ES2569619T3

ES2569619T3 - Péptidos contiguos superpuestos para el tratamiento de la alergia al polen de abedul

Info

Publication number: ES2569619T3
Application number: ES10707962.6T
Authority: ES
Inventors: Christophe Reymond; Francois Spertini
Original assignee: Anergis SA
Current assignee: Anergis SA
Priority date: 2009-02-09
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2030-02-09
Also published as: CA2750705A1; SI2393511T1; HRP20160426T1; US20130156799A1; EP2393511B1; AU2010212039B2; WO2010089671A3; US8343503B2; JP2012517418A; JP5566404B2; PL2393511T5; EP2393511B2; CA2750705C; AU2010212039A1; PL2393511T3; WO2010089671A2; HUE027491T2; JP2014037438A; DK2393511T4; DK2393511T3

Abstract

Una composición que comprende una pluralidad de fragmentos de péptidos contiguos superpuestos que comprende un primer péptido que comprende la secuencia desde el aminoácido 2 hasta los aminoácidos 42-52 de sec. con núm. de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alérgicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alérgicos a polen de abedul se mantiene; un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos 42-52 para los aminoácidos 96-131 de la sec. con núm de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alérgicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alérgicos a polen de abedul se mantiene y un tercer péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 96-131 para el aminoácido 160 de la sec. con núm de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alérgicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alérgicos a polen de abedul se mantiene.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Peptidos contiguos superpuestos para el tratamiento de la alergia al polen de abedul Campo de la invencion

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos num. de serie 61/151,045 presentada el 9 de febrero de 2009 cuya descripcion se incorpora por este medio como referencia.

La presente invencion se refiere a peptidos contiguos superpuestos (COP) derivados del Bet v 1 alergeno principal del polen de abedul y el uso de tales compuestos en medicina. Los compuestos y metodos de tratamiento de la invencion se contemplan por ser utiles en el tratamiento de la alergia al polen de abedul y acelerar ampliamente su tratamiento.

Antecedentes de la invencion

La enfermedad alergica mediada por IgE parece ser muy comun particularmente en los pafses industrializados en los que hasta una cuarta parte de la poblacion esta afectada por la rinitis alergica. (Settipane, R.A., Allergy Asthma Proc, 22(4):185-9 (2001)). Ademas las personas que sufren de rinitis alergica muestran una menor calidad de vida que una sana, (Bousquet, J., y otros, J Allergy Clin Immunol, 94(2):182-8 (1994)) con solo unos pocos que entran en remision espontaneamente. Aproximadamente el 25 % de todos los pacientes alergicos responden al polen de arboles. Entre ellas, el 90 % muestran reactividad con el extracto de polen de abedul en las pruebas cutaneas (Pruebas de Puncion Cutanea, SPT). Las alergias son provocadas por protemas ambientales de secuencia peptfdica conocida y para alergia al polen de abedul la mayona de los pacientes muestran hipersensibilidad a Bet v 1, el principal alergeno del polen de abedul. Bet v 1 es parte de una familia de protemas que juega un papel importante en la defensa de la planta y por lo tanto se encontro reaccion cruzada de protemas Bet v 1 en un numero de plantas. (Breiteneder, H. y otros, J Allergy Clin Immunol, 113(5):821-30 (2004)). Ademas, la alergia al polen de abedul se relaciona frecuentemente con las alergias a otros arboles de la familia Fagales y con ciertas alergias a los alimentos, como las de a la avellana, manzana, melon y melocoton. (Son, D. Y. y otros, Eur JNutr, 38(4):201-15 (1999) y Jahn-Sclunid y otros, J Allergy Clin Immunol, 116(1):213-9 (2005)).

El unico tratamiento orientado a la causa de alergia mediada por IgE es la inmunoterapia espedfica (SIT). Los tratamientos consisten en la inyeccion de dosis crecientes de alergenos por extensos penodos de tiempo (de tres a cinco anos) para inducir tolerancia en el paciente alergico. Varios estudios mostraron el beneficio de esta terapia en la respuesta alergica, particularmente, en tratamientos a largo plazo. (Drachenberg, KJ. y otros, Allergol Immunopathol, 31(2):77-82 (2003) y Dam Petersen, K. y otros, Allergol Immunopathol 33(5)264-269 (2005)). Sin embargo, se observaron una serie de efectos secundarios particularmente durante las terapias de ultra afluencia, donde hasta el 30 % de los pacientes tienen que ser tratados por smtomas alergicos durante el curso del tratamiento. (Birnbaum y otros, Clin. Exp. Allergy, 33(1):58-64 (2003)). Por tanto, existe una fuerte necesidad medica de una alternativa a la SIT en la forma de un tratamiento mas corto con una seguridad aceptable.

Se han probado diferentes enfoques para mejorar la seguridad y la eficacia de la SIT. Las formulaciones o extractos existentes se han mejorado mediante la adicion de adyuvantes, como MPL (Terapeutica de la Alergia), (Drachenberg, KJ. y otros, Allergol Immunopathol, 31(5):270-7 (2003)) secuencias de DNA (Hartl, A. y otros, Allergy, 59(1):65-73 (2004)) o bacteriofago combinado con CpG (Martinez Gomez, J.M. y otros, Pharm. Res., 24(10): 1927-35 (2007)) que aumentan la respuesta inmune TH1, lo que permite asf las posibles reducciones en la cantidad de extracto alergenico. Alergenos definidos se usan en lugar de extractos totales. En el caso de polen de abedul, un ensayo clmico con Bet v 1 recombinante ha demostrado una eficacia equivalente a extractos totales de polen de abedul (Pauli, G. y otros, J. Allergy Clin. Immunol, 122(5):951-60 (2008)).

Para disminuir la aparicion de los smtomas alergicos resultantes del tratamiento, diferentes grupos exploraron el uso de productos con potencial hipoalergenico, concretamente que muestran la union IgE reducida. Particularmente, los peptidos que abarcan un numero limitado de epftopos de celulas T se usaron para la inmunoterapia con alergenos de caspa de gato con eficacia limitada (Campbell, JD y otros, J Exp Med., 206(7): 1535-47 (2009)). Sin embargo, los alergenos albergan una gran variedad de epftopos de celulas T en dependecia, en parte, del tipo HLA del paciente. Por ejemplo, los epftopos de celulas T se encuentran dispersos a lo largo de la secuencia de Bet v 1, a excepcion para una region corta (Jahn-Schmid B. y otros, J Allergy Clin Immunol, 1116(1):213-9 (2005)). Por lo tanto un producto de inmunoterapia eficiente debena contener preferentemente la secuencia completa del alergeno en lugar de epftopos seleccionados de celulas T.

El uso de fragmentos de alergenos sigue siendo atractivo, basado en la evidencia de que la IgE humana reconoce principalmente epftopos no contiguos que pueden separarse por la fragmentacion del alergeno. Dos fragmentos contiguos de Bet v 1 o formas trimericas de Bet v 1 se ensayaron en un estudio de fase I en humanos y mostraron una tendencia hacia la mejora del bienestar, pero no proporcionaron una mejora significativa en las puntuaciones de los smtomas de la medicacion (Niederberger, V. y otros, Proc Natl Acad Sci USA, 101 (2): 14677-82 (2004)). En ese estudio, sin embargo, se observaron un numero de eventos adversos, la mayona de los cuales ocurrieron horas despues de las inyecciones (Purohit, A. y otros, Clin Exp Allergy (2008)). Tres fragmentos del alergeno principal del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

veneno de abeja, concretamente, la fosfolipasa A2, se ensayaron tambien en humanos, mostrando una excelente seguridad debido a la union de IgE reducida aunque obteniendo niveles elevados de IgG4 y IL-10 (Fellrath y otros, J. Allergy CHn. Immunol, 111 : 854-861 (2003)). Se diseno un metodo para seleccionar peptidos contiguos superpuestos (COP) para el tratamiento de alergias que en conjunto forman la secuencia completa de aminoacidos de un alergeno, lo que proporciona as^ todos los posibles epftopos de celulas T del alergeno, aunque se tenga la union de IgE reducida (Solicitud de Patente WO2004/081028 A2). Tales fragmentos seleccionados muestran una capacidad reducida para reformar la estructura terciaria original del alergeno, en su caso, lo que resulta en una capacidad reducida para unir IgE y por lo tanto para provocar reacciones alergicas en humanos.

Breve descripcion de la invencion

De acuerdo con un aspecto, la presente invencion proporciona peptidos contiguos superpuestos (COPs) como una composicion para el tratamiento de alergias al polen del abedul. Espedficamente, se proporcionan COPs a partir de la secuencia del alergeno principal de polen de abedul Bet v 1 que proporcionan todos los potenciales epftopos de celulas T, pero estan desprovistos de la estructura tridimensional del alergeno original, lo que potencialmente reduce por tanto su capacidad de unir IgE.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo de inmunoterapia espedfica (SIT) capaz de reducir los smtomas alergicos despues de algunas administraciones en un penodo corto de tiempo. Esta terapia consiste en administrar repetidamente COPs espedficos a los humanos que sufren de alergia al polen del abedul. La administracion puede realizarse por via sistemica, transdermica, subcutanea intradermica, o por via oral, o vfas mucosas que incluyen las rutas sublingual e intestinal. La administracion puede, en algunas modalidades repetirse cinco veces durante dos meses en comparacion con 3 a 5 anos para la SIT actual. La cantidad administrada de producto activo (COPs) puede alcanzar un valor acumulado equivalente a la cantidad molar de la cantidad de Bet v 1 que se administra durante tres anos de tratamiento SIT.

Espedficamente, la invencion proporciona una composicion que comprende una pluralidad de fragmentos de peptidos contiguos superpuestos que comprenden un primer peptido que comprende la secuencia desde el aminoacido 2 hasta los aminoacidos 42-52 de sec. con num. de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene; un segundo polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos 4252 para los aminoacidos 96-131 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene y un tercer peptido que comprende la secuencia de aminoacidos 96-131 para el aminoacido 160 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene. De acuerdo con un aspecto preferido de la invencion, el primer y segundo peptidos se superponen entre sf por 1 a 11 aminoacidos. De acuerdo con un aspecto preferido de la invencion, el segundo y tercer peptidos se superponen entre sf por 5 a 20 aminoacidos. Las composiciones particularmente preferidas comprenden la combinacion del peptido que tiene la sec. con num de ident.: 1, el peptido que tiene la sec. con num de ident.: 2 y el peptido que tiene la sec. con num de ident.: 3 o la combinacion del peptido que tiene la sec. con num de ident.: 6, el peptido que tiene la sec. con num de ident.: 7 y el peptido que tiene la sec. con num de ident.: 8.

Las composiciones de COP preferidos incluyen aquellos en los que los peptidos son capaces despues de la administracion en los humanos de la induccion de un aumento de 10 veces en los anticuerpos espedficos IgG4 para alergeno Bet v 1 de polen de abedul por encima del nivel de IgG4 presente antes del tratamiento en un panel de al menos 15 individuos sensibles a polen de abedul. Otras composiciones preferidas se caracterizan en que los peptidos son capaces despues de la administracion en humanos de la induccion aproximada de un aumento de 5 veces en IL-10 con el alergeno Bet v 1 de polen de abedul por encima del nivel de IL-10 presente antes del tratamiento en un panel de al menos 15 individuos sensibles a polen de abedul.

Ademas se proporcionan peptidos que comprenden la secuencia desde el aminoacido 2 hasta los aminoacidos 42-52 de sec. con num de ident.: 9 y peptidos que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia con esta en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina

mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene.

Particularmente preferidos son los peptidos que tienen la secuencia de sec. con num de ident.: 1 o de sec. con num de ident.:6.

Ademas se proporcionan peptidos que comprenden la secuencia desde los aminoacidos 42-52 hasta los aminoacidos 96-131 de sec. con num de ident.: 9 y peptidos que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia con esta en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina

Particularmente preferidos son los peptidos que tienen la secuencia de sec. con num de ident.: 2 o de sec. con num de ident.:7.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ademas se proporcionan peptidos que comprenden la secuencia desde los aminoacidos 96-131 hasta el aminoacido 160 de sec. con num de ident.: 9 y peptidos que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia con esta en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene. Particularmente preferidos son los peptidos que tienen la secuencia de sec. con num de ident.: 3 o de sec. con num de ident.:8.

Tales peptidos pueden obtenerse por cualquiera de una variedad de metodos que incluyen por smtesis qmmica o por medios recombinantes.

Las COPs y peptidos de la invencion pueden proporcionarse en forma de polvo seco, pero tambien pueden proporcionarse en combinacion con un portador o diluyente aceptables. Ademas, las composiciones pueden comprender ademas un adyuvante con un adyuvante preferido que es hidroxido de aluminio. Como tal, las composiciones pueden caracterizarse y usarse como una composicion de vacuna.

Tambien se proporcionan metodos de inmunoterapia espedfica (SIT) contra las alergias a polen de abedul, que comprenden administrar a un paciente con necesidad de este uno o mas alergenos seleccionados de del grupo que consiste en un primer peptido que comprende la secuencia desde el aminoacido 2 hasta los aminoacidos 42-52 de sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene; un segundo polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos 42-52 para los aminoacidos 96-131 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene y un tercer peptido que comprende la secuencia de aminoacidos 96-131 para el aminoacido 160 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene.

Tales metodos pueden llevarse a cabo en los que los peptidos se administran mediante el uso de tecnicas de inyeccion intradermica, inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular, inyeccion intravenosa, transdermica, intranasal, oral, sublingual, intraocular, o intratecales.

De acuerdo con uno de tales metodos, un paciente se trata con la combinacion de cada uno de un primer peptido que comprende la secuencia desde el aminoacido 2 hasta los aminoacidos 42-52 de sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene; un segundo peptido que comprende la secuencia desde los aminoacidos 42-52 hasta los aminoacidos 96-131 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene y un tercer peptido que comprende la secuencia de aminoacidos 96-131 para el aminoacido 160 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene. De acuerdo con un metodo preferido, el primer y segundo peptidos se superponen entre sf por al menos 1 a 11 aminoacidos, mientras que el segundo y tercer peptidos se superponen entre sf por al menos 5-20 aminoacidos. De acuerdo con otra modalidad preferida el primer peptido consiste en la sec. con num de ident.: 1, el segundo peptido consiste en la sec. con num de ident.:2 y el tercer peptido consiste en la sec. con num de ident.: 3 y de acuerdo con otra modalidad preferida el primer peptido consiste en la sec. con num de ident.: 6, el segundo peptido consiste en la sec. con num de ident.:7 y el tercer peptido consiste en la sec. con num de ident.: 8.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 representa la union competitiva de COPs seleccionados a IgE en comparacion con Bet v 1. Los COPs se preincuban con suero de sujetos alergicos a polen de abedul ya sea en combinacion (paneles A y D) o individualmente (paneles B y C). La IgE espedfica de Bet v 1 residual se controlo mediante el uso de placas de ELISA recubiertas con r Bet v 1.

La Figura 2 representa los brazos derecho e izquierdo de un sujeto alergico a polen de abedul que se describe en la seccion de pruebas de puncion cutanea (SPT). Las SPT se realizaron con varios COPs y sus combinaciones. La histamina se uso como control positivo. El polen de abedul y cantidades equivalentes de r Bet v 1 se ensayaron a tres concentraciones, mientras que los COPs se ensayaron en paralelo hasta una concentracion 10 veces superior.

La Figura 3 representa los niveles de temperatura de los ratones inyectados con el alergeno de polen de abedul. Una gran cantidad de r Bet v 1 se inyecto a los ratones sensibilizados (cuadrados rellenos) lo que resulta en la cafda de la temperatura dentro de los 30 minutos. Los COPs seleccionados (T1, T2 y T3) que forman el producto AllerT (rombos blancos) no inducen una cafda de la temperatura en los ratones sensibilizados.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La Figura 4 muestra la capacidad del r Bet v 1 para inducir la desgranulacion de basofilos en un ensayo Basotest®. Los COPs no inducen la desgranulacion de basofilos en cualquier concentration ensayada.

La Figura 5 representa el aumento de la IL-10 en PBMCs durante y hasta un mes de postratamiento. Las barras horizontales representan los valores medios de los resultados de los sujetos individuales (puntos).

La Figura 6 representa el incremento de IgG4 en el suero de los sujetos tratados con AllerT o un placebo durante y hasta mes de postratamiento. Las barras horizontales representan los valores medios de los resultados de los sujetos individuales (puntos).

La Figura 7 representa la temporada de polen 2009 en el area de Lausana, en correlation con las puntuaciones medias de un mini Cuestionario de Calidad de Vida de Rinoconjuntivitis. (RQLQ, Juniper, E. F., y otros, Clin. Exp. Allergy, 30: 132-140 (2000)).

Description detallada de la invention

La invencion se describe a continuation a modo de ejemplos con referencia a los siguientes procedimientos experimentales y resultados.

Con el fin de seleccionar los productos con baja union a IgE, tres conjuntos de largos (30-90 aminoacidos) peptidos contiguos superpuestos (COP) se disenaron abarcando todo el alergeno Bet v I, lo que proporciona de este modo todos los posibles eprtopos de celulas T. Un primer conjunto abarca tres peptidos AllerTI, T2 y T3 con capacidad reducida para formar estructuras secundarias como se deriva de un analisis basado en los potenciales eprtopos de IgE y la estructura terciaria de Bet v 1. Un segundo conjunto de tres COPs, AllerTp, T7 y T8, se selecciono. Un tercer grupo contema dos COPs, AllerT4 - T5, que divide aproximadamente el alergeno en dos partes con independencia de eprtopos de IgE y la estructura terciaria. El primer y segundo conjuntos de peptidos se pusieron a prueba a traves de una combination de pruebas de competencia in vitro de IgE y pruebas de puncion cutanea en humanos. La ausencia de reactividad a Bet v 1 se ensayo adicionalmente mediante el uso de ratones sensibilizados con Bet v 1, asi como a traves de la desgranulacion de basofilos humanos. El primer conjunto, llamado AllerT, se uso mas en los seres humanos para el tratamiento de sujetos alergicos a polen de abedul.

Materiales y Metodos

Alergenos

El Bet v 1 purificado recombinante se compro de BIOMAY (Viena, Austria). El extracto de polen de abedul, Aquagel SQ (ALK Wassrig SQ), se obtuvo de ALK Abello, Hosshom, Dinamarca.

Eleccion de peptidos y s^ntesis

El objetivo fue evitar la formation de estructuras terciarias estables de eprtopos de celulas B, mientras se presentan todos los eprtopos de celulas T presentes dentro de la secuencia de Bet v 1. Como resultado, se selecciono el siguiente primer conjunto de COPs que se superponen a lo largo de la secuencia de Bet v 1, concretamente:

Sec. con num de ident.: 1

AllerT1: aa 2-50 de la sec. con num de ident.: 9

GVFNYETETT SVIPAARLFK AFILDGDNLF PKVAPQAISS VENIEGNGG

pI/Mw Teorico: 4.36/5198.82

Sec. con num de ident.: 2

AllerT2: aa 48-118 de la sec. con num de ident.: 9

NGGP GTIKKISFPE GFPFKYVKDR VDEVDHTNFK YNYSVIEGGP IGDTLEKISN EIKIVATPDG GSILKIS

pI/Mw Teorico: 5.72/7742.76

Sec. con num de ident.: 3

AllerT3: aa 106-160 de la sec. con num de ident.: 9

VATPDG GSILKISNKY HTKGDHEVKA EQVKASKEMG ETLLRAVESY LLAHSDAYN pI/Mw Teorico: 6.29/6001.72

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Sec. con num de ident.: 4

AllerT4: aa 2-85 de la sec. con num de ident.: 9

GVFNYETETT SVIP AARLFK AFILDGDNLF PKVAPQA1SS VENIEGNGGP GT1KKISFPE GFPFKYVKDR VDEVDHTNFK YNYS

pI/Mw Teorico: 5.24/9348.49

Sec. con num de ident.: 5

AllerT5: aa 65-160 de la sec. con num de ident.: 9

FKYVKDR VDEVDHTNFK YNYSVIEGGPIGDTLEKISN EIK1VATPDG GSILKISNKY HTKGDHEVKA EQVKASKEMG ETLLRAVESY LLAHSDAYN

pI/Mw Teorico: 5.77/ 10759.06

Sec. con num de ident.: 6

AllerT6: aa 2-49 de la sec. con num de ident.: 9

GVFNYETETT SVIPAARLFK AFILDGDNLF PKVAPQAISS VENIEGNG

pI/Mw Teorico: 4.36 / 5141.77

Sec. con num de ident.: 7

AllerT7: aa 44-118 de la sec. con num de ident.: 9

NIEGNGG PGTIKKISFP EGFPFKYVKD RVDEVDHTNF KYNYSVIEGG PIGDTLEKIS

NEIKIVATPD GGSILKIS

pI/Mw Teorico: 5.24 / 8156.19 Sec. con num de ident.: 8

AllerT8: aa 103-160 de la sec. con num de ident.: 9

IKIVATPD GGSFLKISNK YHTKGDHEVK AEQVKASKEM GETLLRAVES YLLAHSDAYN

pI/Mw Teorico: 7.03 / 6356.22

Sec. con num de ident.: 9

La secuencia de Bet v 1 como se publica bajo Swissprot PI 5494

MGVFNYETET TSVIPAARLF KAFILDGDNL FPKVAPQAIS SVENIEGNGG PGTIKKISFP EGFPFKYVKD RVDEVDHTNF KYNYSVIEGG PIGDTLEKIS NEIKIVATPD GGSFLKISNK YHTKGDHEVK AEQVKASKEM GETLLRAVES YLLAHSDAYN

Los ocho COPs se sintetizaron mediante qdmica de fmoc en fase solida a escala de investigation para permitir la determination de la union a IgE y las primeras pruebas con animales. La HPLC preparativa se uso para obtener mas de 90 % de peptidos puros que se liofilizaron. Los peptidos se resuspendieron en agua a 2 mg/ml y se congelaron en alicuotas.

ELISA competitivo

El Bet v 1 recombinante a 0.5 ^g/m) (rBet v 1 obtenido de Biomay, Austria) se recubrio toda la noche en inmunoplacas de 96 pocillos Nunc Maxisorp® (Life Technologies, Basel, Suiza). Despues de bloquear con 1 % de BSA, se anadieron diez diluciones del suero del paciente. El Abm IgE anti-raton de rata a 2 ^g/ml (PharMingen), BD-Biosciences, San Dingo, CA) se anadio despues y los anticuerpos se revelaron con fosfatasa alcalina acoplada con extravidina (Sigma Diagnostic Inc., St-Louis, MO, Estados Unidos). Los sueros de tres pacientes alergicos se seleccionaron para alto nivel de IgE y clara senal sobre el fondo y se usaron para la prueba de competencia con los peptidos. Las diluciones en serie de cada COP, particularmente AllerT1, AllerT2, AllerT3, AllerT4, AllerT5, AllerT6, AllerT7 y AllerTS, o mezclas de AllerT1 -3, AllerT4-5 y AllerT6-8, comenzando en 10 ^M, se preincubaron con los tres sueros seleccionados toda la noche a 4 °C. Los sueros se incubaron despues en placas de 96 pocillos recubiertas con r Bet v 1 y la union de IgE residual se determino como se describio anteriormente, las diluciones de r Bet v 1 se usaron como control para la inhibition, mientras que la BSA se uso como control para la posible inhibicion no espedfica.

Animales

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los ratones hembra BALB/c de cuatro semanas (H-2d) se obtuvieron de Harlan (AD Horst, Pafses bajos) y se usaron a la edad de 6-8 semanas. Ellos se mantuvieron en condiciones de alojamiento estandar con dieta libre de ovoalbumina (OVA) y agua ad libitum.

Protocolo de Inmunizacion

Los ratones se sensibilizaron mediante inyecciones subcutaneas (s.c.) de concentraciones indicadas de r Bet v 1 (Biomay) que se adsorbieron en 2 mg de Alum (Sigma Chemicals, St-Louis, MO, Estados Unidos) en los intervalos indicados. Las inyecciones se hicieron en el abdomen y en la base de la cola de los ratones

Isotipos de anticuerpos en ratones

La cinetica de respuesta de los anticuerpos IgE, IgG 1 e IgG 2a de suero se determino por ELISA como se describio, (von Gamier, C, y otros, Eur J Immunol, 30(6): 1638-45 (2000) y Barbey, C. y otros, Clin Exp Allergy, 34(4):65462 (2004)). Brevemente, las inmunoplacas de 96 pocillos Nunc Maxisorp® (Life Technologies, Basel, Suiza) se recubrieron con 5 mg/ml de r Bet v 1. Despues de bloquear con 1 % de BSA, las diluciones optimas de suero de raton se anadieron, particularmente 1:5 para IgE, 1:500,000 para IgG 1, 1: 1,000 para IgG 2a respectivamente. El Abm IgE anti-raton de rata a 2 mg/ml (PharMingen, BD Biosciences, San Diego, CA); o IgG 1 anti-raton policlonal purificado de cabra dilmdo 1:3000 (Caltag, WBAG Resources, Zurich, Suiza); o IgG 2a anti-raton policlonal purificado de cabra dilmdo 1:3000 (Caltag) se anadieron como anticuerpos secundarios y se revelaron con fosfatasa alcalina (Sigma Diagnostic Inc., St- Louis, MO, Estados Unidos). Para los isotipos de IgE, la IgE purificados de raton (21-1 A, PharMingen) se uso como estandar en micropocillos recubiertos con IgE anti-raton de rata (R35-72, PharMingen) a 2 mg/ml. Los resultados se expresaron en ng/ml como unidades arbitrarias.

Pruebas de desgranulacion de basofilos

Basotest® (ORPEGEN Pharma Heidelberg, Alemania) se uso para la determinacion cuantitativa de desgranulacion in vitro de basofilos. La sangre heparinizada (100 pl) de donante alergico al polen de abedul se incubo primero con tampon de estimulacion durante 20 minutos a 37 °C, y despues con o sin peptido quimiotactico formilmetionilleucilfenilalanina (fMLP) como controles positivos y negativos respectivamente. Las alfcuotas de sangre se incubaron en paralelo con 100 pl de solucion de alergeno diluido en una solucion salina durante 20 minutos a 37 °C. Una curva de dosis respuesta se realizo con 25, 2.5, 0.25, 0.025 y 0.0025 nanomolar de r Bet v 1, asf como tambien a partir de 10 veces superior con mezclas AllerT (AllerT1-T3, AllerT4-5 y AllerT6-8). El proceso de activacion se detuvo mediante la incubacion de las muestras de sangre a 4 °C durante 10 minutos. A continuacion, las muestras se incubaron durante 20 minutos a +4 °C con 20 pl de anti-IgE conjugado con ficoeritrina (PE) y anti-gp53 (CD63) conjugado con isotiocianato de fluorescema (FITC), los eritrocitos se eliminaron posteriormente mediante la adicion de 2 ml de solucion de lisis (Becton-Dickinson). Las celulas se lavaron dos veces con solucion de PBS y se resuspendieron en 200 pl de solucion de PBS y se analizaron en 1 hora por citofluorimetna (FASCalibur, BectonDickinson). La poblacion de basofilos se enfrento a las celulas PE positivas para anti-IgE y la expresion de gp53 (CD63), se analizo en esta poblacion. La adquisicion se realizo en 1,000 celulas para cada muestra y los resultados se dan como el porcentaje de basofilos (celulas positivas para IgE) que expresan gp53 (CD63). La desgranulacion positiva se fijo en un punto de corte de 15 % de celulas positivas para IgE que expresan CD63 de acuerdo con la notificacion de Basotest®.

Pruebas de puncion cutanea de pacientes alergicos

Se seleccionaron veinte voluntarios que sufren de rinoconjuntivitis o asma estacional durante el penodo de polenosis de abedul, que incluyen siete machos y trece hembras con una media de edad que fue de 30.1 anos (intervalo 23-45 anos). Todos los sujetos reaccionaron a extractos de polen de abedul (Aquagen SQ), y a r Bet v 1 (Biomay) mediante pruebas de puncion cutanea estandar (SPT). La reactividad serologica (anticuerpos IgE) tambien fue positiva para polen de abedul y Bet v 1 como se determino por CAP-RAST. La respuesta alergenica de los peptidos se evaluo in vivo mediante la SPT con cada uno de los 5 peptidos (AllerT1, AllerT2, AllerT3, AllerT4 y AllerT5) y con los 2 conjuntos (AllerT1-3 y AllerT4-5) en todos los pacientes. Para cada peptido, se aplico una gota de 20 pl en el antebrazo a 3 concentraciones diferentes (10, 1 y 0.1 pM). El extracto del polen de abedul (Aquagen SQ, ALK-Abello) y Bet v 1 (Biomay) se probaron ademas con SPT a 3 concentraciones 10 veces mas baja que la usada para los peptidos, es decir 100,000, 10,000 y 1,000 SQ para polen de abedul asf como 1, 0.1 y 0.01 pM para Bet v 1. El diametro de la roncha se evaluo tomando el diametro maximo. La SPT se considero positiva cuando el diametro de la roncha era de 4 mm o mas con un eritema (Hoffmann, A. y otros, J Allergy Clin Immunol, 99(2):227-32 (1997). Las reacciones que resultan en un diametro de la roncha inferior a 4 mm, aunque superior a 2 mm, tambien se registraron y se clasifican como "dudosa".

Resultados experimentales

Eleccion de peptidos

Bet v 1 es una protema madura de 159 aminoacidos despues de la remocion de la primera metionina (NCBI X1 5877, Swissprot P 15494) y esta presente en diferentes isoformas en los granos de polen de abedul (Schenk, M.F. y otros,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

BMC Genomics, 7:168 (2006)). Ademas, la familia Bet v 1 muestra una homologfa de secuencia con algunos alergenos de alimentos como el apio (NCBI: Estructura IBTV, 1FM4_A, 2BKO_A). Una fuerte reaccion alergica cruzada se documenta entre las especies Fagales (abedul, avellana, aliso y el carpe). La comparacion de secuencias Bet v 1 entre estas especies mostro regiones de conservacion de secuencia particularmente elevada que representan candidatos por ser los epftopos de celulas B responsables de la reaccion alergica tal como se propone por Spangfort et al. (Spangfort, M.D. y otros, Int Arch Allergy Immunol, 113(1-3):243-5 (1997)). Tres regiones de sec. con num de ident.: 9 pueden proponerse para union a IgE, concretamente, una primera region, epftopo B1, desde aminoacidos (aa) 97-122 combinado con aa 132-142; una segunda region, epftopo B2, que abarca aa 16-24 en combinacion con aa 143-155; y una tercera region, epftopo B3 que contiene el lazo con homologfa a la secuencia GXGXXG de union a GTP situada en aa 42-53. Por otro lado, los epftopos de celulas T se encuentran dispersas en la secuencia de Bet v 1, excepto para los aminoacidos 49-60, que contiene el sitio de union GTP potencial GXGXXG.

Los epftopos potenciales pueden predecirse mediante el uso de herramientas computacionales para la prediccion de epftopos como se propone en los recursos de bases de datos y analisis de epftopos inmunes (IEDB) (
http://immuneepitope.org/). Particularmente, ElliPro predice epftopos de anticuerpos lineales y discontinuos basados en la estructura 3D de un antfgeno proteico. Dentro de los epftopos lineales pronosticados por ElliPro, se encontro un epftopo potencial que se corresponde con el epftopo B3 (lazo 41-52) pronosticado por Spangfort et al. Tres epftopos discontinuos se pronosticaron por ElliPro los cuales difenan de los propuestos por Spangfort y otros. 1997. El primero incluye los aa 1-4 combinados con los aa 123-126; el segundo incluye aa 92-95 con el aminoacido 127; el tercero incluye aa 10-15 con aa 106-114.

La combinacion de los conocimientos sobre la protema madura al faltar el primer residuo y la prediccion de un epftopo lineal potencial entre los aminoacidos 42 a 53, el primer COP tiene que comenzar en el aminoacido 2 y terminar entre los aa 42 y 52. El segundo COP tiene que comenzar entre los aminoacidos 42 y 52, para evitar la formacion del epftopo lineal original, y que pueda tener una superposicion con el primer COP. La extension de la superposicion se determina por el hecho de que ningun epftopo de celulas T se encuentra dentro de la region de aa 49-60. Asf, la superposicion puede variar desde un mmimo de 0 si el extremo del primer COP esta entre los aminoacidos 49 y 53, hasta un maximo de 11 si el extremo del primer COP esta entre el aa 42 y 48. El extremo del segundo COP tiene que ser colocado entre el aa 96 y 131 para prevenir la formacion de epftopo B1, asf como tambien el segundo epftopo predicho por ElliPro anteriormente citado. El inicio del tercer COP tiene que estar situado entre el aa 96 y 131 por las razones citadas anteriormente para prevenir la formacion de epftopo de celulas B. Las superposiciones puede variar de 5 a 20 aminoacidos para proporcionar todos los posibles epftopes de celulas T.

En base a la secuencia P 15494 (Swissprot), usada por otros en forma recombinante para los ensayos clrnicos (Pauli, G. y otros, J Allergy Clin Immunol, 122(5):951-60 (2008)), y las predicciones anteriores, se disenaron tres conjuntos de peptidos que abarcan la secuencia completa de Bet v 1. Los conjuntos AllerT1, -T2 y -T3 (sec. con num de ident.: 1,2 y 3 respectivamente), asf como AllerT6, -T7 y -T8 (sec. con num de ident.: 6, 7 y 8, respectivamente), se disenaron de acuerdo con la regla descrita anteriormente, concretamente posee puntos finales y superposiciones que previenen la formacion de los epftopos discontinuos de celulas B predichos. Particularmente, los peptidos se superponen en sus extremos por los aminoacidos 3 y 13 entre AllerT1-AllerT2 y AllerT2-AllerT3 respectivamente. Las superposiciones son de 6 y 16 aminoacidos respectivamente, entre AllerT6-AllerT7 y AllerT7-AllerT8 respectivamente. Otro conjunto de los COPs, concretamente AllerT4-T5 se eligio sin tomar en cuenta las predicciones anteriores y se compone de solo dos peptidos que se superponen por 21 aminoacidos. Los epftopos B1 y B3, anteriormente mencionados, estan totalmente presentes en AllerT5 y AllerT4 respectivamente, mientras que el segundo epftopo discontinuo predicho por ElliPro esta presente en AllerT5. Todos los peptidos contiguos superpuestos (COPs) se usaron por separados o mezclados en cantidades equimolares en experimentos adicionales.

Union a IgE de los COPs seleccionados comparado r Bet v 1

Los COPs se probaron in vitro para la reduccion de la union IgE por ELISA competitivo como se describe en materiales y metodos. Como se ve en la Fig. 1, r Bet v 1 compitio con IgE presente en el suero a concentraciones que van desde 10-10 a 10"5 M (50 % de inhibicion) en dependencia del suero del donante, mientras que BSA no mostro inhibicion detectable en todas las concentraciones ensayadas. Los Aller T1, T2 y T3 ya sean solos (Fig. IB) o en combinacion equimolar (Fig. IA) no mostraron competencia. El mismo resultado se obtuvo con peptidos seleccionados de acuerdo con las mismas reglas, concretamente AllerT6, T7 y T8 (Fig. ID). Los Aller T4 y T5 solo mostraron un resultado comparable (Fig. 1C), mientras que, sorprendentemente, la combinacion de Aller T4 con Aller T5 mostro algo de inhibicion, aunque al menos 1,000 veces la concentracion mas alta que r Bet v 1 (Figs. 1A y C). Los ensayos de competencia se llevaron a cabo con sueros de tres pacientes alergicos, lo que confirma la ausencia de competencia de los conjuntos combinados AllerT1, T2 y T3, asf como AllerT6, T7 y T8 con Bet v 1 para la union IgE (datos no mostrados).

Efecto de los COPs seleccionados en ratones sensibilizados con Bet v 1

Una primera serie de ratones se trataron de acuerdo con el protocolo desarrollado por Hufnagl, K. y otros, J Allergy CHn Immunol, 116(2):370-6 (2005), concretamente, mediante tres inyecciones intraperitoneales (i.p.) y se retaron mediante aerosol de polen del arbol, de forma manual, IgE contra Bet v 1 fue indetectable despues del periodo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

inyeccion, lo que indica que los ratones no se sensibilizaron. De acuerdo con ello, fallo el reto del polen del arbol en aumentar la presencia de eosinofilos en el lavado del fluido bronquial (datos no mostrados). De este modo se aplico el protocolo de sensibilizacion usado en los estudios murinos anteriores para PLA2 del veneno de abeja (von Gamier, C. y otros, Eur J Immunol, 30(6):1638-45 (2000)). Los ratones se sensibilizaron mediante seis inyecciones subcutaneas de r Bet v 1 en hidroxido de aluminio a intervalos de 2 semanas. Se ensayaron concentraciones que van de 0.1 a 10 |jg. Interesantemente, la IgE espedfica a Bet v 1 aumento significativamente solo despues de la cuarta inyeccion en ratones sensibilizados con 0.1 mg, lo que puede explicar por que fallo el experimento anterior. Los niveles de IgG2 (correspondientes a IgG4 protectora en humanos) comenzaron a aumentar despues de la 4ta inyeccion y aumentaron de forma constante a partir de entonces, mostrando un maximo despues de 6 inyecciones. IgG2a espedfica a Bet v 1 pareda aumentar ligeramente mas tarde que los niveles de IgE espedfica.

La sensibilizacion de los ratones se probo mediante inyeccion i.p. de una dosis alta (30 |jg) de r Bet v 1 y se registra la temperatura rectal. Como se ve en la Fig. 3, se observa una cafda de temperatura dentro de los 30 minutos posteriores a la inyeccion de r Bet v 1 que muestra una fuerte respuesta alergica sistemica. La inyeccion de 150 jg de AllerT no dio lugar a un cambio de temperatura, lo que indica un incremento de la seguridad del enfoque basado en el COP por encima de r Bet v 1, al menos en los animales. No se observa ninguna diferencia significativa entre los ratones sensibilizados con 0.1, 1.0 o 10 jg de r Bet v 1 (datos no mostrados). Por lo tanto, los ratones sensibilizados con r Bet v 1 no mostraron una disminucion de la temperatura cuando se enfrentan a AllerT, lo que se asemeja a una prueba de choque anafilactico en humanos.

Ensayos de desgranulacion de basofilos

Con el fin de verificar aun mas la seguridad de AllerT, los COPs se pusieron a prueba en un ensayo de desgranulacion de basofilos (Basotest®). Los basofilos son desgranulados cuando se estimulan con r Bet v 1 de una manera dependiente de la concentracion (Fig. 4). Por el contrario, los COPs individuales (AllerT1 a AllerT8) y combinaciones son incapaces de inducir la desgranulacion por encima del nivel observado con un control negativo. No se observo desgranulacion a traves de un intervalo de concentraciones de COPs hasta 1,000 veces que la concentracion de Bet v 1 capaz de inducir la desgranulacion media maxima (Fig. 4). La ausencia de desgranulacion de basofilos indica un riesgo potencialmente reducido de reaccion alergica inmediata tras la aplicacion en humanos.

Ensayos de pruebas de puncion cutanea (SPT)

Las SPT con los COPs AllerT se realizaron en 20 voluntarios los que presentan smtomas de rinitis alergica confirmados ya sea por un CAP RAST positivo y/o por reaccion cutanea positiva al polen de abedul (Tabla I). Como era de esperar, las SPT fueron positivas en todos los voluntarios, ya sea con extractos de polen de abedul o Bet v 1 recombinante en concentraciones de 100,000 de SQ y 1 jM respectivamente (Tabla II A). A concentraciones mas bajas, 80 a 85 % de los sujetos mostraron reaccion positiva a una dilucion de 10 veces, mientras que de 5 a 10 % de los sujetos mostraron reactividad a una dilucion de 100 veces de polen de abedul o r Bet v 1. Las concentraciones de los peptidos tan elevadas como 10 veces con respecto a r Bet v 1 se ensayaron (hasta 10 jM). Ninguno de los COPs mostro reacciones cutaneas positivas por encima del umbral definido, concretamente, un diametro superior de 4 mm de la roncha con eritema (ejemplo de los brazos de un sujeto en la Fig. 2).

Tabla I: Caractensticas de los sujetos

: Sujetos

Cantidad de sujetos: 20

Edad media (intervalo): 30.1 anos (23 -45)

Machos / hembras: 7 / 13

Asma: 7

Rinitis: 20

Flujo maximo (% valor predictivo): 93.75 L/min (61-117)

IgE abedul (kU/L) (intervalo): 29.34 (0.7 - 100)

IgE Bet v 1 (kU/L) (intervalo): 29.48 (0.35 - 100)

Tabla II. A: Resultados de los ensayos de pruebas de puncion cutanea

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Reacciones cutaneas positivas:

: Diluciones

: 1:1 1:10 1:100

Abedul (100'000 SQ): 20 17 1

r Bet v 1 (1|jM): 20 16 2

AllerT1 (10jM): 0 0 0

AllerT2 (10jM): 0 0 0

AllerT3 (10jM): 0 0 0

Mezcla AllerT1-3 (10jM): 0 0 0

AllerT4 (10jM): 0 0 0

AllerT5 (10jM): 0 0 0

Mezcla AllerT4-5 (10jM): 0 0 0

Las reacciones de la piel por debajo del umbral definido se observaron ocasionalmente en algunos sujetos. Tales reacciones dudosas se anotaron cuando se observa un edema con roncha detectable por debajo de 4 mm con o sin eritema (Tabla II B). Tales reacciones se observaron con baja concentracion ya sea de polen de abedul o r Bet v 1 (datos no mostrados). Las pruebas de puncion cutanea pueden provocar irritaciones locales independientes de los productos en algunos sujetos. De hecho, una reaccion mas baja que el umbral definido se registro esporadicamente en uno u otro voluntario. Suponiendo reacciones tales como antecedente, la precaucion estadfstica lleva a definir las reacciones dudosas en mas de tres sujetos como posiblemente significativo. La combinacion Aller T4-T5 provoco reacciones en 6 voluntarios en la concentracion mas alta (Tabla II B) lo que confirma por tanto su capacidad baja pero significativa de unirse IgE observada en ELISA competitivo.

Tabla II B: Puncion cutanea por debajo del umbral (dudosa)

Reactividad menor que el umbral definido:

: Diluciones

: 1:1 1:10 1:100

AllerT1 (10jM): 2 0 0

AllerT2 (10jM): 0 0 0

AllerT3 (10jM): 0 1 0

Mezcla AllerT1-3 (10jM): 0 0 0

AllerT4 (10jM): 0 0 1

AllerT5 (10jM): 1 0 0

Mezcla AllerT4-5 (10jM): 6 0 1

Estudio de toxicolog^a en ratones

Los peptidos contiguos superpuestos (COPs) han demostrado una excelente seguridad en pacientes alergicos al veneno de abejas (Fellrath y otros, J Allergy Clin. Immunol, 111 :854-861 (2003)). Las respuestas inmunologicas se parecieron a los obtenidos cuando se aplica SIT, lo que indica, pero no demuestra, una posible eficacia. La aplicacion del mismo enfoque a la alergia al polen de abedul se presenta aqrn. Sorprendentemente, un conjunto de COP derivados de la secuencia de Bet v 1 mostro union residual a IgE. Dado que los peptidos que componen este conjunto, concretamente AllerT4 y AllerT5, ellos mismos no muestran tal union, una interaccion de los dos peptidos en solucion es la causa mas probable de la aparicion de un epftopo de celulas B reconocido por IgE. Tal union residual se observo en ensayos de competencia con los sueros de dos pacientes asf como tambien en 6 voluntarios analizados por pruebas cutaneas. Queda por demostar si la mezcla AllerT4-T5 resulta en pocas moleculas con la conformacion original de Bet v 1 o si el epftopo de celulas B reconstruido se reconoce parcialmente por IgE con baja afinidad. Los dos conjuntos de COPs combinando Aller T1, T2 y T3 en un lado y AllerT6, T7 y T8 en el otro lado, no muestran ninguna union de IgE detectable mediante el uso ya sea de ELISA competitivo, ensayos de desgranulacion o por pruebas de puncion cutanea.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Por lo tanto, se puede esperar que la combinacion de AllerTI, T2 y T3, llamada AllerT, no provoque respuestas alergicas mediadas por IgE en humanos.

Un estudio toxicologico regulador se llevo a cabo en ratones por la CERB (Francia) para preparar el ensayo clmico en humanos. En el estudio participaron 40 animales divididos en 2 grupos de 10 machos y 10 hembras, uno dosificado con el vehmulo, concretamente hidroxido de aluminio, y el otro dosificado con AllerT (una mezcla equimolar de COPs AllerTI, AllerT2 y AllerT3) a 40 pg/animal. La asignacion de cada animal al tratamiento se determino al azar antes del inicio del estudio. La homogeneidad de los grupos fue validado en el criterio de peso corporal medido en el dfa de la aleatorizacion, de forma separada para machos y hembras. La dosis de 40 pg por animal corresponde a un cuarto de la dosis de mantenimiento que se preve usar en humanos (160 pg). AllerT o sus vehmulos se administraron en los dfas 1, 4, 8, 12 y 26 en aproximadamente el mismo penodo del dfa, por via subcutanea. Para cada administracion, se administra por animal 200 pl de AllerT o del vehmulo. No se observa mortalidad en los animales dosificados ya sea con el vehmulo o con AllerT. No se observan cambios en el consumo de alimentos o el peso corporal.

Durante las observaciones generales, no se observan signos clmicos en los animales tratados con el vehmulo o con AllerT. No se observan efectos sobre los parametros hematologicos y de coagulacion en los ratones dosificados con AllerT, en comparacion con el grupo de vehmulo. No se observan efectos sobre los parametros de qrnmica clmica o en el analisis de orina en los animales dosificados con AllerT, cualquiera sea el sexo. No se observan anormalidades atribuidas al vehmulo o a AllerT en los organos examinados en la necropsia. Por lo tanto no se atribuye mortalidad al tratamiento con AllerT a 40 pg/animal, en las condiciones experimentales adoptadas, y no se observan senales de toxicidad. A excepcion de los cambios histologicos en el sitio de la inyeccion debido al uso del adyuvante hidroxido de aluminio, no se observan cambios anatomicos e histologicos en los organos propensos a ser el objetivo de los tratamientos con peptidos o productos recombinantes. Una prueba de inmunogenicidad limitada mostro que, como se esperaba, la inyeccion AllerT induce tanto IgG espedfica, que incluye IgG2, en ratones.

Tratamiento de los sujetos humanos con AllerT en un ensayo ctfnico fase I/IIa

Se llevo a cabo un ensayo clmico unicentrico fase I/IIa, aleatorizado, controlado con placebo en Lausana (Suiza), que incluye voluntarios con rinitis alergica y asma a polen de abedul para evaluar la seguridad, inmunogenicidad y eficacia potencial de AllerT, basados en peptidos contiguos superpuestos (COPs) derivados de Bet v 1, el principal alergeno del polen de abedul. Antes de la temporada del polen, AllerT en el adyuvante de hidroxido de aluminio se inyecto por via subcutanea a 15 voluntarios adultos (18-45 anos) en el dfa 0, dfa 7, dfa 14, el dfa 21 y el dfa 51. Los voluntarios de control (n = 5) recibieron unicamente hidroxido de aluminio como placebo. Los criterios de valoracion inmunologicos y/o pruebas de seguridad biologica se llevaron a cabo despues de cada visita, hasta un mes despues del tratamiento. Durante la temporada del polen de abedul del 2009, los voluntarios se evaluaron sobre la base de los 32 artmulos del Cuestionario de Calidad de Vida (MiniRQLQ) y Rinitis y en los smtomas de asma.

En general AllerT fue seguro y todos los sujetos completaron el protocolo de inyeccion. Los eventos adversos locales fueron leves y no fueron diferentes del placebo. No se informaron eventos adversos graves, reacciones alergicas inmediatas y valores de laboratorio anormales clmicamente significativos relacionados con AllerT. En el grupo activo, AllerT indujo una respuesta celular inmune temprana vigorosa espedfica a Bet v 1, marcada por INFganma a asociado a vacuna y aumento de mas de 5 veces en la secrecion de IL-10 como se discrimino en PBMCs (Fig. 5). Esto contribuyo a un aumento de al menos 10 veces en el aumento del nivel de IgG4 espedfico para anti-Bet v 1 (Fig. 6), mientras que la respuesta de IgE fue limitada. Durante la temporada de exposicion, se observa una marcada mejona general en la puntuacion de los smtomas de MiniRQLQ y asma en comparacion con el placebo. Asf, la inmunoterapia con una mezcla de tres COPs derivados de Bet v 1 (AllerT) fue segura e inmunogenica en voluntarios con rinitis alergica y asma al polen de abedul, y dio lugar a una marcada mejona de los smtomas estacionales y calidad de vida (Fig. 7).

A partir de estos experimentos se puede concluir que Aller T, una combinacion de los tres peptidos Aller T1, T2 y T3, representa un mejor candidato para el tratamiento de la alergia al polen de abedul que la combinacion de Aller T4 y T5. Tambien se contemplan homologos de los COPs Aller T1, T2 y T3, por cambios de aminoacidos dentro de cada peptido para producir homologos de estos en donde se elimina la reactividad de los homologos a anticuerpos IgE de los pacientes que son alergicos a polen de abedul, mientras que con los linfocitos T aun se mantiene. Ademas se contemplan homologos de los COPs desplazando los lfmites de las COPs en Bet v1 importante alergeno del polen de abedul. Tales homologos resultaran en productos con perfiles equivalentes de union a IgE no detectable y la actividad de linfocitos T. Tales productos presentaran el mismo potencial para la seguridad y la eficacia en humanos como Aller T y pueden considerase como equivalentes en terminos de posibilidades de tratamiento, a menos que se indique lo contrario. Los homologos adecuados caracterizados por ninguna reactividad contra anticuerpos IgE de polen de abedul mientras se mantiene la reactividad con los linfocitos T pueden identificarse por los metodos descritos en la presente descripcion.

Numerosos tratamientos y variaciones en la practica de la invencion se preve se susciten a aquellos expertos en la materia tras la consideracion de las modalidades actualmente preferidas de esta. En consecuencia, las unicas limitaciones que se debe colocar sobre el alcance de la invencion son las que aparecen en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende una pluralidad de fragmentos de peptidos contiguos superpuestos que comprende un primer peptido que comprende la secuencia desde el aminoacido 2 hasta los aminoacidos 42-52 de sec. con num. de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene; un segundo polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos 42-52 para los aminoacidos 96-131 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene y un tercer peptido que comprende la secuencia de aminoacidos 96-131 para el aminoacido 160 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene.
2. La composicion de la reivindicacion 1 en donde el primer y segundo peptidos se superponen entre sf por 1 a 11 aminoacidos.
3. La composicion de la reivindicacion 1 en donde el primer y segundo peptidos se superponen entre sf por 5 a 20 aminoacidos.
4. La composicion de la reivindicacion 1 que comprende una combinacion del peptido que tiene la sec. con num. de ident.: 1, el peptido que tiene sec. con num. de ident.: 2 y el peptido que tiene la sec. con num de ident.: 3.
5. La composicion de la reivindicacion 1 que comprende una combinacion del peptido que tiene la sec. con num. de ident.: 6, el peptido que tiene la sec. con num de ident.: 7 y el peptido que tiene la sec. con num de ident.: 8.
6. Un peptido que consiste en la secuencia desde el aminoacido 2 hasta los aminoacidos 42-52 de sec. con num. de ident.: 9, o

un peptido que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con un peptido que consiste en la secuencia desde el aminoacido 2 hasta los aminoacidos 42-52 de sec. con num. de ident.: 9,

en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de

abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de

abedul se mantiene.
7. El peptido de la reivindicacion 6 que tiene la secuencia de sec. con num. de ident.: 1.
8. El peptido de la reivindicacion 6 que tiene la secuencia de sec. con num. de ident.: 6.
9. Un peptido que comprende la secuencia desde los aminoacidos 42-52 para los aminoacidos 96-131 de sec.

con num de ident.: 9, o

un peptido que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con un peptido que comprende la secuencia desde los aminoacidos 42-52 hasta los aminoacidos 96-131 de sec. con num. de ident.: 9, en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de

abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de

abedul se mantiene.
10. El peptido de la reivindicacion 9 que tiene la secuencia de sec. con num. de ident.: 2.
11. El peptido de la reivindicacion 9 que tiene la secuencia de sec. con num. de ident.: 7.
12. Un peptido que consiste en la secuencia desde los aminoacidos 96-131 hasta el aminoacido 160 de sec. con num. de ident.: 9, o

un peptido que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con un peptido que consiste en la secuencia desde los aminoacidos 96-131 hasta el aminoacido 160 de sec. con num. de ident.: 9,

en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de

abedul se elimina mientras que la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de

abedul se mantiene.
13. El peptido de la reivindicacion 12 que tiene la secuencia de sec. con num. de ident.: 3.
14. El peptido de la reivindicacion 12 que tiene la secuencia de sec. con num. de ident.: 8.
15. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que se proporciona en forma de polvo seco.

10

15

20

25
16. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 9 o 12 que comprende ademas un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable.
17. La composicion de la reivindicacion 16 que comprende ademas un adyuvante.
18. Uno o mas alergenos seleccionado del grupo que consiste en un primer peptido que consiste en la secuencia

desde el aminoacido 2 hasta aminoacidos 42-52 de sec. con num. de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a los anticuerpos IgE de los sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras que la

reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene; un segundo

polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos 42-52 para los aminoacidos 96-131 de la sec. con num de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a anticuerpos IgE de sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene; un tercer peptido que consiste en la secuencia desde aminoacidos 96-131 hasta el aminoacidos 160 de sec. con num. de ident.: 9 en donde la reactividad de dicho peptido a anticuerpos IgE de sujetos que son alergicos a polen de abedul se elimina mientras la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alergicos a polen de abedul se mantiene, para uso en inmunoterapia espedfica contra alergias a polen de abedul.
19. El uno o mas alergenos para usar de conformidad con la reivindicacion 18 en donde los peptidos estan en una forma adecuada para tecnicas de inyeccion intradermal, inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular, inyeccion intravenosa, transdermica, intranasal, oral, sublingual, intraocular, o intratecal.
20. Una composicion que comprende una pluralidad de fragmentos de peptidos contiguos superpuestos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para usar en inmunoterapia espedfica contra alergias al polen de abedul.