JPH06500993A

JPH06500993A - ダーマトファゴイデス（家塵ダニ）のアレルゲンのクローニングおよびシークエンシング

Info

Publication number: JPH06500993A
Application number: JP3514863A
Authority: JP
Inventors: トーマス，ウェイン・ロバート; チュア，カウーヤン
Original assignee: インスティテュート・フォー・チャイルド・ヘルス・リサーチ
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1991-09-10
Publication date: 1994-01-27
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: ES2133288T3; US20060008873A1; DE69131131D1; US6086897A; ATE178940T1; EP0548200B1; AU8506291A; CA2091449A1; AU655599B2; DK0548200T3; EP0548200A4; WO1992004445A1; US6060057A; KR930702523A; JP3592709B2; DE69131131T2; CA2091449C; EP0548200A1; US6689876B1; KR100274321B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ダーマトファゴイデス（家産ダニ）のアレルゲンのクローニングおよびシークエン最近の報告には、家産ダニアレルギーにおける１群および■群アレルゲンに対する応答の重要性が記載されている。たとえば、患者の６０％以上がこれらタンパク質に対して産生された抗ダニ抗体の少なくとも５０％を保有していることが記載されている［リント（Ｌｉｎｄ、　Ｐ、　）ら、Ａｌｌｅｒｇｙ、　３９　：　２５０〜２７４　（１９８４）：ファン・デア・ゼー（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｚｅｅ、　Ｊ、　Ｓ、）ら、Ｊ　、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、　Ｉ　ａｎｕｎｏｌ、　、旦１　：　８８４〜８９６（１９８８）］。子供が一層ひどい反応性を示すことはあり得る［トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｐ、　Ｊ、）ら、Ｉ　＊ｕｓｕｎｏｌｏｇｙ、　６４　：　３１１〜３１４（１９８８）］。ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｊｄｅｓ　：　Ｄ、　）属のダニニ対するアレルギーは、喘息、鼻炎および異所性の皮膚炎を伴う。２つの種、ダーマトファゴイデス・ブテロニシヌス（Ｄ　、　ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｆｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（ｐ、　ｆＢｒｉｎａｅ）が殆どを占め、その結果、これら２つの種により産生されるアレルゲンを同定しようという相当の努力がなされてきた。ダーマトファゴイデス・プテロニシヌスは、西ヨーロッパおよびオーストラリアの家産中における最も一般的なダーマトファゴイデス種である。ダーマトファゴイデス・ファリネ種は、化アメリカや日本などの他の国に多くみられる〔ウォートン（Ｗｈａｒｔｏｎ。

Ｇ、Ｗ、）、Ｊ、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｔｏｍ、１２　：　５７７〜６２１（１９７６）］。この漠のダニに対するアレルギーには、喘息、鼻炎および異所性の皮膚炎などの疾患を伴うと長い間認識されてきた。これらダニにより産生されるいかなるアレルゲンが、アレルギ一応答および関連する状態の原因であるかについては未だ明らかではなたはダーマトファゴイデス属の家産ダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードする単離ＤＮＡＩ：関する。本発明は、特に、ダーマトファゴイデス・ファリネ種の主要なアレルゲン（ＤｅｒｆＩおよびＤＡに関する。本発明はまた、特に、ダーマトファゴイデス・ブテロニシヌスの主要なアレルゲン（旦虹」ＩおよびＤｅｒｐＩＩと称する）またはこれら主要なアレルゲンの部分（すなわち、Ｄｅｒｐｌまたは旦虹」ＩＩの少なくとも一つのエピトープを含むペプチド）をコードするＤＮＡに関する。

本発明はさらに、単離ダーマトファゴイデス（たとえば、ダーマトファゴイデス・ファリネ、ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス）ＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチドに関する。本発明のペプチドは、ダーマトファゴイデス・フ７リネアレルゲンの少なくとも一つのエピトープ（たとえば、ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆｎの少なくとも一つのエピトープ）またはダーマトファゴイデス・ブテロニシヌスアレルゲンの少な（とも一つのエピトープ（たとえば、旦虹」ＩまたはＤｅｒｐＩＩの少なくとも一つのエピトープ）を含む。本発明はまた、ダーマア　トファゴイデス・ファリネタンパク賀またはペプチドに特異的な抗体およびダーマトファゴイデス・ブテロニシヌスタンパク質またはペプチドに特異的な抗体に関する。

、　本発明のダーマトファゴイデスＤＮＡ、タンパク賀およびペプチドは、診断および治療目的に有用である。たとえば、単離したダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質またはペプチドは、家産ダニに対する個体の感受性を検出するのに用いることができ、個体の感受性を治療する（感受性を減少させるかまたは脱感作する）のに用いることができ、該患者に治療学的有効量のダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質またはペプチドを投与する。たとえば、個体を脱感作させるため、ＤｅｒｆｌやＤｅｒｆＩＩなどの単離したダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質アレルゲンを標準的な方法を用いて該個体に投与することができる。

または、ＤｅｒｆｌまたはＤｅｒｆＩＩの少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを同目的で投与することができる。且笠」ＩやＤ虹」ｎなどの単離したダーマトファゴイデス・ブテロニシヌスタンパク質アレルゲンも、ＤｅｒｆｌやＤｅｒｆｎについて記載したのと同様にして投与することができる。同様に、少なくとも一つの０ｇ２１エピトープや少なくとも一つのＤｅｒｐｒｌエピトープを含むペプチドを同目的で投与することができる。これらタンパク質またはペプチドの組合せ（たとえば、旦虹ｆｌとｐ二Ｊ■：ｎ＝」■とｎ＝」■：またはＤｅｒｆζシ虹」の両タンパク質の混合物）もまた投与することができる。そのような単離タンパク質またはペプチドを用いることにより、重要な家産ダニアレルゲンに対して個体を脱感作する手段が得られるっ図面の間車な記載図１はクローンλｇｔｌｌｆｌのｃＤＮＡ挿入物の制限地図であり、ＤＮＡシークエンシングの方策の模式表示を含む。矢印は配列の読み取りを行った方向を示す。

図２は、ｃＤＮＡ　２ｇｔｌｌｆｌのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列である。上に示す番号はヌクレオチドの位置であり、左に示す番号はアミノ酸の位置である。アミノ酸残基の正の番号は、スレオニンで始まる成熟排出Ｄｅｒｆｌの配列に対応する。負の配列番号は、シグナルペプチドおよびＤｅｒｆＩのプロエンザイム領域をさす。矢印は、それぞれ、プロエンザイム配列の開始部分および成熟Ｄｅｒｆｌの開始部分を示す。下線を引いた残基−８１〜−７８はプロニンザイム生成のための提案された開裂部位を構成し、下線を引いた残基５３〜５５は可能なＮ−グリコジル化部位を示す。停止コドンＴＧＡおよび隣接するポリアゾニレ−ジョンシグナルもまた下線を引いである。アミノ８１４基１〜２８は、通常のアミノ酸配列分析により決定された公知のトリプシン分解ペプチド配列に対応する。

図３は、成熟Ｄｅｒｐｌタンパク質およびＤｅｒｆｌタンパク質のアミノ酸配列とを整合して並べたものである。この配列の上の番号は、Ｄｅｒｐｌのものを表す。星印は、整合を最大とした場合に導入されるギャップを示す。記号（、）は、その位置におけるＤｅｒｆＩのアミノ酸残基が旦ｅｒｐｌの対応アミノ酸残基と同一であることを示すために用いである。矢印は、ＤｅｒｐｌおよびＤｅｒｆｌの活性部位を構成する残基を示す。

図４は、Ｄｅｒｆｌのプレペプチド領域およびプロペプチド領域中のアミノ酸配列とラットカテプシンＨ，ラットカテプシンＬ、パパイン、アレウライン（ａｌｅｕｒａｉｎ）、ＣＰＩ、ＣＦ２、ラットカテプシンＢ、ＣＴＬＡ−２、λ４ＣＰ、ＤｅｒｐＩおよびアクチニジンのアミノ酸配列との比較である。ダッシュで示されるギャップは、最大の整合のために加えたものである。二重の星印は、プロエンザイムの８０％以上に共通する保存アミノ酸残基を示す。単一の星印は、５５％以上の配列で保存された残基を示す。記号（、）は９０％以上のプロエンザイム領域に共通する生保存等価アミノ酸を示すのに用いである。

図５は、６残基ウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を用いたマツクベクターシークエンスアナリシスソフトウエア（Ｍａｃ　Ｖｅｃｔｏｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｉ　Ｂ　Ｉ、ニューヘブン）により計算したホップーウッズ（Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ）アルゴリズムを用いて作成したＤｅｒｐｌ成熟タン成熟タンパ水質プロットおよびＤｅｒｆｌ成熟タン成熟タンパ木賃プロットである。正の値は相対的な親水性を示し、負の値は相対的な疎水性を示す。

図６は、Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列である。右側の番号はヌクレオチドの位置であり、上の番号はアミノ酸残基である。停止（ＴＡＡ）シグナルは下線を引いである。最初の８つのヌクレオチドは、ＤｅｒｐＩ［配列に基づいてｃＤＮＡを生成するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーからのものである。

図７は、ｃＤＮＡ　λｇｔｌｌｐｌ（１３Ｔ）のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列である。右側の番号はヌクレオチドであり、上の番号はアミノ酸の位置である。正のアミノ酸は、スレオニンで始まる成熟排出Ｄｅｒｐｌの配列に対応する。

図８は、配列データからコンピューターにより作成したＤｅｒ　ｆ　ｒｉ　ｃＤＮＡの制限地図である。旦虹」Ｉ［の地図も同様にして比較のために示す。保存された共通の制限酵素部位はごくわずかしかない。星印でマークした部位はクローニング方法により導入した。

図９は、Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩ　ｃＤＮＡ配列およびＤｅｒ　ｐ　ｒｌ　ｃＤＮＡ配列の整合を示す。

右側の番号はヌクレオチドの位置であり、上の番号はアミノ酸残基である。一番上のラインは０２ｇ２　ＩＩヌクレオチド配列であり、箪二のラインはＤｅｒｐｌＩアミノ酸残基である。つぎの２つのラインは、これら配列とＤｅｒｆｌＩとの差異を示す。

図１０は、６残基ウインドウを用いたマツクベクターシークエンスアナリノスソフトウエア（ＩＢＩ、ニューヘブン）により計真したホツブーウツズアルゴリズムを用いて作成したＤｅｒｆＩ［およびＤｅｒｐｌＩの親水性プロットである。

１１１１は、５つの０ｇ２１クローン（ａ）　〜（ｅＸＤｅｒｐ　Ｉタンパク質の多型を示す）のアミノ酸配列を整合して並べたものである。番号は、ＤｅｒｆＩ（ａ）クローンの配列のものである。記号（−）は、ＤｅｒｐＩクローンのアミノ酸残基がその位１におけるＤｅｒｐｌ（ａ）の対応アミノ酸残基と同一であることを示すのに用いである。これらクローンのアミノ酸配列は、ＤｅｒｐＩにおいて有意の変異が存在するかもしれず、これら５つの配列中に５つの多脂アミノ酸残基が認められることを示している。

発明の詳細な記載本発明は、家産ダニダーマトファゴイデスからのアレルゲンをフードするヌクレオチド配列およびコードされたタンパク質またはペプチド（ダーマトファゴイデスアレルゲンの少なくとも一つのエピトープを含む）に関する。本発明は、特に、ＤｅｒｆＴやＤｅｒｆｌＩなどのダーマトファゴイデス・ファリネの主要なアレルゲンまたはＤｅｒｆＩまたはＤｅｒ　ｆ　ＩＩの少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを適当な宿主中で発現することのできるヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、ＤｅｒｐＩやＤｅｒｐｌＩなどのダーマトファゴイデス・プテロニンヌスの主要なアレルゲンまたはＤｅｒｐｌまたは０ｇ３Ｔ１の少な（とも一つのエピトープを含むペプチドを適当な宿主中で発現することのできるヌクレオチド配列に関する。ダーマトファゴイデスのヌクレオチド配列は、それにハイブリダイズし他のダニアレルゲン、とりわけダーマトファゴイデス・ファリネアレルゲンまたはダーマトファゴイデス・ブテロニシヌスアレルゲンをコードする別のヌクレオチド配列を同定するためのプローブとして有用である。さらに、本発明は、ダーマトファゴイデス・）７リネタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはダーマトファゴイデス・ブテロニシヌスタンパク賀をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするがダーマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄ、■１ｃｒｏｃｅｒａｓ）などの家産ダニの他の橿またはタイプ（たとえば、］）ｅｒ＋＊ＩおよびＤｅｒ　ｒｍ　ｌ）からのタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。

コードされたダーマトファゴイデスダニアレルゲンまたは少な（とも一つのダーマトファゴイデス（ＤｅｒｆＩまたは旦虹ｆ１１．Ｄ虹」工または２虹」■）エピトープを含むペプチドは、診断目的のため（たとえば、抗原として）および治療目的のため（たとえば、個体を脱感作するため）に用いることができる。または、コードされた家産ダニアレルゲンは、ダーマトファゴイデス・ミクロセラスタンバク質またはペプチドなどの、Ｄｅｒｆアレルゲンまたは２肛」アレルゲンの抗原性を示すかまたは該アレルゲンと交差反応をするタンパク質またはペプチドであり得る；一般に、これらは高度のアミノ酸相同性を育する。

それゆえ、本発明はまた、ダーマトファゴイデスアレルゲン（たとえば、ｐμ二１１アレルゲンまたはＤｅｒｆＩＩアレルゲン；ＤｅｒｐＩまたはＤｅｒｐｌＩアレルゲン、またはこれらと交差反応する他のダーマトファゴイデスアレルゲン）またはダーマトフ７ゴイデスアレルゲン（旦虹ゴＩ、旦虹ｆＵ、旦虹Ｊ！ＬＤ虹」■、またはこれらと交差反応する他のダーマトファゴイデスアレルゲン）の少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを個々にまたは組合せて含有し治療目的（たとえば、脱感作）に用いることのできる組成物にも関する。下記に示すように、家産ダニからの主要なアレルゲンをコードするＤＮＡを単離しシークエンソングした。とりわけ、実施例で一層詳細に記載するように、それぞれＤｅｒｆＩアレルゲンおよびＤｅｒｆｒｌアレルゲンをコードする２つのｃＤＮ、ヘクローンを単離しシークエンソングした。２肛」ＩおよびＤｅｒｐＩＩのヌクレオチド配列も決定した。これら各クローンのヌクレオチド配列を、それぞれの予測されるアミノ酸配列を有する関連するダニであるダーマトファゴイデス・ブテロニンヌスからの相同なアレルゲン（ＤｅｒｐｌおよびＤｅｒｐＩＩそれぞれについて）のヌクレオチド配列と比較した。

下記に記載するのは、Ｄｅｒｆアレルゲンをコードする２つのｃＤＮＡクローンの単離およびシークエンソング並びに対応するダーマトファゴイデス・プテロニンヌスアレルゲンとの比較、並びにヌクレオチド配列およびコードされた生成物の診断および治療目的の使用である。

Ｄｅｒｆｌの嵐離および配列分析家産ダニダーマトファゴイデス・ファリネの主要なアレルゲンであるＤｅｒｆＩをコードするｃＤＮＡを単離し配列決定した。該クローンのｃＤＮＡ挿入物の制限地図を図１にＤＮＡンークエンシングの方策として示す。この旦ｅｒｆＩＣＤＮＡクローンは、典型的なシグナルペプチド、プロエンザイム領域および成熟Ｄｅｒｆｌタンパク質をコードする１、１ｋｂ　ｃＤＮＡを含有する。生成物は３２１アミノ酸残基：推定１８残基のシグナルペプチド、８０残基のプロエンザイム（プロペプチド）領域、および２２３残基の成熟酵素領域である。得られた分子タンパク質において他のンステインブロテアーゼに有意の相同性を示す。関連するダニのダーマトファゴイデス・ブテロニンヌスからの相同なアレルゲン旦虹」■との成熟Ｄｅｒｆｌタンパク質の配列整合（図３）により、タンパク質レベルでのＪ）、前のシークエンソングにより予測されるように、これら２つのタンパク質の間に高度の相同性（８１％）が明らかになった。特に、これら酵素の活性部位を含む残基は保存されており、可能なＮ−グリフシル化部位は両方のダニアレルゲンにおいて等ミな位置に存在していた。

保存されたシスティン残基対（３１，７１）および（６５，１０３０番号は２虹」Ｉについてのもの）は、パパインおよびアクチニジン（さらにジスルフィド橋を有する）に対するＤｅｒｐｌおよびＤｅｒｆＩの３次元構造の仮定された類似性に基づいてジスルフィド結合生成に関与しているように思われる。パパインおよびアクチニジンに相同なシスティン残基が存在する第５および最後のシスティン残基は、活性部位のシスティン（ＤｅｒｆＩ中の残基３５）である。７　Ｉおよび旦ｅｒｆＩ中に存在する２つの余分のシスティン残基が第三のジスルフィド橋の形成に関与していると考えられないこともない。

ＤｅｒｐＩ中の可能なＮ−グリコジル化部位はまたＤｅｒｆＩ中の等価の位置にも存在し、トリペプチド部位の重要な第一の残基および最後の残基が保存されている。ＤｅｒｆＩおよび２虹」１のグリコジル化の程度は、なお決定する必要がある。マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンを含む炭水化物が、これらダニアレルゲンの精製調製物中に報告されている（チャツプマン（Ｃｈａｐ＋ｏａｎ、　Ｍ、　Ｄ　、　）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２５：５８７〜５９２（１９８０）　：ウオルデン（Ｗｏｌｄｅｎ、　Ｓ　、　）ら、Ｉ　ｎｔ、　、Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ。

ｆ＋ｅｕｎｏ１．．６８　：　１４４〜１５１（１９８２））。

通常のアミノ酸ンークエンシングによって決定されたＤｅｒｍｌを用い（ブラツツーミルズ（Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｔｌｌｓ　ＴＡＥ）ら、マイト・アラジー、ア・ワールド−ワイド・プロブレム（Ｍｉｔｅ　Ａｌｌｅｒｇｙ、ａ　Ｗｏｒｌｄ− ｗｉｄｅ　Ｐｒｏｂｌｅｍ）、２７〜２９（１９８８）；リント（Ｌｉｎｄ、Ｐ、）およびホーン（Ｎ、Ｈｏｒｎ）：マイト・アラジー、ア・ワールド−ワイド・プロブレム、３０〜３４（１９８８））、成熟Ｄｇ２　Ｉ　とＤ虹」■の間（７０％）および成熟ＤｅｒｆｌとＤｅｒｍＩとの間（９７％）の最初の３０のＮ −末端アミノ酸残基の相同性の程度が得られると、完全な成熟ＤｅｒｍＩ配列は１群ダニアレルゲンとの間に全体で７０〜８０％の相同性が確認されるででの高い相同性（９１％）および旦ｅｒｆｌの構造分析により、相同な構造および少なくともプロペプチドに関して相同な組成の成熟タンパク質のＮ−末端伸長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を有すると思われる。

シグナル配列の設計の微細構造に関する研究により、これまでに３つの構造的に非類似の領域が同定された：正に荷電したＮ−末端（ｎ）領域、中央の疎水性（ｋ）ｇ域および一層極性の大きいＣ−末端（Ｃ）［域（開裂部位を定めているように思われる）（フォラ・ヘイジン（Ｖａｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｇ、　）、ＥＭＢＯＪ、、３　：　２３１５〜２３２３（１９８４）；Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｌ旦３　：１７〜２１（１９８３）；　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、　、止＝９９〜１０５（１９８５））。２肛ｆｌのシグナルペプチドを分析したところ、該ペプチドもまたこれら領域を含有していることがわかった（図４）。ｎ−領域は長さおよび組成に関しては極めて変化に冨むが、その正味の電荷に関しては全長にわたって認め得るほどに変化せず、約＋１．７の平均値を有する。長さが２残基のＤｅｒｆＩシグナルペプチドのｎ−領域は、最初のメチオニン（ホルミル化されておらず、それゆえ真核生物中で正に荷電している）および隣接するリジン（Ｌ　ｙｓ）残基により＋２の正味電荷を育する。ＤｅｒｆＩのｈ−領域は疎水性残基に富み（この領域の特徴である）、ただ一つの親水性残基（Ｓｅｒ）が許容され得るものとして存在している。ＤｅｒｆＩｃ−領域の全体のアミノ酸組成は、ｈ／ｃ境界が残基−６および−５の間に位置する（真核生物における平均の位！である）シグナル配列において認められるように、ｈ−領域よりも極性が大きい。それゆえ、Ｄｅｒｆｌプレペプチド配列は、機能性のシグナル配列が従わなければならない条件を満たしているように思われる。

ＤｅｒｆＩと他のシスティンプロテアーゼとはシグナル配列が構造的相同性を有するが（すべてｎ、ｂおよびＣ−領域からなる）、図４から明らかなように、全体にわたる長さおよびアミノ酸配列に関しては非常に変化する。しかしながら、システィンプロテアーゼ前駆体のプロ領域の間には有意の配列相同性が示されている（インド−（Ｉ　５ｈｉｄｏｈ、　Ｋ、　）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２６　：　３３〜３７（１９８７））。Ｄｅｒｆ　Ｉと幾つかの他のシスティンプロテアーゼとのプロエンザイム領域の整合（図４）によれば、これらプロ領域は幾つかの非常に保存された残基く　並びに生保存残基にれら配列の半分以上にわたって存在する）を共有していることが示された。この相同性は、バリン（Ｖａｌ）、インロイシン（Ｉ　ｌｅ）およびロイシ）　ン（Ｌｅｕ）（小さな疎水性の残基）またはアルギニン（Ａｒｇ）およびＬｙｓ（正に荷電しｈ　た残基）を同一とみなすならば一層増加した。ＤｅｒｆＩプロ領域は、７つの高度１　に保存されたアミノ酸のうち６つのアミノ酸および保存変化の部位におけるすべての残基を有していた。保存性の低い部位での相同性は一層低かった。プロペプチド、とりわけ高度に保存された残基における相同性は、これら酵素のプロセシングにおけるプロペプチドの機能を考慮した場合に重要である。というのは、これら配列は構造的および機能的類似性を有しているように思われることが示されているからである。

マウス、ウサギおよびヒト血清中に存在する抗体を用い、高度に交差反応性のＢ細胞エピトープがＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｐＩ上に示された（ヘイマン（Ｈｅｙ鵬ａｎｎ。

ｐ、ｗ、）ら、Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、１旦ユニ　２８４１〜２８４７（１９８６）：ブラッッーミルズら、Ｊ　、　Ａ　ｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、、工旦：　３９８〜４０７（１９８６））。

しかしながら、種特真的エピトープもまた、これら系において規定されている。

マウスモノクローナル抗体は、種特異的な抗原決定基に優先的に結合する（ブラッツーミルズら、Ｊ　、　Ｉ　ｍ＋ｍｕｎｏ１．　、１旦９　：１４７９〜１４８４（１９８７））。約４０％のウサギ抗旦虹」１反応性は、ＤｅｒｐＩに独特のエピトープによって説明さ、れ（ブラッッーミルズら、Ｊ　、　Ａ　ｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　、工旦：３９８〜４０７（１９８６））、大部分は交差反応性のエピトープと結合するが、ヒトアレルゲンからの抗体の幾つかの種特異的結合が観察された（ブラッッーミルズら、Ｊ　、　Ｉ　ｍｔｘｕｎｏＬ。

、１且ユニ１４７９〜１４８４（１９８７））。

遺伝子断片化および発現の組換えＤＮＡ法を用い（グリーン（Ｇ　ｒｅｅｎ、　Ｗ、　Ｋ、　）ら、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　（１９９０））、ウサギ抗り！ＬＰ！１抗血清により認識されるＢ細胞エピトープを含む組換え旦！！ＩＪ　Ｉの５つの抗原性領域を定めた。免ｇＥ吸着（ｉ關ｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）の方法を用い、これら推定エピトープのうち、２つはＤｅｒｐｌに特異的であったが（領域８２〜９９および１１２〜１４０）、３つはＤｅｒｆｌと共通していることが示された（アミノ酸残基３４〜４７．６０〜７２および１６６〜１９４を含む領域に位置する）。ウサギ抗ダーマトファゴイデス・ファリネに対するこれらペプチドの反応性の違いは、上記交差反応性のエピトープおよび種特異的エピトープという区分を支持していた。Ｄ！ＬＪ！ＩおよびＤｅｒｆｌタンパク質の間で示される配列の相違は、パパインおよびアクチニジンの二次構造および三次構造から予測されるように（ベイカー（Ｂａｋｅｒ、　Ｅ、　Ｎ、　）およびドレンス（Ｊ、Ｄｒｇｔｈ）、バイオロジカル・マクロモレキュールズ・アンド・アセンブリーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　、Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）、Ｖｏｌ、　３．３１４〜３６８頁、ジョンウイリーアンドサンズ、ニューヨーク（１９８７））、Ｎ末Ｍ領域およびＣ末端領域中、並びにヘリックスＤ（残基１２７〜１３６）を含む酵素の２つのドメインを連結する伸長表面ループ（残基８５〜１３６）中に主として位置する。これら残基が表面に位置することは、図５におけるｐｅｒｐＩおよび旦ｅｒｆＩの親水性プロットにより支持されており、この領域が親水性の佐賀を優勢に示すことから表面にＪＩＮされていることを示している。この領域はまた、ウサギ抗旦竺」Ｉ血清により認識される２つの種特異的Ｂ細胞エピトープを含んでいる（上記）。交差反応性エピトープを含有する領域における配列の分析により、交差反応性エピトープのうち２つ（ａ域３４〜４７および６０〜７２に位！する）はＤｅｒｐｌおよびＤｅｒｆＩ間で完全に保存されているが、第三の交差反応性エピトープ含有領域（残基領域１６６〜１９４）では残基の大部分が保存されていることが示された。

大腸菌中での発現の結果、組換えｐｅｒｐＩのものに比べて大きな溶解性、安定性および抗原性を有する組換えタンパク質であるプレープローＤｅｒｆＩタンパク質が得られた。Ｄｅｒ　ｆ　Ｉ　ｃＤＮ、Ａによりコードされるタンパク質はｐＧＥＸベクターを用いて発現され、ラジオイムノアッセイによりウサギ抗ダーマトファゴイデス・ファリネ抗体と反応することが示された。可溶性のＤｅｒｆｌアレルゲンおよび抗原性誘導体を高収量で得ることが可能になった二とにより、診断および治療剤の開発およびＢ１１８！およびＴｍ胞抗原決定基のマツピングが容易になることであろう。

組換えＤｅｒｆｌの完全なアミノ酸配列が利用できることにより、Ｂ細胞およびＴ細胞の両区画により認識されるエピトープのマツピングを行うことができる。

宜複合成ペプチドのスクリーニングなどの方法の使用、モノクローナル抗体および遺伝子断片化および発現の使用により、Ｄｅｒｆｌの連続および局所的（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）な両エピトープを同定することができるはずである。

アレルゲン性（ＩｇＥ−結合性）抗原決定基が共通の佐賀を有するかどうか、および抗原性（ＴｇＧ−結合性）抗原決定基とは生来的に異なるのかどうか、およびＢ細胞により認識されるものとは異なる独特のエピトープをＴ細胞が認識するのかどうかを決定することは特に有用であろう。ダニアレルギーヒトＩｇＥ抗体と反応性のＤｅｒｆＩエピトープを同定するための研究、およびこれらを２肛」Ｉと交差反応性の抗原決定基とＤｅｒｆｌに独特の抗原決定基に分けることも行うことができる。

いずれかの種に特異的なり細胞（またはＴ細胞）エピトープは、異なるダニ種に対する反応性を決定するのに有用な診断試薬を提供するのに用いることができ、一方、交差反応性のエピトープは共通の免疫治療剤の候補である。

本願とともに出願中の米国出願第４５８，６４３号（参照のために本明細書中に引用する）に記載されているように、ダニアレルゲンのモレキュラークローニングの結果、０．８ｋｂ　ｃＤＮＡ挿入物を含有するＤｅｒｐＩをコードするｃＤＮＡクローンが単離された。配列分析により、２２２アミノ酸残基の成熟組換え旦ｅｒｐｌタンパク質が、アクチニジン、パパイン、カテプシンＨおよびカテプシンＢを含む一層のシスティンプロテアーゼと有意の相同性を示すことがわかった。

ＤｅｒｆＩＩの単離および配列分析実施例２に記載するように、家屋ダニダーマトファゴイデス・ファリネの主要ｔアレルゲンであるｐｅｒｆｌＩをコードするｃＤＮＡクローンを単離し、シークエンジングした。Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を図６に示す。Ｄｅｒｆｎをコードするクローンのｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａ挿入物の制限地図を図８に示す。

図９はＤｅｒｆＩｒおよび旦虹ＪＩＩＣＤＮＡ配列の整合を示す。

Ｄｅｒｆｎの配列と旦虹」１１の配列との相同性（８８％）は、ＤｅｒｐＩとｐ μ二工■との間に認められた相同性（８１％）よりも高く、これはカイ２乗分布を用いて有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。この理由は、単純に１群のアレルゲンの方が大きく、分子の構造および機能にとって各残基が一層重要ではないためであるかもしれない。たとえば、これらが他のシスティンプロテアーゼと類似のフンホメーシ３ンを取るとした場合に、ＤｅｒｐｌおよびＤｅｒｆＩ中のアミノ酸の違いの多くが該分子の２つのドメイン構造を連結する残基中に存在することが知られている。６つのシスティン分子が■群アレルゲンの間で保存されていて、類似のジスルフィド結合を示唆している（このことは高い全体の相同性を仮定した場合に期待されることではあるが）。これらタンパク質の保存を示す他のものとして、コード配列のヌクレオチド変化の３４１５５がコドンの第三の塩基で起こることであり、このような変化は通常アミノ酸を変化させない。該分子の機能において重要な残基は５ｅｒ５７であり、これは３つのすべての塩基が変化しているのにアミノ酸は保存されている。同様の現象は残基８８においても存在し、完全なコドン変化が小さな脂肪族残基を保存させている。さらに、旦虹」ＩＩと同様に、Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩ　ｃＤＮＡクローンは、３゛非コード領域がアデノシンに富み２つの可能なポリアデニル化シグナルＡＴＡＡを有しているが、ポリＡテールを有していない。最初の４つの残基をコードするヌクレオチドは、Ｎ−末端アミノ酸シークエンンングから０ｇ３　ＩＩとＤｅｒｆＩ［との知られた相同性により設計されたＰＣＲプライマーからのものである。これら塩基並びにシグナル配列を決定するため、いまやＣ−末端配列に基づいたプライマーを用いることができる。

本件アレルゲン性タンパク質／ペプチドおよびそれをコードするＤＮ、への使用本明細書に記載する手順により得られる物質並びにこれら物質を含有する組成物は、ダニアレルゲン、とりわけダーマトファゴイデス・ファリネや他の種（たとえば、ダーマトファゴイデス・ブテロニンヌスおよびダーマトファゴイデス・ミクロセラス）などのダーマトファゴイデス属のダニに対するアレルギ一応答の診断、治療および予防方法において用いることができる。加えて、上記ｃＤＮＡ（または該ｃＤＮＡが転写されたｍＲＮＡ）は他の類似の配列を同定するのに用いることができる。このことは、たとえば、低い厳格さの条件下で行うことができ、本明細書に記載した方法を用いてさらに評価するために充分な相同性（一般に４０％以上）を有する配列を選択することができる。別法として、高い厳格さの条件を用いることもできる。この方法では、Ｄｅｒ　ｆ　Ｉ、Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩ、旦虹」ｌまたは０ｇ２　ＩＩと類似のアミノ酸配列を有するダニアレルゲンをコードする配列を同定するために本発明のＤＮＡを用いることができる。それゆえ、本発明は、ＤｅｒｆおよびＤｅｒｐＩ［のみならず他のダニアレルゲン（たとえば、本発明のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる他のダニアレルゲン）をも包含するものである。

本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質およびペプチドは、たとえば、「精製」アレルゲンとして用いることができる。そのような精製アレルゲンは、家屋ダニに対するアレルギーの診断および治療のための試薬として用いることのできるアレルゲン抽出物またはＥ１ｍ製物０標準化に有用である。本発明のペプチドを使用することにより、一定の充分に定められた組成および生物学的活性を有するアレルゲン調製物を調製し、治療目的で（たとえば、家屋ダニ感受性の個体のアレルギ一応答を変えるために）投与することができる。ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆ■ペプチドまたはタンパク質（または下記に記載するような、それらの修飾形）は、たとえば、ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒ　ｆ　ｎに対するＢ−細胞の応答、ＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆｎに対するＴ−細胞の応答、または両方の応答を変えることができる。

同様に、ＤｅｒｐＩまたはＤｅｒｐＩ＋タンパク質またはペプチドは、０ｇ２　Ｉまたは旦虹」ｒｌに対するＢ−細胞および／またはＴ−細胞の応答を変えるのに用いることができる。精製アレルゲンはまた、家屋ダニ、とりわけＤｅｒｆＩ、ＤμｒｆＩＩ、ＤｅｒｐＩおよび２虹」ＴＩに対するアレルギーの免疫治療のメカニズムを研究するために、および非修飾（「天然に存在する」）ペプチドよりも免疫治療において一層有用な修飾された誘導体または類似体を設計するために用いることもできる。

どの交差反応性のエピトープが存在する場合においては、交差反応性のエピトープを含む分子の領域は、共通のエピトープを有する２つの（またはそれ以上の）ダニ種に対するアレルギーを治療するに際して投与すべき共通の免疫治療ペプチドとして使用することができる。たとえば、これら交差反応性のエピトープは、両方のアレルゲン（たとえば、ＤｅｒｆｌおよびＤｅｒｐＩアレルゲン）に対するＩｇＧブロッキング抗体を誘発するのに用いることができる。全分子よりも１抗体体エピトープを含有するペプチドの方を用いることができ、このようｔ１価抗体エピトープは、肥満細胞と交差反応することができず脱感作治療に際して有害な副作用を起こすことができないので有利であることがわかった。また、Ｂ細胞エピ　゛トープを担体分子に付着させて、アレルギ一応答に対するＴ！ＩＩ！！制御を指令させるようにすることもできる。

または、選択されたダーマトファゴイデスアレルゲンに特異的なペプチドを調製することも望ましいかまたは必要である。本明細書に記載するように、みかけ上Ｄｅｒｐｌ−特異的な２つのエピトープを同定した。同様の試みは、他の種−特異的なエピトープ（たとえば、ｐｅｒｐＩまたは■、ＤｅｒｆＩまたは■）を同定するために用いることができる。個体中の種−特異的なエピトープに対する抗体の存在は、どのダニ種がアレルギ一応答を引き起こしているかを決定するための迅速な血清学的試験として用いることができる。このことは、個体に提供される治療を原因種に対して特別に標的化することを可能にするものであり、それゆえ、治療効果を高めることを可能にするものである。

他の研究者による仕事によると、一般に高投与量のアレルゲンが最良の結果（すなわち、最良の徴候緩解）を引き起こすことが示されている。しかしながら、多くの人は、これらアレルゲンに対するアレルギ一応答のために大量のアレルゲン投与に耐えることができない。天体に存在するアレルゲンの修飾は、修飾されたペプチドまたは修飾されたアレルゲンが、対応する天然に存在するアレルゲンと同じかまたはより高い治療性能を有するが副作用（とりわけ、アナフィラキシ− 反応）は減少しているような仕方で設計することができる。これらは、たとえば、本発明のペプチド（たとえば、ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆｌｌ、旦虹」ＩまたはＤｅｒ」■のアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチド）であってよい。または、ペプチドの組合せを投与することができる。修飾したペプチドまたはペプチド類似体（たとえば、免疫原性を修飾し、および／またはアレルギー誘発性を減少させるようにアミノ酸配列を変化させたまたは同目的のために成分を付加したペプチド）は、脱感作治療のために用いることができる。

脱感作しようとする個体への本発明のペプチドの投与は、公知方法を用いて行うことができる。単一のペプチドまたは異なるペプチドの組合せの個体への投与は、たとえば、適当な緩衝液、担体および／またはアジュバントを含有する組成物中にて行うことができる。そのような組成物は、一般に注射、吸入、経皮遍心または直腸投与により投与されるであろう。現在利用できる情報を用い、充分な量で感受性個体に投与した場合に該個体のＤｅｒｆｌおよび／またはＤｅｒｆＩＩに対するアレルギ一応答を変えるであろうＤｅｒｆｌまたはＤｅｒｆＩＩペプチドを設計することができる。このことは、たとえば、ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆｎの構造を調べ、家屋ダニ感受性個体におけるＢ−細胞および／またはＴ−細胞応答に影響を与える能力について調べようとするペプチドを産生させ、ついでこれら細胞により認識される適当なエピトープを選択することにより行うことができる。上記エピトープのアミノ酸配列を模倣しＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆｌＩアレルゲンに対するアレルギ一応答を下方制御することのできる合成アミノ酸配列を調製することができる。本発明のタンパク質、ペプチドまたは抗体は、公知方法において旦ｅｒｆＩまたはＤｅｒｆＩｌｒに対するアレルギ一応答を検出および診断するために用いることができる。このことは、たとえば、これらアレルゲンの一つに対する感受性について評価しようとする個体から得た血液を、該血液中の成分（たとえば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と該ペプチドとの結合および刺激のために適当な条件下で家屋ダニの単離アレルゲン性ペプチドと接触させ、ついでそのような結合が起こる程度を決定することにより行うことができる。０ｇ２　Ｉおよび旦虹」■タンパク質またはペプチドもまた、脱感作および感受性の診断のために同様に用いることができる。Ｄｅｒｆおよび旦虹」タンパク質またはペプチドは、両アレルゲンタイプに感受性の個体を治療するために一緒に投与することができる。

また、家産ダニ感受性個体においてアレルギー反応を引き起こすＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆＵの能力をブロックまたは抑制し得る剤または薬を設計することも今や可能である。そのような剤の設計は、たとえば、それらアレルゲンは関連する抗ＤｅｒｆＩまたは抗ＤｅｒｆＩＩＴｇＨに結合するので、ＩｇＥ−アレルゲン結合およびそれに続く肥満細胞の脱顆粒を防ぐような仕方で行うことができる。

また、そのような剤は免疫系の細胞成分と結合することができ、その結果、これらアレルゲンに対するアレルギ一応答の抑制または脱感作となる。このことの非制限的例示は、適当なり一細胞およびＴ−細胞エビトープペプチドの使用、またはＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆＩＩアレルゲンに対するアレルギ一応答を抑制する本発明のｃＤＮＡ／タンパク質構造に基づいた、その修飾形の使用である。このことは、ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆｎ−感受性個体からの血球を用いたインビトロの研究においてＢ−細胞およびＴ−細胞の機能に影響を与えるＢ−細胞およびＴ−細胞エピトープベブチドの構造を決定することにより行うことができる。このことはまた、ＤｅｒｐＩまたはＤｅｒｐＩＩに対するアレルギ一応答をブロックするために、これらアレルゲンに対しても適用することができる。

ＤｅｒｆｌまたはＤｅｒｆｎまたは少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子クローニングなどの公知方法を用いてさらに別のペプチドを調製することもできる。本発明のタンパク質またはペプチドの製造法は、たとえば、発現ベクター（選択されたアレルゲン性タンパク質またはペプチド（たとえば、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｆＵまたは少な（とも一つのエピトープを含むペプチド）の全部または一部をコードするＤＮＡを含有する）を含む宿主細胞を培養することを包含する。該ＤＮＡ挿入物の発現（コードされたタンパク質またはペプチドの製造）に適した条件下で細胞を培養する。ついで、公知方法を用い、発現された生成物を回収する。別法としては、アレルゲンまたはその部分を公知の機械的または化学的方法を用いて合成することもできる。本明細書において使用するタンパク質またはペプチドなる語は、これら方法により製造されるあらゆるタンパク質またはペプチドをさす。得られたペプチドを、今度は上記のようにして用いることができる。

この発明のいずれかの態様において使用するＤＮＡは、本明細書に記載する方法により得られたｃＤＮＡであってよく、または図２および図６に示す配列の全部または一部を有するあらゆるオリゴデオキシヌクレオチド配列、またはその機能的等価物であってよい。そのようなオリゴデオキシヌクレオチド配列は、公知方法を用いて化学的または機械的に製造することができる。オリゴヌクレオチド配列の機能的等価物とは、図２および図６の配列（または、その対応配列部分）がハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、および／またはこれら図に示す配列（または、その対応配列部分）によりコードされる生成物と同じ機能的特性を有する生成物（たとえば、ポリペプチドまたはペプチド）をコードするものである。機能的等優性がこれら一方または両方の基準に適合する必要があるかどうかは、その使用に依存する（たとえば、オリゴプローブとしてのみ使用するのであれば東−の基準さえ適合すればよく、家産ダニアレルゲンを製造するために用いるのであれば第二の基準に適合する必要がある）。

いまや利用できる構造に関する情報（たとえば、ＤＮＡ、タンパク質／ペプチド配列）はまた、ダーマトファゴイデス・ファリネアレルゲンに対するアレルギー反応において重要なＴ細胞エビトープペプチドおよび／またはＢ細胞エピトープベブチドを同定または規定するために、およびこれら反応が起こるメディエータ −またはメカニズム（たとえば、インターロイキン−２、インターロイキン−４、γインターフエロン）を解明するために用いることもできる。この知識により、ペプチドに基づく家産ダニ治療剤またはこれら応答を調節するために用いることのできる薬を設計することが可能になる。

本発明を下記実施例によりさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定することを意図するものではない。

コモンウエルス・シーラム・ラボラトリーズ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　５ｅｒｕａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＸパークビル、オーストラリア）からダニを購入した。

ダーマトファゴイデス・ファリネｃＤＮＡ２ｇｔｌｌライブラリーの構築生きたダーマトファゴイデス・ファリネからポリアデニル化ｍＲＮＡを単離し、キット（アマーンヤム・インターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、パックス）を用いたＲＮａｓｅＨ法（ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｖ、　）およびホフマン（Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆｆｍａｎ）、Ｇ　ｅｎｅ、２５　：　２６３〜２６９（１９８３））によりｃＤＮ、Ａを合成した。

ＥｃｏＲＩリンカ−（二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ。

１ａｂｓ）、ベバリー、マサチューセッツ州）を加えた後、上記ｃＤＮＡをアルカリホスファターゼ処理２ｇ１１１アーム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ライスコンシン州）にライゲートした。ライゲートしたＤＮＡをパッケージングし、大腸菌Ｙ１０９０（ｒ−）中にブレーティングして２Ｘ１０’組換え体のライブラリーを得た。

ダーマトファゴイデス・ファリネｃＤＮＡ　λｇｔｌｌライブラリーからのＤｅｒｆ　Ｉ　ｃＤＮＡクローンの皇離ライブラリーのスクリーニングは、位置指定突然変異誘発（チュア（Ｃｈｕａ、Ｋ。

Ｙ、）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１６ユ：　１７５〜１８２（１９８８））によりアミノ酸残基−１と１との間および残基１１６と１１７との間に２つのＢａｍＨＩ制限部位７からなる２つのプローブとハイブリダイズさせることにより行った。これらプローブをニックトランスレージコンにより３ｊｌｐで放射性標識した。ファージを１５Ｑｍｍペトリ皿当たり２０．０００ｐｆｕにてブレーティングし、プラークをニトロセルロースに移しくシュライヒヤー・アンド・シュル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌｌ）、ダッセル、ＦＲＧ）、変性し、焼き付けた（マニアチスら、モレキユラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル、コールドスプリングノー−バーラボラトリ−プレス（１９８２））。５０％ホルムアミド１５ＸＳＳＣＥ／ｌｘデンハルト／ポリＣ（０，１ｍｇ／ｍｌ）／ポリＵ（０，１ｍｇ／ｍ＋）中、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行い、４２℃、１０’ｃｐｍ／ｍｌにて一夜ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、２Ｘ塩化ナトリウムクエン酸塩（Ｓ　Ｓ　Ｃ）１０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０゜５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで順番に室温にて１５分間行い、最後に０，１ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳ中、５０℃にて３０分間行った。

λｇｔｌｌ　ｆｌ　ｃＤＮＡクローンからのＤＮＡの単離λｇｔｌｌ　ｆｌクローンからのファージＤＮＡの調製を迅速な単離法により行った。清澄化したファージプレート溶解液（１ｍｌ）を２．５ＭＮａＣｌ中の２５％ｗ　ｔ　／　ｖ　ｏ　１ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００Ｘ２７０μＬ）と混合し、室温にて１５分間インキュベートした。ついで、この混合物をミクロ遠心管（エッペンドルフ、ＦＲＧ）中で５分間回転させ、上澄み液を除去した。得られたペレットを、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１００ｍＭＮａＣ］を含有する１０ｍＭトリス／ＨＣＩ、ｐＨ８，０（１００μＬＸＴＥ）中に溶解した。このＤＮＡ調製物をフェノール／ＴＥで抽出し、フェノール相を１００μ］　ＴＥで洗浄し、ついでプールした水性相をフェノール／ＴＥでさらに２回、リーダー（Ｌｅｄｅｒ）フェノール（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール；２５：２４＋１）で２回、クロロホルムで１回抽出し、ＤＮＡをエタノールにより沈澱させた。

ＤＮＡ配列分析のためのクローンを得るため、上記λｇｔｌｌ　ｆｌファージＤＮＡをＥｃｏＲＩｆ１９！醇素（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）で消化し、得られたＤＮＡ挿入物をＥｃｏＲＩ消化Ｍ１３−由来シーフェンシングベクターｍｐ１８およびｍ＋）１９（マニアチスら、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス（１９８２））にライゲートした。形質転換は大腸菌ＴＧ−１を用いて行い、シーフェンシングはンークエナーゼバージョン２，０ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕ。

Ｓ、　Ｂ、、クリーブランド、オハイオ州）を用い、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーンヨン法（サンガーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ヱマ：５４６３〜５４６７（１９７７））により行った。

複製連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）ＰＣＲは、ＴａｑＰａｑキット（バイオチック・インターナショナル（Ｂ　１ｏｔｅｃｈＩ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ベントレイ、ワシントン州）および供給者により推薦される条件を用いたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ法（サイキ（Ｓ　ａｉｋｉ、　Ｒ，Ｋ、）ら、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ１２３９：４８７〜４９１（１９８８））により、１ｏｎＨの標的ＤＮＡおよび１０ピコモルのλｇｔｌｌプライマー（二ニー・イングランド・バイオチック、ベバリー、マサチューセッツ州）を用いて行った。

結果Ｄｅｒｆ　Ｔ　ｃＤＮＡクローンの単離主要なダニアレルゲンであるＤｅｒｆｌを発現する２つのクローンを、旦虹」Ｉ　ｃＤＮＡプローブ（ヌクレオチド１− ３４８および３４９−８５７）の両方にハイブリダイズする能力によりダーマトファゴイデス・ファリネｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　λｇｔｌｌライブラリーから単離した。この方法を採用したのは、アミノ酸シークエンンングによりこれら２つのアレルゲン間に高い相同性（８０％）が示されたからである（トーツス（Ｔｈｏ＋ｎａｓ、　Ｗ、　Ｒ，）ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳ１４　：１３９〜１４７（１９８９））。このλｇｔｌｌ　ｆｌクローンＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化してｃＤＮＡ挿入物を放出することにより、３つのＤｅｒｆｌｃＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ断片ニ一つの約８００塩基長のもの、および１対の約１５０塩基長のものか得られた。Ｄｅｒｆ　Ｉ　ｃＤＮＡ挿入物はまた複製連鎖反応（ＰＣＲ）によりファージＤＮＡから増幅させて約１．１ｋｂのＰＣＲ生成物とすることもできた。各Ｄｅｒ　ｆ　Ｉ　ｃＤＮＡ断片をＭ１３−由来シーフェンシングベクターｍｐ１８およびｍｐ１９中に別々にクローニングし、シーフェンシングした。

ＤＮＡ配列分析ｌｆｆ１ｌに示すンークエンシング法を用いてＤｅｒｆ　Ｉ　ｃＤＮ、Ａのヌクレオチド配列を決定した。完全な配列は長さが１０８４塩基であることが示され、３３５−塩基長の５°近位端配列、導かれた分子量が２５．１９１で２２３アミノ酸の全天で配したのは、該天然タンパク質のＮＨ２−末端アミノ酸シークエンシングによって得られたデータおよび組換えＤｅｒｐｌの予測されたアミノ酸配列に基づいていた（チュアら、Ｊ、Ｅｒｐ、Ｍｅｄ、、　１６ヱ：　１７５〜１８２（１９８８））。ＮＨ，−末＊ＶＯａ中のＤｅｒｆ　Ｉ　ｃＤＮＡの予測されたアミノ酸配列は、タンパク賀レベルで決定されたものと完全に一致していた（図２）。

完全な成熟タンパク質は、ヌクレオチド位１００７〜１００９のＴＧＡ停止コドンで終わる単一のオーブンリーディングフレームによりコードされている。ヌクレオチド位４２〜４４の最初のＡＴＧコドンは、それに続く配列が典型的なシグナルペプチド配列をコードするので語釈開始部位であると思われる。

アミノ酸配列分析ヌクレオチド分析により予測されるアミノ酸配列を図２に示す。成熟旦虹」■およびＤｅｒｆＩのアミノ酸配列を整合して並べたものに示すように（図３）、これら２つのタンパク質の間に高い相同性が観察された。配列相同性分析によると、以前の通常のアミノ酸シークエンシングにより予測されたように、ＤｅｒｆＩタンパク質はｐ竺」Ｉタンパク質と８１％の相同性を示すことが明らかになつカテプノンＨおよびカテプンンＢについて決定した残基に基づいて、Ｄｅｒ　ｆ　１タンパク質においても保存されていた。その残基は、グルタミン（残基２９）、グリシン、セリンおよびシスティン（残基３３〜３５）、ヒスチジン（残基１７１）およびアスパラギン、セリンおよびトリプトファン（残基１９１〜１９３Ｘ番号はＤｅｒｆｌのものである）である。予測される成熟Ｄｅｒｆｌアミノ酸配列は、５３〜５５位に可能なＮ−グリコジル化部位（Ａｓｎ−Ｔｈｒ　−５ｅｒ）を含んでおり、該スティンプロテアーゼについてそうであるように（図４）、Ｄｅｒ　ｆ　Ｉタンパク質がプレ形およびプロ形の中間体を有していることが示された。すでに記載したように、位置−９８のメチオニン残基は開始メチオニンであると思われる。この仮定は、まず第一に、残基−９８〜−８１からの５゛近位端配列が主として疎水性アミノ酸残基からなり（７２％）、これはシグナルペプチドの特徴であることに基づいている（）イン・ヘイジン、ＥＭＢＯＪ、、３：２３１５〜２３２３（１９８４））。第二に、仮定されたプレペプチド（１８アミノ酸残基）およびプロペプチド（８０残基）の長さが他のシスティンプロテアーゼのプレペプチドおよびプロペプチドの長さと類似している（図４）。調べたたいていのシスティンプロテアーゼは約１２０のプレブロエンザイム残基を有しくそのうち、平均１９！を基がシグナルペプチドを形成する）、カテプシンＢは最も小さくて８０である（イシド−（Ｉ　５ｈｉｄｏｈ、　Ｋ、　）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　’ｌ’ｌ旦：　３２〜３７（１９８７））。ＤｅｒｆＩは、全部で９８のプレブロエンザイム残基にてこの範囲に含まれる。

フィン・ヘイジンにより概略が示されたシグナル配列開裂部位の予測法に従うことにより、プロエンザイム形成のためのプレＤｅｒｆＩ配列からの開裂がＡｌａ（−８１）とＡｒｇ（−８０）との間にあるシグナルペプチダーゼ開裂部位にて起こることが提唱される（）イン・ヘイジン、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ、　１３３　：１７〜２１　（１９８８）およびＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｃｈｅｔ、１８４　：　９９〜１０５（１９８５））、それゆえ、残基−９８から−８１の配列はリーダーペプチドをコードし、ＤｅｒｆＩのブロエンザイム部分は残基Ａｒｇ（−８０）から始まり残基Ｇｌｕ（−１）で終わる。

実施例２ＤｅｒｆｎをコードするｃＤＮＡの単離および特徴付は材料および方法アミノ酸配列分析ム［ユよｆ１上１ビエニにユニ２ヱｙ顛乏ヱ亡シＬ４東ｙダーマトファゴイデス・ファリネをコモンウエルス・シーラム・ラボラトリーズ（パークビル、オーストラリア）から購入し、記載に従ってｍＲＮ　Ａ（ポリアデニル化ＲＮＡ）を調製するのに用いた（スチニアート（Ｓ　ｔｅｖａｒｔ、　Ｇ、　Ａ、　）およびトーツス（Ｗ、　Ｒ，Ｔｈｏｍａｓ）、ｒｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　ｌｍ１ｕｎｏ１．、８３　：　３８４〜３８９（１９８７））。このｍＲＮＡを約０．５μｇ／μｌｌニー７懸濁し、５μｇを用いてＲＮａｓｅＨ法（ガブラーおよびホフマン、Ｇｅｎｅｓ　２旦：２６３〜２６９（１９８３））によりキット（アマ−ジャム・インターナショナル、パックス）を用いてｃＤＮＡを調製した。ヒューン（Ｈｕｙｎｂ）らにより記載された方法（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｃＤＮＡ　１ｉｂｒａｒｉｅｓ　ｉｎ　ｇｔｌ　Ｏａｎｄ　ｇｔｌ　１．　Ｉ　ｎ；ＧｌｏｖｅｒB ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｏｌ、　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　４７〜７８頁、ＩＲＬプレス、オックスフォード（１９８５））に従ってＥｃｏＲＩリンカ−（アマ−ジャム、ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を結合させた。ついで、溶出に０，５Ｍアルギニン塩基を用いた他はサンプルツクらのプロトコール６．２４（サンプルツクら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、第２版、コールドスプリング７％　−ｔ　（−ラボラトリ−プレス（１９８９））に従い、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動によるアガロースゲル精製からＤＥＡＥ膜（シュライヒヤー・アンド・シ二エル、ダッセル、ＦＲＧ、ＮＡ−４５）中に回収した。ついで、このｃＤＮＡをλｇｔｌ。

およびλｇｔｌｌ中に２＝１のアーム／挿入比にてライゲートした。幾つかをプラークライブラリーのためにパッケージングし、アリコートを下記複製連鎖反応により配列を単離するために保持した。

複製連鎖反応によるＤｅｒ　ｆ　ＩＩ　ｃＤＮＡ（Ｄｊｌｌ離Ｄｅｒｆ　ｒｌｃＤＮＡを単離するため、０ｇ３ＴＩのＮ−末端配列に基づいてオリゴヌクレオチドブライマーを調製した。というのは、これら領域においてそれらのアミノ酸配列が同一であるからである（ヘイマンら、Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、　Ｉｓ■Ｕｎｏ１．　、旦３　：　１０５５〜１０８７（１９８９））。ブライｖ− ＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＧＣ−３’を用いた。最初のＧＧＡＴＣＣはＢａｍＨＩ部位をコードし、以下の配列ＧＡＴ、、、はＤｅｒｐｌＩの最初の４残基をコードする。

他のプライマーとして、ＥｃｏＲＩクローニング部位の両側にあるλｇｔｌｌＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧ−３’逆プライマーを用いた（二ニー・イングランド・バイオラブズ、ベバリー、マサチューセッツ州）。２虹」Ｈプライマーの設計は、約５０〜６０％Ｇ−Ｃを有するように、およびコドンの第三の塩基ではなく、第一または第二の塩基で終わるようにして行った（グールド（Ｇｏｕｌｄ、　Ｓ、　Ｊ、）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８６　：　１９３４〜１９３８（１９８９）；すｖ−（ＳｕＩＩＩＩｅｒ、　Ｒ，）およびタウツ（Ｄ、　Ｔａｕｔｚ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

、１７：６７４９（１９８９））。

ＰＣＲ反応は、６７ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８，８，２５℃）、１６．ａｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ○４．４０ｔｔＭ　ｄＮＴＰｓ、５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、６ｕＭＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌ　ゼラチン、２　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　！、１０ピコモルの各プライマーおよび２単位のＴａｑポリメラーゼを含有する２５μｍの最終反応容量で行った。約０．００１μｇの標的ＤＮＡを加え、管の中身を混合し、パラフィン油を重層した。管を最初９５℃で６分間変性し、ついで５５℃で１分間アニールし、７２℃で２分間伸長させた。その後は３８サイクルを、変性を３０秒開行い、アニーリングおよび伸長を上記と同様にして行った。最後の（４０回目）サイクルにおいては、伸長反応を１０分間に伸ばして、増幅したすべての生成物が完全長であることを確実にした。Ｎ−末端プライマーにおけるずれ（ｖａｉｓ■ａｔｃｈｅｓ）を容認するために、アニーリング温ＩをオリゴヌクレオチドブライマーのＴｍ（式：　Ｔｍ＝６９．３＋０６４１（Ｇ＋Ｃ％）　６５０／オリゴ長　により決定）よりも意図的にわずかに低く設定した。

ついで、５μｍの反応液を１％アガロースゲル上での増幅バンドについて調べた。反応混合物の残りをクロロホルムで抽出してパラフィン油をすべて除去し、低融点アガロースゲル（バイオ−ラド、リッチモンド、カリフォルニア州）上での増幅生成物の精製の前にエタノール沈澱させた。

ＰＣＲ生成物のサブクローニング１０ｍＭトリスＨＣＩ、１０ｍＭＭｇＣｌ、、５０ｍＭ　ＮａＣＬ　０．０２５ｍＭ　ｄＮＴＰおよび１μｌのフレノウ酵素を最終容量１００μｍで含有する反応液中で、精製ＰＣＲ生成物の末端を充填した。３７℃で１５分間反応を行い、７０℃で１０分間熱不活化した。この混合物をエタノール沈澱する前にリーダーフェノール抽出した。得られた平滑末端ＤＮＡを、０．５Ｍ　ＡＴＰ、ｌｘリガーゼ緩衡液および１単位のＴ４リガーゼを含有する反応液中、１５℃で２４時間、Ｓｍａ　Ｉで消化したＭ１３ｍｐ１ｇ中にライゲートし、ＣａＣｌ２法によりコンピテントにした大腸１１ＴＧＩ中に形質転換した。形質転換した細胞をＬ＋Ｇプレート上にローン（ｌａｖｎ）としてブレーティングし、３７℃にて一夜増殖させた。

シーフェンシングのための一本鎖ＤＮＡ鋳型の調製単離した白色プラークをオレンジスティック（ｏｒａｎｇｅ　５ｔｉｃｋ）を用い、２ＸＴＹブロス中にＩ／１００に希釈したＴＧＩ細胞の一夜培養液（２，５ｍ１）中に取り出し、３７℃ で６時間増殖させた。培養液をベレット化し、上澄み液を新たな管中に除いた。

この上澄み液の１ｍ］アリコートに２７０μ】の２０％ポリエチレングリコール、２．５ＭＮａＣ］を加え、管を室温にて１５分間静置させる前に回転撹拌した。ついで、これを再び回転させ、上澄み液をすべて痕跡なく管から除いた。ついで、ベレットを１００μｍのＩＸＴＥ緩衝液中に再懸濁した。少なくとも２回のフェノール：ＴＥ油抽出行い、ついでリーダーフェノール抽出を１回行い、ＣＨＣＬｊ抽出した。ＤＮＡをエタノール中で沈澱させ、最終容量２０μｍのＴＥ緩衝液中に再懸濁した。

ＤＮＡ分析ＤＮＡシークエンシングは、大腸菌ＴＧｌ中でＭ１３由来ベクターｍｐ１８およびｍｐ１９から産生させたＤＮＡおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼバージョン２，０．ＵＳＢコーポレーション、クリーブランド、オハイオ州：制限エンドヌクレアーゼは東洋紡（大阪、日本）からのものであった）を用い、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法（サンガーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４　：　５４６３〜５４６７（１９７７））により行った。一般的な手順はすべて標準的な方法によった（サンプルツクら、ア・ラボラトリ−・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス（１９８９））。配列分析はマツクベクターソフトウエア（Ｍａｃ〜’ｅｃｔｏｒ　５ｏｆｔｖａｒｅＸ　Ｉ　Ｂ　Ｉ、ニューヘブン、コネチカット州）を用いて行った。

するオリゴヌクレオチドブライマー、およびコード部位の両側のλｇｔｌｌ配列のための逆プライマーを用い、λｇｔＩｌ中にライゲートしたダーマトファゴイデス・ファリネｃＤＮＡを用いて配列を増幅した。生成物をゲル電気泳動にかけたときに、約５００ｂｐおよび３００ｂｐの２つの主要なバンドが得られた。これらをＭ１３　ｍｐ１８中にライゲートし、上記５００ｂｐ断片を含有する幾つかのクローンをＤＮＡンークエンシングにより分析した。３つのクローンからはＮ−末端プライマー端からの配列データが得られ、一つのクローンからは他の方向からの配列データが得られた。これら２つの方向からの配列データが重複する部分では、完全な一致が認められた。これらクローンの一つはＮ−末端プライマーから読み始め、一つの塩基の欠失を含んでいて読み取り枠がシフトしていた。

これはコピー上のエラーであると考えられた。というのは、他の２つのクローンではアレルゲンの最初の２０のアミノ酸残基のタンパク質配列と一致していたからである。

正しい読み取り枠を有し一致したクローンの配列を、推定されるアミノ酸配列とともに図６に示す。それは、Ｎ−グリコノル化部位を有さず計算された分子量が１４．０２１ｋＤの１２９残基タンパク質をコードしていた。ＧｅｎＢａｎｋデータベース（６１，０リリース）上で他のタンパク質と比較した場合、相同性は認められなかった。しかしながら、図９の整合に示す、ジｅｒｐＨとは８８％のアミノ酸残基相同性を示した。１６の変化のうち７は保存性であった。保存された残基にはまた、８．２１．２７．７３および１１９位に存在するすべてのシスティンが含まれていた。一般に用いられる酵素のための配列データから得られる制トはほとんど同一である。

２虹」■、２虹」■、２虹ＩＩおよび２虹ｆＩ［をコードする核酸配列におの対立遺伝子変異のために個々のダニで変化するかもしれないことは当業者により評伍されるであろう。そのようなヌクレオチド変化およびその結果としてのアミノ酸多型のすべてが本発明の範囲に含まれる。アミノ酸多型は、興なる２肛」■クローンのシーフェンシングの際に発見された。これら冬型は、図１１に示当業者は、通常の実験により本明細書に記載した特定の態様と均等な多くの物を認識しかつ得ることができるであろう。そのような均等物は、下記請求の範囲により包含される。

Ｑ！！Ｊ２１ＱＩＪＬｉｌＡｌａｌｉｓ　ｘｌａ　Ｔｈｒ　）ｌｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＸＬ＊　Ａｒｇ　ＡｓｐＴＴＣＡＣＣＭＯＬＴＣＧＡＡＣＭＭＴＴＣＭＴＭＣＣＪＡｊｌＡｆｌｍＴＩＣＣ）ＪＧＣπ＾χＧＣ４８１ＣＧｃＴｃＧＣＴＡＣ４９１ＤｐＸＸ−ＣＡＣＡＡＡ？ＴＣＴＴＣＴＴ’ＴＣ］ゴ０コ了にテＡＣＴＣｓｋＴＣＡ１ゴ詰−５０親水性　親水性 ω〜〜−−０ロｏ−Ｍ〜ω　ム〜〜−〇〇ロータ〜ωｉの一１ζ０ζＡ　’−ａ　’０２繭　ψｉ−ムζｏ（１−ロψ０ロロロｏＯロロＱｏロ　ロｏｏｏ口５００ロロロＥＮＤＯＦＡＮＮＥＸフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１２Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｑ　８３１０ −２Ｊ３３１５６９　Ａ　９０１５−２Ｊ（７２）発明者　チュア、カウーヤンオーストラリア連邦、６０６１、ウェスターン・オーストラリア、ノラマラ、ムンジャ・ウェイ・３５番Ｌ　Ｆｌ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンをコードする単離ＤＮＡ、またはダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含むペプチドをコードする単離ＤＮＡ、またはダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンまたはペプチドをコードする単離ＤＮＡにハイブリダイズする単離ＤＮＡ。
２．Ｄｅｒ　ｆ　Ｉをコードする請求項１に記載の単離ＤＮＡ。
３．ダーマトファゴイデス・プテロニシヌスのタンパク質アレルゲンをコードする単離ＤＮＡ、またはダーマトファゴイデス・プテロニシヌスのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含むペプチドをコードする単離ＤＮＡ、またはダーマトファゴイデス・プテロニシヌスのタンパク質アレルゲンまたはペプチドをコードする単離ＤＮＡにハイブリダイズする単離ＤＮＡ。
４．Ｄｅｒ　ｐ　Ｉをコードする請求項３に記載の単離ＤＮＡ。
５．ダーマトファゴイデス属のタンパク質アレルゲンの全部または一部をコードする単離ＤＮＡであって、図２に示すＤｅｒ　ｆ　Ｉのヌクレオチド配列、図６に示すＤｅｒ　ｆ　１Ｉのヌクレオチド配列、および図７に示すＤｅｒ　ｐ　Ｉのヌクレオチド配列よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列の全部または一部を有する単離ＤＮＡ。
６．ダーマトファゴイデス・ファリネの単離タンパク質アレルゲンまたはダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトープを含む単離ペプチド。
７．該ダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンがＤｅｒ　ｆ　Ｉである請求項６に記載の単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。
８．ダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンがＤｅｒ　ｆ　ＩＩである請求項６に記載の単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。
９．ダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンまたはペプチドをコードする単離ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。
１０．Ｄｅｒ　ｆ　Ｉのタンパク質アレルゲンまたはペプチドと抗原交差反応性を有し高い相同性を有するタンパク質アレルゲンまたはペプチド。
１１．機械的または化学的に合成されたか、または請求項１に記載の単離ＤＮＡで形質転換された宿主細胞中で産生されたものである、請求項７に記載の単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。
１２．Ｄｅｒ　ｆ　Ｉの単離タンパク質アレルゲンまたはＤｅｒ　ｆ　Ｉのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドであって、図２に示すＤｅｒ　ｆ　Ｉのヌクレオチド配列の全部または一部を有するＤＮＡによりコードされる単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。
１３．Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩの単離タンパク質アレルゲンまたはＤｅｒ　ｆ　ＩＩのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドであって、図６に示すＤｅｒ　ｆ　ＩＩのヌクレオチド配列の全部または一部を有するＤＮＡによりコードされる単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。
１４．Ｄｅｒ　ｐ　Ｉの単離タンパク質アレルゲンまたはＤｅｒ　ｐ　Ｉのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドであって、図７に示すＤｅｒ　ｐ　Ｉのヌクレオチド配列の全部または一部を有するＤＮＡによりコードされる単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。
１５．ダーマトファゴイデス・ファリネの単離タンパク質アレルゲンまたはダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトープを含む単離ペプチドを含有することを特徴とする診断剤。
１６．Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドを含有する請求項１５に記載の診断剤。
１７．ダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンがＤｅｒ　ｆ　Ｉである請求項１５に記載の診断剤。
１８．ダーマトファゴイデス・ファリネの単離タンパク質アレルゲンまたはダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトープを含む単離ペプチドを含有することを特徴とする治療組成物。
１９．Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドを含有する請求項１８に記載の治療組成物。
２０．ダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンがＤｅｒ　ｆ　Ｉである請求項１８に記載の治療組成物。
２１．図７に記載のアミノ酸配列を有するダーマトファゴイデス・プテロニシヌスの単離タンパク質アレルゲン、または図７に示すアミノ酸配列の一部を有するダーマトファゴイデス・プテロニシヌスのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドをさらに含有する請求項１８に記載の治療組成物。
２２．図７に記載のアミノ酸配列を有するダーマトファゴイデス・プテロニシヌスの単離タンパク質アレルゲン、または図７に示すアミノ酸配列の一部を有するダーマトファゴイデス・プテロニシヌスのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドを含有することを特徴とする治療組成物。
２３．ダーマトファゴイデス・ファリネ種の家塵ダニに対する個体の感受性の治療方法であって、該個体にＤｅｒ　ｆ　Ｉ、Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩまたはそれらの組合せの単離タンパク質アレルゲンを治療学的有効量で投与することを特徴とする方法。
２４．ダーマトファゴイデス・ファリネ種の家塵ダニに対する個体の感受性の治療方法であって、該個体にＤｅｒ　ｆ　Ｉ、Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩまたはそれらの組合せの単離ペプチドであって該タンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含むものを充分量で投与することを特徴とする方法。
２５．ダーマトファゴイデス・ファリネ種の家塵ダニに対する個体の感受性の検出方法であって、該個体にダーマトファゴイデス・ファリネの単離タンパク質アレルゲンまたはダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドを充分量で投与し、ついで該個体において該タンパク質アレルゲンに対するアレルギー応答が起こるかどうかを決定することを特徴とする方法。
２６．ダーマトファゴイデス・ファリネのタンパク質アレルゲンがＤｅｒ　ｆ　ＩまたはＤｅｒ　ｆ　ＩＩである請求項２５に記載の方法。
２７．ダーマトファゴイデス・ファリネ種の家塵ダニに対する個体の感受性の検出方法であって、血液成分がＤｅｒ　ｆ　ＩまたはＤｅｒ　ｆ　ＩＩと結合するのに適当な条件下で該個体の血液試料を単離Ｄｅｒ　ｆ　Ｉ、Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩまたはＤｅｒ　ｆ　ＩとＤｅｒｆ　ＩＩの両方と混合し、ついでそのような結合が起こる程度を決定することを特徴とする方法。
２８．家塵ダニ感受性の個体に投与した場合に該個体に家塵ダニに対するアレルギー応答を引き起こす、ダーマトファゴイデス属の修飾タンパク質アレルゲンまたはダーマトファゴイデス属のタンパク質アレルゲンの修飾ペプチド。
２９．ダーマトファゴイデス属のタンパク質アレルゲンがＤｅｒ　ｆ　ＩまたはＤｅｒ　ｆ　ＩＩである請求項２８に記載の修飾タンパク質アレルゲンまたは修飾ペプチド。
３０．ダーマトファゴイデス・プテロニシヌスの単離タンパク質アレルゲンまたはダーマトファゴイデス・プテロニシヌスのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトーブを含む単離ペプチドであって、図１１に示すＤｅｒ　ｐ　ｉのアミノ酸配列の全部または一部を有する単離タンパク質アレルゲンまたは単離ペプチド。