ES2828448T3

ES2828448T3 - Péptidos superpuestos contiguos para el tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico

Info

Publication number: ES2828448T3
Application number: ES14792563T
Authority: ES
Inventors: Alexander Kettner; Christophe Reymond
Original assignee: Anergis SA
Current assignee: Anergis SA
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2021-05-26
Anticipated expiration: 2034-06-06
Also published as: BR112015030644A2; RU2015155874A; JP2018058856A; WO2014195803A2; CN105307679A; JP6300907B2; WO2014195803A3; EP3003366A2; JP6640818B2; US20150050301A1; AU2014276484A1; AU2014276484B2; EP3003366B1; JP2016523231A; DK3003366T3; HK1223019A1; CA2914037A1

Abstract

Una composición que comprende seis péptidos superpuestos contiguos, en donde - el primer péptido consiste en la secuencia del aminoácido T99 al aminoácido G168 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, - el segundo péptido consiste en la secuencia del aminoácido A164 al aminoácido S200 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, - el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido R193 al aminoácido E227 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, - el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido P220 al aminoácido R254 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, - el quinto péptido consiste en la secuencia del aminoácido R249 al aminoácido D282 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y - el sexto péptido consiste en la secuencia del aminoácido A278 al aminoácido L320 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos superpuestos contiguos para el tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y combinaciones de péptidos superpuestos contiguos (COP) derivados de los alérgenos principales de los ácaros del polvo doméstico Der p 1 y Der p 2 y al uso de tales composiciones y combinaciones en medicina. Se contempla que las composiciones, combinaciones y métodos de tratamiento de la invención sean útiles para tratar la alergia a los ácaros del polvo doméstico y acelerar ampliamente su tratamiento.

Antecedentes de la invención

La enfermedad alérgica mediada por IgE parece ser muy común, especialmente en los países industrializados, donde hasta una cuarta parte de la población se ve afectada por la rinitis alérgica [1]. Además, las personas que padecen rinitis alérgica muestran una calidad de vida más baja que las sanas [2], y solo unas pocas entran en remisión espontáneamente.

La alergia a los ácaros del polvo doméstico se distribuye ampliamente en todo el mundo y aproximadamente el 50 % de la población alérgica en los Estados Unidos y Europa sufre de alergia a los ácaros del polvo doméstico; para una revisión, ver [3]. Los ácaros del polvo doméstico (HDM) pertenecen predominantemente a dos especies Dermatophagoides pteronyssinus y Dermatophagoides farinae. El tratamiento contra la alergia a los HDM puede basarse en los principales alérgenos de una de las dos especies, ya que los principales alérgenos de los HDM D. pteronyssinus y D. farinae, Der p 1/Der f 1 y Der p 2/Der f 2 comparten más del 80 % de identidad de secuencia. Der p 1 comparte una identidad de secuencia del 83 % con Der f 1, lo que conduce a respuestas de células T y anticuerpos IgE humanos con alta reactividad cruzada entre estas dos especies. En particular, se ha descubierto que la preincubación del suero de pacientes alérgicos con Der f 1 previene la unión de Der p 1 a anticuerpos IgE contra HDM, aunque se informaron diferentes afinidades de unión. Se ha descubierto que Der p 2 y Der f 2 (identidad de secuencia del 88 %) previenen la unión de sus contrapartes de manera muy eficaz. También se encontró que la proliferación de células T era igualmente inducida por péptidos de D. pteronyssinus y D. farinae. Sin embargo, los alérgenos de las dos especies no son completamente intercambiables, ya que menos péptidos de Der f 1 que de Der p 1 fueron capaces de estimular la proliferación de células T, por ejemplo.

Los resultados de inmunoterapia de un estudio realizado con D. pteronyssinus en regiones italianas donde la especie sensibilizante es D. farinae indican el posible uso intercambiable de alérgenos de diferentes especies, dicho estudio no difirió notablemente de los realizados en Inglaterra con D. pteronyssinus para la sensibilización a D. pteronyssinus o los realizados en Corea del Sur con D. farinae para D. farinae. Los resultados en Italia tampoco difirieron de los realizados con una mezcla de extractos según lo revisado por Thomas [3]. Por tanto, los alérgenos principales de D. pteronyssinus pueden considerarse la base de un producto eficaz al menos contra D. pteronyssinus, D. farinae y posiblemente otras especies de ácaros del polvo doméstico.

Se han descrito múltiples secuencias de alérgenos en la alergia a HDM, como se encuentra en las bases de datos de proteínas y nucleótidos del NCBI. Los alérgenos se pueden asignar a al menos 7 grupos relacionados en cuanto a la secuencia con proteínas conocidas, a saber:

Der p 1, cisteína proteasa (familia de la peptidasa C1A)

Der p 2, proteína de unión a lípidos similar a MD2, unión a TLR 4

Der p 3, serina proteasa similar a la tripsina

Der p 4, alfa-amilasa

Der p 5, Blo t 5 (Blomia tropicalis, un ácaro de almacenes)

Der p 6, similar a quimotripsina (dominio de peptidasa S1)

Der p 7, una glicoproteína secretada

En Europa, el 97 % de los sujetos alérgicos a HDM pueden ser diagnosticados mediante el uso de una mezcla de Der p 1 y Der p 2, mientras que el 50 % de los pacientes reaccionan también a alérgenos adicionales de la familia Der p [4]. En Brasil, se descubrió que alrededor del 87 % de los pacientes positivos a picaduras de HDM con rinitis alérgica contenían IgE que reconocen Der p 1, Der p 2 o ambos alérgenos [5]. Un estudio en Australia [6] muestra que aproximadamente el 50 % de los anticuerpos IgE anti HDM se unen a Der p 1 y Der p 2 y que Der p 4, 5 y 7 contribuyeron igualmente en un 30 %. Por tanto, la reactividad a Der p 1 y Der p 2 domina claramente en la población alérgica, lo que indica que un producto basado en los alérgenos Der p 1 y Der p 2 puede tratar a una gran mayoría de pacientes.

Secuencias de Der p 1 y epítopos de IgE

Se han descrito variantes de Der p 1 que indican cierto polimorfismo [7]. Una búsqueda BLAST mediante el uso de la secuencia de Swiss-Prot P08176.2, reveló varias secuencias de proteínas dentro de las bases de datos del NCBI. La mayoría de las variaciones se encontraron en las secuencias de Der f 1 y se ubicaron en 5 posiciones predominantes, a saber, 123, 132, 150, 152 y 204 (coordenadas con referencia a Swiss-Prot P08176.2). El polimorfismo también se describió mediante el uso de RT-PCR en un panel de secuencias de los alérgenos de los grupos 1 y 2 de D. pteronyssinus y D. farinae aislados de hogares en Bangkok [8]. Tomados en conjunto, estos resultados indican que el Der p 1 más predominante es la secuencia referenciada en Swiss-Prot P08176.2, también idéntica a Der p 1.0105 [8].

La proteína Der p 1 es una cisteína proteasa (peptidasa de la superfamilia C1) de 320 aminoácidos. Los primeros 18 aminoácidos tienen propiedades de péptido señal, mientras que los siguientes aminoácidos de R19 a E98 están presentes en la pro-proteína y contienen un dominio inhibidor de proteasa 129. El Der p 1 maduro está compuesto por 222 aminoácidos (T 99 a L320) y se han determinado tres estructuras cristalinas (Pd B 1XKG, 2AS8 y 3F5V).

Al buscar Der p 1 en la base de datos de epítopos inmunitarios (IEDB), se encontraron 35 epítopos. Se describieron 24 epítopos de células B que se determinaron mediante competencia de antígenos, transferencia Western, ELISA, liberación de histamina por Ig o radioinmunoensayo [9]; [10]; [11]; [12]. La combinación de estos posibles epítopos permitió delinear cuatro regiones principales con límites ubicados en N150 a H170; V187 a R202; c 215 a Q231; y 263 a Y299.

Los epítopos de IgE son en su mayoría conformacionales y, por tanto, difíciles de mapear. Los anticuerpos monoclonales producidos contra Der p 1 o Der f 1 son en su mayoría específicos de la especie. Sin embargo, el anticuerpo 4C1 contra Der f 1 se une también a Der p 1 y se encontró que los epítopos del anticuerpo monoclonal (AcM) y los anticuerpos IgE humanos se superponían según lo determinado por las estructuras cristalinas del complejo [13] . La cocristalización de 4C1 con Der p 1 y Der f 1 indicó que los residuos D113, R115, Q116, R118, R154, 1156, Q279, Y283, D296, Y299, Y301 estaban implicados posiblemente en la unión a IgE.

El AcM W108 no solo inhibió la unión de Der p 1 con anticuerpos IgE, sino también su actividad cisteína proteinasa [14] . Se identificaron tres péptidos por LC-MS después de la digestión con proteasa del complejo W108/Der p 1 (aa 209-224; 227-243 y 260-287) que no se superponían con dos segmentos peptídicos de Der p 1 que se unían más directamente al AcM W108 (aa 151-197 y 286-320). Estos resultados demuestran la complejidad de mapear epítopos de IgE incluso cuando se usan anticuerpos monoclonales.

Resumir los datos de la literatura permitió identificar cuatro regiones de Der p 1 con potencial para unirse a IgE, a saber, N150-H170, V187-R202, C215-Q231 y G274-D291. Los experimentos informados muestran que la división de estos cuatro dominios de Der p 1 no fue suficiente, ya que se tuvo que interrumpir una región adicional entre R149 a R254 para eliminar una unión residual a IgE.

Secuencias de Der p 2 y epítopos de IgE

Der p 2 parece ser muy polimórfico con 15 variantes descritas, incluidas las versiones mejor caracterizadas Der p2.0101, 0103, 0104, 0107 y 0108 [15]. De acuerdo con [8], Der p 2 mostró variaciones frecuentes con grupos de sustituciones de aminoácidos, pero el Der p 2.0101 canónico no se encontró en ninguna de las 17 secuencias. Der f 2 mostró variantes con grupos de sustituciones similares a Der p 2 pero en diferentes posiciones de aminoácidos y sin ninguna concordancia estructural.

De acuerdo con [16], ambas variantes, Der p 2.0101 y Der p 2.0104 fueron las más activas para la estimulación de células T, mientras que otras variantes menos comunes, a saber, 0107 y 0108 mostraron diferencias consistentes que demuestran que los cambios en la secuencia podrían cambiar la respuesta de las citocinas. De acuerdo con [15], las isoformas 0103 y 0104 de Der p 2 parecen estar unidas con una mayor afinidad a una serie de IgE recombinantes obtenidas por presentación de fagos. Estas dos isoformas combinadas con las rIgE mostraron en consecuencia una mejor capacidad para desencadenar la desgranulación en un ensayo de reconstitución. Sin embargo, todas las isoformas de Der p 2 pudieron desencadenar la desgranulación en presencia de sueros policlonales de pacientes alérgicos. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, en particular la respuesta de las células T y la alta afinidad por los clones de rIgE seleccionados, se eligió la variante Der p 2.0104 (GenBank AFJ68067.1 para la definición del producto.

Se han utilizado diferentes técnicas en un intento de determinar los epítopos de IgE, incluida la Resonancia Magnética Nuclear de Intercambio de Hidrógeno [17] y Mimotopos [18]. Tres regiones principales parecen estar involucradas, las cuales se ubican en la superficie de la molécula, a saber, N71-C78, V94-K100 y L111-G115 (numeración de acuerdo con la secuencia del GenBank AFJ68067.1). Las dos últimas regiones incluyen residuos identificados en la base de datos IEDB como parte de posibles epítopos de IgE [7]; sin embargo, no se propuso ningún mapeo de epítopos definitivo debido a la especificidad de unión 3D de las IgE.

Vacunas hipoalergénicas contra las alergias

El único tratamiento dirigido a la causa de una alergia mediada por IgE es la inmunoterapia específica (SIT). El tratamiento consiste en inyectar dosis crecientes de alérgenos durante periodos de tiempo prolongados (de tres a cinco años) para inducir tolerancia en el paciente alérgico. Varios estudios demostraron el beneficio de esta terapia en la respuesta alérgica, en particular en el tratamiento a largo plazo [19], [20]. Sin embargo, se observaron varios efectos secundarios, especialmente durante las terapias ultrarrápidas, en las que hasta el 30 % de los pacientes deben ser tratados por síntomas alérgicos durante el curso de la terapia [21]. Por tanto, existe una gran necesidad médica de una alternativa a la SIT en forma de un tratamiento más corto con una seguridad aceptable.

Se han probado diferentes enfoques para mejorar la seguridad y eficacia de la SIT. Las formulaciones o extractos existentes se han mejorado mediante la adición de adyuvantes, como MPL (Allergy Therapeutics) [22], secuencias de ADN [23] o bacteriófagos combinados con CpG [24] que aumentan la respuesta inmunitaria TH1, para permitir así posibles reducciones en la cantidad del extracto de alérgenos. Se utilizaron alérgenos definidos en lugar de extractos completos. En el caso del polen de abedul, un ensayo clínico con Bet v 1 recombinante ha demostrado una eficacia equivalente al extracto de polen de abedul entero [25].

Para disminuir la aparición de síntomas alérgicos como resultado del tratamiento, diferentes grupos exploraron el uso de productos con potencial hipoalergénico, es decir, que muestran una unión reducida a IgE. La expresión de Der p 1 en E. coli resultó simplemente en proteínas agregadas que mostraron una unión reducida a IgE [26] y se propuso como posible vacuna hipoalergénica. La expresión de pro-Der p 1 en P. pastoris dio como resultado una proenzima hipoalergénica estable también con potencial para su uso en una inmunoterapia específica de alérgenos [27]. La combinación de alérgenos, es decir, proteínas híbridas Der p 1/Der p 2, se diseñaron mediante PCR [28] o las proteínas híbridas se reensamblaron con fragmentos de Der p 1 y Der p 2 [29] y se expresaron en E. coli. En ambos casos se demostró una disminución de la reactividad a IgE a la vez que se conservó la inmunogenicidad. También se ha construido un posible candidato a vacuna de ADN con codones optimizados [30], [31]. Sin embargo, ninguno de estos enfoques ha sido probado en humanos todavía.

Otro enfoque consistió en proporcionar péptidos que abarcaban un número restringido de epítopos de células T que se utilizaron para la inmunoterapia con alérgenos de la caspa de gato con una eficacia limitada [32]. La patente de Estados Unidos US 6,268,491 describe, por ejemplo, péptidos de un alérgeno proteico seleccionado de los alérgenos Der p I, Der p II, Der f I o Der f II, y dicho péptido comprende al menos un epítopo de células T. Sin embargo, los alérgenos albergan una gran variedad de epítopos de células T que dependen en parte del tipo de HLA del paciente. Por ejemplo, se encontraron epítopos de células T dispersos a lo largo de la secuencia de Bet v 1, excepto en una región corta [33]. Por tanto, un producto de inmunoterapia eficaz debería contener preferentemente la secuencia completa del alérgeno en lugar de epítopos de células T seleccionados.

El uso de fragmentos de alérgenos sigue siendo atractivo, sobre la base de la evidencia de que la IgE humana reconoce principalmente epítopos no contiguos que pueden estar separados por fragmentación del alérgeno. Se probaron dos fragmentos contiguos de Bet v 1 o formas triméricas de Bet v 1 en un estudio de fase I en humanos y mostraron una tendencia hacia la mejora del bienestar, pero no proporcionaron una mejora significativa en las puntuaciones de medicación de los síntomas [34]. En ese estudio, sin embargo, se observaron varios eventos adversos, la mayoría de los cuales ocurrieron horas después de las inyecciones [35]. También se analizaron en humanos tres fragmentos del principal alérgeno del veneno de abeja, a saber, la fosfolipasa A2, que mostraron una excelente seguridad debido a una reducción de la unión a IgE a la vez que provocaron niveles elevados de IgG4 e IL-10 [36]. Se ideó un método para seleccionar péptidos superpuestos contiguos (COP) para el tratamiento de la alergia, que juntos forman la secuencia completa de aminoácidos de un alérgeno, para proporcionar así todos los posibles epítopos de células T del alérgeno, al tiempo que se reduce la unión a IgE (patente de Estados Unidos núm.

7,923,209). Dichos fragmentos seleccionados muestran una capacidad reducida para reformar la estructura terciaria original del alérgeno, si la hubiera, lo que da como resultado una capacidad reducida para unirse a IgE, y por lo tanto provocar reacciones alérgicas en humanos.

Resumen de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona composiciones y combinaciones como se definen en las reivindicaciones que comprenden péptidos superpuestos contiguos (COP) como se definen en las reivindicaciones para el tratamiento de alergias a los ácaros del polvo doméstico. Específicamente, los COP descritos en este documento se obtienen a partir de la secuencia de los dos alérgenos principales de los ácaros del polvo doméstico Der p 1 y Der p 2 que incluyen la secuencia completa de estos alérgenos y, por lo tanto, proporcionan todos los posibles epítopos de células T, pero carecen de la estructura tridimensional del alérgeno original.

El COP puede usarse en métodos de inmunoterapia específica contra alergias al polvo de ácaros domésticos y puede administrarse a ratones y otros mamíferos sensibilizados con Der p1 o Der p 2 o una mezcla de estos dos alérgenos sin provocar un choque anafiláctico. Más específicamente, la descripción describe un método de inmunoterapia específica (SIT) que puede reducir los síntomas alérgicos después de unas pocas administraciones durante un período corto de tiempo. Esta terapia consiste en administrar repetidamente COP específicos a seres humanos que padecen alergia a los ácaros del polvo doméstico. La administración puede realizarse por vía sistémica, transdérmica, intradérmica, subcutánea, o por vía oral, o vías mucosales, incluidas las vías sublingual e intestinal. En algunas modalidades, la administración puede repetirse cinco veces durante dos meses en comparación con los 3 a 5 años para la SIT actual. La cantidad administrada de producto activo (COP) puede alcanzar un valor acumulado equivalente en cantidad molar a la cantidad de Der p 1 y Der p 2 administrados durante tres años de tratamiento con SIT.

Específicamente, la invención se refiere a una composición que comprende seis péptidos superpuestos contiguos, en donde

- el primer péptido consiste en la secuencia del aminoácido T99 al aminoácido G168 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el segundo péptido consiste en la secuencia del aminoácido A164 al aminoácido S200 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido R193 al aminoácido E227 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido P220 al aminoácido R254 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el quinto péptido consiste en la secuencia del aminoácido R249 al aminoácido D282 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y

- el sexto péptido consiste en la secuencia del aminoácido A278 al aminoácido L320 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

La invención se refiere además a una composición que comprende cuatro péptidos superpuestos contiguos, en donde

- el primer péptido consiste en la secuencia del aminoácido D1 al aminoácido E25 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el segundo péptido consiste en la secuencia del aminoácido H22 al aminoácido K77 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido S57 al aminoácido D113 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y - el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido K109 al aminoácido D129 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Específicamente, la invención proporciona composiciones que comprenden una pluralidad de fragmentos de péptidos superpuestos contiguos (COP) en donde se reduce o elimina sustancialmente la reactividad de dichos c Op a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico. Como se usa en el presente documento, los expertos en inmunología entienden que la afirmación de que se elimina la reactividad a los anticuerpos IgE significa que dicha reactividad se reduce en tres o cuatro o más logaritmos a un nivel en que es clínicamente irrelevante o el cual es indetectable por técnicas de medición comunes.

La invención se refiere además a una combinación de alérgenos para su uso en un método de inmunoterapia específica contra alergias a los ácaros del polvo doméstico en un paciente, en donde dicha combinación de alérgenos comprende diez péptidos, en donde

- el quinto péptido consiste en la secuencia del aminoácido R249 al aminoácido D282 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el sexto péptido consiste en la secuencia del aminoácido A278 al aminoácido L3220 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el séptimo péptido consiste en la secuencia del aminoácido D1 al aminoácido E25 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el octavo péptido consiste en la secuencia del aminoácido H22 al aminoácido K77 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el noveno péptido consiste en la secuencia del aminoácido S57 al aminoácido D113 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y

- el décimo péptido consiste en la secuencia del aminoácido K109 al aminoácido D129 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

y en donde dicha combinación de diez alérgenos se administra a un paciente que lo necesita.

Dicha combinación de COP que incluye tanto las secuencias completas de Der p 1 (Swiss-Prot P08176.2) como la secuencia completa de Der p 2 (GenBank AFJ68067.1), dichas secuencias de Der p 1 se obtienen mediante la adición de un primer péptido que comienza en el aminoácido T99 y termina en G168 (SEQ ID NO: 8), un segundo péptido que comienza en el aminoácido A164 y termina en S200 (SEQ ID NO: 12), un tercer péptido que comienza en los aminoácidos R193 y termina en E227 (SEQ ID NO: 13), un cuarto péptido que comienza en los aminoácidos P220 y termina en R254 (SEQ ID NO: 14), un quinto péptido que comienza en los aminoácidos R249 y termina en D282 (SEQ ID NO: 15), un sexto péptido que comienza en los aminoácidos A278 y termina en L320 (SEQ ID NO: 11), dichas secuencias de Der p 2 se obtienen mediante la adición de un primer péptido que comienza en los aminoácidos D1 y termina en E25 (SEQ ID NO: 18), un segundo péptido que comienza en los aminoácidos H22 y termina en K77 (SEQ ID NO: 19), un tercer péptido que comienza en los aminoácidos S57 y termina en D113 (SEQ ID NO: 24), y un cuarto péptido que comienza en los aminoácidos K109 y termina en D129 (SEQ ID NO: 25).

Si bien las secuencias anteriores representan los péptidos para superponer versiones ligeramente más cortas y ligeramente más largas de cada uno de los péptidos de Der p 1 primero a sexto y de los péptidos de Der p 2 primero a cuarto descritos en este documento, cada uno de los cuales está truncado o alargado en 1-3 o 1-5 o 1-10 o 1-15 aminoácidos con respecto a los péptidos de las SEQ ID NOS: 8, 11-15, 18, 19, 24 y 25 de manera que los epítopos tridimensionales reactivos de IgE no se recrean y de manera que se elimina la reactividad del péptido a los anticuerpos IgE de sujetos que son alérgicos a Der p 1 y/o Der p 2 y por lo cual se producen conjuntos de péptidos que se superponen entre sí por uno o más aminoácidos de manera que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico. Los COP truncados o alargados serán funcionalmente equivalentes a los péptidos de las SEQ ID NO: 8, 11-15, 18, 19, 24 y 25 siempre que no conduzcan a una restauración de la unión a IgE. En el presente documento se describe que existe cierta variabilidad de secuencia en los principales alérgenos de los ácaros del polvo Der p 1 y Der p 2. Por tanto, una secuencia de Der p 2 del GenBank a Fj 68067.1 (SEQ ID NO: 28) difiere en cuatro residuos de aminoácidos de la variante de secuencia de la proteína madura en Swiss Prot P49278.1 (SEQ ID NO: 29). Con referencia específicamente a la SEQ ID NO: 28, las secuencias varían por la sustitución de una valina hidrófoba (V) por una lisina hidrófila (L) en AA 40, la sustitución de una serina nucleófila (S) por una treonina nucleófila (T) en AA 47, la sustitución de una lisina hidrófoba (L) por una metionina hidrófoba (M) en AA 70 y la sustitución de una amida asparagina (N) por un residuo ácido de ácido aspártico (D) en AA 114. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar entre las secuencias de diferentes isotipos de alérgenos; así como de sustituir residuos de aminoácidos que tengan propiedades similares para obtener péptidos útiles para llevar a cabo los métodos de inmunoterapia específicos de la descripción. Por consiguiente, la descripción describe COP que tienen una identidad de secuencia del 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % con los péptidos de las SEQ ID NO: 8, 11-15, 18, 19, 24 y 25 y los péptidos de las SEQ ID NO: 8 y 11-15 que están alargados o truncados por 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de la SEQ ID NO: 26 y las SEQ ID n O: 18, 19, 24 y 25 a lo largo de SEQ ID NO: 27 y en donde se elimina la reactividad de tales péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Como se describe en el presente documento, el primer y segundo péptidos de Der p 1 se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el segundo y tercer péptidos de Der p 1 se superponen entre sí en 1 a 8 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el tercer y cuarto péptidos de Der p 1 se superponen entre sí en 1 a 8 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el cuarto y quinto péptidos de Der p 1 se superponen entre sí en 1 a 6 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el quinto y sexto péptidos de Der p 1 se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el primer y segundo péptidos de Der p 2 se superponen entre sí en 1 a 4 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el segundo y tercer péptidos de Der p 2 se superponen entre sí en 1 a 21 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el tercer y cuarto péptidos de Der p 2 se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos. De acuerdo con un aspecto de la invención, las composiciones comprenden la combinación del péptido que tiene la SEQ ID NO: 8, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 12, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 13, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 14, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 15, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 11, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 18, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 19, el péptido que tiene la SEQ ID NO: 24 y el péptido que tiene la SEQ ID NO: 25.

Las composiciones de COP preferidas incluyen aquellas en donde los péptidos son solubles en tampones acuosos compatibles con las vías de aplicación. Como se describe en el presente documento, el conjunto de péptidos AllerDM1.5, AllerDM1.52, AllerDM1.53, AllerDM1.54 y AllerDM1.5a se prefieren a AllerDM1.2 debido a su solubilidad en agua. Como se describe en el presente documento, se prefiere AllerDM1.7 a AllerDM1.3 y AllerDM1.72 ya que no se necesita un disolvente aprótico polar para la solubilización.

Dichos péptidos pueden obtenerse mediante cualquiera de una variedad de métodos que incluyen síntesis química o por medios recombinantes.

Los COP y los péptidos que se describen en el presente documento se pueden proporcionar en forma de polvo seco, pero también se pueden proporcionar en combinación con un vehículo o diluyente aceptable. Además, las composiciones pueden comprender adicionalmente un adyuvante, y un adyuvante preferido es el hidróxido de aluminio. Como tales, las composiciones pueden caracterizarse y usarse como una composición vacunal.

Los COP y los péptidos que se describen en el presente documento se pueden proporcionar junto con agentes desnaturalizantes y/o caotrópicos, que comprenden cloruro de guanidinio. Dichos agentes funcionan impidiendo la formación de estructuras tridimensionales en solución y contribuyen a reducir la unión a IgE.

En este documento se describen, además, métodos de inmunoterapia específica (SIT) contra las alergias a los ácaros del polvo doméstico que comprenden administrar a un paciente que lo necesita uno o más alérgenos seleccionados del grupo que consiste en una combinación de COP que incluyen las secuencias completas de Der p 1 (Swiss-Prot P08176.2) y la secuencia completa de Der p 2 (GenBank AFJ68067.1), dichas secuencias de Der p 1 se obtienen mediante la adición de un primer péptido que comienza en el aminoácido T99 y termina en G168 (SEQ ID NO: 8), un segundo péptido que comienza en el aminoácido A164 y termina en S200 (SEQ ID NO: 12), un tercer péptido que comienza en el aminoácido R193 y termina en E227 (SEQ ID NO: 13), un cuarto péptido que comienza en el aminoácido P220 y termina en R254 (SEQ ID NO: 14), un quinto péptido que comienza en el aminoácido R249 y termina en D282 (SEQ ID NO: 15), un sexto péptido que comienza en el aminoácido A278 y termina en L320 (SEQ ID NO: 11), dichas secuencias de Der p 2 se obtienen mediante la adición de un primer péptido que comienza en el aminoácido D1 y termina en E25 (SEQ ID NO: 18), un segundo péptido que comienza en el aminoácido H22 y termina en K77 (SEQ ID NO: 19), un tercer péptido que comienza en el aminoácido S57 y termina en D113 (SEQ ID NO: 24), y un cuarto péptido que comienza en el aminoácido K109 y termina en D129 (SEQ ID NO: 25).

Tales métodos se pueden llevar a cabo en los que los péptidos se administran mediante el uso de inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intravenosa, técnicas transdérmicas, intranasales, orales, sublinguales, intraoculares o intratecales.

De acuerdo con uno de estos métodos, un paciente es tratado con la combinación de COP que incluyen tanto las secuencias completas de Der p 1 (Swiss-Prot P08176.2) como la secuencia completa de Der p 2 (GenBank AFJ68067.1), dichas secuencias de Der p 1 se obtienen mediante la adición de un primer péptido que comienza en el aminoácido T99 y termina en G168 (SEQ ID NO: 8), un segundo péptido que comienza en el aminoácido A164 y termina en S200 (SEQ ID NO: 12), un tercer péptido que comienza en el aminoácido R193 y termina en E227 (SEQ ID NO: 13), un cuarto péptido que comienza en el aminoácido P220 y termina en R254 (SEQ ID NO: 14), un quinto péptido que comienza en el aminoácido R249 y termina en D282 (SEQ ID NO: 15), un sexto péptido que comienza en el aminoácido A278 y termina en L320 (SEQ ID NO: 11), dichas secuencias de Der p 2 se obtienen mediante la adición de un primer péptido que comienza en el aminoácido D1 y termina en E25 (SEQ ID NO: 18), un segundo péptido que comienza en el aminoácido H22 y termina en K77 (SEQ ID NO: 19), un tercer péptido que comienza en el aminoácido S57 y termina en D113 (SEQ ID NO: 24), y un cuarto péptido que comienza en el aminoácido K109 y termina en D129 (SEQ ID NO: 25). La descripción describe además una composición que comprende una pluralidad de fragmentos peptídicos que comprenden un primer polipéptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 99-104 a los aminoácidos 157-177 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un segundo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 154-174 a los aminoácidos 190-210 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un tercer péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 183-203 a los aminoácidos 217-237 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un cuarto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 210-230 a los aminoácidos 244-264 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un quinto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 239-259 a los aminoácidos 272 292 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un sexto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 268-288 a los aminoácidos 310-320 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos que son alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

La descripción describe además composiciones en donde el primer y segundo péptidos se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos; el segundo y tercer péptidos se superponen entre sí en 1 a 8 aminoácidos; el tercer y cuarto péptidos se superponen entre sí en 1 a 8 aminoácidos; el cuarto y quinto péptidos se superponen entre sí en 1 a 6 aminoácidos o el quinto y sexto péptidos se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos.

La descripción describe además una composición que comprende una pluralidad de fragmentos de péptidos que comprenden un primer polipéptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 1-15 a los aminoácidos 15-35 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un segundo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 12-32 a los aminoácidos 67-87 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un tercer péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 47-67 a los aminoácidos 103-123 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un cuarto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 99-119 a los aminoácidos 119-129 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

La descripción describe además composiciones en donde el primer y segundo péptidos se superponen entre sí en 1 a 4 aminoácidos; el segundo y tercer péptidos se superponen entre sí en 1 a 21 aminoácidos o el tercer y cuarto péptidos se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos.

La descripción describe además una composición que comprende una pluralidad de fragmentos de péptidos superpuestos contiguos de Der p1 que comprenden un primer polipéptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 99-104 a los aminoácidos 157-177 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un segundo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 154-174 a los aminoácidos 190-210 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un tercer péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 183-203 a los aminoácidos 217-237 de la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un cuarto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 210-230 a los aminoácidos 244 264 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un quinto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 239-259 a los aminoácidos 272-292 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un sexto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 268-288 a los aminoácidos 310-320 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico; y una pluralidad de fragmentos de péptidos superpuestos contiguos de Der p2 que comprenden un primer polipéptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 1-15 a los aminoácidos 15-35 de la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un segundo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 12-32 a los aminoácidos 67-87 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un tercer péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 47-67 a los aminoácidos 103-123 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos con los anticuerpos IgE de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un cuarto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 99-119 a los aminoácidos 119-129 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

En el presente documento se describe además un método en el que un paciente con necesidad de una inmunoterapia específica para la alergia a los ácaros del polvo se trata con la combinación de uno o más péptidos superpuestos contiguos de Der p 1 que comprenden un primer péptido que comienza en el aminoácido T99 y termina en G 168 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 8), un segundo péptido que comienza en el aminoácido A164 y termina en S200 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 12), un tercer péptido que comienza en los aminoácidos R193 y termina en E227 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 13), un cuarto péptido que comienza en los aminoácidos P220 y termina en R254 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 14), un quinto péptido que comienza en los aminoácidos R249 y termina en D282 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 15), un sexto péptido que comienza en los aminoácidos A278 y termina en L320 (SEQ ID NO: 11) cuyos péptidos primero a sexto están opcionalmente alargados o truncados por 1-3, 1-5, 1-10 o 1 15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 27, y una pluralidad de péptidos superpuestos contiguos de Der p 2 que comprenden un primer péptido que comienza en los aminoácidos D1 y termina en E25 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 18), un segundo péptido que comienza en los aminoácidos H22 y termina en K77 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 19), un tercer péptido que comienza en los aminoácidos S57 y termina en D113 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 24), y un cuarto péptido que comienza en los aminoácidos K109 y termina en D129 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con (SEQ ID NO: 25) cuyos péptidos primero a cuarto están opcionalmente alargados o truncados por 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico. De acuerdo con aspectos preferidos de la invención, el primer y segundo péptidos se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos; el primer y segundo péptidos se superponen entre sí en 1 a 11 aminoácidos; el segundo y tercer péptidos se superponen entre sí en 1 a 8 aminoácidos; el tercer y cuarto péptidos se superponen entre sí en 1 a 8 aminoácidos; el cuarto y quinto péptidos se superponen entre sí en 1 a 6 aminoácidos; el quinto y sexto péptidos se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos; el séptimo y octavo péptidos se superponen entre sí en 1 a 4 aminoácidos; el octavo y noveno péptidos se superponen entre sí en 1 a 21 aminoácidos; y/o el noveno y décimo péptidos se superponen entre sí en 1 a 5 aminoácidos. Como se describe en el presente documento, el paciente que lo necesita se trata con al menos cinco o seis o siete u ocho o nueve o diez de dichos alérgenos.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido T99 a G 168 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 8) que está opcionalmente alargado o truncado por 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 8.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido A164 y que termina en S200 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 12) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 12.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido R193 y que termina en E227 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 13) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 13.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido P220 y que termina en R254 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 14) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 14.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido R249 y que termina en D282 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 15) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 15.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido A278 y que termina en L320 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 11) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 11.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido D1 y que termina en E25 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 18) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 18.

Los péptidos descritos en el presente documento de acuerdo con la invención incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido H22 y que termina en K77 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 19) que está opcionalmente alargada o truncada en 1- 3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 19.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido S57 y que termina en D113 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 24) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 24.

Los péptidos descritos en este documento incluyen un péptido que comprende la secuencia del aminoácido K109 y que termina en D129 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % o 95 % con (SEQ ID NO: 25) que está opcionalmente alargada o truncada en 1-3, 1-5, 1-10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, con un péptido particularmente preferido que tiene la secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 25.

La descripción describe, además, un método de inmunoterapia específica contra las alergias a los ácaros del polvo doméstico que comprende administrar a un paciente que lo necesite uno o más alérgenos seleccionados del grupo que consiste en un primer polipéptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 99-104 a los aminoácidos 157 177 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos que son alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un segundo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 154-174 a los aminoácidos 190-210 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un tercer péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 183-203 a los aminoácidos 217-237 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un cuarto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 210-230 a los aminoácidos 244-264 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un quinto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 239-259 a los aminoácidos 272 292 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos que son alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un sexto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 268-288 a los aminoácidos 310-320 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % a la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un séptimo polipéptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 1-15 a los aminoácidos 15-35 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un octavo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 12-32 a los aminoácidos 67-87 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un noveno péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 47-67 a los aminoácidos 93-123 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y un décimo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 99-119 a los aminoácidos 119-129 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Se describe, además, una composición para realizar inmunoterapia específica que comprende una pluralidad de fragmentos de péptidos superpuestos contiguos cuyos fragmentos juntos comprenden la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con Der p 2 (SEQ ID NO: 28) que comprende un primer polipéptido que consiste en la secuencia del aminoácido 1 a los aminoácidos 30-82 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un segundo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 12-32 a los aminoácidos 67-87 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un tercer péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 47-67 a los aminoácidos 103-123 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y un cuarto péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 89-109 al aminoácido 129 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Se describe, además, una composición para realizar inmunoterapia específica que comprende una pluralidad de fragmentos de péptidos superpuestos contiguos cuyos fragmentos juntos comprenden la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con Der p 2 (SEQ ID NO: 28) que comprende un primer polipéptido que consiste en la secuencia del aminoácido 1 a los aminoácidos 62-82 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, un segundo péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 47-67 a los aminoácidos 103-123 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y un tercer péptido que consiste en la secuencia de los aminoácidos 89 119 al aminoácido 129 de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico. Se prefiere particularmente la composición en donde el segundo péptido que comienza en el aminoácido S57 y termina en D113 (SEQ ID NO: 24) no está ni alargado ni truncado.

Se describe además una composición para realizar inmunoterapia específica que comprende una pluralidad de fragmentos de péptidos superpuestos contiguos de Der p 2 que comprenden un primer péptido que comienza en el aminoácido D1 y termina en A72 de (SEQ ID NO: 16), un segundo péptido que comienza en el aminoácido S57 y termina en D113 (SEQ ID NO: 24), y un tercer péptido seleccionado del grupo que consiste en el péptido que comienza en el aminoácido K89 y termina en D129 de (SEQ ID NO: 28) o el péptido que comienza en el aminoácido K109 y termina en D129 (SEQ ID NO: 25) en donde los péptidos están opcionalmente alargados o truncados en 1-3, 1-5, 1 10 o 1-15 aminoácidos a lo largo de SEQ ID NO: 28 y en donde se elimina la reactividad de dichos péptidos a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico. Se describe, además, la composición en donde el segundo péptido que comienza en el aminoácido S57 y termina en D113 (SEQ ID NO: 24) no está ni alargado ni truncado.

Las composiciones de la invención pueden estar en forma de polvo seco y pueden comprender además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante, donde el hidróxido de aluminio es un adyuvante particularmente preferido.

Como se describe en el presente documento, los péptidos, combinaciones de péptidos y composiciones que los comprenden pueden administrarse en métodos de inmunoterapia específica contra alergias a los ácaros del polvo doméstico que comprenden administrar a un paciente que lo necesite uno o más alérgenos mediante el uso de inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intravenosa, técnicas transdérmica, intranasal, oral, sublingual, intraocular o intratecal.

Como se describe en este documento, se ha descubierto que la realización de inmunoterapia específica mediante la administración de los péptidos individuales como se describe en este documento y los péptidos superpuestos como se describe en este documento se puede promover mediante la coadministración de los péptidos en presencia de un agente desnaturalizante o caotrópico donde el cloruro de guanidinio es un agente particularmente preferido.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la unión competitiva de COP seleccionados a IgE de dos sueros (línea continua y discontinua) en comparación con Der p1. Panel A: Der p1 (símbolos cerrados) frente a péptidos individuales AllerDM1.1, 1.2 y 1.3, (símbolos abiertos). Panel B Der p1 (símbolos cerrados) frente a péptidos individuales AllerDM1.4, 1.5 y 1.6 y 1.7 (símbolos abiertos). Panel C: Der p1 (símbolos cerrados) frente a péptidos individuales AllerDM1.52, 1.53 y 1.5a. Panel D: Der p1 (símbolos cerrados) frente a péptidos individuales AllerDM1.62, 1.63 y 1.64.

La figura 2 representa la capacidad de Der p 2 y COP seleccionados para inducir la desgranulación de células RBL "humanizadas" (obtenidas del Dr. Vogel, Paul-Ehrlich-Institute, Langen, Alemania) preincubadas con dos sueros humanos diferentes. Panel A: Der p2 (símbolos cerrados) frente a Derp2_ConjuntoA (símbolos abiertos). Panel B: Der p2 (símbolos cerrados) frente a Derp2_ConjuntoB (símbolos abiertos). Panel C: Der p2 (símbolos cerrados) frente a péptidos individuales AllerDM2.3, 2.4 y 2.5.

La figura 3 representa la reducción de la unión a IgE como resultado del uso de cloruro de guanidinio en un ELISA de competencia. Panel A: Der p 1, AllerDM1.52 y AllerDM1.62 se analizaron con (etiqueta G) o sin preincubación durante 30 min con cloruro de guanidinio 1 M. Panel B: Der p 2 y AllerDM2.2 se analizaron con o sin preincubación durante 30 min con cloruro de guanidinio 1 M.

La figura 4 representa la falta de unión a IgE del producto seleccionado AllerDM compuesto por una mezcla equimolar de 10 COP. Se probaron 21 sueros de sujetos alérgicos a HDM de Europa y Estados Unidos en ELISA de competencia. Panel A: competencia con Der p1 (símbolos cerrados) frente a AllerDM (símbolos abiertos) para la reactividad de Der p 1. Panel B: competencia con Der p2 (símbolos rellenos) frente a AllerDM (símbolos abiertos) para la reactividad de Der p 2.

La figura 5 representa la incapacidad del producto seleccionado AllerDM compuesto por una mezcla equimolar de 10 COP para inducir la desgranulación de células RBL cargadas con 18 sueros de pacientes alérgicos a HDM. Panel A: Desgranulación inducida por Der p1 (símbolos rellenos) frente a AllerDM (símbolos abiertos). Panel B: Desgranulación inducida por Der p2 (símbolos rellenos) frente a AllerDM (símbolos abiertos).

La Figura 6 representa las reacciones anafilácticas de ratones Balb/c sensibilizados mediante inyecciones subcutáneas repetidas de una mezcla de los alérgenos Der p 1 y Der p 2 recombinantes. 7 días después de la tercera inyección de una dosis baja de alérgenos, los ratones se expusieron a una única dosis masiva de alérgeno. La media y la desviación estándar de las temperaturas corporales de un conjunto de diez ratones se muestra después de la exposición con AllerDM (círculos cerrados), vehículo (PBS, círculos abiertos) o la mezcla Der p 1/Der p 2 (cuadrados cerrados).

La Figura 7 representa la inmunogenicidad de inyecciones de AllerDM en comparación con Der p 1/Der p 2 en ratones Balb/c con adyuvante de Freund (panel A). AllerDM puede inducir IgG específicas que reconocen los alérgenos Der p 1 y Der p 2, respectivamente, hasta niveles comparables a la inmunización con los respectivos alérgenos originales. AllerDM1.42, DM 2.4 y DM 2.10 contribuyen más a la inmunogenicidad de AllerDM, mientras que ratones individuales reaccionan a los otros COP presentes en AllerDM excepto para AllerDM2.9 (panel B).

Descripción detallada de la invención

La invención se describe a continuación a modo de ejemplos con referencia a los siguientes procedimientos experimentales y resultados.

Material y métodos

Alérgenos

Der p 1 natural purificado (NA-DP1-2) y Der p 2 natural (NA-DP2-2) se obtuvieron de Indoor Biotechnologies Ltd, Reino Unido.

Elección de péptidos y síntesis

El objetivo era prevenir la formación de estructuras terciarias estables de epítopos de células B, y a la vez presentar todos los epítopos de células T presentes en las secuencias de proteínas de Der p 1 y Der p 2 que se muestran más adelante como la SEQ ID NO: 27 (Der p 1) secuencia de Swiss-Prot P08176.2 y la SEQ ID NO: 28 (Der p2) secuencia del GenBank AFJ68067.1 expuestas más abajo. Cabe señalar que Der p 2 existe en múltiples isotipos y Swiss Prot P49278.1 (SEQ ID NO: 29) se describe en la solicitud de patente anterior WO 2004-081028 (A2). Hay cuatro diferencias de aminoácidos entre la secuencia del GenBank AFJ68067.1 y la secuencia de la proteína madura (sin péptido señal) de Swiss Prot P49278.1. Las secuencias también difieren con la secuencia de Swiss Prot P49278.1 que es más corta debido a que un péptido individual se escinde de su extremo N-terminal.

SEQ ID NO 27

Secuencia DER p 1

MKJVLAIASLLALSAVYARPSSIK.TFEEYKJCAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQ

SNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEF1LK.TQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQ

MRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGV.AATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASOHGCHG

DTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALA

QTHSAIAVIIGIKDI.DAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRN

S W DTN WG DNG Y G Y F A A NID L M MIE E Y P Y V VIL

SEQ ID NO. 28

Secuencia DER p 2 (secuencia del Gen Bank AFJ68067.1)

DQVDVKDCANHEIKJCVLVPGCHGSEPCIIHRGICPFQLEALFEANQNSKTAKJEIKASID

GLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKJAPKSENVVVTVKVLGDNG

VLACAIATHAkIRD

SEQ ID NO: 29

Secuencia DER p 2 (secuencia de Swiss Prot P49278.1) MMYKJLCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGIvPFQLEAV

FEANQNTK.TAKJEIKLASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPICI

A PK. SEN V V VTVK.VM GD DGVLACAIATFIAKJR D

Como resultado, se seleccionaron los siguientes COP que se superponen a lo largo de las secuencias de Der p1 y Der p 2, a saber:

SEQ ID NO: 1

AllerDM 1.1 (81AA)

TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDL

AEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIE

SEQ ID NO: 2

ALLERDM1.2 (86AA) SQHGCHGDT1PRG1EY1QHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNV NKJREALAQTHSAIAVIIGIBCDLDAFRH

SEQ ID NO: 3

ALLERDM1.3 (86AA) A1AV1IGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWD TNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL

SEQ ID NO: 4

ALLERDM1.4 (66AA) TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDL AEQELVDCA

SEQ ID NO: 5

ALLERDM1,5 (73AA) LAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGIS NYCQ1YPPNVNKIRE

SEQ ID NO: 6

ALLERDM 1.6 (73AA) PNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSN AQGVDYWIVRNSWDT

SEQ ID NO: 7

ALLERDM1.7 (40AA) VDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL

SEQ ID NO: 8

ALLERDM!.42 (70AA) TNACS1NGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDL AEQELVDCASQHG

SEQ ID NO: 9

ALLERDMF52 (64AA) ASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPN VNKJRE

SEQ ID NO: 10

ALLERDME62 (63AA) PNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSN AQGVD

SEQ ID NO: 11

ALLERDM1.72 (43AA) AQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL

SEQ ID NO: 12

ALLERDM1.53 (37AA) ASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGWQESYYRYVAREQS

SEQ ID NO: 13

AllerDMI .54 (35AA) RYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIRE

SEQ ID NO: 14

AllerDMI.63 (35AA) PNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGR

SEQ ID NO: 15

AllerDMI.64 (34AA) RHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVD

SEQ ID NO: 16

ALLERDM2.1 (72 AA) DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCHHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASI DGLEVDVPG1DPNA

SEQ ID NO: 17

ALLERDM2.2 (73AA) SIDGLEVDVPG1DPNACHYMKCPLVKGQQYD1KYTWNVPK1APKSENVVVTVKVMG DDGVLACAIATHAKIRD

SEQ ID NO: 18

ALLERDM2.3 (25AA) DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSE

SEQ ID NO: 19

ALLERDM2.4 (56AA) HGSEPCIIHRGKPFQLEALFEANQNSKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMK

SEQ ID NO: 20

ALLERDM2.5 (56AA) HYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSEN WVTVKVLGDNGVLACAIATHAKIRD SEQ ID NO: 21

ALLERDM2.6 (31AA) DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHR

SEQ ID NO: 22

ALLERDM2.7 (75AA)

SEPCIIHRGKPFQLEALFEANQNSKTAKJEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVK

GQQYDIKYTWNVPKIA

SEQ ID NO: 23

ALLERDM2.8 (41AA) KYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVLGDNGVLA.CAIATHAKIRD

SEQ ID NO: 24

ALLERDM2.10 (57AA)

SIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKJAPK.SENVVVTVKVLG

D

SEQ ID NO: 25

ALLERDM2.9 (21AA) KVLGDNGVLACAIATHAKIRD

SEQ ID NO: 26

ALLERDM1.5a (32AA) AREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIRE

Todos los COP se sintetizaron mediante química fmoc en fase sólida a escala de investigación para permitir la determinación de la unión a IgE. Se utilizó HPLC preparativa para obtener péptidos puros en más del 90 % los cuales se liofilizaron. Los péptidos se resuspendieron en agua a 2 mg/ml o de 10 a 20 mg por ml en DMSO (ver la Tabla 1) y se congelaron en alícuotas.

ELISA de competencia

Der p 1 o Der p 2 purificados a 1,0 pg/ml se utilizaron para recubrir las inmunoplacas Nunc Maxisorp® de 96 pocillos durante la noche (Thermo Fisher Scientific Inc., Wohlen, Suiza). Después del bloqueo con BSA al 1 %, se añadieron diluciones de veinte, treinta o cuarenta veces hasta 200 veces del suero del paciente, según el contenido de IgE específico. Después se añadió un AcM anti-IgE humana, biotinilado, generado en ratón, a 5 pg/ml (BioLegend, San Diego, CA) y los anticuerpos se revelaron con estreptavidina HRP (BD-Biosciences, San Diego, CA) y el sustrato TMB. Se obtuvieron sueros de pacientes alérgicos de Estados Unidos y Europa (PlasmaLab International, Everett, WA, Estados Unidos y Biomnis, Lyon, Francia) respectivamente) seleccionados para CAP positivo para D. pteronyssinus y una señal clara sobre el fondo y se usaron para probar la competencia con los péptidos. Las diluciones en serie de cada conjunto de COP, es decir, para el conjunto A, B, C o D de Der p 1 y para las mezclas de Der p 2 D, E o F en concentraciones que varían entre 10'5 y 10'10 M se pre-incubaron con sueros seleccionados durante 15 min. sobre hielo. Después, los sueros se incubaron en placas de 96 pocillos recubiertas con nDer p 1 o nDer p 2 y se determinó la unión residual a IgE como se describió anteriormente. Se usaron diluciones de nDer p 1 y nDer p 2 como control para la inhibición.

Desgranulación de RBL

El ensayo de desgranulación se realizó como se describe en [37]. Las células RBL-703/21 transfectadas con el receptor RI de Fc épsilon humano se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (105 células/pocillo) durante la noche. La sensibilización pasiva de las células RBL-703/21 se llevó a cabo con sueros de pacientes con alergia a los ácaros del polvo doméstico a 1:20 durante la noche. Los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante lavado de la capa celular dos veces en solución salina equilibrada de Hanks (Gibco, Life Technologies) al día siguiente. La desgranulación de las células RBL se indujo durante 1 hora a 37 °C mediante la adición de nDer p1, nDer p 2 o COP individuales y mezclas a las concentraciones indicadas diluidas en tampón de Tyrode (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,4 mM, MgCl2 1 mM, glucosa 5,6 mM, HEPES 10 mM pH 7,4, BSA al 0,1 %). La actividad de la phexosaminidasa se analizó mediante incubación de 30 |jl de sobrenadante celular con 50 |jl de 4-nitrofenil N-acetil-p-D-glucosaminida (Sigma) a 1,3 mg/ml en tampón citrato (0,1 M, pH 4,5) durante 1 h a 37 °C. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 pl de tampón de glicina (glicina 0,2 M, NaCl 0,2 M, pH 10,7) y se midieron las densidades ópticas (DO) a 405 nm.

Respuesta anafiláctica en ratones

Los ratones Balb/c se sensibilizaron mediante inyecciones repetidas de dosis bajas (1 pg) de una mezcla de alérgenos de Der p 1 y Der p 2 equimolares mediante 3 inyecciones subcutáneas en un intervalo de 14 días. Los ratones se expusieron a dosis altas de una mezcla de Der p 1 y Der p 2 (30 jg/animal) o COP de AllerDM (30 jg/animal) 7 días después de la última inyección. Los síntomas anafilácticos se puntuaron mediante el uso de una escala de 6 grados (0, sin síntomas a 5, muerte) adaptada de Sade y otros, J Investig Allergol Clin Immunol; 17 (6): 379-385 (2007). La temperatura rectal se controló a intervalos de 15 minutos durante 60 minutos después de la exposición mediante el uso de un termómetro digital. Se usó PBS como control para conducir la exposición.

Inmunogenicidad de AllerDM

Los alérgenos Der p 1, Der p 2 y los COP individuales de AllerDM se inyectaron por vía i.p. en ratones Balb/c. Los alérgenos y los péptidos se administraron junto con el adyuvante completo de Freund. Las inyecciones se repitieron dos veces en un intervalo de un mes con Adyuvante Incompleto de Freund. Se recogió sangre del seno retro-orbital 15 días después de la última inyección y se preparó el suero mediante un método estándar. Los resultados se expresan como jg/m l de IgG específica.

Resultados experimentales

Elección de péptidos

Der p 1

Con el fin de seleccionar productos con menor unión a IgE, se diseñaron cuatro conjuntos de péptidos superpuestos contiguos (COP) largos (30-90 aminoácidos) que abarcan todo el alérgeno Der p 1 (Swiss-Prot P08176.2), para proporcionar así todos los posibles epítopos de células T. Un primer conjunto de tres COP, Derp1_Conjunto A compuesto por AllerDM1.1, 1.2 y 1.3, SEQ ID 1, SEQ ID 2 y SEQ ID 3 respectivamente, ya se había propuesto en el depósito de patente "Allergen peptide fragments and use thereof' WO2004-081028 (A2). Los COP de Derp1_Conjunto A se sintetizaron, purificaron y analizaron para la unión a IgE mediante el uso de un ELISA de competencia. Se observó unión residual a IgE con diferentes sueros de pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico a AllerDM1.2 y AllerDM1.3 pero no a AllerDM1.1.

Se diseñó un segundo conjunto (Derp1_Conjunto B) teniendo en cuenta las posibles regiones de unión a IgE de la bibliografía y se analizó la unión a IgE mediante ELISA de competencia. Derp1_Conjunto B, una mezcla de AllerDM1.4, 1.5, 1.6, 1.7, respectivamente SEQ ID 4, 5, 6 y 7 mostró reactividad residual a IgE. a. Cuando se utilizaron péptidos individuales, AllerDM1.4 y 1.7 no mostraron unión a IgE detectable, mientras que se encontró que AllerDM1.5 y 1.6 eran responsables de la reactividad observada previamente con AllerDM1.2 y 1.3 o Derp1_Conjunto B. completo.

AllerDM1.5 incluyó dos cisteínas que podrían reformar un puente disulfuro y recrear un epítopo de IgE. Por tanto, se eliminó la cisteína C-terminal, lo que condujo a AllerDM1.52 (SEQ ID 9) que, lamentablemente, todavía se unía a IgE. Para AllerDM1.6, el acortamiento de la parte C-terminal tampoco influyó en la unión a IgE (AllerDM1.62, SEQ ID 10). Dado que se modificaron el extremo N-terminal de AllerDM1.52 y el extremo C-terminal de AllerDM1.62, se tuvieron que diseñar péptidos alternativos a AllerDM1.4 y 1.7 para proporcionar superposiciones suficientes para garantizar la presencia de posibles epítopos terminales de células T. AllerDM1.42 y 1.72 recibieron 4 y 3 aminoácidos adicionales en la región de superposición (SEQ ID 8 y 11 respectivamente). Así el candidato Derp1_Conjunto C que incluye AllerDM1.52 y 1.62 que muestra una unión residual a IgE fue descartado.

Después de modelar la estructura 3D de Der p 1 y los péptidos sintetizados hasta ahora, se preparó un conjunto adicional, a saber, Derp1_Conjunto D en el que cada uno de los péptidos de unión a IgE AllerDM1.52 y 1.62 se dividió adicionalmente. AllerDM1.52 se dividió en dos péptidos, a saber, AllerDM1.53 y 1.5a (SEQ ID 12 y 26 respectivamente) y AllerDM1.62 se dividió en AllerDM1.63 y 1.64 (SEQ ID 14 y 15) (Figura 1). Finalmente, estos péptidos no mostraron ninguna unión a IgE detectable, lo que indica que se habían eliminado todos los posibles epítopos de IgE. Dado que 1.53 y 1.5a se superpusieron sólo en 5 aminoácidos, se sintetizó una versión extendida AllerDM1.54 (SEQ ID 13), superpuesta en 8 aminoácidos, que mostró las mismas propiedades de no unión a IgE que AllerDM1.5a. Este hallazgo indica que la variación del extremo de los COP en 3 aminoácidos no tiene ningún efecto sobre la capacidad de unión a IgE. Tener que dividir AllerDM1.62 en dos partes fue inesperado con respecto al conocimiento actual, ya que la región R248 a R254 no se había retenido previamente por su posible unión a IgE (ver antecedentes de la invención). El conjunto final de COP derivados de Der p 1 sin unión detectable a IgE incluye seis péptidos, a saber, AllerDM1.42, 1.53, 1.54, 1.63, 1.64 y 1.72. (SEQ ID 8, 12, 13, 14, 15 y 11 respectivamente).

Der p 2

El primer conjunto de COP se derivó de la solicitud de patente anterior WO2004-081028 (A2) (isotipo de Der p 2 P49278.1) (s Eq ID 29) y contenía dos péptidos de igual longitud AllerDM2.1 y 2.2 (SEQ ID 16 y 17). Este conjunto de COP (Derp2_ConjuntoA) mostró una unión a IgE baja pero detectable en ELISA de competencia y se encontró que AllerDM2.2 se unía a IgE en ELISA directo. Derp2_ConjuntoB, compuesto de AllerDM2.3, 2.4 y 2.5 (SEQ ID 18, 19 y 20) se diseñó para evitar los puentes disulfuro responsables de dos bucles cortos que se sabe que desempeñan un papel en el mantenimiento de la estructura 3D de Der p 2. En paralelo, se sintetizó un conjunto alternativo (Derp2_Conjunto C), donde se mantuvieron los puentes disulfuro, a saber, AllerDM2.6, 2.7 y 2.8 (Se Q ID 21, 22 y 23). Ambos conjuntos B y C mostraron unión residual a IgE en ELISA de competencia. En el Conjunto B, la unión a IgE se restringió a AllerDM2.5, como se confirmó mediante ELISA directo y de competencia. La unión de IgE a COP individuales del Conjunto C demostró ser múltiple. AllerDM2.7, que cubre la parte central de Der p 2, mostró unión residual a IgE en ELISA de competencia, mientras que se encontró que AllerDM2.8 (parte C-terminal de Der p 2) se une de manera no específica a IgE de sueros de donantes alérgicos y no alérgicos. Además, Derp2_Conjunto C provocó una respuesta débil pero detectable en el ensayo de desgranulación de RBL y, por lo tanto, se descartó del desarrollo posterior de AllerDM.

Sorprendentemente, Derp2_ConjuntoB (AllerDM2.3, 2.4 y 2.5) pudo inducir la desgranulación de basófilos en los ensayos con RBL, mientras que Derp2_ConjuntoA (Aller DM 2.1 y 2.2) no lo hizo (Figura 2). Además, AllerDM2.4 y 2.5 en combinación dio como resultado la desgranulación, mientras que cada péptido individual no lo hizo (Figura 2, Panel C). Se observó el mismo fenómeno al combinar AllerDM2.1 con AllerDM2.5. Dado que AllerDM2.1 y AllerDM2.4 no se unieron a IgE cuando se analizaron solos en un ELISA competitivo, y dado que se requieren dos epítopos de IgE además de desencadenar la desgranulación, estos resultados plantearon la posibilidad de que tuviera lugar alguna interacción entre los dos péptidos AllerDM2.4 y 2.5 en solución, lo que conduce a la reconstitución parcial de la estructura 3D original del alérgeno, para recrear así un segundo epítopo de IgE.

El análisis de las estructuras cristalinas de Der p 2 en vista de los resultados anteriores conduce a proponer que AllerDM2.4 y 2.5 pueden replegarse parcialmente en solución debido a la presencia de láminas beta antiparalelas y combinarse para recrear un segundo sitio de unión a IgE. Dado que la combinación de AllerDM 2.2 en combinación con 2.1 o 2.4 no indujo la desgranulación, se añadió S57 a C73 en el extremo N de AllerDM2.5 en el siguiente conjunto de COP que conducen a AllerDM2.10 (SEQ ID 24). Para reducir aún más el potencial de unión a IgE, se recortó AllerDM2.10 en su extremo C-terminal a D113. Para mantener una superposición mínima (5 aminoácidos) con AllerDM2.10, tuvo que sintetizarse AllerDM2.9 (SEQ ID 25) que comienza en K109, para incluir la secuencia completa de Der p 2. Derp2_Conjunto D (AllerDM2.3, 2.4, 2.10 y 2.9) y sus componentes individuales no mostraron unión residual a IgE en ELISA de competencia y ya no pudieron desencadenar la desgranulación de basófilos. El conjunto final de COP derivados de Der p 2 incluye así cuatro péptidos, a saber, AllerDM2.3, 2.4, 2.10 y 2.9 (SEQ ID 18, 19, 24 y 25 respectivamente).

Un hallazgo adicional indicó que la unión a IgE y la desgranulación de basófilos se relacionan con la reconstitución parcial de la estructura 3D original en solución que proviene del uso de sales desnaturalizantes. La adición de sales desnaturalizantes, incluido el cloruro de guanidinio o la urea, disminuyó considerablemente la unión de IgE a AllerDM1.52, 1.62 y 2.2 (Figura 3). Esto indica una alternativa para la formulación de productos para disminuir las posibles reacciones alérgicas inmediatas tras la inyección de fragmentos de alérgenos.

AllerDM

Para verificar aún más la ausencia de unión a IgE, la mezcla final de diez péptidos derivados de Der p 1 y Der p 2, que ahora se denomina AllerDM, es decir, compuesta por una combinación de AllerDM1.42, 1.53, 1.54, 1.63, 1.64 y 1.72. (SEQ ID 8, 12, 13, 14, 15 y 11 respectivamente) con AllerDM2.3, 2.4, 2.10 y 2.9 (SEQ ID 18, 19, 24 y 25 respectivamente) se utilizó en las pruebas de ELISA de competencia y desgranulación de RBL. Como se observa en la Figura 4, AllerDM no mostró reactividad detectable hasta una concentración de 10'5 M con un panel de 21 sueros de pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico de Europa y Estados Unidos. Los controles que utilizaron los alérgenos naturales Der p 1 o Der p 2 mostraron una competencia esperada en el rango de 10'7 a 10'9 M. La unión reducida a IgE permite considerar la administración de una dosis más alta de COP en los seres humanos en comparación con los tratamientos tradicionales de SIT.

Se encontró que las células RBL transfectadas con el receptor I de Fc épsilon humano se unían a la IgE humana y se desgranulaban en presencia de los alérgenos [37]. AllerDM, hasta 10'5 M nuevamente, no pudo desencadenar la desgranulación de basófilos cuando se precargaron células RBL con un panel de 18 sueros humanos diferentes de pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico (Figura 5 A y B). Por el contrario, Der p 1 y Der p 2 pudieron inducir la desgranulación en combinación con los mismos sueros. La ausencia de desgranulación de basófilos indica una posible disminución del riesgo de una reacción alérgica inmediata tras la aplicación en seres humanos.

A partir de estos experimentos se puede concluir que un producto preferido compuesto por diez COP que se denominará AllerDM contendrá una combinación de péptidos solubles derivados de proteínas Der p 1 y Der p 2. El producto candidato preferido estará compuesto por las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25.

Una mejora adicional de la invención incluye dividir los COP en partes con mejores propiedades de purificación y solubilidad. Se describen, además, homólogos de los COP AllerDM 1.42 a 1.72 y AllerDM2.3 a 2.10, por cambios de aminoácidos dentro de cada péptido para producir homólogos de este, en donde se elimina la reactividad de los homólogos a anticuerpos IgE de los pacientes alérgicos a HDM mientras que todavía se retiene la reactividad a los linfocitos T. Además, d son homólogos de los COP al cambiar los límites de los COP dentro de los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico Der p 1 y Der p 2. Tales homólogos darán como resultado productos con perfiles equivalentes de unión a IgE no detectable y actividad de linfocitos T. Dichos productos presentarán el mismo potencial de seguridad y eficacia en humanos que AllerDM y pueden considerarse equivalentes en términos de posibilidades de tratamiento, a menos que se demuestre lo contrario. Los homólogos adecuados caracterizados por no tener reactividad con los anticuerpos IgE contra los ácaros del polvo doméstico mientras retienen la reactividad con los linfocitos T pueden identificarse mediante los métodos descritos en el presente documento.

Tabla 1: Características de solubilidad de los COP

Sensibilización y exposición

Se sensibilizaron ratones Balb/c mediante inyecciones subcutáneas repetidas de una mezcla de alérgenos Der p 1 y Der p 2 (1 pg/ml). 7 días después de la última inyección, los ratones se expusieron a una única dosis masiva de alérgenos (Der p 1 y Der p 2 a 30 pg/ml) o AllerDM (30 pg/ml). El choque anafiláctico en ratones se ha asociado con la caída de la temperatura corporal. Los controles y las exposiciones a AllerDM resultaron esencialmente en ninguna caída de temperatura, mientras que la mezcla Der p 1/Der p 2 indujo una disminución marcada en la temperatura rectal (Figura 6). Estos resultados muestran que AllerDM se diferencia de sus alérgenos originales por la falta de actividad en la exposición, lo que indica que AllerDM no desencadena un choque anafiláctico en ratones sensibilizados con Der p 1/Der p 2.

Inmunización

Se inyectaron AllerDM y Der p 1/Der p 2 en ratones Balb/c con adyuvante de Freund. Los niveles de IgG se midieron después de la inyección intraperitoneal (Figura 7). Las IgG generadas por la mezcla AllerDM reconocen Der p 1 y Der p 2 naturales casi en la misma medida que los propios alérgenos originales (Figura 7, panel A). En experimentos separados, se detectó la presencia de IgG contra cada COP individual en sueros de ratones inmunizados con AllerDM (Figura 7, panel B), lo que demuestra que cada COP puede contribuir a la inmunogenicidad general, aunque en diferente medida.

Variaciones en la invención

Se describen, además, homólogos de los COP de AllerDM1.42 a DM2.10, mediante cambios de aminoácidos dentro de cada péptido para producir homólogos de este, en donde se elimina la reactividad de los homólogos a los anticuerpos IgE de pacientes alérgicos a los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico mientras que todavía se retiene la reactividad con los linfocitos T. Se describen además homólogos de los COP cambiando los límites de los COP dentro de los alérgenos de ácaros del polvo doméstico Der p 1 y Der p 2. Tales homólogos darán como resultado productos con perfiles equivalentes de unión a IgE no detectable y actividad de linfocitos T. Dichos productos presentarán el mismo potencial de seguridad y eficacia en seres humanos que AllerDM y pueden considerarse equivalentes en términos de posibilidades de tratamiento, a menos que se demuestre lo contrario. Los homólogos adecuados caracterizados por no tener reactividad con los anticuerpos IgE contra los ácaros del polvo doméstico mientras mantienen la reactividad con los linfocitos T pueden identificarse mediante los métodos descritos en este documento. Se describen, además, conjuntos de COP con reactividad a IgE reducida o eliminada que retienen la reactividad con los linfocitos T pero que también son solubles y/o que muestran mejor síntesis y purificación.

Se espera que a los expertos en la técnica se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la invención al considerar la presente descripción. En consecuencia, las únicas limitaciones que deberían imponerse al alcance de la invención son las que aparecen en las reivindicaciones adjuntas.

Referencias:

[1] Settipane RA. Demographics and epidemiology of allergic and nonallergic rhinitis. Allergy Asthma Proc. 2001; 22:185-9.

[2] Bousquet J, Bullinger M, Fayol C, Marquis P, Valentin B, Burtin B. Assessment of quality of life in patients with perennial allergic rhinitis with the French version of the SF-36 Health Status Questionnaire. J Allergy Clin Immunol.

1994; 94:182-8.

[3] Thomas WR. Geography of house dust mite allergens. Asian Pacific journal of allergy and immunology/launched by the Allergy and Immunology Society of Thailand. 2010; 28:211-24.

[4] Weghofer M, Thomas WR, Kronqvist M, Mari A, Purohit A, Pauli G, y otros, Variability of IgE reactivity profiles among European mite allergic patients. European journal of clinical investigation. 2008; 38:959-65.

[5] Taketomi EA, Silva DA, Sopelete MC, Gervasio AM, Alves R, Sung SJ. Differential IgE reactivity to Der p 1 and Der p 2 allergens of Dermatophagoides pteronyssinus in mite-sensitized patients. Journal of investigational allergology & clinical immunology: official organ of the International Association of Asthmology. 2006; 16:104-9.

[6] Hales BJ, Martin AC, Pearce LJ, Laing IA, Hayden CM, Goldblatt J, y otros, IgE and IgG anti-house dust mite specificities in allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2006; 118:361-7.

[7] Smith WA, Hales BJ, Jarnicki AG, Thomas WR. Allergens of wild house dust mites: environmental Der p 1 and Der p 2 sequence polymorphisms. J Allergy Clin Immunol. 2001; 107:985-92.

[8] Piboonpocanun S, Malainual N, Jirapongsananuruk O, Vichyanond P, Thomas WR. Genetic polymorphisms of major house dust mite allergens. Clin Exp Allergy. 2006; 36:510-6.

[9] Jeannin P, Pestel J, Bossus M, Lassalle P, Tartar A, Tonnel AB. Comparative analysis of biological activities of Der p I-derived peptides on Fc epsilon receptor-bearing cells from Dermatophagoides pteronyssinus-sensitive patients. Clinical and experimental immunology. 1993; 92:133-8.

[10] Jarnicki AG, Tsuji T, Thomas WR. Inhibition of mucosal and systemic T(h)2-type immune responses by intranasal peptides containing a dominant T cell epitope of the allergen Der p 1. International immunology. 2001; 13:1223-31.

[11] Greene WK, Thomas WR. IgE binding structures of the major house dust mite allergen Der p I. Molecular immunology. 1992; 29:257-62.

[12] Greene WK, Chua KY, Stewart GA, Thomas WR. Antigenic analysis of group I house dust mite allergens using random fragments of Der p I expressed by recombinant DNA libraries. International archives of allergy and applied immunology. 1990; 92:30-8.

[13] Chruszcz M, Pomes A, Glesner J, Vailes LD, Osinski T, Porebski PJ, y otros, Molecular determinants for antibody binding on group 1 house dust mite allergens. The Journal of biological chemistry. 2012; 287:7388-98.

[14] Dai YC, Chuang WJ, Chua KY, Shieh CC, Wang JY. Epitope mapping and structural analysis of the anti-Der p 1 monoclonal antibody: insight into therapeutic potential. Journal of molecular medicine. 2011; 89:701-12.

[15] Christensen LH, Riise E, Bang L, Zhang C, Lund K. Isoallergen variations contribute to the overall complexity of effector cell degranulation: effect mediated through differentiated IgE affinity. J Immunol. 2010; 184:4966-72.

[16] Hales BJ, Hazell LA, Smith W, Thomas WR. Genetic variation of Der p 2 allergens: effects on T cell responses and immunoglobulin E binding. Clin Exp Allergy. 2002; 32:1461-7.

[17] Mueller GA, Smith AM, Chapman MD, Rule GS, Benjamin DC. Hydrogen exchange nuclear magnetic resonance spectroscopy mapping of antibody epitopes on the house dust mite allergen Der p 2. The Journal of biological chemistry. 2001; 276:9359-65.

[18] Szalai K, Fuhrmann J, Pavkov T, Scheidl M, Wallmann J, Bramswig KH, y otros, Mimotopes identify conformational B-cell epitopes on the two major house dust mite allergens Der p 1 and Der p 2. Molecular immunology. 2008; 45:1308-17.

[19] Drachenberg KJ, Heinzkill M, Urban E, Woroniecki SR. Efficacy and tolerability of short-term specific immunotherapy with pollen allergoids adjuvanted by monophosphoryl lipid A (MPL) for children and adolescents. Allergol Immunopathol (Madr). 2003; 31:270-7.

[20] Dam Petersen K G-HD, Kjaergaard S, Dahl R. Clinical and patient based evaluation of immunotherapy for grass pollen and mite allergy. Allergol Immunopathol (Madr). 2005; 33:264-9.

[21] Birnbaum J, Ramadour M, Magnan A, Vervloet D. Hymenoptera ultra-rush venom immunotherapy (210 min): a safety study and risk factors. Clin Exp Allergy. 2003; 33:58-64.

[22] Drachenberg KJ, Proll S, Urban E, Woroniecki SR. Single-course specific immunotherapy with mixed pollen allergoids: results of a multi-centre study. Allergol Immunopathol (Madr). 2003; 31:77-82.

[23] Hartl A, Hochreiter R, Stepanoska T, Ferreira F, Thalhamer J. Characterization of the protective and therapeutic efficiency of a DNA vaccine encoding the major birch pollen allergen Bet v 1a. Allergy. 2004; 59:65-73.

[24] Martinez Gomez JM, Fischer S, Csaba N, Kundig TM, Merkle HP, Gander B, y otros, A protective allergy vaccine based on CpG- and protamine-containing PLGA microparticles. Pharm Res. 2007; 24:1927-35.

[25] Pauli G, Larsen TH, Rak S, Horak F, Pastorello E, Valenta R, y otros, Efficacy of recombinant birch pollen vaccine for the treatment of birch-allergic rhinoconjunctivitis. J Allergy Clin Immunol. 2008; 122:951-60.

[26] Walgraffe D, Matteotti C, El Bakkoury M, Garcia L, Marchand C, Bullens D, y otros, A hypoallergenic variant of Der p 1 as a candidate for mite allergy vaccines. J Allergy Clin Immunol. 2009; 123:1150-6.

[27] van Oort E, de Heer PG, van Leeuwen WA, Derksen NI, Muller M, Huveneers S, y otros, Maturation of Pichia pastoris-derived recombinant pro-Der p 1 induced by deglycosylation and by the natural cysteine protease Der p 1 from house dust mite. European Journal of Biochemistry/FEBS. 2002; 269:671-9.

[28] Asturias JA, Ibarrola I, Arilla MC, Vidal C, Ferrer A, Gamboa PM, y otros, Engineering of major house dust mite allergens Der p 1 and Der p 2 for allergen-specific immunotherapy. Clin Exp Allergy. 2009; 39:1088-98.

[29] Chen KW, Blatt K, Thomas WR, Swoboda I, Valent P, Valenta R, y otros, Hypoallergenic Der p 1/Der p 2 combination vaccines for immunotherapy of house dust mite allergy. J Allergy Clin Immunol. 2012; 130:435-43 e4.

Claims

REIVINDICACIONES

Una composición que comprende seis péptidos superpuestos contiguos, en donde

- el primer péptido consiste en la secuencia del aminoácido T99 al aminoácido G168 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el segundo péptido consiste en la secuencia del aminoácido A164 al aminoácido S200 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido R193 al aminoácido E227 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido P220 al aminoácido R254 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el quinto péptido consiste en la secuencia del aminoácido R249 al aminoácido D282 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y

- el sexto péptido consiste en la secuencia del aminoácido A278 al aminoácido L320 de un polipéptido que tiene la s Eq ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Una composición que comprende cuatro péptidos superpuestos contiguos, en donde

- el primer péptido consiste en la secuencia del aminoácido D1 al aminoácido E25 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el segundo péptido consiste en la secuencia del aminoácido H22 al aminoácido K77 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido S57 al aminoácido D113 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y

- el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido K109 al aminoácido D129 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Una composición que comprende una pluralidad de péptidos superpuestos contiguos de Der p1 y una pluralidad de péptidos superpuestos contiguos de Der p2, en donde dicha pluralidad de péptidos superpuestos contiguos de Der p1 son seis péptidos, en donde

- el primer péptido consiste en la secuencia del aminoácido T99 al aminoácido G168 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el segundo péptido consiste en la secuencia de los aminoácidos A164 al aminoácido S200 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido R193 al aminoácido E227 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido P220 al aminoácido R254 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el quinto péptido consiste en la secuencia del aminoácido R249 al aminoácido D282 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el sexto péptido consiste en la secuencia del aminoácido A278 al aminoácido L320 de un polipéptido que tiene la s Eq ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico;

y en donde la pluralidad de los péptidos superpuestos contiguos de Der p2 son cuatro péptidos, en donde

- el primer polipéptido consiste en la secuencia del aminoácido D1 al aminoácido E25 de un polipéptido que tiene la Se Q iD NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el segundo péptido consiste en la secuencia del aminoácido H22 al aminoácido K77 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido S57 al aminoácido D113 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y

- el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido K109 al aminoácido D129 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico.

Una combinación de alérgenos para su uso en un método de inmunoterapia específica contra las alergias a los ácaros del polvo doméstico en un paciente, en donde dicha combinación de alérgenos comprende diez péptidos, en donde

- el primer péptido consiste en la secuencia del aminoácido T99 al aminoácido G168 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el segundo péptido consiste en la secuencia del aminoácido A164 al aminoácido S200 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el tercer péptido consiste en la secuencia del aminoácido R193 al aminoácido E227 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el cuarto péptido consiste en la secuencia del aminoácido P220 al aminoácido R254 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el quinto péptido consiste en la secuencia del aminoácido R249 al aminoácido D282 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el sexto péptido consiste en la secuencia del aminoácido A278 al aminoácido L320 de un polipéptido que tiene la s Eq ID NO: 27 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el séptimo péptido consiste en la secuencia del aminoácido D1 al aminoácido E25 de un polipéptido que tiene la SEQ iD NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el octavo péptido consiste en la secuencia del aminoácido H22 al aminoácido K77 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

- el noveno péptido consiste en la secuencia del aminoácido S57 al aminoácido D113 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, y

- el décimo péptido consiste en la secuencia del aminoácido K109 al aminoácido D129 de un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 28 en donde se elimina la reactividad de dicho péptido a los anticuerpos IgE de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico mientras que se retiene la reactividad con los linfocitos T de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico,

y en donde dicha combinación de diez alérgenos se administra a un paciente que lo necesita.

La combinación de alérgenos para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde los péptidos se administran al paciente mediante el uso de inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intravenosa, técnicas transdérmicas, intranasales, orales, sublinguales, intraoculares o intratecales.

La combinación de alérgenos para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde

(i) los péptidos se administran en presencia de un agente desnaturalizante o caotrópico, preferentemente en donde el agente caotrópico es cloruro de guanidinio;

(ii) los alérgenos se proporcionan en forma de polvo seco;

(iii) los alérgenos comprenden además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable; y/o (iv ) los alérgenos comprenden además un adyuvante, preferentemente en donde el adyuvante es hidróxido de aluminio.