JP2014037438A - カバノキ花粉アレルギーの処置のための連続重複ペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】カバノキ花粉アレルギーの処置のための連続重複ペプチドの提供。
【解決手段】カバノキ花粉Ｂｅｔｖ１の主要アレルゲンの配列から、特異的免疫治療（ＳＩＴ）によるアレルギー患者の処置のための連続重複ペプチド（ＣＯＰ）が提供される。そのようなペプチドは、全ての潜在的Ｔ細胞エピトープを提供する一方、原型アレルゲンの３Ｄ構造を欠き、従って、それらのＩｇＥに結合する能力を減少する。例えば、一つの様相では、本発明はカバノキ花粉アレルギーの処置用組成物として連続重複ペプチド（ＣＯＰ）を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、その開示が本明細書に参照により組み込まれる、２００９年２月９日に出願された米国仮出願番号６１／１５１，０４５の利益を主張する。

本発明は、Ｂｅｔｖ１カバノキ花粉主要アレルゲン由来の連続重複ペプチド（ＣＯＰ）、および医学におけるそのような化合物の使用に関する。本発明の化合物および処置方法は、カバノキ花粉アレルギーの処置に及び、その治療を幅広く加速するのに有用であると考えられる。

ＩｇＥ媒介アレルギー疾患は、特に、人口の４分の１もがアレルギー性鼻炎に影響されている工業国において非常に一般的であるように思われる。（非特許文献１）。さらに、アレルギー性鼻炎に苦しむ人々は、健常者よりも低い生活の質を呈し（非特許文献２）、ごくわずかしか自然的に回復しない。全てのアレルギー患者のおよそ２５％が、木の花粉に反応する。これらのうち、９０％がカバノキ花粉抽出物による皮膚試験に対する反応性を呈する（皮膚プリック試験、ＳＰＴ）。アレルギーは、公知のペプチド配列の環境タンパク質によって引き起こされ、カバノキ花粉アレルギーについては、ほとんどの患者が、主要なカバノキ花粉アレルゲンであるＢｅｔｖ１に対して高感受性を呈する。Ｂｅｔｖ１は、植物防御において重要な役割を果たすタンパク質ファミリーの一部であり、従って、Ｂｅｔｖ１交差反応タンパク質はいくつかの植物において見出された（非特許文献３）。加えて、カバノキ花粉に対するアレルギーは、頻繁にブナ目ファミリーの他の樹木に対するアレルギー、およびヘーゼルナッツ、リンゴ、メロンおよびモモ等のある食物アレルギーと関連する（非特許文献４および非特許文献５）。

ＩｇＥ媒介アレルギーの原因に対して向けられた唯一の処置は、特異的免疫治療（ＳＩＴ）である。この処置は、アレルギー患者において寛容を誘導するために長期間（３〜５年）に亘ってアレルゲンの増加する用量を注射することからなる。いくつかの研究は、特に長期処置の際、アレルギー反応に対するこの療法の利点を示した（非特許文献６および非特許文献７）。しかしながら、特に超急速療法（ｕｌｔｒａ ｒｕｓｈ ｔｈｅｒａｐｙ）において多くの副作用が観察され、３０％までの患者が療法の経過中、アレルギー症状に対して処置されなければならなかった（非特許文献８）。従って、許容できる安全性を有するより短期間の療法形態のＳＩＴの代替法に対する強い医学的必要性が存在する。

ＳＩＴの安全性および有効性を向上するために異なるアプローチが試験されてきた。ＴＨ１免疫反応を増加する、ＭＰＬ等のアジュバント（アレルギー療法）（非特許文献９）、ＤＮＡ配列（非特許文献１０）またはＣｐＧと組み合わせられたバクテリオファージ（非特許文献１１）を添加することによって、処方物または既存の抽出物が改良されてきており、従って、可能なアレルゲン抽出物の量の減少を可能とする。一定のアレルゲンは、全部の抽出物に代えて使用された。カバノキ花粉の場合、組換えＢｅｔｖ１を用いた治験は、全カバノキ花粉抽出物と同等の有効性を呈した（非特許文献１２）。

処置の結果生じるアレルギー症状の発生を減少させるため、異なるグループが、低アレルギーの可能性を有する、すなわち低減されたＩｇＥ結合を呈する製品の使用を探索した。特に、制限された（ｒｉｓｔｒｉｃｔｅｄ）数のＴ細胞エピトープを含むペプチドは、限られた有効性しか有さないネコ鱗屑（ｃａｔ ｄａｎｄｅｒ）のアレルゲン免疫療法に使用された（非特許文献１３）。しかしながら、アレルゲンは、患者のＨＬＡ型に部分的に依存する非常に多様なＴ細胞エピトープを抱える。例えば、Ｔ細胞エピトープは、短い領域以外で、Ｂｅｔｖ１配列を通して散在することが見出された（非特許文献１４）。従って、有効な免疫療法製品は、好ましくは、選択されたＴ細胞エピトープよりも、アレルゲンの完全配列を含有するべきである。

ヒトＩｇＥが、主に、アレルゲンの断片化によって分離され得る非連続エピトープを認識するという証拠に基づいて、アレルゲンのフラグメントの使用は、依然として魅力的である。Ｂｅｔｖ１の２つの連続するフラグメントまたは、Ｂｅｔｖ１の三量体形態は、ヒトにおける第Ｉ相研究で試験され、健康状態の改善傾向を呈するが、症状薬物スコア（ｓｙｍｐｔｏｍ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）における顕著な改善は提供されなかった（非特許文献１５）。しかしながら、その研究において、多くの有害事象が観察され、その大半は注射の数時間後に生じた（非特許文献１６）。ハチ毒の主要アレルゲン、すなわちホスホリパーゼＡ２の３種のフラグメントもまた、ヒトにおいて試験され、低下したＩｇＥ結合に起因する優れた安全性を呈する一方、ＩｇＧ４およびＩＬ−１０の上昇したレベルを誘導した（非特許文献１７）。アレルゲンの全アミノ酸配列を共に形成し、従って、アレルゲンの全ての可能性のあるＴ細胞エピトープを提供する一方で、低下したＩｇＥ結合を有する、アレルギーの治療用連続重複ペプチド（ＣＯＰ）を選択するための、方法が考案された。（特許文献１）。そのような選択されたフラグメントは、アレルゲンの原型の三次元構造を再形成する低減された能力を呈し、もしあれば、低減されたＩｇＥへの結合能力を結果として生じ、従って、ヒトにおけるアレルギー反応を誘発する。

国際公開第２００４／０８１０２８号

Ｓｅｔｔｉｐａｎｅ，Ｒ．Ａ．，Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｐｒｏｃ，２２（４）：１８５−９（２００１） Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｊ．ら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９４（２）：１８２−８（１９９４） Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ，Ｈ．ら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１３（５）：８２１−３０（２００４） Ｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｔｒ，３８（４）：２０１−１５（１９９９） Ｊａｈｎ−Ｓｃｌｕｎｉｄら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１６（ｌ）：２１３−９（２００５） Ｄｒａｃｈｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．Ｊ．ら，Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，３１（２）：７７−８２（２００３） Ｄａｍ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｋ．ら，Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ３３（５）２６４−２６９（２００５） Ｂｉｒｎｂａｕｍら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，３３（ｌ）：５８−６４（２００３） Ｄｒａｃｈｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．Ｊ．ら，Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，３１（５）：２７０−７（２００３） Ｈａｒｔｌ，Ａ．ら，Ａｌｌｅｒｇｙ，５９（１）：６５−７３（２００４） Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｇｏｍｅｚ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２４（１０）：１９２７−３５（２００７） Ｐａｕｌｉ，Ｇ．ら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２２（５）：９５１−６０（２００８） Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＪＤら， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，２０６（７）：１５３５−４７（２００９） Ｊａｈｎ−Ｓｃｈｍｉｄ Ｂ．ら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１６（１）：２１３−９（２００５） Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０１（２）：１４６７７−８２（２００４） Ｐｕｒｏｈｉｔ，Ａ．ら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ（２００８） Ｆｅｌｌｒａｔｈら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１１：８５４−８６１（２００３）

一つの様相では、本発明はカバノキ花粉アレルギーの処置用組成物として連続重複ペプチド（ＣＯＰ）を提供する。具体的には、ＣＯＰＳは、全ての潜在的なＴ細胞エピトープを提供するが、原型アレルゲンの三次元構造を欠き、従って、それらのＩｇＥに結合する能力を強力に低減する、カバノキ花粉Ｂｅｔｖ１の主要アレルゲンの配列から提供される。

さらに深い様相では、本発明は、短期間に亘る数回の投与の後アレルギー症状を低減することが可能な、特異的免疫治療（ＳＩＴ）法に関する。この療法は、特異的ＣＯＰを、カバノキ花粉アレルギーに罹患したヒトに反復して投与することからなる。投与は、全身、経皮、皮内、皮下、または経口経路、または舌下および腸管経路を包含する粘膜経路によって行われ得る。いくつかの実施態様において、現在のＳＩＴが３〜５年であるのに対し、投与は２カ月に亘って反復する５回であってもよい。活性産物（ＣＯＰ）の投与量は、ＳＩＴ処置で３年に亘って投与されたＢｅｔｖ１量と同等のモル量での集積値に達し得る。

具体的には、本発明は、第１ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含む第１ペプチド；第２ポリペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含む第２ポリペプチド、および第３ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含む第３ペプチドを含む複数の連続重複ペプチドフラグメント含む組成物を提供する。本発明の好ましい様相によると、第１および第２ペプチドは、１〜１１アミノ酸によって互いに重複する。本発明の他の好ましい様相では、第２および第３ペプチドは、５〜２０アミノ酸によって互いに重複する。特に好ましい組成物は、配列番号１を有するペプチド、配列番号２を有するペプチドおよび配列番号３を有するペプチドの組み合わせ、または、配列番号６を有するペプチド、配列番号７を有するペプチドおよび配列番号８を有するペプチドの組み合わせを含む。

好ましいＣＯＰ組成物は、ヒトにおける投与の際、カバノキ花粉に感受性のある少なくとも１５名のパネルにおいて処置前に存在するＩｇＧ４レベルに対し、カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔｖ１に特異的なＩｇＧ４抗体の１０倍の増加を誘導することが可能なペプチドを包含する。他の好ましい組成物は、前記ペプチドがヒトにおける投与に際し、カバノキ花粉に感受性のある少なくとも１５名のパネルにおいて処置前に存在するＩＬ−１０レベルに対し、カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔｖ１に対するＩＬ−１０の５倍を超える増加を誘導することが可能であることが特徴づけられる。

また、配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含むペプチド、それに対して９０％および８０％および７０％の配列同一性を有するペプチドであって、カバノキ花粉に対してアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチドが提供される。特に好ましくは、配列番号１または配列番号６の配列を有するペプチドである。

また、配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含むペプチド、それに対して９０％および８０％および７０％の配列同一性を有するペプチドであって、カバノキ花粉に対してアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチドが提供される。特に好ましくは、配列番号２または配列番号７の配列を有するペプチドである。

また、配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含むペプチド、それに対して９０％および８０％および７０％の配列同一性を有するペプチドであって、カバノキ花粉に対してアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチドが提供される。特に好ましくは、配列番号３または配列番号８の配列を有するペプチドである。

そのようなペプチドは、化学合成または組換え手段を包含する様々なあらゆる方法によって得られることが可能である。

本発明のＣＯＰおよびペプチドは、乾燥粉末形態で提供され得るが、許容される担体または希釈剤と組み合わせても提供され得る。加えて、前記組成物は、好ましいアジュバントである水酸化アルミニウムを有する、アジュバントをさらに含むことができる。そういうわけで前記組成物は、ワクチン組成物として特徴づけられ、かつワクチン組成物として使用され得る。

また、カバノキ花粉アレルギーに対する特異的免疫治療（ＳＩＴ）方法であって、それを必要とする患者に、第１ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含む第１ペプチド；第２ポリペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含む第２ポリペプチド、および第３ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含む第３ペプチドからなる群より選択される１以上のアレルゲンを投与することを含む方法が提供される。

そのような方法は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射、経皮、経鼻、経口、舌下、眼内または髄腔内技術を用いてペプチドが投与される方法において実施される。

１つのそのような方法により、第１ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含む第１ペプチド；第２ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含む第２ペプチド、および第３ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含む第３ペプチドの各々の組み合わせによって患者は処置される。１つの好ましい方法によると、第１および第２ペプチドは、少なくとも１〜１１アミノ酸によって互いに重複する一方、第２および第３ペプチドは、少なくとも５〜２０アミノ酸によって互いに重複する。他の好ましい実施態様によると、第１ペプチドは配列番号１からなり、第２ペプチドは配列番号２からなり、かつ第３ペプチドは配列番号３からなり、ならびに他の好ましい実施態様によると、第１ペプチドは配列番号６からなり、第２ペプチドは配列番号７からなり、かつ第３ペプチドは配列番号８からなる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
第１ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含む第１ペプチド；第２ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含む第２ペプチド；および第３ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含む第３ペプチド：を含む複数の連続重複ペプチドフラグメントを含む組成物。
（項目２）
前記第１および第２ペプチドが１〜１１アミノ酸によって互いに重複する、項目１の組成物。
（項目３）
前記第２および第３ペプチドが５〜２０アミノ酸によって互いに重複する、項目１の組成物。
（項目４）
配列番号１を有するペプチド、配列番号２を有するペプチド、および配列番号３を有するペプチドの組み合わせを含む、項目１の組成物。
（項目５）
配列番号６を有するペプチド、配列番号７を有するペプチド、および配列番号８を有するペプチドの組み合わせを含む、項目１の組成物。
（項目６）
配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含むペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目７）
配列番号１の配列を有する、項目６のペプチド。
（項目８）
配列番号６の配列を有する、項目６のペプチド。
（項目９）
項目６のペプチドと９０％の配列同一性を有するペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目１０）
項目６のペプチドと７０％の配列同一性を有するペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目１１）
配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含むペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目１２）
配列番号２の配列を有する、項目１１のペプチド。
（項目１３）
配列番号７の配列を有する、項目１１のペプチド。
（項目１４）
項目１１のペプチドと９０％の配列同一性を有するペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目１５）
項目１１のペプチドと７０％の配列同一性を有するペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目１６）
配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含むペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目１７）
配列番号３の配列を有する、項目１６のペプチド。
（項目１８）
配列番号８の配列を有する、項目１６のペプチド。
（項目１９）
項目１６のペプチドと９０％の配列同一性を有するペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目２０）
項目１６のペプチドと７０％の配列同一性を有するペプチドであって、ここで、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持されるペプチド。
（項目２１）
乾燥粉末形態で提供される、項目１、６、１０または１５のいずれかの組成物。
（項目２２）
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、項目１、６、１０または１５のいずれかの組成物。
（項目２３）
アジュバントをさらに含む、項目２２の組成物。
（項目２４）
アジュバントが水酸化アルミニウムである、項目２３の組成物。
（項目２５）
カバノキ花粉アレルギーに対する特異的免疫治療方法であって、それを必要とする患者に、第１ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含む第１ペプチド；第２ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含む第２ペプチド、および第３ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含む第３ペプチドからなる群より選択される１以上のアレルゲンを投与することを含む方法。
（項目２６）
前記ペプチドが皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射、経皮、経鼻、経口、舌下、眼内または髄腔内技術を用いて投与される、項目２５の方法。
（項目２７）
前記患者が、第１ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸２からアミノ酸４２〜５２の配列を含む第１ペプチド；第２ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸４２〜５２からアミノ酸９６〜１３１の配列を含む第２ペプチド、および第３ペプチドであって、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者のＩｇＥ抗体に対する前記ペプチドの反応性が排除される一方、カバノキ花粉にアレルギー性の被験者由来のＴリンパ球との反応性は保持される配列番号９のアミノ酸９６〜１３１からアミノ酸１６０の配列を含む第３ペプチドの各々の組み合わせによって処置される、項目２５の方法。
（項目２８）
前記第１および第２ペプチドが少なくとも１〜１１アミノ酸によって互いに重複する、項目２５の方法。
（項目２９）
前記第２および第３ペプチドが少なくとも５〜２０アミノ酸によって互いに重複する、項目２５の方法。
（項目３０）
前記第１ペプチドが配列番号１からなり、前記第２ペプチドが配列番号２からなり、および前記第３ペプチドが配列番号３からなる、項目２５の方法。
（項目３１）
前記第１ペプチドが配列番号６からなり、前記第２ペプチドが配列番号７からなり、および前記第３ペプチドが配列番号８からなる、項目２５の方法。

図１は、Ｂｅｔｖ１と比較したＩｇＥへの選択されたＣＯＰの競合的結合を示す。組み合わせられた（パネルＡおよびＤ）または個別の（パネルＢおよびＣ）いずれかのＣＯＰは、カバノキ花粉アレルギー被験者由来の血清と予めインキュベートされた。残存Ｂｅｔｖ１特異的ＩｇＥは、ｒＢｅｔｖ１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用してモニターされた。 図１は、Ｂｅｔｖ１と比較したＩｇＥへの選択されたＣＯＰの競合的結合を示す。組み合わせられた（パネルＡおよびＤ）または個別の（パネルＢおよびＣ）いずれかのＣＯＰは、カバノキ花粉アレルギー被験者由来の血清と予めインキュベートされた。残存Ｂｅｔｖ１特異的ＩｇＥは、ｒＢｅｔｖ１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用してモニターされた。 図２は、皮膚プリック試験（ＳＰＴ）欄に記載されるカバノキ花粉アレルギー被験者の右および左腕を示す。ＳＰＴは、様々なＣＯＰおよびそれらの組み合わせを用いて行われた。ヒスタミンを、陽性コントロールとして使用した。カバノキ花粉および等価量のｒＢｅｔｖ１は３種の濃度で試験された一方で、ＣＯＰは１０倍高い濃度まで同時に試験された。 図３は、カバノキ花粉アレルゲンを注射されたマウスの体温レベルを示す。大量のｒＢｅｔｖ１が感作マウス（黒色四角）に注射され、結果として３０分以内の体温低下を生じた。製品ＡｌｌｅｒＴ（白色ひし形）を形成する選択されたＣＯＰ（Ｔ１、Ｔ２およびＴ３）は、感作マウスにおいて体温低下を誘導しない。 図４は、Ｂａｓｏｔｅｓｔ（登録商標）アッセイにおける、ｒＢｅｔｖ１の好塩基球の脱顆粒を誘導する能力を示す。ＣＯＰは、試験したどの濃度でも好塩基球脱顆粒を誘導しない。 図５は、処置後１カ月間および１カ月までの、ＰＢＭＣｓにおけるＩＬ−１０の増加を示す。水平バーは、個々の被験者（ドット）からの結果の平均値を表わす。 図６は、処置後１カ月間および１カ月までの、ＡｌｌｅｒＴまたはプラセボにより処置された被験者の血清中のＩｇＧ４における増加を示す。水平バーは、個々の被験者（ドット）からの結果の平均値を表わす。 図７は、ローザンヌ地方における２００９年の花粉シーズンとミニ鼻結膜炎生活の質質問事項（ＲＱＬＱ、Ｊｕｎｉｐｅｒ，Ｅ．Ｆ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，３０：１３２−１４０（２０００））の平均スコアとの関連を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、下記実験的手法および結果を参照して、例として以下に記載される。

低減されたＩｇＧ結合を伴う製品を選択するため、全ＢｅｔｖＩアレルゲンを含み、従って全ての可能性のあるＴ細胞エピトープを提供する、３セットの長い（３０〜９０アミノ酸）連続重複ペプチド（ＣＯＰ）が考案された。第１セットは、潜在的なＩｇＥエピトープおよびＢｅｔｖ１の３次構造に基づく解析から得られた２次構造を形成する低減された能力を有する３種のペプチドＡｌｌｅｒＴ１、−Ｔ２および−Ｔ３を含む。３種のＣＯＰの第２セット、ＡｌｌｅｒＴ６、−Ｔ７および−Ｔ８が選択された。第３セットは、ＩｇＥエピトープおよび３次構造と無関係に、アレルゲンをほぼ２つの部分に分割する２つのＣＯＰ、ＡｌｌｅｒＴ４−Ｔ５を含有した。ペプチドの第１および第２セットは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ＩｇＥ競合試験およびヒトにおける皮膚プリック試験の組み合わせを通して試験された。ＢｅｔｖＩとの反応性の非存在は、Ｂｅｔｖ１で感作されたマウスを用いると共に、ヒト好塩基球の脱顆粒を通してさらに試験された。第１セットはＡｌｌｅｒＴと名づけられ、カバノキ花粉アレルギー被験者を処置するためにヒトにおいてさらに使用された。

材料及び方法
アレルゲン
精製組換えＢｅｔｖ１は、ＢＩＯＭＡＹ（ヴィエナ、オーストラリア）から購入された。カバノキ花粉抽出物、Ａｑｕａｇｅｌ ＳＱ（ＡＬＫ Ｗａｓｓｒｉｇ ＳＱ）は、デンマーク、ホッショム（Ｈｏｓｓｈｏｍ）のＡＬＫ Ａｂｅｌｌｏから入手された。

ペプチドの選出および合成
目的は、Ｂ細胞エピトープの安定な３次構造の形成を防止する一方、Ｂｅｔｖ１配列内に存在する全てのＴ細胞エピトープを提示することである。結果として、Ｂｅｔｖ１配列に沿って重複する以下のＣＯＰの第１セットが選択され、すなわち次の通りであった：
配列番号１
ＡｌｌｅｒＴ１：配列番号９のａａ２〜５０
ＧＶＦＮＹＥＴＥＴＴＳＶＩＰＡＡＲＬＦＫＡＦＩＬＤＧＤＮＬＦＰＫＶＡＰＱＡＩＳＳＶＥＮＩＥＧＮＧＧ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：４．３６／５１９８．８２

配列番号２
ＡｌｌｅｒＴ２：配列番号９のａａ４８−１１８
ＮＧＧＰＧＴＩＫＫＩＳＦＰＥＧＦＰＦＫＹＶＫＤＲＶＤＥＶＤＨＴＮＦＫＹＮＹＳＶＩＥＧＧＰＩＧＤＴＬＥＫＩＳＮＥＩＫＩＶＡＴＰＤＧＧＳＩＬＫＩＳ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：５．７２／７７４２．７６

配列番号３
ＡｌｌｅｒＴ３：配列番号９のａａ１０６−１６０
ＶＡＴＰＤＧＧＳＩＬＫＩＳＮＫＹＨＴＫＧＤＨＥＶＫＡＥＱＶＫＡＳＫＥＭＧＥＴＬＬＲＡＶＥＳＹＬＬＡＨＳＤＡＹＮ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：６．２９／６００１．７２

配列番号４
ＡｌｌｅｒＴ４：配列番号９のａａ２−８５
ＧＶＦＮＹＥＴＥＴＴＳＶＩＰＡＡＲＬＦＫＡＦＩＬＤＧＤＮＬＦＰＫＶＡＰＱＡＩＳＳＶＥＮＩＥＧＮＧＧＰＧＴＩＫＫＩＳＦＰＥＧＦＰＦＫＹＶＫＤＲＶＤＥＶＤＨＴＮＦＫＹＮＹＳ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：５．２４／９３４８．４９

配列番号５
ＡｌｌｅｒＴ５：配列番号９のａａ６５−１６０
ＦＫＹＶＫＤＲＶＤＥＶＤＨＴＮＦＫＹＮＹＳＶＩＥＧＧＰＩＧＤＴＬＥＫＩＳＮＥＩＫＩＶＡＴＰＤＧＧＳＩＬＫＩＳＮＫＹＨＴＫＧＤＨＥＶＫＡＥＱＶＫＡＳＫＥＭＧＥＴＬＬＲＡＶＥＳＹＬＬＡＨＳＤＡＹＮ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：５．７７／１０７５９．０６

配列番号６
ＡｌｌｅｒＴ６ 配列番号９のａａ２−４９
ＧＶＦＮＹＥＴＥＴＴＳＶＩＰＡＡＲＬＦＫＡＦＩＬＤＧＤＮＬＦＰＫＶＡＰＱＡＩＳＳＶＥＮＩＥＧＮＧ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：４．３６／５１４１．７７

配列番号７
ＡｌｌｅｒＴ７ 配列番号９のａａ４４−１１８
ＮＩＥＧＮＧＧＰＧＴＩＫＫＩＳＦＰＥＧＦＰＦＫＹＶＫＤＲＶＤＥＶＤＨＴＮＦＫＹＮＹＳＶＩＥＧＧＰＩＧＤＴＬＥＫＩＳＮＥＩＫＩＶＡＴＰＤＧＧＳＩＬＫＩＳ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：５．２４／８１５６．１９

配列番号８
ＡｌｌｅｒＴ８ 配列番号９のａａ１０３−１６０
ＩＫＩＶＡＴＰＤＧＧＳＩＬＫＩＳＮＫＹＨＴＫＧＤＨＥＶＫＡＥＱＶＫＡＳＫＥＭＧＥＴＬＬＲＡＶＥＳＹＬＬＡＨＳＤＡＹＮ
理論上ｐＩ／Ｍｗ：７．０３／６３５６．２２

配列番号９
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｐ１５４９４により公開されたＢｅｔｖ１配列
ＭＧＶＦＮＹＥＴＥＴＴＳＶＩＰＡＡＲＬＦＫＡＦＩＬＤＧＤＮＬＦＰＫＶＡＰＱＡＩＳＳＶＥＮＩＥＧＮＧＧＰＧＴＩＫＫＩＳＦＰＥＧＦＰＦＫＹＶＫＤＲＶＤＥＶＤＨＴＮＦＫＹＮＹＳＶＩＥＧＧＰＩＧＤＴＬＥＫＩＳＮＥＩＫＩＶＡＴＰＤＧＧＳＩＬＫＩＳＮＫＹＨＴＫＧＤＨＥＶＫＡＥＱＶＫＡＳＫＥＭＧＥＴＬＬＲＡＶＥＳＹＬＬＡＨＳＤＡＹＮ
全ての８種のＣＯＰは、ＩｇＥ結合の判定および最初の動物試験を可能にする研究スケールで固相ｆｍｏｃ化学によって合成された。分取ＨＰＬＣは、凍結乾燥された９０％を超える精製ペプチドを得るために使用された。ペプチドは、２ｍｇ／ｍｌで水に再懸濁され、分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）で凍結された。

競合ＥＬＩＳＡ
０．５μｇ／ｍｌの組換えＢｅｔｖ１（Ｂｉｏｍａｙ、オーストリアから入手したｒＢｅｔｖ１）は、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）免疫プレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バーゼル、スイス）上に一晩、コーティングされた。１％ＢＳＡによるブロッキングの後、患者血清の１０倍希釈物が添加された。２μｇ／ｍｌのラット抗マウスｍＡｂ ＩｇＥ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）が、その後、添加され、抗体はｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ結合アルカリフォスファターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリー州、アメリカ合衆国）によって明らかにされた。３名のアレルギー患者の血清は、高ＩｇＥレベルおよびバックグラウンドに対する明確なシグナルの為に選択され、ペプチドとの競合に関する試験に使用された。１０μＭから開始される各ＣＯＰ、すなわち、ＡｌｌｅｒＴ１、ＡｌｌｅｒＴ２、ＡｌｌｅｒＴ３、ＡｌｌｅｒＴ４、ＡｌｌｅｒＴ５、ＡｌｌｅｒＴ６、ＡｌｌｅｒＴ７およびＡｌｌｅｒＴ８、またはＡｌｌｅｒＴ１−３、ＡｌｌｅｒＴ４−５およびＡｌｌｅｒＴ６−８の混合物の連続希釈物は、３種の選択された血清と共に４℃で一晩、予めインキュベートされた。その後、血清をｒＢｅｔｖ１コーティング９６ウェルプレート上でインキュベートし、残存ＩｇＥ結合は上記のとおり測定された。ｒＢｅｔｖ１希釈物は、阻害に関するコントロールとして使用される一方、ＢＳＡは可能性のある非特異的阻害に関するコントロールとして使用された。

動物
４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）は、Ｈａｒｌａｎ（ＡＤ Ｈｏｒｓｔ、オランダ）から入手され、６〜８週齢において使用された。それらは、標準的な居住条件下で、オボアルブミン（ＯＶＡ）を含まない食餌および自由飲水のもとで維持された。

免疫化プロトコル
マウスは、指示された間隔で、２ｍｇ Ａｌｕｍ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、セントルイス、ミズーリー州、アメリカ合衆国）上に吸着された指示された濃度のｒＢｅｔｖ１（Ｂｉｏｍａｙ）の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって感作された。注射は、腹部およびマウス尾部根元（ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ）において行われた。

マウスにおける抗体アイソタイプ
血清ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体反応の動態は、記載された様にＥＬＩＳＡによって測定された（ｖｏｎ Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｃ．ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０（６）：１６３８−４５ （２０００）およびＢａｒｂｅｙ，Ｃ．ら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，３４（４）：６５４６２（２００４））。簡潔には、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）免疫プレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バーゼル、スイス）が、５ｍｇ／ｍｌ ｒＢｅｔｖ１によってコーティングされた。１％ＢＳＡによるブロッキングの後、マウス血清の最適希釈物、すなわち、それぞれＩｇＥについて１：５、ＩｇＧ１について１：５００，０００、ＩｇＧ２ａについて１：１，０００が添加された。２ｍｇ／ｍｌのラット抗マウスｍＡｂ ＩｇＥ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）；または１：３０００希釈の精製ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｃａｌｔａｇ、ＷＢＡＧ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、チューリッヒ、スイス）；または１：３０００希釈の精製ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｃａｌｔａｇ）は二次抗体として添加され、アルカリフォスファターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリー州、アメリカ合衆国）によって明らかにされた。ＩｇＥアイソタイプについて、２ｍｇ／ｍｌのラット抗マウスＩｇＥ（Ｒ３５−７２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でコーティングされたマイクロウェルにおいて、精製マウスＩｇＥ（２７−７４、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）が標準として使用された。結果は、任意の単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）としてｎｇ／ｍｌで表わされた。

好塩基球脱顆粒試験
Ｂａｓｏｔｅｓｔ（登録商標）（ＯＲＰＥＧＥＮ Ｐｈａｒｍａ、ハイデルベルグ、ドイツ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ好塩基球脱顆粒の定量的測定のために使用された。カバノキ花粉アレルギードナー由来のヘパリン添加血液（１００μｌ）は、最初に刺激緩衝溶液と共に３７℃で２０分間インキュベートされ、その後、それぞれ、陽性および陰性コントロールとして、走化性ペプチドホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ｆＭＬＰ）を伴って、または伴わずにインキュベートされた。血液の分割量は、同時に、生理食塩水溶液中に希釈された１００μｌのアレルゲン溶液と共に、３７℃で２０分間インキュベートされた。用量反応曲線は、２５、２．５、０．２５、０．０２５および０．００２５ナノモーラーｒＢｅｔｖ１により実施され、同様にＡｌｌｅｒＴ混合（ＡｌｌｅｒＴ１−Ｔ３、ＡｌｌｅｒＴ４−５およびＡｌｌｅｒＴ６−８）により１０倍高くから開始された。活性化プロセスは、血液試料を１０分間４℃でインキュベートすることによって停止された。試料は、その後、２０μｌのフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ＩｇＥおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ｇｐ５３（ＣＤ６３）と共に、＋４℃で２０分間インキュベートされた。赤血球は、その後、２ｍｌ溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の添加によって除去された。細胞は、ＰＢＳ溶液で２回洗浄され、２００μｌのＰＢＳ溶液に再懸濁され、細胞蛍光測定法（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）（ＦＡＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって１時間以内に分析された。好塩基球集団は、ＰＥ抗ＩｇＥ陽性細胞上にゲートされ（ｇａｔｅｄ）、ｇｐ５３（ＣＤ６３）の発現がこの集団について分析された。収集は、各試料に対し、１，０００細胞について行われ、結果は好塩基球（ＩｇＥ陽性細胞）発現ｇｐ５３（ＣＤ６３）のパーセンテージとして与えられた。陽性脱顆粒は、Ｂａｓｏｔｅｓｔ（登録商用）報告に従って、１５％のＩｇＥ陽性細胞発現ＣＤ６３のカットオフにおいて設定された。

アレルギー患者の皮膚プリック試験
カバノキ花粉症の期間中に季節性鼻結膜炎または喘息に苦しむ、平均年齢３０．１歳（範囲２３〜４５歳）の７名の男性および１３名の女性を含む、２０名のボランティアが選択された。標準的皮膚プリック試験（ＳＰＴ）により、全ての被験者はカバノキ花粉抽出物（Ａｑｕａｇｅｎ ＳＱ）、およびｒＢｅｔｖ１（Ｂｉｏｍａｙ）に反応した。ＣＡＰ−ＲＡＳＴによって測定されるように、血清学的反応性（ＩｇＥ抗体）もまた、カバノキ花粉およびＢｅｔｖ１に対して陽性であった。ペプチドのアレルギー性反応は、全ての患者に対し、各５ペプチド（ＡｌｌｅｒＴ１、ＡｌｌｅｒＴ２、ＡｌｌｅｒＴ３、ＡｌｌｅｒＴ４およびＡｌｌｅｒＴ５）、および２セット（ＡｌｌｅｒＴ１−３およびＡｌｌｅｒＴ４−５）を用いたＳＰＴにより、ｉｎ ｖｉｖｏで評価された。各ペプチドについて、３種の異なる濃度（１０、１および０．１μＭ）で、２０μｌ滴（ｄｒｏｐ）が前腕上に適用された。また、カバノキ花粉抽出物（Ａｑｕａｇｅｎ ＳＱ、ＡＬＫＡｂｅｌｌｏ）およびＢｅｔｖ１（Ｂｉｏｍａｙ）も、ペプチドについて使用されたものよりも１０倍低い３種の濃度、すなわちカバノキ花粉について１００，０００、１０，０００および１，０００ＳＱ、同様に、Ｂｅｔｖ１について１、０．１および０．０１μＭにおいて、ＳＰＴにより試験された。みみず腫れの直径は最大径をとることによって評価された。ＳＰＴは、紅斑を伴うみみず腫れの直径が４ｍｍ以上である場合に陽性と認められた（Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ａ．ら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９９（２）：２２７−３２ （１９９７）。ミミズ腫れの直径が４ｍｍ未満であるが、２ｍｍを超える結果を生じた反応も記録され、『疑わしい』と分類された。

実験結果
ペプチドの選出
Ｂｅｔｖ１は、第一メチオニンの除去後の１５９アミノ酸の成熟タンパク質（ＮＣＢＩ
Ｘ１５８７７、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｐ１５４９４）であり、カバノキ花粉粒上に異なるアイソフォームで存在する（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｍ．Ｆ．ら，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７：１６８（２００６））。加えて、Ｂｅｔｖ１ファミリーは、セロリ（ＮＣＢＩ：構造１ＢＴＶ、１ＦＭ４＿Ａ、２ＢＫＯ＿Ａ）等のいくつかの食物アレルゲンと配列相同性を呈する。強いアレルギー交差反応がブナ目種（カバノキ、ハシバミ、ハンノキおよびシデ）間で文書で証明されている。これらの種間のＢｅｔｖ１配列比較は、Ｓｐａｎｇｆｏｒｔら（Ｓｐａｎｇｆｏｒｔ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１３（ｌ−３）：２４３−５（１９９７））によって提案されているように、アレルギー反応の原因となるＢ細胞エピトープの候補を表わす、特に高い配列保存の領域を呈した。配列番号９由来の３種の領域は、ＩｇＥに結合すると提案される可能性があり、すなわち第１領域、エピトープＢ１、アミノ酸（ａａ）９７〜１２２とａａ１３２−１４２との組み合わせ；第２領域、ａａ１６〜２４とａａ１４３〜１５５との組み合わせを包含するエピトープＢ２；および第３領域、ａａ４２〜５３に位置するＧＴＰ結合配列ＧＸＧＸＸＧに対する相同性を有するループを含有するエピトープＢ３である。一方、Ｔ細胞エピトープは、潜在的なＧＴＰ結合部位ＧＸＧＸＸＧを含有するアミノ酸４９〜６０以外のＢｅｔｖ１配列を通して散在する。

潜在的なエピトープは、免疫エピトープおよびデータベースおよび解析供給源（ＩＥＤＢ）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／）において提案されている様にエピトープコンピューター予測ツールを使用して予測され得る。特に、ＥｌｌｉＰｒｏは、タンパク質抗原の３Ｄ構造に基づいて直鎖および断続的な抗体エピトープを予測する。ＥｌｌｉＰｒｏによって予測された直鎖エピトープ内で、１つの潜在的なエピトープが、Ｓｐａｎｇｆｏｒｔらによって予測されたエピトープＢ３（ループ４１−５２）に適合することが見出された。Ｓｐａｎｇｆｏｒｔら、１９９７によって提案されたものとは異なる、３つの断続的なエピトープがＥｌｌｉＰｒｏによって予測された。１つ目のものはａａ１〜４とａａ１２３〜１２６の組み合わせを包含し；２つ目はａａ９２〜９５と共にアミノ酸１２７を包含し；３つ目はａａ１０〜１５と共にａａ１０６〜１１４を包含する。

第１残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を欠損する成熟タンパク質に関する知識と、アミノ酸４２〜５３間の潜在的な直鎖エピトープの予測を組み合わせれば、第１ＣＯＰはアミノ酸２で開始し、ａａ４２〜５２の間で終わらなければならない。第２ＣＯＰは、原型直鎖エピトープの形成を防止するためにアミノ酸４２〜５２の間で開始しなければならず、第１ＣＯＰへの重複を有する可能性がある。重複の程度は、ａａ４９〜６０の領域内でＴ細胞エピトープが全く見出されないという事実によって決定される。従って、重複は、第１ＣＯＰの末端がアミノ酸４９〜５３の間である場合、最小０から、第１ＣＯＰの末端がアミノ酸４２〜４８の間である場合、最大１１の範囲まで及び得る。第２ＣＯＰの末端はエピトープＢ１及び上記ＥｌｌｉＰｒｏによって予測された第２エピトープの形成を防止するために、ａａ９６〜１３１の間に位置しなければならない。第３ＣＯＰの開始は、Ｂ細胞エピトープ形成を防止するという上記理由のため、ａａ９６〜１３１の間に位置しなければならない。重複は、全ての可能性のあるＴ細胞エピトープを提供するために５〜２０アミノ酸の範囲に及んでもよい。

治験用の組換え形態で他のものによって使用される（Ｐａｕｌｉ，Ｇ．ら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １２２（５）：９５１−６０（２００８））配列Ｐ１５４９４（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）および上記予測に基づき、３セットのペプチドは、完全Ｂｅｔｖ１配列を含んで考案された。ＡｌｌｅｒＴ１、−Ｔ２および−Ｔ３のセット（それぞれ、配列番号１、２および３）と及び、ＡｌｌｅｒＴ６、−Ｔ７および−Ｔ８（それぞれ、配列番号６、７および８）は、上記規則に従って考案され、すなわち、終末点および予測された断続的Ｂ細胞エピトープの形成を防止する重複を保有する。特に、ペプチドは、それぞれ、ＡｌｌｅｒＴ１−ＡｌｌｅｒＴ２およびＡｌｌｅｒＴ２−ＡｌｌｅｒＴ３間の３および１３アミノ酸によってそれらの先端で重複された。重複は、それぞれＡｌｌｅｒＴ６−ＡｌｌｅｒＴ７およびＡｌｌｅｒＴ７−ＡｌｌｅｒＴ８間のそれぞれ６および１６アミノ酸である。他のＣＯＰセット、すなわちＡｌｌｅｒＴ４−Ｔ５は、上記予測を考慮することなく選出され、２１アミノ酸によって重複する２つのペプチドのみで構成される。前述のエピトープＢ１およびＢ３は、ＡｌｌｅｒＴ５およびＡｌｌｅｒＴ４にそれぞれ完全に存在する一方、ＥｌｌｉＰｒｏによって予測された第２断続的エピトープはＡｌｌｅｒＴ５上に存在する。全ての連続重複ペプチド（ＣＯＰ）は、さらなる実験において個別に、または等モル量で混合されて使用されたかのいずれかである。

ｒＢｅｔｖ１と比較される選択されたＣＯＰのＩｇＥ結合
ＣＯＰは、最初に、材料および方法において記載された様に競合ＥＬＩＳＡによって減少されたＩｇＥ結合に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された。図１に見られるように、ｒＢｅｔｖ１は、ドナーの血清に依存する１０^−１０〜１０^−５Ｍ（５０％阻害）の範囲に及ぶ濃度で血清中に存在するＩｇＥと競合する一方、ＢＳＡは全ての試験された濃度において検出可能な阻害を呈さなかった。ＡｌｌｅｒＴ１、Ｔ２およびＴ３単独（図１Ｂ）または等モルの組み合わせ（図１Ａ）のいずれも、競合を呈さなかった。同様の結果が、同様の規則に従って選択されたペプチド、すなわちＡｌｌｅｒＴ６、Ｔ７およびＴ８について得られた（図１Ｄ）。ＡｌｌｅｒＴ４およびＴ５単独は、類似の結果を呈した（図１Ｃ）が、驚くべきことに、ｒＢｅｔｖ１よりも少なくとも１，０００倍高い濃度であるにもかかわらず、ＡｌｌｅｒＴ４とＡｌｌｅｒＴ５の組み合わせはいくらかの阻害を呈した（図１ＡおよびＣ）。競合アッセイは、３名のアレルギー患者由来の血清を用いて行われ、ＩｇＥ結合について、ＡｌｌｅｒＴ１、Ｔ２およびＴ３と及び、ＡｌｌｅｒＴ６、Ｔ７およびＴ８の組み合わせセットとＢｅｔｖ１との競合がないことを確認した（データ非表示）。

Ｂｅｔｖ１に対して感作されたマウスにおける選択されたＣＯＰの効果
第１系列のマウスは、Ｈｕｆｎａｇｌ，Ｋ．ら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１６（２）：３７０−６（２００５）によって開発されたプロトコルに従って処置され、すなわち、３回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって処置され、木の花粉エアロゾルによって挑戦された。我々の手元において、注射期間の後、Ｂｅｔｖ１に対するＩｇＥは検出不可能であり、マウスが感作されていなかったことを示唆した。従って、木の花粉の挑戦は、気管支肺胞洗浄液における好酸球の存在を増加できなかった（データ非表示）。従って、我々は、ハチ毒ＰＬＡ２に対する以前のネズミの研究に使用された感作プロトコル（ｖｏｎ Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｃ．ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０（６）：１６３８−４５（２０００））を適用した。マウスは、２週間間隔で、水酸化アルミニウム中のｒＢｅｔｖ１の６回の皮下注射によって感作された。０．１〜１０μｇの範囲に及ぶ濃度が試験された。興味深いことに、Ｂｅｔｖ１特異的ＩｇＥは、０．１μｇで感作されたマウスにおける４回目の注射の後のみ、顕著に増加し、おそらく、何故以前の試験が失敗したかを説明している。ＩｇＧ２レベル（ヒトにおける防御ＩｇＧ４に対応する）は４回目の注射の後増加し始め、その後着実に増加し、６回の注射の後最高値を呈した。Ｂｅｔｖ１特異的ＩｇＧ２ａは、ＩｇＥ特異的レベルよりもわずかに後に増加するように見えた。

マウスの感作は、高用量（３０μｇ）のｒＢｅｔｖ１のｉ．ｐ．注射および直腸温度の記録によって試験された。図３に示されている様に、体温低下はｒＢｅｔｖ１の注射後３０分以内に観察され、強い全身性アレルギー反応を呈した。１５０μｇのＡｌｌｅｒＴの注射は、体温シフトを導かず、従って、少なくとも動物において、ｒＢｅｔｖ１を上回る、COPに基づくアプローチの増加された安全性を示唆している。０．１、１．０または１
０μｇのｒＢｅｔｖ１を用いて感作されたマウス間で顕著な相違は観察されたなかった（データ非表示）。従って、ｒＢｅｔｖ１に対して感作されたマウスは、ヒトにおけるアナフェラキシーショックに類似する試験である、ＡｌｌｅｒＴを用いて挑戦された場合、体温減少を呈さなかった。

好塩基球脱顆粒試験
ＡｌｌｅｒＴの安全性をさらに確認するため、ＣＯＰは好塩基球脱顆粒アッセイ（Ｂａｓｏｔｅｓｔ（登録商標））において試験された。濃度依存的方式においてｒＢｅｔｖ１によって刺激された場合、好塩基球は脱顆粒した（図４）。反対に、個別のＣＯＰ（ＡｌｌｅｒＴ１〜ＡｌｌｅｒＴ８）および組み合わせは、陰性コントロールによって観察されたレベルを超えて脱顆粒を誘導することができなかった。最大半量の脱顆粒を誘導することが可能なＢｅｔｖ１濃度の１，０００倍までのＣＯＰ濃度範囲を通して、いかなる脱顆粒も観察されなかった（図４）。好塩基球の脱顆粒の非存在は、ヒトに適用した際の即時のアレルギー反応の潜在的に低減されたリスクを示す。

皮膚プリック試験（ＳＰＴ）
ＡｌｌｅｒＴ ＣＯＰを用いたＳＰＴは、陽性ＣＡＰ ＲＡＳＴおよび／またはカバノキ花粉に対する陽性皮膚反応のいずれかによって確認されたアレルギー性鼻炎症状を呈する２０名のボランティアにおいて行われた（表Ｉ）。期待された通り、それぞれ、１００，０００ＳＱおよび１μＭの濃度における、カバノキ花粉抽出物または組換えＢｅｔｖ１のいずれかによって、ＳＰＴは全てのボランティアにおいて陽性であった（表ＩＩＡ）。より低い濃度において、８０〜８５％の被験者が、１０倍希釈物に対して陽性反応を呈する一方、カバノキ花粉またはｒＢｅｔｖ１の１００倍希釈物に対して、５〜１０％の被験者が反応性を呈した。ｒＢｅｔｖ１に対して１０倍高い濃度のペプチドが試験された（１０μＭまで）。ＣＯＰのいずれもが、一定の閾値を越えても陽性皮膚反応、すなわち紅斑を伴う４ｍｍを超えるみみず腫れを呈さなかった（１名の被験者の腕の例が図２に示される）。

一定の閾値を下回る皮膚反応は、時折、数人の被験者において観察された。そのような疑わしい反応は、紅斑を伴うまたは伴わない４ｍｍ未満の検出可能なみみず腫れが観察された場合に得点された（表ＩＩＢ）。そのような反応は、低濃度のカバノキ花粉またはｒＢｅｔｖ１に観察された（データ非表示）。プリック試験は、数人の被験者において製品（ｐｒｏｄｕｃｔ）と無関係の局所的な刺激を誘発する可能性がある。実際、一定の閾値を下回る一つの反応が、散発的にどちらか一方のボランティアにおいて得点された。そのような反応をバックグラウンドと仮定すれば、統計学的な予防策によると、３名を超える被験者における疑わしい反応を、場合によっては有意であると定義するように導かれる。ＡｌｌｅｒＴ４−Ｔ５の組み合わせは、６名のボランティアにおいて最も高濃度で反応を誘発し（表ＩＩＢ）、従って、競合ＥＬＩＳＡにおいて観察されたその低いものの顕著なＩｇＥ結合能力を確認した

マウスにおける毒物学研究
連続重複ペプチド（ＣＯＰ）は、ハチ毒アレルギー患者において優れた安全性を呈した（Ｆｅｌｌｒａｔｈら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１１：８５４−８６１（２００３））。免疫反応は、ＳＩＴを適用した場合に得られたものに類似し、可能性のある有効性を示唆したが、証明はしなかった。カバノキ花粉アレルギーに対する同様のアプローチの適用が、本明細書に提示される。驚くべきことに、Ｂｅｔｖ１配列由来の一組のＣＯＰは、残存ＩｇＥ結合（ｒｅｓｉｄｕａｌ ＩｇＥ ｂｉｎｄｉｎｇ）を呈した。このセット、すなわちＡｌｌｅｒＴ４およびＡｌｌｅｒＴ５を構成するペプチドは、それ自身、そのような結合を呈さないことから、溶液中の２つペプチドの相互作用が、ＩｇＥによって認識されるＢ細胞エピトープの出現の最も確実らしい原因である。そのような残存結合（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）は、プリック試験によって試験された６名のボランティア及び、２名の患者からの血清を用いた競合アッセイにおいて観察された。ＡｌｌｅｒＴ４−Ｔ５の混合が、原型Ｂｅｔｖ１の高次構造を伴う少数の分子を結果として生じるかどうか、または、再構築されたＢ細胞エピトープが低親和性を有するＩｇＥによって部分的に認識されるかどうかは、まだ示されていない。一方のＡｌｌｅｒＴ１、Ｔ２およびＴ３を組み合わせるＣＯＰ、もう一方のＡｌｌｅｒＴ６、Ｔ７およびＴ８を組み合わせるＣＯＰの２組のＣＯＰは、競合ＥＬＩＳＡ、脱顆粒アッセイまたは皮膚プリック試験のいずれを使用しても、検出可能なＩｇＥ結合を呈さなかった。従って、ＡｌｌｅｒＴと名づけられた、ＡｌｌｅｒＴ１、Ｔ２およびＴ３の組み合わせは、ヒトにおいてＩｇＥ媒介アレルギー反応を誘発しないことが期待され得る。

調節性の毒物学試験は、ヒトにおける治験を準備するため、ＣＥＲＢ（フランス）によってマウスにおいて行われた。研究は、雄１０匹および雌１０匹の２つの群に分けられた４０匹の動物を含み、１群にビヒクル、すなわち水酸化アルミニウムを投与し、他方に４０μｇ／動物のＡｌｌｅｒＴ（ＡｌｌｅｒＴ１、ＡｌｌｅｒＴ２およびＡｌｌｅｒＴ３ＣＯＰの等モル混合物）を投与した。処置に対する各動物の割り当ては、研究の開始前にランダムに決定された。群の均質性は、雄および雌別々に、ランダム化の日に計測された体重の基準により確認された。動物１匹あたり４０μｇの用量は、ヒトにおいて使用されることが予期される維持用量（１６０μｇ）の４分の１に相当する。ＡｌｌｅｒＴまたはそのビヒクルは、１、４、８、１２および２６日目のおよそ同じ時間に、皮下経路によって投与された。各投与につき、２００μｌのＡｌｌｅｒＴまたはビヒクルが動物１匹あたりについて投与された。ビヒクルまたはＡｌｌｅｒＴのいずれを投薬された動物においても死亡は観察されなかった。摂食または体重において変化は認められなかった。

一般的な観察の間、ビヒクルまたはＡｌｌｅｒＴが投与された動物において臨床的兆候は認められなかった。ビヒクル群と比較した場合、ＡｌｌｅｒＴが投薬されたマウスにおいて血液学および凝固パラメーターに及ぼす影響は認められなかった。性別に関係なく、ＡｌｌｅｒＴが投与された動物において、臨床化学パラメーターまたは検尿上のいずれについても影響は認められなかった。ビヒクルまたはＡｌｌｅｒＴに帰する異常は、剖検で検査された器官において認められなかった。従って、採用された実験条件下において、４０μｇ／動物でのＡｌｌｅｒＴによる処置に帰する死亡はなく、毒性兆候も認められなかった。アジュバント水酸化アルミニウムの使用に起因する注射部位における組織学的変化以外、ペプチドまたは組換え産物による処置の標的となる器官においていかなる解剖学的および組織学的変化も観察されなかった。制限された免疫原性試験は、期待されたように、ＡｌｌｅｒＴ注射がマウスにおいて、ＩｇＧ２を包含する特異的ＩｇＧの両方を誘導したことを示した。

治験第Ｉ／ＩＩａ相におけるＡｌｌｅｒＴによるヒト被験者の処置
単一施設の、ランダム化された、プラセボコントロール第Ｉ／ＩＩａ相治験は、主要カバノキ花粉アレルゲンであるＢｅｔｖ１由来連続重複ペプチド（ＣＯＰ）に基づいて、ＡｌｌｅｒＴの安全性、免疫原性および潜在的有効性を評価するため、カバノキ花粉アレルギー性鼻炎および喘息を有するボランティアを包含し、ローザンヌ（スイス）において実施された。花粉シーズンの前に、アジュバント水酸化アルミニウム中のＡｌｌｅｒＴが１５名の成人ボランティア（１８〜４５歳）に０日目、７日目、１４日目、２１日目および５１日目に皮下注射された。コントロールボランティア（ｎ＝５）は、プラセボとして水酸化アルミニウムを単独で受けた。免疫学的エンドポイントおよび／または生物学的安全性試験は、処置後１カ月までの各訪問（ｖｉｓｉｔ）後に行われた。２００９年のカバノキ花粉シーズンの間、ボランティアは３２項目の鼻炎および生活の質質問事項（ＭｉｎｉＲＱＬＱ）および喘息症状に基づいて評価された。

全体的にＡｌｌｅｒＴは安全であり、全ての被験者は注射プロトコルを完了した。局所的な有害事象は軽度であり、プラセボと異ならなかった。重篤な有害事象、即時性アレルギー反応およびＡｌｌｅｒＴ関連の臨床的に顕著に異常な検査室値（ｌａｂ ｖａｌｕｅ）は報告されなかった。活性な群において、ＡｌｌｅｒＴは、ワクチン関連ＩＮＦガンマによって表わされる活発な初期Ｂｅｔｖ１特異的細胞免疫反応、およびＰＢＭＣについて判定される様にＩＬ−１０分泌の５倍を超える増加を誘導した（図５）。これは、抗Ｂｅｔｖ１特異的ＩｇＧ４レベル増加に少なくとも１０倍の増加（図６）に寄与する一方、ＩｇＥ反応は制限された。季節性の露出の間、プラセボに比較して、ＭｉｎｉＲＱＬＱおよび喘息症状スコアにおける全体的な著しい改善が観察された。従って、Ｂｅｔｖ１由来の３種のＣＯＰ（ＡｌｌｅｒＴ）の混合物による免疫治療は、カバノキ花粉アレルギー性鼻炎および喘息を有するボランティアにおいて安全でかつ免疫原性があり、季節性症状および生活の質の著しい改善を導いた（図７）。

これらの実験より、ＡｌｌｅｒＴ、３種のペプチドＡｌｌｅｒＴ１、Ｔ２およびＴ３の組み合わせは、ＡｌｌｅｒＴ４およびＴ５の組み合わせよりもカバノキ花粉アレルギーの処置についてより良好な候補を提示すると結論付けられ得る。また、そのホモログを産生するための各ペプチド内のアミノ酸変化によるＡｌｌｅｒＴ１、Ｔ２およびＴ３ＣＯＰのホモログもまた、考慮され、ここで、カバノキ花粉に対してアレルギー性である患者のＩｇＥ抗体に対するホモログの反応性が排除される一方、Ｔリンパ球との反応性はいまだ保持される。さらに、カバノキ花粉主要アレルゲンＢｅｔｖ１内のＣＯＰの制限をシフトすることによって、ＣＯＰのホモログが考慮される。そのようなホモログは、検出不可能なＩｇＥ結合およびＴリンパ球活性と同等の特性を有する製品を結果として生じるであろう。そのような製品は、ヒトにおいてＡｌｌｅｒＴと安全性および有効性に対する同じ潜在的能力を提示し、他に示されない限り、処置の機会という観点から等価物として認められ得るであろう。抗カバノキ花粉ＩｇＥ抗体に対する反応性はないが、Ｔリンパ球に対する反応性を保持することにより特徴づけられる好適なホモログは、本明細書に記載される方法によって同定され得る。

本発明の実施における多数の改良および変化は、現在のその好ましい実施態様の考慮の際、当業者に対して生じることが期待される。その結果、本発明の範囲について置かれるべき単なる制限は、添付の請求項において現れるものである。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。