ES2494817T3 - Nuevo alérgeno de ácaro - Google Patents
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Abstract
El siguiente alérgeno recombinante de ácaro (a) a (c) que tiene actividad alergénica de ácaro: (a) un alérgeno recombinante de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35; (b) un alérgeno recombinante de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35, excepto en que se han delecionado de 1 a 10 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35; o (c) un alérgeno recombinante de ácaro que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35 calculada usando BLAST y usando parámetros por defecto.
Description
Nuevo alérgeno de ácaro
La presente invención se refiere a alérgenos recombinantes de ácaro que tienen actividad alergénica y en particular se refiere a alérgenos de ácaro que causan atopía en perros. La presente invención se refiere adicionalmente a genes que codifican los alérgenos, vectores de expresión que posibilitan la expresión de los genes, transformantes obtenidos por transformación usando vectores de expresión, un método para producir los alérgenos recombinantes de ácaro, agentes terapéuticos para enfermedades alérgicas a ácaros, y agentes de diagnóstico para enfermedades alérgicas a ácaros.
Los ácaros del polvo doméstico son conocidos como causas principales de enfermedades alérgicas tales como dermatitis atópica y asma bronquial. Convencionalmente, la terapia de desensibilización que usa sustancias causantes de alergias como agentes terapéuticos para enfermedades alérgicas se considera como el remedio básico más importante. En particular, la terapia de desensibilización se realiza ampliamente para enfermedades tales como polinosis, alergia al polvo doméstico, y alergias a hongos, que se inducen por antígenos tales como alérgenos inhalantes que son difíciles de evitar. Sin embargo, la terapia de desensibilización implica el riesgo de anafilaxis debido a la acción de antígenos sensibilizantes, de modo que se requiere la administración de antígenos terapéuticos seguros. Dichos antígenos seguros de sensibilización están en investigación.
Con respecto a enfermedades alérgicas a ácaros, se ha informado de tipos de ácaros, Dermatophagoides pteronyssinus y Dermatophagoides farinae, como fuentes alergénicas en el polvo doméstico (véanse los documentos no de patente 1 y 2). Los alérgenos principales de ácaro se han fraccionado a partir de estos ácaros. Se sabe que estos alérgenos de ácaro son una glucoproteína (pI 4,6 a 7,2) con un peso molecular entre 24 kD y 28 kD y/o una proteína (pI 5 a 7,2) con un peso molecular entre 14,5 kD y 20 kD contenida en la excreción de ácaros y/o cuerpos de ácaros (véanse los documentos no de patente 3 a 7).
Respecto a los genes del alérgeno del ácaro, Der p 1 (peso molecular: 25.371) y Der p 2 (peso molecular: 14.131) que son alérgenos principales de Dermatophagoides pteronyssinus y Der f 1 (peso molecular: 25.191) y Der f2 (peso molecular: 14.021) que son alérgenos principales de Dermatophagoides farinae se han clonado y también se han determinado las secuencias de nucleótidos de los mismos (véanse los documentos no de patente 8 a 15). También se han preparado alérgenos recombinantes basados en estos alérgenos, y ha progresado la investigación referente a los mismos. Además, también se ha presentado la secuencia de nucleótidos de Der f 3, un alérgeno con un peso molecular de aproximadamente 30.000 (véase el documento no de patente 16). Además, como alérgenos de ácaro, ma 10, ma 3, ma 15, ma 29, ma 44, ma 50, ma 113, ma 114, y ma 115 (véase el documento de patente 1) también se han presentado. Además, ma 124, que ejerce reactividad cruzada fuerte con un suero anti-Der f2, también se ha presentado (véase el documento de patente 2).
Además, se ha informado con respecto a perros que Der f 15 de 98 kDa, Der f 15 de 109 kDa (véase el documento no de patente 17), y Der f 18 de 60 kDa (véase el documento no de patente 18) son alérgenos con los que reacciona fuertemente IgE.
Como método para diagnosticar enfermedades alérgicas a ácaros, se ha usado convencionalmente un ensayo de reacción intradérmica como método dominante, que se basa en el historial del paciente y usa extractos de polvo doméstico y/o extractos de cuerpos de ácaro. Este método (ensayo) se ha usado en combinación con un método RAST (ensayo radio alergoabsorbente) que implica la medición del título de anticuerpos IgE en suero (valor relativo), un ensayo de inducción por inhalación, un ensayo de provocación de membrana mucosa nasal, y similares. Sin embargo, ha seguido siendo considerablemente difícil diagnosticar directamente enfermedades alérgicas a ácaros.
Se ha realizado convencionalmente un método terapéutico de desensibilización para asma bronquial, que usa un extracto de polvo doméstico y un ácaro de polvo doméstico como alérgeno específico. Sin embargo, la composición del polvo doméstico no se ha analizado suficientemente. Además, el polvo doméstico contiene muchos tipos de impurezas que pueden inducir anafilaxis. Por tanto, las dosis de polvo doméstico en dichos casos son extremadamente limitadas. Por consiguiente, el tratamiento de desensibilización convencional puede tener afectos a niveles extremadamente bajos. Por lo tanto, se han deseado antígenos más eficaces y más seguros para el tratamiento de desensibilización. Se ha sabido convencionalmente que los alérgenos eficaces para el tratamiento de desensibilización están presentes en fracciones de excreciones de ácaros en bruto de alto peso molecular. A partir de dichas fracciones, ha sido imposible obtener alérgenos de ácaro en cantidades suficientes para el tratamiento de desensibilización. Por lo tanto, con métodos que implican la extracción y purificación de alérgenos de ácaro a partir de productos obtenidos por la cría de ácaros, es difícil conseguir un suministro estable de antígenos para tratamiento. Además, como se ha descrito anteriormente, se ha informado convencionalmente de diversos alérgenos recombinantes de ácaro con el uso de técnicas de recombinación génica. Sin embargo, no puede decirse que estos
alérgenos sean siempre eficaces para el tratamiento real. Se ha deseado la provisión de un alérgeno recombinante de ácaro con actividad más eficaz, nueva, y mayor de alérgeno de ácaro.
Documento de patente 1 publicación de patente JP (Kokai) Nº 7-112999 A (1995)
Documento de patente 2 publicación de patente JP (Kokai) Nº 7-278190 A (1995)
Documento no de patente 1 Allerg. Asthma, 10, 329-334 (1964)
Documento no de patente 2 J. Allergy, 42, 14-28 (1968)
Documento no de patente 3 J. Immunol., 125, 587-592 (1980)
Documento no de patente 4 J. Allergy Clin. Immunol., 76, 753-761 (1985)
Documento no de patente 5 Immunol., 46, 679 -687 (1982)
Documento no de patente 6 Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 81, 214-223 (1986)
Documento no de patente 7 J. Allergy Clin. Immunol., 75, 686-692 (1985)
Documento no de patente 8 Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 85,127-129 (1988)
Documento no de patente 9 J. Exp. Med., 167, 175-182 (1988)
Documento no de patente 10 J. Exp. Med., 170, 1457-1462 (1989)
Documento no de patente 11 Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 118-123 (1990)
Documento no de patente 12 Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 124-129 (1990)
Documento no de patente 13 Jpn. J. Allergol., 39, 557-561 (1990)
Documento no de patente 14 Clinical and Experimental Allergy, 21, 25-32 (1991)
Documento no de patente 15 Clinical and Experimental Allergy, 21, 33-37 (1991)
Documento no de patente 16 FEBS Lett., 377, 62-66 (1995)
Documento no de patente 17 Vet. Immunol. Immunopathol, 78, 231-247 (2001)
Documento no de patente 18 J. Allergy Clin. Immunol, 112, 79-86 (2003)
Un objetivo de la presente invención es proporcionar alérgenos recombinantes de ácaro eficaces que no contengan impurezas que induzcan anafilaxis como agentes terapéuticos o agentes de diagnóstico para enfermedades alérgicas a ácaros. Más específicamente, los objetivos de la presente invención son proporcionar genes derivados de cuerpos de ácaro y proporcionar vectores de expresión que posibiliten la expresión de los genes. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar nuevos alérgenos de ácaro que tengan actividad alergénica, que se obtengan por expresión de genes derivados de cuerpos de ácaro. Objetivos adicionales de la presente invención son proporcionar nuevos agentes terapéuticos para enfermedades alérgicas a ácaros que contengan alérgenos recombinantes de ácaro como principios activos y proporcionar nuevos agentes de diagnóstico para enfermedades alérgicas a ácaros que contengan alérgenos recombinantes de ácaro.
Como resultado de estudios intensivos para conseguir los objetivos anteriores, los presentes inventores han descubierto nuevos alérgenos de ácaro y también han descubierto que los alérgenos ejercen excelentes efectos en el tratamiento de desensibilización. Por tanto, los presentes inventores han completado la presente invención.
Específicamente, la presente invención es como se describe a continuación.
[1] El siguiente alérgeno recombinante de ácaro (a) a (c) que tiene actividad alergénica de ácaro:
- (a)
- un alérgeno recombinante de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35;
- (b)
- un alérgeno recombinante de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35, excepto en que están delecionados de 1 a 10 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35;o
- (c)
- un alérgeno recombinante de ácaro que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35 calculada usando BLAST usando parámetros por defecto.
[2] Un gen que (1) codifica el siguiente alérgeno de ácaro (a) a (c) que tiene actividad alergénica de ácaro:
- (a)
- un alérgeno de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35;
- (b)
- un alérgeno de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35, excepto en que están delecionados de 1 a 10 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35; o
- (c)
- un alérgeno recombinante de ácaro que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35 calculada usando BLAST usando parámetros por defecto: o
- (2)
- comprende el siguiente ADN (d) o (e):
- (d)
- un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº 34; o
- (e)
- un ADN que codifica una proteína que tiene actividad alergénica de ácaro e hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende una secuencia complementaria a la del ADN que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 34, donde el ADN (1) hibrida en presencia de NaCl 0,7 M a 1,0 M a 68 ºC usando un filtro en que se inmoviliza el ADN y lavando con el uso de solución SSC 0,1 a 2 x a 68 ºC, o
(2) puede formar un híbrido cuando se transfiere a e inmoviliza en una membrana de nitrocelulosa por el método de transferencia de Southern y después se deja reaccionar durante una noche a 42 ºC en un tampón de hibridación de formamida al 50 %, SSC 4 x, HEPES 50 mM (pH 7,0), solución de Denhardt 10 x y 10 µg/ml de ADN de esperma de salmón.
[3] El alérgeno de ácaro de acuerdo con [1] parte (c) o el gen de acuerdo con [2] parte (c), donde el nivel de homología es de al menos el 90 %.
[4] El alérgeno de ácaro o gen que codifica [3], donde el nivel de homología es de al menos el 95 %.
[5] El alérgeno de ácaro o gen de acuerdo con [3], donde el nivel de homología es de al menos el 97 %.
[6] Un vector recombinante, que contiene el gen de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [5].
[7] Una proteína de fusión, que está compuesta por el alérgeno de ácaro de acuerdo con uno cualquiera de [1] y
[3] a [5] y otra proteína.
[8] Una célula bacteriana, de levadura, de insecto, o animal, que se transforma usando el vector de expresión de acuerdo con [6].
[9] Un método para producir un alérgeno recombinante de ácaro, que comprende cultivar la célula bacteriana, de levadura, de insecto o animal de acuerdo con [8] en condiciones en que pueda expresarse el gen, causar que la célula produzca un alérgeno recombinante de ácaro, y después recoger el alérgeno recombinante de ácaro.
[10] Un método para producir un alérgeno recombinante de ácaro, que comprende cultivar una célula bacteriana, de levadura, de insecto o animal que está transformada con un vector recombinante que contiene un gen que codifica una proteína de fusión entre el alérgeno de ácaro de uno cualquiera de [2] -[5] y otra proteína en condiciones en que pueda expresarse el gen, causar que la célula produzca un alérgeno recombinante de ácaro de fusión, recoger el alérgeno recombinante de ácaro de fusión, y después eliminar la otra proteína fusionada al alérgeno.
[11] Un agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros, que contiene como principio activo el alérgeno recombinante de ácaro de acuerdo con uno cualquiera de [1] y [3] a [5], o la proteína de fusión de acuerdo con [7].
[12] Un agente de diagnóstico para enfermedades alérgicas a ácaros, que contiene como principio activo el alérgeno recombinante de ácaro de acuerdo con uno cualquiera de [1] y [3] a [5], o la proteína de fusión de acuerdo con [7].
[13] Un anticuerpo contra el alérgeno de ácaro de acuerdo con uno cualquiera de [1] y [3] a [5].
[14] El anticuerpo contra el alérgeno de ácaro de acuerdo con [13], que es un anticuerpo monoclonal.
[15] Un hibridoma, que produce el anticuerpo monoclonal de acuerdo con [14].
[16] Un método de inmunoensayo para un alérgeno de ácaro en el polvo doméstico, que usa el anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de [13] a [15].
[17] El método de inmunoensayo para un alérgeno de ácaro en el polvo doméstico de acuerdo con [16], que es el método ELISA.
La Fig. 1 es una fotografía que muestra el resultado de electroforesis de una cadena FcεRIα de perro
recombinante.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra la unión de una cadena FcεRIα de perro recombinante con IgE.
La Fig. 3 muestra el resultado de detectar IgE específica de Dermatophagoides farinae.
La Fig. 4 es una fotografía que muestra los resultados del análisis de transferencia de Western usando una
cadena FcεRIα de perro recombinante.
La Fig. 5 es una fotografía que muestra un patrón de electroforesis 2-D (bidimensional) de un antígeno extraído
de Dermatophagoides farinae.
La Fig. 6 muestra fotografías que muestran los resultados de electroforesis 2-D (bidimensional) y análisis de
transferencia de Western de una proteína alergénica de Dermatophagoides farinae.
La Fig. 7-1 muestra la secuencia de nucleótidos parcial y la secuencia de aminoácidos de un gen Zen1.
La Fig. 7-2 muestra la secuencia de nucleótidos parcial y la secuencia de aminoácidos del gen Zen1
(continuación de la Fig. 7-1).
La Fig. 8-1 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc de longitud completa y la secuencia de aminoácidos
del gen Zen1.
La Fig. 8-2 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc de longitud completa y la secuencia de aminoácidos
del gen Zen1 (continuación de la Fig. 8-1).
La Fig. 8-3 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc de longitud completa y la secuencia de aminoácidos
del gen Zen1 (continuación de la Fig. 8-2).
La Fig. 8-4 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc de longitud completa y la secuencia de aminoácidos
del gen Zen1 (continuación de la Fig. 8-3).
La Fig. 9 es una fotografía que muestra el resultado de SDS-PAGE de Zen1 recombinante preparado usando
Escherichia coli y después purificado.
La Fig. 10 es una fotografía que muestra el resultado de una reacción analizada por transferencia de Western de
un anticuerpo policlonal anti-Zen1. El carril 1 muestra el resultado con respecto a Zen1 recombinante y el Carril 2
muestra el resultado con respecto a un cuerpo de ácaro.
La Fig. 11 es un gráfico que muestra la reactividad de Zen1 recombinante con IgE analizada por ELISA.
5
La presente invención se describirá en detalle del siguiente modo.
(1) Aislamiento de una proteína Zen1 alergénica de ácaro y determinación de secuencias parciales de la misma
10 Un alérgeno de ácaro se especifica usando IgE específica de alérgeno de ácaro obtenida de un animal clínicamente diagnosticado como que tiene alergia a ácaros. Específicamente, un alérgeno de ácaros se identifica por transferencia de Western usando suero que contiene IgE específica de alérgeno de ácaro, un extracto de ácaro, y un receptor de IgE que reconoce IgE específica de alérgeno, por ejemplo. Un alérgeno puede identificarse por un método conocido.
15 El nuevo alérgeno de ácaro identificado de este modo de la presente invención, que es una proteína Zen1, tiene un peso molecular entre 150 kDa y 200 kDa.
El alérgeno de ácaro identificado puede aislarse realizando electroforesis y después extrayendo el alérgeno de ácaro 20 de una mancha de alérgeno de ácaro. En ese momento, se desea realizar electroforesis 2-D (bidimensional) para la separación completa de otras proteínas.
Las secuencias parciales pueden determinarse por un método conocido usando el alérgeno de ácaro extraído de este modo. Ejemplos de métodos conocidos para determinar secuencias parciales incluyen la secuenciación de 25 novo basada en MS/MS y mapeo de péptidos.
(2) Preparación de clon de ADNc por RT-PCR
Un ADN que codifique el alérgeno de ácaro de la presente invención puede obtenerse extrayendo ARNm de un 30 ácaro, sintetizando un ADNc de alérgeno de ácaro usando el ARNm como molde, construyendo una biblioteca de ADNc, y después seleccionando la diana.
Una fuente de suministro de dicho ARNm es un cuerpo de ácaro, y el ácaro es preferiblemente Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, o similares, que son ácaros del polvo doméstico. Sin embargo, los 35 ejemplos no se limitan a ellos. Dicho ARNm puede prepararse mediante técnicas generalmente empleadas. El ARNm obtenido de este modo se usa como molde, se diseñan cebadores basados en la información de secuencia obtenida en (1) anterior, y después se sintetiza un fragmento de ADNc que codifica un alérgeno de ácaro. El fragmento obtenido de este modo se sub-clona en un vector apropiado tal como pGEM (producido por Promega). La secuencia de nucleótidos después se determina mediante un método convencional tal como un método de
40 secuenciación cíclica.
Las secuencias parciales de aminoácidos del alérgeno de ácaro de la presente invención se muestran en las SEC ID Nº 3 a 19. De estas, las secuencias mostradas en las SEC ID Nº 3 a 7 se determinaron por secuenciación de novo. Se muestra una secuencia de aminoácidos N-terminal en la SEC ID Nº 19. Las secuencias mostradas en las SEC ID
45 Nº 8 a 18 se determinaron por mapeo de péptidos.
En este documento se describe un alérgeno de ácaro que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nº 3 a 19 que representan fragmentos de la proteína Zen1, que es un alérgeno de ácaro.
50 Una secuencia de nucleótidos parcial del ADNc del gen Zen1 que codifica la proteína Zen1 se muestra en la SEC ID Nº 1, y la secuencia de nucleótidos de longitud completa de la misma se muestra en la SEC ID Nº 34. Una secuencia parcial de aminoácidos de la proteína Zen1 se muestra en la SEC ID Nº 2, y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la misma se muestra en la SEC ID Nº 35.
55 Siempre que una proteína que comprenda dicha secuencia de aminoácidos tenga actividad alergénica de ácaro, pueden tener lugar mutaciones tales como deleción, sustitución, o adición de al menos uno, y preferiblemente uno o varios, aminoácidos en la secuencia de aminoácidos.
60 Por ejemplo, puede delecionarse al menos uno, y preferiblemente uno o varios (por ejemplo, 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5), aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº
35. Puede añadirse al menos uno, y preferiblemente uno o varios (por ejemplo, 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5), aminoácidos a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2. Como alternativa, puede sustituirse al menos uno, y preferiblemente uno o varios (por ejemplo, 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5), aminoácidos de la
65 secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 con otro u otros aminoácidos.
Ejemplos de dicha secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 35 por deleción, sustitución, o adición de uno o varios aminoácidos incluyen secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 85 % o más, preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 95 % o más, y particularmente preferible un 97 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 35 calculada usando BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica del National Center for Biological Information) usando parámetros por defecto para la configuración inicial, por ejemplo.
Una proteína que tiene dicha secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2
o SEC ID Nº 35 por deleción, sustitución, o adición de uno o varios aminoácidos es sustancialmente igual a la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 35.
Además, ejemplos del gen de la presente invención también incluyen un ADN que es capaz de hibridar en las siguientes condiciones con un ADN que comprende una secuencia complementaria a la de un gen que tiene la secuencia de ADN mostrada en la anterior SEC ID Nº 34 y que codifica una proteína que tiene actividad alergénica de ácaro. Específicamente, dichas condiciones posibilitan la identificación por hibridación en presencia de NaCl 0,7 M a 1,0 M a 68 ºC usando un filtro en que se inmoviliza un ADN y lavando con el uso de una solución SSC 0,1 a 2 X (SSC 1 X comprende NaCl 150 mM y citrato sódico 15 mM) a 68 ºC. Como alternativa, el gen de la presente invención es una ADN que puede formar un híbrido cuando transfiere a e inmoviliza en una membrana de nitrocelulosa por el método de transferencia de Southern y después se deja reaccionar durante una noche a 42 ºC en un tampón de hibridación (formamida al 50 %, SSC 4 X, HEPES 50 mM (pH 7,0), solución de Denhardt 10 X, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón).
También se describe un ARN que corresponde al anterior ADN o un ARN capaz de hibridar en condiciones rigurosas con el ARN y que codifica una proteína que tiene actividad alergénica de ácaro.
El vector recombinante de la presente invención es como se expone en las reivindicaciones y puede obtenerse ligando (insertando) el gen de la presente invención en un vector apropiado. Los vectores para su uso en la inserción del gen de la presente invención no están particularmente limitados siempre que puedan replicarse en hospedadores tales como células bacterianas, de levadura o animales. Ejemplos de dichos vectores incluyen un ADN plasmídico y un ADN fágico. Un ADN vector que se usa para la construcción de un vector de expresión se disemina ampliamente y se obtiene fácilmente. Ejemplos de dicho ADN vector incluyen pUC19 y pTV118 N (producidos por Takana Shuzo), pUEX2 (producido por Amersham), pGEX-4T y pKK233-2 (producidos por Pharmacia), y pMAM-neo (producido por Clontech).
Un método para construir dicho vector de expresión de la presente invención no está particularmente limitado y puede realizarse de acuerdo con un método convencional. Por ejemplo, puede insertarse un fragmento de ADNc de alérgeno de ácaro digerido con EcoR I en el sitio EcoR I en el sitio de clonación múltiple del plásmido pUC19. Además, el fragmento puede ligarse al sitio EcoR I del vector plasmídico pGEX-4T, de modo que pueda obtenerse un vector de expresión.
Las células bacterianas, de levadura o animales transformadas con dicho vector de expresión de la presente invención no están particularmente limitadas, siempre que puedan expresar el gen de la presente invención. Ejemplos de dichas bacterias incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Ejemplos de dichas levaduras incluyen Saccharomyces cerevisiae y similares. Ejemplos de dichas células animales incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células Sf21 y Sf9 que son células de ovario de Mamestra brassicae, células COS de mono, y fibroblastos de ratón.
Ejemplos del alérgeno recombinante de ácaro de la presente invención incluyen, además de los alérgenos de ácaro que se expresan directamente, aquellos expresados como proteínas de fusión con otras proteínas como se expone en las reivindicaciones. A partir de ahora en este documento, dichas proteínas de fusión se mencionan como alérgenos recombinantes de ácaro de fusión. Ejemplos de otras proteínas que forman dichas proteínas de fusión incluyen, aunque sin limitación particular, β-galactosidasa, glutatión S-transferasa, proteína A, y una proteína de unión a maltosa.
También se describe en este documento un fragmento peptídico que consta únicamente de una región esencial para la actividad alergénica o un fragmento peptídico que comprende una región esencial para la actividad alergénica. Además, a parte de un producto obtenido por expresión de una proteína alergénica de ácaro solamente, dicho alérgeno recombinante de ácaro puede obtenerse a partir de un producto expresado como proteína de fusión eliminando la otra u otras proteínas.
Específicamente, el alérgeno recombinante de ácaro de la presente invención se obtiene por expresión de un gen derivado de un cuerpo de ácaro y es una proteína que tiene actividad alergénica de ácaro. Aquí, "que tiene actividad alergénica de ácaro" significa que es capaz de inducir una reacción alérgica en un mamífero.
El alérgeno de ácaro de la presente invención puede producirse por los siguientes métodos. Después de completarse el cultivo de la cepa transformante anterior, se recogen los cuerpos microbianos, se suspenden en un
tampón que contiene diversos inhibidores de proteasa, y después se alteran por ultrasonicación. Se extrae una proteína localizada en membrana en los desechos celulares usando un tampón que contiene un inhibidor de proteasa tal como fluoruro de fenilmetanosulfonilo, ácido monoiodoacético, pepstatina A, o ácido etillendiaminatetraacético y un tensioactivo tal como lauril sulfato sódico (SDS), tritón X-100, o Nonidet P40. Se purifica una proteína de fusión compuesta por el alérgeno de ácaro y glutatión S-transferasa obtenida del extracto o el concentrado de cultivo por cromatografía de afinidad usando glutatión inmovilizado, cromatografía de afinidad usando anticuerpo anti-cuerpo de ácaro inmovilizado, o similares. Además, un vehículo en que se ha inmovilizado glutatión es un vehículo producido por Pharmacia. Además, un vehículo en que se ha inmovilizado un anticuerpo anti-cuerpo de ácaro es un vehículo preparado por unión covalente de un anticuerpo de conejo anti-cuerpo de ácaro contra un vehículo de Tresyl activado (por ejemplo, gel Tresil GM (producido por Kurita Water Industries), Tresil Toyopearl (producido por Tosoh), y Tresil sepharose (producido por Pharmacia)). Además, puede obtenerse una proteína de fusión compuesta por alérgeno de ácaro y una marca His (por ejemplo, 6X His), seguido por purificación usando perlas de afinidad en las cuales se ha inmovilizado un metal, o similares.
El alérgeno recombinante de ácaro de fusión purificado se digiere con proteasa y después se fracciona por un único método o una combinación de métodos de purificación conocidos incluyendo cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía hidrófoba, cromatoenfoque, un método de enfoque isoeléctrico, y un método de electroforesis en gel mientras tiene lugar un control con ELISA y un ensayo de liberación de histamina de leucocitos para pacientes con enfermedad alérgica a ácaros (Allergy 37, 725 (1988)).
La presente invención también abarca un agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros que contiene un alérgeno de ácaro como principio activo como se expone en las reivindicaciones. Dicho agente terapéutico se usa como agente terapéutico para diversos tipos de enfermedades alérgicas a ácaros. Aquí, "enfermedades alérgicas a ácaros" significa todas las enfermedades alérgicas que están causadas por antígenos específicos de ácaro, tales como asma bronquial atópica, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, y dermatitis atópica.
El agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros de la presente invención puede prepararse secando un alérgeno recombinante de ácaro o un fragmento peptídico del mismo purificado por el método anterior, recogiendo dicho alérgeno o fragmento peptídico en una forma de polvo, y después preparando un agente terapéutico desensibilizante para enfermedades alérgicas a ácaros, por ejemplo. Sin embargo, el método no está particularmente limitado a ello. Cuando el agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros de la presente invención se usa como agente terapéutico desensibilizante, el agente puede usarse directamente o, si fuera necesario, usarse como fármaco de combinación suplementado por un método convencional con un adyuvante usado generalmente y diversos agentes aditivos tales como un agente estabilizante, un excipiente, un agente solubilizante, un agente emulsionante, un agente tamponante, un agente calmante, un conservante, y un agente colorante. Por ejemplo, se disuelve un alérgeno recombinante de ácaro purificado en una forma de polvo en solución salina fisiológica suplementada con fenol y después se usa como solución madre para un antígeno para tratamiento de desensibilización.
El agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros de la presente invención puede administrarse por vías generales de administración tales como métodos de administración percutánea, oral, intracutánea, subcutánea, intramuscular, e intraperitoneal. Además, el agente terapéutico de la presente invención también puede usarse en un fármaco percutáneo o transmucosa tal como un trocisco, un comprimido sublingual, un colirio, un agente de pulverización intranasal, una cataplasma, una crema, y una loción. Además, la dosis y la cantidad de veces de administración del agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros de la presente invención se seleccionan apropiadamente dependiendo de la vía de administración, los síntomas, y similares, de modo que la dosis esté dentro de un intervalo de aproximadamente 20 µg o menos por vez de administración para un adulto. La administración se realiza una o varias veces a la semana.
Además, el agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros de la presente invención es útil no solamente como agente terapéutico contra enfermedades alérgicas a ácaros, sino también como agente profiláctico contra las mismas. Además, el agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros de la presente invención puede usarse de forma segura en organismos humanos sin ejercer acción inductora de anafilaxis.
El agente de diagnóstico para enfermedades alérgicas a ácaros de la presente invención es como se expone en las reivindicaciones y se usa como reactivo para diagnosticar reacciones intracutáneas contra enfermedades alérgicas a ácaros o un reactivo de titulación para diagnosticar alergias a ácaros. Cuando el agente de diagnóstico se usa como reactivo para diagnosticar reacciones intracutáneas, el reactivo se obtiene preparando un alérgeno recombinante de ácaro o un fragmento peptídico del mismo purificado por el método anterior de acuerdo con un método convencional. Por ejemplo, se seca y pulveriza un alérgeno recombinante de ácaro, se disuelve el polvo y se diluye en solución salina fisiológica que contiene fenol, y después se usa. Se emplea un método que usa el agente de diagnóstico como reactivo para diagnosticar reacciones intracutáneas de acuerdo con un método convencional.
Además, cuando el agente de diagnóstico se usa como reactivo de titulación para diagnosticar alergias a ácaros, el reactivo se prepara de forma similar por un método convencional. Por ejemplo, se disuelve apropiadamente un
alérgeno recombinante de ácaro o un fragmento peptídico del mismo y se diluye en un tampón de Hank, de modo que se usa el resultante como reactivo para titulación de liberación de histaminas. Este método se realiza generalmente por los siguientes procedimientos. Específicamente, se suspende sangre de un paciente con enfermedad alérgica a ácaros o una fracción de las células sanguíneas obtenidas por centrifugación de la sangre del paciente en un tampón. Se somete una cantidad fija de la suspensión de células sanguíneas a titulación usando un alérgeno recombinante de ácaro como reactivo de titulación. Se mide la cantidad de histamina que se libera de los vasófilos por estimulación alergénica usando HPLC [Allergy 37, 725 (1988)].
En la titulación de liberación de histaminas, se determina la cantidad de histamina que se libera basándose en el 50 % (punto de inflexión de la curvad de titulación) de la cantidad máxima de liberación. Específicamente, esta titulación se caracteriza porque: (1) se mide directamente la sensibilidad al alérgeno de un paciente basándose en un título de una suspensión de células sanguíneas; y (2) después de la pre-reacción del plasma sanguíneo con un alérgeno recombinante de ácaro, el valor (valor de la curva de titulación en sangre) obtenido por titulación de la suspensión de células sanguíneas con la solución de reacción es habitualmente mayor que el valor (valor de la curva de titulación de la suspensión de células sanguíneas) obtenido titulando la suspensión de células sanguíneas con el alérgeno recombinante de ácaro. Esto se debe a la presencia de un anticuerpo IgG (anticuerpo de bloqueo) capaz de neutralizar el alérgeno en plasma sanguíneo. Por lo tanto, el título del anticuerpo de bloqueo puede obtenerse del grado al cual se ha desplazado la curvad e titulación en sangre desde la curva de titulación de suspensión de células sanguíneas. La sensibilidad al alérgeno y este título de anticuerpo de bloqueo posibilitan un diagnóstico de alergia a ácaros preciso factible. Este ensayo de titulación de liberación de histaminas también es útil para controlar el efecto del tratamiento de desensibilización.
La presente invención también abarca un anticuerpo contra el alérgeno de ácaro de la presente invención o un fragmento peptídico del mismo como se expone en las reivindicaciones. Dicho anticuerpo puede obtenerse como anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal por un método conocido. Dicho anticuerpo puede usarse para medir la presencia, ausencia, o similares de un alérgeno de ácaro en polvo doméstico, por ejemplo. Dicha medición puede realizarse por un método inmunológico conocido tal como ELISA. Después de dicha medición, se extrae una proteína del polvo doméstico y después se mide.
Además, se expresa la proteína alergénica recombinante de ácaro de la presente invención. Realizando un ensayo tal como un ensayo de reacción de IgE específico o un ensayo de reacción intracutáneo con un perro paciente con alergia a ácaros usando la proteína recombinante expresada de este modo, pueden confirmarse las funciones de proteína alergénica de la proteína alergénica de ácaro de la presente invención.
La presente invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no pretender limitar el alcance de la invención.
Además, los reactivos usados en cada ejemplo fueron reactivos comerciales adquiridos de Nacalai Tesque, Wako Pure Chemical Industries, Sigma, Difco, o similares, salvo que se especifique de otro modo. Además, los reactivos para ingeniería genética, tales como enzimas de restricción se adquirieron de Takara Shuzo, Toyobo, Invitrogen, o similares y después se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
[Ejemplo 1] Establecimiento de un sistema de detección de IgE
Se amplificó la región extracelular de un ADNc de cadena α de receptor de IgE (FcεRIα) de alta afinidad de perro, excluyendo su sitio de péptido señal y que tenía sitios de las enzimas de restricción EcoRIy Xho I añadidos a la misma, por PCR. El resultante se ligo en los sitios EcoRIy Xho I del vector plasmídico de expresión de Escherichia coli pGEX4T-1 (producido por Amersham Biosciences) usando ADN ligasa T4. Se transformó una cepa de E. coli TOP10 (producida por Invitrogen) con el plásmido recombinante obtenido de este modo. La cepa transformada se cultivó a 37 ºC durante una noche en un medio LB que contenía ampicilina (100 µg/ml). Posteriormente, se subculitvó una pequeña cantidad de la cepa en un nuevo medio LB hasta que la DO a 600 nm alcanzó 1,0. A continuación, se añadió IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactósido) a una concentración final de 1 mM. Tres horas después, las células se recogieron y después se lavaron una vez con PBS (pH 7,4). Las células regidas de nuevo se lisaron por ultrasonicación en PBS (pH 7,4), se retiraron las fracciones insolubles por centrifugación, y después se recogieron las fracciones solubles que contenían FcεRIα de perro fusionada a glutatión S-transferasa (GST). Posteriormente, se obtuvo FcεRIα de perro fusionada a de las fracciones solubles usando una columna de glutatión sepharose 4B (producida por Amersham Biosciences). Se obtuvieron 1,0 mg de la proteína de fusión (GST-FcεRIα) de 10 litros de la solución de cultivo. Se confirmó que la GST-FcεRIα purificada obtenida mostraba una única banda de 45 kDa como resultado de SDS-PAGE (Fig. 1). La IgE recombinante de perro (producida por BETHYL) y la IgG purificada de perro se inmovilizaron en una inmunoplaca (producida por Nalge Nunc International) con dilución en serie de factor 2 de 1,0 µg, 0,1 µg, 0,05 µg, 0,025 µg, 0,0125 µg, y después 0,00625 µg, para confirmar la reactividad de la GST-FcεRIα purificada. Se confirmó que la GST-FcεRIα purificada reaccionaba con IgE pero no reaccionaba con IgG (Fig. 2). Se inmovilizaron 4,0 µg de un antígeno extraído de Dermatophagoides farinae (producido por GREER) en una inmunoplaca (producida por Nalge Nunc International). Se hizo reaccionar suero de perro Dermatophagoides-farinae-positivo (suero de perro que daba positivo en ensayo para
Dermatophagoides farinae confirmado por una reacción intracutánea usando una solución antigénica de Dermatophagoides farinae (producida por GREER) diluida 50 veces usando solución salina fisiológica) con el antígeno. Después se añadió GST-FcεRIα marcada con biotina. Además, basándose en la reacción de desarrollo de color resultante de la adición de estreptavidina conjugada con peroxidasa (producida por Jackson Immuno Research) y un sustrato, se confirmó que GST-cadena FcεRIα reconocía IgE específica de alérgeno de ácaro (Fig. 2). Además, se inmovilizaron 4,0 µg de un antígeno extraído de Dermatophagoides farinae (producido por GREER) en una inmunoplaca (producida por Nalge Nunc International). El suero de perro obtenido por inmunización con el antígeno extraído de Dermatophagoides farinae se hizo reaccionar con el antígeno. Se confirmó que GST-FcεRIα no reaccionaba ni con suero de perro Dermatophagoides-farinae-positivo sometido a tratamiento por calor a 56 ºC durante 1 hora ni con IgG de perro purificada, pero reaccionaba con la IgE recombinante de perro (producida por BETHYL). Se consideró que GST-FcεRIα reconocía IgE específica de alérgeno (Fig. 3). En la Fig. 3, "-" indica suero no tratado a 56 ºC durante 1 hora, "+" indica suero tratado a 56 ºC durante 1 hora, y "cont." indica suero no inmunizado.
[Ejemplo 2] Análisis de un alérgeno de ácaro principal por transferencia de Western
Se realizó análisis de transferencia de Western usando los sueros y muestras de plasma sanguíneo de ocho perros. Los ocho perros habían desarrollado dermatitis atópica y se les había diagnosticado con alergias a ácaros basándose en reacciones intracutáneas usando la solución de un antígeno extraído de un alérgeno de Dermatophagoides farinae (producido por GREER) y el método ELISA usando la cadena FcεRIα recombinante de perro establecida en el Ejemplo 1. Se añadió β-mercaptoetanol a 100,0 µl de la solución de un antígeno extraído de Dermatophagoides farinae hasta una concentración final de 50,0 µl/ml. Se añadieron 200 µl del tampón de muestra de Laemmli preparado de este modo (producido por BIO-RAD), seguido de tratamiento por calor a 100 ºC durante 5 minutos. El resultante se aplicó a gel de poliacrilamida (PAGEL; producido por ATTO) con una concentración de gel entre el 5 % y el 20 %, y después se realizó electroforesis. Después de completarse la electroforesis, el resultante se transfirió a una membrana de PVDF (Hybond-P; producida por Amersham Biosciences). La membrana se dejó en reposo at 4 ºC durante una noche en una solución de bloqueo (PBST (preparada añadiendo Tween20 a PBS hasta una concentración final del 0,1 %) suplementada con leche desnatada al 5 %). Después de que la membrana se hubiera lavado en PBST durante 10 minutos, cada muestra de suero o plasma sanguíneo de perro se diluyó 10 veces en una solución de bloqueo. Cada muestra en solución diluida se añadió a la membrana, seguido de 3 horas de reacción a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados (10 minutos cada uno) con PBST. Se diluyó FcεRIα de perro marcada con biotina con una solución de bloqueo y después la solución diluida se añadió a la membrana, seguido de 2 horas de reacción a temperatura ambiente. Después de 3 lavados (10 minutos cada uno) con PBST, se añadió un conjugado de estreptavidina-HRP (producido por Amersham Biosciences) diluido 10.000 veces con PBST a la membrana, seguido de 1 hora de reacción a temperatura ambiente. Después de 5 lavados (10 minutos cada uno) con PBST, se añadió una solución de reacción para un sistema de detección a de transferencia de Western ECL Plus (producido por Amersham Biosciences) a la membrana, seguido de 5 minutos de reacción a temperatura ambiente. Después se detectaron las señales usando película de rayos X (Hyperfilm ECL; producido por Amersham Biosciences). Como resultado, se detectó una proteína que mostraba una fuerte reacción entre una banda correspondiente a un peso molecular de 150 kDa y una banda correspondiente a la misma de 250 kDa (Fig. 4). En la Fig. 4, una banda indicada con una flecha corresponde a la proteína que muestra una fuerte reacción y que tiene un peso molecular entre 150 kDa y 250 kDa. En la Fig. 4, los números 1 a 8 por separado indican ocho perros, y "ct." indica un suero negativo.
[Ejemplo 3] Análisis de una proteína alergénica de ácaro por electroforesis 2-D (bi-dimensional)
Se aisló una proteína alergénica con un peso molecular entre 150 kDa y 250 kDa, con que IgE había reaccionado fuertemente, se aisló por electroforesis 2-D (bi-dimensional). La electroforesis 2-D (bi-dimensional) se realizó usando una célula Protean IEF (producida por BIO-RAD). Se disolvieron 1,0 mg de un antígeno extraído de Dermatophagoides farinae (producido por GREER) en 1,0 ml de un tampón de hinchamiento (kit 2-D starter; producido por BIO-RAD). Se hincharon 300 µl de la solución obtenida de este modo en condiciones activas (50 V, 20 ºC, y 12 horas) usando gel IPG Ready strip de 17 cm de longitud (pH 4-7; producido por BIO-RAD) y una cubeta de enfoque. Después del hinchamiento, se realizó el enfoque en las siguientes condiciones. En primer lugar, se realizó un procedimiento para retirar el exceso de sales en la etapa 1 (250 V, 20 minutos, y 20 ºC). En la etapa 2, se elevó la tensión de 250 V a 10.000 V durante 6 horas. En la etapa 3, se realizó el enfoque con una tensión de 10.000 V y sumando las horas de tensión 60.000 VH. Antes de la electroforesis 2-D (bi-dimensional), se agitó suavemente el gel IPG ready strip durante 10 minutos usando tampón de equilibrado de SDS-PAGE I (urea 6 M, Tris 0,375 M pH 8,8, SDS al 2 %, glicerol al 20 %, y DTT al 2 % (p/v); producido por BIO-RAD). Posteriormente, el gel adicionalmente se agitó suavemente durante 10 minutos usando tampón de equilibrado de SDS-PAGE II (urea 6 M, Tris 0,375 M pH 8,8, SDS al 2 %, glicerol al 20 %, y yodoacetamida al 2,5 % (p/v); producido por BIO-RAD), realizando de este modo el equilibrado. Se hizo que el gel IPG ready strip equilibrado se adhiriera estrechamente a gel PII ready (8-16 %; producido por BIO-RAD) usando agarosa de baja fusión al 1 % (v/w) (producida por BIO-RAD). La electroforesis se realizó con una corriente constante de 40 mA (con tensión inicial de 135 V y tensión final de 400 V) durante aproximadamente 3 horas. Después de la electroforesis, el gel se tiñó usando Bio-Safe (producido por BIO-RAD), de modo que pudo hacerse el análisis de patrones para la mancha de proteína (Fig. 5).
[Ejemplo 4] Identificación de una mancha de alérgeno por análisis de transferencia de Western
Después de la electroforesis 2-D (bi-dimensional), la mancha de proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Hybond-P; producida por Amersham Biosciences). La membrana se dejó en reposo a 4 ºC durante una noche en una solución de bloqueo (PBST (preparada añadiendo Tween20 a PBS hasta una concentración final del 0,1 %) suplementada con leche desnatada al 5 %). Después de haber lavado la membrana con PBST durante 10 minutos, se diluyó 10 veces una muestra de suero o plasma sanguíneo de perro usando una solución de bloqueo. La solución diluida de este modo se añadió a la membrana, seguido de 3 horas de reacción a temperatura ambiente. Después de 3 lavados (10 minutos cada uno) con PBST, se diluyó FcεRIα de perro marcada con biotina con una solución de bloqueo. La FcεRIα de perro marcada con biotina diluida se añadió a la membrana, seguido de 2 horas de reacción a temperatura ambiente. Después de 3 lavados (10 minutos cada uno) con PBST, se añadió un conjugado de estreptavidina-HRP (producido por Amersham Biosciences) diluido 10.000 veces con PBST a la membrana. Se realizó una hora de reacción a temperatura ambiente. Después de 5 lavados (10 minutos cada uno) con PBST, se añadió una solución de reacción para un sistema de detección de transferencia de Western ECL plus (producido por Amersham Biosciences) a la membrana, seguido de 5 minutos de reacción a temperatura ambiente. Las señales se detectaron usando película de rayos X (Hyperfilm ECL; producido por Amersham Biosciences). Como resultado, se detectó una mancha que mostraba una fuerte reacción entre una banda correspondiente a un peso molecular de 150 kDa y una banda correspondiente a la misma de 250 kDa y a un pH de aproximadamente 4,5. Por tanto, se obtuvo la mancha correspondiente a la proteína alergénica (Zen1) de la presente invención (Fig. 6). En la Fig. 6: la Fig. 6-1 izquierda superior muestra el patrón de electroforesis 2-D (bi-dimensional) (pH 4 a 7) de Dermatophagoides farinae; la Fig. 6-2 derecha superior muestra el resultado de análisis de transferencia de Western (pH 4 a 7) usando el suero Dermatophagoides-farinae-positivo de un perro paciente que desarrolló dermatitis atópica; la Fig. 6-3 izquierda inferior muestra el patrón de electroforesis 2-D (bi-dimensional) (pH 3,9 a 5,1) de Dermatophagoides farinae; y la Fig. 6-4 derecha inferior muestra la mancha de reacción (donde la mancha aparece como una mancha circular negra sobre la parte superior en la figura y se indica con una flecha) obtenida por análisis de transferencia de Western (pH 3,9 a 5,1) usando el suero Dermatophagoides farinae-positivo de un perro paciente que desarrolló dermatitis atópica, en comparación con el patrón de electroforesis 2-D (bi-dimensional). Se observó una fuerte reacción para la mancha indicada con la flecha.
[Ejemplo 5] Análisis de proteoma de la proteína Zen1
La mancha de la proteína Zen aislada por electroforesis 2-D (bi-dimensional) se escindió del gel y después se realizó análisis MS/MS. Pudieron obtenerse muchos datos MS/MS, pero no se confirmaron aciertos. Cinco péptidos que se consideraba que eran nuevas proteínas se sometieron al método de secuenciación de novo, de modo que se determinaron las secuencias de aminoácidos (SEC ID Nº 3 a 7) (Tabla 1). Se realizó una búsqueda BLAST para estas secuencias de aminoácidos, pero no se obtuvieron aciertos claros.
Tabla 1
Secuencia parcial 415 : MKSLLNEANELLK Secuencia parcial 445 : SAQDVLEK Secuencia parcial 847 : FMQSLLNEADELLR Secuencia parcial 448 : LPDSDLKDELAK Secuencia parcial 491 : LPDSDLKNELAEK
Secuencias parciales de aminoácidos de Zen1 determinadas por el método de secuenciación de novo.
[Ejemplo 6] Análisis de mapeo de péptidos de la proteína Zen1
La mancha de la proteína Zen1 aislada por electroforesis 2-D (bi-dimensional) se escindió del gel. Se preparó un mapa de péptidos y después se realizó la secuenciación de aminoácidos para 8 picos. Como resultado, se determinaron las secuencias (SEC ID Nº 8 a 18) de 11 fragmentos de aminoácidos (Tabla 2). Se realizó una búsqueda BLAST, pero no se obtuvieron aciertos claros.
Tabla 2
- Secuencia parcial 21
- : MYNFHLEAY
- Secuencia parcial 28
- : IAHFLELE
- Secuencia parcial 32
- : IAHFELE
Secuencia parcial 23-1 : KFQSLLNEAN Secuencia parcial 23-2 : IAHLESE(T) Secuencia parcial 24 : KFQSLLN(E)A Secuencia parcial 22 : DAQLEXE Secuencia parcial 9-1 : SAQDVSL Secuencia parcial 9-2 : RNEMNE Secuencia parcial 20-1 : MFQSLLNKADFD
Secuencia parcial 20-2 : DLARDVXL Secuencias de aminoácidos correspondientes a picos obtenidos por mapeo de péptidos de Zen 1
[Ejemplo 7] Análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína Zen1
La mancha de proteína Zen1 aislada por electroforesis 2-D (bi-dimensional) se escindió del gel. La secuencia de aminoácidos N-terminal (SEC ID Nº 19) de la proteína Zen1 se determinó por un método convencional usando un sistema de secuenciación de proteínas HP G1005A (Tabla 3). Se realizó una búsqueda BLAST para la secuencia, pero no se obtuvieron aciertos claros.
Tabla 3
Secuencia N-terminal : DNRDDVLKQTEE
Secuencia de aminoácidos N-terminal de Zen1
10 [Ejemplo 8] Extracción del ARN total de ácaro y separación del ARNm poli(A) de ácaro
Se colocaron cuerpos de ácaro sin tratar obtenidos por cultivo y crecimiento de Dermatophagoides farinae de acuerdo con un método convencional en aproximadamente 2,0 l de una solución salina saturada. La solución se
15 agitó bien y después se dejó en reposo durante 30 minutos. Los cuerpos de ácaro en el sobrenadante se depuraron usando un colador, se lavaron usando solución salina fisiológica, y después se secaron. Se sometieron 1,0 g de cuerpos de ácaro a extracción de ARN total y separación de ARNm poli(A) de ácaro usando un kit FastTrack 2.0 (producido por Invitrogen) de acuerdo con el manual del kit.
20 [Ejemplo 9] Síntesis de ADNc de ácaro
Se realizó reacción de transcripción inversa usando 100 ng del ARNm poli(A) de ácaro separado en el Ejemplo 8 como molde y un kit de síntesis de ADNc (ReverTraAce-α-; producido por Toyobo) de acuerdo con el manual del kit.
25 [Ejemplo 10] Amplificación del gen Zen 1 por PCR
Basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína Zen1, se diseñaron los cebadores N-1 (5' -GAYGAYGTNTTRAARCARACNGARGAR -3' (SEC ID Nº 20): Y = C o T, N = A o C o G o T, y R = A o G) y N-2 (5' -GAYGAY GTN CTN AAR CAR ACN GAR GAR -3' (SEC ID Nº 21): Y= C oT, N = A oC o G oT, y R = A oG) 30 como cebadores con sentido. Además, se diseñaron 12 cebadores (SEC ID Nº 22 a 33) basándose en las secuencias de aminoácidos obtenidas por el método de secuenciación de novo (Tabla 4) como cebadores inversos. Con el uso de 10 µg del ADNc de ácaro sintetizado en el Ejemplo 9 como molde, polimerasa Ex taq (producida por TaKaRa Bio), y cada muestra preparada de acuerdo con el manual, se realizó tratamiento de desnaturalización térmica a 94 ºC durante 2 minutos y se realizaron 35 ciclos de reacción, cada uno de los cuales constaba de 94 ºC 35 durante 1 minuto, 65 ºC durante 2 minutos, y 72 ºC durante 3 minutos. Después de realizar reacción adicional a 72 ºC durante 9 minutos, la muestra se almacenó a 4 ºC. Se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 1.000 pb cuando se realizó PCR usando un cebador inverso 415-4 (5' -RTTNAGNAGRTCYTTNGCRTCYTT -3' (SEC ID Nº 25): N = A o C o G o T, R = A o G, e Y = C o T). Se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 880 pb cuando se realizó PCR usando 491-2 (5' -RTT RTC NGC NAG RTC YTT RTT -3' (SEC ID Nº 29): N = A o C o G o
40 T,R=AoG,eY=CoT).
Tabla 4
N-1 : 5' -GAY GAY GTN TTR AAR CAR ACN GAR GAR -3' N-2 : 5' -GAY GAY GTN CTN AAR CAR ACN GAR GAR -3' 415-1 : 5' -RTT RAA RAA RTC YTT NGC RTC YTT RAA -3' 415-2 : 5' -RTT NAG RAA RTC YTT NGC RTC YTT -3' 415-3 : 5' -RTT RAA NAG RTC YTT NGC RTC YTT -3' 415-4 : 5' -RTT NAG NAG RTC YTT NGC RTC YTT -3' 445-1 : 5' -RTT RTC RAA NAC YTC RTG NGC -3' 445-2 : 5' -RTT RTC NAG NAC YTC RTG NGC -3' 491-1 : 5' -RTT RTC NGC RAA RTC YTT RTT -3' 491-2 : 5' -RTT RTC NGC NAG RTC YTT RTT -3' 448-1 : 5' -RTT NGC RAA RTC YTC RTT RAA YTC -3' 448-2 : 5' -RTT NGC NAG RTC YTC RTT RAA YTC -3' 448-3 : 5' -RTT NGC RAA RTC YTC RTT NAG YTC -3' 448-4 : 5' -RTT NGC NAG RTC YTC RTT NAG YTC -3'
Mezcla de secuencias cebadoras sintetizadas para amplificación del gen Zen 1. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1000 pb cuando se realizó PCR usando N-1 y 415-4. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 880 pb cuando se realizó PCR
usando N-1 y 491-2.
N=A o C o G o T, R=A o G, Y=C o T
[Ejemplo 11] Clonación del gen Zen 1
El fragmento de ADN amplificado usando los cebadores N-1 y 415-4 en el Ejemplo 10 se recogió del gel de agarosa (SUPREC-O1 producido por TaKaRa). El fragmento de ADN se ligó al sitio de clonación del vector pGEM-T Easy (producido por Promega) usando la ADN ligasa T4, transformando de este modo el hospedador Escherichia coli TOP10 (producido por Invitrogen). Específicamente, se mezclaron células competentes de Escherichia coli y un plásmido y después la mezcla se sometió a tratamiento de temperatura en hielo durante 30 minutos, a 42 ºC durante 30 segundos, y en hielo durante 2 minutos. El resultante después se suspendió en un medio SOC (triptona al 2 %, extracto de levadura al 0,5 %, NaCl al 0,05 %, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, y glucosa 20 mM), seguido de 1 hora de incubación a 37 ºC. Posteriormente, las Escherichia coli transformadas se cultivaron a 37 ºC durante una noche en un medio de agar LB (extracto de levadura al 1 %, triptona al 0,5 %, y NaCl al 1 %) suplementado con 50 µg/ml de ampicilina, obteniendo de este modo colonias de Escherichia coli. Se seleccionaron los clones blancos que se pensaba que contenían el fragmento insertado. Los clones se cultivaron durante una noche en un medio LB suplementado con 50 µg/ml de ampicilina. El ADN plasmídico se purificó usando un kit GFX (marca registrada) Micro Plasmid Prep (producido por Amersham Bioscience). La reacción de secuenciación se realizó usando un kit de secuenciación cíclica con cebador colorante (producido por Amersham) y después se realizó análisis de secuencia de nucleótidos usando un secuenciador de ADN de fluorescencia (producido por Shimadzu Corporation). Además, se hizo una determinación final cuando se halló que las secuencias de nucleótidos de 3 clones coincidían completamente tras el análisis de secuencia de nucleótidos de los mismos (Fig. 7-1 y Fig. 7-2).
[Ejemplo 12] Análisis del gen Zen1
El gen Zen1 clonado en el Ejemplo 11 se analizó usando el software Genetyx-win ver.6 (producido por Software Development). La cantidad de bases fue de 1020 pb y la cantidad de restos aminoacídicos fue de 340 (Fig. 7-1, Fig. 7-2, y SEC ID Nº 1 y 2). Se realizó una búsqueda BLAST para la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del gen, pero no se obtuvieron aciertos claros. Se pensó que el gen Zen1 era un nuevo gen.
[Ejemplo 13] Aislamiento del ADNc de Zen1 de longitud completa
Se aisló el ADNc de longitud completa por el método RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Se extrajo el ARN total de los cuerpos de ácaro usados en el Ejemplo 8 usando un kit de aislamiento de ARN total SV (producido por Promega). Se preparó un molde para RACE usando un kit GeneRacer (marca registrada) (producido por Invitrogen) de acuerdo con el manual del kit. Además, basándose en las secuencias parciales de Zen1 obtenidas en el Ejemplo 12, se sintetizaron cebadores para la 1ª PCR y la PCR anidada para amplificación de los extremos 5' y 3' (Tabla 5). La reacción de amplificación para los extremos 5' y 3' se realizó del siguiente modo. A 1,0 µl del molde para RACE preparado anteriormente, se añadieron 3,0 µl de cada uno de los cebadores 5' y 3' incluidos en un kit GeneRacer (marca registrada), 1,0 µl de una solución de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 5,0 µl de tampón de reacción de PCR de ADNc 10 x incluido en la mezcla de polimerasa de ADNc Advantage (producido por CLONTECH), 1,0 µl de mezcla de polimerasa de ADNc Advantage, y 1,0 µl de cada uno de los cebadores específicos de gen para la 1ª PCR sintetizados anteriormente y ajustados a 10 µM. Entonces se ajustó el volumen de la solución resultante a 50,0 µl usando agua destilada esterilizada. La amplificación génica se realizó usando un método de PCR Touchdown. La solución de muestra preparada se sometió desnaturalización térmica a 94 ºC durante 1 minuto, 5 ciclos de reacción, cada uno de los cuales constaba de 94 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 4 minutos, 5 ciclos de reacción, cada uno de los cuales constaba de 94 ºC durante 30 segundos y 70 ºC durante 4 minutos, 25 ciclos de reacción final, cada uno de los cuales constaba de 94 ºC durante 30 segundos y 68 ºC durante 4 minutos, y después almacenamiento a 4 ºC. Después de completarse la 1ª PCR, a 1,0 µl de cada una de las soluciones de reacción de amplificación del extremo 5' y 3', se añadieron 1,0 µl de cada cebador 5' y cebador 3' para la PCR anidada incluidos en un kit GeneRacer (marca registrada), 1,0 µl de una solución de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 5,0 µl de tampón de reacción de PCR de ADNc 10 x incluido en la mezcla de polimerasa de ADNc Advantage (producido por CLONTECH), 1,0 µl de mezcla de polimerasa de ADNc Advantage, y 1,0 µl de cada uno de los cebadores específicos de gen para la 1ª PCR sintetizados anteriormente y ajustados a 10 µM. Entonces se ajustó el volumen de la solución resultante a 50,0 µl usando agua destilada esterilizada. La amplificación génica se realizó usando el método de PCR Touchdown anterior. Los fragmentos amplificados obtenidos de este modo de los extremos 5' y 3' se confirmaron por electroforesis usando gel de agarosa al 1,0 %. Estos fragmentos se escindieron y después se recogieron (SUPREC-01 producido por TaKaRa). Los fragmentos se ligaron al sitio de clonación del vector pGEM-T Easy (producido por Promega) usando ADN ligasa T4, transformando de este modo el hospedador Escherichia coli TOP10 (producido por Invitrogen). Específicamente, se mezclaron células competentes de Escherichia coli y un plásmido y después la mezcla se sometió a tratamiento de temperatura en hielo durante 30 minutos, a 42 ºC durante 30 segundos, y en hielo durante 2 minutos. El resultante después se suspendió en un medio SOC (triptona al 2 %, extracto de levadura al 0,5 %, NaCl al 0,05 %, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, y Glucosa 20 mM), seguido de 1 hora de incubación a 37 ºC. Posteriormente, las Escherichia coli transformadas se cultivaron a 37 ºC durante una noche en un medio de agar LB (extracto de levadura al 1 %, triptona al 0,5 %, y NaCl al 1 %)
suplementado con 50 µg/nl de ampicilina, obteniendo de este modo colonias de Escherichia coli. Se seleccionaron las colonias blancas que se pensaba que contenían los fragmentos insertados. Los clones se cultivaron durante una noche en un medio LB suplementado con 50 µg/ml de ampicilina. El ADN plasmídico se purificó usando un kit GFX (marca registrada) Micro Plasmid Prep (producido por Amersham Bioscience). La reacción de secuenciación se realizó usando un kit de secuenciación cíclica con cebador colorante (producido por Amersham) y después se realizó análisis de secuencia de nucleótidos usando un secuenciador de ADN de fluorescencia (producido por Shimadzu Corporation). Además, se hizo una determinación final cuando se halló que las secuencias de nucleótidos de 3 clones coincidían completamente tras el análisis de los mismos. Como resultado, pudo determinarse la secuencia de nucleótidos del extremo 5' y la del extremo 3' de Zen1 (Fig. 8-1 a Fig. 8-4 y SEC ID Nº 34 y 35).
Tabla 5
- Nombre del cebador
- Secuencia Propósito de uso
- Zen1 RS-1 :
- 5' -AAT TAC AAA CAT GAG TTA GAA -3' 3' RACE 1ª PCR
- Zen1 RS-2 :
- 5' -GAA TTG TTG ACA ATG TTC AAA -3' 3' RACE PCR anidada
- Zen1 RR-1 :
- 5' -GAT TTC ATC TTT CAA ATC TGA -3' 5' RACE 1ª PCR
- Zen1 RR-2 :
- 5' -CTT TTC CAA TAC ATC CTG GGC -3' 5' RACE PCR anidada
(Desde arriba, SEC ID Nº 36, 37, 38, y 39)
Cebadores usados en el método RACE y las secuencias de los mismos
[Ejemplo 14] Purificación de Zen1 recombinante
El ADNc de Zen1 obtenido en el Ejemplo 13 al cual se habían añadido sitios para las enzimas de restricción BamHI y XhoI se amplificó por PCR. El producto de amplificación se ligó a los sitios BamHI y XhoI del vector plasmídico de expresión de Escherichia coli pGEX4T-1 (producido por Amersham Biosciences) usando ADN ligasa T4. La cepa de
E. coli TOP10 (producida por Invitrogen) se transformó con el plásmido recombinante obtenido de este modo. La cepa transformada se cultivó a 37 ºC durante una noche en un medio LB que contenía 100 µg/ml de ampicilina. Se subculitvó una pequeña cantidad de la cepa en un nuevo medio LB hasta que la DO a 600 nm alcanzó 1,0. A continuación, se añadió IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactósido) hasta una concentración final de 1 mM. Tres horas después, las células se recogieron y después se lavaron una vez con PBS (pH 7,4). Las células recogidas de nuevo se lisaron por ultrasonicación en PBS (pH 7,4), se retiró una fracción por centrifugación, y después se recogió una fracción soluble que contenía Zen1 fusionada a glutatión S-transferasa (GST). Posteriormente, Zen1 fusionada a GST se obtuvo de la fracción soluble usando una columna de glutatión sepharose 4B (producida por Amersham Biosciences). Se añadió trombina (producida por Amersham Biosciences) en una cantidad 1/100 de la de la proteína de fusión a una solución que contenía un producto de fusión purificado (es decir, Zen1 fusionada a GST), seguido de 20 horas de reacción a 22 ºC. Por tanto, se separó GST de Zen1. Posteriormente, se retiró la trombina usando Benzamidina Sepharose (producido por Amersham Biosciences) y después se purificó una Zen1 recombinante. La Zen1 purificada obtenida de este modo mostró una única banda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 60 kDa confirmado por SDS-PAGE (Fig. 9).
[Ejemplo 15] Preparación de un anticuerpo policlonal anti-Zen1 y análisis de la reactividad del anticuerpo con la proteína de ácaro
Se inmunizaron seis ratones (BALB/c, hembra, 4 semanas de edad) 5 veces con la Zen1 recombinante purificada en el Ejemplo 14 a intervalos de 1 semana. Posteriormente, se recogió sangre de los ratones, se separaron los sueros, y después se analizó la reacción del anticuerpo IgG por ELISA. El ELISA se realizó del siguiente modo. Se inmovilizaron por separado 1,0 µg de la Zen1 recombinante y 4,0 µg de un antígeno extraído de Dermatophagoides farinae (producido por GREER) en inmunoplacas (producidas por Nalge Nunc International), seguido de 1 hora de bloqueo a 37 ºC usando una solución de bloqueo (preparada añadiendo Tween20 a PBS suplementado con FBS al 10 % hasta una concentración final del 0,05 %). Cada muestra de suero de ratón se diluyó 1000 veces con una solución de bloqueo y después se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar cada inmunoplaca, se hizo reaccionar un anticuerpo monoclonal de cabra marcado con HRP anti-IgG de ratón (producido por ZYMED) diluido 2000 veces con una solución de bloqueo con las mismas. Después de lavar cada inmunoplaca, se añadieron 100 µl de una solución de sustrato enzimático (solución ABTS) a cada pocillo, seguido de 10 minutos de reacción a 37 ºC. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 100 µl de una solución de fluoruro sódico al 0,32 % a cada pocillo. Se midió la absorbancia de cada pocillo a 414 nm usando un inmunolector (BioRad). Después de confirmar la reacción de IgG con el sujeto relevante por ELISA, se determinó que el sujeto era un anticuerpo policlonal contra Zen1.
Se analizó la reactividad de IgG ratón con el anticuerpo policlonal (la Zen1 recombinante) y lo mismo con respecto a cuerpos de ácaro por transferencia de Western. Se prepararon 200 µl de un tampón de muestra de Laemmli (producido por BIO-RAD) añadiendo β-mercaptoetanol hasta una concentración final de 50,0 µl/ml a 100,0 µl de la solución de proteína Zen1 recombinante ajustada a 50 µg/ml y 100,0 µl de la solución de un antígeno extraído de Dermatophagoides farinae. Después de tratamiento por calor a 100 ºC durante 5 minutos, el resultante se aplicó a gel de poliacrilamida (PAGEL; producido por ATTO) con una concentración de gel entre el 5 % y el 20 %. Por tanto, se realizó electroforesis. Después de completarse la electroforesis, el resultante se transfirió a una membrana de
PVDF (Hybond-P; producida por Amersham Biosciences). La membrana se dejó en reposo a 4 ºC durante una noche en una solución de bloqueo (PBST (preparada añadiendo Tween20 a PBS hasta una concentración final del 0,1 %) suplementada con leche desnatada al 5 %). La membrana se lavó con PBST durante 10 minutos. Se diluyó un anticuerpo monoclonal de cabra marcado con HRP anti-IgG de ratón (producido por ZYMED) 20.000 veces con 5 PBST, y después la solución diluida se añadió a la membrana, seguido de 2 horas de reacción a temperatura ambiente. Después de 5 lavados (10 minutos cada uno) con PBST, se añadió la solución de reacción de un sistema de detección de transferencia de Western ECL Plus (producido por Amersham Biosciences) a la membrana, seguido de 5 minutos de reacción a temperatura ambiente. Las señales se detectaron usando película de rayos X (Hyperfilm ECL; producido por Amersham Biosciences). Como resultado, se detectó una señal que indicaba la reacción con
10 Zen1 recombinante con un peso molecular de aproximadamente 60 kDa y una señal que indicaba la reacción con Zen1 de tipo natural con un peso molecular entre 150 kDa y 250 kDa (Fig. 10). Por consiguiente, se confirmó que el ADNc de Zen1 de longitud completa aislado en el Ejemplo 13 codifica dicha proteína alergénica de cuerpos de ácaro con un peso molecular entre 150 kDa y 250 kDa.
15 [Ejemplo 16] Análisis de reactividad con IgE de Zen1 recombinante
Se evaluó la alergenicidad de Zen1 recombinante purificada en el Ejemplo 14 por ELISA. Se inmovilizaron 1,0 µg de Zen1 recombinante en una inmunoplaca (producida por Nalge Nunc International K.K.), seguido de bloqueo a 37 ºC durante 1 hora con una solución de bloqueo (preparada añadiendo Tween20 a PBS suplementado con FBS al 10 % 20 hasta una concentración final del 0,05 %). Se hicieron reaccionar los sueros de nueve perros que dieron positivo en ensayo para Dermatophagoides farinae (sueros de perros que dieron positivo en ensayo para Dermatophagoides farinae confirmado por reacción intracutánea usando una solución antigénica de Dermatophagoides farinae (producida por GREER) diluida 50 veces usando solución salina fisiológica)) con un suero de perro de control negativo. Se añadió GST-FcεRIα marcada con biotina y después se hizo que tuviera lugar una reacción de 25 desarrollo de color mediante la adición de estreptavidina conjugada con peroxidasa (producido por Jackson Immuno Research) y una solución de sustrato enzimático (solución ABTS). La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 100 µl de una solución de fluoruro sódico al 0,32 % por pocillo. Se midió la absorbancia de cada pocillo a 414 nm usando un inmunolector (BioRad). Específicamente, se analizó la reacción de IgE sérica (de nueve perros que habían dado positivo en ensayo para ácaros confirmado por reacción intracutánea de este procedimiento y del
30 perro negativo (control)) a Zen1 recombinante por un sistema ELISA usando FcεRIα recombinante de perro. Como resultado, se confirmaron valores por encima del valor para el perro negativo (indicado con una línea discontinua). Por lo tanto, se confirmó que Zen1 recombinante es una proteína alergénica que reacciona con IgE (Fig. 11).
35 La presente invención hace posible proporcionar alérgenos recombinantes de ácaro seguros y eficaces como agentes terapéuticos o agentes de diagnóstico para enfermedades alérgicas a ácaros, que no contienen impurezas que inducen anafilaxis.
<110> NIPPON ZENYAKU KOGY0 LTD.
<120> Nuevo alérgeno de ácaro 45
<130> PH-2409-PCT
<150> JP2004-116089
<151> 50
<160> 39
<170> PatentIn Ver. 2. 1
<211> 1022
<212> ADN
<213> Dermatophagoides farinae
60 <220>
<221> CDS
<222> (1).. (1020)
<400> 1 65
<210> 2
<211> 340
<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
<400> 2
<210> 3
<211> 13
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 10
<400> 3
15 <210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<400> 4
<210> 5
<211> 14
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
35 <400> 5
<210> 6
<211> 12
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 10
<400> 6
15 <210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
35 <400> 8
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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5
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<210> 11
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 20
<400> 11
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<400> 12
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<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
45 <400> 13
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<213> Secuencia artificial
<220>
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<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
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<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
40 <400> 17
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético 10
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<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220>
<221> base modificada 25 <222>9y21
<223> n representa a, c, g o t
<400> 20
gaygaygtnt traarcarac ngargar 27 30
<210> 21
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220> 40
<221> base modificada
<222> 9, 12 y 21
<223> n representa a, c, g o t 45
<400> 21 gaygaygtnc tnaarcarac ngargar 27
<210> 22 50 <211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 55 <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220>
<221> base modificada
60 <222> 16
<223> n representa a, c, g o t
<400> 22
rttraaraar tcyttngcrt cyttraa 27
5
<210> 23
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220> 15 <221> base modificada
<222>4 y 16
<223> n representa a, c, g o t
<400> 23 rttnagraar tcyttngcrt cytt 24
<210> 24
<211> 24
<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220>
<221> base modificada
<222>7 y 16
<223> n representa a, c, g o t
35 <400> 24 rttraanagr tcyttngcrt cytt 24
<210> 25
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 45
<220>
<221> base modificada
<222>4, 7 y 16
<223> n representa a, c, g o t
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55 <210> 26
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220>
<221> base modificada 65 <222> 10 y 19
<223> n representa a, c, g o t
<400> 26
rttrtcraan acytcrtgng c 21
<210> 27
5 <211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220>
<221> base modificada
<222> 7, 10 y 19 15 <223> n representa a, c, g o t
<400> 27
rttrtcnagn acytcrtgng c 21
<210> 28
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220>
<221> base modificada
<222> 7
<223> n representa a, c, g o t
<400> 28
rttrtcngcr aartcyttrt t 21 35
<210> 29
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220> 45 <221> base modificada
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<223> n representa a, c, g o t
<400> 29
rttrtcngcn agrtcyttrt t 21
<210> 30
<211> 24
<212> ADN 55 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220>
<221> base modificada
<222> 4
<223> n representa a, c, g o t
65 <400> 30 rttngcraar tcytcrttra aytc 24
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<220> 10 <221> base modificada
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<223> n representa a, c, g o t
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<210> 32
<211> 24
<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
25 <220>
<221> base modificada
<222>4 y 19
<223> n representa a, c, g o t
30 <400> 32 rttngcraar tcytcrttna gytc 24
<210> 33
<211> 24 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
- <223>
- Descripción de la secuencia artificial: cebador 40
<220>
<221> base modificada
<222>4, 7 y 19
- <223>
- n representa a, c, g o t 45
<400> 33 rttngcnagr tcytcrttna gytc 24
<210> 34 50 <211> 1518
<212> ADN
<213> Dermatophagoides farinae
<220> 55 <221> CDS
<222> (1).. (1515)
<400> 34
<210> 35
<211> 505
<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
<400> 35
<210> 36
<211> 21
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 10
<400> 36 aattacaaac atgagttaga a 21
<210> 37 15 <211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<400> 37
gaattgttga caatgttcaa a21
25 <210> 38
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<400> 38
gatttcatct ttcaaatctg a 21 35
<210> 39
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 40
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
<400> 39 45 cttttccaat acatcctggg c 21
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. El siguiente alérgeno recombinante de ácaro (a) a (c) que tiene actividad alergénica de ácaro:5 (a) un alérgeno recombinante de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35;(b) un alérgeno recombinante de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35, excepto en que se han delecionado de 1 a 10 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35; o10 (c) un alérgeno recombinante de ácaro que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35 calculada usando BLAST y usando parámetros por defecto.
- 2. Un gen que (1) codifica el siguiente alérgeno de ácaro (a) a (c) que tiene actividad alergénica de ácaro: 15
- (a)
- un alérgeno de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35;
- (b)
- un alérgeno de ácaro que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35, excepto en que se han delecionado de 1 a 10 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 35; o
- (c)
- un alérgeno recombinante de ácaro que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85
20 % de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 35 calculada usando BLAST y usando parámetros por defecto; o- (2)
- comprende el siguiente ADN (d) o (e):
- (d)
- un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº 34; o
- (e)
- un ADN que codifica una proteína que tiene actividad alergénica de ácaro y que hibrida en condiciones
25 rigurosas con un ADN que comprende una secuencia complementaria a la del ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 34, en donde el ADN (1) hibrida en presencia de NaCl 0,7 M a 1,0 M a 68 ºC usando un filtro sobre el cual se ha inmovilizado ADN y lavando con el uso de solución SSC 0,1 a 2 x a 68 ºC, o(2) puede formar un híbrido cuando se transfiere a y inmoviliza en una membrana de nitrocelulosa por el método de transferencia de Southern y después se deja reaccionar durante la noche a 42 ºC en un tampón de30 hibridación de formamida al 50 %, SSC 4 x, HEPES 50 mM (pH 7,0), solución de Denhardt 10 x y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón. - 3. El alérgeno de ácaro de acuerdo con la reivindicación 1 parte (c) o el gen de acuerdo con la reivindicación 2 parte(c), en donde el nivel de homología es de al menos el 90 %. 35
- 4. El alérgeno de ácaro o gen de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el nivel de homología es de al menos el 95 %.
-
- 5.
- El alérgeno de ácaro o gen de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el nivel de homología es de al menos el 40 97%.
- 6. Un vector recombinante, que contiene el gen de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
-
- 7.
- Una proteína de fusión, que está compuesta por el alérgeno de ácaro de acuerdo con una cualquiera de las 45 reivindicaciones 1 y 3 a 5 y otra proteína.
- 8. Una célula bacteriana, de levadura, de insecto o animal, que se transforma usando el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6.50 9. Un método para producir un alérgeno recombinante de ácaro, que comprende cultivar la célula bacteriana, de levadura, de insecto o animal de acuerdo con la reivindicación 8 en condiciones en que el gen pueda expresarse, hacer que la célula produzca un alérgeno recombinante de ácaro, y después recoger el alérgeno recombinante de ácaro.55 10. Un método para producir un alérgeno recombinante de ácaro, que comprende cultivar una célula bacteriana, de levadura, de insecto o animal que está transformada con un vector recombinante que contiene un gen que codifica una proteína de fusión entre el alérgeno de ácaro de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5 y otra proteína en condiciones en que el gen pueda expresarse, hacer que la célula produzca un alérgeno recombinante de ácaro de fusión, recoger el alérgeno recombinante de ácaro de fusión y después eliminar la otra proteína fusionada al60 alérgeno.
- 11. Un agente terapéutico para enfermedades alérgicas a ácaros, que contiene como principio activo el alérgeno recombinante de ácaro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, o la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7.
- 12. Un agente de diagnóstico para enfermedades alérgicas a ácaros, que contiene como principio activo el alérgeno recombinante de ácaro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, o la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7.5 13. Un anticuerpo contra el alérgeno de ácaro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5.
- 14. El anticuerpo contra el alérgeno de ácaro de acuerdo con la reivindicación 13, que es un anticuerpo monoclonal.
-
- 15.
- Un hibridoma, que produce el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 14. 10
- 16. Un método de inmunoensayo para un alérgeno de ácaro en polvo doméstico, que usa el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.
-
- 17.
- El método de inmunoensayo para un alérgeno de ácaro en polvo doméstico de acuerdo con la reivindicación 16, 15 que es el método ELISA.
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