KR100274321B1 - 데르마토파고이디즈(집 먼지 진드기)의 알레르기 항원의 클로닝 및 서열결정 - Google Patents

데르마토파고이디즈(집 먼지 진드기)의 알레르기 항원의 클로닝 및 서열결정 Download PDF

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콰-얀 츄아
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스미드 이. 그레이엄
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Abstract

본 발명은 데르마토파고이디즈 화리나 또는 데르마토파고이디즈 프테로니시누스의 알레르기 항원 단백질이나 알레르기 항원 단백질의 에피트프를 암호하는 DNA 분리물에 관한것이다. 상기 분리된 알레르기 항원 단백질이나 펩티드는 데르마토파고이디즈 화리나 또는 데르마토파고이디즈 화리나 또는 데르마토파고이디즈 프테로니시누스의 알레르기 항원 단백질의 에피토프를 포함한다. 또한 그것의 진단 및 치료조성물 및 그것의 사용방법을 포함한다.

Description

[발명의 명칭]
데르마토파고이디즈(집 먼지 진드기)의 알레르기 항원의 클로닝 및 서열 결정
[발명의 상세한 설명]
[배경 기술]
최근의 보고서에 의하면 집 먼지 진드기 알레르기에 있어서 그룹 I 및 그룹부 Ⅱ의 알레르기 항원에 대한 반응이 매우 중요하다고 알려지고 있다. 예를 들면 환자의 60% 이상이 상기 단백질들에 대해 생성된 항-진드기 항체를 50% 이상 갖고 있는 것으로 보고되었다(Lind, p등., allergy, 39: 259-274(1984); van der zee, J.S. 등, J.Allergy Clin. Immunol., 81: 884-896(1988)).
소아의 경우 더 큰 반응성을 나타낼 수도 있다(Thompson, P.J. 등., Immunology, 64:311-314(1988)). 데르마토파고이디즈(디.) (Dermatophagoides)속에 속하는 진드기에 대한 알레르기 반응은 천식, 비염 및 전위성 피부염과 같은 증상과 관련이 있다. 2개종, 즉 디. 프테로니시누스(D.pteronyssinus)와 디.화리나(D. farinae)가 주요한 것들이며, 결국 이 2개종에 의해 생산된 알레르기 항원을 동정하려는 시도가 지속적으로 행해져 왔다. 디. 프테로니시누스 진드기들은 서유럽 및 오스트레일리아의 집먼지중에 가장 일반적으로 존재하는 데르마토파고이디즈종이다. 디.화리나 종은 북미 및 일본 등지의 기타 지역에 주로 분포하는 종류이다(Wharton. G. W., J. Medical Entom 12: 577-621(1976)). 상기 속에 속하는 진드기류에 대한 알레르기 반응이 천식, 비염 및 전위성 피부염 같은 질환과 밀접한 관련이 있다는 것은 오랫동안 인지되어 왔다. 그러나, 이들 진드기류에 의해 생산된 알레르기 항원중 어느 종류가 알레르기 반응 및 관련 증상을 유발하는 역할을 하는지는 분명하지 않았다.
[본 발명의 요약]
본 발명은 데르마토파고이디즈((디.)집 먼지 진드기)의 알레르기 항원 단백질 또는 데르마토파고이디즈 속에 속하는 집먼지 진드기의 알레르기 항원 단백질의 에피토프를 적어도 한개 포함하고 있는 펩티드를 암호하는 분리된 DNA에 관한 것이다. 특히 디. 화리나 종의 주요 알레르기 항원(Der f I 및 Der f Ⅱ라고 명명함)또는 이들 주요 알레르기 항원의 일부(즉, Der f I 또는 Der f Ⅱ의 에피토프중 적어도 하나를 포함하는 펩티드)를 암호하는 DNA에 관한 것이다. 또한 본 발명은 특히 Der p I과 Der p Ⅱ로 명명된 디프테로니시누스의 주요 알르레기 항원 또는 이들 주요 알레르기 항원의 일부(즉, Der p I 또는 Der p Ⅱ의 에피토프중 적어도 하나를 포함하는 펩티드)를 암호하는 DNA에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분리된 데르마토파고이디즈(즉, 디. 화리나, 디. 프테로니시누스) DNA에 의해 암호된 단백질 및 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드들은 디.화리나 알레르기 항원의 에피토프중 적어도 하나(즉, Der f I 또는 Der f Ⅱ의 에피토프중 적어도 하나) 또는 디. 프테로니시누스 알레르기 항원의 에피토프중 적어도 하나(즉, Der p I 또는 Der p Ⅱ의 에피토프중 적어도 하나)를 포함하고 있다. 또한 본 발명은 디.화리나 단백질 또는 펩티드에 대해 특이적인 항체 및 디. 프테로니시누스 단백질 또는 펩티드에 특이적인 항체에 관한 것이다.
본 발명의 데르마토파고이디즈 DNA, 단백질 및 펩티드들은 진단 및 치료용으로 유용하다. 예를 들면 디.화리나 단백질 또는 펩티드 분리물을 사용하여 집 먼지 진드기에 대한 개체의 감응성을 검출할 수 있으며, 개체에 치료적 유효량의 디. 화리나 단백질 또는 펩티드를 투여함으로써 개체의 감응성을 치료(감응성을 감소시키거나 탈감작 시킨다)할 수 있다. 예를 들면, Der f I 또는 Der f Ⅱ와 같은 디. 화리나 알레르기 항원 단백질 분리물을 표준방법을 사용하여 개체에 주기적으로 투여하여 개체를 탈감작시킬 수 있다. 또는, Der f I 또는 Der f Ⅱ의 에피토프중 적어도 하나를 포함하는 펩티드를 상술한 용도로 투여할 수 있다. Der p I 또는 Der p Ⅱ와 같은 디. 프테로니시누스 알르레기 항원 단백질 분리물은 Der f I 또는 Der f Ⅱ에 대해 제시한 바와 같은 방법으로 투여할 수 있다.
이와 유사하게 상술한 목적을 위해 적어도 하나의 Der p I 에피토르 또는 적어도 하나의 Der p Ⅱ 에피토르를 포함하는 펩티드를 투여할 수 있다. 이들 단백질 또는 펩티드로 구성된 조합물(즉, Der f I 및 Der f Ⅱ; Der pI 및 Der pⅡ; 또는 Der f 와 Der p 단백질 두 종류 모두로 구성된 혼합물)을 또한 투여할 수 있다. 이와 같은 단백질 분리물이나 펩티드를 사용함으로써 주요 집먼지 진드기 알레르기 항원에 대해 개체를 탈감작 시키는 수단이 제공된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 DNA 서열 결정법의 개요도와 함께 클론 λgt11 f1의 cDNA 삽입체의 제한효소 지도를 나타낸 것이다. 화살표는 서열을 해독하는 방향을 나타낸 것이다.
제2도는 cDNA λgt11 f1의 뉴클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 윗쪽의 번호는 뉴클레오티드 위치이다. 좌측의 번호는 아미노산 위치이다. 양의 정수로 나타낸 아미노산 잔기 번호들은 트레오닌에서 시작하여 성숙 상태로 분비된 Der f I의 서열에 해당한다. 음의 정수로 나타낸 서열번호들은 시그날 펩티드와 Der f I의 전효소(proenzyme)영역이다. 화살표들은 각각 전효소 서열 및 성숙 Der f I의 개시부를 나타낸 것이다. 밑줄친 잔기 -81 내지 -78은 전효소를 형성하기 위해 제안된 절단부위를 구성하며, 밑줄친 53-55는 잠재적인 N-글리코실화 부위를 나타낸 것이다. 또한 종결 코돈 TGA와 인접한 폴리아데닐화 시그날을 밑줄로 표시했다. 아미노산 잔기 1-28은 통상의 아미노산 서열 결정 분석법으로 결정된 공지의 트립신 분해성 펩티드서열에 해당한다.
제3도는 성숙 Der P I 단백질과 성숙 Der f I 단백질의 아미노산 서열을 함께 배열한 것이다. 서열 위쪽의 번호 표시는 Der f I에 해당한다. 별표는 최대의 배열(maximal alignment)을 위해 삽입된 갭부분을 나타낸 것이다. 기호(.)는 해당 위치에서 Der f I의 아미노산 잔기가 Der P I의 상응하는 아미노산 잔기와 동일함을 표시하기 위해 사용한 것이다. 화살표들은 Der p I과 Der f I의 활성부위를 구성하는 잔기들을 나타낸 것이다.
제4도는 Der f I의 프리-펩티드 영역(pre-peptide regions)과 프로-펩티드 영역(pro-peptide regions)내의 아미노산 서열과 래트의 카뎁신 H, 래트의 카뎁신 L, 파파인, 알루레인, CP1, CP2, 래트의 카뎁신 B, CTLA-2, MCP, Der p I과 악티니딘의 상응하는 아미노산 서열을 비교한 것이다. 점선으로 표시한 갭들은 최대 배열을 위해 첨가시켰다. 이중 별표는 상기 전효소들중 80% 이상이 공유하고 있는 보존된 아미노산 잔기를 나타낸 것이다; 단일 별표는 상기 서열중 55% 이상 보존된 잔기를 나타낸 것이다. 기호(.)는 상기 전효소 부위중 90%이상이 공유하고 있는 반보존된 등가 아미노산을 표시하기 위해 사용했다.
제5도는 6-잔기 윈도우를 사용해 Mac Vector Sequence 분석용 소프트웨어(IBI, New Haven)로 계산된 호프-우드(Hopp-Woods) 연산법을 사용해 얻어진 Der p I 성숙 단백질의 친수성 플로트와 Der f I 성숙 단백질의 친수성 플로트를 나타낸 것이다. 양의 값은 비교적 친수성인 것을 의미하며 음의 값은 비교적 소수성인 것을 나타낸다.
제6도는 Der f Ⅱ cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열이다. 오른쪽에 표시한 번호들은 뉴클레오티드 위치이며, 윗쪽에 표시한 번호들은 아미노산 잔기들이다. 종결 시그날(TAA)는 밑줄로 표시했다. 처음 8개 뉴클레오티드들은 상기 cDNA를 제조하기 위해 Der p Ⅱ 서열에 기초해 제조한 올리고뉴클레오티드 프라이머에서 유래한 것이다.
제7도는 cDNA λgt11 p1(13T)의 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열이다. 우측에 기재한 번호들은 뉴클레오티드 위치이고, 윗쪽의 번호들은 아미노산 위치이다. 양수로 표시된 아미노산들은 트레오닌으로부터 시작하여 성숙한 상태로 분비된 Der p I 서열에 해당한다.
제8도는 상기 서열 자료로부터 컴퓨터를 이용해 얻은 Der f Ⅱ cDNA의 제한 효소 지도이다. 유사하게 얻은 Der p Ⅱ의 지도를 비교용으로 제시했다. 보존된 일반적인 제한 효소 부위가 거의 없다. 별표로 표시된 부위들은 클로닝 과정으로 도입된 것들이다.
제9도는 Der f Ⅱ와 Der p Ⅱ cDNA 서열들을 일렬 배열한 것이다. 우측의 번호들은 뉴클레오티드 위치이며, 윗쪽 번호들은 아미노산 잔기들의 위치이다. 위쪽 줄은 Der p Ⅱ 뉴클레오티드 서열을 제시하였고 두번째 줄은 Der p Ⅱ 아미노산 잔기들은 제시하였으며 그 다음 두줄은 이들 서열에 대한 Der f Ⅱ의 차이점을 보여준다.
제10도는 6-잔기 윈도우를 사용해 Mac Vector Sequence 분석용 소프트웨어(IBI, New Haven)를 사용해 계산한 호프-우드 연산법을 사용해 얻은 Der f Ⅱ 와 Der p Ⅱ의 친수성 플로트를 나타낸 것이다.
제11도는 Der p I 단백질내의 다형성을 보여주는 5개의 Der p I 클론(a)-(e)들의 아미노산 서열들을 함께 일렬로 배열한 것이다. 번호표시는 Der p I(a) 클론의 서열에 대한 것이다. 기호(-)는 Der p I 클론의 아미노산 잔기가 해당 위치에서 Der p I(a)의 상응하는 아미노산 잔기와 동일함을 표시하기 위해 사용했다. 5개의 다형성 아미노산 잔기들이 5개의 서열 내에서 발견되었으며, 이 클론들의 아미노산 서열로부터 Der p I내에 상당한 변이가 이루어질 수도 있음을 알 수 있다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 집 먼지 진드기 데르마토파고이디즈의 알레르기 항원을 암호하는 뉴클레오티드 서열 및 그로부터 암호된 데르마토파고이디즈 단백질이나 데르마토파고이디즈 알레르기 항원의 에피토프를 하나 이상 포함하는 펩티드에 관한 것이다. 특히 본 발명은 디. 화리나의 주요 알레르기 항원, (예, Der f I 또는 Der f Ⅱ) 또는 Der f I 또는 Der f Ⅱ의 에피토프를 하나이상 포함하는 펩티드를 적합한 숙주내에서 발현시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 또한 본 발명은 디. 프테로니시누스의 주요 알레르기 항원, (예, Der p I 또는 Der p Ⅱ) 또는 Der p I 또는 Der p Ⅱ의 에피토프를 하나이상 포함하는 펩티드를 적합한 숙주내에서 발현시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 상기 데르마토파고이디즈 뉴클레오티드 서열은 그것과 하이브리드하고 다른 진드기 알레르기 항원, 특히 디.화리나 또는 디.프테로니시누스 알레르기 항원을 암호하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위한 프로브로서 유용하다. 또한, 본 발명은 디.화리나 단백질-암호 뉴클레오티드 서열 또는 디. 프테로니시누스 단백질-암호 뉴클레오티드 서열에 하이브리드하지만 집 먼지 진드기의 다른 유형 또는 다른 종, 즉 디.마이크로세라스(예, Der m I 및 Der m Ⅱ)의 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
상기 암호된 데르마토파고이디즈 진드기 알레르기 항원 또는 하나이상의 데르마토파고이디즈(Der f I 또는 Der f Ⅱ; Der p I 또는 Der p Ⅱ) 에피토프를 포함하는 펩티드는 진단용(예를 들어, 항원으로서) 및 치료용(예, 환자의 탈감작을 위해)으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 암호된 집 먼지 진드기 알르레기 항원은 디.마이크로세라스 단백질 또는 펩티드와 같이, Der f 또는 Der p 알레르기 항원과 같은 항원성을 나타내거나 이와 교차 반응성이 있는 단백질 또는 펩티드일 수 있으며; 이들은 일반적으로 높은 아미노산 상동성을 지닌다.
따라서, 본 발명은 또한 데르마토파고이디즈 알레르기 항원(예, Der f I 알르레기 항원, Der f Ⅱ 알레르기 항원; Der p I 또는 Der p Ⅱ 알르레기 항원 또는 그것과 교차 반응성을 갖는 기타 디. 알르레기 항원) 또는 데르마토파고이디즈 알레르기 항원(Der f I, Der f Ⅱ, Der p I, Der p Ⅱ 또는 그것과 교차 반응성을 갖는 디, 알르레기 항원)의 에피토프를 하나이상 포함하는 펩티드를 각각 또는 조합하여 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 치료용(예, 탈감작)으로 사용될 수 있다. 후술하는 바와 같이, 집 먼지 진드기의 주요 알레르기 항원을 암호하는 DNA를 분리 및 서열 분석했다. 특히, 실시예에서 더욱 구체적으로 기술하고 있는 바와 같이, Der f I 알르레기 항원과 Der f Ⅱ 알레르기 항원을 각각 암호하는 2개의 cDNA 클론을 분리하여 서열 분석했다. Der p I 및 Der p Ⅱ의 뉴클레오티드 서열도 또한 결정했다. 상기 클론 각각의 뉴클레오티드 서열을 그 각각의 예상 아미노산 서열을 가지고 있는 관련 진드기 디. 프테로니시누스의 동종 알레르기 항원(각각 Der p I 및 Der p Ⅱ)의 뉴클레오티드 서열과 비교했다.
이하에서는 Der f I 알레르기 항원을 암호하는 두개의 cDNA클론을 분리 및 서열 분석하고, 상응하는 디,프테로니시누스의 알레르기 항원과 비교하였으며, 이 뉴클레오티드 서열과 암호된 생성물을 진단 또는 치료용으로 사용하는 것에 대해 기술하였다.
[Der f I의 분리 및 서열 분석]
집 먼지 진드기 디. 화리나의 주요 알레르기 항원인 Dr f I을 암호하는 cDNA 클론을 분리하고 서열 분석했다. 클론의 cDNA 삽입체에 대한 제한 효소 지도와 DNA 서열분석의 전략이 제1도에 나타나 있다. 이 Der f I cDNA 클론은 전형적인 시그널 펩티드, 전효소 영역 및 Der f I 성숙 단백질을 암호하는 1.1-kb cDNA 삽입체를 포함한다. 이 생성물은 321 아미노산 잔기로서, 18잔기의 추정시그널 펩티드, 80잔기의 전효소(전-펩티드)영역 및 223 잔기의 성숙 효소 영역을 포함한다. 유도된 분자량은 25,191이다. Der f I cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 예상 아미노산 서열은 제2도에 나타내었다. 추정된 아미노산 서열은 전 효소영역 뿐만 아니라 성숙 단백질에 있어서, 다른 시스테인 프로테아제와 높은 상동성을 갖는 것으로 나타났다. Der f I 성숙 단백질 및 관련된 진드기 디. 프테로니시누스(제3도)로부터의 동종 알레르기 항원 Der p I의 서열 배열은 단백질 단계에서의 예비 서열 분석으로 예상했던 바와 같이, 두 단백질 사이에 높은 상동성(81%)을 나타냈다. 특히, 상기 효소의 활성 부위를 구성하고 있는 잔기는 보존적이며 유력한 N-글리코실화 부위는 상기 두 진드기 알레르기 항원에 있어서 동일 위치에 존재한다.
보존된 시스테인 잔기 쌍(31, 71)과 (65, 103)(Der p I에 대한 번호임)은 역시 추가의 이황화 결합을 지니는 파파인과 악티니딘의 입체 구조와 Der p I 및 Der f I의 입체 구조가 유사하다는 가정을 근거로 하여, 이황화 결합 형성과 관련이 있음이 명백하다. 파파인과 악티니딘에 있어서 상동한 시스테인 잔기가 있는 5번째 및 최종 시스테인 잔기가 활성부위 시스테인(Der f I의 잔기 35)이다. Der p I과 Der f I에 존재하는 두개의 여분의 시스테인 잔기는 세번째 이황화 결합 형성과 관련이 있는 것 같다.
또한 Der p I에 있어서 유력한 N-글리코실화 부위는 Der f I에서도 동등한 위치에 존재하머, 상기 트리펩티드 부위의 중요한 첫번째 및 마지막 잔기는 보존된다. Der f I과 Der p I의 글리코실화 정도는 아직 결정되어야 한다. 만노즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코사민 및 N-아세틸갈락토스아민을 비롯한 탄수화물이 상기 진드기 알레르기 항원의 정제된 제제에서 보고되어 왔다(채프만, 엠.디., J.Immunol., 125:587-592(1980); 울덴, 에스, 등, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 68: 144-151(1982))
처음 30개의 N-말단 아미노산 잔기에 대한 성숙 Der p I과 Der m I(70%) 및 성숙 Der f I과 Der m I(97%)사이의 상동성 정도를 종래의 아미노산 서열 분석법에 의해 결정했으며(플랫츠-밀스 TAE등, Mite Allergy, a World-Wide Problem, 27-29(1988); 린드, 피. 와 엔. 호온, Mite Allergy, a World-Wide Problem, 30-34(1988)), 성숙한 Der m I 전체 서열이 진드기 그룹 I 알레르기 항원간에 전체적으로 70-80%의 상동성을 갖는 것으로 확인할 것으로 보인다. Der m I은 디. 마이크로세라스의 알레르기 항원이다. 잔기 -23 내지 -1에 걸쳐 Der p I 과 Der f I의 전효소 부위 사이의 높은 상동성 (91%) 및 Der f I의 구조 분석 결과는 그룹 I 알레르기 항원은 상동한 구조 그리고 적어도 전-펩티드에 있어서는 상동한 조성의 성숙 단백질의 N-말단 연장 펩티드를 가질 것으로 예상된다.
시그널 서열을 고안함에 있어 상세한 구조에 대한 연구로 지금까지 3가지의 구조상 상이한 영역을 확인했다: 양전하의 N-말단(n) 영역, 중앙의 소수성(h) 영역 및 절단 부위를 규정하는 것으로 보이는 극성의 C-말단(c) 영역 (폰 헤인, 쥐., EMBO J., 3: 2315-2323(1984); Eur. J. Biochem., 133:17-21 (1983); J. Mol. Biol., 184: 99-105(1985)). Der f I의 시그널 펩티드 분석 결과 이 펩티드도 상기 영역을 포함하는 것으로 나타났다(제4도). n-영역은 길이와 조성에 있어서 매우 다양하지만 그것의 총 전하는 총 길이에 따라 크게 변하지 않으며 평균 약 +1.7이다. 두잔기의 길이를 지닌 Der f I 시그널 펩티드의 n-영역은 개시인자 메티오닌(프로밀화되지 않았으며 따라서 진핵세포에서는 양 전하를 띰)과 인접한 리신(Lys) 잔기에 의해 총전하 +2를 갖는다. Der f I의 h-영역은 소수성 잔기가 많음으로써 이 영역의 특징인 소수성을 나타내게 되며, 단 하나의 친수성 잔기인 세린(Ser)이 존재한다. Der f I c-영역의 총 아미노산 조성은 h-영역보다 더 극성을 지니며 이것은 잔기 -6과 -5 사이에 위치한 h/c 경계 부위의 시그널 서열에서도 발견되는데, 상기 잔기 위치는 진핵세포에 있어서의 평균 위치이다. 따라서, Der f I 전-펩티드 서열은 작용성 시그널 서열에 적합한 요건을 충족하는 것으로 나타났다
Der f I과 다른 시스테인 프로테아제의 시그널 서열이 구조적 상동성, 즉 모두 n, h 및 c-영역으로 구성되지만, 전체적인 길이 및 아미노산 서열 면에서는 아주 다양하며 이는 제4도에 명백하게 나타내었다. 그러나, 시스테인 프로테아제 전구체의 전효소-영역 사이에서는 높은 서열 상동성이 나타났다.(이시도, 케이.등, FEBS Letters, 226:33-37(1987)). Der f I과 다수의 기타 시스테인 프로테아제의 전효소 영역의 정렬(제4도)은 이들 전효소 영역이 다수의 보존 잔기를 공유할 뿐만 아니라 상기 서열의 1/2 이상에 존재하는 반-보존 잔기도 공유하는 것을 나타냈다. 발린(Val), 이소로이선(Ile) 및 로이신(Leu) (작은 소수성 잔기) 또는 아르기닌(Arg) 및 리신(양전하 잔기)같은 보존전 아미노산이 동일한 것으로 간주될 경우 이러한 상동성은 더 증가되었다. Der f I 전효소 영역은 7개의 보존성이 높은 아미노산 중 6개 아미노산을 보유하며 그 잔기들은 모두 보존적 변화 부위에 있다. 보존성이 낮은 부위일수록 상동성이 낮았다. 전-펩티드내의, 특히 높은 보존성 잔기들의 상동성은 이들 서열이 아마도 구조 및 작용 유사성을 지닐 것이라는 것을 나타내므로 이러한 효소들의 프로세싱(processing)에서 전-펩티드의 기능을 생각할 때 중요할 수도 있다.
Der f I 및 Der p I상의 고도로 교차 반응성인 B세포 에피토프가 마우스, 토끼 및 사람 혈청에 존재하는 항체를 사용함으로써 증명되었다(Heymann, P.W. 등, J. Immunol. 137: 2841-2847(1986); Platts-Mills, TAE 등, J. Allergy Clin. Immunol., 78:398-407(1986)). 그러나 종-특이적 에피토프도 또한, 이들 시스템에서 규정되었다. 쥐의 단일 클론 항체들은 종-특이적 항원 결정기에 주로 결합하였다(Platts-Mills TAE 등, J. Immunol., 139: 1479-1484(1987)). 토끼 항-Der p I 반응성의 약 40%는 Der p I에 고유한 에피토프에 의한 것으로 생각되며 (Platts-Mills, TAE 등, J. Allergy Clin. Immunol., 78:398-407 (1986)), 비록 대부분의 항체들은 교차 반응성 에피토프에 결합하지만, 알레르기성 사람으로부터 유래하는 항체들의 일부 종-특이적 결합이 관찰되었다(Platts-Mills TAE 등, J. Immunol., 139: 1479-1484(1987)).
토끼 항-Der p I 항혈청에 의해 인식되는 B세포 에피토프를 포함하는 재조합 Der p I의 5개의 항원성 영역을 규정하기 위해서, 유전자 단편화 및 형질 발현과 같은 재조합 DNA 기술을 시용하였다(Greene, W. K. 등, Immunol.(1990). 면역 흡착 기술을 사용한 결과, 이들 추정되는 에피토프들중 3개는 Der f I(아미노산 잔기 34-37, 60-72 및 166-194를 포함하는 영역에 위치)와 공유되는 것으로 나타난 반면, 2개는 Der p I(영역 82-99 및 112-140)에 특이적인 것으로 나타났다. 토끼 항-디. 화리나(antk-D. farinae)에 대한 이들 펩티드들의 반응성에 있어서의 차이는 교차-반응성 에피토프와 종-특이적 에피토프로 나눈 상기 분류를 지지하는 것이다. Der p I과 Der f I 단백질 사이에 나타나는 서열상의 차이는, 파파인과 악티니딘의 2차 및 3차 구조(Baker, E.N. 및 J. Drenth, In: Biological Macromolecules and Assemblies, Vol. 3 pp. 314-368, John Wiley 및 Sons, NY. (1987))로부터 예측되는 바와 같이, 나선구조 D (잔기 127-136)를 포함하는 상기 효소의 2개의 도메인을 연결시키는 하나의 연장된 표면 루프(잔기 85-136) 뿐만 아니라, N 및 C말단 영역중에 주로 위치한다. 이들 잔기들이 표면에 위치한다는 것은, 표면에 노출되어 있을 것으로 예측되는 이 영역이 주로 친수성이라는 것을 도시하는 제5도에서의 Der p I 및 Der f I에 대한 친수성 플로트에 의해서 확증된다. 또한, 이 영역은 토끼 항-Der p I 혈청(상기 참조)에 의해 인식되는 2개의 종-특이적 B세포 에피토프를 포함한다. 교차 반응성 에피토프들을 포함하는 상기 영역들에 있어서의 서열 분석은 교차 반응성 에피토프중 2개(영역 34-47 및 60-72에 위치)가 Der p I과 Der f I 사이에 완전하게 보존된다는 것을 나타냈으며, 한편 세번째의 교차 반응성 에피토프를 포함하는 영역(영역 166-194의 잔기)내의 잔기들 대부분도 보존되었다.
이. 콜리(E. coli)에서의 예비(pre)-전(pro)-Der f I 단백질의 생산에 있어서의 형빌 발현 결과는, 재조합 Der p I 보다 더 큰 용해성, 안정성 및 항원성을 갖는 재조합 단백질을 산출하였다. Der f I cDNA에 의해 암호화된 단백질은 pGEX 벡터를 사용하여 형질 발현시켰으며, 방사능 면역 측정법으로 분석한 결과 토끼 항-디. 화리나 항체들과 반응하는 것으로 나타났다.
가용성인 Der f I 알레르기 항원과 항원성 유도체들을 높은 수율로 얻을 수 있으므로, 진단 및 치료제의 개발 및 B와 T 세포 항원 결정부의 지도작성이 용이하게될 것이다.
재조합 Der f I의 완전한 아미노산 서열을 이용하여, 면역계중의 B와 T세포 구획부 양자에 의해서 인식되는 에피토프에 대하여 지도 작성을 할 수 있다. 중첩하는 합성 펩티드의 선별과 같은 기술의 사용 및, 단일 클론 항체들의 사용, 그리고 유전자 단편화 및 형질 발현을 이용하면, Der f I의 연속적 및 지형적 에피토프를 확인할 수 있다. 알레르기 항원(IgE-결합) 결정기가 항원(IgG-결합)결정기와 공통적인 특징을 갖는지 그리고 그와는 본질적으로 다른지의 여부 및, T세포가 B세포에 의해 인식되는 것들과는 다른 독특한 에피토프들을 인식하는지의 여부를 결정하는 것이 특히 유용할 것이다. 진드기에 알레르기성인 사람이 IgE 항체들과 반응성인 Der f I 에피토프들을 확인하기 위한 연구 및, 이들을 Der p I과 교차 반응성인 결정기와 Der f I에 독특한 결정기에 분류하는 것도 또한 수행될 수 있다. 2가지 중의 어느 한가지에 대하여 특이적인 B세포(및 T세포)는 다른 진드기 종에 대한 반응성을 측정하는 유용한 진단 시약을 제공하는데 사용할 수 있으며, 한편, 교차 반응성 에피토프들은 공통적인 면역 치료제로서 사용될 수 있다.
참조 문헌으로서 본원에 기재하는 공 계류중인 미합중국 특허 출원 일련 번호 제458, 643호에 기재된 바와 같이, 진드기 알레르기 항원의 분자적 클로닝은 0.8 kb cDNA삽입물을 포함하는 Der p I를 암호화하는 cDNA클론을 분리시켰다. 서열 분석 결과, 222 아미노산 잔기의 숙성된 재조합 Der p I 단백질은 악티니딘, 파파인, 카뎁신 H 및 카뎁신 B를 포함하는 시스테인 프로테아제의 일군과 상당한 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
[Der f Ⅱ의 분리 및 서열 분석]
집 먼지 진드기인 디. 화리나(D. farinae)로부터 유래하는 주요 알레르기 항원인, Der f Ⅱ를 암호화하는 cDNA 클론을, 실시예 2에 기재된 바와 같이 분리하여, 서열 결정하였다. Der f Ⅱ cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열을 제6도에 나타낸다. Der f Ⅱ를 암호화하는 클론의 cDNA 삽입물에 대한 제한 효소 지도를 제8도에 나타낸다.
제9도는 Der f Ⅱ와 Der p Ⅱ cDNA 서열을 배열한 것이다.
Der f Ⅱ 및 Der p Ⅱ사이의 서열 상동성(88%)은 Der f I 및 Der p I사이에서 발견되는 81% 상동성 보다 더 크며, chi2분포도 상당히 다르다(p＜0.05). 이에 대한 이유는 단지 그룹 I의 알레르기 항원들이 더욱 크고, 각각의 잔기들은 그 분자의 구조 및 기능에 있어서 보다 중요하지 않기 때문이다.
예컨대, 다른 종류의 시스테인 프로테아제와 상기 알레르기 항원들이 유사한 구조를 채택한다고 가정하는 경우, DerpI과 Derf I의 아미노산 차이의 대부분은 그 분자들의 2개인 도메인 구조를 연결시키는 잔기들중에 존재한다는 것은 공지되어있다. 6개의 시스테인 분자들이 그룹 Ⅱ 알레르기 항원들 사이에 보존되며, 이로써 예상되는 바와 같이, 유사한 이황화 결합을 통하여 전체적으로 높은 상동성을 부여할 것이다. 이들 단백질들의 보존성에 대한 다른 증거는, 암호 서열중의 뉴클레오티드 변화의 34/55가 코돈의 세번째 염기에서 일어나며, 이는 통상적으로 아미노산을 변화시키지 못한다는 사실이다. 이 분자의 작용에 중요할 수도 있는 잔기들은 Ser 57이며, 모든 3염기들이 변화되더라도 이 아미노산은 보존된다. 이와 유사한 현상이 잔기 88에서도 존재하며, 코돈이 완전히 변하더라도 하나의 작은 지방족 잔기는 보존된다. 또한, Der p Ⅱ와 같이, Der f Ⅱ cDNA클론은 비록 3'비암호 영역에 아데노신이 풍부하고, 가능한 폴리아데닐화 시그널인 2개의 ATAA를 갖고 있지만, 폴리 A꼬리부를 갖고 있지 않다. 처음 4개의 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드들은 N-말단 아미노산 서열 결정에 의해 공지된 Der p Ⅱ 와 Der f Ⅱ사이의 상동성으로부터 고안된 PCR 프라이머로부터 만들어진다. C-말단 서열에 기초한 프라이머는 현재 시그널 서열 뿐만 아니라, 상기 염기를 결정하는데 사용될 수 있다.
[상기 목적 알레르기 항원 단백질/펩티드 및 그들을 암호화하는 DNA의 사용 방법]
본 명세서에 기술된 연구로부터 얻어지는 물질, 뿐만 아니라 이 물질을 함유하는 조성물은 진드기 알레르기 항원, 특히 디.파리나 및 기타 종(예; 디. 프테로니시누스 및 디.마이크로세라스)과 같은 데르마토파고이디즈(Dermatophagoides)속의 진드기에 대한 알레르기 반응의 진단 방법, 치료 방법 및 예방 방법에 사용될 수 있다. 게다가 cDNA (또는 이로부터 전사된 mRNA)는 기타 유사 서열을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 낮은 통제(stringency) 조건하에서 수행될 수 있으며, 충분한 상동성 (일반적으로 40% 이상)을 가지는 그들 서열은 본 명세서에 기술된 방법을 사용한 또다른 측정을 위해 선택될 수 있다. 한편 높은 통제 조건을 사용할 수 있다. 이런 방식으로, 본 발명의 DNA는 Der f I, DEr f Ⅱ, Der p I 또는 Der p Ⅱ의 서열과 유사한 아미노산 서열을 가지는 진드기 알레르기 항원을 암호화하는 서열을 동정하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 Der f 및 Der p Ⅱ 뿐만 아니라 기타 진드기 알레르기 항원(예; 본 발명의 DNA에 하이브리드화되는 DNA가 암호화하고 있는 기타 진드기 알레르기 항원)을 포함한다.
본 발명의 cDNA가 암호화하고 있는 단백질 또는 펩티드는 예를 들어 "정제된" 알레르기 항원으로서 사용될 수 있다. 그러한 정제된 알레르기 항원은 집먼지 진드기에 대한 알레르기의 진단 및 치료용 시약으로 사용될 수 있는 알레르기 항원 추출물 또는 제제의 표준화에 유용하다. 본 발명의 펩티드의 사용을 통해, 일관되고 잘 정립된 조성 및 생물학적 활성을 가진 알레르기 항원 제제를 만들고, 치료 목적 (예; 집먼지 진드기에 민감한 개체의 알레르기 반응을 변형하기 위해)으로 투여할 수 있다. Der f I 또는 Der f Ⅱ 펩티드 또는 단백질 (또는 하기 기술한 것과 같은 그들의 변형체)은 예를 들면, Dr f I 또는 Der f Ⅱ에 대한 B-세포 반응, Der f I 및 Der f Ⅱ에 대한 t-세포 반응, 또는 양 반응 모두를 변형시킬 수 있다. 유사하게, Der p I 또는 Der p Ⅱ 단백질 또는 펩티드는 Der p I 또는 Der p Ⅱ에 대한 B-세포 및/또는 T-세포 반응을변형시키는데 사용될 수 있다. 정제된 알레르기 항원은 또한 집먼지 진드기, 특히 Der f I, Der f Ⅱ, Der p I 및 Der p Ⅱ에 대한 알레르기의 면역요법의 메카니즘을 연구하는데 사용될 수 있으며, 미변형("자연 발생의") 펩티드보다 면역요법에 더 유용한 변형된 유도체 또는 유사체의 설계에 사용될 수 있다.
교차 반응성이 있는 에피토프, 예를 들어 Der f I 및 Der p I이 공유하는 본 명세서에서 기술되는 3개의 에피토프의 경우에 있어서, 교차 반응성 에피토프를 함유하는 분자의 영역(들)은 그 에피토프를 공유하는 2개 (또는 그 이상의) 진드기종에 대한 알레르기를 치료할 때 투여하기 위한 공통된 면역요법 펩티드로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 교차 반응성 에피토프는 두 알레르기 항원 모두(예: Der f I 및 Der p I 알레르기 항원)에 대한 IgG 차단 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 분자 전체보다는 1가의 항체 에피토프를 함유하는 펩티드가 사용될 수 있으며, 이것은 1가의 항체 에피토프가 비만 세포(mast cell)를 교차 결합시킬 수 없고, 탈감작 치료동안 역반응을 일으킬 수 없기 때문에 유리할 수도 있다. B세포 에피토프를 담체 분자에 부착시켜 알레르기 반응의 T세포 조절을 지휘하는 것 또한 가능하다.
한편, 선택된 테르마토파고이디즈 알레르기 항원에 특이성이 있는 펩티드를 가지는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 본 명세서에서 기술하는 바와 같이, 명백히 Der p I-특이성인 2개의 에피토프가 동정되어 있다. 유사한 접근에 의해 기타의 종-특이성 에피토프 (예; Der p I 또는 Ⅱ, Dr f I 또는 Ⅱ)를 동정할 수 있다. 한 개체내에 종-특이성 에피토프에 대한 항체의 존재는 신속한 혈청학적 시험으로 사용되어 어느 진드기종이 알레르기 반응을 일으키고 있는가를 결정할 수 있게 한다. 이것은 한 개체에 제공되는 요법을 원인이 되는 종에 대해 특이적으로 찾을 수 있게 하고 따라서 치료 효과를 증가시킬 수 있다.
타연구에서는 알레르기 항원의 고투여량이 최상의 결과(즉, 최상의 징후 구제)를 산출함을 보여 주었다. 그러나, 많은 사람들은 알레르기 항원에 대한 알레르기 반응 때문에 알레르기 항원의 고투여량에 견딜 수 없다. 자연 발생의 알레르기 항원의 변형은 상응하는 자연 발생의 알레르기 항원과 동일한 또는 증가된 치료 특성을 가지지만, 감소된 부작용 (특히, 과민 반응)을 가지는 변형된 펩티드 또는 변형된 알레르기 항원을 제조하는 방식으로 설게될 수 있다.
이들은 예를 들면, 본 발명의 펩티드 (예: Der f I 또는 Der f Ⅱ, Der p I 또는 Der p Ⅱ의 아미노산 서열의 모두 또는 일부를 가지는 펩티드)일 수 있다. 한편, 펩티드의 조합물이 투여될 수 있다. 변형된 펩티드 또는 펩티드 유사체 (예; 아미노산 서열이 변경되어 면역원성을 변형시키고 및/또는 알레르기 항원성을 감소시키는 펩티드 또는 같은 목적으로 한 성분이 첨가된 펩티드)가 탈감작 치료법에 사용될 수 있다.
개체가 탈감작되도록 본 발명의 펩티드를 투여하는 것은 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 펩티드 또는 상이한 펩티드들의 조합물은 예를 들어 적당한 완충액, 담체 및/또는 보조제를 포함하는 조성물로 개체에 투여될 수 있다. 상기 조성물은 일반적으로 주사, 흡입, 경피 투여 또는 직장 투여에 의해 투여될 수 있다. 현재 이용가능한 정보를 사용하여, 충분한 양을 민감한 개체에 투여할 때, Der f I 및/또는 Der f Ⅱ에 대한 개체의 알레르기 반응을 변형시킬 수 있는 Der f I 또는 Der f Ⅱ 펩티드를 설게하는 것이 가능하다. 이것은 예를 들어 Der f I 또는 Der f Ⅱ의 구조를 검사하고 집먼지 진드기에 민감한 개체내에서 B-세포 및/또는 T-세포 반응에 영향을 끼치는 능력에 대해 검사할 펩티드를 제조하며 상기 세포들에 의해 인지되는 적당한 에피토프를 선택하므로써 행해질 수 있다. 상기 에피토프들의 서열을 모방하고, Der f I 또는 Der f Ⅱ 알레르기 항원에 대한 알레르기 반응을 감소 조절할 수 있는 합성 아미노산 서열을 만들 수 있다. 본 발명의 단백질, 펩티드 또는 항체는 또한 공지된 방법으로 Der f I 또는 Der f Ⅱ에 대한 알레르기 반응을 검사하고 진단하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 이것은 상기 펩티드와 혈액내의 성분들(예; 항체, T세포, B세포)의 결합이나 상기 성분들을 자극하기에 적당한 조건하에서 상기 알레르기 항원들중의 하나에 대한 감응성이 측정될 개체로부터 얻은 혈액을 분리된 집먼지 진드기의 알레르기 항원성 펩티드와 혼합하여 상기 결합이 일어나는 정도를 결정하므로써 행해질 수 있다. Der p I 및 Der p Ⅱ 단백질 또는 펩티드를 탈감작 시키고 감응성을 진단하는데 유사한 방법으로 사용할 수 있다. Der f 및 Der p 단백질 또는 펩티드를 이 두가지 알레르기 항원형 모두에 민감한 개체를 치료하기 위해 함께 투여할 수 있다.
Der f I 또는 Der f Ⅱ가 집먼지 진드기에 민감한 개체내에서 알레르기 반응을 유도하는 능력을 차단 또는 억제할 수 있는 제제 또는 약제를 설계하는 것도 또한 현재 가능하다. 상기 제제는 예를 들어, 관련된 항-Der f I 또는 Der f Ⅱ IgE에 결합하여 IgE-알레르기 항원 결합 및 비만 세포 탈과립을 방지하는 방식으로 고안될 수 있다. 한편 상기 제제는 면역계의 세포 성분에 결합하여 이들 알레르기 항원에 대한 알레르기 반응의 억제 또는 탈감작을 일으킬 수 있다. 이것의 비제한적 예는 Der f I 또는 Der f Ⅱ 알레르기 항원에 대한 알레르기 반응을 억압하기 위해 적당한 B-세포 및 T-세포 에피토프 펩티드, 또는 본 발명의 cDNA/단백질 구조에 기초한 이들의 변형물을 사용하는 것이다. 이것은 B-세포 및 T-세포 에피토프 펩티드의 구조를 규명함으로써 수행될 수 있는데, 이 구조는 Der f I 또는 Der f Ⅱ-민감성 개체의 혈액 세포를 가지고 시험관내 연구를 실시할때 B-세포 및 T-세포 작용에 영향을 끼친다. 이것은 또한 이들 알레르기 항원에 대한 알레르기 방응을 차단하기 위해 Der p I 또는 Der p Ⅱ에 적용될 수 있다.
Der f I 또는 Der f Ⅱ 또는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩티드를 암호하는 cDNA나 유전자 클로닝과 같은 공지된 기술을 사용하여 추가 펩티드를 제조하는 데에 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩티드를 제조하는 방법은 예를 들어, 선택된 알레르기 항원 단백질 또는 펩티드 (예; Der f I, Der f II 또는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩티드)의 전부 또는 일부를 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 세포들은 DNA 삽입체의 발현 (암호화된 단백질 또는 펩티드의 제조)에 적당한 조건하에서 배양한다. 발현된 생성물을 공지된 기술을 사용하여 회수한다. 한편, 상기 알레르기 항원 또는 이들의 일부를 공지된 기계적 또는 화학적 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 단백질 또는 펩티드라는 용어는 상기 기술들 중의 임의의 것에 의해 만들어진 단백질 또는 펩티드를 말한다. 한편 생성되는 펩티드는 전술한 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 사용된 DNA는 본 명세서에서 기술한 바대로 얻어지는 cDNA이거나 또는 제2도 및 제6도에 나타낸 서열의 모두 또는 일부를 가지는 임의의 올리고데옥시뉴클레오티드 서열, 또는 그들의 작용성 동질체일 수 있다. 상기 올리고데옥시뉴클레오티드 서열은 공지된 기술을 사용하여, 화학적으로 또는 기계적으로 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 서열의 작용성 동질체는 제2도 및 제6도의 서열(또는 상응하는 서열 일부)이 하이브리드화할 수 있는 상보적 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 있거나, 그리고/또는 상기 도면에서 나타낸 서열(또는 상응하는 서열 부분)이 암호화하고 있는 생성물과 동일한 작용성 특징을 가지는 생성물(예: 폴리펩티드 또는 펩티드)를 암호화한다. 작용성 동질체가 하나 또는 양쪽기준을 충족시켜야 하는지는 그 용도에 달려 있다 (예; 그것이 올리고프로브로만 사용된다면, 그것은 첫번째 기준만을 만족시키면 되고, 그것이 집먼지 진드기 알레르기 항원을 제조하는 데에 사용된다면, 그것은 두번째 기준만을 충족시키면 된다).
현재 이용가능한 구조 정보 (예: DNA, 단백질/펩티드 서열)는 또한 디.화리나 알레르기 항원에 대한 알레르기 반응에 중요한 T세포 에피토프 펩티드 및/또는 B세포 에피토프 펩티드를 동정하거나 규명하는데, 그리고 이들 반응을 일으키는 매개체 또는 메카니즘 (예: 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마 인터페론)을 규명하는데 사용될 수 있다. 이 지식은 상기 반응들을 조정하기 위해 사용될 수 있는 펩티드계 집먼지 진드기 치료제 또는 약제를 고안하는 데 사용될 수 있다.
이제 하기 실시예들에 의해 본 발명을 추가로 설명하고자 하면, 그 실시예들로 제한하려고 하는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예 1]
[Der f I를 암호화하는 cDNA의 분리 및 특성규명 재료 및 방법]
[데르마토파고이디즈 화리나 배양물]
진드기는 컴먼웰쓰 세럼 레보러토리즈(Parkville, Australia)에서 구입했다.
[디.화리나 cDNA λgt11 라이브러리의 작제]
디.화리나 진드기 생세포로부터 폴리아데닐화 mRNA를 분리하고 RNase H 방법(Gubler, V.와 B.J.Hoffman, Gene, 25,: 263-269(1983))을 통해 키트(Amersham International, Bucks.)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. EcoRI링커(New Englahd Biolabs, Beverly, MA)를 부가한후 cDNA를 알칼리 포스파타아제 처리된 λgt11 아암(arms) (Promega, Madison, WI)에 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 팩키징(packaging)한후 이.콜리 Y1090(r-)내에서 평판 배양함으로써 2×104재조합체 라이브러리를 제조했다.
[디.화리나 cDNA λgt11 라이브러리로부터 Der f I cDNA클론의 분리]
부위지시성 돌연변이(Chua, K.Y.외 다수의, J.Exp.Med., 167 : 175-182(1988))를 통해 아미노산 잔기 -1과 1사이, 및 잔기 116과 117 사이에 삽입된 2개의 BamHI 제한효소 부위를 지닌 Der p I cDNA 유도체를 BamHI 절단함으로써 생성된 2개의 Der p I cDNA BamHI 단편 1-348 및 349-857을 포함하는 두개의 프로브로 하이브리드화하여 라이브러리를 선별하였다. 상기 프로브를 닉 트랜슬레이션(nick translation)에 의해32P로써 방사능 표지 시켰다. 파지는 150mm의 페트리 디쉬당 20,000pfu씩 평판 배양하고 생성된 플라크를 니트로셀룰로즈(Schleicher and Schull, Dassel, FRG)상에 옮기고, 변성시킨후 고온처리(bake)하였다. (Maniatis, T.외 다수의, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press((1982)). 50% 포름아미드/ 5X SSCE/1X 덴하르트/폴리C(0.1mg/ml)/폴리U(0.1mg/ml)중에서 42℃에서 2시간 동안 예비하이브리드화 시킨 후 42℃에서 하룻밤동안 106cpm/ml씩 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 처리 후, 세정은 실온에서 2X 소듐 클로라이드 시트레이트(SSC)/0.1% 소듐 도데실설페이트(SDS), 0.5X SSC/0.1% SDS, 0.1X SSC/0.1% SDS로써 연속적으로 15분동안 세정하고 최종적으로는 0.1X SSC/1% SDS로 30분 동안 50℃에서 세정하였다.
[λgt11 f 1 cDNA 클론으로부터 DNA의 분리]
급속 분리방법으로 λgt11 f1 클론으로부터 파지 DNA를 제조하였다. 청징화된 파지 플레이트 용균물(1ml)을 2.5M의 NaCl 중의 270μl의 25% wt/vol 폴리에틸렌 글리콜(PEG 6000)과 혼합한후 15분 동안 실온에서 항온처리 하였다. 이어서, 상기 혼합물을 마이크로퓨즈(Eppendorf, FRG) 중에서 5분동안 회전시킨후, 상청액을 제거하였다. 그 펠릿을 1mM의 EDTA 및 100mM의 Nacl(TE)를 함유하는 100μL의 100mM 트리스/HCl(pH8.0) 중에 용해시켰다. 이 DNA 제제는 페놀/TE로써 추출하고, 페놀상은 100μl의 TE로 세정한후, 수득된 수성상을 또 다시 페놀/TE로써 2차례 추출하고, Leder 페놀(페놀/클로로포름/이소아밀알콜; 25:24:1)로써 2회, 클로로포름으로 1회 추출하고 에탄올로 DNA를 침전시켰다.
[DNA 서열결정]
DNA 서열분석을 위한 클론을 수득하고자, EcoRI 제한효소(Pharmacia, Uppsala, Sweden)로써 λgt11 f1 파지 DNA를 절단한후 DNA 삽입물을 EcoRI-절단된 M13-유도된 서열결정 벡터 mp18및 mp19에 결찰시켰다(Maniatis, t.외 다수의, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1982)). E.Coli TG-1를 사용하여 형질전환 시킨 후 디데옥시뉴클레오티드 체인 종결법(Sanger, F. 외 다수의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467(1977))을 통해 시퀘나아제 버젼 2.0 DNA 서열 결졍 킷트(U.S.B., 클리블랜드, 오하이오)를 사용하여 서열을 결정하였다.
[폴리머라제 사슬 반응(RCR)]
TaqPaq 킷트(Biotech International, Bentley, WA)및 공급자의 추천조건을 사용하여 Taq DNA 폴리머라제 방법(Saiki, R. K. 외 다수의, Science, 239: 487-491(1988))을 통해 10ng의 표적 DNA와 10pmol의 λgt11 프라이머(뉴잉글랜드 바이오랩스, 비버리, MA)로 PCR을 수행하였다.
[결과]
[Der f I cDNA 클론의 분리]
진드기의 주요 알레르기 항원 Der f I을 발현시키는 두개의 클론을, Der p I cDNA 프로브(뉴클레오티드 1-348 및 349-857) 2가지와 하이브리드하는 그들의 능력에 의해 디. 화리나 cDNA λgt11 라이브러리로부터 분리하였다. 아미노산 서열 결정을 통해 2개의 알레르기 항원사이에 상당한 상동성(80%)이 있음이 밝혀졌기 때문에 이러한 접근방식을 사용한다(Thomas, W.R. 외 다수의 Advances in the Biosciences, 14: 139-147(1989)). cDNA 삽입물을 방출시키기 위해 EcoRI 제한 효소로써 λgt 11 f1클론 DNA를 절단하여 3개의 Der f I cDNA EcoRI 단편들을 얻었다: 하나는 그 길이가 약 800 염기이고 두개는 약 150개의 염기이다. 또한 Der f I cDNA삽입물을 폴리머라아자제 사슬 반응(PCR)을 통해 파지 DNA로부터 증식시킴으로써 약 1.1-kb의 PCR생성물을 산출한다. 각 Der f I cDNA 단편을 각각 M13유래의 서열 결정 벡터 mp 18 및 mp19에 각각 클로닝한후 서열 결정하였다.
[DNA 서열 분석]
제1도에 제시된 서열 결정법을 사용하여 Der f I cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 완전한 서열은 1084개의 염기로 구성되며 335-염기의 5'인접말단서열, 추론된 분자량이 25,191인 233개의 아미노산으로 구성된 거의 천연의 Der f I 단백질에 대한 암호 영역 및 80-염기의 3' 비암호 영역으로 구성된다(제2도 참고). 천연 단백질의 NH2-말단 아미노산 서열 결정 및 재조합 Der f I의 추정된 아미노산 서열(chua, K.Y.외 다수, J.Exp.Med., 167:175-182(1988))을 통해 수득된 데이타를 기초로 하여 Der f I의 NH2-말단 아미노산으로서 1위치에 트레오닌 잔기를 배열하였다. NH2-말단 영역에서 Der f I cDNA의 추정된 아미노산 서열은 단백질 수준에서 결정된 서열과 거의 일치하였다(제2도).
완전히 성숙한 단백질은 뉴클레오티드 위치 1007-1009의 TGA 종결 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 의해 암호화된다. 뉴클레오티드 위치 42-44의 첫번째 ATG코돈 다음의 서열이 일반적인 시그널 펩티드 서열을 암호하므로 이 ATG 코돈이 해독 개시부인 것으로 추정된다.
[아미노산 서열의 분석]
뉴클레오티드 분석을 통해 추정된 아미노산 서열을 제2도에 제시한다. 성숙한 Der p I 및 Der f I의 아미노산 서열의 일렬 배열에서 알수 있듯이(제3도), 2개의 단배질간에는 상당한 상동성이 관찰되었다. 서열의 상동성을 분석한 결과 Der f I 단백질은 종래의 통상적인 아미노산 서열 결정에서 예상된 바와 같이 Der p I 단백질과 81%의 상동성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 특히, 파파인, 악티니딘, 카뎁신 H, 및 카뎁신 B에 대해 결정된 서열들을 기초로한, Der p I의 활성부를 이루는 잔기는 또한 Der f I 단백질에서도 보존된다. 그 잔기들은 글루타민(잔기 29), 글리신, 세린 및 시스테인 (잔기 33-35), 히스티딘(잔기 171) 및 아스파라진, 세린 및 트립토판(잔기 191-193)으로서, 상기 번호 매김은 Der f I를 참고로 한다. 추정된 성숙한 Der f I 아미노산 서열에는 위치 53-55에 잠재적 N-글리코실화(Asn-Thr-Ser)가 있는데, 이는 Der p I의 동일한 위치에서는 Asn-Gln-Ser으로써 존재한다.
전체 Der f I cDNA 삽입물의 추정된 아미노산 서열을 분석한 결과, 다른 시스테인 프로테아제에서와 같이(제4도), Der f I 단백질에는 예비형태 및 전구형태의 중간물이 있었다. 상기 언급된 바와 같이, -98위치의 메티오닌 잔기는 개시메티오닌인 것으로 추정된다. 이러한 가정은, 첫째로 잔기 -98 내지 -81의 5'인접 말단 서열이 주로 소수성 아미노산 잔기(72%)로 구성된다는 점을 기초로한 것이며, 이것은 시그널 펩티드의 특징이다(Von Heijne, G., EMBO J. 3:2315-2323(1984)). 두번째로, 추정된 예비-펩티드(18아미노산잔기) 및 전구-펩티드(80잔기)의 길이는 다른 시스테인 프로테아제의 것들과 유사하다(제4도). 대부분의 시스테인 프로테아제를 검사해본 결과 예비전효소 잔기는 약 120 이고(이중 평균 19개의 잔기가 시그널 펩티드를 형성함), 카뎁신 B가 80으로 가장 작다(Ishidon, K. 외 다수의, FEBS Letters, 226:32-37(1987)). Der f I은 총 98개의 예비전효소 잔기로써 이 범위에 해당된다.
상기 von Heijne의 문헌에 요약된 시그널 서열 절단부위를 추정하는 방법에 따라, 전효소 형성을 위한 예비-Der f I 서열의 절단은 Ala(-81)과 /Arg(-80) 사이에 위치한 시그널 펩티다아제 절단부위에서 실시되는 것으로 생각된다(Von Heijne, G., Eru. J. Biochem., 133: 17-21(1988) 및 J.Mol.Biol., 184:99-105(1985))). 따라서, 잔기 -88 내지 -81의 서열은 리더 (leader)펩티드를 암호하는 반면, Der f I의 전효소부는 잔기 Arg(-80)에서 시작하고 잔기 Glu(-1)에서 끝난다.
[실시예 2]
[Der f II를 암호하는 cDNA의 분리 및 특성규명 재료 및 방법]
[아미노산 서열 분석]
[λgt11 디. 화리나 cDNA 접합체의 제조]
디.화리나는 오스트레일리아, 파크빌에 소재하는 컴먼웰쓰 세럼 레보러토리즈로부터 구입하여, 문헌[스튜워트, 지. 에이. 및 더블유. 알, 토마스, Int.Arch. Allergy Appl Immunol., 83: 384-389(1987)]에 기술된 바와 같이 mRNA(폴리아데닐화된 RNA)를 제조하는데 사용했다. mRNA를 약 0.5μg/μl의 비율로 현탁시키고 그 5μg을 키트(애머샴 인터내쇼날, 벅스)를 이용하여 RNase H 방법(거블러, 유. 및 호프만, 비. 제이., Gene, 25: 263-269(1983))에 의해 cDNA를 제조하는데 사용했다. RcoRI 링커(애머샴, GGAATTCC)를 문헌 [휴인등, gt 10과 gt11의 cDNA라이브러리의 작제 및 선별, in: Glover, DNA Cloning vol. A practical approach pp. 47-48 IRL Press, Oxford(1985)]에 기술된 방법에 의거하여 부착시켰다.
이어서 DNA를 EcoRI으로 분해시키고, 0.5M 아르기닌 염기를 용출에 사용한 것을 제외하고는 샘브룩등의 프로토콜 6.25(샘브룩등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))에 의거하여 DEAE 막(슈라이커 앤드 스쿠엘, 다셀, 독일연방공과국, NA-45)으로의 전기 영동에 의해 한천 겔 정제로부터 회수했다. 이어서 cDNA를 2:1의 삽입물 비율로 λgt 10 및 λgt11의 아암에 결찰시켰다. 일부는 플라크 라이브러리로서 팩키지하였고, 일정량은 후술되는 바와 같은 폴리머라제 사슬 반응에 의한 서열 결정를 위해 남겨 두었다.
[폴리머라제 사슬반응에 의한 Der f Ⅱ cDNA의 분리]
Der f Ⅱ cDNA를 분리하기 위해, Der p Ⅱ의 N-말단 서열에 근거하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조했고, 이것은 Der f Ⅱ와 Der p Ⅱ의 아미노산 잔기들은 N-말단의 영역내에서 동일하기 때문이다(헤이만, 피. 더블유. 둥, J. Allergy Clin. Immunol., 83: 1055-1087(1989)). 프라이머 GGATCCGATCAACTCGATGC-3'를 사용했다. 초두의 GGATCC는 BamH1 부위를 암호화하고, 이어지는 GAT···서열은 Der p Ⅱ의 처음 4잔기를 암호화한다. 다른 프라이머로서 EcoRI 클로닝 부위에 선행하는 λgt11 TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3' 역 프라이머를 사용했다(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 비버리, 마이애미). Der p Ⅱ 프라이머는 약 50-60%의 G-C를 가지고 있고 코돈의 세번째 염기보다는, 첫번째 또는 두번째 염기상에서 종결되도록 고안되었다(고울드, 에스. 제이. 등, Proc. Natl, Acad. Sci., 86: 1934-1938(1989); 섬머, 알. 및 디. 타우쯔, Nucleic Acid Res., 17:6749(1989)).
PCR 반응은 67mM 트리스-HCl(25℃ 에서 pH8.8), 16.6mM(NH4)2SO4, 40μM dNTPs, 5mM 2-머캅토에탄올, 6μM EDTA, 0.2mg/ml 젤라틴, 2mM MgCl2, 각각의 프라이머 10pmoles 및 Taq 폴리머라제2 유니트를 함유하는 25μl의 최종 반응부피로 수행했다. 약 0.01μg의 표적 DNA를 첨가하고 시험관의 내용물을 혼합하고 파라핀 오일을 위에 덮었다. 시험관을 초기에 95℃에서 6분동안 변성시킨 후에 55℃에서 1분동안 어닐링하고 72℃에서 2분동안 연장시켰다. 38사이클 후, 30초 동안 변성단계를 수행한 후 전술한 바와 같이 어닐링하고 연장시켰다. 최종(40번째) 사이클에서는, 모든 증폭된 생성물이 완전한 길이를 가질 수 있도록 연장 반응을 10분으로 증가시켰다. 어닐링 온도는 N-말단 프라이머에서 잘못된 염기쌍 결합이 일어날 수 있도록 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm보다 약간 낮게(식 Tm-69.3+0.41(G+C%)-650/올리고 길이에 의해 결정됨) 주위깊게 고정시켰다.
이어서 5μl의 반응물로 1% 아가로오스 겔상에서 증폭된 밴드에 대해 조사했다. 남아있는 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하여 파라핀유를 모두 제거하고 에탄올로 침전시킨 후에 증폭된 생성물을 저융점 아가로오스 겔상에서 정제했다(Bio-Rad, Richmond, CA).
[PCR 생성물의 서브클로닝]
정제된 PCR 생성물의 말단은 10mM 트리스 Hcl, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 0.025mM dNTP 및 1μl의 클레노우 효소를 함유하는 최종 부피 100μl의 반응물에서 메웠다. 반응을 37℃에서 15분동안 수행하고 70℃에서 10분동안 가열하여 불활성화시켰다. 혼합물을 레더(Leder) 페놀로 추출한 후에 에탄올로 침전시켰다. 생성된 평활 말단의 DNA를 0.5M ATP, 1X 리가아제 완충액 및 1유니트의 T4리가아제를 함유한 반응물내에서 Sma I으로 분해된 M13mp18내로 15℃에서 24시간동안 결찰시킨 후, CaCl2방법에 의해 감응세포가 되도록 제조된 이. 콜리 TG1을 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 L+G평판상에 잔디처럼 얇게 펴고 37℃에서 밤새 증식시켰다.
서열 분석을 위한 단일-가닥 DNA 주형의 제조
분리된 백색 플라크를 오렌지색 스틱을 사용하여 2 X TY 브로쓰중에 1/100로 희석된 TGI 세포를 밤새 배양한 배양물 2.5ml 내에 넣고, 37℃에서 6시간동안 증식시켰다. 배양물을 펠릿화하고 상청액을 깨끗한 튜브로 옮겼다. 이 상청액 1ml 분취량에 20% 폴리에틸렌 글리콜, 2.5M NaCl 270μl를 첨가하고 튜브를 볼텍스 한 후에 실온에서 15분동안 정치시켰다. 이어서 이를 재차 스피다운시키고 미량의 상청액을 튜브로부터 모두 제거했다. 이어서 펠릿을 1 X TE 완충액 100μl에 재현탁시켰다. 페놀: TE 추출을 최소한 2회 수행한 후에, 레더 페놀로 1회, 이어서 CHCl3로 추출했다. DNA를 에탄올에서 침전시키고 최종부피 20μl로 조정한 TE 완충액내에 재차 현탁시켰다.
[DNA 분석]
DNA 서열 분석은 T4 DNA 폴리머라제(시쿼나제 버젼 2.0, USB 코오포레이션, 클리브랜드, 오하이오; 제한 효소는 일본, 오사카에 소재하는 토요보로부터 입수함) 및 이.콜리 TG1 내에서 M13 유도 벡터 mp18과 mp19로부터 제조된 DNA를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법(생거, 에프. 등, Proc. Nat. Acad. Sci., 74: 5463-5467(1977))에 의해 수행했다. 전반적인 모든 절차는 표준 기술(샘브록, 제이. 등, A Laboratory Manual, 2d Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))에 따른다. 서열 분석은 Mac 벡터 소프트웨어(IBI, 뉴 하벤, 코네티컷)를 사용하여 수행했다.
[결과]
λgt11에 결찰된 디. 화리나 cDNA를 사용하여 Der p Ⅱ의 N 말단의 4잔기와 상동성인 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 암호 부위의 측면에 접하는 λgt11 서열에 대한 역 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시켰다. 생성물을 겔 전기영동 분석했을때 약 500bp 및 300bp의 두개의 주요 밴드를 얻었다. 이들을 M13mp18로 결찰시키고 500bp 단편을 함유하는 많은 클론들을 DNA 서열 결정에 의해 분석하였다. 3개의 클론들로부터 N-말단 프라이머 말단으로부터의 서열 데이타와 다른 배향의 서열 데이타를 수득했다. 2 가지 배향의 서열 데이타가 오버랩되는 곳에서, 완전한 염기쌍 결합이 발견되었다. 상기 클론들중 하나는 N-말단 프라이머로부터 판독할 때, 1-염기가 결실되어 있어 이동된 리딩 프레임을 포함하고 있다. 이것은 복제 오류인것으로 추론되며, 다른 2개의 클론의 해독 서열은 알레르기 항원의 처음 20개 아미노산 잔기에 대하여 단백질 서열에 부합되었다.
일치성을 나타내고 올바른 리딩 프레임을 제공하는 클론의 서열을 추정된 아미노산 서열과 함께 제6도에 도시하였다. 이는 N-글리코실화 부위 없는 129 잔기의 단백질을 암호화하며, 분자량은 14,021KD로 계산되었다. GenBank 데이타 베이스(61.0 릴리이즈)의 다른 단백질과 비교했을때 상동성은 전혀 없었다. 그러나 상기 클론의 서열은 제9도의 배열에서 나타나는 것처럼 Der p Ⅱ와는 88%의 아미노산 잔기 상동성을 나타낸다. 16개의 변화잔기들중 7개의 잔기가 보존되었다. 보존된 잔기들은 또한 8, 21, 27, 73 및 119 위치에 존재하는 모든 시스테인을 포함한다. 또한, 통용되는 효소에 대한 상기 서열 데이타로부터 만들어진 제한효소 지도가 Der p Ⅱ와 상이함에도 불구하고(제8도), 상당한 뉴클레오티드 상동성을 나타났다. 제10도애 도시한 바와 같이 Der f Ⅱ 및 Der p Ⅱ의 해독 서열에 대한 소수성 플로트는 거의 동일하다.
Der p I, Der p Ⅱ, Der f I 및 Der f Ⅱ를 암호화하는 핵산 서열에 서열 다형성이 존재하는 것으로 생각되며, 당업자들은 Der p I, Der p Ⅱ, Der f I 및 Der f Ⅱ를 암호하는 핵산 서열중에 1개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 자연적인 대립 유전자 변이에 의해 각각의 진드기들 사이에서 변화할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 거의 모든 뉴클레오티드 변이체 및 그로 인한 아미노산 다형체도 본 발명의 영역에 포함된다. 아미노산 다형성은 상이한 Der p I클론의 서열 분석시에 발견되었다. 이러한 다형태성을 제11도에 도시했다.
[동등물]
당업자들이라면 통상의 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 발명의 특정한 구체예에 대한 다수의 동등물을 인식할 수 있을 것이다. 이러한 동등물들을 첨부된 청구범위에 의해 포함시키고자 한다.

Claims (8)

  1. 도2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 Der f I 알레르기 항원 단백질 또는, 도2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 Der f I 알레르기 항원 단백질의 에피토프로서 Der p I 알레르기 항원 단백질과 교차 반응하지 않는 에피토프를 포함하는 펩티드를 암호하는 핵산.
  2. 도2에 도시된 Der f I의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-223을 암호하는 핵산.
  3. Der f I 알레르기 항원 단백질 또는 Der f I 알레르기 항원 단백질의 에피토프를 포함하는 펩티드를 암호하는 핵산으로서 도2에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  4. Der p I외의 데르마토파고이디즈의 알레르기 항원 단백질을 암호하는 핵산으로서, 높은 엄격도(stringency) 조건(Tm-20℃에서 혼성화시킨 후 Tm-12℃에서 한번 이상 세척)하에서 도2에 도시된 Der f I의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보체를 포함하는 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항중의 어느 한 항의 핵산에의해 암호되는 알레르기 항원 단백질.
  6. 도2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 Der f I 알레르기 항원 단백질 또는, 도2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 Der f I 알레르기 항원 단백질의 에피토프로서 Der p I 알레르기 항원 단백질과 교차 반응하지 않는 에피토프를 포함하는 펩티드.
  7. 도2에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-223을 포함하는 Der f I 알레르기 항원 단백질.
  8. 알레르기 항원 단백질을 암호하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포에서 재조합 기술에 의해 생산된 제5항 내지 제7항중의 어느 한 항의 알레르기 항원 단백질 또는 펩티드.
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