されている）ような複合体を形成させるこ
ともできる。固定化の技術は、当業者によって知られている。適切な基質材料に
は、プラスチック、ガラス、ゲル、セルロイド、紙、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニ
リデン）、ナイロン、ニトロセルロースおよび粒子状材料、たとえラテックス、
ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロースおよび磁性樹脂が含ま
れるが、これらに限定されるわけではない。基質材料の適切な形状には、ウェル
（例えばマイクロタイタープレートウェル）、プレート、ディップスティック、
ビーズ、側方フロー装置、メンブレン、フィルタ、チューブ、皿、セルロイド型
基質、磁性粒子および他の粒子が含まれるが、これらに限定されるわけではない
。特に好ましい基質は、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、ラジオイム
ノアッセイプレート、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビー
ズ、イムノブロットメンブレン、およびイムノブロットペーパーから成る。１つ
の実施形態において、粒子などの基質は検出マーカーを含んでいてもよい。
【０１１８】 ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合する抗体を検出するための好ましい方
法は、免疫吸着剤アッセイである。本発明の免疫吸着剤アッセイは、捕捉分子と
指標分子とを含む。本発明の捕捉分子は、ＩｇＥまたはＩｇＧが基質に固定化さ
れるように、ＩｇＥまたはＩｇＧに結合する。そのようなものとして、捕捉分子
は、該捕捉分子をＩｇＥを含有すると推定される組成物またはＩｇＧを含有する
と推定される組成物に暴露する前に、本発明の基質に固定化されることが好まし
い。本発明の指標分子は、捕捉分子に結合したＩｇＥまたはＩｇＧの存在を検出
する。そのようなものとして、指標分子は、該捕捉分子をＩｇＥを含有すると推
定される組成物またはＩｇＧを含有すると推定される組成物に暴露する前に、捕
捉分子と同一の基質に固定化されないことが好ましい。
【０１１９】 好ましい免疫吸着剤アッセイは、（ａ）ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をＩ
ｇＥを含有すると推定される組成物またはＩｇＧを含有すると推定される組成物
に接触させる前に、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を基質上に固定化して、Ｄ
ｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質固定化基質を形成する工程、および（ｂ）Ｄｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をＩｇＥを含有すると推定される組成物またはのＩｇ
Ｇを含有すると推定される組成物に接触させる前に、ＩｇＥを含有すると推定さ
れる組成物またはＩｇＧを含有すると推定される組成物を基質上に結合させて、
それぞれ、ＩｇＥを含有すると推定される組成物結合型基質またはＩｇＧを含有
すると推定される組成物結合基質を形成する工程のうちのいずれか一方を含む。
好ましくは、基質は、非被覆基質、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質固定化基質
、抗ＩｇＥ抗体固定化基質または抗ＩｇＧ抗体固定化基質を包含する。
【０１２０】 本発明の捕捉分子および指標分子はいずれもＩｇＥ、ＩｇＧまたはＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐタンパク質に結合することができる。好ましくは、捕捉分子は、指標
分子とは異なるＩｇＥ，ＩｇＧまたはＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の部位に
結合し、これにより捕捉分子が指標分子と同時にＩｇＥ，ＩｇＧまたはＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合することができる。試薬を捕捉分子または指標分
子のいずれとして使用するかは、分子がＩｇＥ、ＩｇＧまたはＤｅｒＨＭＷ−ｍ
ａｐタンパク質に暴露されるときに、当該分子が基質に固定化されているかどう
かに依存する。例えば、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐタンパク質が基質に結合されている場合には捕捉分子として用いら
れる。また反対に、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ
タンパク質が基質に結合されていない場合には指標分子として用いられる。捕捉
分子または指標分子として使用するのに適切な分子には、本発明のＤｅｒＨＭＷ
−ｍａｐタンパク質、本発明の抗ＩｇＥ抗体試薬または抗ＩｇＧ抗体試薬が含ま
れるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２１】 本発明の免疫吸着剤アッセイは、指標分子の存在を検出することのできる、１
またはそれ以上の層および／または型の二次分子または結合性分子を含んでいて
もよい。例えば、指標分子に選択的に結合する標識されていない（すなわち、検
出マーカーに結合されていない）二次抗体を、該二次抗体に選択的に結合する標
識された（すなわち、検出マーカーに連結されている）三次抗体に結合させるこ
とができる。適切な二次抗体、三次抗体、および他の二次または三次分子は、当
業者によって選択可能である。本発明の好ましい二次分子には、抗原、抗ＩｇＥ
イディオタイプ抗体（すなわち、抗ＩｇＥ抗体に特有のエピトープに結合する抗
体）、抗ＩｇＥアイソタイプ抗体、抗ＩｇＧイディオタイプ抗体（すなわち、抗
ＩｇＧ抗体に特有のエピトープに結合する抗体）、および、抗ＩｇＧアイソタイ
プ抗体が含まれる。好ましい三次分子は、二次分子の特性に基づいて当業者によ
って選択可能である。次の層に対しても同様の戦略が適用される。
【０１２２】 １つの実施形態において、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、マイクロタイ
タープレートウェルまたはディップスティックなどの基質上に固定化されること
により、捕捉分子として用いられる。動物から回収した生物試料を基質に加え、
基質に結合されたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体を形成させる（
すなわち、試料中のＩｇＥまたはＩｇＧが基質上に固定化されたＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質に結合する）のに適切な（すなわち十分な）条件下でインキュ
ベートする。過剰の非結合物質（すなわち、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に
結合しなかった生物試料由来の物質）を、もしあれば、抗原：抗体複合体を基質
に結合したまま保持するような条件下において基質から除去する。好ましい条件
は、一般にサンブルックらの前掲の文献に開示されている。抗原に結合したＩｇ
ＥまたはＩｇＧに選択的に結合することのできる指標分子を基質に加え、インキ
ュベートして、指標分子とＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗体複合体との間
に複合体を形成させる。過剰の指標分子を除去し、必要であれば展開試薬を加え
、基質を分析のために検出装置に供す。本実施形態に対する好ましい指標分子は
、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合したＩｇＧ抗体を検出するためには抗
ＩｇＧ抗体、あるいは、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合したＩｇＥ抗体
を検出するためには抗ＩｇＥ抗体である。好ましくは、抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＥ
抗体はビオチン、蛍光標識または酵素標識に結合されている。
【０１２３】 １つの実施形態において、抗ＩｇＥまたは抗ＩｇＧ抗体（例えば、アイソタイ
プまたはイディオタイプ特異的抗体）は、マイクロタイタープレートウェルまた
はディップスティックなどの基質上に固定化されることにより、捕捉分子として
用いられる。動物から回収した生物試料を基質に加え、それぞれ基質に結合され
た抗ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体または抗ＩｇＧ抗体：ＩｇＧ複合体を形成させる
のに適切な条件下でインキュベートする。過剰の非結合物質を、もしあれば、抗
ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体または抗ＩｇＧ抗体：ＩｇＧ複合体を基質に結合した
まま保持するような条件下において基質から除去する。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタ
ンパク質を基質に加え、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、抗ＩｇＥ抗体：Ｉ
ｇＥ複合体または抗ＩｇＧ抗体：ＩｇＧ複合体と間に複合体を形成させるように
インキュベートする。好ましくは、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質は、検出マ
ーカー（好ましくはビオチン、蛍光標識または酵素標識）に結合されている。過
剰のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を除去し、必要であれば展開試薬を加え、
基質を分析のために検出装置に供す。
【０１２４】 １つの実施形態において、本発明の免疫吸着剤アッセイは、捕捉分子を使用し
ない。この実施形態においては、動物から回収した生物試料を、マイクロタイタ
ープレートウェルまたはディップスティックなどの基質に加え、ＩｇＥまたはＩ
ｇＧを基質に結合させるのに適した条件下でインキュベートする。体液中に存在
するすべてのＩｇＥまたはＩｇＧは、基質上に固定化される。過剰の非結合物質
を、もしあれば、ＩｇＥまたはＩｇＧを基質に結合したまま保持するような条件
下において基質から除去する。ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を基質に加え、
ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、ＩｇＥまたはＩｇＧと間に複合体を形成さ
せるようにインキュベートする。好ましくは、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質
は、検出マーカー（好ましくはビオチン、蛍光標識または酵素標識）に結合され
ている。過剰のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を除去し、必要であれば展開試
薬を加え、基質を分析のために検出装置に供す。
【０１２５】 ＩｇＥまたはＩｇＧを測定するための他の好ましい方法は、側方フローアッセ
イであり、その例が、１９９５年６月１３日発行のプロノボスト（Pronovost ）
らによる米国特許第５，４２４，１９３号、１９９５年５月１６日発行のイムリ
ッチ（Imurich ）らによる米国特許第５，４１５，９９４号、１９９４年１２月
２２日公表のミラー（Mi ller）らによる第ＷＯ９４／２９６９６号、および１
９９４年１月２０日公表のポーラック（Pawlak）らによる第ＷＯ９４／０１７７
５号に開示されている。１つの実施形態において、生物試料を以下の構成要素（
ａ）〜（ｃ）を含む側方フロー装置に導入する。（ａ）流路を形成する支持構造
物。（ｂ）ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に結合されたビーズを含む標識試薬
であって、標識領域で支持構造物内に充填されている標識試薬。（ｃ）ＩｇＥ結
合性またはＩｇＧ結合性組成物を含む捕捉試薬。捕捉試薬は、標識試薬が標識領
域から捕捉領域に流動できるように、標識領域に流体が移動しうるように連結さ
れた捕捉領域内で標識試薬の下流に配置される。支持構造物は、標識領域から捕
捉領域へのビーズの流れを阻害することのない材料からなる。支持構造物として
用いるのに適切な材料には、イオン性（すなわち、アニオン性またはカチオン性
）材料が含まれる。そのような材料の例としては、ニトロセルロース（ＮＣ）、
ＰＶＤＦ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ）が含まれるが、これらに限定さ
れるわけではない。この支持構造物は、横向きの、複数の領域すなわち標識領域
と補足領域とに分割された流路を形成する。上記装置は流路に沿った、好ましく
は標識試薬の上流に配置される試料受容領域をさらに含んでいてもよい。支持構
造物内の流路は、捕捉領域の下流、好ましくは流路の末端部にある支持構造物の
一部分を、標識および捕捉領域からの余剰液体を吸収することのできる吸収剤に
接触させることによって作成される。
【０１２６】 本実施形態においては、生物試料を支持構造物の一部分を含む試料受容領域に
導入する。標識領域では、流路によって下流方向に向けられた試料受容領域から
の試料を受け取る。標識領域は、ＩｇＥもしくはＩｇＧまたはその両方に結合す
る標識試薬を含む。好ましい標識試薬は、ラテックスビーズなどのプラスチック
ビーズ基質に直接またはリンカーを介して結合されているＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ
タンパク質である。上記基質は、好ましくは比色分析用マーカーなどの検出マー
カーも含む。典型的には、標識試薬は乾燥または凍結乾燥によって支持構造物中
に充填されている。支持構造物は、標識領域の下流の捕捉領域も含む。捕捉領域
では、流路によって下流方向に向けられた標識領域からの標識試薬を受け取る。
捕捉領域は、捕捉領域においてＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と複合体を形成
したＩｇＥおよび／またはＩｇＧを固定化する標識試薬、この場合は上で開示し
たような抗ＩｇＥもしくは抗ＩｇＧ抗体、またはその両方を含む。捕捉試薬は、
乾燥または凍結乾燥によって支持構造物に固定されていることが好ましい。標識
試薬は捕捉領域に蓄積し、この蓄積を目視または光学検出機器によって評価する
。
【０１２７】 別の実施形態において、ＩｇＥまたＩｇＧを検出するために用いられる側方フ
ロー装置は、（ａ）流路を形成する支持構造物と、（ｂ）上で開示したような抗
ＩｇＥまたは抗ＩｇＧ抗体、もしくは両方を含む標識試薬であって、標識領域に
おいて支持構造物に充填された標識試薬と、（ｃ）ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパ
ク質を含む捕捉試薬であって、標識試薬が標識領域から捕捉領域に流動できるよ
うに、標識領域に流体が移動しうるように連結された捕捉領域内で標識試薬の下
流に配置された捕捉試薬とを含む。本装置は、流路に沿って、好ましくは標識試
薬の下流に配置される試料受容領域も含むことが好ましい。本装置は、流路の末
端に配置された吸収剤も含むことが好ましい。
【０１２８】 ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して過敏性の動物は、体液の試料を用い
た場合の免疫複合体形成量と、対照試料を用いた場合の免疫複合体形成量とを比
較することによって同定される。免疫複合体とは、抗体とＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ
タンパク質とからなる複合体（すなわち、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質：抗
体複合体）のことをいう。そのようなものとして、免疫複合体は陽性対照標準試
料を用いた場合に形成され、陰性対照標準試料を用いた場合には形成されない。
生物試料が、陽性対照標準試料を用いた場合と同等かそれ以上の複合体を形成し
たとすれば、その体液を採取した動物は基質に結合されたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ
タンパク質に対して過敏性であることになる。また逆に、体液試料が、陰性対照
標準試料を用いた場合と同等の免疫複合体形成しか示さなかったとすれば、その
体液を採取した動物は基質に結合されたＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対し
て過敏性でないことになる。
【０１２９】 診断目的のために２回以上の異なる皮膚テストおよび／またはインビトロテス
トを組み合わせて使用できることは本発明の範囲に含まれる。例えば、ＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する動物の即時型過敏症は、動物の体液中のＤｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的なＩｇＥ抗体を検出することのできるインビ
トロ免疫吸着剤テストを用いることによって試験することができる。ＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐタンパク質に対して遅延型過敏反応を示すほとんどの動物は、アレル
ゲンに対して即時型過敏反応も示すが、アレルゲンに対して遅延型過敏反応を示
す小数の動物は、アレルゲンに対して即時型過敏反応を示さない。そのような場
合は、ＩｇＥ特異的インビトロテストからの負の結果に続いて、動物のＤｅｒＨ
ＭＷ−ｍａｐタンパク質に対する遅延型過敏反応を本発明の皮膚テストを用いて
試験することができる。
【０１３０】 本発明は、開示した各検出方法に基づいて、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質
に特異的に結合する抗体を検出するためのキットも包含する。１つの実施形態は
、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、ＩｇＥおよび／またはＩｇＧを検出する
手段とを含む、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質特異的抗体を検出するためのキ
ットである。適切な検出手段には、本明細書中に開示される、ＤｅｒＨＭＷ−ｍ
ａｐタンパク質またはＩｇＥおよび／またはＩｇＧに結合する化合物が含まれる
。本発明の好ましいキットは、本明細書中に開示されるＩｇＥまたはＩｇＧに選
択的に結合することができる抗体、および／またはＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパ
ク質に連結された検出マーカーに結合することのできる化合物（検出マーカーが
ビオチンである場合には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、およびＩｍ
ｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎなど）を含む検出手段さ
らに含む。
【０１３１】 本発明の他の好ましいキットは、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、ダニア
レルゲンと同一環境中で広く検出されるアレルゲンとを含むアレルゲンキットで
ある。本キットと共に用いられる適切かつ好ましいダニ関連アレルゲンには、本
明細書中で開示されるダニ関連アレルゲンが含まれる。
【０１３２】 本発明の好ましいキットには、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が基質上に固
定化されているものが含まれる。キットがＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質と、
他のアレルゲンとを含む場合には、当該キットは、それぞれ１つのアレルゲンを
含む１または複数の組成物を含んでいてもよい。そのようなものとして、各アレ
ルゲンは独立して試験することができる。キットは、ＩｇＥまたはＩｇＧのため
２つ以上の診断試薬、または本明細書中で開示される他の化合物も含んでいても
よい。側方フローアッセイ形式で用いられるキットが特に好ましい。側方フロー
アッセイキットが、１つまたは以上の側方フローアッセイ装置を含んでいてもよ
いことは、本発明の範囲に含まれる。複数の側方フロー装置を各装置の一方端部
において互いに固定して、扇状構造物を作り出すこともできる。
【０１３３】 本発明の他の態様は、ダニアレルギーに対して罹患性を示すかダニアレルギー
を有する動物を本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質製剤で治療することを
包含する。本発明に従えば、「治療」という用語は、動物によるダニアレルゲン
に対する過敏反応を調節することを意味しうる。調節には、例えば動物の過敏反
応に関与する細胞の免疫変調が含まれうる。免疫変調には、免疫反応に典型的に
関与する分子（例えば、抗体、抗原、主要組織適合性分子（ＭＨＣ）およびＭＨ
Ｃ分子と相互反応する分子）の活性を変調することが含まれうる。特に、免疫変
調とは、過敏反応に関与する細胞の炎症反応、免疫抑制および免疫寛容を引き起
こす抗原：抗体相互作用の変調をいう。免疫抑制とは、例えば、免疫反応に関与
する特定の細胞を殺すことによって、免疫反応を阻害することをいう。免疫寛容
とは、免疫反応に関与する特定の細胞をアネルギー化する（すなわち、抗原に対
するＴ細胞の反応性を小さくする）ことにより、免疫反応を阻害することをいう
。
【０１３４】 本発明の１つの実施形態は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対す
る免疫反応を阻害することのできる脱感作化合物を含む治療用組成物である。そ
のような脱感作化合物には、遮断化合物、トレラゲンおよび／またはサプレッサ
ー化合物が含まれる。遮断化合物は、炎症反応を引き起こしうる抗原：抗体相互
作用を変調することのできる化合物を含み、トレラゲンは、動物を免疫寛容にす
ることのできる化合物であり、サプレッサー化合物は、動物の免疫抑制を行うこ
とのできる化合物である。本発明の脱感作化合物は、可溶性または膜結合型のい
ずれであってもよい。膜結合型脱感作化合物は、細胞、リポソーム、二次元膜ま
たはミセルを含む生体膜に付随するものでありうる。本発明の可溶性脱感作化合
物は、（１）ＩｇＥ：抗原によって媒介されるマスト細胞の脱顆粒を阻害するこ
とにより、Ｉ型過敏反応を阻害する、（２）細胞の補体破壊を引き起こすＩｇＧ
：抗原複合体の形成を阻害することにより、ＩＩＩ型過敏反応を阻害する、およ
び（３）マクロファージによるサイトカイン分泌のＴヘルパー細胞刺激を阻害す
ることにより、ＩＶ型過敏反応を阻害するのに有用である。本発明の膜結合型脱
感作化合物は、（１）細胞の補体破壊を引き起こす細胞表面上でのＩｇＧ：抗原
複合体の形成を阻害することにより、ＩＩ型過敏反応を阻害する、（２）免疫細
胞におけるＩｇＧ調節性シグナル伝達を阻害することにより、ＩＩ型過敏反応を
阻害する、および（３）細胞障害性Ｔ細胞による抗原耐性細胞の殺傷を阻害する
ことにより、ＩＶ型過敏反応を阻害するのに有用である。脱感作化合物の例とし
ては、本発明の突然変異タンパク質、ミメトープ、抗原、ならびに、本発明のタ
ンパク質とＩｇＥとの間の結合を阻害する本発明の他の阻害剤が含まれるが、こ
れらに限定されるわけではない。
【０１３５】 本発明の脱感作化合物は、脱感作化合物を、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質
に対する過敏反応に関与する特定の細胞に仕向けることのできるリガンド分子に
共有結合的に連結されていてもよい。脱感作化合物と連結するための適切なリガ
ンドには、例えば、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、サイトカイン、レ
クチン、異種アレルゲン、ＣＤ８分子または主要組織適合性分子（例えば、ＭＨ
ＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子）が含まれる。脱感作化合物に連結する
ための好ましい免疫グロブリン分子の一部分には、免疫細胞特異的表面分子に結
合することのできる可変部、および免疫細胞上のＦｃレセプターに結合すること
のできる定常部、特にＩｇＥ定常部が含まれる。好ましいＣＤ８分子には、少な
くともＣＤ８のα鎖の細胞外機能ドメインが含まれる。免疫細胞とは、免疫反応
に関与する細胞のことをいい、特に、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分
子を有する細胞のことをいう。好ましい免疫細胞には、抗原提示細胞、Ｔ細胞お
よびＢ細胞が含まれる。
【０１３６】 １つの実施形態において、本発明の治療用組成物は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−
ｍａｐタンパク質、そのミメトープまたは突然変異タンパク質、あるいは本発明
のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む。ダニアレルギーを治療するための本発
明の適切な治療用組成物は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質、そのミ
メトープまたは突然変異タンパク質、あるいは本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核
酸分子を含む。好ましい治療用組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３
、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９
、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、
配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配
列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３３、配列番号３５、配列
番号３８、配列番号４１、および配列番号４４からなる群より選択されるアミノ
酸配列をコードする核酸分子の相補的配列とストリンジェントなハイブリッド形
成条件下でハイブリッド形成する核酸分子によってコードされる単離ダニアレル
ゲンタンパク質、上記アレルゲンタンパク質の突然変異タンパク質、および単離
核酸分子を含み、該単離核酸分子は、約１５０以上のヌクレオチドから成る核酸
分子であって、１ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドから成る溶液中、約５０℃の
温度において、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配
列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列
番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および
配列番号３３のアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする核酸配列およびそ
の相補的配列から成る群より選択される核酸配列とハイブリッド形成する核酸分
子と、約１５０ヌクレオチドから成る前記核酸分子のいずれかのフラグメントを
含む核酸分子とから成る群より選択される。好ましいＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ変異
タンパク質は、少なくともＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質の一部分を含み、該
一部分においては、改変ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質が動物に対して毒性を
示さないように（例えば、アナフィラキシーを起こさないように）、適切な数の
システイン残基が除去されているか、あるいは非システイン残基に置換されてい
る。
【０１３７】 別の実施形態において、本発明の治療用組成物は、動物中で核酸分子がＤｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に発現されうるようにして、動物に投与することので
きるＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードする核酸分子を含む。核酸分子は
、（ａ）裸の（すなわちウィルスコートまたは細胞膜にパッケージングされてい
ない）核酸分子（例えば、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、例えば、Science,第２
４７号、１４６５〜１４６８頁においてウォルフ（Wolff ）らによって教示され
ているようなもの）を投与すること、または、（ｂ）組換えウィルスまたは組換
え細胞としてパッケージングされた核酸分子を投与すること（すなわち、核酸分
子がウィルスまたは細胞伝達体によって伝達される）を含み、これらに限定され
るわけではない様々な方法によって動物に伝達することができる。
【０１３８】 本発明の裸の核酸分子は、本発明の核酸分子を含み、好ましくは複製能を有す
るか、あるいは増幅能を有すると共に感応能力を有する本発明の組換え分子を含
むことが好ましい。本発明の裸の核酸分子は、例えば１または複数の内部リボソ
ーム挿入部位を有する、例えばビシストロニック（bicistronic ）組換え分子の
形態で、１または複数の本発明の核酸分子を含んでいてもよい。好ましい裸の核
酸分子は、ウィルスゲノムの少なくとも一部分（すなわちウィルスベクター）を
含む。好ましいウィルスベクターには、アルファウィルス、ポックスウィルス、
アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ピコルナウィルス、およびレトロウィルス
に基づくものが含まれるが、アルファウィルス（シンドビスまたはセムリキウィ
ルスなど）、種特異的ヘルペスウィルス、種特異的ポックスウィルスが特に好ま
しい。タンパク質の生産に適切であるとして開示したものを含む、任意の転写調
節配列を用いることができる。特に好ましい転写調節配列には、サイトメガロィ
ルス中間初期配列（好ましくはイントロンＡと連結して）、ラウス肉腫ウィルス
の長い末端反復配列、および組織特異的転写調節配列、ならびにウィルスベクタ
ーが用いられる場合にはウィルスベクターに内在する転写調節配列が含まれる。
「強力な」ポリＡ配列を組み合わせることも好ましい。
【０１３９】 本発明の裸の核酸分子は、様々な方法によって投与することができる。適切な
送達方法には、例えば、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、皮内乱切、粒子衝撃
、経口投与、および経鼻投与が含まれるが、筋肉内注射、皮内注射、皮内乱切お
よび粒子衝撃が好ましく、筋肉内注射がさらに好ましい。裸のＤＮＡ分子の好ま
しい一回量は、当業者によって決定されうるように、投与経路および／または送
達方法によって、約１ナノグラム（ｎｇ）から約１ミリグラム（ｍｇ）の範囲で
ある。投与方法の例は、例えば、１９９３年４月２０日に発行されたブルナー（
Bruner）らによる米国特許第５，２０４，２５３号、１９９５年７月２７日に公
開されたマッケーブ（McCabe）によるＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／１９７９９、お
よび１９９５年３月２日に公開されたカーソン（Carson）らによるＰＣＴ公開公
報第ＷＯ９５／０５８５３号に開示されている。本発明の裸のＤＮＡ分子は、水
性賦形剤（例えばリン酸緩衝塩類溶液）および／または担体（例えば脂溶性賦形
剤）中に含まれていてもよく、あるいは微小粒子（例えば金粒子）に結合されて
いてもよい。
【０１４０】 本発明の組換えウィルスは、ウィルスコート中にパッケージされ、投与後に動
物中で発現されることのできる本発明の組換え分子を含む。好ましくは、組換え
分子はパッケージング欠失および／または弱毒化ウィルスをコードする。アルフ
ァウィルス、ポックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ピコルナ
ウィルス、およびレトロウィルスに基づく多数の組換えウィルスを用いることが
できるが、これらに限定されるわけではない。好ましい組換えウィルスは、アル
ファウィルス（シンドビスウィルスなど）、アライグマポックスウィルス、種特
異的ヘルペスウィルス、および種特異的ポックスウィルスに基づくものである。
アルファウィルス組換えウィルスを作成し使用するための方法の例は、１９９４
年８月１８日に公開されたション（Xiong ）らによるＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／
１７８１３に開示されている。
【０１４１】 動物に投与されると、本発明の組換えウィルスはレシピエント動物内の細胞に
感染し、当該動物内のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質によって媒介される生物
学的反応を低減することのできるタンパク質またはＲＮＡ核酸分子の産生を指示
する。例えば、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子を含む組換えウィルスは
、動物がＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質によって媒介される生物学的反応を低
減するのに十分な量のタンパク質またはＲＮＡを生産する結果をもたらすような
プロトコールに従って投与される。本発明の組換えウィルスの好ましい一回量は
、動物の体重１キログラムあたり、約１×１０4 〜約１×１０7 ウィルスプラー
ク形成単位（ｐｆｕ）である。投与プロトコールは、本明細書中でタンパク質に
基づく組成物に対して記載したものと同様であり、皮下、筋肉内、鼻腔内、およ
び経口投与経路が好ましい。
【０１４２】 本発明の組換え細胞ワクチンは、本発明の少なくとも１つのタンパク質を発現
する本発明の組換え細胞を含む。この実施形態に対する好ましい組換え細胞には
、サルモネラ（Salmonella）、イー・コリ（E. coli ）、リステリア（Listeria
）、ミコバクテリウム（Mycobacterium ）、エス・フルジペルダ(S. frugiperda
) 、酵母（サッカロマイセス・セルビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）およ
びピチア・パストリス（Pichia pastoris ）を含む）、ＢＨＫ、ＣＶ−１、筋芽
細胞Ｇ８、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫおよびＣＲＦＫ
組換え細胞が含まれる。本発明の組換え細胞ワクチンは様々な方法によって投与
可能であるが、経口にて、好ましくは体重１キログラムあたり細胞約１０8 〜約
１０12個の用量で投与可能であるという利点を有している。投与プロトコールは
、本明細書中でタンパク質に基づくワクチンに対して開示したものと同様である
。組換え細胞ワクチンは、全細胞、細胞壁を除去した細胞、または細胞溶菌液の
いずれから成るものであってもよい。
【０１４３】 ダニアレルギーに対する動物の脱感作を行うための本発明の治療用組成物の効
力は、本明細書中で開示したインビボ皮膚テスト方法、治療される動物中での細
胞性免疫活性の検出、または本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に特異的
に結合するＩｇＥのレベルの測定を含む様々な方法で試験することができるが、
これらに限定されるわけではない。動物中における細胞性免疫活性およびＩｇＥ
レベルを決定するための方法は、当業者によって知られている。１つの実施形態
において、治療用組成物は、イヌ、ネコ、ウサギ、マウスなどの動物モデルにお
いて試験することができ、ヒトにおいても試験することができる。そのような技
術は、当業者によって知られている。
【０１４４】 本発明の治療用組成物とともに用いる好ましい核酸分子には、本明細書中で開
示される任意のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ核酸分子が含まれ、特に配列番号１４、配
列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列
番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番
号４２、配列番号４３、配列番号４５、および／または、配列番号３３のアミノ
酸配列から成るタンパク質をコードする核酸配列およびその相補的配列である。
【０１４５】 本発明の治療用組成物における有用な組換え細胞には、本発明のＤｅｒＨＭＷ
−ｍａｐタンパク質を含む本発明の組換え細胞が含まれる。この実施形態に対す
る好ましい組換え細胞には、サルモネラ（Salmonella）、イー・コリ（E. coli
）、リステリア（Listeria）、ミコバクテリウム（Mycobacterium ）、エス・フ
ルジペルダ(S. frugiperda) 、酵母（サッカロマイセス・セルビシアエ（Saccha
romyces cerevisiae）を含む）、ＢＨＫ、ＣＶ−１、筋芽細胞Ｇ８、ＣＯＳ（例
えば、ＣＯＳ−７）、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫおよびＣＲＦＫ組換え細胞が含まれる
。本発明の組換え細胞は様々な方法によって投与可能であるが、経口にて、好ま
しくは体重１キログラムあたり細胞約１０8 〜約１０12個の用量で投与可能であ
るという利点を有している。投与プロトコールは、本明細書中でタンパク質組成
物に対して開示したものと同様である。組換え細胞は、全細胞、細胞壁を除去し
た細胞、または細胞溶菌液のいずれから成るものであってもよい。
【０１４６】 本発明の１つの実施形態は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質を含む
有効量の治療用組成物を動物に投与することを含む、免疫治療の方法である。適
切な治療用組成物および投与方法は、本明細書中で開示されている。本発明によ
れば、本発明の治療用組成物および方法は、ダニアレルゲン病原に付随する症状
を予防または軽減するために使用することができる。
【０１４７】 ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対するアレルギー反応に有効な本発明の治
療用組成物の効力は、即時型過敏症、遅延型過敏症、抗体依存性細胞障害（ＡＤ
ＣＣ）、免疫複合体活性、マイトジェン活性を含み、これらに限定されるわけで
はない、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質媒介性免疫を検出するための標準的な
方法、ヒスタミン放出アッセイ、およびジェーンウェイ（Janeway ）らの文献に
記載されているような他の方法を用いて試験することができる。
【０１４８】 本発明はまた、１または複数の本発明の治療用化合物を含む治療用組成物も包
含する。そのような治療用化合物の例としては、例えば本明細書中に開示される
他のアレルゲンも含まれる。
【０１４９】 本発明の治療用組成物は、治療される動物が耐性を有する賦形剤中で調製する
ことができる。そのような賦形剤の例としては、水、生理的食塩水、リンガー溶
液、デキストロース溶液、ハンク溶液、および他の水性の生理学的平衡塩溶液が
含まれる。非水性賦形剤、例えば不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、また
はトリグリセリドなども使用することができる。他の有用な製剤には、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの増粘
剤を含有する懸濁液が含まれる。賦形剤は少量の添加剤、例えば等張性および化
学的安定性を高める基質などを含んでいてもよい。緩衝液の例としては、リン酸
緩衝液、重炭酸緩衝液、およびトリス緩衝液が含まれ、保存剤の例としては、チ
メロサール、ｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが含まれ
る。標準製剤は、液体注入可能であるか、あるいは適当な液体中に懸濁液として
若しくは注入用溶液として溶解可能な固体のいずれであってもよい。したがって
、非液体製剤においては、賦形剤はデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存
剤などを含んでいてもよく、これに滅菌水または生理的食塩水を投与に先立って
添加することができる。
【０１５０】 本発明の１つの実施形態において、治療用組成物はアジュバントを含んでいて
もよい。アジュバントは、特定の抗原に対する動物の免疫反応を増強することの
できる物質である。適切なアジュバントには、サイトカイン、ケモカイン、およ
びサイトカインおよびケモカインの産生を誘起する化合物（例えば、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−
ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子
（ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイ
キン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（
ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６
）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、イン
ターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、イン
ターフェロンγ、インターフェロンγ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォー
ミング増殖因子β、ＲＡＮＴＥＳ（regulated upon activation, normal T cell
expressed and presumably secreted）、マクロファージ炎症性タンパク質（例
えば、ＭＩＰ−１αやＭＩＰ−１β）、および、リーシュマニア伸長開始因子（
ＬＥＩＦ）、細菌成分（例えば、内毒素、特に超抗原、外毒素、および細胞壁成
分）、アルミニウムに基づく塩、カルシウムに基づく塩、シリカ、ポリヌクレオ
チド、トキソイド、血清タンパク質、ウィルスコートタンパク質、ブロック共重
合体アジュバント（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ Ｔｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）
アジュバント（Vaxcel（登録商標）、ジョージア州、ノークロス（Norcross）所
在）、Ｒｉｂｉアジュバント（マサチューセッツ州ハミルトン（Hamilton）所在
、Ribi ImmunoChem Research, 社）、およびサポニンとその誘導体（例えば、Ｑ
ｕｉｌ Ａ（デンマーク所在、Superfos Biosector A/S）が含まれるが、これら
に限定されるわけではない。本発明のタンパク質アジュバントは、それらのタン
パク質そのものの形で送達してもよいし、あるいは本明細書中に開示される方法
を用いてそのようなタンパク質をコードする核酸分子の形で送達してもよい。
【０１５１】 本発明の１つの実施形態において、治療用組成物は担体を含んでいてもよい。
担体には、治療される動物中における治療用組成物の半減期を延ばすような化合
物が含まれる。適切な担体には、高分子放出制御賦形剤、生体内分解性移植片、
リポソーム、細菌、ウィルス、他の細胞、油、エステルおよびグリコールが含ま
れるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５２】 本発明の１つの実施形態は、本発明の組成物を動物中にゆっくりと放出するこ
とのできる放出制御製剤である。本明細書中で用いる放出制御製剤は、本発明の
組成物を放出制御賦形剤中に含む。適切な放出制御賦形剤には、生物適合性ポリ
マー、他の高分子マトリックス、カプセル、マイクロカプセル、徴小粒子、巨丸
剤、浸透ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェア、および経皮送達システ
ムが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の他の放出制御製剤
には、動物に投与されると、インサイトゥ（in situ ）で固体またはゲルを形成
する液体も含まれる。好ましい放出制御製剤は生体内分解性（すなわち生物腐食
性）である。
【０１５３】 本発明の好ましい放出制御製剤は、本発明の治療用組成物を動物の血中に、該
動物におけるダニアレルギーを軽減するための組成物の治療用量を達成するのに
十分な一定速度で放出することができる。本明細書中で用いるダニアレルギーと
は、ダニアレルゲンが動物に接触したときに起こる細胞性反応のことをいう。例
えば、ダニアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥは、Ｆｃεレセプターと結合さ
れた状態になり、その結果、ヒスタミン、プロスタグランジンおよび／またはプ
ロテアーゼなどといった、アレルギーの臨床的症状の引き金となりうる生物学的
メディエータの放出を含むＦｃイプシロンレセプター媒介性生物学的反応が引き
起こされる。治療用組成物は、約１ヶ月から約１２ヶ月の期間に亘って放出され
ることが好ましい。本発明の好ましい放出制御製剤は、少なくとも１ヶ月間、よ
り好ましくは少なくとも３ヶ月間、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月間、さら
に好ましくは少なくとも９ヶ月間、さらに好ましくは少なくとも１２ヶ月間に亘
って治療の効力を発揮することができる。
【０１５４】 本発明の治療用組成物は、タンパク質分解が起こらないような従来の方法（例
えば濾過）によって滅菌されるか、および／または凍結乾燥されてもよい。 本発明の治療用組成物は、本明細書中に記載したようなダニアレルギーに罹患
性のあらゆる動物に投与することができる。本発明の治療用組成物を有効に投与
するための許容されうるプロトコールは、個々の用量、投与回数、投与頻度、お
よび投与様式に応じて変化しうる。そのようなプロトコールの決定は、当業者に
よって達成されることができる。有効用量とは、動物のダニアレルゲンに対する
過敏症を治療することのできる用量のことをいう。有効用量は、例えば使用され
る治療用組成物、およびレシピエント動物の大きさや種類に応じて変化しうる。
動物に対してダニアレルギーに対する免疫変調を行うための有効用量は、動物が
示すダニアレルゲンに対する過敏反応を軽減することのできる期間に亘って投与
される用量を含む。例えば、第１の減感作用量は、過敏性動物に投与された場合
に最小限の過敏反応を引き起こすような本発明の治療用組成物量を含むことがで
きる。第２の減感作用量は、第１の用量よりも多い量の同一の治療用組成物を含
むことができる。有効な減感作投与は、動物がダニアレルゲンへの暴露に対して
過敏反応を示さないように動物を減感作するために必要な治療用組成物を、濃度
を増加させながら投与することを含みうる。動物を脱感作するための有効用量は
、動物の環境中に存在するダニアレルゲンへの暴露に対して動物が示す過敏反応
を阻害するのに十分な濃度の本発明の治療用組成物を含みうる。有効な脱感作投
与は、過敏性動物に投与された場合に最小限の過敏反応しか引き起こさないよう
な濃度の治療用組成物の繰り返し投与を含みうる。
【０１５５】 適切な一回量は、適切な期間に亘って１回以上投与された場合に、動物のダニ
アレルゲンに対する過敏症を治療することのできる用量である。例えば、ダニア
レルゲンまたはミメトープ治療用組成物の好ましい一回量は、動物の体重１キロ
グラムあたり約０．５ｎｇ〜約１ｇの治療用組成物である。この治療用組成物を
用いたさらなる治療は、最初の投与が施されてからの約１日から１年後に行うこ
とができる。この治療用組成物による追治療は、動物におけるダニアレルゲン過
敏反応に対する予防効果が消滅したときに施されることが好ましい。個々の投与
用量および計画は、上で検討したパラメータに基づいて当業者によって編み出さ
れることができる。投与の様式には、皮下、皮内、静脈内、経鼻、経口、経皮お
よび筋肉内経路が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５６】 本発明の治療用組成物は、動物のダニアレルゲンに対する過敏症を改変するこ
とのできる他の化合物と組み合わせて使用することができる。例えば、動物は、
過敏反応に関与する細胞の機能を改変することのできる化合物、全身性物質（sy
stemic agent）または抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン、抗ステロイド剤、抗炎
症剤、およびＩｇＥからＩｇＧへの免疫グロブリンＨ鎖クラススイッチを駆動す
る物質）などによってアレルギー反応を軽減する化合物を用いて治療することが
できる。過敏反応に関与する細胞の機能を改変するのに有用な適切な化合物には
、抗ヒスタミン、クロモリンナトリウム、テオフィリン、シクロスポリンＡ、ア
ドレナリン、コルチゾン、細胞性シグナル伝達を調節することのできる化合物、
アデノシン３’，５’−サイクリックリン酸（ｃＡＭＰ）活性を調節することの
できる化合物、およびＩｇＥ活性を阻害する化合物、例えばＩｇＥまたはＩｇＥ
特異的Ｆｃレセプター由来のペプチド、ＩｇＥまたはＩｇＥ特異的Ｆｃレセプタ
ー由来のペプチドに特異的な抗体、あるいはＩｇＥがＦｃレセプターに結合する
のを阻害することのできる抗体が含まれるが、これらに限定されるわけではない
。
【０１５７】 本発明の組成物は、ダニアレルゲン過敏症を有するか、あるいは罹患性のある
任意の動物に投与することができる。治療する好ましい動物には、哺乳動物およ
び鳥類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒトおよび他の愛玩動物、労働および／または経済
的食用動物が含まれる。予防を行う特に好ましい動物は、イヌとネコである。
【０１５８】 本発明の他の態様は、ダニアレルゲンに対する過敏症を有するか、あるいは罹
患性のある動物に対して、本発明の製剤を用いた治療の処方を行う方法を包含す
る。ダニアレルゲン過敏症に対する治療の好ましい処方方法は、例えば、（１）
本発明のダニアレルゲンまたはそのミメトープを含有する有効量の製剤（適切か
つ好ましい製剤は本明細書中に開示されている）を動物の一部位に皮内注射する
工程と、（２）有効量の対照溶液を動物の別の部位に皮内注射する工程と、（３
）製剤を注射した場合に見られる膨疹の大きさと対照溶液を注射した場合に見ら
れる膨疹の大きさとを測定し、比較することにより、その動物がダニアレルゲン
過敏症を有するかどうか評価する工程と、（４）そのダニアレルゲン過敏症に対
する治療を処方する工程とを含む。
【０１５９】 ダニアレルゲン過敏症に対する治療を処方するための代替の好ましい方法は、
（１）被験動物から得られた体液試料の第１の部分を、本発明のダニアレルゲン
またはそのミメトープを含有する有効量の製剤（適切かつ好ましい製剤は本明細
書中に開示されている）に接触させて、第１の免疫複合体溶液を形成させる工程
と、（２）陽性対照標準抗体を接触させて第２の免疫複合体溶液を形成させる工
程と、（３）第１および第２の免疫複合体溶液中における免疫複合体形成量を測
定し、比較することにより、その動物がダニアレルゲン過敏症を有するかどうか
を評価する工程と、（４）そのダニアレルゲン過敏症に対する治療を処方する工
程とを含む。ここで、本明細書中に開示されるダニアレルゲン製剤を用いたアレ
ルギーの治療を処方するためにも、同様の方法を用いることができることを注記
しておく。
【０１６０】 本発明の他の態様は、本発明の製剤を用いて、ダニアレルゲン過敏症を有する
か、あるいは罹患性のある動物をモニターするための方法を包含する。本発明の
インビボおよびインビトロ試験は、ダニアレルゲン過敏症のためのあらゆる治療
の前後に、動物のダニアレルゲン過敏症を試験するために用いることができる。
ダニアレルゲン過敏症の治療をモニターするための好ましい方法（これは他のア
レルギーの治療をモニターするためにも適用することができる）は、（１）本発
明のダニアレルゲンまたはそのミメトープを含有する有効量の製剤（適切かつ好
ましい製剤は本明細書中に開示されている）を動物の一部位に皮内注射する工程
と、（２）有効量の対照溶液を動物の別の部位に皮内注射する工程と、（３）製
剤を注射した場合に見られる膨疹の大きさと対照溶液を注射した場合に見られる
膨疹の大きさとを測定し、比較することにより、その動物がダニアレルゲンに対
して脱感作されたかどうかを決定する工程とを含む。
【０１６１】 ダニアレルゲン過敏症の治療をモニターするための代替の好ましい方法（他の
アレルギーの治療をモニターするためにも適用することができる）は、（１）被
験動物から得られた体液試料の第１の部分を、本発明のダニアレルゲンまたはそ
のミメトープを含有する有効量の製剤（適切かつ好ましい製剤は本明細書中に開
示されている）に接触させて、第１の免疫複合体溶液を形成させることと、（２
）陽性対照標準抗体を接触させて第２の免疫複合体溶液を形成させることと、（
３）第１および第２の免疫複合体溶液中における免疫複合体形成量を測定し、比
較することにより、その動物がダニアレルゲンに対して脱感作されたかどうかを
決定することとを含む。
【０１６２】 また本発明は、ダニアレルゲンまたはそのミメトープに選択的に結合すること
のできる抗体も包含する。そのような抗体は、本明細書中では抗ダニアレルゲン
抗体と称する。本明細書中で用いる「選択的に結合する」という用語は、そのよ
うな抗体の持つ、ダニアレルゲンおよびそのミメトープに優先的に結合する能力
のことをいう。特に、本発明はＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に選択的に結合
することのできる抗体を含む。結合は、イムノブロットアッセイ、免疫沈降アッ
セイ、酵素イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫
蛍光抗体アッセイ、免疫電子顕微鏡を含む当業者によって知られている様々な方
法を用いて測定可能である。上記については、例えばサンブルックらの前掲の文
献を参照のこと。
【０１６３】 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであ
ってもよい。本発明の抗体には、抗体を得るために用いられるタンパク質または
ミメトープの少なくとも１つのエピトープに選択的に結合することのできる一本
鎖抗体を含む、抗体の断片および遺伝子工学的に設計された抗体などの機能的均
等物も含まれる。好ましい抗体は、ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質またはその
ミメトープに応答して産生される。抗体の産生させるためのより好ましいＤｅｒ
ＨＭＷ−ｍａｐタンパク質には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号
１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３
１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８
、配列番号４１、および／または配列番号４４のアミノ酸配列を有するタンパク
質の少なくとも一部分、またはその同族体が含まれる。好ましくは、本発明の抗
体は、本発明のＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質に対して約１０3 Ｍ-1から約１
０12Ｍ-1の単一部位結合親和性を有している。
【０１６４】 本発明の抗体を産生させるための好ましい方法は、動物に有効量のＤｅｒＨＭ
Ｗ−ｍａｐタンパク質またはそのミメトープを投与して、抗体を産生させ、その
抗体を回収することを含む。特定の産物またはミメトープに対して産生された抗
体は、治療用組成物中で使用された場合に診断アッセイの妨害や副作用を引き起
こす可能性のある他の物質に対する抗体が混入していないために、有益であると
考えられる。
【０１６５】 本発明の抗体は、本発明の範囲に含まれる様々な潜在的用途を有している。例
えば、本発明の抗体は、（ａ）動物をダニアレルゲン過敏症から守るために動物
を受動免疫するためのワクチンとして、（ｂ）テストキットにおける陽性対照標
準として、および／または（ｃ）タンパク質と他の混入物の混合物から所望のダ
ニアレルゲンを回収するための道具として用いることができる。
【０１６６】 以下の実施例は説明のために与えられるものであって、本発明の範囲を限定す
ることを意図したものではない。 （実施例） 実施例には、当業者には周知であると考えられる、多くの分子生物学、微生物
学、免疫学及び生物化学的技術が含まれることに注意すべきである。そのような
技術の開示は、サンブルック（Sambrook）らの前掲の文献および関連文献におい
て見出すことができる。
【０１６７】 実施例１． この実施例では、ダニアレルゲンにアレルギー反応を示すことが知られている
イヌ由来ＩｇＥに結合する高分子量タンパク質の同定について説明する。 約５．５ｇの凍結湿性のDermataphagoides farinae（Ｄｅｒｆ）ダニ（ワシン
トン州スポーカン（s pokane ）所在、Bayer Allergy 社より入手可能）をすり
ガラスホモジナイザ内、約３０ｍｌのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）あるいは０
．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８のいずれか（それぞれ、完全なプロテアーゼ
阻害剤（インディアナ州インディアナポリス所在、Behringer Mannheim社より入
手可能）を含む）中で、ホモジナイズし、Ｄｅｒｆ粗抽出液を得た。得られた上
清を集め、それぞれを、セントリプレップ（Centriprep）３０濃縮器（アミコン
（マサチューセッツベヴァリー（Beverly ）所在、Amicon社より入手可能）中で
、約３０分間、１６、０００ｘｇでの遠心を行い濃縮した。濃縮された上清を、
それぞれ、ＰＢＳあるいは０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に漬けた分離セ
ファクリル（Sephacryl ）Ｓ−１００カラム（２．７×７０ｃｍ、ファーマシア
（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway）所在、Pharmacia 社より入
手可能）に適用した。各カラムから除去した画分をプールした。画分は、ＰＢＳ
を使用した場合には、１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に対し透析した。画
分は分離Ｑ−セファロースカラム（２．５×５ｃｍ、Pharmacia より入手可能）
に適用した。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を含む画分を使用する場合、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８でＱ−セファロースカラムを予め平衡化し
た。各カラムについて、約４５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、次
に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、次に０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８、次に０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、次に０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８、及び次に０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を用い逐次溶出し
た。各溶出工程から画分を収集した。各画分について、ダニアレルゲンに対して
アレルギー反応を起こすことが知られているイヌから単離したイヌ血清（本明細
書では、ダニアレルギーイヌ抗血清またはダニアレルギー抗血清という）中に存
在するＩｇＥ抗体に結合したタンパク質の存在に対し、ウエスターンブロットに
より分析した。特に、画分中に含まれるタンパク質は、１２％ Ｔｒｉｓ−グリ
シン ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上にブロットした。ブ
ロットを、標準緩衝液を用いて１：２０に希釈された、ダニアレルゲンに対して
アレルギー反応を起こすことが知られているイヌから得られた血清プールと共に
インキュベートした。標準手順を用いて、ブロットをインキュベートし、その後
、洗浄した。その後、ブロットを、マウスモノクローナル抗イヌＩｇＥ抗体ＤＥ
Ｉ３８（１ｍｇ／ｍｌ、１：１０００希釈）と共にインキュベートした。標準手
順を用いて、ブロットをインキュベートし、その後、洗浄した。その後、ブロッ
トを、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させたロバ抗マウスＩｇＧ抗
体（１：１０００希釈、メイン所在のジャクソン（Jackson ）研究所より入手可
能）と共にインキュベートした。ブロットに結合されたＨＲＰ共役抗体の存在を
、標準技術を用いて検出した。約７０ｋＤのタンパク質が、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ８画分中で同定され、約９８ｋＤのタンパク質及び約１０９ｋＤ
のタンパク質が０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８画分中で同定された。
【０１６８】 ０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を用いて溶出された上述の画分を、セン
トリプレップ３０濃縮器中で濃縮され、その後、２０ｍＭ Ｎａ−Ａｃ、ｐＨ５
．６で希釈した。希釈された画分はその後、ポリキャット Ａ ＨＰＬＣカチオ
ン交換カラム（メリーランド州コロンビア（Columbia）所在、PolyLCより入手可
能）に適用した。カラムの溶出を、約１０ｍｌの２０ｍＭ Ｎａ−Ａｃ、ｐＨ５
．６、その後に、０から０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を有する約４５ｍｌの２
０ｍＭ Ｎａ−ＡＣ、ｐＨ５．６緩衝液を用いて、約１ｍｌ／分の流速で行った
。画分を溶出手順から収集し、上述のダニアレルギー性血清及びウエスタンブロ
ットプロトコルを用いて高分子量タンパク質の存在について分析した。高分子量
タンパク質を含む画分をプールした。トリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）を約０．０５
％の濃度まで添加した。溶液を、８０％の溶剤Ａと２０％の溶剤Ｂに浸して予め
平衡化したＴＳＫ−ゲルＴＭＳ−２５０ Ｃ１逆相カラム（ペンシルベニア州モ
ンゴメリービレ（Montgomeryville ）所在TosoHaas社より入手可能）に適用した
。溶剤Ａは、水中約０．０５％のＴＦＡからなり、溶剤Ｂは水中９０％のアセト
ニトリル中約０．０５％のＴＦＡからなる。カラムは、約５ｍｌの２０％溶剤Ｂ
を用いて、その後２０％から７０％の直線勾配の約３６ｍｌの溶剤Ｂを用いて、
０．６ｍｌ／分で溶出した。カラムから溶出したタンパク質は、１２％のＴｒｉ
ｓ−グリシンＰＡＧＥにより分離した。ゲルは、クマシー（Comassie）青を用い
て染色した。染色したゲルを図１に示す。レーン１は、マーク（Mark）−１２タ
ンパク質分子量マーカー（カリフォルニア州サンディエゴ（San Diego ）所在、
Novex より入手可能）を含み、レーン２は逆相カラムから溶出したタンパク質を
含み、レーン３はシーブルー（SeeBlue 、登録商標）タンパク質分子量マーカー
（Novex より入手可能）を含む。２つの主要なタンパク質が溶出剤中で同定され
た。タンパク質の分子量を、バイオラッド（BioRad、登録商標）マルチアナリス
ト（Multi-Analyst 、登録商標）／ＰＣイメージシステム（バイオラッド社より
入手可能）を用いて決定した。図１のレーン２中の分子量が高い方のタンパク質
は約１０９ｋＤであると決定された。これを本明細書ではダニアレルゲンタンパ
ク質Ａ（ｍａｐＡ）と称する。図１のレーン２中の分子量が低い方のタンパク質
は約９８ｋＤであると決定された。これを本明細書ではダニアレルゲンタンパク
質Ｂ（ｍａｐＢ）と称する。混合タンパク質の純度は８５％より大きく、すなわ
ち、不純物は１５％未満である。この精製された溶出液は、本明細書で、D. far
inae高分子量ｍａｐ（ＨＭＷ−ｍａｐ）組成物という。
【０１６９】 実施例２． この実施例では、D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物中のタンパク質のＮ−末端
配列決定について説明する。 実施例１で上述したように得られた０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８画分
中に含まれるタンパク質を、１２％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミド−Ｓ
ＤＳゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後、クマシー（Coomasie
）染色を行った。タンパク質をＰＶＤＦ上にブロットし、クマシーＲ−２５０を
用いて染色し、標準手順を用いて脱染した。約９８ｋＤ及び約１９８ｋＤバンド
に対応するタンパク質を切り出し、それぞれについて当業者に周知の技術を用い
てＮ−末端アミノ酸配列決定した。約１４アミノ酸の部分Ｎ−末端アミノ酸配列
を、両方のタンパク質に対し導きだし、その配列が同一であることを決定した。
Ｎ−末端アミノ酸配列は、本明細書では、配列番号１と表すが、これはＳｅｒ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｍｅｔのアミノ酸配列を有する。
【０１７０】 D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物中のタンパク質を、内部アミノ酸配列データ
が得られるように、タンパク質分解開裂に付した。とりわけ、D. farinaeＨＭＷ
−ｍａｐ組成物は、当分野における標準方法により、エンドプロテイナーゼＡｓ
ｐ−Ｎ（インディアナ州インディアナポリス所在、Boehringer Mannheim Bioche
micaより入手可能）を用いて開裂した。その後、消化したタンパク質を、ストー
ン（stone ）ら、微小配列決定のためのタンパク質及びペプチドに対する実用ガ
イドにおけるタンパク質の酵素消化とＨＰＬＣペプチド単離（Enzymatic Digest
ion of Proteins and HPLC Peptide Isolation in A practical Guide to Prote
in and Peptide Purification for Microsequencing ）、PT Matsudaira ed. 、
Academic Press 、 San Diego、 CA.に記載の方法を用いてＨＰＬＣにより分離
した。１２のタンパク質分解フラグメントが単離され、それらを本明細書では、
ｍａｐ（１）、ｍａｐ（２）、ｍａｐ（３）、ｍａｐ（４）、ｍａｐ（５）、ｍ
ａｐ（６）、ｍａｐ（７）、ｍａｐ（８）、ｍａｐ（９）、ｍａｐ（１０）、ｍ
ａｐ（１１）、ｍａｐ（１２）と称する。
【０１７１】 ｍａｐ（１）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｙ
ｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｙ
ｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏと決定され、配
列番号２と示す。ｍａｐ（２）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
と決定され、配列番号３と示す。ｍａｐ（３）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｓｅｒと決定され、配列番号４と示す。ｍａｐ（４）のＮ末端の部分ア
ミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃ
ｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏと決定され、配列番号５と示す。ｍａｐ
（５）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒ
ｏ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｙｓと決定され、配列番号６と示す。ｍａｐ（
６）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓと決定さ
れ、配列番号７と示す。ｍａｐ（７）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎと決定され、配列番号８と示す。ｍａ
ｐ（８）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｘａａ Ａｓｎ Ｖ
ａｌ Ｍｅｔ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａ
ｒｇと決定され、配列番号９と示す（本明細書で、Ｘａａは任意のアミノ酸を示
す）。ｍａｐ（９）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｘａａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕと決定され、配列番号１０と示す（本
明細書で、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す）。ｍａｐ（１０）のＮ末端の部分ア
ミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉ
ｌｅ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖ
ａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙと決定され、配列番号１１と示す。ｍａｐ（１１）のＮ末
端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒと決定され、配列番号１２と示す。ｍ
ａｐ（１２）のＮ末端の部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒと決定され、配列番
号１３と示す。ｍａｐ（１）、ｍａｐ（２）、ｍａｐ（３）、ｍａｐ（４）、ｍ
ａｐ（５）、ｍａｐ（６）、ｍａｐ（７）、ｍａｐ（８）、ｍａｐ（９）、ｍａ
ｐ（１０）、ｍａｐ（１１）、ｍａｐ（１２）、ｍａｐ（１３）に対するアミノ
酸配列は、ｍａｐＡ及びｍａｐＢタンパク質の混合物から生じたものであるため
、これらの配列は、必ずしも、１つのタンパク質の部分配列を示すものではない
。
【０１７２】 実施例３． この実施例では、ダニアレルゲンにアレルギー反応を示すことが知られている
イヌ由来ＩｇＥに結合する７０−ｋＤのタンパク質の精製について説明する。 ０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を用いて溶出した実施例１において説明
した画分を、セントリプレップ３０濃縮器内で濃縮し、その後、２０ｍＭ Ｎａ
−Ａｃ、ｐＨ５．６で希釈した。希釈したタンパク質はその後、ポリキャット
Ａ ＨＰＬＣカチオン交換カラムに適用した。カラムは、約１０ｍｌの２０ｍＭ
Ｎａ−Ａｃ ｐＨ５．６を用いて、その後、０から０．５Ｍ ＮａＣｌまでの
直線勾配の約４５ｍｌの２０ｍＭ Ｎａ−Ａｃ、ｐＨ５．６緩衝液を用いて、約
１ｍｌ／分の流速で溶出させた。画分を溶出手順から収集し、上述したダニアレ
ルギー性抗血清及びウエスタンブロットプロトコルを用いて７０−ｋＤのタンパ
ク質の存在について分析した。７０−ｋＤのタンパク質を含む画分をプールした
。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を約０．０５％の濃度まで添加した。その溶液を
、８０％溶剤Ａと２０％溶剤Ｂにおいて予め平衡化しておいたＴＳＫ−ゲル Ｔ
ＭＳ−２５０ Ｃ１逆相カラムに適用した。溶剤Ａは、水中約０．０５％ＴＦＡ
からなり、溶剤Ｂは、水中９０％アセトニトリル中約０．０５％ＴＦＡからなる
。カラムは、約３ｍｌの２０％溶剤Ｂを用いて、その後３６ｍｌの約２０％から
約７０％の直線勾配の溶剤Ｂを用いて、０．６ｍｌ／分で、溶出させた。純度＞
９０％の約７０−ｋＤのタンパク質が得られた。約７０−ｋＤのタンパク質は本
明細書ではｍａｐＣと称する。
【０１７３】 ７０ｋＤタンパク質（ｍａｐＣ）に対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の１つの領域
のＮ−末端配列を、実施例２で説明しているように求めた。約２１アミノ酸のＮ
−末端アミノ酸配列が、８０％の信頼レベルで導かれ、本明細書では、配列番号
３３として表される。これは、以下のアミノ酸配列を有する：Ｇｌｎ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｘａａ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｐ。
【０１７４】 実施例４． この実施例では、ダニアレルゲンにアレルギー反応を示すことが知られている
イヌから単離されたイヌ血清中のイヌＩｇＥへのD. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成
物（すなわち、ｍａｐＡ及びｍａｐＢを含む）の結合を説明する。
【０１７５】 イミュロン（Immulon ）ＩＩ マイクロタイタ−プレートの複数のウェルを、
実施例１の中で説明した方法に従い単離しＣＢＣ緩衝液中で希釈した約１００ｎ
ｇ／ウェルのD. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物でコートした。プレートを、４℃
で一晩インキュベートした。インキュベート後、D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成
物含有溶液をプレートから除去し、プレートをブロットして乾かした。その後、
プレートを、０．０５％トゥィーン（Tween ）−２０（ＰＢＳＴＦＣＳ）を有す
るリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中に含まれる４．０％ウシ胎児血清、約２００
μｌ／ウェルを用いて、約１時間室温で、ブロックした。その後、自動洗浄機（
ヴァージニア州シャンティリ（Chantilly ）所在、Dynatech社より入手可能）を
用いて、ＰＢＳ中０．０５％トゥィーン２０（ＰＢＳＴ）により４回、プレート
の洗浄を行った。皮内皮膚試験においてダニアレルゲンに感受性を示すことが知
られている異なるイヌから単離された血清サンプルのＰＢＳＴＦＣＳにおける１
：１０希釈の約１００μｌ／ウェルをプレートに添加した。血清の陰性対照標準
グループもまた、バリヤ施設（インディアナ州インディアナポリス（Indianapol
is）所在、Harlan Bioproducts社より入手可能）において生育した６匹のイヌの
血清の組み合わせを含むプレートに添加した。いくつかのウェルにはイヌ血清を
添加せず、バックグラウンド結合レベルを決定することができるようにした。プ
レートを、１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。Ｐ
ＢＳＴＦＣＳ中に含まれる４０μｇ／ｍｌビオチン化ヒトＦｃ∈Ｒ α鎖タンパ
ク質（１９９７年１１月２４日に発行されたフランク（Frank ）らの第ＷＯ９８
／２３９６４号に説明されているように生成された）の１：４０００希釈の約１
００μｌ／ウェルを添加した。プレートを、約１時間室温でインキュベートし、
その後、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ
に結合された約０．２５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（streptavidin）（メ
リーランド州ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）所在、Kirkegaard and Perry研
究所（ＫＰＬ）、ＰＢＳＴ中で希釈）、約１００μｌを実験または対照標準サン
プルを収容した各ウェルに添加した。その後、プレートについては、約１時間室
温でインキュベートし、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した。予め室温まで温めてお
いた、約１００μｌのＴＭＢ基質（ＫＰＬより入手可能）を各ウェルに添加した
。その後、プレートを、約１０分間室温でインキュベートし、その後、約１００
μｌ／ウェルのストップ溶液（ＫＰＬより入手可能）を添加した。ストップ溶液
の添加後１０分以内に、４５０ｎｍでスペクトラマックスマイクロタイタ−プレ
ート（Spectramax Microtiter Plate 、Molecular Devices 社より入手可能）読
取器上で、ウェルの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読み取った。
【０１７６】 陰性対照標準サンプル及びバックグラウンドウェルを用いて得られたＯ．Ｄ．
読取値は、０Ｏ．Ｄ．であった。２６匹のダニアレルゲン感受性イヌのうちの５
匹の血清で、約２、０００Ｏ．Ｄ．から約３、２００Ｏ．Ｄ．の間のＯ．Ｄ．読
取値が得られた。３匹の他のアレルゲン感受性イヌの血清では、約１、０００Ｏ
．Ｄ．から約２、０００Ｏ．Ｄ．の間のＯ．Ｄ．読取値が得られた。３匹の他の
アレルゲン感受性イヌの血清では、約５００Ｏ．Ｄ．から約１、０００Ｏ．Ｄ．
の間のＯ．Ｄ．読取値が得られた。７匹の他のアレルゲン感受性イヌの血清では
、約２００Ｏ．Ｄ．から約５００Ｏ．Ｄ．の間のＯ．Ｄ．読取値が得られた。６
匹の他のアレルゲン感受性イヌの血清では、５０Ｏ．Ｄ．未満のＯ．Ｄ．読取値
が得られた。このように、これらの結果から、ダニアレルゲンに感受性を示すこ
とが知られているイヌの血清は、本発明のｍａｐＡ及びｍａｐＢタンパク質に特
異的に結合するＩｇＥ抗体を含むことが示される。
【０１７７】 実施例５． この実施例では、ダニアレルゲンにアレルギー反応を示すことが知られている
イヌから単離したイヌ血清中のイヌＩｇＥへの７０ｋ−Ｄ D. farinaeタンパク
質の結合について説明する。
【０１７８】 イミュロンＩＩ マイクロタイタ−プレートの複数のウェルを、実施例１及び
３の中で説明した方法に従い単離し、ＣＢＣ緩衝液中で希釈した、約１００ｎｇ
／ウェルのD. farinaeタンパク質でコートした。プレートを、４℃で一晩インキ
ュベートした。実施例４で説明した方法を用いてプレートをブロックし、洗浄し
た。皮内試験においてダニアレルゲンに対し感受性があることが知られている異
なるイヌから単離した血清サンプルのＰＢＳＴＦＣＳ中１：１０希釈の、約１０
０μｌ／ウェルを、プレートに添加した。陰性対照標準サンプルもまた、ＳＰＦ
血清サンプル（バリヤ設備内で維持したイヌの血清で、そのためダニアレルゲン
には暴露していない）を含むプレートに添加した。いくつかのウェルはイヌ血清
を受理せず、そのため、バックグラウンド結合レベルを決定することができた。
プレートを、約１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳＴを用いて４回洗浄した
。ビオチン化ヒトＦｃ∈Ｒ α鎖タンパク質を添加し、プレートに結合したＩｇ
Ｅの存在を、実施例４で説明された方法を用いて検出した。
【０１７９】 陰性対照標準サンプル及びバックグラウンドウェルを用いて得られたＯ．Ｄ．
読取値は、０Ｏ．Ｄ．であった。２６匹のダニアレルゲン感受性イヌのうちの３
匹の血清で、約１、５００Ｏ．Ｄ．から約２、７００Ｏ．Ｄ．の間のＯ．Ｄ．読
取値が得られた。５匹の他のダニアレルゲン感受性イヌの血清では、約８００Ｏ
．Ｄ．から約１、５００Ｏ．Ｄ．の間のＯ．Ｄ．読取値が得られた。４匹の他の
ダニアレルゲン感受性イヌの血清では、約５００Ｏ．Ｄ．から約８００Ｏ．Ｄ．
の間のＯ．Ｄ．読取値が得られた。６匹の他のダニアレルゲン感受性イヌの血清
では、約２００Ｏ．Ｄ．から約５００Ｏ．Ｄ．の間のＯ．Ｄ．読取値が得られた
。８匹の他のダニアレルゲン感受性イヌの血清では、５０Ｏ．Ｄ．未満のＯ．Ｄ
．読取値が得られた。このように、これらの結果から、ダニアレルゲンに感受性
を示すことが知られているイヌの血清は、本発明のｍａｐＣタンパク質に特異的
に結合するＩｇＥ抗体を含むことが示される。
【０１８０】 実施例６． この実施例では、インビトロ試験によりダニアレルゲンに過敏であることが示
されたネコから単離したネコ血清中のネコＩｇＥへのｍａｐＡ、ｍａｐＢまたは
ｍａｐＣの結合を説明する。
【０１８１】 イミュロンＩＩ マイクロタイタ−プレートの複数のウェルを、（実施例１中
で説明した方法に従い単離した）約１００ｎｇ／ウェルのD. farinae ＨＭＷ−
ｍａｐ組成物及び（実施例３中で説明した方法に従い単離した）D. farinaeタン
パク質でコートした。プレートの他のウェルは、全Dermatophagoides pteronyss
ius 抽出物（ノースカロライナ州レノア（Lenoir）所在、ギア（Geer）研究所よ
り入手可能、使用前に８倍に濃縮）
【０１８２】 あるいは全D. farinae抽出物（インディアナ州エルカート（Elkhart ）マイルス
（Miles ）社より入手可能）、４００ｎｇ／ウェルでコートした。すべてのサン
プルはＣＢＣ緩衝液中で希釈した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした
。実施例４で説明した方法を用いてプレートをブロックし、洗浄した。インビト
ロアレルゲン試験においてダニアレルゲンに感受性を示すことが知られている異
なるネコから単離した血清サンプルのＰＢＳＴＦＣＳ中の１：１０希釈物、約１
００μｌ／ウェルをプレートに添加した。インビトロ試験で、ダストダニアレル
ゲンに対し感受性を示さないことが示された７匹の対照標準ネコ（１５番、１６
番、１７番、１８番、１９番、２０番、２１番）の血清の試験も行った。いくつ
かのウェルにはネコ血清を添加せず、バックグラウンド結合レベルを決定するこ
とができるようにした。プレートを、１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳＴ
を用いて４回洗浄した。その後、ビオチン化ヒトＦｃ∈Ｒ α鎖タンパク質を添
加し、プレートに結合したＩｇＥの存在を、実施例４で説明された方法を用いて
検出した。
【０１８３】 結果を下の表１に示す。すべての値は、Ｏ．Ｄ．値×１０００を示している。
ＨＤＭは（血清学試験、すなわち全Ｆ．farinae 抽出物に対するＥＬＩＳＡによ
る）ハウスダストダニアレルゲンに対し感受性を有するネコを示す。
【０１８４】
【表１】 得られた結果から、ダニアレルゲンに感受性を示すことが知られているネコの
数匹の血清は、本発明のｍａｐＡ、ｍａｐＢまたはｍａｐＣタンパク質に特異的
に結合するＩｇＥ抗体を含むことが示される。さらに、ｍａｐＡ、ｍａｐＢまた
はｍａｐＣタンパク質に結合するＩｇＥを含む幾つかの血清は、また、D.pteron
yssius抽出物に結合するＩｇＥ抗体を含む。対照標準血清は、本発明のｍａｐＡ
、ｍａｐＢ及びｍａｐＣタンパク質のいずれに結合するＩｇＥ抗体も含んでいな
かった。
【０１８５】 実施例７． この実施例では、D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物の、イヌにおける過敏応答
を誘発する能力について説明する。 実施例１で説明したD. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物が、ダストダニアレルギ
ー応答を罹患しやすい動物において、アレルギー応答を誘発することができるか
どうかを決定するために、ダストダニアレルギーに対し臨床的な徴候を能動的に
示すイヌ（本明細書では、アトピー性イヌと称する）について皮膚試験を行った
。正常イヌには、ダニアレルギーの症状は示さないが、ダニアレルギー応答を起
こし得るイヌが含まれる。各イヌ（すなわち、４匹の正常イヌ及び４匹のアトピ
ー性イヌ）について、外側胸部／腹部領域をそり、その領域の異なる部位で、実
施例１で説明した方法により単離したD. farinae粗抽出物の約１：５０、０００
希釈を用いて、精製D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物、約２μｇを用いて、及び
／または、対照標準溶液、すなわち、陰性対照標準としては生理食塩水、陽性対
照標準としてはヒスタミンの１：１０００希釈を用いて、皮内注射を行った。す
べての４匹の正常イヌ及び、すべての４匹のアトピー性イヌはD. farinae全抽出
物を受けた。正常イヌのうち３匹が、アトピー性イヌのうち２匹が、D. farinae
ＭＨＷ−ｍａｐ組成物を受けた。８匹すべてのイヌが陰性対照標準サンプル及び
陽性対照標準サンプルの両方を受けた。１回の注射あたりの総容積は、５０μｌ
であり、組成物及び対照標準は生理食塩水中で希釈した。注射は、単一の注射と
して投与した。
【０１８６】 すべての注射部位は、１５分にｍｍの単位で客観的に測定し、対照標準と比較
して（＋）または（−）のいずれかの評価を行った。主観的な評点付けは、オハ
イオ州立大学、コロンバス、ＯＨのアンドリュー ヒラー（And rew Hiller ）
、Ｄ．Ｖ．Ｍ、により実行された。結果を表２に示す。
【０１８７】
【表２】 結果から、D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物は、アトピー性イヌを含むイヌに
おいて、即時過敏応答を誘発することができたことが示される。このように、Ｈ
ＭＷ−ｍａｐ組成物は、アトピー性イヌを含むイヌにおいて過敏応答を誘発する
ほど十分なアレルギー誘発性を有する。
【０１８８】 表３は、以下の実験結果を説明するものである。ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対す
るＩｇＥを、ＥＬＩＳＡを用いて、３つのグループのイヌの血清中で測定した。
３つのグループは、D. farinaeアレルギー性（ＨＤＭ−ＡＤ）イヌ、アトピー性
（他のアレルギーに対し）であるがＨＤＭアレルギー性ではないイヌ（ＡＤ）、
及び未処置のイヌである。これらのイヌについてはまた、D. farinae全抽出物に
対する、及びＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対する皮内皮膚試験により調べた。
【０１８９】 表３．D. farinae−アレルギー性イヌ、アトピー性であるがＨＤＭ−アレルギー
性でないイヌ、未処置のイヌにおけるD. farinae全抽出物及びＨＭＷ−ｍａｐ組
成物に対する皮膚試験及びＥＬＩＳＡデータ
【０１９０】
【表３】 ＥＬＩＳＡにより全D. farinae抽出物に対し陽性であったイヌはすべて、ＨＭＷ
−ｍａｐ組成物アレルゲンに対しても陽性であった。全D. farinae抽出物に対し
ＥＬＩＳＡ陰性であった８匹のイヌのうち、８匹中７匹がＨＭＷ−ｍａｐ組成物
に対しても陰性であった。
【０１９１】 実施例８． この実施例では、本発明のＤｅｒ ＨＭＷ−ｍａｐ組成物をコードする核酸分
子の単離について説明する。 Ｄｅｒ ＨＭＷ−ｍａｐ組成物核酸分子は以下のように、同定、単離した。 Ａ．Dermatophagoides farinae ｃＤＮＡライブラリーの作成
【０１９２】 Dermatophagoides farinae ｃＤＮＡライブラリーを以下のように作成した
。総ＲＮＡを、約２ｇの急速冷凍し、粉砕したハウスダストダニから、チョムジ
ンスキー（Chomzynski）らが、１９８７年、Anal. Biochem.第１６２巻、１５６
−１５９頁で説明している方法と同様の酸−グアニジニウム−フェノール−クロ
ロホルム法を用いて抽出した。ポリＡ＋選択ＲＮＡは、製造業者が推奨する方法
に従い、ｍＲＮＡ精製キット（ニュージャージー州ニューアーク（Newark）所在
、Pharmacia Biotech より入手可能）を用いてオリゴ−ｄＴセルロースクロマト
グラフィーにより総ＲＮＡ調製物から分離された。ｃＤＮＡライブラリーは、λ
−Ｕｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ＸＲベクター（ストラタジーン（stratagene）よ
り入手可能）中で、ストラタジーンＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットプロトコルを用
いて、作成された。Dermatophagoides farinae ｃＤＮＡライブラリーの作成に
は約５μｇのポリＡ＋ＲＮＡが使用された。
【０１９３】 Ｂ．ＰＣＲプライマーの調製 さらに、Ｎ−末端アミノ酸配列分析を、実施例２で説明した方法に従い実行し
た。３４アミノ酸の部分Ｎ−末端アミノ酸配列を導き出した。これを、配列番号
２４として表す。このアミノ酸配列は、Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓ
ｐ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｍｅ
ｔ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｘａ
ａ Ｘａａ Ｔｈｒ（ここで、「 Ｘａａ」 は、任意のアミノ酸残基を示す）であ
る。配列番号４のアミノ酸配列（実施例２で説明）及び配列番号２４を使用して
、合成オリゴヌクレオチドプライマーの設計を行った。配列番号２４由来の、ヌ
クレオチド配列５’ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＡＡＹ ＧＡＴ ＴＡＹ
ＴＣＮ ＡＡＲ ＡＡＹ Ｃ３’（ここで、ＹはＣまたはＴを、ＲはＡまたは
Ｇを、ＮはＡ、Ｃ、ＴまたはＧを表す）、配列番号２５と示す、を有するセンス
プライマーＤｅｒｆ１、または配列番号２４由来の、ヌクレオチド配列５’ＡＡ
Ａ ＣＧＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＡＡＹ ＧＡＴ ＴＡＹ ＡＧＹ ＡＡＲ ＡＡ
Ｙ Ｃ３’、配列番号２６と示す、を有するセンスプライマーＤｅｒｆ２を、配
列番号４由来の、ヌクレオチド配列５’ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＣＮ ＡＣ
Ｒ ＡＴＣ ＡＡＮ ＣＣ３’、配列番号２７と示す、を有するアンチセンスプ
ライマーＤｅｒｆ３、または配列番号４由来の、ヌクレオチド配列５’ＣＣＴ
ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＣＮ ＡＣＲ ＡＴＧ ＡＡＮ ＣＣ３’、配列番号２８と
示す、を有するアンチセンスプライマーＤｅｒｆ４と組み合わせて使用した。
【０１９４】 その後、前述のプライマーを使用して、標準ポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣ
Ｒ）技術により、Ｄｅｒｆ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。
プライマーとハイブリッド形成するｃＤＮＡを同定する試みはすべて失敗した。
【０１９５】 Ｃ．抗−ＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗体を用いたD. farinaeｃＤＮＡライブラ
リーの免疫スクリーニング ＰＣＲ方法を用いてｃＤＮＡクローンを単離する試みは失敗したので、発明者
らは、以下のように作成した抗血清を用いてD. farinaeｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングを行った。実施例１で説明した方法に従い単離したタンパク質を
、抗原の入手源として使用し、本明細書では抗−Ｄｅｒ ＨＭＷ−ｍａｐ組成物
抗体というウサギポリクローナル抗体を産出させた。ウサギポリクローナル抗体
の調製は標準技術を用いて実行した。
【０１９６】 約７．５ｍｌの大腸菌（ＸＬ１Ｂｌｕｅ、Ｏ．Ｄ．600 ＝０．５）を、Dermat
ophagoides farinae ＺＡＰ−ｃＤＮＡライブラリーからの３．０×１０4 ｐｆ
ｕのファージ（１．８×１０9 ｐｆｕ／ｍｌ）と共に、３７℃で１０分間インキ
ュベートし、ルリア−ベルターニ（Luria _ Bertani 、ＬＢ）培地寒天プレート
（１５０ｍｍ）内に移す。そのプレートを、３７℃で一晩インキュベートした。
各プレートには、約４時間、３７℃で、ＩＰＴＧ（１０ｍＭ）処理ニトロセルロ
ースフィルタを載せた。その後、フィルタを除去し、０．１％トゥィーン（ＴＢ
ＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝塩類溶液（ｐＨ７．５）を用いて５分間、洗浄した。
ＴＢＳＴで調製された、１％乾燥粉末ミルク、１％ＢＳＡ、２％ヤギ血清及び０
．１５％ゼラチンの溶液を用いて、２時間、室温で、フィルタのブロックを行っ
た。フィルタを、上記ブロッキング溶液中に含まれる、１：１０００希釈の抗−
Ｄｅｒ ＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗体と共に、一晩インキュベートした。その後、
混合物を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ロバ抗−ウサギＩｇＧ抗体
（ペンシルベニア州ウエストグローブ（West Grove）、ImmunoResearchより入手
可能）と共に、２時間室温で、インキュベートした。フィルタはすべて、各イン
キュベート間に、ＴＢＳＴ中に含まれるブロッキング溶液を用いて洗浄した（３
×１５分／洗浄）。その後、フィルタすべてに対し、Ｔｒｉｓ緩衝塩類溶液（ｐ
Ｈ７．５）中で、約５分間、室温で、最終洗浄処理を行った。フィルタを、１／
１／０．１の容積比の展開液（Kirkegaard & Perry研究所より入手可能なＴＭＢ
ペルオキシダーゼ基質／ＴＭＢペルオキシダーゼ溶液／ＴＭＢメンブランエンハ
ンサー）中に浸漬し発色反応を生成させることにより、免疫複合プラークの同定
を行った。１２３個のプラークが同定され、５０個のプラークについては、上述
したのと同じ免疫スクリーニング条件下でさらに２回プラーク精製した。
【０１９７】 Ｄ．精製ファージプラグのＰＣＲスクリーニング その後、前述の免疫スクリーニングにおいて同定したファージプラグについて
、さらに、セクション８Ｂで説明したプライマーを用い、ＰＣＲ増幅により分析
した。５０個プラークのＤＮＡを、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７
及び配列番号２８により同定された４プライマーの混合物を用いて増幅させた。
ＰＣＲ増幅は標準技術を用いて行った。１つの得られたＰＣＲ増幅生成物は、約
７００のヌクレオチドのフラグメントを含んでいた。ＰＣＲ生成物を、インビト
ロゲン社（InVitrogen、 Corp.）、ＴＡ（登録商標）クローニングベクターでク
ローン化し（インビトロ社から提供された手順）、標準技術を用いてＤＮＡ配列
分析を受けさせた。７００−ｂｐ ＰＣＲ生成物においてコードされる配列を含
むことが決定された精製ファージからのファージミド（phargemid ）を獲得し、
標準技術を用いてＤＮＡ配列分析をした。
【０１９８】 約１７５２のヌクレオチド挿入配列、本明細書ではｎＤｅｒｆ９８1752と称す
る、を含むクローンを単離した。ｎＤｅｒｆ９８1752から、標準技術を用いて核
酸配列を求め、核酸配列配列番号１４を有するコード鎖と核酸配列配列番号１６
を有する相補鎖からなるｎＤｅｒｆ９８1752という名のDermatophagoides fari
nae 核酸分子が得られた。配列番号１４の翻訳から、核酸分子ｎＤｅｒｆ９８17 52 は、アミノ酸配列配列番号１５を有する約５５５アミノ酸の全長ノミタンパク
質、本明細書ではＰＤｅｒ９８555 と称する、をコードし、第１コドンが配列番
号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３まで、停止コドンが配列番号１４の
ヌクレオチド１６６６から１６６８までに及ぶオープンリーディングフレームを
とることが示唆される。ＰＤｅｒ９８555 のアミノ酸配列は、核酸配列配列番号
１７を有するコード鎖と、核酸配列配列番号１９を有する相補鎖を備えたｎＤｅ
ｒｆ９８1665核酸分子によりコードされる。配列番号１８として表されるＰＤｅ
ｒ９８555 の推定分子量は約６３．２ｋＤ、推定ｐＩは約５．３３である。配列
番号１５の分析から、約アミノ酸１から約アミノ酸１９までにわたるシグナルペ
プチドの存在が示唆される。提案した成熟タンパク質は、本明細書ではＰＤｅｒ
ｆ536 と示され、約５３６のアミノ酸を含む。この配列は、本明細書では配列番
号２１として表され、本明細書ではｎＤｅｒｆ９８1608と呼ばれ、配列番号２０
のコード鎖と、配列番号２２の相補鎖とによる表される核酸分子によりコードさ
れる。ノミＰＤｅｒｆ536 のアミノ酸配列（すなわち、配列番号２１）から、Ｐ
Ｄｅｒｆ536 の推定分子量は６１．２、推定ｐＩは約５．２６であることが予想
される。
【０１９９】 アミノ酸配列配列番号１５をジェンバンク（GenBank ）において報告されてい
るアミノ酸配列と比較すると、配列番号１５はアノフェレスガンビアエ（Anophe
les gambiae ）からのキチナーゼタンパク質（ジェンバンク目録番号２６５４６
０２）と最も高い相同性、すなわち約４２％の同一性を示すことが示された。核
酸塩基配列配列番号１７とジェンバンクにおいて報告されている核酸配列との比
較により、配列番号１７は、チェロナス種（Chelonus sp.）毒キチナーゼｍＲＮ
Ａ（ジェンバンク目録番号Ｕ１０４２２）と最も高い相同性、すなわち約５８％
の同一性を示すことが示された。
【０２００】 実施例９． この実施例では、ダニアレルゲンに対しアレルギー反応を示すことが知られて
いるイヌ由来ＩｇＥに結合する６０−ｋＤタンパク質の精製、およびこの６０−
ｋＤタンパク質から得られた部分アミノ酸配列について説明する。
【０２０１】 Ａ．６０ｋＤタンパク質の精製 Ｄ．実施例１で説明した方法に従い、farinae 抽出物を調製し、セファクリル
（Sephacryl ）Ｓ−１００カラム上で分別した。排除ピーク（画分２９から３５
まで）後、画分をセファクリルＳ−１００カラムから収集し、プールした。その
後、プールした画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を用いて１：１に希
釈し、実施例１で説明した方法を用いて、Ｑ−セファロースカラムに適用し、画
分を得た。０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で溶出した画分を濃縮し、さらに、実
施例１で説明した方法を用いて、ＴＭＳ２５０ 逆相ＨＰＬＣカラムを通して精
製した。実施例１において１２％ゲルについてのタンパク質の分離について説明
したのと同様の方法を用いて、１４％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り、画分中のタンパク質を分離した。染色したゲルを図２に示す。タンパク質は
、約５０％Ｂ（９０％アセトニトリル中．０５％ＴＡ）で溶出した、約９０％の
純度で約６０ｋＤ（図２、レーン４）の分子量を有するものであると同定された
。示した６０−ｋＤタンパク質の分子量は、バイオラッドマルチ−アナリスト／
ＰＣバージョン１．１プログラムおよびマーク−１２タンパク質分子量マーカー
を用いて、５６．１１ｋｄであると推定した。約６０−ｋＤタンパク質は、本明
細書では、ｍａｐＤタンパク質と称する。
【０２０２】 Ｂ．６０−ｋｄタンパク質から得られた部分Ｎ−末端および内部配列 上記パートＡから溶出したタンパク質をＰＶＤＦ上にブロットした。この染色
はクマシーＲ−２５０で行い、標準手順を用いて脱染した。約６０−ｋｄバンド
に対応するタンパク質を切り出し、当業者に周知の技術を用いて、Ｎ−末端アミ
ノ酸配列決定した。約２５アミノ酸の部分Ｎ−末端アミノ酸を、そのタンパク質
に対し導き出し、そのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号２３として表すが
、Ｘａａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ（本明細書でＸａ
ａは任意のアミノ酸である）であることが決定された。
【０２０３】 ６０ｋｄ領域に対応するタンパク質もまた、タンパク質分解開裂に付し、内部
アミノ酸配列データを得た。実施例１で説明したように、６０−ｋｄタンパク質
の消化および逆相クロマトグラフィーを実行した。４つのタンパク質分解フラグ
メントが、単離され、配列決定された。これらは、本明細書では、ｍａｐ（１３
）、ｍａｐ（１４）、ｍａｐ（１５）、ｍａｐ（１６）と称する。
【０２０４】 ｍａｐ（１３）のＮ−末端部分アミノ酸配列は、Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ ＰｒｏＡｌ
ａと決定され、配列番号２９と示される。ｍａｐ（１４）のＮ−末端部分アミノ
酸配列は、Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ と決定され、配列番号３０と示される。ｍａｐ（１
５）のＮ−末端部分アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ
Ｓｅｒと決定され、配列番号３１と示される。ｍａｐ（１６）のＮ−末端部分
アミノ酸配列は、Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎと決定され、配列番号２９と示される
。
【０２０５】 実施例１０． この実施例では、D. farinae ６０ｋＤ（ｍａｐＤ）アレルゲンの一部をコー
ドする核酸分子の単離と配列決定について説明する。 実施例８において前述したように、D. farinaeライブラリーを作成した。D. f
arinae ６０ ｋＤ−タンパク質（配列番号２３）に対し導き出したＮ−末端ア
ミノ酸配列から、縮重合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。プライマ
ー１は、配列番号２３の約３から約１１までのアミノ酸残基に対応するセンスプ
ライマーであり、その配列は、５’ＧＡＡＣＣＡＡＡＡ ＣＨＧＴＮＴＧＹＴＡ
ＹＴＡＹＧ３’であり、これはまた配列番号４６として知られている。この配
列中、ＨはＡまたはＣまたはＴを表し、ＮはＡまたはＣまたはＧまたはＴを表し
、ＹはＣまたはＴを表す。D. farinaeライブラリーからのフラグメントのＰＣＲ
増幅は、標準技術を用いて行った。配列番号４６（プライマー１）とＭ１３の順
方向の一般的なプライマー、５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’、配
列番号４７と示す、との組み合わせを使用して、ＰＣＲ増幅生成物を産出させた
。
【０２０６】 第１のＰＣＲ反応生成物に対し、第２の、入れ子に挟む様式の（nested）ＰＣ
Ｒ反応を実行した。６０−ｋＤタンパク質内部アミノ酸配列、配列番号３１の約
アミノ酸残基１からアミノ酸残基１０までにわたる領域に対応する合成オリゴヌ
クレオチドを合成した。このプライマー、プライマー２は、配列番号４８と示す
核酸配列５’ＧＡＴＡＴＧＧＡＡＣ ＡＴＴＴＹＡＣＨＣＡ ＡＣＡＹＡＡＲＧ
Ｇ３’を有し、この配列において、ＲはＡまたはＧを表す。配列番号４８のプラ
イマー２と配列番号４９のＴ７標準プライマー、５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣ Ｔ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧ ＧＣ３’、とを組合わせて使用し、ＰＣＲ増幅生成物を産
出させた。標準技術を用いて、得られたＰＣＲ生成物にＤＮＡ配列決定分析を受
けさせた。
【０２０７】 ＰＣＲ生成物の配列決定を行うと、５１０のヌクレオチドを含むことが見出さ
れた。これはｎＤｅｒｆ６０510 として知られている。ｎＤｅｒｆ６０510 のコ
ード鎖のヌクレオチド配列は、本明細書では配列番号４３として示され、その相
補鎖は、配列番号４５として示される。配列番号４３の翻訳から、ｎＤｅｒｆ６
０510 は、約１７０アミノ酸の部分D. farinae６０−ｋＤタンパク質、本明細書
ではＰＤｅｒｆ６０170 と呼ばれ、配列番号４４と示されるアミノ酸配列を有す
る、をコードし、第１のコドンが配列番号４３の約ヌクレオチド１からヌクレオ
チド３まで及び、最終コドンが配列番号４３の大体ヌクレオチド５０８から大体
ヌクレオチド５１０まで及ぶオープンリーディングフレームをとることが示唆さ
れる。ＰＤｅｒｆ６０170 の推定分子量は１９．２ｋＤであり、推定ｐＩは約６
．５１である。
【０２０８】 核酸分子ｎＤｅｒｆ６０510 をプローブとして用い、全長、あるいはより大き
な部分のD. farinae６０−ｋＤタンパク質に対応するタンパク質をコードする核
酸を単離した。実施例８において前述した手順を用いて、標準技術により32Ｐで
放射性同位体標識した核酸配列番号４３を用いて、全D. farinaeライブラリーの
スクリーニングを行った。６ＸＳＳＣ、５Ｘ デンハーツ（Denhardt’s ）溶液
、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ中、５５℃で、約３６時間、
ハイブリッド形成を行った。フィルタは、１回につき３０分間、５５℃の２ＸＳ
ＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で計３回洗浄し、その後、０．２ＸＳＳＣ、０．２％Ｓ
ＤＳ中で約３０分、最終洗浄を行った。
【０２０９】 一次ファージプラグについて、ＰＣＲ増幅を行った。配列番号４６と示される
プライマー１と、配列番号４０と示されるＴ７標準プライマーとをプライマーと
して使用し、ＰＣＲ生成物を産出させた。この１．６キロ塩基のＰＣＲ生成物の
予備配列決定分析から、これが、ＰＤｅｒｆ６０全長タンパク質をコードする完
全な配列を含む核酸配列を表すことが示された。
【０２１０】 ＰＤｅｒｆ６０170 、アミノ酸配列配列番号４４と、ジェンバンクにおいて報
告されているアミノ酸配列とを比較することにより、アファノジジウム アルブ
ム（Aphanodidium album. ）（ジェンバンク目録番号Ｐ３２４７０）のキチナー
ゼタンパク質前駆体と、最も高い相同性、すなわち約３９％の同一性を示した。
核酸配列配列番号４３は、ジェンバンクに提出されている配列のいずれに対して
も有意な相同性は示さなかった。
【０２１１】 実施例１１． この実施例では、Der matophagoides pteronyssius ９８ｋＤ アレルゲン
タンパク質をコードする核酸分子の単離について説明する。
【０２１２】 D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物をコードする３２Ｐ標識ｃＤＮＡとのハイブ
リッド形成により、D. pteronyssius ｃＤＮＡライブラリーから、D. farinae
９８ｋＤアレルゲン（ｍａｐＢ）に対し高い相同性を有する核酸分子を単離した
。
【０２１３】 以下のように、Ｄ．プテロニシウスｃＤＮＡライブラリーを作成した。チョム
ジンスキー（Chomz ynski）らにより、１９８７年、Anal. Biochem 第１６２巻
、１５６−１５９頁において説明されている、酸−グアニジウム−フェノール−
クロロホルム法を用いて、約２ｇのＤ．プテロニシウスダニから総ＲＮＡを抽出
した。製造業者が推奨する方法に従い、ｍＲＮＡ精製キット（ニュージャージー
州ニューアーク（Newark）所在、Pharmacia 社より入手可能）を用いて、オリゴ
−ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより、総ＲＮＡ調製物からポリＡ＋選択
ＲＮＡを分離した。ストラタジーン（Stratagene）ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット
プロトコルを用いて、λ−Ｕｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ＸＲベクター（カリフォ
ルニア州ラホール（La Jolla）所在Stratagene社入手可能）中で、D.pteronyssi
usｃＤＮＡライブラリーを構築した。約５ｍｇのポリＡ＋ＲＮＡを使用して、D.
pteronyssius ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【０２１４】 ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーンより入手可能）において説明されている
プロトコルの変更を用い、D. farinae９７ｋＤｍａｐＢアレルゲンをコードする
３２Ｐ標識ｃＤＮＡ、すなわち配列番号１７を用いて、重複プラークリフトによ
り、D.pteronyssiusｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。６ＸＳＳ
Ｃ（処方については、サンブルック（Sambrook）ら、前掲の文献を参照のこと）
、５Ｘデンハーツ溶液（処方については、サンブルックらの前掲の文献を参照の
こと）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（シグマより入手可能）、
及び１００ｍｇ／ｍｌの１本鎖ＤＮＡ（シグマより入手可能）中、５５℃で、約
３６時間、ハイブリッド形成を行った。フィルタを３回、１回の洗浄につき３０
分、５５℃、２ＸＳＳＣ０．２％ＳＤＳ中で洗浄し、その後、約３０分、５５℃
、０．２ＸＳＳＣ０．２％ＳＤＳ中で最終洗浄を行った。Ｄ．プテロニシウス９
７ｋＤアレルゲン（ｍａｐＢ）をコードするD.pteronyssius核酸分子のプラーク
精製クローンは、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットにおいて説明されているインビボ
切り出しプロトコルに従い、ＥｘＡｓｓｉｓｔ（登録商標）ヘルパーファージと
ＳＯＬＲ（登録商標）大腸菌を用いて、２本鎖組換分子に変換された（すべてス
トラタジーンより入手可能）。D.pteronyssiusを含むプラスミドには、標準技術
を用いるＤＮＡ配列決定分析を受けさせた。ＤＮＡ配列決定分析には、分子量及
び等電点（ｐＩ）の決定を含み、ＧＣＧ（登録商標）プログラムを用いて実行さ
れた。
【０２１５】 配列番号３４と表されるコード鎖と配列番号３６と表される相補鎖とを有する
約１６２１−ヌクレオチド挿入配列、全長コード領域を含み本明細書ではｎＤｅ
ｒｆ９８1621と称する、を含むクローンを単離した。見かけの開始コドン及び停
止コドンは、それぞれ、配列番号３４のヌクレオチド１４からヌクレオチド１６
まで、ヌクレオチド１５４１からヌクレオチド１５４３までである。推定ポリア
デニル化シグナル（５’ＡＡＴＡＡＡ３’）は、配列番号３４のヌクレオチド１
５８４から１５８９までに及んでいる領域内に配置されている。
【０２１６】 配列番号３４の翻訳により、約５０９のアミノ酸のタンパク質が得られ、この
タンパク質はＰＤｅｒｆ９８509 と示され、そのアミノ酸配列は、配列番号３５
として表される。ＰＤｅｒｆ９８509 をコードするコード領域からなる核酸分子
は、本明細書ではｎＤｅｒｆ９８1527と呼ばれ、その核酸配列は配列番号３７（
コード鎖）、及び配列番号３９（相補鎖）として表される。ＰＤｅｒｆ９８509 のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号３８としても表されるが、約５８．９
ｋＤの推定分子量及び約５．６１の推定ｐＩを有する。ＰＤｅｒｆ９８509 の分
析により、大体アミノ酸１から大体アミノ酸１９までに及ぶシグナルペプチドの
存在が示唆される。提案した成熟タンパク質、本明細書ではＰＤｅｒｆ９８490 として示される、は約４９０のアミノ酸を含み、本明細書では配列番号４１とし
て表される。ＰＤｅｒｆ９８490 のアミノ酸配列から、推定分子量が約５６．８
ｋＤおよび推定ｐＩが約５．４９であり、それぞれ、大体アミノ酸１１５から大
体アミノ酸１１７まで及び大体アミノ酸２４０からアミノ酸２４２まで延在して
いる２つのアスパラギン−結合グリコシル化部位を有するタンパク質が予想され
る。ＰＤｅｒｆ９８490 をコードする核酸分子は、ｎＤｅｒｆ９８1470として知
られており、配列番号４０で表されるコード鎖と配列番号４２で表される相補鎖
とを有する。
【０２１７】 前述したように、ＢＬＡＳＴ調査を実行した。ＰＤｅｒｆ９８509 、配列番号
３５は、アミノ酸レベルで、マンデューカセクスタ（Man duca sexta ）キチナ
ーゼ（スイスプロット目録番号ｐ３６３３６２）と最も高い相同性、約３４％の
同一性を示した。ｎＤｅｒｆ９８1621、配列番号３４は、核酸レベルで、チェロ
ナス属（Chelonus sp.）キチナーゼ（目録番号Ｕ１０４２２）と最も高い相同性
、約４９％の同一性を示した。D. farinae９８ｋＤアレルゲンタンパク質に対す
るコード領域に対応するｃＤＮＡ領域と、D.pteronyssius９８ｋＤに対するコー
ド領域に対応するｃＤＮＡ領域との比較により、約８４％の同一性が示されてい
る。
【０２１８】 実施例１４． この実施例では、ダニアレルゲンにアレルギー反応を示すことが知られている
ヒトから単離したヒト血清中のヒトＩｇＥへの、D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成
物の結合を説明する。
【０２１９】 ＲＡＳＴ、すなわち放射アレルゲン吸着試験、と呼ばれる技術を使用した。と
いうのは、ヒト血清中に存在するヒトＩｇＥの量は実に少ないからである。ＲＡ
ＳＴは、本質的には、アールバース（Aalberse, RC）らの１９８１年、J. Aller
gy Clin Immun. ６８：３５６−３６４頁において説明されているように、ＲＡ
ＳＴは実行された。単位ＩＵ／ｍｌを計算するために、Ｄｅｒｐ２に対する、十
分に特徴付けがなされたキメラヒト／マウスＩｇＥモノクローナル抗体（ヒトＩ
ｇＥ／モノクローナル抗−Ｄｅｒｐ２、シュアーマン（Schuurman ）らの（１９
９７）の手順、J. Allergy Clin Immunol.９９：５４５−５５０頁に従う）のい
くつかの希釈物を用いてＲＡＳＴを実行し、標準曲線を導き出した。
【０２２０】 簡単に説明すると、製造業者のプロトコルに従い、実施例１で説明したように
精製した５０μｇのＨＭＷ−ｍａｐ組成物を、５０ｍｇのＣＮＢｒ−活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファーマシア、ピスカタウエイ、ＮＪより入手可能）に結合させ
た。全ダニD. farinae抽出物に対し陽性のＲＡＳＴ（陽性ＲＡＳＴ数は１ＩＵ／
ｍｌを超える）を基本に、ヒト血清を選択した（全部で、１７の異なるサンプル
）。２つの陰性（０．３ＩＵ未満）対照標準血清も含ませた。
【０２２１】 それぞれの血清サンプルの試験を行うために、０．５ｍｇのD. farinaeＨＭＷ
−ｍａｐ組成物結合セファロースを、総体積３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（０．１％
体積比トゥィーン２０を添加したリン酸緩衝塩類溶液、シグマより入手可能）中
の５０μｌの血清と共にインキュベートした。一晩中、２７℃で、振とうさせな
がらインキュベートを行った。インキュベート後、結合セファロースを５回、Ｐ
ＢＳ−Ｔを用いて洗浄した。総体積７５０μｌの、（体積比で、４．５％ウシ血
清及び０．５％ヒツジ血清を有するＰＢＳ−Ｔ中で希釈された）標準放射性ヨウ
素化標識プロトコルにより作成した放射性同位体標識（125−ヨウ素）ヒツジ抗
−ヒトＩｇＥを添加し、２７℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、
結合セファロースを、ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄し、ガンマカウンタ内で計数
し、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物結合セファロースに結合した放射性同位体標識ヒツジ
抗ヒトＩｇＥの量を決定した。得られた結果を表４に示す。
【０２２２】 表４．D. farinaeのＨＭＷ−ｍａｐ組成物へのヒトＩｇＥの結合
【０２２３】
【表４】 D. farinae全ダニ抽出物に対し感受性を示す患者の約７５％（１５人中１１人
）が、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物抗原に対し敏感であった。このことから、ＨＭＷ−
ｍａｐ組成物抗原が、D. farinae感受性ヒトに対する主な抗原であることが意味
される。ＨＭＷ−ｍａｐ組成物に対する感受性は、０．５ＩＵ以上のＲＡＳＴと
して規定した。
【０２２４】 実施例１５． この実施例では、実施例１で説明したD. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物が糖タ
ンパク質を含むことを説明するものである。 実施例１に従い調製した約５．４μｇのD. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物を、
ＳＤＳ ＰＡＧＥに適用し、標準技術に従い電気泳動を行った。標準技術に従い
、ニトロセルロース膜にタンパク質をブロットし、ＤＩＧ（登録商標）グリシン
検出キット（インディアナ州インディアナポリス所在、Boehringer Mannheim よ
り入手可能）を用い、製造業者のプロトコルを用い、糖タンパク質を検出した。
ＨＭＷ−ｍａｐ領域に対応する領域はキットと陽性反応を示し、これにより、Ｈ
ＭＷ−ｍａｐ組成物が糖タンパク質を含むことが示された。
【０２２５】 実施例１６． この実施例では、D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物が、化学的または酵素手段
の両方によりアミノ酸残基が除去されてもアレルゲンとしての特徴を保持するこ
とを示す。結果から、主エピトープは、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物上のＮ−結合また
はＯ−結合グリコシル化部位に付着された多糖を含む炭水化物エピトープである
ことが示唆される。
【０２２６】 Ａ．化学的手段によるタンパク質除去（タンパク質のβ−除去） １２μｇのＨＭＷ−ｍａｐ組成物（実施例１で説明したように精製）を、１０
０μｌの蒸留脱イオン水中に溶解させた。この混合物に、５μｌの１０Ｍ Ｎａ
ＯＨと３．８ｍｇのＮａＢＨ4（シグマより入手可能）を添加し、最終濃度を０
．５Ｍ ＮａＯＨと１Ｍ ＮａＢＨ4とした。この反応混合物を５０℃で、３０
分間加熱し、その後冷却し、１００μｌのアセトンを添加した。この混合物に、
十分な量、すなわち約１５０μｌのドウエックス（Dowex ）５０（Ｈ＋）（ファ
ーマシアより入手可能）を添加し、溶液をわずかに酸性とした。ドウエックス５
０はタンパク質を吸着除去し、上清中には糖部分が残った。微小遠心分離機中で
混合物の遠心を行い、３回、１００μｌの水を用いて洗浄した。遠心分離からの
上清を一緒にして、蒸発乾燥させ、その後、５回メタノール：ＨＣｌ溶液（１０
００：１ｖ／ｖ）から洗浄し、各洗浄後に蒸発乾燥させ、塩を除去した。混合物
を１０μｌの水に溶解し、一部（２０μｌ）について標準技術を用いてＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブルー及びシルバー染色の両方を用い、化学的
処理を施したサンプル中のタンパク質の量を定量した。クマシー染色でもシルバ
ー染色でもタンパク質は検出されず、タンパク質が除去されたことが示された。
タンパク質上の糖部分はこれらの条件では影響を受けないであろう。
【０２２７】 各サンプルからの残基の残りについて、実施例４で説明したように、ＥＬＩＳ
Ａ分析を行った。簡単に説明すると、１００ｎｇの、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物のβ
−除去サンプルまたは非β−除去サンプルのいずれかをイミュロンプレート上に
コートさせ、実施例４で説明したように、D. farinae感受性イヌ血清プール、D.
farinae感受性ネコ血清プール、及びD. farinae感受性があるかまたは感受性が
ないか（ＥＬＩＳＡにより測定）のいずれかの様々な個々のイヌ血清を用いて、
ＥＬＩＳＡを実行した。結果を表５に示す。
【０２２８】 表５．ＨＭＷ−ｍａｐ組成物及びβ−除去ＨＭＷ−ｍａｐ組成物（炭水化物のみ
）に対するイヌ血清及びネコ血清の反応性
【０２２９】
【表５】 表５からの結果から、β−除去ＨＭＷ−ｍａｐ組成物サンプルは依然として、
D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物に感受性のあるイヌ血清及びネコ血清のＩｇＥ
に結合する能力を保持していることが示され、これにより、タンパク質に付着し
たグリカンが、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物アレルゲンタンパク質の主エピトープを構
成することが示される。
【０２３０】 Ｂ．酵素的手段によるタンパク質除去 １４μｇのＨＭＷ−ｍａｐ組成物（実施例１で説明したように精製）を、１μ
ｇのエンドプロテイナーゼＫ、シグマより入手可能、を用いて消化し、分子のタ
ンパク質部分を除去した。消化反応は、５６℃で２４時間起こり、その後、反応
物中のエンドプロテイナーゼは、沸騰水中で１０分間、熱変性させた。
【０２３１】 この反応物の一部を、標準技術を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマ
シーブルー染色とシルバー染色の両方を用いて、酵素消化されたサンプル中のタ
ンパク質の存在を検出した。クマシー染色でもシルバー染色でも、ＨＭＷ−ｍａ
ｐ組成物は検出されず、これにより、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物の除去が示された。
タンパク質上のグリコシル化部位を介して付着されているグリカンは、これらの
条件によっては影響されないであろう。
【０２３２】 酵素消化反応の残りについて、実施例４で説明したように、ＥＬＩＳＡ試験を
行った。簡単に説明すると、１００ｎｇの、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物のプロテイナ
ーゼＫ−消化サンプルまたは無消化サンプルのいずれかを、イミュロンプレート
上にコートさせ、実施例４で説明したように、D. farinae感受性があるまたは感
受性がない（ＥＬＩＳＡにより測定）のいずれかである様々な個々のイヌ血清を
用いて、ＥＬＩＳＡを実行した。結果を表６に示す。
【０２３３】 表６．ＨＭＷ−ｍａｐ組成物及びエンドプロテイナーゼ−Ｋ消化ＨＭＷ−ｍａｐ
組成物に対するイヌ血清の反応性
【０２３４】
【表６】 表６の結果から、プロテイナーゼ−Ｋ消化ＨＭＷ−ｍａｐ組成物サンプルは依
然として、D. farinaeＨＭＷ−ｍａｐ組成物に感受性のあるイヌ血清及びネコ血
清のＩｇＥに結合する能力を保持していることが示され、これにより、タンパク
質に付着したグリカンが、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物上の主エピトープを構成するこ
とが示唆される。
【０２３５】 実施例１７． この実施例は、ＨＭＷ−ｍａｐ組成物からＮ−結合グリカンを除去する試みに
ついて説明するものである。 実施例１のように精製したＨＭＷ−ｍａｐ組成物（２μｇ）を、製造業者の指
示に従い、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Boehringer Mannheim より入手可能）を用い
て消化させた。消化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、標準プロトコルに従い
染色した。２μｇのフェツイン（Fetuin：シグマより入手可能）を陽性Ｎ−結合
グリコシル化タンパク質対照標準として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析から
、未処理のｍａｐＢタンパク質と消化ｍａｐＢタンパク質の分子量の間には見か
けの差異はないことが示された。陽性対照標準、フェツインは、Ｎ−グリコシダ
ーゼＦとの消化後に、分子量の減少を示さなかった。この結果から、ＨＭＷ−ｍ
ａｐ組成物上にはＮ−結合グリカンがない、あるいはその代わりに、ＨＭＷ−ｍ
ａｐ組成物上には小さなサイズのＮ−グリカンしか存在しないことが示される。
【０２３６】 本発明の様々な実施の形態について詳細に説明してきたが、これらの実施の形
態の修正及び変更は当業者にとっては明らかであろう。しかしながら、このよう
な修正や変更は、添付の特許請求の範囲において説明されている本発明の範囲内
にあることを特に理解すべきである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 １２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した高分子
量Ｄｅｒｆタンパク質を示す。
【図２】 １４％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した約６０
ｋＤＤｅｒｆタンパク質を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｈ０４５ 48/00 Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 7/00 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／０９８，９０９ (32)優先日 平成10年９月２日(1998．9．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ウェーバー、エリック アール． アメリカ合衆国 80525 コロラド州 フ ォート コリンズ シルバー クリーク ドライブ 2625 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 CA01 CA04 CA11 CA12 EA06 GA11 GA19 HA14 HA15 4B065 AA26X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA45 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 AA18 BA01 BA08 BA18 BA19 BA22 BA23 CA51 CA53 CA56 NA14 ZA341 ZA342 ZA591 ZA592 ZB071 ZB072 ZB131 ZB132 ZB371 ZB372 4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 EE03 EE05 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA02 MA04 NA14 ZA34 ZA59 ZB07 ZB13 ZB37 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA16 BA17 BA18 BA53 CA50 DA75 DA76 DA86 EA22 EA52 FA74 GA10 GA15 GA22 GA23

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子であっ
    て、前記約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子は、１ＸＳＳＣおよび０
    ％ホルムアミドを含有する溶液中で約５０℃の温度にて、配列番号１４、配列番
    号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号
    ３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４
    ２、配列番号４３、配列番号４５、ならびに配列番号３３のアミノ酸配列を有す
    るタンパク質をコードする核酸配列およびその相補的配列から成る群より選択さ
    れた核酸配列を有する核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子と、 （ｂ）（ａ）の前記核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸分子
    であって、前記断片は約１５以上のヌクレオチドを含む核酸分子と、 から成る群より選択された単離核酸分子。
  2. 【請求項２】 （ａ）約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子であっ
    て、前記約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子は、１ＸＳＳＣおよび０
    ％ホルムアミドを含有する溶液中で約５０℃の温度にて、配列番号１６、配列番
    号１９、配列番号２２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号
    ４５、および配列番号３３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸
    配列の相補的配列から成る群より選択された核酸分子とハイブリッド形成する核
    酸分子と、 （ｂ）（ａ）の前記核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸分子
    であって、前記断片は約１５以上のヌクレオチドを含む核酸分子と、 から成る群より選択された核酸配列を有する核酸分子によりコードされた単離タ
    ンパク質。
  3. 【請求項３】 ダニに対するアレルギー反応を治療するための治療用組成物
    であって、前記治療用組成物は、 （ａ）単離ダニアレルゲンタンパク質であって、ストリンジェントなハイブリ
    ッド形成条件下で配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号
    ５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番
    号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号
    ２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３
    １、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１
    、および配列番号４４から成る群より選択されたアミノ酸配列をコードする核酸
    分子の相補的配列とハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるダニアレ
    ルゲンタンパク質と、 （ｂ） 前記ダニアレルゲンタンパク質のミメトープと、 （ｃ） 前記ダニアレルゲンタンパク質の突然変異タンパク質と、 （ｄ） （ｉ）約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子であって、前記
    約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子は、１ＸＳＳＣおよび０％ホルム
    アミドを含有する溶液中で約５０℃の温度にて、配列番号１４、配列番号１６、
    配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配
    列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列
    番号４３、配列番号４５ならびに配列番号３３のアミノ酸配列を有するタンパク
    質をコードする核酸配列およびその相補的配列から成る群より選択された核酸配
    列とハイブリッド形成する核酸分子と、 （ｉｉ）（ｉ）の前記核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸
    分子であって、前記断片は約１５以上のヌクレオチドを含む核酸分子と、 から成る群より選択された単離核酸分子と、 （ｅ）前記ダニアレルゲンタンパク質に対する抗体と、 （ｆ）前記ダニアレルゲンタンパク質のＩｇＥへの結合阻害剤と から成る群より選択された脱感作化合物を含む治療用組成物。
  4. 【請求項４】 動物がダニに対して罹病性であるかまたはアレルギー反応を
    示すかを試験するためのアッセイキットであって、 （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
    番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
    配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配
    列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列
    番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および
    配列番号４４から成る群より選択されたアミノ酸配列をコードする核酸分子の相
    補的配列とストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する
    核酸分子によりコードされた単離タンパク質と、 （ｂ） 前記動物が罹病性であるかまたは前記アレルギー反応を示すかを決定
    する手段であって、前記手段はダニに対して罹病性であるかアレルギー反応を示
    す動物を同定するために前記タンパク質を使用することを含むことと、 を備えたキット。
  5. 【請求項５】 ダニに対して罹病性であるかまたはアレルギー反応を示す動
    物を同定する方法であって、 （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
    番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
    配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配
    列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列
    番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および
    配列番号４４から成る群より選択されたアミノ酸配列をコードする核酸分子の相
    補的配列とストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する
    核酸分子によりコードされた単離タンパク質を動物の抗体と接触させる工程と、 （ｂ）前記タンパク質と前記抗体との間の免疫複合体の形成を確認する工程で
    あって、前記免疫複合体の形成により前記動物が罹病性であるかまたは前記アレ
    ルギー反応を有するかが示される工程と から成る方法。
  6. 【請求項６】 ダニのアレルギー反応に対して宿主動物を脱感作する方法で
    あって、 （ａ）単離ダニアレルゲンタンパク質であって、配列番号１、配列番号２、配
    列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配
    列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番
    号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号
    ２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３
    ５、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４４から成る群より選択され
    たアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補的配列とストリンジェントなハイブ
    リッド形成条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされるダニアレ
    ルゲンタンパク質と、 （ｂ）前記ダニアレルゲンタンパク質のミメトープと、 （ｃ）前記ダニアレルゲンタンパク質の突然変異タンパク質と （ｄ）（ｉ）約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子であって、前記約
    １５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子は、１ＸＳＳＣおよび０％ホルムア
    ミドを含有する溶液中で約５０℃の温度にて、配列番号１４、配列番号１６、配
    列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列
    番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２、配列番
    号４３、配列番号４５ならびに配列番号３３のアミノ酸配列を有するタンパク質
    をコードする核酸配列およびその相補的配列とハイブリッド形成する核酸分子と
    、 （ｉｉ）（ｉ）の前記核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸
    分子であって、前記断片は約１５以上のヌクレオチドを含む核酸分子と、 から成る群より選択された単離核酸分子と、 （ｅ）前記ダニアレルゲンタンパク質に対する抗体と、 （ｆ）前記ダニアレルゲンタンパク質のＩｇＥへの結合阻害剤と から成る群より選択された脱感作化合物を含む治療用組成物を前記動物に投与す
    る工程を含む方法。
  7. 【請求項７】 ダニアレルゲンタンパク質の製造方法であって、 約１５０以上のヌクレオチドを有する核酸分子であって、前記約１５０以上のヌ
    クレオチドを有する核酸分子は、１ＸＳＳＣおよび０％ホルムアミドを含有する
    溶液中で約５０℃の温度にて、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配
    列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、および配列番号３３
    のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列の相補的配列から成る
    群より選択された核酸配列を有する核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子と
    、前記核酸分子のうちの任意の核酸分子の断片を有する核酸分子であって、前記
    断片は約１５以上のヌクレオチドを含む核酸分子とから成る群より選択された核
    酸分子により形質転換した細胞を培養する工程を含む方法。
  8. 【請求項８】 非タンパク質エピトープを備えた試薬であって、前記エピト
    ープが、 （ａ）前記エピトープはペプチドのβ−除去に耐性である、 （ｂ）前記エピトープはプロテイナーゼＫによる消化に耐性である、および （ｃ）前記エピトープはグリコシル化タンパク質を検出するよう設計された試
    験に対して反応性である、 から成る群より選択された少なくとも１つの識別特性を有し、 前記エピトープはダニアレルギーのイヌ由来のイヌＩｇＥおよびダニアレルギー
    のネコ由来のネコＩｇＥから成る群より選択されたＩｇＥに結合する試薬。
  9. 【請求項９】 前記核酸分子はＤｅｒＨＭＷ−ｍａｐタンパク質をコードす
    る核酸配列を有する請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の発明。
  10. 【請求項１０】 前記核酸分子はｎＤｅｒｆ９８1752、ｎＤｅｒｆ９８1665 、ｎＤｅｒｆ９８1608、ｎＤｅｒｐ９８1621、ｎＤｅｒｐ９８1527、ｎＤｅｒｐ
    ９８1470、およびｎＤｅｒｆ６０から成る群より選択される請求項１、２、３、
    ４、５、６、または７に記載の発明。
  11. 【請求項１１】 前記核酸分子が、 （ａ）配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号
    ２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３
    ９、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５から成る群より
    選択された核酸配列を有する核酸分子と、 （ｂ）（ａ）の核酸分子の対立変異型を有する核酸分子と から成る群より選択される請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の発
    明。
  12. 【請求項１２】 前記核酸分子が、 （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
    番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
    配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配
    列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列
    番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および
    配列番号４４から成る群より選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコー
    ドする核酸配列を有する核酸分子と、 （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子の対立
    変異型を有する核酸分子と から成る群より選択される請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の発
    明。
  13. 【請求項１３】 転写制御配列と機能的に連結された請求項１、２、３、４
    、５、６、または７に記載の核酸分子を有する組換え分子。
  14. 【請求項１４】 請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の核酸分
    子を有する組換えウィルス。
  15. 【請求項１５】 請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の核酸分
    子を有する組換え細胞。
  16. 【請求項１６】 前記タンパク質が、動物に投与された場合にＤｅｒＨＭＷ
    −ｍａｐタンパク質に対する免疫反応を引き起こす請求項２、３、４、５、６、
    または７に記載の発明。
  17. 【請求項１７】 前記タンパク質が、 （ａ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３４、配列番号
    ３７、配列番号４０、配列番号４３、およびアミノ酸配列配列番号３３を有する
    タンパク質をコードする核酸配列のコード鎖から成る群より選択された核酸配列
    を有する核酸分子によりコードされたタンパク質と、 （ｂ）（ａ）の前記核酸分子のうちの任意の核酸分子を含む核酸分子の対立変
    異型を含む核酸分子によりコードされたタンパク質と から成る群より選択される請求項２、３、４、５、６、または７に記載の発明。
  18. 【請求項１８】 前記タンパク質が、 （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
    番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
    配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配
    列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列
    番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、および
    配列番号４４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質と （ｂ）（ａ）の前記アミノ酸配列のうちの任意のアミノ酸配列を有するタンパ
    ク質をコードする核酸分子の対立変異型によりコードされたタンパク質と から成る群より選択される請求項２、３、４、５、６、または７に記載の発明。
  19. 【請求項１９】 請求項２、３、４、５、６、または７に記載のタンパ
    ク質に選択的に結合する単離抗体。
  20. 【請求項２０】 前記タンパク質はＩｇＥに選択的に結合する請求項２、３
    、４、５、６、または７に記載のタンパク質。
  21. 【請求項２１】 前記タンパク質がエピトープを備え、前記エピトープが、
    ピトープが、 （ａ）前記エピトープはペプチドのβ−除去に耐性である、 （ｂ）前記エピトープはプロテイナーゼＫによる消化に耐性である、および （ｃ）前記エピトープはグリコシル化タンパク質を検出するよう設計された試
    験に対して反応性である、 から成る群より選択された少なくとも１つの識別特性を有し、 前記エピトープはダニアレルギーのイヌ由来のイヌＩｇＥおよびダニアレルギー
    のネコ由来のネコＩｇＥから成る群より選択されたＩｇＥに結合する請求項２、
    ３、４、５、６、または７に記載のタンパク質。
  22. 【請求項２２】 前記脱感作化合物は裸の核酸分子として動物に投与される
    請求項３または６に記載の発明。
  23. 【請求項２３】 ダニに対するアレルギー反応を治療するための治療用組成
    物であって、請求項８に記載の試薬を備えた脱感作化合物を有する治療用組成物
    。
  24. 【請求項２４】 動物がダニに対して罹病性であるかまたはアレルギー反応
    を示すかを試験するためのアッセイキットであって、前記キットは、請求項８に
    記載の試薬と前記動物が罹病性であるかまたは前記アレルギー反応を示すかを決
    定する手段とを有し、前記手段はダニに対して罹病性であるかアレルギー反応を
    示す動物を同定するために前記試薬を使用することを含むキット。
  25. 【請求項２５】 ダニに対して罹病性であるかまたはアレルギー反応を示す
    動物を同定する方法であって、 （ａ）請求項８に記載の試薬を動物の抗体と接触させる工程と、 （ｂ）前記試薬と前記抗体との間の免疫複合体の形成を決定する工程であって
    、前記免疫複合体の形成により前記動物が罹病性であるかまたは前記アレルギー
    反応を有するかが示される工程と から成る方法。
  26. 【請求項２６】 ダニのアレルギー反応に対して宿主動物を脱感作する方法
    であって、請求項８に記載の試薬を有する脱感作化合物を含む治療用組成物を前
    記動物に投与する工程から成る方法。
  27. 【請求項２７】 請求項８に記載のエピトープに選択的に結合する単離抗体
    。
  28. 【請求項２８】 前記組成物が賦形剤、アジュバント、および担体から成る
    群より選択される成分をさらに含む請求項３、６、２３、または２６に記載の発
    明。
  29. 【請求項２９】 請求項４または２４の前記手段もしくは請求項５または２
    ５の前記接触させる工程がインビトロまたはインビボで行われる請求項４、５、
    ２４、または２５に記載の発明。
JP2000544687A 1998-04-17 1999-04-16 新規なダーマトファゴイデス属（ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）核酸分子、タンパク質、およびそれらの使用方法 Pending JP2002512253A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6201398A 1998-04-17 1998-04-17
US09/062,013 1998-04-17
US8529598P 1998-05-13 1998-05-13
US60/085,295 1998-05-13
US9890998P 1998-09-02 1998-09-02
US60/098,909 1998-09-02
PCT/US1999/008524 WO1999054349A2 (en) 1998-04-17 1999-04-16 Dermatophagoides nucleic acid molecules, proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002512253A true JP2002512253A (ja) 2002-04-23

Family

ID=27370193

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000544687A Pending JP2002512253A (ja) 1998-04-17 1999-04-16 新規なダーマトファゴイデス属（ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）核酸分子、タンパク質、およびそれらの使用方法

Country Status (6)

Country Link
US (3) US6455686B1 (ja)
EP (1) EP1071709A2 (ja)
JP (1) JP2002512253A (ja)
AU (1) AU762249B2 (ja)
CA (1) CA2325391A1 (ja)
WO (1) WO1999054349A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016088765A1 (ja) * 2014-12-02 2016-06-09 大鵬薬品工業株式会社 新規コナヒョウヒダニタンパク質

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6455686B1 (en) * 1998-04-17 2002-09-24 Heska Corporation Dermatophagoides nucleic acid molecules, proteins and uses thereof
US7128921B1 (en) 1998-04-17 2006-10-31 Heska Corporation Dermatophagoides proteins and fragments thereof
GB0014288D0 (en) * 2000-06-10 2000-08-02 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
WO2002022807A2 (en) * 2000-09-14 2002-03-21 Heska Corporation Dermatophagoides nucleic acid molecules, proteins and uses thereof
FR2817260A1 (fr) * 2000-11-29 2002-05-31 Centre Nat Rech Scient Peptides ayant des proprietes anti-inflammatoires, leurs utilisations et les compositions les contenant
FR2822709B1 (fr) * 2001-03-30 2007-01-19 Antialis Composition pharmaceutique anti-allergique comprenant au moins un allergene et au moins un compose antihistaminique
US7927600B2 (en) * 2001-03-30 2011-04-19 Emile Loria Anti-allergic pharmaceutical composition containing at least one allergen and at least one antihistamine compound
GB0120150D0 (en) * 2001-08-17 2001-10-10 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compounds
EP2037916A4 (en) * 2006-04-07 2011-09-14 Mike Nicolaou PURE TRITOQUALINE ISOMERS
EP2559434A3 (en) * 2007-02-12 2013-05-29 Mike Nicolaou Treatment of COPD using a histidine decarboxylase inhibitor sole or combined with an anti-H1 drug or with a leucotriene receptor antagonist
MX2020001353A (es) * 2017-07-31 2020-08-31 Laboratorios Leti S L Unipersonal Producto veterinario.

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2787162B2 (ja) 1989-08-24 1998-08-13 フマキラー株式会社 精製ダニアレルゲン
US5433948A (en) 1990-02-13 1995-07-18 Thomas; Wayne R. Cloning and sequencing of allergens of dermatophagoides (house dust mite)
JP3139777B2 (ja) 1990-08-27 2001-03-05 フマキラー株式会社 組換えダニアレルゲン
JP2516842B2 (ja) 1991-02-06 1996-07-24 アサヒビール株式会社 ダニ抗原に対するモノクロ―ナル抗体とその利用
FR2681076B1 (fr) * 1991-09-06 1994-11-18 Sanofi Elf Adn recombinant codant pour une proteine a activite endochitinase.
US5460977A (en) 1992-08-14 1995-10-24 Torii & Co. Peptide having allergenicity
NZ266739A (en) 1993-06-02 1997-07-27 Tvw Telethon Inst Child Health Inducing immunologic tolerance by administering a cryptic peptide derived from the antigen der pi
JPH07133227A (ja) 1993-11-09 1995-05-23 Fumakilla Ltd 精製ダニアレルゲン
US6455686B1 (en) * 1998-04-17 2002-09-24 Heska Corporation Dermatophagoides nucleic acid molecules, proteins and uses thereof
US7128921B1 (en) * 1998-04-17 2006-10-31 Heska Corporation Dermatophagoides proteins and fragments thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016088765A1 (ja) * 2014-12-02 2016-06-09 大鵬薬品工業株式会社 新規コナヒョウヒダニタンパク質
CN107001434A (zh) * 2014-12-02 2017-08-01 大鹏药品工业株式会社 新型粉尘螨蛋白质
US10457711B2 (en) 2014-12-02 2019-10-29 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Dermatophagoides farinae protein

Also Published As

Publication number Publication date
US20080038205A1 (en) 2008-02-14
WO1999054349A2 (en) 1999-10-28
WO1999054349A3 (en) 2000-02-03
AU3652199A (en) 1999-11-08
CA2325391A1 (en) 1999-10-28
US20030096779A1 (en) 2003-05-22
US6455686B1 (en) 2002-09-24
AU762249B2 (en) 2003-06-19
US7256263B2 (en) 2007-08-14
EP1071709A2 (en) 2001-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1051432B1 (en) Method for reducing immunogenicity of proteins
US20080038205A1 (en) Novel dermatophagoides proteins
US7582735B2 (en) Feline immunoglobulin E molecules and related methods
JP2007151555A (ja) ハウスダストダニからのアレルゲン蛋白質、ペプチド及びそのための使用
US7226996B2 (en) Equine Fc epsilon receptor alpha protein
US7589187B2 (en) Dermatophagoides nucleic acid molecules
EP0950104B1 (en) NOVEL FELINE Fc EPSILON RECEPTOR ALPHA CHAIN NUCLEIC ACID MOLECULES, PROTEINS AND USES THEREOF
US20080286817A1 (en) Novel allergens and treatment
JP2004529605A (ja) Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ核酸分子、タンパク質およびそれらの使用
WO2002006323A1 (en) IMMUNOGENIC PROTEINS DERIVED FROM DOMESTIC MITE ALLERGEN, BLOMIA TROPICALIS (Bt5)
AU783254B2 (en) Immunogenic proteins from the domestic mite, blomia tropicalis
WO2001030817A1 (en) Immunogenic proteins from the domestic mite, blomia tropicalis
WO2010070136A2 (en) Novel caviidae allergens and uses thereof