ES2738636T3 - Composición para la administración intradérmica de alergenos polimerizados - Google Patents

Abstract

La composición comprende al menos un alergoide, obtenido mediante modificación química de un extracto alergénico o de un alérgeno individualizado, para su administración intradérmica, útil para el tratamiento de alergias.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para la administración intradérmica de alérgenos polimerizados

Campo de la invención

La invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende al menos un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual, para la administración intradérmica de dicho alergoide para uso en el tratamiento de alergias.

Antecedentes de la invención

La alergia, en términos generales, es una reacción o respuesta anormal o exagerada del sistema inmunitario frente a sustancias conocidas como alérgenos, que conduce a la síntesis de anticuerpos o inmunoglobulinas de la clase IgE (IgE) en los individuos alérgicos, tanto humanos como en algunas especies animales (gatos, perros, caballos, etc.), y que en la población sana, sin embargo, son perfectamente tolerados.

Los alérgenos pueden encontrarse en alimentos, polen de plantas, ácaros del polvo, caspa de animales, venenos de insectos, etc. La IUIS (“International Union of Immunologic Societies”) ha establecido un sistema de nomenclatura para identificar los alérgenos presentes en una fuente de sensibilización consistente en emplear las 3 primeras letras del género de la fuente sensibilizante, seguidas por la primera letra de la especie y de un número arábigo que indica el orden del descubrimiento del alérgeno; a modo ilustrativo, en el caso del ácaro del polvo doméstico Dermatophagoides pteronyssinus, su primer alérgeno descubierto se denominó Derp1.

La patofisiología de la reacción alérgica mediada por la IgE (Tipo I) se pone de manifiesto en los pacientes alérgicos, tanto humanos como los de algunas especies de animales, tras la unión del alérgeno con las IgE específicas del mismo, fijadas en la superficie de los mastocitos o células cebadas. Las señales ocasionadas tras la fijación conducen a la liberación de los mediadores almacenados en el mastocito. Los mediadores pueden encontrarse preformados (histamina, triptasa, etc.) o bien pueden responder a síntesis ulterior por acción de la ciclooxigenasa (prostaglandina D2 y tromboxano A2) y de la lipooxigenasa (leucotrienos B4, C4, D4, E4), así como a la secreción de citoquinas. La histamina es el mediador responsable de la mayor parte de los fenómenos asociados con la fase inmediata de la reacción alérgica.

El diagnóstico etiológico (fuente sensibilizante) en los pacientes alérgicos se suele realizar mediante las denominadas pruebas cutáneas, que pueden ser clasificadas en pruebas de punción o intradérmicas, con el extracto alergénico obtenido a partir de la fuente de sensibilización. Cuando el extracto alergénico es introducido en la piel se produce una reacción local inflamatoria en forma de pápula y eritema a los pocos minutos que da lugar a la conocida como respuesta de tipo inmediato. La medida de las áreas o diámetros de las respuestas en forma de pápula o eritema permite establecer el diagnóstico etiológico, así como la sensibilidad del paciente a la fuente de sensibilización o extracto alergénico empleado. La prueba cutánea intradérmica está documentada ampliamente como de una mayor sensibilidad que la prueba de punción y, en general, emplea diluciones entre 1:100 y 1:1.000 de las concentraciones que se emplean en las pruebas de punción. Otra alternativa del diagnóstico etiológico, que muestra una elevada correlación con la prueba cutánea, es la cuantificación de la IgE específica del extracto alergénico presente en el suero de los pacientes mediante técnicas de ELISA.

El tratamiento de las enfermedades alérgicas parte inicialmente de establecer el adecuado diagnóstico etiológico que permite identificar la fuente de sensibilización alergénica, e incluye una serie de medidas preventivas y terapéuticas. Evitar o minimizar la exposición a la fuente de sensibilización alergénica constituye el primer paso del tratamiento. El segundo paso incluye el tratamiento farmacológico de los pacientes alérgicos y comprende (i) un tratamiento preventivo conducente a evitar o minimizar la liberación de los mediadores del mastocito, que con independencia de la patología, puede emplear diversos medicamentos, tales como las cromonas o las teofilinas, (ii) un tratamiento sintomático para evitar los efectos biológicos causados por los mediadores una vez que se han liberado, para el que se emplean los antihistamínicos o los antileucotrienos, y (iii) un tratamiento de fondo que permita resolver los fenómenos inflamatorios que se producen en el órgano diana (rinitis, asma), para el que se emplean, por ejemplo, los corticoides.

El tratamiento etiológico (específico) de la alergia incluye la inmunoterapia. La inmunoterapia con extractos alergénicos obtenidos a partir de la fuente de sensibilización es un tratamiento alternativo y concomitante con el farmacológico, reconocido por la OMS (Organización Mundial de la Salud) como el único tratamiento con capacidad de revertir a la normalidad la respuesta inmune alterada en el paciente alérgico. En términos generales, comprende la administración de dosis crecientes (volumen y concentración) del extracto alergénico hasta alcanzar una dosis máxima de mantenimiento. La inmunoterapia específica convencional con extractos alergénicos considera la administración del extracto por vía subcutánea exclusivamente desde hace más de 100 años, y, recientemente, otra nueva vía de administración, la vía sublingual, que, sobre las mismas consideraciones de pautado, volumen y concentraciones 10 veces superiores a las empleadas en la vía de administración convencional subcutánea puede representar una alternativa. El documento GB1282163A divulga la administración subcutánea de una composición que contiene alergoides para tratar una alergia hacia un alergeno en un sujeto que padece dicha alergia y las tasas de dosis varían según el estado alérgico del paciente. El documento US4269764A divulga el uso de una composición que contiene alergoides que se administra por vía intracutánea a un volumen de 0,02 ml en el contexto de titulación cutánea. Malet et al., Allergologia et Immunopathologia, Garsi, Madrid, ES, vol. 22, no. 5, 1 Septiembre 1994 divulga la administración subcutánea de una composición que contiene alergoides para tratar una alergia a los ácaros del polvo doméstico.

El problema derivado de la práctica clínica de la inmunoterapia específica con extractos alergénicos, bien por vía subcutánea o sublingual, es común y referente a la seguridad en términos de su capacidad de inducir respuestas alérgicas tras la administración de las dosis y de un modo especial en el escalado a la dosis de mantenimiento. Este hecho obliga a que el paciente se mantenga en observación durante, al menos, 20 minutos tras la administración de cada dosis. Por otro lado, el pautado hasta alcanzar la dosis máxima representa tediosos ensayos de búsqueda de dosis en función de la sensibilidad de los pacientes, además de que origina múltiples tipos de pautas de administración para minimizar el número de dosis a administrar hasta alcanzar la dosis de mantenimiento.

Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar un sistema alternativo a los existentes que permita subsanar la totalidad o parte de los problemas mencionados previamente; en concreto, sería conveniente aumentar la seguridad de un tratamiento de inmunoterapia en términos de reducción de respuestas alérgicas tras la administración de las dosis y en el escalado a la dosis de mantenimiento; también sería conveniente reducir los tediosos ensayos de búsqueda de dosis hasta alcanzar la dosis máxima a administrar a los pacientes y minimizar el número de dosis a administrar hasta alcanzar la dosis de mantenimiento.

Breve descripción de la invención

Los inventores han observado que los denominados alergoides, obtenidos mediante polimerización de extractos alergénicos de, por ejemplo, Phleum pratense (Ejemplos 1-5), Parietaria judaica y Artemisia vulgaris (Ejemplo 7), Dermatophagoides pteronyssinus (Ejemplos 8 y 9) y Apis mellifera (Ejemplos 10 y 11), con glutaraldehído, muestran una menor alergenicidad (capacidad de fijación de IgE específica de alérgeno) que los extractos alergénicos nativos correspondientes, tal como se pone de manifiesto en las determinaciones de los valores Ag⁵⁰ y liberación de histamina, pero mantienen la inmunogenicidad, tal como lo muestran los resultados derivados de los estudios de inmunización realizados con extractos alergénicos de Phleum pratense nativos y polimerizados con glutaraldehído, en conejos, empleando las vías de administración subcutánea e intradérmica.

La invención contempla alergoides que se van a administrar por vía intradérmica para uso en tratar enfermedades alérgicas mediante inmunoterapia. Una ventaja asociada con ello consiste en la eliminación de la dosis de escalado para alcanzar la dosis máxima tolerada por el paciente, dado que en el diseño del alergoide (extracto alergénico modificado químicamente, por ejemplo, extracto alergénico polimerizado con glutaraldehído), se considera una dosis de administración única, establecida en términos de seguridad como la dilución de alergoide que negativiza la prueba cutánea intradérmica realizada con el mismo. La invención muestra que esta dosis es segura, dado que diagnóstico e inmunoterapia se realizan por la misma vía intradérmica y, por tanto, es posible fijar para cada alérgeno la dosis máxima tolerada en función de la sensibilidad del paciente, al ser ensayada sobre una población específicamente sensibilizada al alérgeno en cuestión. Además, la invención elimina la diversidad de los volúmenes a administrar en la inmunoterapia con extractos alergénicos, factor éste que origina posibilidades de inducción de reacciones por sobredosis en la práctica clínica. Efectivamente, el volumen máximo a administrar siempre será de 0,1 ml, dado que esta acotación es inherente a la técnica de administración intradérmica.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un sujeto que padece una alergia hacia un alergeno, en donde la composición se va a administrar por vía intradérmica, la composición comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido por medio de modificación química de dicho alergeno, en donde dicho alergoide está presente en la composición a la dosis máxima no reactiva y en donde dicha dosis máxima no reactiva corresponde a la concentración del alergoide que, administrada por la vía intradérmica, da negativo en la prueba cutánea, ensayada en una población que está específicamente sensibilizada a dicho alergeno por medio de un estudio de titulación final con el alergoide en una población de pacientes sensibilizados al alergeno.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit farmacéutico que comprende una composición farmacéutica en donde la composición se va a administrar por vía intradérmica, la composición comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante modificación química de dicho alérgeno, en donde dicho alergoide está presente en la composición a la dosis máxima no reactiva y en donde dicha dosis máxima no reactiva corresponde a la concentración del alergoide que, administrada por la vía intradérmica, da negativo en la prueba cutánea, ensayada en una población que está específicamente sensibilizada hacia dicho alergeno por medio de un estudio de titulación final con el alergoide en una población de pacientes sensibilizada hacia el alergeno y los medios e instrucciones para administrar dicha composición para uso en el tratamiento de un sujeto que padece una alergia hacia un alergeno.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un título de antisuero obtenido en conejo inmunizado con Phleum pratense nativo administrado por vía subcutánea.

La figura 2 muestra un título de antisuero obtenido en conejo inmunizado con Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído administrado por vía subcutánea.

La figura 3 muestra un título de antisuero obtenido en conejo inmunizado con Phleum pratense nativo administrado por vía intradérmica.

La figura 4 muestra un título de antisuero obtenido en conejo inmunizado con Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído administrado por vía intradérmica.

La figura 5 muestra la liberación de histamina de un extracto alergénico de Phleum pratense nativo frente a un extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído, utilizando sangre completa humana.

La figura 6 muestra una comparación determinada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coomassie entre el extracto de Parietaria judaica nativo (Par j 001-10, carril 2) y el polimerizado con glutaraldehído (Par j 003p-11, carriles 3, 4 y 5).

La figura 7 muestra una comparación determinada mediante inmunotransferencia entre el extracto de Parietaria judaica nativo (Par j 001-10, carril 2) y el polimerizado con glutaraldehído (Par j 003p-11, carril 3).

La figura 8 muestra una comparación determinada mediante ELISA de inhibición entre el extracto de Parietaria judaica nativo (Par j 001-10) y el polimerizado con glutaraldehído (Par j 003p-11), observándose una pérdida de potencia del 91,46%.

La figura 9 muestra una comparación determinada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coomassie entre el extracto de Artemisia vulgaris nativo (Art v 001-08 y Art v 001-10, carriles 2 y 3) y el polimerizado con glutaraldehído (Art v 002p-12, carriles 4, 5 y 6).

La figura 10 muestra una comparación determinada mediante inmunotransferencia entre el extracto de Artemisia vulgaris nativo (Art v 001-06 y Art v 001-10, carriles 2 y 3) y el polimerizado con glutaraldehído (Art v 002p-12, carril 4).

La figura 11 muestra una comparación determinada mediante ELISA de inhibición entre el extracto de Artemisia vulgaris nativo (Art v 001-10) y el polimerizado con glutaraldehído (Art v 002p-12), observándose una pérdida de potencia del 98,91%.

La figura 12 muestra una comparación determinada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coomassie entre el extracto nativo de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p SAP 001-13, carril 1) y el polimerizado con glutaraldehído (Der p liofilizado polimerizado, carril 2).

La figura 13 muestra una comparación determinada mediante inmunotransferencia entre el extracto nativo de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 001-13, carril 1) y el polimerizado con glutaraldehído (Der p liofilizado polimerizado, carril 2).

La figura 14 muestra una comparación determinada mediante ELISA de inhibición entre el extracto nativo de Dermatophagoides pteronyssinus, (Der p 001-13) y 3 lotes consecutivos de extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus, liofilizado polimerizado con glutaraldehído, observándose una pérdida de potencia de más del 99% en los 3 casos.

La figura 15 muestra una comparación determinada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coomassie entre la materia prima del veneno de Apis mellifera (carril 1) y el extracto alergénico del veneno de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído (carril 2).

La figura 16 muestra una comparación determinada mediante inmunotransferencia entre la materia prima del veneno de Apis mellifera (carril 1) y el extracto alergénico del veneno de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído (carril 2).

La figura 17 muestra una comparación determinada mediante ELISA de inhibición entre la materia prima del veneno de Apis mellifera y el extracto alergénico liofilizado del veneno de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído, observándose una pérdida de potencia de más del 99%.

La figura 18 muestra la liberación de histamina de un extracto alergénico de veneno de Apis mellifera nativo frente a un extracto alergénico de veneno de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído, utilizando sangre completa humana.

Descripción detallada de la invención

Composición

Se divulga una composición farmacéutica, en adelante “composición”, para la administración intradérmica que comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente.

Una composición farmacéutica, tal como aquí se utiliza, es una composición que comprende al menos un agente biológicamente activo (bioactivo), que está adaptada para ser administrada a un humano u otro animal, y que es útil para el mantenimiento de un estado de salud, el control, el alivio o el tratamiento de los síntomas, afecciones o enfermedades de etiología alérgica.

La administración intradérmica es uno de los cuatro tipos de administración parenteral de agentes bioactivos. La administración parenteral es un tipo de administración que introduce el agente bioactivo directamente en el organismo y por tanto aporta dicho agente bioactivo directamente a la circulación sistémica. Los otros 3 tipos de administración parenteral son la vía subcutánea, la vía intramuscular y la vía intravenosa. Cada tipo de administración parenteral presenta sus particularidades [GUÍA PARA LA ADMINISTRACIÓN SEGURA DE MEDICAMENTOS VÍA PARENTERAL. Mayo 2011. Coordinador: Ernesto Sánchez Gómez. Ed. Hospital “Juan Ramón Jiménez”. Huelva. ISBN: 978-84-694-1318-0].

De acuerdo con la presente invención, por “administración intradérmica” se entiende un modo de administración en el que se inyecta una composición farmacéutica que comprende una cantidad reducida de un agente bioactivo mediante una aguja de calibre fino de modo que se forme una pápula intracutánea o intradérmica. Generalmente, las zonas de administración incluyen la cara anterior o ventral de ambos antebrazos, la parte anterior y superior del tórax por debajo de las clavículas (excepto en mujeres), y la parte superior de la espalda en la zona inferior escapular. Esta vía de administración solo admite pequeños volúmenes, normalmente entre 0,05 y 0,1 ml. Dado que la dermis está poco irrigada, el efecto del agente bioactivo se prolonga durante bastante tiempo. Esta vía es la vía habitualmente utilizada para las pruebas cutáneas diagnósticas de intradermorreacción en alergia. En general, para la administración intradérmica se utilizan agujas con una longitud de 9,5-16 mm, un calibre de 25-26 G (0,5 mm) y un bisel corto.

Tal como se utiliza aquí, la expresión "para la administración intradérmica" se entiende que significa lo mismo que adecuada o adaptada para la administración intradérmica; es decir, en otras palabras, la composición divulgada se compone y se procesa de tal manera que es adecuada para la administración intradérmica por criterios generalmente aceptados.

Un “excipiente” es cualquier sustancia, o mezcla de sustancias, farmacológicamente inerte, farmacéuticamente aceptable, útil para la formulación de una composición farmacéutica. Para su empleo en la presente invención el excipiente o excipientes debe(n) ser excipiente(s) útil(es) para la producción de composiciones farmacéuticas para administración intradérmica.

Ejemplos de excipientes potencialmente útiles incluyen disolventes, co-disolventes, diluyentes, tensioactivos, cotensioactivos, espesantes, estabilizantes, antioxidantes, solubilizantes, agentes de ajuste del pH, colorantes y similares. En una divulgación particular, la composición contiene un diluyente, solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%) y, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. En otra divulgación particular, dicho excipiente comprende manitol, por ejemplo, manitol a 10 mg/ml.

Por tanto, la composición divulgada es una “composición farmacéutica intradérmica”, o una “composición farmacéutica para administración intradérmica”, o una “composición farmacéutica para administración por vía intradérmica”, que comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para la administración intradérmica de dicho alergoide. En la presente descripción, dichos términos “composición farmacéutica para administración intradérmica”, “composición farmacéutica para administración por vía intradérmica” o “composición farmacéutica intradérmica”, se utilizan indistintamente con el mismo significado.

Un “alergoide” es un compuesto con una reactividad alergénica muy reducida en comparación con el alérgeno nativo del que deriva, en términos de fijación de IgE específica de alérgeno, manteniendo al mismo tiempo un alto grado de otras propiedades deseables, características del alérgeno nativo, incluyendo la capacidad de inducir síntesis de anticuerpos de tipo IgG neutralizante de alérgenos, protegiendo a los individuos atópicos de los síntomas alérgicos tras la exposición y restaurando la inmunidad alterada en el paciente alérgico [Hans J Maasch & David G. Marsh, Standardized extract modified allergens allergoids. Clin Rev Allergy. (1987). 5: 89-106]. En otras palabras, un alergoide mantiene la inmunogenicidad del alérgeno nativo, pero con una alergenicidad inferior a la del alérgeno nativo, por lo que, puede ser utilizado en inmunoterapia (IT) debido a que puede ser administrado a elevadas dosis, con bajo riesgo de reacciones sistémicas.

Los alergoides pueden obtenerse a partir de los alérgenos correspondientes por métodos conocidos por los expertos en la materia. Aunque prácticamente cualquier método puede ser utilizado para la obtención de un alergoide, en una divulgación preferida particular, dicho método se basa en la polimerización con glutaraldehído [Patterson R. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. (1981). Vol. 68(2):85-90; Maasch & Marsh, citado supra]. Otros métodos emplean la modificación con formaldehído [Bousquet J. et al. J AIlergy Clin Immunol. (1989). 84:546-56], glutaraldehído [Grammer LC et al. J AIlergy Clin Immunol. (1985). 76:397-401] y alginato [Corrado OJ et al. AIlergy. (1989). 44:108-15]. Las directrices de la Agencia Europea del Medicamento (“EMA”, del inglés “European Medicinal Agency”), “GUIDELINE ON ALLERGEN PRODUCTS: PRODUCTION AND QUALITY ISSUES", EMEA/CHMP/BWP/304831/2007, se refieren a los alergoides, en el apartado “Definiciones” (página 14) como alérgenos modificados químicamente para reducir la reactividad de IgE. El artículo de opinión publicado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1998, titulado “ Inmunoterapia con Alérgenos: Vacunas Terapéuticas para las Enfermedades Alérgicas”, en su apartado 2.3.3, incluye entre los denominados alergoides a las vacunas modificadas con glutaraldehído. Por tanto, la polimerización con glutaraldehído es una modificación química, que como tal está considerada en el apartado 4.2.4.3 de las directrices de la EMA anteriormente citadas. Por tanto, un alergoide es un alérgeno polimerizado (es decir, modificado químicamente).

Un alérgeno es cualquier compuesto, sustancia o material capaz de provocar una reacción alérgica e inducir la síntesis de IgE. En general, se considera que los alérgenos constituyen una subcategoría de los antígenos, los cuales son compuestos, sustancias o materiales capaces de provocar una respuesta inmune. Los alérgenos pueden ser naturales o nativos, sintéticos, recombinantes, etc. En términos de su naturaleza química o bioquímica, los alérgenos suelen ser proteínas (o péptidos) nativas o recombinantes, variantes o fragmentos de dichas proteínas (o péptidos) nativas o recombinantes, proteínas de fusión, compuestos sintéticos (alérgenos químicos), compuestos sintéticos que imitan alérgenos, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitantes, de alérgenos incluyen, entre otros, alérgenos del polen de plantas, alérgenos de derivados epidérmicos de animales, alérgenos de ácaros del polvo, alérgenos de hongos, alérgenos de alimentos, alérgenos de venenos de animales y alérgenos del látex (Hevea brasiliensis).

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición de la invención es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual del polen de plantas, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un derivado epidérmico de animales, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un ácaro del polvo, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un hongo, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un alimento, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual del veneno de un animal, o un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de látex (Hevea brasiliensis).

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual del polen de plantas, tales como, por ejemplo, gramíneas, hierbas, árboles, malezas, etc.; ejemplos ilustrativos, no limitantes de tales plantas incluyen Agropyron, Acacia dealbata, Alnus glutinosa, Amaranthus spp, Ambrosia spp, Artemisia vulgaris, Avena sativa, Betula verrucosa, Chenopodium album, Chrysantemun spp, Citrus sinensis, Corylus avellana, Cryptomeria japonicum, Cupressus arizonica, Cupressus sempervirens, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Eucalyptus spp, Fagus silvatica, Festuca pratensis, Fraxinus excelsior, Helianthus spp, Hevea brasiliensis, Holcus lanatus, Hordeum vulgare, Jasminum spp, Juniperus oxycedrus, Ligustrum vulgare, Lolium perenne, Mercurialis annua, Morus alba, Olea europaea, Oryza sativa, Parietaria judaica, Phleum pratense, Phoenix canariensis, Phoenix dactilyfera, Phragmites communis, Phytolacca dioica, Pinus silvestris, Plantago lanceolata, Platanus acerifolia, Poa pratensis, Populus deltoides, Quercus ilex, Quercus robur, Quercus virginiana, Robinia pseudoacacia, Rumex acetosella, Salix nigra, Salsola kali, Sambucus nigra, Schinopsis sp., Secale cereale, Taraxacum officinale, Trisetum paniceum, Triticum aestivum, Ulmus campestris, Urtica dioica, Zea mays, etc.

En una divulgación concreta, dicha planta es Phleum pratense. En una divulgación más concreta, el alergoide presente en la composición de la invención es un alergoide obtenido a partir de un alérgeno individual o de un extracto alergénico de Phleum pratense que comprende uno, dos o más de los alérgenos mayores y/o menores descritos para Phleum pratense, por ejemplo, Phlp5, Phlp1, Phlp2, Phlp6, Phlp11, o Phlp12, etc.

En una divulgación particular, dicha planta es Artemisia vulgaris y el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de Artemisia vulgaris. En otra divulgación concreta, dicha planta es Parietaria judaica y el alergoide presente en la composición divulgada es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de Parietaria judaica.

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un derivado epidérmico de un animal; ejemplos ilustrativos, no limitantes de tales animales incluyen Canis familiaris, Equus caballus, Felis domesticus, etc.

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un ácaro del polvo; ejemplos ilustrativos, no limitantes de tales ácaros incluyen Acarus siro, Blomia kulagini, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Glycyphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentaie, etc. En una divulgación particular, dicho ácaro es Dermatophagoides pteronyssinus y el alergoide presente en la composición divulgada es un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus. En una divulgación más concreta el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de alérgeno individual o de un extracto alergénico de D. pteronyssinus que comprende uno, dos o más de los alérgenos mayores y/o menores descritos para D. pteronyssinus, por ejemplo, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 6, Der p 10, o combinaciones de los mismos.

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un hongo; ejemplos ilustrativos, no limitantes de tales hongos incluyen Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum, Rhizopus nigricans, etc.

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un alimento; ejemplos ilustrativos, no limitantes de tales alimentos incluyen pescados, leche y derivados de la leche (lactoalbúmina, lactoglobulina, caseína, etc.), huevos y derivados del huevo (ovoalbúmina, ovomucoide, etc.), frutos secos (avellana, cacahuete, nuez, etc.), etc.

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico o de un alérgeno individual de un veneno de un animal; ejemplos ilustrativos, no limitantes de dichos animales incluyen tanto insectos, en cualquier estadio de su desarrollo, por ejemplo, orugas, etc., como no insectos, por ejemplo, medusas, serpientes, etc. En una divulgación concreta, dicho insecto es un himenóptero, por ejemplo, un insecto perteneciente al género Apis (abejas), un insecto perteneciente a la familia Vespidae (avispas), por ejemplo, del género Polistes, Vespula, etc., un insecto perteneciente a la familia Formicidae (hormigas), etc. En otra divulgación concreta dicho insecto es un díptero, por ejemplo, un insecto perteneciente al género Aedes, Culex, Culicoides, etc. En otra divulgación concreta dicho insecto pertenece al orden Siphonaptera, por ejemplo, un insecto perteneciente al género Ctenocephalides. Ejemplos ilustrativos, no limitantes, de dichos insectos incluyen Aedes aegypti, Apis mellifera, Culex pipiens, Culicoides spp, Ctenocephalides sp., Formica fusca, Polistes sp., Vespula sp., etc. En una divulgación particular, dicho insecto es Apis mellifera y el alergoide presente en la composición divulgada es un alergoide de un extracto alergénico del veneno de Apis mellifera. En una divulgación más concreta el alergoide presente en la composición es un alergoide de un alérgeno individual o de un extracto alergénico del veneno de Apis mellifera que comprende uno, dos o más de los alérgenos mayores y menores descritos para el veneno de Apis mellifera, por ejemplo, Api m 1, Api m 2, Api m 3, o sus combinaciones.

En una divulgación concreta, el alergoide presente en la composición es un alergoide seleccionado del grupo formado por alergoides obtenidos a partir de un alérgeno individual o de un extracto alergénico de Agropyron, Acacia dealbata, Alnus glutinosa, Amaranthus spp, Ambrosia spp, Artemisia vulgaris, Avena sativa, Betula verrucosa, Chenopodium album, Chrysantemun spp, Citrus sinensis, Corylus avellana, Cryptomeria japonicum, Cupressus arizonica, Cupressus sempervirens, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Eucalyptus spp, Fagus silvatica, Festuca pratensis, Fraxinus excelsior, Helianthus spp, Hevea brasiliensis, Holcus lanatus, Hordeum vulgare, Jasminum spp, Juniperus oxycedrus, Ligustrum vulgare, Lolium perenne, Mercurialis annua, Morus alba, Olea europaea, Oryza sativa, Parietaria judaica, Phleum pratense, Phoenix canariensis, Phoenix dactilyfera, Phragmites communis, Phytolacca dioica, Pinus silvestris, Plantago lanceolata, Platanus acerifolia, Poa pratensis, Populus deltoides, Quercus ilex, Quercus robur, Quercus virginiana, Robinia pseudoacacia, Rumex acetosella, Salix nigra, Salsola kali, Sambucus nigra, Schinopsis sp., Secale cereale, Taraxacum officinale, Trisetum paniceum, Triticum aestivum, Ulmus campestris, Urtica dioica, Zea mays, Canis familiaris, Equus caballus, Felis domesticus, Acarus siro, Blomia kulagini, Blomia tropicalis, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Glycyphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentaie, Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum, Rhizopus nigricans, pescados, leche y derivados de la leche (por ejemplo, lactoalbúmina, lactoglobulina, caseína, etc.), huevos y derivados del huevo (por ejemplo, ovoalbúmina, ovomucoide, etc.), frutos secos (por ejemplo, avellana, cacahuete, nuez, etc.), insectos, por ejemplo, insectos de la familia Formicidae, etc., venenos de medusas, serpientes, orugas, etc., venenos de himenópteros, por ejemplo, venenos de insectos del género Apis (por ejemplo, Apis mellifera), venenos de insectos de la familia Vespidae, por ejemplo, insectos del género Polistes, Vespula, etc., veneno de dípteros, por ejemplo, insectos perteneciente a los géneros Aedes, Culex, Culicoides, etc.; venenos de insectos pertenecientes al orden Siphonaptera, por ejemplo, insectos del género Ctenocephalides, etc., por ejemplo, veneno de Aedes aegypti, Apis mellifera, Culex pipiens, Culicoides spp, Ctenocephalides sp., Formica fusca, Polistes sp., Vespula sp., etc., alérgenos del látex (Hevea brasiliensis), o combinaciones de los mismos.

En una divulgación particular, la composición comprende un único alergoide. Esta divulgación particular resulta especialmente útil para el tratamiento de la alergia frente a un alérgeno.

En otra divulgación particular, la composición comprende dos o más alergoides diferentes. Esta divulgación particular resulta especialmente útil para tratar simultáneamente dos o más alergias frente a dos o más alérgenos diferentes.

El experto en la materia entenderá que mediante la formulación apropiada de la composición divulgada se pueden tratar simultáneamente alergias frente a diversos alérgenos; para ello, basta con incluir en la formulación de la composición divulgada los alergoides correspondientes, obtenidos mediante modificación química, por ejemplo, mediante polimerización con glutaraldehído, de los alérgenos en cuestión. A modo ilustrativo, no limitante, se podría formular una composición que incluyera uno o más alergoides obtenidos a partir de alérgenos individualizados o de extractos alergénicos del polen de gramíneas y/o uno o más alergoides obtenidos a partir de alérgenos individuales o de extractos alergénicos del polen de arizónicas; dicha composición divulgada sería útil para el tratamiento simultáneo de la alergia frente al polen de gramíneas y/o de la alergia frente al polen de arizónicas. Cualquier combinación de alergoides tal como se han definido previamente puede ser utilizada dentro del ámbito de la presente invención.

En una divulgación, la composición se caracteriza, además, porque está libre de un adyuvante inmunológico. En otra divulgación particular, la composición de la invención comprende uno o más adyuvantes.

Un “adyuvante” inmunológico, tal como aquí se utiliza, es una sustancia (o combinación de sustancias) utilizada en combinación con un alérgeno (caso particular de un antígeno) específico que produce una respuesta inmune más robusta que el alérgeno solo. Esta definición incluye una amplia gama de materiales. Algunos adyuvantes inmunológicos que se utilizan en muchos productos comercializados como vacunas incluyen sales minerales, en particular, fosfato de calcio, fosfato de aluminio, etc., o bases, por ejemplo, hidróxido de aluminio, etc. Adyuvantes inmunoestimulantes más eficaces incluyen oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes, ARN inmunoestimulantes, proteínas, incluyendo anticuerpos o pequeñas entidades químicas sintéticas que se unen a los receptores de sustancias inmunoestimulantes o coestimuladoras, tales como, por ejemplo, receptores de tipo Toll. Ejemplos ilustrativos, no limitantes, de adyuvantes incluyen saponinas (como QS21), citoquinas (tales como la IL-2, IL-12), derivados de MDP, LPS, MLP y sus derivados, GM-CSf , lipopéptidos e imiquimod.

La cantidad de alergoide en la composición divulgada se seleccionará en base a la naturaleza del alergoide presente en la misma; no obstante, en una divulgación particular, el contenido de alergoide presente en una unidad de dosis de 0,1 ml está comprendido entre aproximadamente 0,001 |jg y aproximadamente 1.000 |jg de proteína por dosis. Preferentemente, dicha dosis es la dosis máxima no reactiva (titulación a punto final) del alergoide administrado por vía intradérmica en sujetos alérgicos sensibilizados con el alérgeno. Dicha dosis es una dosis segura, pues corresponde a la concentración de alergoide que negativiza la prueba cutánea, y puede ser determinada por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Ejemplo 6). En una divulgación particular, dicha dosis máxima no reactiva de alergoide de Phleum pratense [extracto alergénico (proteico) de Phleum pratense que comprende la totalidad o parte de los alérgenos descritos de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído] es de 0,27 jg de extracto proteico/ml. Dicho valor ha sido establecido en un ensayo clínico unicéntrico, abierto y controlado con extracto nativo de Phleum pratense, para la obtención de la dosis máxima no reactiva (titulación a punto final), con dicho alergoide de Phleum pratense, en pacientes con rinoconjuntivitis alérgica con o sin asma leve o moderado intermitente, sensibilizados al polen de Phleum pratense.

En una divulgación particular, la composición se formula como una formulación líquida para administración intradérmica. En otra divulgación particular, la composición se formula como una formulación de polvo liofilizado que, tras su reconstitución, conduce a una formulación líquida para administración intradérmica, para lo cual se elegirán los excipientes más apropiados para ello. Tal como aquí se utiliza, la formulación líquida obtenida tras reconstituir el liofilizado se caracteriza por el estado líquido de por lo menos la fase continua de la composición. La formulación líquida puede contener una sola fase o, alternativamente, puede incorporar una o más fases adicionales que se dispersan en la fase continua y que pueden (o no) ser líquidas. Por ejemplo, una suspensión es un líquido que comprende una fase sólida dispersa, y una emulsión es un líquido que comprende una fase líquida dispersa. El experto en la materia conoce los excipientes y técnicas para formular composiciones líquidas para administración intradérmica. Información adicional sobre los excipientes apropiados para la formulación de formulaciones líquidas para administración intradérmica puede encontrarse, por ejemplo, en el “Tratado de Farmacia Galénica”, C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid; y en Remington's Pharmaceutical Sciencies (A.R. Gennaro, Ed.), 20a edición, Williams & Wilkins PA, USA (2000). Entre los excipientes preferidos para la composición divulgada se encuentran el suero salino fisiológico y el manitol. Opcionalmente, se pueden incorporar uno o más codisolventes. Dependiendo de su naturaleza química, el alergoide puede disolverse, dispersarse coloidalmente o estar suspendido (disperso) en la fase líquida. En una divulgación particular, el alergoide se incorpora en un estado disuelto o disperso coloidalmente.

Excipientes adicionales opcionales para la formulación líquida de la composición divulgada incluyen agentes gelificantes, tensioactivos, cotensioactivos, estabilizantes, agentes reguladores del pH tales como ácidos, bases y sales tampón, conservantes, azúcares, etc., farmacéuticamente aceptables.

En una divulgación particular, el alergoide presente en la composición está liofilizado.

En otra divulgación particular, el alergoide presente en la composición para uso según la invención está disuelto en un excipiente adecuado para su administración por vía intradérmica. En una realización concreta, dicho excipiente es suero salino fisiológico y manitol a 10 mg/ml.

En otra divulgación particular, la composición se presenta en forma de monodosis. En una realización concreta, la composición divulgada se presenta en forma de monodosis en la que el contenido de alergoide por unidad de dosis de 0,1 ml está comprendido entre aproximadamente 0,001 |jg y aproximadamente 1.000 |jg de proteína por dosis. En una divulgación particular, dicha dosis es la dosis máxima no reactiva (titulación a punto final) del alergoide administrado por vía intradérmica en sujetos alérgicos sensibilizados con el alérgeno. Dicha dosis puede ser determinada por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia; a modo ilustrativo, dicha dosis puede ser establecida como una dosis no reactiva en el diagnóstico en fase I, ventajosamente, como la dosis máxima no reactiva en el diagnóstico en fase I. En una divulgación particular, la composición comprende una dosis de 0,27 jg de proteína/ml de alergoide de Phleum pratense, en donde dicho alergoide ha sido obtenido a partir de un extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído.

Usos médicos

En un aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un sujeto que padece una alergia frente a un alérgeno, en donde la composición se va a administrar por vía intradérmica, la composición comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante modificación química de dicho alérgeno, en donde dicho alergoide está presente en la composición a la dosis máxima no reactiva y en donde dicha dosis máxima no reactiva corresponde a la concentración del alergoide que, administrada por la vía intradérmica, da negativo en la prueba cutánea ensayada en una población que está específicamente sensibilizada a dicho alergeno por medio de un estudio de titulación final con el alergoide en una población de pacientes sensibilizados hacia el alergeno.

En una realización particular, dicho alergoide de la composición para uso según la invención es un alergoide obtenido mediante la polimerización de dicho alergeno con glutaraldehído.

Las características de la composición ya han sido discutidas previamente y se incorporan aquí por referencia.

El término “sujeto” tal como aquí se utiliza incluye a cualquier animal, preferentemente, un mamífero, incluyendo seres humanos. Por tanto, dicho método puede ser utilizado para el tratamiento de alergias tanto en seres humanos como en animales, por ejemplo, perros, gatos, caballos, etc.

El experto en la materia entenderá que, para que dicho tratamiento inmunoterapéutico sea eficiente, el alergoide presente en la composición para uso en el tratamiento de dicha alergia de la invención será un alergoide obtenido mediante modificación química del alérgeno al que el sujeto es sensible. Por tanto, una vez conocido el alérgeno al que el sujeto es sensible, se puede preparar, de acuerdo con la presente invención, un alergoide mediante modificación química de dicho alérgeno, preferentemente, mediante polimerización con glutaraldehído, y formular dicho alergoide para su administración por vía intradérmica al sujeto mediante su formulación en una composición farmacéutica apropiada para administración intradérmica.

En una realización particular, la composición que se va a usar en el uso médico anteriormente indicado comprende un único alergoide, por lo que resulta especialmente útil para el tratamiento de la alergia frente a un único alérgeno, por ejemplo, alergia al polen de Phleum pratense, o alergia al polen de Artemisia vulgaris, o alergia al polen de Parietaria judaica, o alergia a Dermatophagoides pteronyssinus, o alergia al veneno de Apis mellifera, o alergia a la caspa de perros o gatos, etc.

En otra realización particular, la composición que se va a usar en el uso médico anteriormente indicado comprende dos o más alergoides diferentes; en este caso, dicha composición resulta especialmente útil para tratar simultáneamente dos o más alergias frente a dos o más alérgenos diferentes. A modo ilustrativo, no limitante, la invención contempla la posibilidad de tratar simultáneamente la alergia a dos o más alérgenos diferentes, por ejemplo, alergias a dos o más tipos de pólenes diferente (por ejemplo, polen de Phleum pratense, polen de Artemisia vulgaris, polen de Parietaria judaica, etc.); alergias a uno o más pólenes de plantas y a ácaros del polvo; alergias a uno o más pólenes de plantas y a venenos de insectos (por ejemplo, Apis mellifera); alergias a ácaros del polvo y alergias a venenos de insectos; alergias a uno o más pólenes de plantas y a caspa de perros o gatos; etc. El experto en la materia entenderá que mediante la formulación apropiada de la composición para uso según la invención se pueden tratar simultáneamente alergias a diversos alérgenos. Así, una vez identificados los alérgenos causantes de alergia en un sujeto, el experto en la materia podrá formular la composición adecuada para uso según la invención, que incorporará los alergoides correspondientes a los alérgenos que producen la reacción alérgica en el sujeto que se va a tratar. Cualquier combinación de alergoides tal como se han definido previamente puede ser utilizada dentro del ámbito de la presente invención.

La pauta de administración de la composición para uso según la invención se elegirá en función de la gravedad de la enfermedad o afección del sujeto particular, la sensibilidad inmunológica del sujeto al alergoide(s) comprendido en la composición para uso según la invención, etc.

Típicamente, la administración de la composición para uso según la invención se realiza con una frecuencia que varía desde aproximadamente una vez al día a una vez al año, preferentemente, una vez cada dos días, tres veces por semana, dos veces por semana, una vez a la semana, y una vez cada dos semanas.

En general, el tratamiento tendrá una duración de un período de tiempo comprendido entre aproximadamente una semana y aproximadamente 6 meses, o más preferiblemente de aproximadamente 2 semanas a alrededor de 5 meses, por ejemplo, alrededor de 1 mes, alrededor de 6 semanas, aproximadamente 2 meses, o alrededor de 3 meses, y en cualquier caso, cuando se demuestra la tolerancia al alérgeno del sujeto.

Durante un periodo de tratamiento, la dosis administrada puede permanecer sustancialmente constante, o puede ser ajustada.

Para sostener los efectos positivos de una terapia que se ha llevado a cabo durante un período de varias semanas o meses, puede ser útil continuar con una frecuencia de administración reducida, tal como aproximadamente una vez cada mes, aproximadamente una vez cada 2 meses, aproximadamente una vez cada 3 meses, aproximadamente una vez cada 6 meses o una vez al año.

Uso

Se divulga el uso de una composición para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la alergia de un sujeto a un alérgeno, en donde dicha composición es una composición farmacéutica para administración intradérmica que comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante modificación química de dicho alérgeno.

Las características de la composición divulgada, el sujeto y el alergoide ya han sido discutidas previamente. El experto en la materia entenderá que, para que el uso terapéutico de la composición de la invención sea eficiente, el alergoide presente en la misma deberá ser un alergoide del alérgeno al que el sujeto es sensible.

En una realización preferida particular, dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante polimerización con glutaraldehído de dicho alérgeno.

En una realización particular, dicha composición para uso según la invención comprende un único alergoide. En otra realización particular, la composición de la invención comprende dos o más alergoides diferentes.

También se divulga el uso de un alergoide para la elaboración de una composición farmacéutica para la administración intradérmica a un sujeto, para el tratamiento de la alergia de dicho sujeto a un alérgeno, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante modificación química de dicho alérgeno. También se divulga un alergoide para su empleo en el tratamiento de la alergia de un sujeto a un alérgeno mediante la administración intradérmica de dicho alergoide, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante modificación química de dicho alérgeno.

Las características del sujeto y el alergoide ya han sido discutidas previamente. El experto en la materia entenderá que, para que el uso terapéutico del alergoide sea eficiente en el tratamiento de la alergia a un alérgeno, dicho alergoide deberá ser un alergoide del alérgeno al que el sujeto es sensible.

En una divulgación preferida, dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante polimerización con glutaraldehído de dicho alérgeno.

En una divulgación particular, dicha composición farmacéutica comprende un único alergoide. En otra divulgación particular, dicha composición farmacéutica comprende dos o más alergoides diferentes.

Kit

Se divulga un kit farmacéutico, que comprende la composición divulgada y los medios e instrucciones para administrar dicha composición, en donde dicha composición es una composición farmacéutica para la administración intradérmica que comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las características de la composición y del alergoide ya han sido discutidas previamente y se incorporan aquí por referencia. En una divulgación particular, dicha composición farmacéutica comprende un único alergoide. En otra divulgación particular, dicha composición farmacéutica comprende dos o más alergoides diferentes.

En una divulgación particular, dicho alergoide está liofilizado y el kit comprende un número variable de viales, típicamente de 1 a 4 viales, con un excipiente adecuado para la administración, tras la reconstitución, del alergoide por vía intradérmica.

Las instrucciones también pueden comprender cualquiera de las características opcionales o preferidas del uso médico descrito anteriormente.

Ventajosamente, el kit de la divulgación puede comprender no sólo la composición y las instrucciones, sino también los medios para su administración, en particular, las agujas adecuadas para la administración intradérmica de la composición divulgada, los viales necesarios y otros dispositivos que faciliten la administración intradérmica del alergoide.

Según la presente invención, la composición farmacéutica de la invención y el kit de la invención son para uso en el tratamiento de sujetos que padecen alergia frente a un alérgeno.

Por tanto, la invención se refiere a un kit farmacéutico que comprende una composición farmacéutica en donde la composición se va a administrar por vía intradérmica, la composición comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido por medio de modificación química de dicho alergeno, en donde dicho alergoide está presente en la composición a la dosis máxima no reactiva y en donde dicha dosis máxima no reactiva corresponde a la concentración de alergoide que, administrada por la vía intradérmica, da negativo en la prueba cutánea ensayada en una población que está específicamente sensibilizada a dicho alergeno por medio de un estudio de titulación final con el alergoide en una población de pacientes sensibilizados al alergeno y los medios e instrucciones para administrar dicha composición para uso en el tratamiento de un sujeto que padece una alergia hacia un alergeno.

Tal como aquí se utiliza, el término “alergia” incluye cualquier forma de hipersensibilidad de tipo I latente o manifiesta, también conocida como hipersensibilidad inmediata o mediada por IgE. La hipersensibilidad de tipo I se caracteriza por la activación de los mastocitos y basófilos a través de la inmunoglobulina E (IgE), que conduce a la liberación de los mediadores contenidos en sus gránulos, originando una respuesta inflamatoria sistémica que puede causar una amplia gama de síntomas leves, moderados y graves que van desde un goteo de la nariz (rinorrea), al potencialmente mortal choque anafiláctico. La diferencia fundamental entre una reacción de hipersensibilidad de tipo I contra un alérgeno y una respuesta humoral normalizada frente al mismo es que, en la hipersensibilidad, las células plasmáticas predominantemente secretan inmunoglobulinas de tipo E en lugar de tipo G, que son secretadas contra los antígenos reconocidos.

Las enfermedades alérgicas también pueden ser clasificadas de acuerdo con los síntomas predominantes que están asociados. Por ejemplo, la invención comprende el tratamiento de sujetos que padecen rinitis alérgica estacional (fiebre del heno), rinitis alérgica perenne, conjuntivitis alérgica, y combinaciones de las mismas, tales como, por ejemplo, rinosinusitis, asma, dermatitis atópica, urticaria, así como de cualquier alergia alimentaria, alergia frente al polvo de la casa, o una alergia frente a cualquiera de los alérgenos mencionados en el presente documento.

El ámbito de la invención se extiende al tratamiento de cualquier sujeto alérgico, sin restricciones.

En una realización preferida adicional, el uso médico de la invención se utiliza para el tratamiento que establece la respuesta inmunitaria normal alterada de los pacientes alérgicos, tal y como define la OMS, de aquellos sujetos que tienen una enfermedad alérgica manifiesta o un mayor riesgo de desarrollar una alergia o una patología alérgica de mayor gravedad, como está demostrado en el tránsito de la rinitis al asma.

La administración intradérmica de alergoides de acuerdo con la presente invención presenta numerosas ventajas ya que:

1. La aplicación intradérmica de alergoides permite obtener un efecto inmunógeno, tal como se pone de manifiesto mediante los estudios de inmunización realizados en conejos, pero con una alergenicidad del extracto alergénico reducida, tal como se pone de manifiesto mediante la determinación de los valores de Ag⁵⁰ y la liberación de histamina.

2. La disminución de la alergenicidad y del volumen a administrar, máximo 0,1 ml del extracto alergénico polimerizado, junto con vía de administración intradérmica, asociada al empleo de los alergoides, resalta el incremento de la seguridad de los preparados vacunales.

3. Permite eliminar la dosis de escalado para alcanzar la dosis máxima tolerada por el paciente, dado que en el diseño del alergoide se considera una dosis de administración única, establecida en términos de seguridad como la dilución de alergoide que negativiza la prueba cutánea intradérmica realizada con el mismo. La invención pone de manifiesto que esta dosis es segura, dado que diagnóstico e inmunoterapia se realizan por la misma vía intradérmica, y, por tanto, es posible fijar para cada alergoide la dosis máxima tolerada en función de la sensibilidad del paciente, al ser ensayada sobre una población específicamente sensibilizada al alérgeno en cuestión. Por tanto, la aplicación intradérmica permite establecer la dosis máxima eficaz y segura de un alergoide, considerando la diferencia de sensibilidad entre sujetos (pacientes) y permitiendo ajustarla en base a un escalado de dosis establecido en el diagnóstico hasta poder llegar a fijarla.

4. El concepto dosis óptima - dosis tolerada de alergoide puede ser ensayado mediante pruebas cutáneas intradérmicas (ID) en una población sensibilizada al alérgeno mediante titulación a punto final y adecuadamente establecido puesto que la administración de la inmunoterapia (IT) emplea la misma vía diagnóstica para cada alérgeno.

5. Permite eliminar la diversidad de volúmenes a administrar en la inmunoterapia con extractos alergénicos, factor este que origina posibilidades de inducción de reacciones por sobredosificación en la práctica clínica (el volumen máximo a administrar siempre será de 0,1 ml, dado que esta acotación es inherente a la técnica de administración intradérmica).

6. Permite mantener la estabilidad y actividad del alergoide al contemplar la posibilidad de ser diseñado en forma de polvo liofilizado con un crioprotector (por ejemplo, manitol) y minimizar al máximo posible las posibles variaciones y pérdidas de su actividad biológica.

La presente invención, por primera vez demuestra la posibilidad de empleo de la vía intradérmica con alergoides con fines terapéuticos. Habiendo sido históricamente y hasta la fecha práctica habitual el empleo de pruebas intradérmicas con alérgenos con fines diagnósticos (práctica habitual en Estados Unidos para establecer el diagnóstico etiológico).

Puesto que la invención considera la vía de administración intradérmica de alergoides, representa una innovación no ensayada con anterioridad. La vía intradérmica ha sido ensayada y ampliamente demostrada su seguridad y eficacia con otros agentes inmunizantes (por ejemplo, vacunas BCG, rabia, y, recientemente, la vacuna de la gripe). Esta vía de administración permite mejorar el procesamiento y reconocimiento de los antígenos dada la amplia distribución de células presentadoras de antígenos y por tanto su papel modulador de la respuesta inmunitaria.

La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1

Protocolo general de obtención de extractos alergénicos de polen

1.1 Obtención de extractos alergénicos de polen

La materia prima de pólenes se adquiere a un productor, tal como, por ejemplo, Allergon, Pharmalerga, etc., y, una vez recibida, es almacenada en la cámara fría hasta su procesado. Alternativamente, la materia prima del polen se suministra a partir de la colección de pólenes que posee el propio solicitante.

El polen se pesa en un recipiente estéril, se anota la cantidad de materia prima a extraer y se vierte a un vaso de precipitado en una campana de flujo laminar. La extracción hidrosoluble se realiza por maceración con solución salina tamponada con fosfato (PBS), mediante agitación magnética suave en agitador (aproximadamente a 1000 rpm) y a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C (cámara fría) durante 4 horas. El pH del extracto se mantiene en un valor de 7,5-8,5 con HCl o NaOH 1N, mediante medida en pHmetro.

Tras este paso, el extracto se somete a centrifugación a 5.000 rpm durante 30 minutos en una centrífuga y el sobrenadante se pasa a través de filtros clarificantes, midiéndose la conductividad con un conductivímetro y guardando el sobrenadante resultante a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C.

El sedimento de la centrifugación se resuspende en PBS. Este segundo extracto se somete a centrifugación a 5.000 rpm durante 30 minutos, descartándose el sedimento y juntando el sobrenadante con el obtenido en la anterior centrifugación, para continuar con su procesado. El sobrenadante obtenido se pasa a través de filtros clarificantes y se mide su conductividad.

Posteriormente, se procede a mezclar ambos sobrenadantes filtrados y el extracto crudo se somete a una concentración por ultrafiltración de flujo tangencial en un equipo apropiado, por ejemplo, un sistema Cogent M1 (Millipore) equipado con un sistema de membranas empaquetadas (Cassette) con un límite de exclusión molecular de 5.000 Dalton (Da) [3.000 Da en caso de procesar Parietaria judaica, Artemisia vulgaris y Ambrosia trífida, por ejemplo]. La diálisis se realiza por adición de 5 volúmenes de agua de calidad inyectable respecto al volumen concentrado. Cuando el extracto crudo obtenido de pólenes sea inferior a 600 ml de volumen final, se realiza la diálisis en Labscale por adición de 5 volúmenes de agua WFI respecto al volumen obtenido empleando cartuchos de 5 kDa. Se mide la conductividad con conductivímetro al final de proceso, que debe ser inferior a 1,5 mS.

A continuación, el extracto es alicuotado en viales a razón de 30 ml/vial que se tapan y posteriormente se congelan a -20°C (en caso de no ser liofilizados inmediatamente).

Para la liofilización, los viales se introducen en una cámara estéril en un liofilizador, por ejemplo, un liofilizador Telstar. Finalizado el ciclo de liofilización, se procede a pesar el contenido de 1 vial para calcular el rendimiento, expresado en gramos de producto intermedio liofilizado por 100 gramos de materia prima. Por último, se entrega el producto obtenido y la documentación a Control de Calidad para su caracterización.

Siguiendo el protocolo indicado previamente, se ha obtenido un extracto alergénico nativo de Phleum pratense que se utilizó en los Ejemplos 4 y 5.

1.2 Caracterización del extracto alergénico nativo

1.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Tampones y disoluciones

Acrilamida/Bisacrilamida, Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8; Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (concentrador); disolución de dodecilsulfato sódico (SDS) al 10 %; persulfato amónico 30 mg/ml; Temed: (N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina); tampón de muestra 5X; tampón de electrodos pH 8,3; patrón de pesos moleculares; fijador de plata; acelerador de plata; tinción de plata (agua pura, solución de complejo de plata, solución de moderador reductor y reactivo de revelado de imagen). Disolución de Coomassie (Tinción); solución desteñidora de Coomassie.

Método

Los geles empleados se preparan con las siguientes proporciones de acrilamida: gel separador 12,5% y gel concentrador 4%.

Se cargan 15 |jg proteína (extractos alergénicos) /carril para la tinción de Coomasie (se cargan 10 j l de una muestra diluida a 1,5 mg proteína/ml) y 0,5 jg proteína/carril para la tinción de plata (se cargan 10 j l de una muestra diluida a 0,05 mg proteína/ml).

Una vez diluidas las muestras a la concentración de proteína necesaria para el tipo de tinción que se vaya a emplear, se procede a preparar las muestras. Para ello, se toman en un eppendorf 80 j l de la dilución obtenida anteriormente y 20 j l de tampón de muestra 5X (relación 4:1) y la mezcla se calienta durante 8 minutos a aproximadamente 100°C. Tras su enfriamiento (temperatura ambiente), los restos insolubles se eliminan por centrifugación durante 5 minutos a 14.000 rpm.

Condiciones electroforéticas.

Se dispensan:

- en un carril, 7 j l de patrón de pesos moleculares para tinción de Coomassie, o 4 j l de patrón de pesos moleculares para tinción de Plata;

- en un carril, 10 j l de IHR (patrón de referencia interno, del inglés “in house reference”) para el caso de extractos alergénicos estandarizados (en el caso de los extractos alergénicos no estandarizados este carril se obviará); y

- en tres carriles, 10 j l de extracto alergénico a analizar.

Cuando el frente de migración se encuentre cerca del final del gel, aproximadamente a los 45 minutos de haberse iniciado la electroforesis, se desconecta la fuente y se saca el gel. Posteriormente se procede a la tinción y destinción del gel dependiendo de la concentración de proteína que tenga cada muestra:

- Tinción de Coomassie: Se coloca el gel en una placa de 10 cm x 10 cm y se añade la solución de Comassie.

Tinción: 1 hora a 60°C, 2 h a 37°C, o 12 h a temperatura ambiente.

- Solución desteñidora de Coomasie: Se añade la solución desteñidora de Coomassie, hasta que el fondo del gel quede casi transparente y se visualicen bien las bandas del patrón y las muestras. Una vez que esté totalmente decolorado, desechar la solución y añadir agua para que se encuentre en las condiciones óptimas de hidratación.

La determinación de los pesos moleculares se lleva a cabo por el método de Weber y Osborn [Weber, K. & Osborn, M. J. Biol. Chem. 244:4406-4412 (1969)], construyendo una recta de calibrado, representando la movilidad (en mm) manifestada por una serie de proteínas frente al logaritmo de su peso molecular (conocido). La movilidad se mide desde el comienzo del gel separador hasta el punto medio de la banda. Una vez demostrada la correlación entre ambas variables (r> 0,90), la determinación de pesos moleculares se lleva a cabo con un programa informático (Diversity database) basado en el método de Weber y Osborn. Los pesos moleculares de las proteínas utilizadas como patrones son: 250, 150, 100 y 75 Daltons.

1.2.2 Determinación de proteína

Reactivos y preparación

La lectura se realiza a 595 nm en un espectrofotómetro (por ejemplo, un espectrofotómetro BECKMAN COULTER DU 640), con cubeta de cuarzo para uso en el espectro visible. Para la realización del ensayo se utiliza el reactivo concentrado de BIO-RAD (Protein assay. Ref: 500-0006) para la determinación de contenido en proteínas, que se prepara en una proporción de 0,2 ml de reactivo de BIO-RAd por ml de reactivo (por ejemplo, 20 ml reactivo de BIO-RAD 80 ml agua pura). Se realiza una recta patrón partiendo de una solución madre de seroalbúmina bovina (BSA) a 1 mg/ml. Para ello, se preparan diversas concentraciones: 2; 4; 6; 8 y 10 |ig/ml. Esta recta se realiza por triplicado en un eppendorf de 1,5 ml, con un volumen final de 1 ml a completar con el reactivo. Se toma como blanco 1 ml del reactivo ya diluido, que se leerá previamente en el espectrofotómetro.

Preparación de las muestras

Se inicia preparando alícuotas de 900 pl de reactivo preparado en eppendorf de 1,5 ml hasta un total de 6 por muestra. Límites de aceptación

El valor absoluto obtenido relativo a la cantidad de proteína que contiene la muestra, deberá ser un ± 50-150% respecto al lote IHR (según monografía Phr. Eur EMEA/BWP/304831/2007).

1.2.3 ELISA de inhibición con suero humano

Se pesan los productos a analizar (aproximadamente 5-6 mg) en una balanza. Las muestras pesadas se reconstituyen a 10 mg/ml con agua pura, se agita y se centrifugan durante 5 minutos a 14.000 rpm.

Se prepara una solución del extracto referencia (IHR) a analizar en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9,6 a una concentración de 250 pg/ml (6 ml de tampón carbonato/bicarbonato y 150 pl del IHR 10 mg/ml a analizar). Se pipetean 50 pl de la solución del IHR (250 pg/ml) en los 96 pocillos de la placa de ELISA y se cubre la placa para evitar la evaporación. Se incuba a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C en nevera durante toda la noche. La placa de ELISA se lava con PBS-Tween® 20 al 0,05%, pH 7,4, en un aparato lavador Biotek Elx50. A continuación, se bloquea añadiendo 200 pl/pocillo de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05% y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.

Preparación de las muestras a analizar: El IHR y las sustancias activas a analizar se preparan en un tubo eppendorf a 1 mg/ml con BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05%. A un nuevo tubo eppendorf se añaden 90 pl de las diluciones previamente preparadas de los productos a analizar más 90 pl del correspondiente suero humano.

Para la preparación del control positivo (BSA suero humano) se añaden a un tubo eppendorf 90 pl de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05% (en lugar de la muestra) más 90 pl del correspondiente suero humano.

Para la preparación del control negativo (BSA) se añaden a un tubo eppendorf 180 pl de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05%.

Las muestras se incuban, junto con el control positivo y el control negativo, durante 1 hora a temperatura ambiente y con rotación. Transcurrido el tiempo de incubación de las muestras, se centrifugan durante 10 segundos a 14.000 rpm. Se pipetean 50 pl de las muestras en una placa de ELISA y se incuba la placa durante 2 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de bloqueo (2 horas), se lava la placa de ELISA con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4. Se añade 50 pl/pocillo de anticuerpo monoclonal de IgE humano E-27-IgG (Operón) a una dilución 1/1000 y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lava con PBS-Tween® 20 al 0,05%, pH 7,4. A continuación, se añaden 50 pl/pocillo de anti-IgG murina (específico de cadena y) a una dilución 1/500 y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4. Posteriormente, se añaden 50 pl/pocillo del conjugado estreptavidina-peroxidasa de Streptomyces avidinii, a una dilución de 1:250 (24 pl 6 ml de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05%) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05%, pH 7,4. Seguidamente, se añaden 50 pl/pocillo de H²O² + ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) a una dilución de 1:1000 (6 pl de H²O² + 6 ml de ABTS). La lectura de la placa se realiza utilizando un lector de placas Multiskan Ascent V1.23.

Cálculos y presentación de resultados:

Porcentaje de unión: Tanto por ciento de IgE unida al fondo de la placa de ELISA, con respecto al 100% de unión, que corresponde a los pocillos control positivo, sin alérgeno (BSA anticuerpo). Se obtiene multiplicando el valor promedio de absorbancia (Abs) para cada concentración de alérgeno por 100, y dividiendo dicho producto entre el promedio de absorbancias del control positivo, según la ecuación:

% unión = Abs media a cada conc x 100 / Abs media Control+

Porcentaje de inhibición: Porcentaje de anticuerpo no unido al fondo de la placa, que corresponde al total de anticuerpo menos el anticuerpo unido. Este valor se calcula como:

% inhibición = 100 - % unión

Coeficiente de correlación de la curva, que ha de ser mayor o igual a 0,980.

Valores de Log Ag50 y Ag50: Se corresponden con la concentración media de alérgeno que produce una inhibición de la unión de IgE a la placa de un 50%.

El valor de LogAg50 se obtiene extrapolando los diferentes porcentajes de inhibición frente a los diferentes logaritmos de concentraciones de alérgeno, para calcular la concentración de alérgeno capaz de provocar un 50% de inhibición.

El valor de Ag50 se obtiene calculando el antilogaritmo del valor de LogAg50. Este valor sirve para comparar extractos alergénicos entre sí, así como una preparación, tratamiento o diagnóstico frente a su IHR.

Límites de aceptación: Los límites de aceptación de Ag50 de un ensayo concreto están comprendidos entre el 50%-150% sobre el valor de Ag50 del extracto de referencia (IHR). Estos límites vienen establecidos por la actual ICH.

1.2.4 ELISA de Phleum pratense Phlp5

Se parte de una solución madre a 2 mg/ml en PBS de anticuerpo monoclonal anti-Phlp5 (1D11). En una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos se pipetean 2.000 ng/pocillo de anticuerpo monoclonal 1D11, diluido en tampón carbonato-bicarbonato 50 mM pH 9,6 (10 pl de anticuerpo monoclonal anti-Phlp5 en 10 ml de tampón carbonato-bicarbonato 50 mM pH 9,6), y se deja incubar toda la noche a 4°C. Transcurrido ese tiempo los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4.

La placa se incuba durante 30 minutos con 100 pl de BSA al 1% en PBS-T (PBS con Tween® 20) al 0,05%.

Para la preparación de las muestras en las que se va a cuantificar el alérgeno mayor Phlp5 se parte de una solución madre a 10 mg/ml, tanto en el IHR como en las muestras problemas, que se lleva a una concentración de 1 mg/ml, usando como diluyente PBS-T al 0,05%-BSA al 1%. A partir de cada dilución de producto a analizar a 1 mg/ml se hacen diluciones 1/200, 1/400 y 1/800, en PBS-T al 0,05%-BSA al 1%.

Paralelamente, se realiza una curva patrón. Para ello, se emplea el estándar “Universal allergen Standard rPhlp5a”, que se encuentra a una concentración de 5.000 ng/ml (Indoor Biotechnologies). En el caso de la curva para el rPhlp5, tiene que abarcar un intervalo desde 250 a 0,98 ng/ml de rPhlp5a, a diluciones de 1:2 de una concentración a otra. Se pipetean directamente en los pocillos 10 pl de rPhlp5a (5.000 ng/ml) sobre 190 pl de BSA al 1% en PBS-T al 0,05% previamente añadidos al pocillo. Trascurridos 30 minutos de incubación en BSA al 1%, los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4. El tratamiento de la placa, a la hora de añadir el estándar “Universal allergen Standard rPhlp5a” comprende, la adición, a cada pocillo, siguiendo el esquema establecido por el operario, de 100 pl de muestra de alérgeno diluido a diferentes diluciones, tanto del IHR como de la muestra problema, y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. Trascurrido ese tiempo de incubación en PBS-T al 0,05%-BSA al 1%, los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4. La placa se incuba durante 1 hora con 100 pl de anticuerpo biotinilado Bo1 (Indoor Biotechnologies) previamente diluido a una dilución 1/1000 en PBS-T al 0,05%-BSA al 1%, es decir, se toman 10 pl de anticuerpo biotinilado Bo1 en 10 ml de PBS-T al 0,05%-BSA al 1%. Este anticuerpo monoclonal se utiliza como anticuerpo secundario. Trascurrido ese tiempo de incubación en PBS-T al 0,05-BSA al 1%, los pocillos se lavan con PBS-T al 0,05% pH 7,4. Posteriormente se añade el conjugado estreptavidina-peroxidasa de Streptomyces avidinii, a dilución 1:1000 en solución de bloqueo (10 pl 10 ml de PBS-T al 0,05%-BsA 1%), a razón de 100 pl por pocillo, y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Trascurrido ese tiempo de incubación en BSA al 1%, los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4.

Para el revelado de la placa se añaden 100 pl por pocillo de H²O² + ABTS dilución 1:1000 (10 pl de H²O² + 10 ml ABTS). La lectura de la placa se realiza en un lector de placas Multiskan Ascent V1.23 a 405 nm.

Los límites de aceptación de la concentración de alérgenos mayores de un ensayo concreto son del 50%-200% sobre el valor de alérgenos mayores del extracto de referencia (IHR). Estos límites vienen establecidos por Farmacopea Europea y Farmacopea FDA.

EJEMPLO 2

Obtención de un extracto alergénico de polen de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído

En un Eurotubo® IVD estéril se pesan 0,4 g de un extracto alergénico (350 mg proteína/g de extracto) liofilizado de Phleum pratense que comprende como mínimo Phlp1, Phlp2, Phlp5, Phlp6, Phlp11 y/o Phlp12 y se diluyen en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, a una concentración entre 0,1 y 3 mg/ml, típicamente, de 1,4 mg/ml de proteína del extracto alergénico de Phleum pratense (100 ml). A continuación, se adicionan, gota a gota, entre 0,1 y 2 ml, típicamente 0,95 ml de glutaraldehído hasta una concentración entre 0,01 M y 0,3 M, típicamente 0,025 M, con agitación suave (80 rpm) en un agitador magnético en cámara fría a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C, durante 24 horas, con lo que se obtiene un extracto alergénico polimerizado crudo.

El extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado crudo se somete a ultrafiltración (UF) de flujo tangencial (Labscale® Millipore) a través de un cartucho de 300 KDa de exclusión molecular (Pellicon® XL Filter Millipore), pasándose 10 volúmenes de agua calidad inyectable respecto al volumen de extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado crudo, en concreto 1.000 ml. El extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado resultante contiene las proteínas polimerizadas con glutaraldehído, con un peso molecular superior a 100.000 Da. La concentración de proteína presente en el extracto alergénico nativo de partida puede determinarse tal como se indica en el Ejemplo 1.

EJEMPLO 3

Obtención de los viales para tratamiento con extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído

El extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído, sometido a UF de flujo tangencial, obtenido en el Ejemplo 2, una vez dializado en un sistema de UF de flujo tangencial Labscale®, se somete a filtración y se ajusta la concentración de dicho extracto alergénico polimerizado según se describe a continuación.

Para llevar a cabo la filtración esterilizante de dicho de extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído, sometido a UF de flujo tangencial, se procede, con carácter previo, a activar el filtro esterilizante de 0,22 micrómetros (|jm) de polietersulfona. Se añaden 2 ml de manitol (5 mg/ml) al filtro y se deja incubar durante 5 minutos; a continuación, se abre la válvula del sistema de vacío hasta que se filtre todo el tampón (manitol en agua de inyección a 5 mg/ml) y, posteriormente, se cierra la válvula del sistema de vacío. Este proceso se repite una vez más. A continuación, se deja secar el filtro durante 30 minutos (15 minutos con vacío abierto y otros 15 minutos con vacío cerrado), se añaden 2,5 ml de la muestra a filtrar (extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído, sometido a UF de flujo tangencial) y se abre la llave de vacío hasta que se seque el filtro durante 10 minutos, repitiéndose este paso 2 veces más. Finalmente, el filtro se deja secar durante 10 minutos.

Una vez activado el filtro esterilizante de 0,22 jm de polietersulfona, el extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído, sometido a UF de flujo tangencial, se somete a filtración esterilizante. Para ello, antes de proceder a filtrar dicho extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído sometido a UF de flujo tangencial, se toma una muestra de 2 ml para analizar la carga biológica del producto. A continuación, se abre el vacío y se añade el extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído sometido a UF de flujo tangencial para que se filtre y, una vez filtrado, se pasa a una cámara estéril a través del sistema SAS [del inglés “Security Air System”]. Una alícuota de 10 ml de dicho extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído sometido a UF de flujo tangencial y a filtración esterilizante se analiza mediante el ensayo de Bradford [Bradford, M.M. (1976), Anal. Biochem. 72: 248-254] para determinar la cantidad de proteína presente en dicho extracto, y, posteriormente, producir el envasado a granel. El extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído sometido a UF de flujo tangencial y a filtración esterilizante se diluye en diluyente crioprotector (manitol a 10 mg/ml) para obtener una concentración final comprendida entre 0,001 y 1.000 jg de proteína por mililitro (ml) en el extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído sometido a UF de flujo tangencial y a filtración esterilizante. Tras el ajuste a concentración de tratamiento de proteína el producto a granel obtenido es dosificado en viales de 2 ml de capacidad a razón de 1 ml/vial. Los viales, una vez dosificados, son liofilizados introduciéndolos en un liofilizador Telstar y realizando un ciclo completo de liofilización, terminando con el cierre al vacío de los viales.

EJEMPLO 4

Estudio de la inmunogenicidad a extractos alergénicos de polen de Phleum pratense nativos y polimerizados con glutaraldehído

Se realizó este ensayo en colaboración con el Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, de la Facultad de Farmacia (Universidad del País Vasco), para estudiar la inmunogenicidad a extractos alergénicos de Phleum pratense nativos y polimerizados con glutaraldehído.

Para ello, se obtuvieron antisueros frente a extracto alergénico de Phleum pratense nativo (nPh.p) o polimerizado con glutaraldehído (pPh.p) mediante inoculación subcutánea (SC) o intradérmica (ID) de dichos extractos en 10 conejos albinos neozelandeses de aproximadamente 2,5 kg de peso inicial, según la Tabla 1.

Tabla 1

Inoculación

- Inoculación subcutánea (SC): los inóculos para la administración SC se prepararon diluyendo los viales que contienen (i) extracto alergénico de Phleum pratense nativo (10 |jg en 1 ml de solución salina fisiológica fenolada al 0,2%, con hidróxido de aluminio como adyuvante), obtenido según el protocolo descrito en el Ejemplo 1, aplicado a la obtención de un extracto alergénico de Phleum pratense nativo, o (ii) extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante (“alergoide”) -de acuerdo a los Ejemplos 2 y 3-(10 jg de alergoide y 10 mg de manitol en 1 ml de solución salina fisiológica fenolada al 0,2% y con adyuvante), inyectándose 0,5 ml por dosis.

- Inoculación intradérmica (ID): los inóculos para la administración ID de (i) extracto alergénico de Phleum pratense nativo (10 jg ) [obtenido según el protocolo descrito en el Ejemplo 1, aplicado a la obtención de un extracto alergénico de Phleum pratense nativo] o (ii) extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante -de acuerdo a los Ejemplos 2 y 3-(10 jg de alergoide y 10 mg de manitol, se reconstituyeron en 0,2 ml de solución salina fisiológica fenolada al 0,2%), inyectándose 0,1 ml por dosis.

Pauta de inmunización

Las inmunizaciones se llevaron a cabo durante 7 semanas tras las cuales se procedió a la sangría final del animal, después de la titulación del suero, cuyos resultados se expresan en tablas y figuras a continuación.

Resultados

Los resultados obtenidos se especifican en las figuras que se muestran más adelante (Figuras 1-4). En general, la titulación de los antisueros (sueros hiperinmunes) obtenidos de los conejos mostró que los títulos obtenidos por ambas vías de administración (SC e ID) para los extractos alergénicos de polen de Phleum pratense nativos y polimerizados con glutaraldehído mostraban curvas de titulación similares y que la vía SC permitía obtener mayores títulos (máximos 1:1 -1:2000) en menor tiempo (7 semanas) que la vía ID (máximos 1:1 - 1:1000 en 14 semanas), si bien los volúmenes de extracto alergénico de Phleum pratense administrados por dosis fueron de 0,5 ml para la vía SC y de 0,1 ml para la vía ID y que en la vía SC empleó hidróxido de aluminio como adyuvante.

EJEMPLO 5

Disminución de alergenicidad (Valores Ag50 y liberación de histamina)

5.1 Valores Ag50

En el Ejemplo 1 se describe un protocolo para obtener y caracterizar un extracto alergénico de polen de Phleum pratense nativo del que se podría obtener un extracto alergénico de polen de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído, tal como el descrito en los Ejemplos 2 y 3.

Ensayos realizados con dicho extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído según los Ejemplos 2 y 3 han puesto de manifiesto la presencia de todos los alérgenos y sus isoformas descritas mediante HPSEC (del inglés, “High-Performance Size Exclusion Chromatography); asimismo, el proceso de polimerización muestra la ausencia de bandas fijadoras de IgE en los rangos de peso molecular (PM) de los alérgenos descritos mediante técnicas de inmunofijación y de ELISA de inhibición que muestran la disminución de la capacidad fijadora de IgE del extracto polimerizado frente al extracto nativo en términos de potencia relativa estableciendo una pérdida de la misma para el extracto polimerizado superior al 97%.

La Tabla 2 refleja las pérdidas de potencia (valores Ag50) de los tres lotes validados de extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante de acuerdo con los Ejemplos 2 y 3.

Definición de Ag50: Ag50 se define como la concentración de extracto alergénico que inhibe el 50% de la IgE específica presente en el suero, mediante técnicas de enzimoinmunoadsorción o radioinmunoadsorción. La técnica consiste en valorar la potencia de un extracto alergénico frente a un suero rico en IgE específica frente a un determinado alérgeno. La competencia de la IgE por el alérgeno fijado o en solución, se determina en función a la denominada Ag50 o concentración del alérgeno que inhibe el RAST o el ELISA al 50%. En términos generales, se puede definir que un extracto alergénico es tanto o más potente cuanto más inhibe el RAST o el ELISA, es decir, cuanto menor sea la concentración del extracto alergénico que induce el 50% de inhibición (valor Ag50).

Tabla 2

Phleum Polimerizados: Extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante (Ejemplos 2 y 3).

Phleum Nativos: Extracto alergénico de Phleum pratense nativo [este extracto puede obtenerse siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 1].

La potencia relativa (PR), definida en base a la determinación de las Ag50 establecidas para el extracto alergénico de Phleum pratense nativo frente al extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:

PR = Valor Ag50 Phleum polimerizado/Valor Ag50 Phleum nativo

donde

- “Valor Ag50 Phleum polimerizado” se refiere al Ag50 establecido para el extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante; y

- “Valor Ag50 Phleum nativo” se refiere al Ag50 establecido para el extracto alergénico de Phleum pratense nativo.

De este modo, el valor de la PR obtenido es de 18,0603/0,343 = 52,654, que resulta de dividir el valor de Ag50 Phleum polimerizado (media de los 3 lotes) entre el valor de Ag50 Phleum nativo (media de los 3 lotes), según los valores indicados en la Tabla 2.

5.2 Liberación de histamina

El ensayo de liberación de histamina de basófilos de pacientes alérgicos utilizado es un método aprobado para evaluar la alergenicidad de las preparaciones alergénicas [Siraganian RP: An automated continuous flow system for the extraction and fluorimetric analysis of histamine. Anal Biochem 57:388-394, 1974. Hans J Maasch y David G. Marsh. Standardized extract modified allergens allergoids. Clin rev allergy. 5: 89-106; 1987].

Se trata de un ensayo in vitro para detectar histamina liberada por métodos de fluoroenzimoinmunoensayo tras la activación alergénica de basófilos por el uso de un método de detección fluorométrica patentado (Reflab, Denmark). La prueba se realiza con los leucocitos de una muestra de sangre completa heparinizada lavada y estimulada con extracto alergénico de Phleum pratense nativo y con extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante (Ejemplos 2 y 3), en placas de ELISA. La histamina liberada es absorbida por una matriz de fibra de vidrio en el interior del pocillo (muy afín y selectiva) y posteriormente detectada fluorométricamente.

Los resultados revelan la variación en el reconocimiento de ambos extractos y por tanto su alergenicidad. La reducción de la liberación de la histamina a igualdad de concentración proteica inducida por parte del alergoide de Phleum pratense respecto del extracto alergénico no modificado (nativo) puede variar de paciente a paciente. Presumiblemente debido a que cada paciente reconoce diferentes determinantes alergénicos [Hans J Maasch y David G. Marsh. Standardized extract modified allergens allergoids. Clin rev allergy. 5: 89-106; 1987].

Los inventores establecieron un valor superior a, al menos 50, preferentemente, 200 veces en la liberación de histamina para el extracto alergénico de Phleum pratense nativo frente al extracto de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante, dato en consonancia con lo indicado bibliográficamente por otros autores [Hans J Maasch & David G. Marsh, Standardized extract modified allergens allergoids. Clin Rev Allergy. (1987). 5: 89-106] (Figura 5).

Sin embargo, el grado de reducción de la alergenicidad en este tipo de pruebas puede variar entre individuos.

EJEMPLO 6

Seguridad y eficacia del método

La prueba intradérmica (ID) es un método habitual para el diagnóstico del agente etiológico involucrado en la enfermedad alérgica. Una vez establecido el diagnóstico etiológico (alérgeno causal), la modificación de su estructura con glutaraldehído permite mantener su carácter inmunogénico y disminuir su alergenicidad (capacidad de inducir síntomas clínicos). El Ejemplo 4 ilustra el mantenimiento de la inmunogenicidad en el extracto alergénico de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído y sometido a UF tangencial y filtración esterilizante, al demostrarse los títulos de los anticuerpos específicos obtenidos en los conejos y la disminución de la alergenicidad mediante las pruebas de inhibición de IgE, potencia alergénica y liberación de histamina específica de alérgeno mostrados en el Ejemplo 5.

El método de utilización de la vía ID con fines terapéuticos, puede ser establecido sobre estos conceptos en términos de seguridad, conociendo la concentración del extracto de alergoide polimerizado que negativiza la prueba cutánea ID, en términos de área de pápula o de eritema habituales para la interpretación correcta en el diagnóstico ID.

En cuanto a la eficacia, se ha mostrado que la vía ID es una vía habitualmente empleada en la inmunización frente a agentes infecciosos [por ejemplo, gripe, rabia, hepatitis A y B, influenza, paperas, tétanos, fiebre amarilla, difteriatétanos-tosferina (Informe PATh - Intradermal Delivery of Vaccines. A review of the literature and the potential for development for use in low- and middle-income countries. 27 de agosto, 2009)].

En el caso específico de la inmunización con alérgenos, el rango de concentración de tratamientos habituales en inmunoterapia (IT) con alérgenos, se corresponde con la concentración preconizada por la OMS y detallada en los Ejemplos 2 y 3, y ratificada en cuanto a inmunogenicidad en el Ejemplo 4 y conforme a los valores de alérgenos del informe de la o Ms sobre uso de IT con alérgenos [Allergy 44 (53), 2-42, 1998].

Estos datos apoyan que los conceptos de “dosis máxima tolerada” y “dosis óptima” pueden ser establecidos por la vía de administración ID, lo cual conlleva a que la administración de alérgenos en IT puede ser establecida de una forma segura, con ausencia de efectos secundarios, y, eficaz, pues el rango de concentraciones a emplear por cada alérgeno, puede ser establecido previamente mediante la prueba cutánea ID con el alergoide.

La seguridad de la dosis óptima puede ser previamente establecida mediante un estudio de titulación a punto final con el extracto alergénico polimerizado, en una población de pacientes sensibilizados frente al alérgeno causal, con el alérgeno polimerizado.

Por tanto, el concepto de dosis máxima eficaz queda establecido por la concentración del extracto polimerizado, conforme al informe de la OMS, al emplear un extracto polimerizado que permite incrementar las concentraciones y ajustar las dosis eficaces preconizadas por sus características demostradas en los Ejemplos 4 y 5 de disminución de su alergenicidad.

6.1 Ensayo clínico

Para el objetivo principal de obtener la dosis máxima no reactiva de alergoide de Phleum pratense (alérgeno de Phleum pratense polimerizado con glutaraldehído) se ha realizado un ensayo clínico unicéntrico, abierto y controlado con extracto nativo, para la obtención de la dosis máxima no reactiva (titulación a punto final), con el alergoide de Phleum pratense polimerizado, obtenido y caracterizado como se ha mencionado en los Ejemplos 1-5, en pacientes con rinoconjuntivitis alérgica con o sin asma leve o moderado intermitente, sensibilizados al polen de la gramínea Phleum pratense. Como objetivo secundario de dicho ensayo clínico se ha evaluado la seguridad de dicho alergoide de Phleum pratense administrado por vía intradérmica. También se han evaluado las variables de diagnóstico, incluido el diagnóstico molecular, de alergia frente a Phleum pratense.

Número de Pacientes: Se reclutaron 29 pacientes. El análisis de la variable principal del estudio se realizó con los datos de 20 pacientes.

Diagnóstico y principales criterios de inclusión:

1. Pacientes con edades comprendidas entre los 18 y 50 años (ambos inclusive).

2. Demostración de sensibilidad a la fuente alergénica:

- Presencia de IgE específica a Phleum pratense igual o superior a (>) 3,5 KU/L (CAP)

- Pruebas cutáneas específicas de alérgeno positivas (Phleum pratense), al menos con una pápula de igual o superior a (>) 3 mm con respecto al control negativo.

3. Demostración clínica de patología concordante con cuadros de rinitis o rinoconjuntivitis con o sin asma leve o moderado intermitente asociada.

4. Paciente capaz de cumplir con el tratamiento.

5. Las mujeres en edad fértil deben presentar una prueba de embarazo en orina con resultado negativo en los 7 días previos a la inclusión en el ensayo.

6. Pacientes que respondan a los criterios anteriores y que considere el investigador que se ha mantenido estable respecto a su enfermedad alérgica durante los 6 meses previos a la entrada en el estudio.

Todos los pacientes del ensayo otorgaron su consentimiento informado para participar en el estudio.

Fármacos y controles utilizados en el ensayo:

- Fármaco experimental: Alergoide de Phleum pratense polimerizado y liofilizado, obtenido y caracterizado según los Ejemplos 1-5. Dosis: 5; 1; 0,2 y 0,04 |jg de proteína/ml. Vía intradérmica. Lote: 110603

- Control Positivo: Extracto nativo de Phleum pratense. Dosis: 0,5 ng/ml. Vía intradérmica. Lote: 120912A.

- Control Negativo: Manitol en solución salina fisiológica. Dosis: 10 mg/ml de manitol con solución salina al 0,9%. Vía intradérmica. Lote: 120912A.

Duración del tratamiento: 1 día de tratamiento 1 mes de seguimiento.

Metodología del estudio:

Tras la reconstitución del fármaco en estudio y los controles se procedió a su inyección por vía intradérmica (0,1 ml) en la parte volar del antebrazo. Los pacientes recibieron 6 administraciones en total: 4 para el fármaco experimental a distintas concentraciones (5; 1; 0,2 y 0,04 jg de proteína /ml), 1 para el control positivo y 1 para el control negativo. A los 15 minutos se midió la reacción producida (pápula) alrededor de los puntos de inyección. Se consideró “dosis no reactiva” aquella que provocó un crecimiento del diámetro de la pápula inferior a los 3 mm sin acompañamiento de eritema.

Criterios de evaluación:

Variable principal:

Medición del diámetro mayor de la pápula. Se considera dosis no reactiva aquella que provoque una diferencia del diámetro mayor de la pápula inferior a los 3 mm. Para obtener la diferencia de diámetro, se realiza una medida de la pápula inmediatamente después de la administración del tratamiento (diámetro de pápula inicial), y una segunda medida a los 15 minutos (diámetro de pápula final).

Variables secundarias:

• Medición del diámetro mayor de eritema a los 15 minutos y búsqueda de equivalencia con el diámetro de pápula observado para cada paciente.

• Valoración de la seguridad mediante documentación y seguimiento de los sucesos adversos locales y/o sistémicos que pudieran generarse en el transcurso del ensayo.

• Valoración de variables de diagnóstico molecular en muestras sanguíneas (IgE específica total, IgE específica frente a Phl p 1 y 5, IgG, IgG4).

Métodos Estadísticos:

Variable principal

Se realizó el logaritmo en base 5 del crecimiento de diámetro mayor de pápula para cada una de las cuatro concentraciones utilizadas en el estudio, en cada uno de los pacientes y se calculó una recta de regresión de mínimos cuadrados con los valores logarítmicos de diámetro de pápula frente al logaritmo en base 5 de la concentración de las dosis aplicadas.

Se realizó una interpolación sobre los valores logarítmicos de concentración frente al valor logarítmico en base 5 equivalente a un aumento de diámetro mayor de pápula de 2,9 mm, valor más alto que se considera negativo en la prueba cutánea.

Al valor obtenido de la interpolación, se le aplicó la quinta potencia para obtener un valor de concentración equivalente a un aumento de diámetro mayor de pápula de 2,9 mm.

Se ordenaron los datos de concentración de menor a mayor y se calculó la mediana.

Variables secundarias:

• Medición de la suma del diámetro mayor de eritema a los 15 minutos y búsqueda de equivalencia con el diámetro de pápula observado para cada paciente.

Se calculó el logaritmo en base 5 del diámetro mayor de eritema para cada una de las cuatro concentraciones utilizadas en el estudio, en cada uno de los pacientes. Sobre el logaritmo en base 5 se realizó una interpolación sobre los valores logarítmicos de diámetro frente al valor logarítmico en base 5 equivalente a una concentración de 0,27 |jg prot/ml de Phl p polimerizado, valor más alto que se considera negativo en la prueba cutánea valorando crecimiento del diámetro mayor de pápula. Al valor obtenido de la interpolación se le aplicó la quinta potencia para obtener un valor de diámetro mayor de eritema que se considera negativo en la prueba cutánea.

• Evaluación de Seguridad: Análisis descriptivo de los sucesos adversos locales y sistémicos, tipificados por su gravedad y frecuencia.

• Análisis cuantitativo de la variación de los niveles de IgE específica total, IgE específica frente a Phl p 1 y 5, IgG, IgG4, tras el tratamiento respecto a sus correspondientes niveles basales, mediante el método comercial de ImmunoCAP®.

Resultados:

Variable principal: Se obtuvo un valor de 0,27 jg prot/ml como concentración de Phleum pratense polimerizado que se considera negativo en la prueba cutánea.

Variable secundaria:

• El diámetro mayor de eritema que se considera negativo en la prueba cutánea se estableció en 7 mm. • No hay cambios estadísticamente significativos en la variación de los niveles de IgE específica total, IgE específica frente a Phl p 1 y 5, IgG e IgG4.

• No se produjeron sucesos adversos.

Conclusión:

Se ha establecido el valor de la dosis máxima no reactiva de Phleum pratense polimerizado administrado por vía intradérmica, objetivo del estudio, en 0,27 jg prot/ml. Además, se estableció el diámetro mayor de eritema que se considera negativo en la prueba cutánea en 7 mm.

La alta tolerabilidad del tratamiento y la ausencia de sucesos adversos indican que la inyección intradérmica de Phleum pratense polimerizado es una vía de administración segura para los pacientes. Esto es importante de cara al desarrollo del tratamiento de inmunoterapia con el alergoide Phleum pratense polimerizado.

La evaluación de variables de diagnóstico, incluido el diagnóstico molecular, de alergia frente a Phleum pratense no muestra variaciones estadísticamente significativas (p<0.05) de los niveles de inmunoglobulinas finales respecto a los iniciales.

EJEMPLO 7

Estudios de disminución de potencia entre alérgeno nativo y polimerizado con glutaraldehído para Parietaria judaica y Artemisia vulgaris

7.1 Materiales

La materia prima de los pólenes de Parietaria judaica y Artemisia vulgaris fue procesada tal y como se describe en el ejemplo 1, apartado 1.1, relativo a la obtención de un extracto alergénico de polen de la patente para la obtención de extractos alergénicos nativos.

A continuación, se procedió a la caracterización del extracto alergénico nativo tal y como se describe en el punto 1.2, apartado 1.2.1 “Electroforesis en gel de poliacrilamida” del ejemplo 1.

Los extractos nativos de Parietaria judaica y Artemisia vulgaris fueron polimerizados con glutaraldehído de manera análoga a la descrita para Phleum pratense. Brevemente, en un Eurotubo® IVD estéril se pesan los gramos necesarios de extracto alergénico liofilizado para obtener una concentración comprendida entre 0,1 y 3 mg/ml de proteína, usando como diluyente tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4. A continuación, se adiciona, gota a gota, glutaraldehído, hasta obtener una concentración de entre 0,01 M y 0,3 M, con agitación suave (80 rpm) en un agitador magnético en cámara fría a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C, durante 24 horas, con lo que se obtienen los correspondientes extractos alergénicos polimerizados crudos.

Los extractos alergénicos polimerizados crudos se someten a UF tangencial (Labscale® Millipore) a través de un cartucho de 300 kDa de exclusión molecular (Pellicon® XL Filter Millipore), pasándose 10 volúmenes de agua de calidad inyectable respecto al volumen de extracto alergénico polimerizado crudo. Los extractos alergénicos polimerizados resultantes contienen las proteínas polimerizadas con un peso molecular superior a 100.000 Da.

7.2 Métodos

7.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Tampones y disoluciones

Acrilamida/Bisacrilamida, Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8; Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (concentrador); Disolución de dodecilsulfato sódico (SDS) al 10 %; Persulfato amónico 30 mg/ml; Temed (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina); Tampón de muestra 5X; Tampón de electrodos pH 8,3; Patrón de pesos moleculares; Disolución de Coomassie (Tinción); Solución desteñidora de Coomassie.

Método

Los geles empleados se preparan con las siguientes proporciones de acrilamida: gel separador 12,5% y gel concentrador 4%.

Se cargan 15 |jg extracto proteico/carril para la tinción de Coomassie (se cargan 10 j l de una muestra diluida a 1,5 mg extracto proteico/ml)

Una vez diluidas las muestras a la concentración de proteína necesaria para la tinción, se procede a preparar las muestras; para ello, se toman en un eppendorf 80 j l de la dilución obtenida anteriormente y 20 j l de tampón de muestra 5X (relación 4:1) y la mezcla se calienta durante 8 minutos a aproximadamente 100°C. Tras su enfriamiento (temperatura ambiente), los restos insolubles se eliminan por centrifugación durante 5 minutos a 14.000 rpm.

Condiciones electroforéticas

Se dispensan:

- en un carril, 7 j l de patrón de pesos moleculares para Tinción de Coomassie,

- en un carril, 10 j l de IHR (patrón de referencia interno), y

- en tres carriles, 10 j l de extracto alergénico polimerizado a analizar.

Cuando el frente de migración se encuentre cerca del final del gel, aproximadamente a los 45 minutos de haberse iniciado la electroforesis, se desconecta la fuente y se saca el gel. Posteriormente se procede a la tinción y destinción del gel dependiendo de la concentración de proteína que tenga cada muestra:

- Tinción de Coomassie: Se coloca el gel en una placa de 10 cm x 10 cm y se añade la solución de Coomassie.

Tinción: 1 hora a 60°C, 2 h a 37°C, o 12 h a temperatura ambiente.

- Solución desteñidora de Coomassie: Se añade la solución desteñidora de Coomassie, hasta que el fondo del gel quede casi transparente y se visualicen bien las bandas del patrón y las muestras. Una vez que esté totalmente decolorado, desechar la solución y añadir agua para que se encuentre en las condiciones óptimas de hidratación.

La determinación de los pesos moleculares se lleva a cabo por el método de Weber y Osborn [Weber, K. & Osborn, M. J. Biol. Chem. 244:4406-4412 (1969)], construyendo una recta de calibrado, representando la movilidad (en mm) manifestada por una serie de proteínas frente al logaritmo de su peso molecular (conocido). La movilidad se mide desde el comienzo del gel separador hasta el punto medio de la banda. Una vez demostrada la correlación entre ambas variables (r> 0,90), la determinación de pesos moleculares se lleva a cabo con un programa informático (Diversity database) basado en el método de Weber y Osborn. Los pesos moleculares de las proteínas utilizadas como patrones son: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20,15 y 10 kDa.

7.2.2 ELISA de inhibición con suero humano

Se pesan los productos a analizar (aproximadamente 5-6 mg) en una balanza. Las muestras pesadas se reconstituyen a 10 mg/ml con agua pura, se agita y se centrifugan durante 5 minutos a 14.000 rpm.

Se prepara una solución del extracto de referencia (IHR) a analizar en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9,6 a una concentración de 250 jg/m l (6 ml de tampón carbonato/bicarbonato y 150 j l del IHR a una concentración de 10 mg/ml a analizar).

Se pipetean 50 j l de la solución del IHR (250 jg/m l) en los 96 pocillos de la placa de ELISA y se cubre la placa para evitar la evaporación. Se incuba a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C en nevera durante toda la noche.

La placa de ELISA se lava con PBS-Tween® 20 al 0,05%, pH 7,4, en un aparato lavador Biotek Elx50. A continuación, se bloquea añadiendo 200 jl/pocillo de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05% y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.

Preparación de las muestras a analizar. Los extractos alergénicos a analizar se preparan a una concentración 5 veces superior a la del IHR para el primer punto de la recta. A partir de ese primer punto se realizarán diluciones a la mitad en BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05%.

Para la preparación del control positivo (BSA suero humano) se añaden a un tubo eppendorf 90 j l de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05% (en lugar de la muestra) más 90 j l del correspondiente suero humano.

Para la preparación del control negativo (BSA) se añaden a un tubo eppendorf 180 j l de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05%.

Las muestras se incuban, junto con el control positivo y el control negativo, durante 1 hora a temperatura ambiente y con rotación. Transcurrido el tiempo de incubación de las muestras, se centrifugan durante 10 segundos a 14.000 rpm. Se pipetean 50 j l de las muestras en una placa de ELISA y se incuba la placa durante 2 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de bloqueo (2 horas), se lava la placa de ELISA con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4. Se añaden 50 jl/pocillo de anticuerpo primario anti-IgE a una dilución de 1/1000 y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lava con PBS-Tween® 20 al 0,05%, pH 7,4. A continuación, se añaden 50 jl/pocillo de anticuerpo secundario anti-IgG a una dilución 1/500 y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05% pH 7,4. Posteriormente, se añaden 50 jl/pocillo del conjugado estreptavidina-peroxidasa de Streptomyces avidinii, a una dilución de 1:250 (24 j l 6 ml de BSA al 1% en PBS-Tween® 20 al 0,05%) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan con PBS-Tween® 20 al 0,05%, pH 7,4. Seguidamente, se añaden 50 jl/pocillo de H²O² + ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) a una dilución de 1:1000 (6 j l de H²O² + 6ml ABTS). La lectura de la placa se realiza utilizando un lector de placas Multiskan Ascent V1.23.

Se calcula la Ag 50 para cada alergoide ensayado:

Valor de Log Ag50 y Ag50: Se corresponden con la concentración media de alérgeno que produce una inhibición de la unión de IgE a la placa de un 50%.

El valor de LogAg50 se obtiene extrapolando los diferentes porcentajes de inhibición frente a los diferentes logaritmos de concentraciones de alérgeno, para calcular la concentración de alérgeno capaz de provocar un 50% de inhibición.

El valor de Ag50 se obtiene calculando el antilogaritmo del valor de LogAg50. Este valor sirve para comparar extractos alergénicos entre sí, así como una preparación, tratamiento o diagnóstico frente a su IHR.

Límites de aceptación: Los límites de aceptación para los alergoides se fijan en una pérdida de potencia, calculada por comparación de Ag50, con respecto al IHR de más del 90%.

7.2.3 Procedimiento semiseco de inmunotranferencia

Para realizar este procedimiento se parte de una electroforesis realizada según las condiciones descritas en el método “Electroforesis en gel de poliacrilamida”, explicado anteriormente.

A continuación, se cortan la membrana de PVDF y el filtro de papel a las dimensiones del gel y se introduce el filtro de papel en una cubeta con tampón de transferencia. Dada la naturaleza hidrofóbica de la membrana y para permeabilizarla, se le da el siguiente tratamiento en una cubeta y con agitación suave durante 10 segundos en metanol. A continuación, se desecha el metanol en un contenedor de residuos y se sumerge 1 minuto en agua pura. Por último, se desecha el agua en uncontenedor de residuos y se sumerge 15 minutos en tampón de transferencia, junto con los filtros de nitrocelulosa.

El gel recibe un tratamiento de equilibrio previo sumergiéndolo una vez acabada la electroforesis en tampón de transferencia durante 1 minuto aproximadamente.

A continuación, se sitúan los componentes de transferencia en la placa del aparato transferidor. Para ello, se abre el transferidor, se humedece la plancha inferior gris con tampón de transferencia. A continuación, se coloca el filtro de papel inferior, humedecido en tampón de transferencia. Seguidamente se coloca la membrana de PVDF, y el gel, al cual se le habrán cortado previamente los pocillos de carga, sobre la membrana. Se debe tener cuidado de que no queden burbujas. Por último, colocar el segundo filtro de papel, la plancha superior y la tapa del transferidor.

A continuación, se calcula el área del gel en cm2 (lado x lado), se multiplica por la constante 5,5 y se divide entre por 1000. Este valor equivale a los miliamperios (mA) que se requieren para la transferencia. El tiempo aproximado de la transferencia es de 45 minutos. Se selecciona en la fuente de alimentación el amperaje y el tiempo necesarios y se presiona el botón START.

Inmunodetección de proteínas transferidas a la membrana

Las proteínas transferidas a la membrana de PVDF se detectan por el método de Shen et al. (1988) con modificaciones. Una vez transferidas las proteínas, la membrana se corta para separar los diversos carriles que se vayan a incubar individualmente, en función del alérgeno que se va a detectar. Se corta la esquina inferior izquierda de cada uno de los segmentos para conocer la orientación de la membrana.

Se incuba la membrana durante 1 hora con agitación suave y constante a temperatura ambiente con tampón PBS-Tween al 0,5% para saturar la membrana (bloqueo de la membrana) y así evitar la posterior unión inespecífica, tanto de inmunoglobulinas como de conjugados inmunoglobulina.

Para eliminar los restos del tampón de saturación anterior, la membrana se lava con tampón PBS-Tween al 0,05%. Se realizan 5 lavados de 5 minutos cada uno de ellos, a temperatura ambiente y con agitación suave y constante.

A continuación, se incuba la membrana con el suero correspondiente diluido en PBS-Tween al 0,05% a 4°C y con agitación constante durante toda la noche (aproximadamente 16 h) en una bolsita de plástico sellada previamente.

Tras la incubación con suero, los anticuerpos no fijados se eliminan mediante 5 lavados de 5 minutos con tampón PBS-Tween al 0,05% a temperatura ambiente y con agitación suave y constante.

La membrana se incuba con el anticuerpo anti IgE humana de ratón, que se diluye a una dilución de 1/1000 en tampón PBS-Tween al 0,5%. A continuación se añade a la membrana un volumen suficiente para cubrirla. Se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente, con agitación constante.

Para eliminar el conjugado no fijado, se efectúan 5 lavados de 5 minutos con tampón PBS-Tween al 0,05% a temperatura ambiente y con agitación suave y constante.

Revelado del inmunocomplejo utilizando reactivos PerkinElmer

Se preparan los reactivos de revelado: revelador/reforzador, dilución 1/5 (160 m1H²O² y 40 ml Reactivo) en cubeta n°1. Agua pura en cubeta n°2. Fijador, dilución 1/4 (150 ml H²O² y 50 ml Reactivo) en cubeta n°3 y agua pura en cubeta n°4.

Seguidamente, se mezclan las soluciones reactivo luminol potenciado (A) y reactivo oxidante (B) inmediatamente antes de usar, en una proporción de 1:1 (por ejemplo: 1 ml de solución A 1 ml de solución B = 2 ml, para dos carriles de alérgeno). El volumen total necesario dependerá del número de carriles a revelar. El volumen final requerido es de 0,1 ml/cm2 de membrana. Este reactivo se deja preparado para el siguiente paso.

A continuación, se retira el exceso del tampón de lavado de la membrana, y se coloca la membrana sobre un cristal, un plástico u otra superficie limpia, con el lado que tiene las proteínas adsorbidas hacia arriba. A partir de este momento el proceso debe realizarse en habitación oscura, con luz roja de seguridad.

Se añade el reactivo preparado en el paso anterior. La superficie de la membrana tiene que estar totalmente sumergida. Se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se retira el exceso de mezcla de detección (por ejemplo, sosteniendo la membrana en posición vertical, y después dejar que escurra el líquido hacia abajo, tocar su extremo inferior con un papel secante para retirar el líquido acumulado en el borde inferior).

Se coloca la membrana sobre un plástico, con la cara que lleva las proteínas adsorbidas hacia arriba. Se envuelve la membrana en un plástico transparente y, con cuidado y suavemente, se retiran las burbujas de aire que quedan entre el plástico y la membrana, evitando aplicar presión sobre la membrana. Se sitúa la membrana envuelta en el plástico dentro del casete de revelado con el lado que lleva las proteínas absorbidas hacia arriba, asegurándose de que el casete está seco (no debe haber restos de reactivo humedeciendo el casete) y la película tampoco debe humedecerse.

Se coloca una película de revelado encima de la membrana y el plástico. Se cierra el casete y se expone durante 1 minuto. Se retira la película expuesta con pinzas y guantes y se coloca otra sin exponer directamente encima de la membrana.

Se revela la primera película inmediatamente, pasándola 10 segundos por cada uno de los 4 reactivos preparados anteriormente (en el revelador/potenciador tendrá que estar expuesto hasta la aparición de las manchas negras, que corresponden con las bandas fijadas por la unión de IgE a la membrana).

En función del resultado en la primera película, se estimará cuanto tiempo se debe mantener la exposición en la segunda. Esta exposición, puede variar entre 1 minuto y 1 hora, dependiendo de la intensidad con la que se aprecien las bandas.

7.3 Resultados

7.3.1 Caracterización bioquímica y ELISA de inhibición de un extracto alergénico de polen de Parietaria judaica polimerizado con glutaraldehído frente a un extracto alergénico de polen de Parietaria judaica nativo

En la Figura 6, se muestra mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coomassie, la comparativa entre el extracto nativo (Par j 001-10, carril 2) y el polimerizado con glutaraldehído (Par j 003p-11, carriles 3.4 y 5). La figura muestra cómo al contrario del alérgeno nativo, que muestra bandas electroforéticas a distintos niveles, el alérgeno polimerizado, no presenta bandas electroforéticas por debajo de 100 kDa.

En la Figura 7, se muestra mediante inmunotransferencia, la comparativa entre el extracto nativo (Par j 001-10, carril 2) y el polimerizado con glutaraldehído (Par j 003p-11, carril 3). La figura muestra cómo al contrario del alérgeno nativo, que muestra fijación de IgE específica a distintos niveles, el alérgeno polimerizado, no presenta fijación de IgE específica debajo de 100 kDa.

En la Figura 8, se muestra mediante ELISA de inhibición, la comparativa entre el extracto nativo (Par j 001-10) y el polimerizado con glutaraldehído (Par j 003p-11), observándose una pérdida de potencia del 91,46%.

7.3.2 Caracterización bioquímica y ELISA de inhibición de un extracto alergénico de polen de Artemisia vulgaris polimerizado con glutaraldehído frente a un extracto alergénico de polen de Artemisia vulgaris nativo

En la Figura 9, se muestra mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coomassie, la comparativa entre el extracto nativo (Art v 001-06 y Art v 001-10, carriles 2 y 3) y el polimerizado con glutaraldehído (Art v 002p-12, carriles 4, 5 y 6). La figura muestra cómo al contrario de los alérgenos nativos, que muestran bandas electroforéticas a distintos niveles, el alérgeno polimerizado, no presenta bandas electroforéticas por debajo de 100 kDa.

En la Figura 10, se muestra mediante inmunotransferencia, la comparativa entre el extracto nativo (Art v 001-06 y Art v 001-10, carriles 2 y 3) y el polimerizado con glutaraldehído (Art v 002p-12, carril 4). La figura muestra cómo al contrario de los alérgenos nativos, que muestran fijación de IgE específica a distintos niveles, el alérgeno polimerizado, no presenta fijación de IgE específica debajo de 100 kDa.

En la Figura 11, se muestra mediante ELISA de inhibición, la comparativa entre el extracto nativo (Art v 001-10) y el polimerizado con glutaraldehído (Art v 002p-12), observándose una pérdida de potencia del 98,91%.

7.4 Discusión

El proceso de polimerización con glutaraldehído muestra la ausencia de bandas fijadoras de IgE específica en los rangos de peso molecular (PM) de los alérgenos descritos mediante técnicas de inmunofijación y de ELISA de inhibición que muestran la disminución de la capacidad fijadora de IgE de los extractos polimerizados con glutaraldehído frente a los extractos nativos en términos de potencia relativa (PR), observándose una pérdida de la misma para el extracto alergénico de Parietaria judaica polimerizado con glutaraldehído del 91,4% y del 98,9% del extracto alergénico de Artemisia vulgaris polimerizado con glutaraldehído.

EJEMPLO 8

Obtención de los viales para tratamiento con extracto alergénico de Dermatophagoides pteronvssinus polimerizado con glutaraldehído

En un Eurotubo® IVD estéril se pesan alrededor de 0,3 g de un extracto alergénico (250 mg proteína/g de extracto) liofilizado de Dermatophagoides pteronyssinus que comprende al menos Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 6 y Der p 10. Este extracto procede de cultivos propios crecidos y controlados en el laboratorio. El extracto se diluye en PBS, pH 7,4, a una concentración comprendida entre 0,1 y 3 mg/ml de proteína para obtener un volumen de 50 ml. A continuación, se adicionan, gota a gota, entre 0,1 y 2 ml, típicamente 0,5 ml de glutaraldehído hasta una concentración entre 0,01 M y 0,3 M, típicamente 0,025 M, con agitación suave (80 rpm) en un agitador magnético en cámara fría a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C, durante 24 horas, con lo que se obtiene un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus polimerizado crudo.

Dicho extracto alergénico polimerizado crudo se somete a UF tangencial (Labscale® Millipore) a través de un cartucho de 300 KDa de exclusión molecular (Pellicon® XL Filter Millipore), pasándose 10 volúmenes de agua de calidad inyectable respecto al volumen de extracto alergénico polimerizado crudo, entre 500 ml y 1.500 ml. El extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus polimerizado con glutaraldehído resultante contiene las proteínas polimerizadas con un peso molecular superior a 100.000 Da. La concentración de proteína presente en el extracto alergénico nativo de partida puede determinarse tal como se indica en el Ejemplo 1.

El extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus polimerizado con glutaraldehído, sometido a UF tangencial, obtenido como se describe anteriormente, una vez dializado en un sistema de UF tangencial Labscale, se somete a filtración esterilizante y se ajusta la concentración del extracto alergénico polimerizado según se describe a continuación.

Para llevar a cabo la filtración esterilizante de dicho extracto alergénico polimerizado, sometido a UF tangencial, se procede, con carácter previo, a activar el filtro esterilizante de 0,22 micrómetros (|jm) de polietersulfona. Se añaden 2 ml de manitol (5 mg/ml) al filtro y se deja incubar durante 5 minutos; a continuación, se abre la válvula del sistema de vacío hasta que se filtre todo el tampón (manitol en agua de inyección a 5 mg/ml) y, posteriormente, se cierra la válvula del sistema de vacío. Este proceso se repite una vez más. A continuación, se deja secar el filtro durante 30 minutos (15 minutos con vacío abierto y otros 15 minutos con vacío cerrado), se añaden 2,5 ml de la muestra a filtrar (extracto alergénico polimerizado, sometido a UF tangencial) y se abre la llave el vacío hasta que se seque el filtro durante 10 minutos, repitiéndose este paso 2 veces más. Finalmente, el filtro se deja secar durante 10 minutos.

Una vez activado el filtro esterilizante de 0,22 jm de polietersulfona, el extracto alergénico polimerizado, sometido a UF tangencial, se somete a filtración esterilizante. Para ello, antes de proceder a filtrar dicho extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial, se toma una muestra de 2 ml para analizar la carga biológica del producto. A continuación, se abre el vacío y se añade el extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial para que se filtre y, una vez filtrado, se pasa a una cámara estéril a través del sistema SAS [del inglés “Security Air System”]. Una alícuota de 10 ml de dicho extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial y a filtración esterilizante se analiza mediante el ensayo de Bradford [Bradford, M.M. (1976), Anal. Biochem. 72: 248-254] para determinar la cantidad de proteína presente en dicho extracto, y, posteriormente, producir el envasado a granel. El extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial y a filtración esterilizante se diluye en diluyente crioprotector (manitol a 10 mg/ml) para obtener una concentración final de entre 0,001 y 1.000 jg de proteína por ml, típicamente a 0,02 mg de proteína /ml en el extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial y a filtración esterilizante. Tras el ajuste a concentración de tratamiento de proteína el producto a granel obtenido es dosificado en viales de 3 ml de capacidad a razón de 1 ml/vial. Los viales, una vez dosificados, son liofilizados introduciéndolos en un liofilizador Telstar y realizando un ciclo completo de liofilización, terminando con el cierre al vacío de los viales.

EJEMPLO 9

Caracterización bioquímica y ELISA de inhibición de un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus polimerizado con glutaraldehído, producto final para administración intradérmica

Se realizaron la caracterización bioquímica y ELISA de inhibición del alergoide de D. pteronyssinus obtenido en el Ejemplo 8.

9.1 Métodos de caracterización bioquímica y ELISA de inhibición

9.1.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Se siguió el protocolo descrito en el Ejemplo 7, apartado 7.2.1. Como patrón de referencia interna (IHR) se utilizó el extracto nativo de Dermatophagoiodes pteronyssinus

9.1.2 ELISA de inhibición con suero humano

Se siguió el protocolo descrito en el Ejemplo 7, apartado 7.2.2. La solución del extracto de referencia (extracto nativo de Dermatophagoiodes pteronyssinus (IHR)) a analizar se preparó en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9,6 a una concentración de 250 |jg/ml (6 ml de tampón carbonato/bicarbonato y 150 |jl del IHR a una concentración de 10 mg/ml).

9.1.3 Procedimiento semiseco de inmunotransferencia

Se siguió el protocolo descrito en el Ejemplo 7, apartado 7.2.3, incluyendo lo relativo a la inmunodetección de las proteínas transferidas a membrana y el revelado del inmunocomplejo.

9.2 Resultados

En la Figura 12 se muestra, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coomassie, la comparativa entre el extracto nativo (Der p SAP 001-13, carril 1) y el polimerizado con glutaraldehído (Der p liofilizado polimerizado, carril 2). La figura muestra cómo en el extracto nativo aparecen las bandas electroforéticas correspondientes a los alérgenos característicos de Dermatophagoides pteronyssinus, mientras que en el alérgeno polimerizado no aparece ninguna banda electroforética por debajo de 100 kDa.

En la Figura 13 se muestra, mediante inmunotransferencia, la comparativa entre el extracto nativo (Der p 001-13, carril 1) y el polimerizado con glutaraldehído (Der p liofilizado polimerizado, carril 2). La figura muestra cómo en el extracto nativo aparecen las bandas de fijación de IgE específica correspondientes a los alérgenos característicos de Dermatophagoides pteronyssinus, mientras que en el alérgeno polimerizado no se detecta fijación de IgE específica por debajo de 100 kDa.

En la Figura 14 se muestra, mediante ELISA de inhibición, la comparativa entre el extracto nativo (Der p 001-13) y tres lotes consecutivos de Der p liofilizado polimerizado con glutaraldehído, observándose una pérdida de potencia de más del 99% en los tres casos.

EJEMPLO 10

Obtención de viales para tratamiento con extracto alergénico de veneno de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído

En un Eurotubo® IVD estéril se pesan entre 0,3 y 0,4 g de una materia prima (200-250 mg proteína/g de extracto) liofilizada de veneno de Apis mellifera que comprende al menos Api m1, Api m 2 y Api m 3. Esta materia prima se adquiere a un proveedor auditado y homologado (Allergon, Greer, EE UU). La materia prima se diluye en tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 a una concentración entre 0,1 y 3 mg/ml de proteína para obtener un volumen de 50 ml. A continuación, se adicionan, gota a gota, entre 0,1 y 2 ml, típicamente 0,5 ml de glutaraldehído hasta una concentración entre 0,01 M y 0,3 M, típicamente 0,025 M, con agitación suave (80 rpm) en un agitador magnético en cámara fría a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C, durante 24 horas, con lo que se obtiene un extracto alergénico polimerizado crudo.

Dicho extracto alergénico polimerizado crudo se somete a ultrafiltración (UF) tangencial (Labscale® Millipore) a través de un cartucho de 300 KDa de exclusión molecular (Pellicon® XL Filter Millipore), pasándose 10 volúmenes de agua de calidad inyectable respecto al volumen de extracto alergénico de veneno de Apis mellifera polimerizado crudo, entre 500 ml y 1.500 ml. El extracto alergénico de veneno de Apis mellifera polimerizado resultante contiene las proteínas polimerizadas con un peso molecular superior a 100.000 Da. La concentración de proteína presente en la materia prima de partida puede determinarse tal como se indica en el Ejemplo 1.

El extracto alergénico de veneno de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído, sometido a UF tangencial, obtenido como se describe anteriormente, una vez dializado en un sistema de ultrafiltración tangencial Labscale, se somete a filtración y se ajusta la concentración del extracto alergénico polimerizado según se describe a continuación.

Para llevar a cabo la filtración esterilizante de dicho extracto alergénico polimerizado, sometido a UF tangencial, se procede, con carácter previo, a activar el filtro esterilizante de 0,22 micrómetros (jm ) de polietersulfona. Se añaden 2 ml de manitol (5 mg/ml) al filtro y se deja incubar durante 5 minutos; a continuación, se abre la válvula del sistema de vacío hasta que se filtre todo el tampón (manitol en agua de inyección a 5 mg/ml) y, posteriormente, se cierra la válvula del sistema de vacío. Este proceso se repite una vez más. A continuación, se deja secar el filtro durante 30 minutos (15 minutos con vacío abierto y otros 15 minutos con vacío cerrado), se añaden 2,5 ml de la muestra a filtrar (extracto alergénico polimerizado, sometido a UF tangencial) y se abre la llave el vacío hasta que se seque el filtro durante 10 minutos, repitiéndose este paso 2 veces más. Finalmente, el filtro se deja secar durante 10 minutos.

Una vez activado el filtro esterilizante de 0,22 jm de polietersulfona, el extracto alergénico polimerizado, sometido a UF tangencial, se somete a filtración esterilizante. Para ello, antes de proceder a filtrar dicho extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial, se toma una muestra de 2 ml para analizar la carga biológica del producto. A continuación, se abre el vacío y se añade el extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial para que se filtre y, una vez filtrado, se pasa a una cámara estéril a través del sistema SAS [del inglés “Security Air System”]. Una alícuota de 10 ml de dicho extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial y a filtración esterilizante se analiza mediante el ensayo de Bradford [Bradford, M.M. (1976), Anal. Biochem. 72: 248-254] para determinar la cantidad de proteína presente en dicho extracto, y, posteriormente, producir el envasado a granel. El extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial y a filtración esterilizante se diluye en diluyente crioprotector (manitol a 10 mg/ml) para obtener una concentración final de entre 0,001 y 1.000 |jg de proteína por ml, típicamente a 0,01 mg/ml de proteína en el extracto alergénico polimerizado sometido a UF tangencial y a filtración esterilizante. Tras el ajuste a concentración de tratamiento de proteína el producto a granel obtenido es dosificado en viales de 3 ml de capacidad a razón de 1 ml/vial. Los viales, una vez dosificados, son liofilizados introduciéndolos en un liofilizador Telstar y realizando un ciclo completo de liofilización, terminando con el cierre al vacío de los viales.

EJEMPLO 11

Caracterización bioquímica y ELISA de inhibición de veneno de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído, producto final para administración intradérmica

Se procedió a la caracterización bioquímica y ELISA de inhibición del alergoide del veneno de Apis mellifera obtenido en el Ejemplo 10.

11.1 Métodos de caracterización bioquímica y ELISA de inhibición

11.1.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Se siguió el protocolo descrito en el Ejemplo 7, apartado 7.2.1. Como patrón de referencia interna (IHR) se utilizó el extracto nativo de veneno de Apis mellifera.

11.1.2 ELISA de inhibición con suero humano

Se siguió el protocolo descrito en el Ejemplo 7, apartado 7.2.2. La solución del extracto de referencia (extracto nativo del veneno de Apis mellifera (IHR)) a analizar se preparó en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9,6 a una concentración de 250 jg/m l (6 ml de tampón carbonato/bicarbonato y 150 j l del IHR a una concentración de 10 mg/ml).

11.1.3 Procedimiento Semiseco de inmunotransferencia

Se siguió el protocolo descrito en el Ejemplo 7, apartado 7.2.3, incluyendo lo relativo a la inmunodetección de las proteínas transferidas a membrana y el revelado del inmunocomplejo.

11.2 Resultados

En la Figura 15 se muestra, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Azul de Coommassie, la comparativa entre la materia prima de veneno de Apis mellifera (carril 1) y el polimerizado con glutaraldehído (carril 2). La figura muestra cómo en la materia prima aparecen las bandas electroforéticas correspondientes a los alérgenos característicos de Apis mellifera, mientras que en el alérgeno polimerizado no aparece ninguna banda electroforética por debajo de 100 kDa.

En la Figura 16 se muestra, mediante inmunotransferencia, la comparativa entre la materia prima de veneno de Apis mellifera (carril 1) y el polimerizado con glutaraldehído (carril 2). La figura muestra cómo en la materia prima aparecen las bandas de fijación de IgE específica correspondientes a los alérgenos característicos de Apis mellifera, mientras que en el alérgeno polimerizado no se detecta fijación de IgE específica por debajo de 100 kDa.

En la Figura 17 se muestra mediante ELISA de inhibición, la comparativa entre la materia prima de veneno de Apis mellifera y el extracto alergénico liofilizado polimerizado de veneno de Apis mellifera con glutaraldehído, observándose una pérdida de potencia de más del 99%.

EJEMPLO 12

Ensayo de liberación de histamina de basófilos de donantes sanos con adición pasiva de IgE, procedente del suero de pacientes alérgicos al veneno de Apis mellifera

El ensayo de liberación de histamina de basófilos de pacientes alérgicos utilizado es un método aprobado para evaluar la alergenicidad de las preparaciones alergénicas [Siraganian RP: An automated continuous flow system for the extraction and fluorimetric analysis of histamine. Anal Biochem 57:388-394, 1974. Hans J Maasch y David G. Marsh. Standardized extract modified allergens allergoids. Clin rev allergy. 5: 89-106; 1987].

Se trata de un ensayo in vitro para detectar la histamina liberada por métodos de fluoroenzimoinmunoensayo tras la activación alergénica de basófilos por el uso de un método de detección fluorométrica patentado (Reflab, Denmark).

La prueba se realiza con los basófilos de una muestra de sangre completa heparinizada lavada y estimulada con extracto alergénico de Apis mellifera nativo y con extracto alergénico de Apis mellifera polimerizado con glutaraldehído (sustancia activa y producto final), de uno o varios pacientes atópicos, o con los basófilos (de donantes sanos) sometidos a la eliminación de las IgE por descenso del pH, y que por transferencia de la IgE de los sueros de pacientes alérgicos (transferencia pasiva) se produce la liberación de la histamina contenida en estos basófilos [M. H. Platzer, C. E. H. Grattan, L. K. Poulsen, P. S. Skov. Validation of basophil histamine release against the autologous serum skin test and outcome of serum-induced basophil histamine release studies in a large population of chronic urticaria patients. Allergy 2005: 60: 1152-1156]. La histamina liberada es absorbida por una matriz de fibra de vidrio en el interior del pocillo (alta afinidad y selectividad) y posteriormente detectada fluorométricamente.

Los resultados revelan la variación en el reconocimiento de ambos extractos y por tanto su alergenicidad. La reducción de la liberación de la histamina a igualdad de concentración proteica inducida por parte del alergoide de Apis mellifera respecto del extracto alergénico no modificado (nativo) puede variar de paciente a paciente, presumiblemente debido a que cada paciente reconoce diferentes determinantes alergénicos [Hans J Maasch y David G. Marsh. Standardized extract modified allergens allergoids. Clin rev allergy. 5: 89-106; 1987]. Tal y como se observa en la Figura 18, a igualdad de concentración entre extracto nativo y polimerizado (producto final) la liberación de histamina es entre 3 y 4 veces superior en el caso del extracto nativo demostrándose así la disminución de alergenicidad del extracto polimerizado respecto al extracto nativo.

APIS MP (♦) = Extracto alergénico de Apis mellifera

APIS SA (■) = Extracto crudo polimerizado de Apis mellifera

APIS PF polimerizado (A ) = Extracto liofilizado polimerizado de Apis mellifera

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un sujeto que padece una alergia a un alérgeno, en donde la composición se va a administrar por vía intradérmica, la composición comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante modificación química de dicho alérgeno, en donde dicho alergoide está presente en la composición a la dosis máxima no reactiva y en donde dicha dosis máxima no reactiva corresponde a la concentración de alergoide que, administrado por la vía intradérmica, da negativo en la prueba cutánea ensayada en una población que está específicamente sensibilizada a dicho alergeno por medio de un estudio de titulación final con el alergoide en una población de pacientes sensibilizados al alergeno.

2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante polimerización de un alérgeno con glutaraldehído.

3. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho alergoide es un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico del polen de plantas, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico de un derivado epidérmico de animales, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico de un ácaro del polvo, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico de un hongo, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico de un alimento, un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico de un componente animal, o un alergoide obtenido a partir de un extracto alergénico de látex (Hevea brasiliensis).

4. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho alergoide es un alergoide seleccionado del grupo formado por alergoides obtenidos a partir de un alérgeno individual o de un extracto alergénico de Agropyron, Acacia dealbata, Alnus glutinosa, Amaranthus spp, Ambrosia spp, Artemisia vulgaris, Avena sativa, Betula verrucosa, Chenopodium album, Chrysantemun spp, Citrus sinensis, Corylus avellana, Cryptomeria japonicum, Cupressus arizonica, Cupressus sempervirens, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Eucalyptus spp, Fagus silvatica, Festuca pratensis, Fraxinus excelsior, Helianthus spp, Hevea brasiliensis, Holcus lanatus, Hordeum vulgare, Jasminum spp, Juniperus oxycedrus, Ligustrum vulgare, Lolium perenne, Mercurialis annua, Morus alba, Olea europaea, Oryza sativa, Parietaria judaica, Phleum pratense, Phoenix canariensis, Phoenix dactilyfera, Phragmites communis, Phytolacca dioica, Pinus silvestris, Plantago lanceolata, Platanus acerifolia, Poa pratensis, Populus deltoides, Quercus ilex, Quercus robur, Quercus virginiana, Robinia pseudoacacia, Rumex acetosella, Salix nigra, Salsola kali, Sambucus nigra, Schinopsis sp., Secale cereale, Taraxacum officinale, Trisetum paniceum, Triticum aestivum, Ulmus campestris, Urtica dioica, Zea mays, Canis familiaris, Equus caballus, Felis domesticus, Acarus siro, Blomia kulagini, Blomia tropicalis, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Glycyphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentaie, Alternaría alternata, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum, Rhizopus nigricans, pescado, leche y productos lácteos, huevos y derivados del huevo, frutos secos y frutas desecadas, veneno de medusas, veneno de serpientes, veneno de orugas, veneno de un himenóptero, veneno de un díptero, veneno de un insecto perteneciente al orden Siphonaptera, látex (Hevea brasiliensis), o combinaciones de los mismos.

5. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un único alergoide o dos o más alergoides.

6. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho alergoide está liofilizado y está disuelto en un excipiente adecuado para su administración por vía intradérmica.

7. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la que dicho excipiente comprende suero salino fisiológico y/o manitol.

8. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en forma de monodosis.

9. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el contenido de alergoide por unidad de dosis de 0,1 ml, está comprendido entre aproximadamente 0,001 |jg de proteína y aproximadamente 1.000 jg de proteína por dosis.

10. Un kit farmacéutico que comprende una composición farmacéutica en donde la composición se va a administrar por vía intradérmica, la composición comprende al menos un alergoide y al menos un excipiente, en donde dicho alergoide es un alergoide obtenido mediante modificación química de dicho alérgeno, en donde dicho alergoide está presente en la composición a la dosis máxima no reactiva y en donde dicha dosis máxima no reactiva corresponde a la concentración de alergoide que, administrado por la vía intradérmica, da negativo en la prueba de la piel ensayada en una población que está específicamente sensibilizada a dicho alergeno por medio de un estudio de titulación final con el alergoide en una población de pacientes sensibilizados al alérgeno, y los medios y las instrucciones para administrar dicha composición para su uso en el tratamiento de un sujeto que sufre una alergia a un alérgeno.

11. El kit para uso según la reivindicación 10, en el que dicho alergoide está liofilizado y el kit comprende al menos un vial con un excipiente adecuado para la administración, tras la reconstitución, del alergoide por vía intradérmica.