CN105307679A

CN105307679A - 用于治疗室内尘螨过敏的连续重叠肽

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Publication number: CN105307679A
Application number: CN201480032217.9A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·谢特纳; 克里斯托弗·雷蒙
Original assignee: Anergis SA
Current assignee: Anergis SA
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2016-02-03
Also published as: JP2016523231A; US20150050301A1; JP2018058856A; WO2014195803A3; DK3003366T3; JP6640818B2; HK1223019A1; BR112015030644A2; AU2014276484B2; ES2828448T3; RU2015155874A; WO2014195803A2; EP3003366B1; AU2014276484A1; EP3003366A2; CA2914037A1; JP6300907B2

Abstract

本发明由室内尘螨的主要过敏原Der？p？1和Der？p？2的序列提供了用于通过特异性免疫治疗(SIT)治疗过敏患者的连续重叠肽(COP)。这些肽虽然提供了所有潜在的T细胞表位，但是缺乏原始过敏原的三维结构，因此降低了它们结合IgE的能力。因此，可以每次注射施用增加量的COP，从而减少注射次数和免疫疗法治疗的时间长度这两者。

Description

用于治疗室内尘螨过敏的连续重叠肽

对相关申请的交叉引用

本申请是基于2013年6月6日提交的美国临时申请序列号61/831,961，该美国临时申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

以引用的方式并入以电子方式递交的材料

以引用方式整体并入的是同时随本文递交并且被如下标识的计算机可读的氨基酸序列表：ASCII文本文件，所命名的文件名：47712A_SeqListing.txt；大小：20,103个字节；创建：2014年6月5日。

技术领域

本发明涉及源自于Derp1和Derp2室内尘螨主要过敏原的连续重叠肽(COP)以及这些化合物在医疗中的用途。本发明的化合物和治疗方法预期可用于治疗室内尘螨过敏以及广泛地促进对它的治疗。

背景技术

IgE介导的过敏性疾病似乎是非常常见的，特别是在工业化国家中，其中高达四分之一的人群患有过敏性鼻炎[1]。此外，患有过敏性鼻炎的人与健康人相比显示出更低的生活质量[2]，只有少数人自发地进入缓解期。

室内尘螨过敏在世界范围内广泛分布并且美国和欧洲的过敏人群的约50％患有室内尘螨过敏，关于综述，参见[3]。室内尘螨(HDM)主要属于两种物种，即屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)。针对HDM过敏的治疗可以基于这两种物种之一的主要过敏原，这是因为屋尘螨和粉尘螨的主要HDM过敏原Derp1/Derf1和Derp2/Derf2共有超过80％的序列同一性。Derp1与Derf1共有83％的序列同一性，从而在这两种物种之间产生高交叉反应性人类IgE抗体和T细胞应答。具体来说，已经发现将过敏患者的血清与Derf1一起预孵育阻止了Derp1与HDMIgE抗体的结合，尽管报道了不同的结合亲和力。已经发现Derp2和Derf2(88％的序列同一性)非常有效地阻止它们的对应物的结合。还发现屋尘螨肽和粉尘螨肽同样地诱导T细胞增殖。然而，来自这两种物种的过敏原并不是完全可互换的，这是因为与来自Derp1的肽相比，更少的来自Derf1的肽能够例如刺激T细胞增殖。

来自不同物种的过敏原的可能可互换的使用已经通过在其中致敏物种是粉尘螨的意大利地区使用屋尘螨进行的研究的免疫治疗结果所表明，所述结果与在英国使用屋尘螨针对屋尘螨致敏所进行的研究结果或在南韩使用粉尘螨针对粉尘螨所进行的研究结果没有显著差异。意大利的结果还与使用提取物混合物进行的研究结果没有差异，如由Thomas所综述[3]。因此，来自屋尘螨的主要过敏原可以被认为是至少针对屋尘螨、粉尘螨这两者以及可能的其它室内尘螨物种的有效产品的基础。

已经在HDM过敏中描述了多个过敏原序列，如在NCBI核苷酸和蛋白质数据库中所见。过敏原可以被分配成在序列上与已知蛋白质相关的至少7组，即：

Derp1，半胱氨酸蛋白酶(肽酶C1A家族)

Derp2，MD2样脂质结合蛋白，TLR4结合

Derp3，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶

Derp4，α-淀粉酶

Derp5，Blot5(热带无爪螨(Blomiatropicalis)，一种仓储螨)

Derp6，胰凝乳蛋白酶样(S1肽酶结构域)

Derp7，分泌的糖蛋白

在欧洲，对HDM过敏的受试者中有97％可以使用Derp1和Derp2的混合物来诊断，而这些患者中有50％还对Derp家族的另外的过敏原反应[4]。在巴西，发现患有过敏性鼻炎的HDM点刺阳性患者中有约87％含有识别Derp1、Derp2或这两种过敏原的IgE[5]。在澳大利亚进行的研究[6]证实约50％的抗HDMIgE抗体与Derp1和Derp2结合并且另外的30％由Derp4、5以及7同等地促成。因此，对Derp1和Derp2的反应性在过敏人群中明显占优势，这表明基于Derp1和Derp2过敏原的产品可以治疗大多数的患者。

Derp1序列和IgE表位

Derp1变体已经被描述表现出一定的多态性[7]。使用Swiss-Prot序列P08176.2进行的BLAST搜索揭示了NCBI数据库内许多的蛋白质序列。大多数的变异存在于Derf1序列中并且被定位到5个主要的位置，即123、132、150、152以及204(坐标参照Swiss-ProtP08176.2)。还使用RT-PCR，关于一组来自在曼谷从家中分离的屋尘螨和粉尘螨这两者的组1和组2过敏原的序列描述了多态性[8]。综上所述，这些结果表明最主要的Derp1是Swiss-ProtP08176.2中所提到的还与Derp1.0105具有同一性的序列[8]。

Derp1蛋白质是具有320个氨基酸的半胱氨酸蛋白酶(C1超家族的肽酶)。前18个氨基酸具有信号肽的特性，而随后的从R19到E98的氨基酸存在于原蛋白中并且的确含有蛋白酶抑制因子结构域I29。成熟的Derp1由222个氨基酸(T99到L320)构成并且已经确定了三种晶体结构(PDB1XKG、2AS8以及3F5V)。

在针对Derp1搜索免疫表位数据库(IEDB)时，发现35个表位。描述了24个B细胞表位，这些表位是通过抗原竞争、蛋白质印迹、ELISA、Ig组胺释放或放射免疫测定来确定的[9]；[10]；[11]；[12]。将这些潜在的表位组合允许界定四个主要的区域，所述区域所具有的边界位于N150至H170；V187至R202；C215至Q231；Y263至Y299。

IgE表位主要是构象表位，并且因此难以定位。针对Derp1或Derf1所产生的单克隆抗体大多是具有物种特异性的。然而，针对Derf1的抗体4C1还结合Derp1并且发现单克隆抗体(mAb)和人类IgE抗体的表位重叠，如通过复合体的晶体结构所确定[13]。4C1与Derp1和Derf1的共结晶表明残基D113、R115、Q116、R118、R154、I156、Q279、Y283、D296、Y299、Y301可能参与IgE结合。

mAbW108不仅抑制Derp1与IgE抗体的结合，而且还抑制它的半胱氨酸蛋白酶活性[14]。在对W108/Derp1复合体进行蛋白酶消化之后通过LC-MS鉴定出三个肽(aa209-224；227-243以及260-287)，这些肽没有与Derp1的被发现最直接与mAbW108结合的两个肽段(aa151-197和286-320)重叠。这些结果证实了甚至在使用单克隆抗体时定位IgE表位的复杂性。

从文献中汇总数据允许鉴定出Derp1的具有与IgE结合的潜能的四个区域，即N150-H170、V187-R202、C215-Q231以及G274-D291。所报道的实验证实分开Derp1的这四个结构域是不够的，这是因为R149至R254之间的另外的区域必须被中断以去除残留的IgE结合。

Derp2序列和IgE表位

Derp2似乎是非常多态的，具有15种所述的变体，包括被最佳表征的型式Derp2.0101、Derp2.0103、Derp2.0104、Derp2.0107以及Derp2.0108[15]。根据[8]，Derp2表现出随氨基酸取代的集群而发生的频繁变异，但是在17个序列中的任一个中没有发现典型Derp2.0101。Derf2表现出具有与Derp2相似的，但是处在不同的氨基酸位置处的取代集群并且没有任何结构一致性的变体。

根据[16]，这两种变体Derp2.0101和Derp2.0104在T细胞刺激方面是最具活性的，而其它不太常见的变体，即0107和0108表现出始终如一的差异，这证实了序列的变化可以使细胞因子反应发生变化。根据[15]，Derp2亚型0103和0104似乎以更高的亲和力与通过噬菌体展示所获得的一系列重组IgE结合。与rIgE组合的这两种亚型因此在重构测定中表现出更好的触发脱颗粒的能力。然而，所有的Derp2亚型均能够在来自过敏患者的多克隆血清的存在下触发脱颗粒。考虑到上述结果，特别是T细胞应答以及对所选的rIgE克隆的高亲和力，Derp2.0104变体(基因库AFJ68067.1)被选用于产品限定。

已经使用不同的技术以试图确定IgE表位，包括氢交换核磁共振[17]和模拟表位[18]。三个主要的区域似乎被涉及，这些区域位于分子的表面上，即N71-C78、V94-K100以及L111-G115(根据基因库AFJ68067.1序列编号)。后两个区域包括在IEDB数据库中被鉴定为可能的IgE表位的一部分的残基[7]；然而，由于IgE的三维结合特异性，因此没有提出明确的表位定位。

低过敏原性过敏疫苗

针对IgE介导的过敏的病因的唯一治疗是特异性免疫治疗(SIT)。所述治疗在于在一段较长的时间(三年至五年)内注射递增剂量的过敏原以在过敏患者中诱导耐受性。多项研究证实了这种治疗对过敏反应的益处，特别是在长期治疗后[19],[20]。然而，观测到许多副作用，特别是在超快速(ultra-rush)治疗期间，其中多达30％的患者在治疗过程中不得不针对过敏症状接受治疗[21]。因此对呈具有可接受的安全性的更短的治疗形式的SIT替代方案存在强烈的医疗需求。

已经测试了不同的方法来提高SIT的安全性和功效。制剂或现有提取物已经通过添加佐剂，如MPL(过敏治疗剂)[22]、DNA序列[23]、或噬菌体与CpG的组合[24]而得以改进，所述佐剂增强TH1免疫应答，从而允许有可能降低过敏原提取物的量。使用限定的过敏原而不是整个提取物。在桦树花粉的情况下，使用重组Betv1进行的临床试验已经证实了等同于整个桦树花粉提取物的功效[25]。

为了减少由治疗引起的过敏症状的出现，不同的小组研究具有低过敏原性潜能，即表现出减少的IgE结合的产品的使用。Derp1在大肠杆菌中的表达仅仅产生聚集的蛋白质，这证实IgE的结合减少[26]，并且被提出作为可能的低过敏原性疫苗。原Derp1在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中的表达产生稳定的低过敏原性酶原，所述酶原还具有用于过敏原特异性免疫治疗中的潜能[27]。通过PCR将过敏原的组合，即Derp1/Derp2杂合蛋白工程化[28]或将杂合蛋白用Derp1和Derp2片段重新组装[29]并且在大肠杆菌中表达。在这两种情况下，显示出降低的IgE反应性，而保持免疫原性。还已经构建了具有优化的密码子的潜在的DNA疫苗候选者[30],[31]。然而，这些方法均尚未在人类中经过测试。

另一种方法在于提供包含有限数目的T细胞表位的肽，所述肽以有限的功效用于猫皮屑的过敏原免疫治疗[32]。然而，过敏原带有多种多样的T细胞表位，这部分地取决于患者的HLA类型。举例来说，发现T细胞表位分散在整个Betv1序列中，除了短区域之外[33]。因此，有效的免疫治疗产品应当优选地含有过敏原的完整序列，而不是所选择的T细胞表位。

基于以下的证据，过敏原片段的使用仍是吸引人的：人类IgE主要识别可以通过将过敏原片段化而分离的非连续表位。Betv1的两个连续片段或Betv1的三聚体形式在人类I期研究中被测试并且显示出改善健康的倾向，但是在症状药物评分方面没有提供显著的改进[34]。然而，在该研究中，观测到许多不良事件，大部分在注射后数小时出现[35]。还在人类中对蜂毒的主要过敏原，即磷脂酶A2的三个片段进行测试，这些片段由于IgE的结合降低而显示出优良的安全性，而引起IgG4和IL-10的水平升高[36]。设计出一种方法来选择连续重叠肽(COP)以治疗过敏，所述连续重叠肽共同形成过敏原的整个氨基酸序列，从而提供所述过敏原的所有可能的T细胞表位，而具有降低的IgE结合(美国专利7,923,209)。这些所选择的片段表现出降低的重新形成过敏原的原始三级结构(如果有的话)的能力，从而使得结合IgE的能力以及因此在人类中引出过敏性反应的能力降低。

发明内容

根据一个方面，本发明提供了作为组合物的连续重叠肽(COP)以用于治疗室内尘螨过敏。确切地说，由室内尘螨的两种主要过敏原Derp1和Derp2的序列提供COP，所述COP包括这些过敏原的完整序列并且因此提供所有潜在的T细胞表位，但是缺乏原始过敏原的三维结构。

所述COP可以用于针对室内螨尘过敏的特异性免疫治疗的方法中并且可以向用Derp1或Derp2或这两种过敏原的混合物致敏的小鼠和其它哺乳动物施用而不会引起过敏性休克。更确切地说，本发明涉及一种能够在一段短的时间内几次施用之后减轻过敏症状的特异性免疫治疗(SIT)方法。这种治疗由反复地向患有室内尘螨过敏的人类施用特异性COP组成。可以通过全身途径、透皮途径、真皮内途径、皮下途径、或通过口服途径、或包括舌下途径和肠道途径在内的粘膜途径进行施用。与当前SIT的3年至5年相比，在一些实施方案中可以在两个月内反复施用五次。活性产品(COP)的施用量可以在摩尔量上达到与经过三年的SIT治疗所施用的Derp1和Derp2量等同的累积值。

确切地说，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含多个连续重叠肽片段(COP)，其中所述COP对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被显著降低或消除，而与来自室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。如本文所用的有关对IgE抗体的反应性被消除的陈述由免疫学领域的技术人员理解成这种反应性降低了三级或四级或更多级对数而达到如下的水平，在所述水平上它在临床上是不相关的或它不可通过普通的测量技术检出。所述COP组合包括Derp1的完整序列(Swiss-ProtP08176.2)和Derp2的完整序列(基因库AFJ68067.1)这两者，所述Derp1序列是通过添加以下各项而获得的：起始于氨基酸T99并且终止于G168的第一肽(SEQIDNO:8)、起始于氨基酸A164并且终止于S200的第二肽(SEQIDNO:12)、起始于氨基酸R193并且终止于E227的第三肽(SEQIDNO:13)、起始于氨基酸P220并且终止于R254的第四肽(SEQIDNO:14)、起始于氨基酸R249并且终止于D282的第五肽(SEQIDNO:15)、起始于氨基酸A278并且终止于L320的第六肽(SEQIDNO:11)，所述Derp2序列是通过添加以下各项而获得的：起始于氨基酸D1并且终止于E25的第一肽(SEQIDNO:18)、起始于氨基酸H22并且终止于K77的第二肽(SEQIDNO:19)、起始于氨基酸S57并且终止于D113的第三肽(SEQIDNO:24)、以及起始于氨基酸K109并且终止于D129的第四肽(SEQIDNO:25)。

虽然上述序列代表了用于重叠的最优选的肽，但是涵盖了那些第一至第六Derp1肽和第一至第四Derp2肽中的每一个的略微更短和略微更长的型式，它们各自相对于SEQIDNO:8、11-15、18、19、24以及25的优选肽被截短或延长了1-3个或1-5个或1-10个或1-15个氨基酸，以使得IgE反应性三维表位没有重新形成，并且以使得所述肽对于对Derp1和/或Derp2过敏的受试者的IgE抗体的反应性得以消除并且借此，产生彼此重叠一个或多个氨基酸的肽的组，从而维持与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性。截短或延长的COP在功能上将等同于SEQIDNO:8、11-15、18、19、24以及25的肽，前提条件是它们没有使得IgE结合恢复。作为本发明的一个方面，应当指出的是，在主要尘螨过敏原Derp1和Derp2中存在一定的序列变异性。因此，Derp2基因库序列AFJ68067.1的一个序列(SEQIDNO:28)与SwissProtP49278.1中的成熟蛋白质序列变体(SEQIDNO:29)相差四个氨基酸残基。具体参考SEQ28，所述序列通过在AA40处亲水性赖氨酸(L)被疏水性缬氨酸(V)取代、在AA47处亲核性苏氨酸(T)被亲核性丝氨酸(S)取代、在AA70处疏水性甲硫氨酸(M)被疏水性赖氨酸(L)取代以及在AA114处酸性残基天冬氨酸(D)被酰胺天冬酰胺(N)取代而改变。本领域技术人员将能够从不同过敏原同种型的序列中进行选择以及用具有类似特性的氨基酸残基进行取代以获得可用于实施本发明的特异性免疫治疗方法的肽。因此，本发明提供了COP，所述COP与SEQIDNO:8、11-15、18、19、24和25的肽以及沿SEQIDNO:26被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个、或1-15个氨基酸的SEQIDNO:8和11-15的肽以及沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸的SEQIDNO:18、19、24和25的肽具有70％、80％、85％、90％或95％序列同一性，并且其中这些肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

根据本发明的一个优选的方面，Derp1的第一肽和第二肽彼此重叠1至5个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第二肽和第三肽彼此重叠1至8个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第三肽和第四肽彼此重叠1至8个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第四肽和第五肽彼此重叠1至6个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第五肽和第六肽彼此重叠1至5个氨基酸。根据本发明的一个优选的方面，Derp2的第一肽和第二肽彼此重叠1至4个氨基酸。根据本发明的一个优选的方面，Derp2的第二肽和第三肽彼此重叠1至21个氨基酸。根据本发明的一个优选的方面，Derp2的第三肽和第四肽彼此重叠1至5个氨基酸。特别优选的组合物包含以下肽的组合：具有SEQIDNO:8的肽、具有SEQIDNO:12的肽、具有SEQIDNO:13的肽、具有SEQIDNO:14的肽、具有SEQIDNO:15的肽、具有SEQIDNO:11的肽、具有SEQIDNO:18的肽、具有SEQIDNO:19的肽、具有SEQIDNO:24的肽、以及具有SEQIDNO:25的肽。

优选的COP组合物包括如下的组合物，其中所述肽可溶于与施用途径相容的水性缓冲液中。具体来说，相对于AllerDM1.2，肽AllerDM1.5、AllerDM1.52、AllerDM1.53、AllerDM1.54以及AllerDM1.5a的组是优选的，这是因为它们可溶于水中。相对于AllerDM1.3和AllerDM1.72，AllerDM1.7是优选的，这是因为不需要极性非质子溶剂进行溶解。

这些肽可以通过包括化学合成或重组手段在内的多种方法中的任一种而获得。

本发明的COP和肽可以干粉形式提供，但是还可以与可接受的载体或稀释剂的组合形式提供。此外，所述组合物还可以包含佐剂，优选的佐剂是氢氧化铝。因而，所述组合物可以被表征为并且用作疫苗组合物。

本发明的COP和肽可以连同包括氯化胍的变性剂和/或离液剂一起被提供。这些药剂通过阻止溶液中三维结构的形成而起作用以有助于降低IgE结合。

还提供了针对室内尘螨过敏的特异性免疫治疗(SIT)方法，所述方法包括向有需要的患者施用一种或多种过敏原，所述过敏原选自由COP的组合组成的组，所述COP的组合包括Derp1的完整序列(Swiss-ProtP08176.2)和Derp2的完整序列(基因库AFJ68067.1)这两者，所述Derp1序列是通过添加以下各项而获得的：起始于氨基酸T99并且终止于G168的第一肽(SEQIDNO:8)、起始于氨基酸A164并且终止于S200的第二肽(SEQIDNO:12)、起始于氨基酸R193并且终止于E227的第三肽(SEQIDNO:13)、起始于氨基酸P220并且终止于R254的第四肽(SEQIDNO:14)、起始于氨基酸R249并且终止于D282的第五肽(SEQIDNO:15)、起始于氨基酸A278并且终止于L320的第六肽(SEQIDNO:11)，所述Derp2序列是通过添加以下各项而获得的：起始于氨基酸D1并且终止于E25的第一肽(SEQIDNO:18)、起始于氨基酸H22并且终止于K77的第二肽(SEQIDNO:19)、起始于氨基酸S57并且终止于D113的第三肽(SEQIDNO:24)、以及起始于氨基酸K109并且终止于D129的第四肽(SEQIDNO:25)。

可以实施这些方法，其中使用真皮内注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、透皮、鼻内、口服、舌下、眼内或鞘内技术来施用所述肽。

根据一种这样的方法，用COP的组合治疗患者，所述COP的组合包括Derp1的完整序列(Swiss-ProtP08176.2)和Derp2的完整序列(基因库AFJ68067.1)这两者，所述Derp1序列是通过添加以下各项而获得的：起始于氨基酸T99并且终止于G168的第一肽(SEQIDNO:8)、起始于氨基酸A164并且终止于S200的第二肽(SEQIDNO:12)、起始于氨基酸R193并且终止于E227的第三肽(SEQIDNO:13)、起始于氨基酸P220并且终止于R254的第四肽(SEQIDNO:14)、起始于氨基酸R249并且终止于D282的第五肽(SEQIDNO:15)、起始于氨基酸A278并且终止于L320的第六肽(SEQIDNO:11)，所述Derp2序列是通过添加以下各项而获得的：起始于氨基酸D1并且终止于E25的第一肽(SEQIDNO:18)、起始于氨基酸H22并且终止于K77的第二肽(SEQIDNO:19)、起始于氨基酸S57并且终止于D113的第三肽(SEQIDNO:24)、以及起始于氨基酸K109并且终止于D129的第四肽(SEQIDNO:25)。根据本发明的一个优选的方面，Derp1的第一肽和第二肽彼此重叠1至5个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第二肽和第三肽彼此重叠1至8个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第三肽和第四肽彼此重叠1至8个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第四肽和第五肽彼此重叠1至6个氨基酸。根据本发明的另一个优选的方面，Derp1的第五肽和第六肽彼此重叠1至5个氨基酸。根据本发明的一个优选的方面，Derp2的第一肽和第二肽彼此重叠1至4个氨基酸。根据本发明的一个优选的方面，Derp2的第二肽和第三肽彼此重叠1至21个氨基酸。根据本发明的一个优选的方面，Derp2的第三肽和第四肽彼此重叠1至5个氨基酸。特别优选的组合物包含以下肽的组合：具有SEQIDNO:8的肽、具有SEQIDNO:12的肽、具有SEQIDNO:13的肽、具有SEQIDNO:14的肽、具有SEQIDNO:15的肽、具有SEQIDNO:11的肽、具有SEQIDNO:18的肽、具有SEQIDNO:19的肽、具有SEQIDNO:24的肽、以及具有SEQIDNO:25的肽。

根据本发明的优选的方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含多个肽片段，所述肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-104至氨基酸157-177的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸154-174至氨基酸190-210的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸183-203至氨基酸217-237的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸210-230至氨基酸244-264的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第五肽，所述第五肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸239-259至氨基酸272-292的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第六肽，所述第六肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸268-288至氨基酸310-320的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

根据本发明的再另外的优选方面，提供了组合物，其中第一肽和第二肽彼此重叠1至5个氨基酸；第二肽和第三肽彼此重叠1至8个氨基酸；第三肽和第四肽彼此重叠1至8个氨基酸；第四肽和第五肽彼此重叠1至6个氨基酸；或第五肽和第六肽彼此重叠1至5个氨基酸。

根据本发明的另一个方面，提供了一种组合物，所述组合物包含多个肽片段，所述肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1-15至氨基酸15-35的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸12-32至氨基酸67-87的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸103-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-119至氨基酸119-129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

根据本发明的再另外的优选的方面，提供了组合物，其中第一肽和第二肽彼此重叠1至4个氨基酸；第二肽和第三肽彼此重叠1至21个氨基酸；或第三肽和第四肽彼此重叠1至5个氨基酸。

还提供了一种组合物，所述组合物包含：多个Derp1连续重叠肽片段，所述Derp1连续重叠肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-104至氨基酸157-177的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸154-174至氨基酸190-210的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第三肽，所述第三肽由SEQIDNO:27的氨基酸183-203至氨基酸217-237的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸210-230至氨基酸244-264的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第五肽，所述第五肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸239-259至氨基酸272-292的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第六肽，所述第六肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸268-288至氨基酸310-320的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及多个Derp2连续重叠肽片段，所述Derp2连续重叠肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由SEQIDNO:28的氨基酸1-15至氨基酸15-35的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸12-32至氨基酸67-87的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸103-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-119至氨基酸119-129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

根据一种方法，用以下各项的组合治疗需要针对尘螨过敏的特异性免疫治疗的患者：一种或多种Derp1连续重叠肽，所述Derp1连续重叠肽包括：与(SEQIDNO:8)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸T99并且终止于G168的第一肽、与(SEQIDNO:12)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸A164并且终止于S200的第二肽、与(SEQIDNO:13)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸R193并且终止于E227的第三肽、与(SEQIDNO:14)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸P220并且终止于R254的第四肽、与(SEQIDNO:15)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸R249并且终止于D282的第五肽、起始于氨基酸A278并且终止于L320的第六肽(SEQIDNO:11)，所述第一肽至第六肽任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸；以及多种Derp2连续重叠肽，所述Derp2连续重叠肽包括：与(SEQIDNO:18)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸D1并且终止于E25的第一肽、与(SEQIDNO:19)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸H22并且终止于K77的第二肽、与(SEQIDNO:24)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸S57并且终止于D113的第三肽、以及与(SEQIDNO:25)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸K109并且终止于D129的第四肽，所述第一肽至第四肽任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。根据本发明的优选的方面，第一肽和第二肽彼此重叠1至5个氨基酸；第一肽和第二肽彼此重叠1至11个氨基酸；第二肽和第三肽彼此重叠1至8个氨基酸；第三肽和第四肽彼此重叠1至8个氨基酸；第四肽和第五肽彼此重叠1至6个氨基酸；第五肽和第六肽彼此重叠1至5个氨基酸；第七肽和第八肽彼此重叠1至4个氨基酸；第八肽和第九肽彼此重叠1至21个氨基酸；和/或第九肽和第十肽彼此重叠1至5个氨基酸。根据本发明的一个方面，用所述过敏原中的至少五种或六种或七种或八种或九种或十种治疗有需要的患者。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:8)具有90％或95％序列同一性的多肽的氨基酸T99至G168的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:8的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:12)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸A164开始并且终止于S200的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:12的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:13)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸R193开始并且终止于E227的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:13的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:14)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸P220开始并且终止于R254的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:14的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:15)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸R249开始并且终止于D282的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:15的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:11)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸A278开始并且终止于L320的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:11的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:18)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸D1开始并且终止于E25的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:18的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:19)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸H22开始并且终止于K77的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:19的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:24)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸S57开始并且终止于D113的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:24的序列组成的序列。

根据本发明的优选的肽包括如下的肽，所述肽包含与(SEQIDNO:25)具有90％或95％序列同一性的多肽的从氨基酸K109开始并且终止于D129的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留，其中特别优选的肽具有由SEQIDNO:25的序列组成的序列。

本发明还提供了一种针对室内尘螨过敏的特异性免疫治疗的方法，所述方法包括向有需要的患者施用选自由以下各项组成的组的一种或多种过敏原：第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-104至氨基酸157-177的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸154-174至氨基酸190-210的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸183-203至氨基酸217-237的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸210-230至氨基酸244-264的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第五肽，所述第五肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸239-259至氨基酸272-292的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第六肽，所述第六肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸268-288至氨基酸310-320的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第七多肽，所述第七多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1-15至氨基酸15-35的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第八肽，所述第八肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸12-32至氨基酸67-87的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第九肽，所述第九肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸93-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及第十肽，所述第十肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-119至氨基酸119-129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

还提供了一种用于进行特异性免疫治疗的组合物，所述组合物包含多个连续重叠肽片段，所述片段共同构成与Derp2(SEQIDNO:28)具有90％序列同一性的多肽的整个氨基酸序列，包括第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1至氨基酸30-82的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸12-32至氨基酸67-87的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸103-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸89-109至氨基酸129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

还提供了一种用于进行特异性免疫治疗的组合物，所述组合物包含多个连续重叠肽片段，所述片段共同构成与Derp2(SEQIDNO:28)具有90％序列同一性的多肽的整个氨基酸序列，包括第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1至氨基酸62-82的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸103-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸89-119至氨基酸129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。特别优选的是如下的组合物，其中起始于氨基酸S57并且终止于D113的第二肽(SEQIDNO:24)既没有被延长，也没有被截短。

还提供了一种用于进行特异性免疫治疗的组合物，所述组合物包含多个Derp2连续重叠肽片段，所述肽片段包括：(SEQIDNO:16)的起始于氨基酸D1并且终止于A72的第一肽、起始于氨基酸S57并且终止于D113的第二肽(SEQIDNO:24)、以及选自由以下各项组成的组的第三肽：(SEQIDNO:28)的起始于氨基酸K89并且终止于D129的肽或起始于氨基酸K109并且终止于D129的肽(SEQIDNO:25)，其中所述肽任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，并且其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。特别优选的是如下的组合物，其中起始于氨基酸S57并且终止于D113的第二肽(SEQIDNO:24)既没有被延长，也没有被截短。

本发明的组合物可以呈干粉形式，并且还可以包含药学上可接受的载体或稀释剂和/或佐剂，其中氢氧化铝是特别优选的佐剂。

可以在针对室内尘螨过敏的特异性免疫治疗的方法中施用所述肽、肽的组合以及包含其的组合物，所述方法包括使用真皮内注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、透皮、鼻内、口服、舌下、眼内或鞘内技术向有需要的患者施用一种或多种过敏原。

根据本发明的一个方面，已经发现通过施用本发明的单独的并且重叠的肽进行特异性免疫治疗可以通过在变性剂或离液剂存在下共同施用所述肽来促进，其中氯化胍是特别优选的药剂。

附图说明

图1描绘了与Derp1相比，所选择的COP与来自两种血清(实线和虚线)的IgE的竞争性结合。图A：Derp1(实心符号)相比于单个肽AllerDM1.1、AllerDM1.2以及AllerDM1.3(空心符号)。图B：Derp1(实心符号)相比于单个肽AllerDM1.4、AllerDM1.5和AllerDM1.6以及AllerDM1.7(空心符号)。图C：Derp1(实心符号)相比于单个肽AllerDM1.52、AllerDM1.53以及AllerDM1.5a。图D：Derp1(实心符号)相比于单个肽AllerDM1.62、AllerDM1.63以及AllerDM1.64。

图2描绘了Derp2和所选择的COP诱导与两种不同的人类血清一起预孵育的“人源化”RBL细胞(从德国兰根的保罗-埃尔利希研究所(Paul-Ehrlich-Institute,Langen,Germany)的Vogel博士(Dr.Vogel)那里获得)的脱颗粒的能力。图A：Derp2(实心符号)相比于Derp2_组A(空心符号)。图B：Derp2(实心符号)相比于Derp2_组B(空心符号)。图C：Derp2(实心符号)相比于单个肽AllerDM2.3、AllerDM2.4以及AllerDM2.5。

图3描绘了在竞争ELISA中由使用氯化胍所引起的IgE结合减少。图A：在与1M氯化胍一起预孵育30分钟(标记G)或没有进行预孵育的情况下对Derp1、AllerDM1.52以及AllerDM1.62进行测试。图B：在与1M氯化胍一起预孵育30分钟或没有进行预孵育的情况下对Derp2和AllerDM2.2进行测试。

图4描绘了由10种COP的等摩尔混合物构成的所选择的产品AllerDM缺乏IgE结合。在竞争ELISA中测试来自欧洲和美国的HDM过敏受试者的21种血清。图A：对于Derp1反应性，与Derp1(实心符号)的竞争相比于与AllerDM(空心符号)的竞争。图B：对于Derp2反应性，与Derp2(实心符号)的竞争相比于与AllerDM(空心符号)的竞争。

图5描绘了由10种COP的等摩尔混合物构成的所选择的产品AllerDM不能诱导被加载了来自HDM过敏患者的18种血清的RBL细胞的脱颗粒。图A：Derp1(实心符号)诱导的脱颗粒相比于AllerDM(空心符号)诱导的脱颗粒。图B：Derp2(实心符号)诱导的脱颗粒相比于AllerDM(空心符号)诱导的脱颗粒。

图6描绘了通过反复皮下注射重组Derp1和Derp2过敏原的混合物而致敏的Balb/c小鼠的过敏反应。在低剂量的过敏原的第三次注射之后的7天时，使用单次大剂量的过敏原对小鼠进行激发。示出了在使用AllerDM(实心圆圈)、媒介物(PBS，空心圆圈)或Derp1/Derp2混合物(实心正方形)激发之后，一组十只小鼠的体温的平均值和标准差。

图7描绘了AllerDM相较于Derp1/Derp2注射在弗氏佐剂(Freund'sadjuvant)存在下在Balb/c小鼠中的免疫原性(图A)。AllerDM能够将分别识别过敏原Derp1和Derp2的特异性IgG诱导到与使用对应的原始过敏原进行免疫接种相当的水平。AllerDM1.42、AllerDM2.4以及AllerDM2.10在最大程度上促成AllerDM免疫原性，而单个小鼠确实对AllerDM中存在的除AllerDM2.9以外的其它COP有反应(图B)。

具体实施方式

在下文以实施例的方式，参考以下实验程序和结果来描述本发明。

材料和方法

过敏原

纯化的天然Derp1(NA-DP1-2)和天然Derp2(NA-DP2-2)是从英国的英导生物技术有限公司(IndoorBiotechnologiesLtd,UK)获得的。

肽的选择和合成

目的在于阻止B细胞表位的稳定三级结构的形成，而提呈下文以下文所示的SEQIDNO:27(Derp1)Swiss-Prot序列P08176.2和SEQIDNO:28(Derp2)基因库序列AFJ68067.1所呈现的Derp1和Derp2蛋白质序列内所存在的所有T细胞表位。应当指出的是，Derp2以多种同种型的形式存在，所述同种型具有先前专利申请WO2004-081028(A2)中所述的SwissProtP49278.1(SEQIDNO:29)，该专利申请的公开内容以引用的方式并入本文。基因库序列AFJ68067.1与成熟蛋白质(没有信号肽)SwissProtP49278.1序列之间存在四处氨基酸差异。所述序列与SwissProtP49278.1序列的不同之处还在于是更短的，这是因为单个肽从它的N末端被切除。

SEQIDNO:27

Derp1序列

MKIVLAIASLLALSAVYARPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL

SEQIDNO:28

Derp2序列(基因库序列AFJ68067.1)

DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEALFEANQNSKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVLGDNGVLACAIATHAKIRD

SEQIDNO:29

Derp2序列(SwissProt序列P49278.1)

MMYKILCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD

因此，选择以下沿Derp1序列和Derp2序列重叠的COP，即：

SEQIDNO:1

AllerDM1.1(81个氨基酸)

TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIE

SEQIDNO:2

ALLERDM1.2(86个氨基酸)

SQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRH

SEQIDNO:3

ALLERDM1.3(86个氨基酸)

AIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL

SEQIDNO:4

ALLERDM1.4(66个氨基酸)

TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCA

SEQIDNO:5

ALLERDM1.5(73个氨基酸)

LAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIRE

SEQIDNO:6

ALLERDM1.6(73个氨基酸)

PNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDT

SEQIDNO:7

ALLERDM1.7(40个氨基酸)

VDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL

SEQIDNO:8

ALLERDM1.42(70个氨基酸)

TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHG

SEQIDNO:9

ALLERDM1.52(64个氨基酸)

ASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIRE

SEQIDNO:10

ALLERDM1.62(63个氨基酸)

PNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVD

SEQIDNO:11

ALLERDM1.72(43个氨基酸)

AQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL

SEQIDNO:12

ALLERDM1.53(37个氨基酸)

ASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQS

SEQIDNO:13

AllerDM1.54(35个氨基酸)

RYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIRE

SEQIDNO:14

AllerDM1.63(35个氨基酸)

PNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGR

SEQIDNO:15

AllerDM1.64(34个氨基酸)

RHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVD

SEQIDNO:16

ALLERDM2.1(72个氨基酸)

DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNA

SEQIDNO:17

ALLERDM2.2(73个氨基酸)

SIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD

SEQIDNO:18

ALLERDM2.3(25个氨基酸)

DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSE

SEQIDNO:19

ALLERDM2.4(56个氨基酸)

HGSEPCIIHRGKPFQLEALFEANQNSKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMK

SEQIDNO:20

ALLERDM2.5(56个氨基酸)

HYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVLGDNGVLACAIATHAKIRD

SEQIDNO:21

ALLERDM2.6(31个氨基酸)

DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHR

SEQIDNO:22

ALLERDM2.7(75个氨基酸)

SEPCIIHRGKPFQLEALFEANQNSKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIA

SEQIDNO:23

ALLERDM2.8(41个氨基酸)

KYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVLGDNGVLACAIATHAKIRD

SEQIDNO:24

ALLERDM2.10(57个氨基酸)

SIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVLGD

SEQIDNO:25

ALLERDM2.9(21个氨基酸)

KVLGDNGVLACAIATHAKIRD

SEQIDNO:26

ALLERDM1.5a(32个氨基酸)

AREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIRE

所有COP均是通过在研究规模上进行固相fmoc化学法而合成的以允许测定IgE结合。使用制备型HPLC获得超过90％纯的肽，将所述肽冻干。将肽以2mg/ml重悬在水中或以每毫升10mg至20mg重悬在DMSO中(参见表1)并且以等分部分冷冻。

竞争ELISA

将1.0μg/ml的纯化的Derp1或Derp2在96孔Nunc免疫板(瑞士沃伦的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientificInc.,Wohlen,Switzerland))上涂布过夜。在用1％BSA封闭之后，添加患者血清的二十倍、三十倍或四十倍至200倍稀释液，这取决于特异性IgE的含量。然后添加5μg/ml的生物素小鼠抗人类mAbIgE(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司(BioLegend,SanDiego,CA))，并且使用链霉亲和素HRP(加利福尼亚州圣地亚哥的碧迪生物科技公司(BD-Biosciences,SanDiego,CA))和底物TMB使抗体显现。过敏患者的血清是从美国和欧洲(分别是美国华盛顿州埃弗雷特的PlasmaLab国际公司(PlasmaLabInternational,Everett,WA,USA)和法国里昂的Biomnis公司(Biomnis,Lyon,France))获得，针对屋尘螨阳性CAP和明显的高于背景的信号来选择的并且被用于测试与所述肽的竞争。将在10^-5M至10^-10M范围内的浓度的每一组的COP，即对于Derp1，组A、组B、组C或组D以及对于Derp2，混合物D、E或F的连续稀释液与所选择的血清一起在冰上预孵育15分钟。然后将血清在涂有nDerp1或nDerp2的96孔板上孵育并且如上文所述测定残留的IgE结合。nDerp1和nDerp2稀释液用作抑制作用的对照。

RBL脱颗粒

如[37]中所述进行脱颗粒测定。将用人类FcεRI受体转染的RBL-703/21细胞接种在96孔组织培养板(105个细胞/孔)中过夜。将RBL-703/21细胞用来自患有室内尘螨过敏的患者的血清以1:20进行被动致敏过夜。第二天，通过将细胞层在汉克斯平衡盐溶液(Hanks'balancedsaltsolution)(Gibco，生命技术公司(Lifetechnologies))中洗涤两次以去除未结合的抗体。在37℃通过添加在台氏缓冲液(130mMNaCl、5mMKCl、1.4mMCaCl₂、1mMMgCl₂、5.6mM葡萄糖、10mMHEPES(pH7.4)、0.1％BSA)中稀释的所示浓度的nDerp1、nDerp2或单个COP以及混合物将RBL细胞的脱颗粒诱导1小时。通过在37℃将30μl的细胞上清液与50μl的于柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH4.5)中1.3mg/ml的4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(西格玛公司(Sigma))一起孵育1小时来分析β-氨基己糖苷酶活性。通过添加100μl甘氨酸缓冲液(0.2M甘氨酸、0.2MNaCl，pH10.7)停止反应并且在405nm测量光密度(OD)。

小鼠的过敏反应

通过以14天的时间间隔进行3次皮下注射来反复注射低剂量(1μg)的等摩尔Derp1和Derp2的过敏原混合物以使Balb/c小鼠致敏。在最后一次注射后的7天时，使用高剂量的Derp1和Derp2的混合物(每只动物30μg)或AllerDMCOP(每只动物30μg)激发小鼠。使用改编自Sade等,JInvestigAllergolClinImmunol；17(6):379-385(2007)的6级(0级无症状到5级死亡)量表对过敏症状进行评分。在激发之后，使用数字式温度计以15分钟的时间间隔监测直肠温度，持续60分钟。使用PBS作为激发产生的对照。

AllerDM的免疫原性

对Balb/c小鼠腹膜内注射Derp1、Derp2过敏原以及单个AllerDMCOP。将过敏原和肽连同完全弗氏佐剂一起给予。以一个月的时间间隔用不完全弗氏佐剂反复注射两次。在最后一次注射后的15天时从眼眶后窦采集血液并且通过标准方法制备血清。结果被表示为μg/ml的特异性IgG。

实验结果

肽的选择

Derp1

为了针对具有降低的IgE结合的产品进行选择，设计了四组长(30-90个氨基酸)连续重叠肽(COP)，所述连续重叠肽涵盖了整个Derp1过敏原(Swiss-ProtP08176.2)，因此提供了所有可能的T细胞表位。三种COP的第一组，即由AllerDM1.1、AllerDM1.2以及AllerDM1.3(分别是SEQID1、SEQID2以及SEQID3)构成的Derp1_组A已经是提出的保藏物“过敏原肽片段和其用途(Allergenpeptidefragmentsandusethereof)”WO2004-081028(A2)。合成Derp1_组A的COP，纯化并且使用竞争ELISA测定IgE结合。使用来自对室内尘螨过敏的患者的不同血清对AllerDM1.2和AllerDM1.3观测到残留IgE结合，但是对AllerDM1.1则没有观测到。

在将来自文献的潜在IgE结合区考虑在内的情况下，设计了第二组(Derp1_组B)，并且通过竞争ELISA测试IgE结合。Derp1_组B，即AllerDM1.4、AllerDM1.5、AllerDM1.6、AllerDM1.7(分别是SEQID4、5、6以及7)的混合物显示出残留IgE反应性。a.当使用单个肽时，AllerDM1.4和AllerDM1.7没有显示出可检测的IgE结合，而发现AllerDM1.5和AllerDM1.6是先前使用AllerDM1.2和AllerDM1.3或完整Derp1_组B所观测到的反应性的原因。

AllerDM1.5包括两个半胱氨酸，这两个半胱氨酸可能重新形成二硫桥并且重新形成IgE表位。因此，去除C末端半胱氨酸，从而产生AllerDM1.52(SEQID9)，令人遗憾的是，它仍结合IgE。对于AllerDM1.6，缩短C末端部分对IgE结合也没有影响(AllerDM1.62，SEQID10)。由于AllerDM1.52的N末端和AllerDM1.62的C末端经过修饰，因此不得不设计AllerDM1.4和AllerDM1.7的替代性肽以提供足够的重叠而确保可能的T细胞末端表位的存在。AllerDM1.42和AllerDM1.72接受重叠区中的4个和3个额外的氨基酸(分别是SEQID8和11)。因此舍弃包括显示出残留IgE结合的AllerDM1.52和AllerDM1.62的候选Derp1_组C。

在对Derp1和到目前为止所合成的肽的三维结构进行建模后，制备了另一组，即Derp1_组D，其中IgE结合肽AllerDM1.52和AllerDM1.62中的每一种被进一步分开。AllerDM1.52被分成两种肽，即AllerDM1.53和AllerDM1.5a(分别是SEQID12和26)并且AllerDM1.62被分成AllerDM1.63和AllerDM1.64(SEQID14和15)(图1)。这些肽最终没有显示出任何可检测的IgE结合，这表明已经去除了所有可能的IgE表位。由于1.53和1.5a仅重叠5个氨基酸，因此合成了重叠8个氨基酸的延长型式AllerDM1.54(SEQID13)并且该型式显示出与AllerDM1.5a相同的IgE非结合特性。这个发现表明将COP末端改变3个氨基酸对IgE结合力没有影响。就当前的知识来说，必须将AllerDM1.62分成两段是意想不到的，这是因为区域R248至R254先前并没有被保留为潜在结合IgE(参见本发明的背景技术)。由Derp1产生而没有可检测的IgE结合的最终一组COP包括六种肽，即AllerDM1.42、AllerDM1.53、AllerDM1.54、AllerDM1.63、AllerDM1.64以及AllerDM1.72(分别是SEQID8、12、13、14、15以及11)。

Derp2

第一组的COP源自于先前的专利申请WO2004-081028(A2)(Derp2同种型P49278.1)(SEQID29)并且含有具有相等长度的两种肽AllerDM2.1和AllerDM2.2(SEQID16和17)。这组COP(Derp2_组A)在竞争ELISA中显示出低的，但是可检测的IgE结合，并且发现AllerDM2.2在直接ELISA中结合IgE。设计了由AllerDM2.3、AllerDM2.4以及AllerDM2.5(SEQID18、19以及20)构成的Derp2_组B以阻止产生两个短环的二硫桥，这两个短环已知在维持Derp2的三维结构中起作用。同时，合成了替代组(Derp2_组C)，其中二硫桥被保留，即AllerDM2.6、AllerDM2.7以及AllerDM2.8(SEQID21、22以及23)。组B和组C这两组在竞争ELISA中显示出残留IgE结合。在组B中，IgE结合被限制在AllerDM2.5，如通过直接ELISA和竞争ELISA这两者所确认。IgE与来自组C的单个COP的结合被证明是多样的。覆盖了Derp2的中心部分的AllerDM2.7在竞争ELISA中显示出残留IgE结合，而发现AllerDM2.8(Derp2的C末端部分)非特异性地结合IgE，即来自过敏供体和非过敏供体的血清的IgE。此外，Derp2_组C在RBL脱颗粒测定中引起弱的，但是可检测的反应，并且因此从进一步的AllerDM研发中被舍弃。

惊人的是，Derp2_组B(AllerDM2.3、AllerDM2.4以及AllerDM2.5)能够在RBL测定中诱导嗜碱性粒细胞脱颗粒，而Derp2_组A(AllerDM2.1和AllerDM2.2)则没有(图2)。此外，AllerDM2.4和AllerDM2.5的组合引起脱颗粒，而每一种单个肽则没有(图2，图C)。当将AllerDM2.1与AllerDM2.5组合时，观测到相同的现象。由于AllerDM2.1和AllerDM2.4在竞争性ELISA中被单独测试时没有结合IgE，并且由于除了触发脱颗粒之外还需要两个IgE表位，因此这些结果提出了如下的可能：这两种肽AllerDM2.4和AllerDM2.5之间的某种相互作用在溶液中发生，从而使得过敏原的原始三维结构部分重构，因此重新形成第二IgE表位。

鉴于上述结果，对Derp2晶体结构进行分析，得出以下提议：AllerDM2.4和AllerDM2.5可能由于反向平行β折叠的存在而在溶液中部分地重新折叠并且组合以重新形成第二IgE结合位点。由于组合AllerDM2.2与AllerDM2.1或AllerDM2.4的组合没有诱导脱颗粒，因此在下一组COP中的AllerDM2.5的N末端处添加S57至C73，从而产生AllerDM2.10(SEQID24)。为了进一步降低IgE结合潜能，将AllerDM2.10在它的C末端处修剪到D113。为了与AllerDM2.10维持最少的重叠(5个氨基酸)，必须从K109开始合成AllerDM2.9(SEQID25)，以包括完整的Derp2序列。Derp2_组D(AllerDM2.3、AllerDM2.4、AllerDM2.10以及AllerDM2.9)和它的单个组分在竞争ELISA中没有显示出残留IgE结合并且不再能够触发嗜碱性粒细胞脱颗粒。由Derp2产生的最终一组COP因此包括四种肽，即AllerDM2.3、AllerDM2.4、AllerDM2.10以及AllerDM2.9(分别是SEQID18、19、24以及25)。

另一发现表明IgE结合和嗜碱性粒细胞脱颗粒与原始三维结构在溶液中的部分重构有关，这起源于变性盐的使用。添加包括氯化胍或脲的变性盐强烈地减少了IgE与AllerDM1.52、AllerDM1.62以及AllerDM2.2的结合(图3)。这表明了减小在注射过敏原片段后潜在的速发型过敏反应的产品制剂的一种替代方案。

AllerDM

为了进一步验证不存在IgE结合，在竞争ELISA和RBL脱颗粒测试中使用源自于Derp1和Derp2这两者的十种肽的最终混合物，该混合物现在被称作AllerDM，即由AllerDM1.42、AllerDM1.53、AllerDM1.54、AllerDM1.63、AllerDM1.64以及AllerDM1.72(分别是SEQID8、12、13、14、15以及11)与AllerDM2.3、AllerDM2.4、AllerDM2.10以及AllerDM2.9(分别是SEQID18、19、24以及25)的组合构成。如图4中所示，AllerDM在一组来自欧洲和美国这两者的对室内尘螨过敏的患者的21种血清存在下一直到10^-5M的浓度为止没有显示出可检测的反应性。使用Derp1或Derp2天然过敏原的对照在10^-7M至10^-9M范围内显示出预期的竞争。减少的IgE结合允许考虑在人类中施用与传统的SIT治疗相比更高剂量的COP。

发现用人类Fcε受体I转染的RBL细胞在过敏原存在下结合人类IgE并且脱颗粒[37]。AllerDM再次一直到10^-5M为止不能在用对室内尘螨过敏的患者的一组18种不同的人类血清预加载RBL细胞时触发嗜碱性粒细胞脱颗粒(图5A和B)。相反，Derp1和Derp2能够与相同的血清组合诱导脱颗粒。不存在嗜碱性粒细胞的脱颗粒表明了在人类中施用后速发型过敏反应的风险潜在地降低。

从这些实验，可以得出的结论是由十种COP构成的被称作AllerDM的优选的产品将含有源自于Derp1和Derp2蛋白质这两者的可溶性肽的组合。所述优选的产品候选者将由以下各项构成：SEQID:8、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:11、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:24以及SEQIDNO:25。

本发明的另一改进之处包括将COP分成具有改进的纯化和溶解特性的部分。还涵盖了COPAllerDM1.42至1.72和AllerDM2.3至2.10的同源物，所述同源物是通过使每一种肽内氨基酸发生变化以产生其同源物而获得的，其中所述同源物对于对HDM过敏的患者的IgE抗体的反应性被消除，而与T淋巴细胞的反应性仍被保留。还涵盖了COP的如下同源物，所述同源物是通过变换室内尘螨过敏原Derp1和Derp2内COP的界限而获得的。这些同源物将产生具有不可检测的IgE结合和T淋巴细胞活性的等同特征的产品。这些产品将在人类中提供与AllerDM相同的安全性和功效潜能并且除非另有说明，否则在用于治疗的可能性方面可以被认为是等同的。特征在于对抗室内尘螨IgE抗体没有反应性，而维持对T淋巴细胞的反应性的合适的同源物可以通过本文所述的方法来鉴定。

表I：COP的溶解特征

致敏和激发

通过反复皮下注射Derp1和Derp2过敏原的混合物(1μg/ml)来使Balb/c小鼠致敏。在最后一次注射之后的7天时，使用单次大剂量的过敏原(30μg/ml的Derp1和Derp2)或AllerDM(30μg/ml)激发小鼠。小鼠的过敏性休克与体温下降有关。对照和AllerDM激发基本上没有引起温度下降，而混合物Derp1/Derp2诱导直肠温度明显的下降(图6)。这些结果证实AllerDM与它的亲本过敏原的不同之处在于缺乏激发活性，这表明AllerDM不会触发Derp1/Derp2致敏的小鼠的过敏性休克。

免疫接种

向Balb/c小鼠注射AllerDM和Derp1/Derp2以及弗氏佐剂。在腹膜内注射之后测量IgG水平(图7)。由AllerDM混合物产生的IgG在与原始过敏原本身差不多相同的程度上识别天然Derp1和Derp2(图7，图A)。在独立的实验中，在来自接受AllerDM免疫接种的小鼠的血清中检测到针对每一种单个COP的IgG的存在(图7，图B)，这证实每一种COP均可以促成总体免疫原性，尽管程度不同。

本发明中的变化方案

还涵盖了AllerDM1.42至DM2.10COP的同源物，所述同源物是通过使每一种肽内氨基酸发生变化以产生其同源物而获得的，其中所述同源物对于对室内尘螨过敏原过敏的患者的IgE抗体的反应性被消除，而与T淋巴细胞的反应性仍被保留。还涵盖了COP的如下同源物，所述同源物是通过变换室内尘螨过敏原Derp1和Derp2内COP的界限而获得的。这些同源物将产生具有不可检测的IgE结合和T淋巴细胞活性的等同特征的产品。这些产品将在人类中提供与AllerDM相同的安全性和功效潜能并且除非另有说明，否则在用于治疗的可能性方面可以被认为是等同的。特征在于对抗室内尘螨IgE抗体没有反应性，而维持对T淋巴细胞的反应性的合适的同源物可以通过本文所述的方法来鉴定。还涵盖了具有降低或消除的IgE反应性而保留T淋巴细胞反应性，但是还具有可溶性和/或显示出改进的合成和纯化的COP的组。

在实施本发明中许多改动方案和变化方案预期在考虑本发明的优选的实施方案后被本领域技术人员想到。因此，应当对本发明的范围所施加的限制条件仅仅是所附权利要求书中出现的那些限制条件。

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Claims

1.一种组合物，所述组合物包含多个肽片段，所述肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-104至氨基酸157-177的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸154-174至氨基酸190-210的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸183-203至氨基酸217-237的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸210-230至氨基酸244-264的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第五肽，所述第五肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸239-259至氨基酸272-292的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及

第六肽，所述第六肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸268-288至氨基酸310-320的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一肽和所述第二肽彼此重叠1至5个氨基酸。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述第二肽和所述第三肽彼此重叠1至8个氨基酸。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述第三肽和所述第四肽彼此重叠1至8个氨基酸。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述第四肽和所述第五肽彼此重叠1至6个氨基酸。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述第五肽和所述第六肽彼此重叠1至5个氨基酸。

7.一种组合物，所述组合物包含多个肽片段，所述肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1-15至氨基酸15-35的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸12-32至氨基酸67-87的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸103-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及

第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-119至氨基酸119-129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述第一肽和所述第二肽彼此重叠1至4个氨基酸。

9.如权利要求7所述的组合物，其中所述第二肽和所述第三肽彼此重叠1至21个氨基酸。

10.如权利要求7所述的组合物，其中所述第三肽和所述第四肽彼此重叠1至5个氨基酸。

11.一种组合物，所述组合物包含多个Derp1连续重叠肽片段，所述肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-104至氨基酸157-177的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第三肽，所述第三肽由SEQIDNO:27的氨基酸183-203至氨基酸217-237的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第五肽，所述第五肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸239-259至氨基酸272-292的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第六肽，所述第六肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸268-288至氨基酸310-320的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

以及多个Derp2连续重叠肽片段，所述肽片段包括：第一多肽，所述第一多肽由SEQIDNO:28的氨基酸1-15至氨基酸15-35的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸103-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

12.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:8)具有90％序列同一性的多肽的氨基酸T99至G168的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

13.如权利要求12所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:8的序列组成的序列。

14.一种肽，所述肽与如权利要求12所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

15.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:12)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸A164开始并且终止于S200的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

16.如权利要求15所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:12的序列组成的序列。

17.一种肽，所述肽与如权利要求15所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

18.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:13)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸R193开始并且终止于E227的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

19.如权利要求18所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:13的序列组成的序列。

20.一种肽，所述肽与如权利要求18所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

21.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:14)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸P220开始并且终止于R254的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

22.如权利要求21所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:14的序列组成的序列。

23.一种肽，所述肽与如权利要求21所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

24.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:15)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸R249开始并且终止于D282的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

25.如权利要求24所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:15的序列组成的序列。

26.一种肽，所述肽与如权利要求24所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

27.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:11)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸A278开始并且终止于L320的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

28.如权利要求27所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:11的序列组成的序列。

29.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:18)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸D1开始并且终止于E25的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

30.如权利要求29所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:18的序列组成的序列。

31.一种肽，所述肽与如权利要求29所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

32.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:19)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸H22开始并且终止于K77的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

33.如权利要求32所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:19的序列组成的序列。

34.一种肽，所述肽与如权利要求32所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

35.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:24)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸S57开始并且终止于D113的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

36.如权利要求35所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:24的序列组成的序列。

37.一种肽，所述肽与如权利要求35所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

38.一种肽，所述肽包含与(SEQIDNO:25)具有90％序列同一性的多肽的从氨基酸K109开始并且终止于D129的序列，所述序列任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

39.如权利要求38所述的肽，所述肽具有由SEQIDNO:25的序列组成的序列。

40.一种肽，所述肽与如权利要求38所述的肽具有95％序列同一性，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

41.一种针对室内尘螨过敏的特异性免疫治疗的方法，所述方法包括向有需要的患者施用选自由以下各项组成的组的一种或多种过敏原：

第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:27具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-104至氨基酸157-177的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第七多肽，所述第七多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1-15至氨基酸15-35的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第八肽，所述第八肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸12-32至氨基酸67-87的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第九肽，所述第九肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸93-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及

第十肽，所述第十肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸99-119至氨基酸119-129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

42.如权利要求41所述的方法，其中使用真皮内注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、透皮、鼻内、口服、舌下、眼内或鞘内技术来施用所述肽。

43.如权利要求41所述的方法，其中用以下各项的组合来治疗所述患者：多种Derp1连续重叠肽，所述Derp1连续重叠肽包括：与(SEQIDNO:8)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸T99并且终止于G168的第一肽、与(SEQIDNO:12)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸A164并且终止于S200的第二肽、与(SEQIDNO:13)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸R193并且终止于E227的第三肽、与(SEQIDNO:14)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸P220并且终止于R254的第四肽、与(SEQIDNO:15)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸R249并且终止于D282的第五肽、起始于氨基酸A278并且终止于L320的第六肽(SEQIDNO:11)，所述第一肽至第六肽任选地沿SEQIDNO:27被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸；以及多种Derp2连续重叠肽，所述Derp2连续重叠肽包括：与(SEQIDNO:18)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸D1并且终止于E25的第一肽、与(SEQIDNO:19)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸H22并且终止于K77的第二肽、与(SEQIDNO:24)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸S57并且终止于D113的第三肽、以及与(SEQIDNO:25)具有90％序列同一性的多肽的起始于氨基酸K109并且终止于D129的第四肽，所述第一肽至第四肽任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

44.如权利要求41所述的方法，其中所述第一肽和所述第二肽彼此重叠1至5个氨基酸。

45.如权利要求41所述的方法，其中所述第二肽和所述第三肽彼此重叠1至8个氨基酸。

46.如权利要求41所述的方法，其中所述第三肽和所述第四肽彼此重叠1至8个氨基酸。

47.如权利要求41所述的方法，其中所述第四肽和所述第五肽彼此重叠1至6个氨基酸。

48.如权利要求41所述的方法，其中所述第五肽和所述第六肽彼此重叠1至5个氨基酸。

49.如权利要求41所述的方法，其中所述第七肽和所述第八肽彼此重叠1至4个氨基酸。

50.如权利要求41所述的方法，其中所述第八肽和所述第九肽彼此重叠1至21个氨基酸。

51.如权利要求41所述的方法，其中所述第九肽和所述第十肽彼此重叠1至4个氨基酸。

52.如权利要求41所述的方法，其中用所述过敏原中的至少五种或六种或七种或八种或九种或十种治疗所述有需要的患者。

53.如权利要求41所述的方法，其中在变性剂或离液剂存在下施用所述肽。

54.如权利要求41所述的方法，其中所述离液剂是氯化胍

55.如权利要求41所述的方法，其中所述过敏原是以干粉形式提供的。

56.如权利要求41所述的方法，其中所述过敏原还包含药学上可接受的载体或稀释剂。

57.如权利要求41所述的方法，其中所述过敏原还包含佐剂。

58.如权利要求41所述的方法，其中所述佐剂是氢氧化铝。

59.一种组合物，所述组合物包含多个连续重叠肽片段，所述片段共同构成与Derp2(SEQIDNO:28)具有90％序列同一性的多肽的整个氨基酸序列，包括第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1至氨基酸30-82的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第四肽，所述第四肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸89-109至氨基酸129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

60.一种组合物，所述组合物包含多个连续重叠肽片段，所述片段共同构成与Derp2(SEQIDNO:28)具有90％序列同一性的多肽的整个氨基酸序列，包括第一多肽，所述第一多肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸1至氨基酸62-82的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；

第二肽，所述第二肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸47-67至氨基酸103-123的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留；以及

第三肽，所述第三肽由与SEQIDNO:28具有90％序列同一性的多肽的氨基酸89-119至氨基酸129的序列组成，其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

61.一种组合物，所述组合物包含多个Derp2连续重叠肽片段，所述肽片段包括：(SEQIDNO:16)的起始于氨基酸D1并且终止于A72的第一肽、起始于氨基酸S57并且终止于D113的第二肽(SEQIDNO:24)、以及选自由以下各项组成的组的第三肽：(SEQIDNO:28)的起始于氨基酸K89并且终止于D129的肽或起始于氨基酸K109并且终止于D129的肽(SEQIDNO:25)，其中所述肽任选地沿SEQIDNO:28被延长或截短了1-3个、1-5个、1-10个或1-15个氨基酸，并且其中所述肽对于对室内尘螨过敏的受试者的IgE抗体的反应性被消除，而与来自对室内尘螨过敏的受试者的T淋巴细胞的反应性被保留。

62.如权利要求61所述的组合物，其中所述起始于氨基酸S57并且终止于D113的第二肽(SEQIDNO:24)既没有被延长，也没有被截短。

63.一种针对室内尘螨过敏的特异性免疫治疗的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求59、60、61或62所述的组合物。