ES2354820T3 - Proteínas de fusión que comprenden alérgenos modificados de la familia ns-ltps, utilización de las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden. - Google Patents
Proteínas de fusión que comprenden alérgenos modificados de la familia ns-ltps, utilización de las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2354820T3 ES2354820T3 ES05708860T ES05708860T ES2354820T3 ES 2354820 T3 ES2354820 T3 ES 2354820T3 ES 05708860 T ES05708860 T ES 05708860T ES 05708860 T ES05708860 T ES 05708860T ES 2354820 T3 ES2354820 T3 ES 2354820T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- allergens
- fusion protein
- baselineskip
- amino acid
- parj1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Proteína de fusión caracterizada por el hecho de que las secuencias de aminoácidos de los diferentes alérgenos Parj1 y Parj2, pertenecientes a la familia de las proteínas de transferencia de lípidos no específicas (ns-LTPs) de la especie Parietaria judaica, por el hecho de que dichas secuencias no presentan uno o más de los cuatro puentes disulfuro presentes en la secuencia de los alérgenos de tipo salvaje, encontrándose comprendido por lo menos uno en la región aminoterminal ente los residuos aminoácidos 1 y 30, y por el hecho de que dichas secuencias mantienen esencialmente la misma longitud que las secuencias de los alérgenos de tipo salvaje.
Description
Proteínas de fusión que comprenden alérgenos
modificados de la familia ns-LTPs, utilización de
las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden.
La presente invención se encuentra comprendida
dentro de los campos de la prevención y el tratamiento de los
síntomas alérgicos asociados a alérgenos pertenecientes a la familia
de las proteínas de transferencia de lípidos no específicas
(ns-LTPs).
Las proteínas ns-LTPs son
moléculas proteicas pequeñas, de aproximadamente 10 kDa, que
demuestran una elevada estabilidad y se encuentran naturalmente
presentes en todos los organismos vegetales estudiados hasta hoy.
Estas proteínas se caracterizan por su capacidad de transportar
lípidos a través de las membranas in vitro.
En varias especies también han sido
identificadas como alérgenos, tal como en el caso de las rosáceas
prunoideas (melocotón, albaricoque, ciruela) y las pomoideas
(manzana), así como en urticáceas como la Parietaria. El
género Parietaria incluye 5 especies, siendo P.
judaica la más alergénica.
La reacción alérgica, también denominada
hipersensibilidad de tipo I, es inducida por una respuesta mediada
por IgE frente a antígenos ambientales, habitualmente inocuos y
presentes, por ejemplo, en granos de polen. La interacción
IgE/alérgenos es el suceso inicial de una cascada de reacciones que
conduce a la liberación de mediadores, como la histamina,
responsables de la sintomatología alérgica. En el caso de que se
localicen a nivel de la piel, la liberación de histamina provoca
picor, eritema y edema, mientras que, en el caso de que sea
generalizada, provoca broncoconstricción a nivel broncopulmonar y
fenómenos importantes que implican el sistema cardiovascular.
Las enfermedades alérgicas más comunes son la
rinitis, la conjuntivitis, la urticaria, el angioedema, el eccema,
la dermatitides, el asma y, en casos extremos, el choque
anafiláctico.
La tecnología del ADN recombinante ha permitido
aislar diversos alérgenos de la familia de las
ns-LTPs, entre ellos los alérgenos principales de
Parietaria, denominados Parj1 y Parj2 (Colombo P. et
al., The allergens of Parietaria, Int. Arch. Allergy
Immunol. 130(3):173-9, 2003, revisión).
Parj1 es una proteína de 176 aminoácidos y un
peso molecular de 18.450 kDa. La secuencia
N-terminal muestra una composición de aminoácidos
característica de secuencias de señal de las proteínas glucosiladas.
La proteína madura está compuesta de 139 aminoácidos, con un peso
molecular de 14.726 kDa. Es un alérgeno importante, debido a que se
une a más de 90% de los sueros de sujetos alérgicos a Parietaria
judaica (Costa et al., cDNA cloning, expression and
primary structure of Parj1, a major allergen of Parietaria
judaica pollen, FEBS Lett.
341(2-3):182-6, 21 de marzo
de 1994).
Parj2 es una proteína de 133 aminoácidos y
contiene un péptido de señal de 31 aminoácidos. La proteína madura
está compuesta de 102 aminoácidos, con un peso molecular de 11.344
kDa. Muestra una homología de 45% con Parj1 a nivel de los
aminoácidos y también es un alérgeno importante, debido a que
reacciona con la práctica totalidad de los sueros de los sujetos
alérgicos (Duro G. et al., cDNA cloning, sequence analysis
and allergological characterization of Parj2.0101, a new major
allergen of the Parietaria judaica pollen, FEBS Lett.
399(3):295-8, 1996).
A pesar de su homología estructural, Parj1 y
Parj2 son, sin embargo, alérgenos independientes que contienen
epítopos que también son independientes, tal como han subrayado los
experimentos de inhibición cruzada. En el caso de que un grupo de
sueros procedentes de sujetos alérgicos se preincube con los
alérgenos Parj1 y Parj2 recombinantes, la unión de IgE a la región
de 10-14 kDa resulta totalmente inhibida, sugiriendo
que únicamente estos dos alérgenos se encuentran presentes en esta
región y que conjuntamente son capaces de inhibir la mayoría de las
IgE específicas contra los alérgenos de Parietaria judaica
(Tabla en fig. 8).
Los alérgenos Parj1 y Parj2 muestran todas las
características de las ns-LTPs y el modelo
estructural de Parj1 se determinó utilizando el cristal de la
ns-LTP de la semilla de soja como referencia. Según
dicho modelo, ambas moléculas presentan 4 puentes disulfuro, en el
orden 4-52, 14-29,
30-75 y 50-91. Todas las proteínas
ns-LTP consideradas, en el caso de que se encuentren
convenientemente alineadas tal como se ilustra en la fig. 2 de la
solicitud de patente WO nº A-02/20790, contienen
cuatro puentes disulfuro entre los residuos cisteína en las
posiciones correspondientes a las posiciones anteriormente indicadas
de Parj1 o de Parj2.
Mediante la aplicación de una estrategia de
mutagénesis específica de sitio, anteriormente se había demostrado
la relevancia de los puentes disulfuro para la formación de los
epítopos de IgE (patente WO nº A-02/20790) y la
existencia de un epítopo dominante en la región bucle1 comprendida
entre los aminoácidos 1 y 30 (Colombo P. et al.,
Identification of an immunodominant IgE epitope of the Parietaria
judaica major allergen, J. Immunol.
160(6):2780-5, 1998).
Desde un punto de vista terapéutico, existen
diversos tratamientos farmacológicos de la sintomatología alérgica,
mientras que la terapia preventiva únicamente se encuentra
representada por la inmunoterapia específica (SIT). Esta terapia
prevé la administración subcutánea de cantidades diluidas de
alérgeno en el paciente, de manera que se suprime la reacción
específica hacia el alérgeno. Sin embargo, la mayor parte de los
extractos de proteínas comerciales utilizados para ello son, de
todas maneras, extractos crudos, mezclas de varios componentes en
los que resulta difícil una estandarización precisa del componente
alergénico. De esta manera, la estrategia SIT puede comprender la
administración de componentes alergénicos para los que no es
sensible el paciente, induciendo la producción de IgEs específica
contra otros componentes del extracto. Además, la administración
del alérgeno total implica un riesgo de efectos secundarios, que
incluso podrían provocar un choque anafiláctico. Con el fin de
eliminar algunas de las desventajas indicadas en la presente
memoria, se han desarrollado moléculas alternativas con efectos
secundarios reducidos, es decir, capaces de no interactuar con las
IgE, manteniendo simultáneamente la capacidad de inmunosuprimir la
respuesta de células T y la capacidad de estimular la producción de
inmunoglobulinas IgG.
El trabajo anterior de los presentes autores,
dado a conocer en la solicitud de patente WO nº
A-02/20790, se encuentra comprendido dentro del
mismo alcance. Mediante manipulación genética se produjeron formas
variantes, o muteínas, de alérgenos ns-LTP,
caracterizados por la eliminación parcial o total de los puentes
disulfuro típicos de la proteína nativa. Estas muteínas presentaban
una actividad alergénica reducida con características que las
convertían en útiles en la SIT como moléculas que sustituyen a las
proteínas nativas.
Un enfoque diferente es el descrito por B.
Linhart en la solicitud de patente EP nº A-1 219
301. En este caso, se describen polipéptidos híbridos que contienen
por lo menos dos proteínas alergénicas de tipo salvaje o fragmentos
de las mismas. En alérgenos Phl-p de polen de
Phlenum pratense o en alérgenos parásitos Der, Linhart
observó una alergenicidad reducida de los péptidos híbridos.
Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de
nuevas herramientas que resulten útiles para el tratamiento de
formas alérgicas específicas, tales como aquéllas causadas por las
proteínas ns-LTPs; herramientas que aúnen las
características de alergenicidad reducida con la efectividad
inmunoterapéutica elevada y la fácil accesibilidad con respecto a
tanto su preparación como a su utilización. El alcance de la
presente invención es satisfacer esta necesidad.
Los estudios epidemiológicos han demostrado que
los sujetos generalmente alérgicos a diversas plantas pertenecientes
al mismo género, o a la misma especie, o incluso a una única
variedad vegetal específica, en la mayoría de casos presentan IgEs
contra una pluralidad de alérgenos producidos por la planta. Por
ejemplo, en el caso de los sujetos alérgicos a Parietaria
judaica, habitualmente presentan IgEs contra los dos alérgenos
principales, es decir las proteínas Parj1 y Parj2. Tal como se
subraya en la figura 8 (Tabla) en un ensayo de inhibición de la
unión entre las IgEs humanas en suero de pacientes alérgicos a PJ y
un extracto de P. judaica, el porcentaje de inhibición
inducido por la mezcla de Parj1 y Parj2 de tipo salvaje
habitualmente es más alto que el inducido por los alérgenos
individuales. Por lo tanto, cualquier formulación terapéutica
adecuada para el tratamiento de la alergia debería comprender todos
los alérgenos principales, o muteínas de los mismos, producidos por
una o más de las plantas responsables de la alergia.
La presente invención se basa en el inesperado
descubrimiento de que las proteínas híbridas, obtenidas mediante la
fusión de las secuencias polipeptídicas de una pluralidad de
alérgenos en forma mutada, presentan características que resultan
ventajosas desde el punto de vista tanto terapéutico como
preparativo, así como con respecto al control del medicamento en
comparación con las simples mezclas de una pluralidad de
alérgenos.
El objeto principal de la presente invención son
proteínas de fusión que comprenden secuencias de aminoácidos de los
diferentes alérgenos Parj1 y Parj2, pertenecientes a la familia de
proteínas ns-LTPs, en los que dichas secuencias no
presentan uno o más de los cuatro puentes disulfuro presentes en la
secuencia de los alérgenos de tipo salvaje, en particular que no
presentan por lo menos un puente disulfuro en la región
aminoterminal comprendida entre los residuos aminoácidos 1 y 30. La
secuencia de aminoácidos de cada uno de los alérgenos ha mutado
independientemente mediante eliminación o sustitución de uno o más
de los residuos cisteína implicados en la formación de un puente
disulfuro, aunque manteniendo esencialmente la misma longitud de las
secuencias de los alérgenos de tipo salvaje.
Los alérgenos de la invención son producidos por
plantas pertenecientes al mismo género, o a la misma especie, o
preferentemente a la misma variedad vegetal. En una realización
preferente, la proteína de fusión es una proteína heterodimérica
que comprende las secuencias de aminoácidos de dos alérgenos
diferentes, por ejemplo alérgenos de la misma planta, tales como
los alérgenos Parj1 y Parj2 de la especie Parietaria
judaica.
En este caso, ambas secuencias de aminoácidos,
de los alérgenos Parj1 y Parj2, serán modificadas independientemente
mediante la sustitución de los residuos cisteína con residuos no
capaces de formar un puente disulfuro en las posiciones 29 y 30 ó
4, 29 y 30 ó 29, 30, 50 y 52.
Son objetos adicionales de la invención una
secuencia de nucleótidos que comprende el ADN codificante de la
proteína de fusión de la invención, un sistema de expresión o de
clonación que comprende la secuencia de nucleótidos en cuestión
flanqueada por secuencias adecuadas para controlar, estimular y
regular la expresión, y una célula huésped transformada por medio
de dicho sistema de expresión o de clonación.
Otros objetos de la invención son usos médicos
de la proteína de fusión, en particular como agente inmunológico
hipoalergénico en el tratamiento de inmunoterapia específica (SIT),
así como composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de
fusión y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Son objetos adicionales de la invención métodos
de preparación de la proteína de fusión en los que se producen
secuencias de aminoácidos convenientemente mutadas y se unen
directamente o mediante una molécula conectora para la síntesis
química o mediante expresión, en la forma de una proteína de fusión,
en células huésped modificadas genéticamente, así como métodos de
preparación de las composiciones farmacéuticas.
Las moléculas de fusión según la invención
proporcionan ventajas inequívocas. En primer lugar, muestran una
capacidad de interactuar con las IgE2 que es marcadamente reducida
con respecto a: los alérgenos individuales o las mezclas de
alérgenos de tipo salvaje, tal como pone de manifiesto la
comparación entre los datos informados en la Tabla de la fig. 5
(carril PjEDcys) y los datos en la Tabla de la fig. 8; los alérgenos
modificados individuales, tal como pone de manifiesto la
comparación entre la Tabla de la fig. 5 y la Tabla proporcionada en
la fig. 9; o el heterodímero de los alérgenos de tipo salvaje (Wt),
tal como nuevamente pone de manifiesto la Tabla de la fig. 5.
Además, el análisis citofluorométrico de la proliferación de las
células sanguíneas periféricas CD3^{+} demuestra que dicha
alergenicidad reducida se ve acompañada ventajosamente por una
capacidad inmunogénica inalterada o incluso incrementada, tal como
ilustra la fig. 7, paneles B y C, y como se resume en la Tabla de
la misma fig. 7. No sólo la reducción de las características del
heterodímero alergénico, acompañada por una capacidad inmunogénica
marcada con respecto a los alérgenos de tipo salvaje o mutados
individuales o las mezclas de los mismos, resultó inesperada, sino
que ya el mero mantenimiento por parte de la proteína híbrida de
las características típicas del alérgeno modificado individual
resultó ser una característica totalmente inesperada.
Además, con respecto a la mera mezcla de
alérgenos, o de muteínas de los mismos, los heterodímeros de la
invención implican la ventaja adicional de ser producibles mediante
un único procedimiento, evidentemente simplificado todos los
procedimientos de producción, control, almacenamiento, autorización
para la venta y uso, con un ahorro inequívoco de tiempos,
materiales y medios de financiación.
Figura 1: secuencia de nucleótidos del dímero
Parj2- Parj1 en su forma mutada en los residuos de posiciones 10,
85, 88, 122, 397 y 400. En todas las posiciones indicadas, el
nucleótido T ha sido sustituido por el nucleótido A (en negrita).
El espaciador "GGATTC" entre las secuencias codificantes de
los dos alérgenos Parj1 y Parj1 también se encuentra subrayado en
negrita (SEC ID nº 3).
Figura 2: secuencia de aminoácidos del
heterodímero Parj2-Parj1 en su forma mutada en los
residuos de posiciones 4, 29 y 30 en cada una de las dos moléculas
(PjEDcys). La secuencia de aminoácidos se expresa en código de
una letra. Los aminoácidos subrayados indican las sustituciones
realizadas. Los aminoácidos en negrita y cursiva indican los
aminoácidos glicina y fenilalanina introducidos con la clonación
(SEC ID nº 4).
Figura 3: detección mediante ELISA de la
capacidad de unión del alérgeno Parj2 en comparación con la
actividad de unión del mutante Par2/4,29,30. Las líneas con
cuadrados negros indican los sueros de sujetos alérgicos a Pj, la
línea con cuadrados blandos indica un suero de un paciente no
alérgico a Pj.
Figura 4: panel A - representación esquemática
del mutante PjEDcys. Panel B: análisis de transferencia western
llevado a cabo mediante la utilización de las proteínas
recombinantes Parj1 (carril A), Parj2 (carril B), dímero
Parj2-Parj1 (clon de dímero de tipo salvaje)
(carril C), PjEDcys (carril D) con un suero de sujeto alérgico a
Pj. Panel C: la misma membrana del Panel B incubada con una sonda
específica para la cola de histidinas.
Figura 5: detección mediante ELISA de la
inhibición de la unión de IgEs humanas por parte del dímero de tipo
salvaje y las proteínas recombinantes PjEDcys utilizando un
extracto crudo de Parietaria judaica como antígeno y 5
sueros de pacientes alérgicos a Pj.
Figura 6: ensayo de la liberación de histamina
de sangre pacientes alérgicos a Pj. Los antígenos utilizados
fueron: una mezcla equimolar de los dos alérgenos rParj1 y rParj2
(línea con rombos, denominada rPj1+rPj2) y el mutante PjEDcy
(línea con cuadrados). Se proporciona, en el eje x, las cantidades
de proteína utilizadas, y en el eje y, el porcentaje de histamina
liberada con respecto al porcentaje de histamina total de los
mastocitos del paciente.
Figura 7: análisis citofluorométrico de la
proliferación de las células CD3^{+} de PBMC.
Se estimularon células marcadas con CSFE con una
solución que contenía una mezcla de los alérgenos Parj1 y Parj2
(panel B) y una mezcla que contenía una cantidad equimolar del
híbrido PjEDcys (panel C). El panel A muestra el cultivo de
control no estimulado.
La tabla inferior resume el porcentaje de
células CD3^{+} capaces de proliferar tras la estimulación
antigénica en 5 sujetos alérgicos. Los números indican los
porcentajes de estimulación a los que se ha restado el número de
células no estimuladas.
Figura 8: la tabla proporciona los resultados de
un ensayo ELISA de la inhibición de la unión de IgEs humanas por
parte de alérgenos de tipo salvaje individuales o de una mezcla de
los mismos.
Figura 9: la tabla proporciona los resultados de
un ensayo ELISA de la inhibición de la unión de IgEs humanas por
parte de los alérgenos mutados PjA, PjB, PjC y PjD indicados en la
solicitud de patente WO nº A- 02/020790.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de péptidos de los alérgenos
ns-LTPs de tipo salvaje producidas por diversas
plantas, tales como Parietaria judaica (Parj1 y Parj2),
soja, Lyces, Ricco, tabaco, Oryza, Mais,
espinaca y trigo, se informan en la solicitud de patente WO nº
A-02/20790. Todas las moléculas presentan cuatro
puentes disulfuro entre ocho residuos cisteína en posiciones
altamente conservadas correspondientes, tras alinearse
convenientemente, a las posiciones 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 y 91,
de las moléculas Parj1 y Parj2. Los residuos cisteína implicados en
los puentes disulfuro son las parejas 4-51,
14-29, 30-75 y
50-91.
Las muteínas de dichos alérgenos con una
capacidad reducida de formar puentes disulfuro son moléculas en las
que uno o más residuos cisteína implicados en el enlace -SS- han
sido eliminados o sustituidos por otros residuos no capaces de
participar en la unión, aunque sin alterar estéricamente la
conformación espacial de la molécula, por ejemplo Asn, Ser, Thr,
Ile, Met, Gly, Ala, Val, Gln o Leu. Las muteínas preferentes se
obtienen mediante eliminación de dos, tres o cuatro puentes
disulfuro; por ejemplo aquéllas correspondientes a los enlaces
14-29 y/o 30-75 y/o
4-51 y/o 50-91 de la molécula Parj1
o Parj2. Las moléculas mutadas mediante sustitución del residuo
cisteína con un residuo serina o alanina en las posiciones 29, 30 ó
4, 29, 30 ó 29, 30, 50, 52 de Parj1 o Parj2, o en las posiciones
correspondientes de los otros alérgenos ns-LTPs,
muestran las mejores propiedades de alergenicidad reducida. Aparte
de las indicadas, las muteínas utilizadas en la invención no
muestran ninguna otra modificación, y por lo tanto mantienen
sustancialmente inalterada la secuencia, la longitud y el peso
molecular del alérgeno de tipo
salvaje.
salvaje.
Las secuencias polinucleótidas codificantes de
alérgenos de tipo salvaje de la familia de las
ns-LTPs se encuentran disponibles para el público
en bancos de datos como EMBL, o se encuentran descritas en el estado
de la técnica. En particular, las secuencias de nucleótidos de los
alérgenos de Parietaria judaica se describe en el documento
anteriormente mencionado nº
WO-A-02/20790 y en Duro G. et
al., FEBS Letter 1996, supra.
La preparación de las muteínas de la invención
se lleva a cabo mediante cualquier método conocido adecuado para la
introducción de variaciones en residuos aminoácidos individuales a
lo largo de la secuencia polipeptídica de las proteínas.
Habitualmente, la variación se lleva a cabo mediante una mutación
puntual específica de sitio al nivel de la secuencia de nucleótidos
codificante mediante el método de PCR del ADN y utilizando
oligonucleótidos sintéticos adecuados. Los procedimientos se
describen en, por ejemplo, la solicitud anterior nº
WO-A-02/20790.
Las proteínas de fusión de la invención
contienen las secuencias de aminoácidos, convenientemente mutadas,
de alérgenos obtenidos de la misma familia vegetal, por ejemplo de
fagáceas, urticáceas, oleáceas, compuestas o gramíneas; o del mismo
género, por ejemplo Parietaria; o de la misma especie, por
ejemplo P. judaica, officinalis o lusitanica;
o, incluso mejor, de la misma variedad de planta. Las proteínas de
fusión preferentes son aquéllas que comprenden muteínas de los
alérgenos principales de Parietaria judaica, es decir, Parj1
y Parj2 o isoformas de las mismas conocidas y depositadas en, por
ejemplo, EMBL. Las dos proteínas unidas en un heterodímero puede
modificarse según el mismo esquema o según esquemas diferentes. De
esta manera, las dos proteínas podrían contener puentes disulfuro
diferentes entre sí en número y/o posición. Las realizaciones
preferentes de la invención proporcionan alérgenos mutados
individual e independientemente en una o más de las posiciones
correspondientes a las posiciones 4, 29 y 30 de la secuencia de
aminoácidos de los alérgenos principales de P. judaica. La
proteína de fusión de la invención contiene, por ejemplo, los
alérgenos Parj1 y Parj2 modificados en las posiciones 29 y 30 ó 4,
29 y 30 ó 29, 30, 50 y 52.
La preparación de la molécula híbrida se produce
mediante fusión de las dos partes de proteína correspondientes a
los dos alérgenos. La formación mediante síntesis de un enlace
químico directo, por ejemplo peptídico, entre los residuos
N-terminal y C-terminal de las dos
partes resulta viable; sin embargo, el método utilizado
preferentemente implica la construcción de una molécula
polinucleótida codificante de las proteínas alergénicas en forma
fusionada y convenientemente mutadas en las posiciones deseadas
(SEC ID nº 1).
Las dos partes que constituyen el heterodímero
resultante pueden unirse directamente o separarse mediante uno o
más residuos aminoácidos. Según un esquema bien conocido para el
experto en la materia y detallado en los ejemplos, los clones que
contienen el material codificante de las proteínas alergénicas
individuales convenientemente mutadas se amplifican, se digieren
con enzimas de restricción y los fragmentos codificantes se unen y
se integran en vectores de expresión. Con el fin de facilitar su
purificación, la proteína híbrida puede expresarse opcionalmente
como proteína de fusión con una molécula de unión que muestre una
afinidad específica para una molécula emparejada determinada, por
ejemplo con una cola de histidinas en la región aminoterminal,
permitiendo la purificación en una columna trampa de His.
\newpage
Los sistemas de clonación y expresión utilizados
para la preparación de la proteína de fusión pueden ser vectores
adecuados para células procarióticas o eucarióticas, por ejemplo el
vector procariótico pQE30 comercial.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
la administración de las moléculas de la invención son composiciones
en forma de soluciones acuosas, hidroalcohólicas o aceitosas, de
emulsiones o suspensiones, en medio acuoso o aceitoso, o de
suspensiones de liposomas. Ventajosamente, la composición se formula
para conseguir una liberación retardada. Para ello, pueden
utilizarse medios aceitosos o medios que contengan espesantes
adecuados. Aparte de las formulaciones indicadas en forma líquida,
las composiciones de la invención pueden encontrarse en forma
semisólida, como cremas, pomadas, geles u otras formas adecuadas
para la aplicación tópica. También pueden utilizarse implantes para
la aplicación subcutánea destinada a la liberación prolongada. En
este caso, las moléculas de la invención se incorporan en una
matriz de polímero biodegradable o biodispersable bajo la acción
del sistema enzimático natural del paciente. Para ello, se utilizan
polímeros tales como polilactato o poliglicolato o copolímeros
polilactato/
glicolato.
glicolato.
Las composiciones en cuestión se formulan para
una administración parenteral, de uso subcutáneo, intramuscular o
intravenoso, para una administración tópica sobre la piel o mucosa,
o para la administración oral.
Las moléculas de fusión de la invención se
caracterizan por una marcada hipoalergenicidad con respecto a los
alérgenos monómeros individuales (fig. 4, paneles B y C) o con
respecto a una molécula heterodímero consistente de los alérgenos
de tipo salvaje (fig. 5).
Las moléculas hipoalergénicas de la invención
encuentran un uso válido como medicamentos en el tratamiento
preventivo y curativo de alergias causadas por una pluralidad de
alérgenos vegetales, y en particular como desensibilizadores o
inmunosupresores con actividad anafiláctica reducida en tratamientos
SIT. Son enfermedades alérgicas ejemplares que pueden tratarse con
la proteína de fusión de la invención, rinitis, conjuntivitis,
urticaria, angioedema, eccema, dermatitides, asma y choque
anafiláctico.
Finalmente, las proteínas de fusión
hipoalergénicas de la invención resultan útiles para la preparación
de vacunas de ADN.
A continuación se describen las características
inmunológicas de una molécula heterodímero específica formada
mediante la fusión de las secuencias de Parj1 y Parj2 y mutada en
las posiciones respectivas 4, 29 y 30 (PjEDcys). En particular,
dicha proteína se generó mediante la fusión genética de los dos
polipéptidos en el orden Parj2/4,29,30-Parj1/4,9,30.
El suceso de fusión causó la inserción de dos aminoácidos
adicionales (G y F) que no interfieren con la fase de lectura
correcta (figs. 2 y 4, panel A). Esta proteína de fusión se produjo
y se purificó mediante la utilización de un sistema de expresión
procariótico comercial (sistema de expresión de proteína de fusión
pQE30, QIAGEN). La fig. 4, panel B, muestra un análisis de
transferencia western a partir del que se infiere que la proteína
dímero mutada muestra una alergenicidad reducida (carril D) en
comparación con la actividad de unión de IgE de los monómeros
individuales (carriles A y B) o a una molécula dímero consistente de
los alérgenos Parj1 y Parj2 de tipo salvaje (carril C). Esto
demuestra que tanto el suceso de fusión como la mutación introducida
contribuyen a conseguir la hipoalergenicidad indicada. Estos datos
no pueden atribuirse a una cantidad diferente de proteína cargada
en el gel, tal como demuestra el panel C, en el que se utilizó una
sonda específica para las colas de histidinas. La capacidad de
unión reducida seguidamente se demostró mediante una técnica
independiente de la anterior, en la que se sometió a ensayo la
molécula heterodímero PjEDcys para su capacidad de inhibir la unión
de IgE humana a un extracto crudo de Parietaria. De hecho, la
fig. 5 muestra cómo esta molécula inhibe la unión de IgE de 5
pacientes alérgicos con un valor comprendido entre 3,5% y 10%, y en
todo caso con valores extremadamente reducidos en comparación con
un constructo dímero que contiene los alérgenos Parj1 y Parj2 en su
forma nativa (clon dímero de tipo
salvaje).
salvaje).
El efecto de la capacidad reducida de unión
seguidamente se demostró en un ensayo de liberación de histamina
llevado a cabo en sangre periférica de pacientes alérgicos. Los
datos informados en la fig. 6 muestran los porcentajes de
liberación de histamina del heterodímero PjEDcys en relación a los
porcentajes liberados de una mezcla equimolar de los monómeros
Parj1 y Parj2 de tipo salvaje. En todos los pacientes estudiados
(N=4), la molécula mutada mostraba una reducción marcada de la
actividad anafiláctica.
Estas variaciones a nivel estructural no sólo no
reducen la capacidad inmunogénica de la molécula, sino que
potencian sus características. De hecho, en la fig. 7 se proporciona
el gráfico de proliferación celular obtenido mediante la incubación
de PBMCs purificadas a partir de sangre de un sujeto alérgico, y
tras la estimulación con el clon PjEDcys y con la mezcla de los
alérgenos Parj1 y Parj2 de tipo salvaje. Las mutaciones que
afectaban a los residuos cisteína y la fusión de las dos proteínas
no presentaron ningún efecto cualitativo sobre el procesamiento y
el reconocimiento del alérgeno por parte de las células T
sanguíneas, aunque incrementaron marcadamente la intensidad de los
mismos, tal como demuestra la Tabla (panel D) de la misma fig.
7.
A continuación se ilustra la invención por medio
de ejemplos específicos referentes a etapas experimentales de
preparación y evaluación de las propiedades inmunológicas de
molécula de fusión Par2/4,29,30-Par1/4,29,30. Estos
ejemplos presentan un propósito meramente ilustrativo, no siendo en
modo alguno limitativos de la invención.
\newpage
Ejemplo
1
Se llevó a cabo la mutagénesis específica de
sitio de los residuos cisteína en las posiciones 29 y 30 utilizando
el kit de mutagénesis dirigida a sitio Transformer (Clontech)
siguiendo las instrucciones del fabricante, y utilizando el
oligonucleótido sintético Pj2/29-30 5' GAG AGC AGC
AGC GGC AGC 3' (SEC ID nº 5). El clon, capaz de expresar el Parj2
de tipo salvaje, se utilizó como molde para la mutagénesis y los
residuos cisteína en las posiciones 29 y 30 se transformaron en
serina (clon Par2/29-30). Se confirmó el éxito del
procedimiento mediante secuenciación del clon recombinante
utilizando el método de Sanger. Se realizó la mutagénesis del
residuo cisteína en la posición 4 en serina mediante reacción en
cadena de ADN polimerasa (PCR) utilizando los oligonucléotidos
sintéticos Pj2/4 5' GTG GGA TCC GAG GAG GCT AGC GGG AAA GTG 3' (SEC
ID nº 6) y Pj2 inverso 5' GGG GGA TCC ATA GTA ACC TCT GAA 3' (SEC
ID nº 7) y utilizando el clon Parj2/29-30 como
molde. El fragmento de ADN obtenido de esta manera se clonó en el
vector de expresión pQE30 (Qiagen). El análisis de la secuencia de
nucleótidos del clon recombinante demostró que se había producido la
sustitución (ver la fig. 1).
Ejemplo
2
La molécula dímero consistente de los alérgenos
Parj1 y Parj2 mutados en las posiciones Cys4, Cys29 y Cys30,
respectivamente, se obtuvo mediante una serie de procedimientos de
amplificación del DAN.
El clon Parj1 mutado en las cisteínas en las
posiciones Cys4, Cys29 y Cys30 dado a conocer en la patente WO nº
02/20790 (clon 29-30) se digirió con el enzima de
restricción BamH1.
El fragmento que contenía la información
genética para Parj2 mutado en las posiciones Cys4, 29 y 30 (clon
Parj2/4,29,30) se sometió a un procedimiento de amplificación del
ADN utilizando los oligonucleótidos Pj2/4 y Pj2 inverso. El
fragmento generado de esta manera se purificó mediante gel de
agarosa, se digirió con el enzima de restricción BamH1 y se incubó
con una mezcla que contenía el enzima ADN ligasa y el clon Parj1
(29-30) previamente linearizado. Los clones
recombinantes se purificaron y su secuencia de nucleótidos se
determinó mediante el método de Sanger. La proteína híbrida
construida de esta manera se expresó como proteína de fusión con
una cola de histidinas en su región aminoterminal para permitir la
purificación del a misma (clon PjEDcys) en una columna de afinidad
(ver las figs. 2 y 4, panel A).
Ejemplo
3
Se utilizaron 10 ml de cultivo O/N para una
inoculación en 400 ml de medio de cultivo 2YT que contenía
ampicilina y canamicina hasta una concentración final de 100
\mug/ml y 10 \mug/ml, respectivamente. El cultivo se realizó a
37ºC y bajo agitación. A las 2 horas, se añadió IPTG al cultivo
hasta una concentración final de 1 mM y se continuó con el cultivo
durante 4 horas más a 37ºC bajo agitación. A continuación, el
cultivo bacteriano se centrifugó a 5.000 rpm durante 15 minutos a
4ºC. Se resuspendió el pellet en 5 ml/g de tampón Start (fosfato de
Na 10 mM, pH 7,4, y urea 6 M) y las células se destruyeron mediante
la utilización de un sonicador. A continuación, las proteínas
recombinantes se purificaron definitivamente mediante la utilización
de una columna trampa de His (Amersham) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Las fracciones eluidas se analizaron en un gel de
poliacrilamida al 16% y las fracciones que contenían la proteína
recombinante se evaluaron cuantitativamente mediante el método de
Bradford en el espectrofotómetro tras la tinción. Finalmente, las
proteínas se desalaron mediante la utilización de una columna
Sephadex G-25 (Pharmacia).
Ejemplo
4
Se llevó a cabo la detección en el ensayo ELISA
tal como se describe en Bonura et al., "Hypoallergenic
variants of the Parietaria judaica major allergen Parj1: a
member of the non-specific lipid transfer protein
plant family", Int. Arch. Allergy Immunol.
126(1):32-40, septiembre de 2001), o tal como
se describe en la solicitud anteriormente mencionada WO nº
A-02/020790. La concentración del antígeno utilizada
en cada pocillo era de 5 \mug/ml. Los pacientes sometidos a
ensayo (n=5) presentaban una historia clara de alergia a
Parietaria judaica, y todos presentaron un resultado
positivo en el ensayo de la piel utilizando productos
comerciales.
Los resultados del ensayo de inhibición de la
unión con respecto a la proteína nativa y de las formas modificadas
mediante la eliminación de dos, tres o cuatro puentes disulfuro se
proporcionan en la Tabla de la fig. 9.
\newpage
Los resultados observados con el heterodímero de
tipo salvaje y el heterodímero PjEDcys se proporcionan en la Tabla
de la fig. 5. Finalmente, los resultados observados con el extracto
crudo de Parietaria, los alérgenos individuales de tipo
salvaje y la mezcla de los mismos se proporcionan en la Tabla de la
fig. 8.
Ejemplo
5
Se llevó a cabo un ensayo de liberación de
histamina utilizando sangre heparinizada de pacientes alérgicos a
Pj y una escala de concentraciones de alérgeno comprendida entre
0,0001 y 1 \mug/ml. El protocolo de liberación se llevó a cabo
tal como se ha descrito con anterioridad (Colombo P. et al.,
Identification of an immunodominant IgE epitope of the
Parietaria judaica major allergen, J. Immunol.
160(6):2780-5, 1998).
Ejemplo
6
Se purificaron PBMCs de pacientes alérgicos a Pj
y se resuspendieron en 1XPBS, pH 7,2 (1x10^{7}/ml) y se marcaron
con succinimidil-éster de diacetato de
carboxi-fluoresceína (CFDA-SE) a una
concentración final de 5 mM durante 5 minutos, a temperatura
ambiente y en la oscuridad. Las células se lavaron en RPMI completo
(suero AB al 10%) y se estimularon durante 7 días con una mezcla que
contenía 1 \mug/ml de alérgenos Parj1 y Parj2 y con una mezcla
equimolar del híbrido PjEDcys. A continuación, las PBMCs se tiñeron
con anticuerpo anti-CD3-PE y se
analizaron citofluorométricamente. Los datos resultantes se
analizaron utilizando el software WinMDI 2.8. La proliferación de
las PBMCs se determinó mediante tinción CFDA-SE
(succinimidil-éster de diacetato de
carboxi-fluoresceína). El análisis citofluorométrico
demostró que, en los 5 sujetos estudiados, el híbrido PjEDcys era
capaz de estimular un porcentaje de células CD3^{+} mucho mayor
que el estimulado por la mezcla que contenía los alérgenos en forma
de monómero (fig. 7).
<110> Consiglio Nazionale delle
Ricerche
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas de fusión
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BW352R
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 732
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Parietaria judaica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(729)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(12); (40)..(42); (85)..(90);
(148)..(150); (154)..(156); (271)..(273); (322)..(324);
(352)..(354); (397)..(402); (460)..(462); (466)..(468);
(535)..(537); (583)..(585)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Parietaria judaica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> `Xaa' en las posiciones 4, 14, 29,
30, 50, 52, 75, 91, 108, 118, 133, 154, 156, 179, 195 representa
Asn,Ser, Thr, lie, Met, Gly, Ala, Val, Gln o Leu.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 732
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Parietaria judaica
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(729)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Parietaria judaica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para la inserción de
una mutación en las posiciones 29 y 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagcagca gcggcagc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para la inserción de
una mutación en la posición 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggatccg aggaggctag cgggaaagtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso de parj2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggggatcca tagtaacctc tgaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Proteína de fusión caracterizada por
el hecho de que las secuencias de aminoácidos de los diferentes
alérgenos Parj1 y Parj2, pertenecientes a la familia de las
proteínas de transferencia de lípidos no específicas
(ns-LTPs) de la especie Parietaria judaica,
por el hecho de que dichas secuencias no presentan uno o más de los
cuatro puentes disulfuro presentes en la secuencia de los alérgenos
de tipo salvaje, encontrándose comprendido por lo menos uno en la
región aminoterminal ente los residuos aminoácidos 1 y 30, y por el
hecho de que dichas secuencias mantienen esencialmente la misma
longitud que las secuencias de los alérgenos de tipo salvaje.
2. Proteína de fusión según la reivindicación
1, caracterizada por el hecho de que la secuencia de
aminoácidos de cada uno de los alérgenos se muta independientemente
mediante eliminación o sustitución de uno o más residuos cisteína
implicados en la formación de un puente disulfuro.
3. Proteína de fusión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por el hecho de que la
secuencia de aminoácidos de cada uno de los alérgenos se muta
independientemente mediante eliminación o sustitución de uno o más
residuos cisteína en posiciones correspondientes a las posiciones 4,
14, 29, 30, 50, 52, 75 y 91 de la secuencia de aminoácidos del
alérgeno Parj1 y/o Parj2.
4. Proteína de fusión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por el hecho de que
contiene las secuencias de aminoácidos de los alérgenos Parj1 y
Parj2, ambos modificados independientemente mediante sustitución de
los residuos cisteína por los residuos Asn, Ser, Thr, Ile, Met, Gly,
Ala, Val, Gln o Leu en las posiciones 29 y 30 ó 4, 29 y 30 ó 29,
30, 50 y 52.
5. Proteína de fusión según la reivindicación
4, que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4.
6. Secuencia de nucleótidos que comprende el
ADN codificante de la proteína de fusión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
7. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 6, que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID
nº 3.
8. Sistema de expresión o clonación que
comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 ó 7
flanqueado por secuencias adecuadas para controlar, estimular y
regular la expresión.
9. Célula huésped transformada por medio del
sistema de expresión o clonación según la reivindicación 8.
10. Proteína de fusión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, para la utilización en el método diagnóstico
o de tratamiento terapéutico in vivo y/o in
vitro.
11. Proteína de fusión según la reivindicación
10, para la utilización como agente inmunológico hipoalergénico en
el tratamiento de inmunoterapia específica (SIT) de alergias.
12. Proteína de fusión según la reivindicación
10, para la utilización en el tratamiento de rinitis, conjuntivitis,
urticaria, angioedema, eccema, dermatitides, asma y choque
anafiláctico.
13. Proteína de fusión según la reivindicación
10, para la preparación de vacunas de ADN.
14. Composición farmacéutica que comprende la
proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Composición farmacéutica según la
reivindicación 14, en forma de solución, suspensión, emulsión,
crema, pomada o implante.
16. Composición farmacéutica según la
reivindicación 14, para una administración parenteral, subcutánea,
intramuscular, intravenosa, tópica u oral, o para el implante
subcutáneo.
17. Método de preparación de la proteína de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado por el hecho de que se producen secuencias de
aminoácidos convenientemente mutados de diferentes alérgenos y se
unen directamente o mediante una molécula conectora para la síntesis
química o mediante expresión, en forma de proteína de fusión, en
células huésped genéticamente modificadas.
18. Método de preparación según la
reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que se
transforman células huésped con un vector de expresión que
comprende el ADN codificante de secuencias de aminoácidos en forma
fusionada, se mutan mediante mutagénesis específica de sitio en
codones codificantes de residuos cisteína.
19. Método de preparación según la
reivindicación 18, caracterizado por el hecho de que se
sustituyen uno o más residuos cisteína por residuos Asn, Ser, Thr,
Ile, Met, Gly, Ala, Val, Gln o Leu.
20. Método de preparación según cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado por el hecho de
que se sustituye uno o más residuos cisteínas en posición 29, 30 ó
4, 29, 30 ó 29, 30, 50 y 52, por residuos alanina o serina.
21. Método de preparación de una composición
farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16,
caracterizado por el hecho de que la proteína heterodímero se
mezcla en una cantidad inmunológicamente activa con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000103A ITRM20040103A1 (it) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Proteine di fusione comprendenti allergeni della famiglia delle ns-ltps, loro usi e composizioni farmaceutiche che le comprendono. |
| ITRM04A0103 | 2004-02-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2354820T3 true ES2354820T3 (es) | 2011-03-18 |
Family
ID=34917554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05708860T Active ES2354820T3 (es) | 2004-02-27 | 2005-02-28 | Proteínas de fusión que comprenden alérgenos modificados de la familia ns-ltps, utilización de las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070178122A1 (es) |
| EP (1) | EP1720900B1 (es) |
| AT (1) | ATE482229T1 (es) |
| CA (1) | CA2558660C (es) |
| DE (1) | DE602005023712D1 (es) |
| ES (1) | ES2354820T3 (es) |
| IL (1) | IL177698A0 (es) |
| IT (1) | ITRM20040103A1 (es) |
| WO (1) | WO2005085278A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2307381B1 (es) * | 2006-04-12 | 2009-10-23 | Bial Industrial Farmaceutica S.A. | Proteinas quimericas hipoalergenicas pertenecientes a la familia de transportadoras de lipidos de parietaria judaica utiles para el tratami ento de alergias. |
| AT503690A1 (de) * | 2006-06-09 | 2007-12-15 | Biomay Ag | Hypoallergene moleküle |
| ITPA20080007A1 (it) * | 2008-03-19 | 2009-09-20 | Angela Bonura | Fattore anti - lps da parietaria judaica e suoi metodi di utilizzo. |
| EP2436691B1 (en) | 2008-03-25 | 2017-08-02 | Bial Industrial Farmaceutica, S.A. | Hypoallergenic hybrid proteins of major group 1 and 2 mite allergens for use in the treatment of allergies |
| IT1395735B1 (it) * | 2009-08-04 | 2012-10-19 | Lofarma Spa | Proteina ibrida ipoallergenica e suoi usi |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1317905B1 (it) * | 2000-09-11 | 2003-07-15 | Consiglio Nazionale Ricerche | Varianti di allergeni ns-ltps, loro usi e composizioni che lecomprendono. |
| ITRM20030247A1 (it) * | 2003-05-20 | 2004-11-21 | Bonura Angela | Varianti ipoallergeniche degli allergeni maggiori |
-
2004
- 2004-02-27 IT IT000103A patent/ITRM20040103A1/it unknown
-
2005
- 2005-02-28 AT AT05708860T patent/ATE482229T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-02-28 ES ES05708860T patent/ES2354820T3/es active Active
- 2005-02-28 DE DE602005023712T patent/DE602005023712D1/de active Active
- 2005-02-28 US US10/590,940 patent/US20070178122A1/en not_active Abandoned
- 2005-02-28 CA CA2558660A patent/CA2558660C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-28 WO PCT/IB2005/050714 patent/WO2005085278A1/en active Application Filing
- 2005-02-28 EP EP05708860A patent/EP1720900B1/en active Active
-
2006
- 2006-08-24 IL IL177698A patent/IL177698A0/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1720900A1 (en) | 2006-11-15 |
| ATE482229T1 (de) | 2010-10-15 |
| US20070178122A1 (en) | 2007-08-02 |
| CA2558660C (en) | 2015-07-14 |
| WO2005085278A1 (en) | 2005-09-15 |
| IL177698A0 (en) | 2006-12-31 |
| EP1720900B1 (en) | 2010-09-22 |
| ITRM20040103A1 (it) | 2004-05-27 |
| DE602005023712D1 (de) | 2010-11-04 |
| CA2558660A1 (en) | 2005-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2014276484B2 (en) | Contiguous overlapping peptides for treatment of house dust mites allergy | |
| Vrtala et al. | Strategies for converting allergens into hypoallergenic vaccine candidates | |
| ES2354820T3 (es) | Proteínas de fusión que comprenden alérgenos modificados de la familia ns-ltps, utilización de las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden. | |
| ES2341367T3 (es) | Variantes hipoalergenicas del alergeno principal del polen de betula verrucosa. | |
| JPH09511747A (ja) | スギ花粉アレルギーを治療するための医薬組成物 | |
| ES2239162T3 (es) | Variantes de antigeno ns-ltp de parietaria judaica, usos de las mismas y composiciones que las contienen. | |
| ES2252315T3 (es) | Variantes de proteinas alergenicas del grupo 2 dermatophagoides. | |
| ES2318077T3 (es) | Polipeptidos hipoalergenicos basados en parvalbumina de peces. | |
| ES2238487T3 (es) | Variantes de la proteina alergica phl p1 de phleum pratense. | |
| JP4745237B2 (ja) | パリエタリアジュダイカの主要アレルゲンの低アレルギー性変異体、その使用およびそれらを含む組成物 | |
| CN103059140B (zh) | 用于治疗过敏的属于欧蓍草(Parietaria judaica)脂质转移家族的低变应原的嵌合蛋白质 | |
| CN103874509B (zh) | 来自苹果的主要变应原Mal d 1的低变应原性变体 | |
| ES2286150T3 (es) | Variantes del alergeno principal par j2 de parietaria judaica. | |
| EP2794644B1 (en) | Hypoallergenic variants of phl p 5, the major allergen from phleum pratense | |
| ES2384231T3 (es) | Proteínas híbridas de pincipales alérgenos de Parietaria judaica y usos de las mismas | |
| ES2371262T3 (es) | Proteínas hipoalergénicas obtenidas del alérgeno principal de parietaria judaica. | |
| ES2396540T3 (es) | Clonación y secuenciación del alérgeno Dac g5 y del polen de Dactylis glomerata, su preparación y su utilización | |
| WO2002070716A1 (es) | Producción en la levadura pichia pastoris, y sistema de aislamiento y purificación, del alergeno recombianante de olea europaea ole e 9 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias | |
| ES2352775B1 (es) | Dna que codifica el alérgeno de mostaza amarilla (sinapis alba) sin a 3, y sus aplicaciones. |