ES2252315T3 - Variantes de proteinas alergenicas del grupo 2 dermatophagoides. - Google Patents

Variantes de proteinas alergenicas del grupo 2 dermatophagoides.

Info

Publication number
ES2252315T3
ES2252315T3 ES01984645T ES01984645T ES2252315T3 ES 2252315 T3 ES2252315 T3 ES 2252315T3 ES 01984645 T ES01984645 T ES 01984645T ES 01984645 T ES01984645 T ES 01984645T ES 2252315 T3 ES2252315 T3 ES 2252315T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
allergen
der
baselineskip
dermatophagoides
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01984645T
Other languages
English (en)
Inventor
Monica Sturaro
Angelo Viotti
Paolo C/O Lofarma S.P.A. Falagiani
Giovanni C/O Lofarma S.P.A. Mistrello
Daniela C/O Lofarma S.P.A. Roncarolo
Stefania c/o Lofarma S.p.A. ZANOTTA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Original Assignee
Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consiglio Nazionale delle Richerche CNR filed Critical Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Application granted granted Critical
Publication of ES2252315T3 publication Critical patent/ES2252315T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
    • Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un alérgeno de Dermatophagoides que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos con Der p 2 de tipo salvaje mayor que el 85% y en el que los residuos Lys que coinciden con la secuencia Der p 2 de tipo salvaje en las posiciones 33, 48, 82, 96, 100 y 126 están sustituidos y/o eliminados.

Description

Variantes de proteínas alergénicas del grupo 2 de Dermatophagoides.
La presente invención se refiere a nuevas variantes de un alérgeno de ácaros de la especie Dermatophagoides pteronyssinus.
Más en particular, la presente invención se refiere a las secuencias de aminoácidos de variantes hipoalergénicas del alérgeno Der p 2, obtenido por mutagénesis específica del sitio de la secuencia nucleotídica que codifica dicho alérgeno. Las variantes hipoalergénicas se pueden usar en inmunoterapia específica de patologías alérgicas causadas por ácaros del polvo.
Antecedentes de la invención
Las alergias son reacciones de hipersensibilidad inmediata causadas por la producción de anticuerpos de la clase IgE después del contacto con alérgenos. Los IgE se unen a receptores específicos situados en la superficie de las células efectoras (basófilos y células cebadas) y, cuando se exponen de nuevo al alérgeno inducen la desgranulación de dichas células, que libera mediadores tales como histamina y leucotrienos, responsables de los síntomas conocidos de las alergias: rinitis, conjuntivitis, dermatitis atópica y asma.
Dermatophagoides pteronyssinus y Dermatophagoides farinae son dos especies similares de ácaros presentes en el polvo de la casa. Los alérgenos que se derivan de estos artrópodos tienen una importancia clínica considerable.
Hasta la fecha se han identificado nueve tipos diferentes de alérgenos de ácaros, siendo los dos principales Der p 1 (Der f 1) y Der p 2 (Der f 2), cada uno de los cuales inmunorreacciona con IgE en aproximadamente el 80% de los sujetos alérgicos.
El alérgeno Der p 2 (cuya secuencia de nucleótidos está identificada en el GenBank con el código de acceso AF276239) es una proteína consistente en 129 residuos aminoacídicos con un peso molecular de aproximadamente 14 kD, que contiene 3 puentes disulfuro esenciales para su inmunogenicidad [1, 2]. No posee homología de secuencia con cualquier otra proteína conocida, salvo Der f 2 (código de acceso del GenBank D10449).
El único tratamiento etiológico de las alergias está representado por inmunoterapia hiposensibilizante específica (SIT del inglés Specific Hyposensitizing Immunotherapy). Esta consiste en administrar dosis crecientes de la sustancia que causa la alergia, induciendo de este modo una desensibilización gradual de dicha sustancia en el paciente
[3].
No obstante, la inmunoterapia, aunque constituye un tratamiento establecido para las alergias, no está totalmente exenta de riesgos [4].
Puesto que incluso se pueden presentar durante dicha terapia efectos secundarios graves, los investigadores se han centrado en el uso de vías no inyectadas (oral/sublingual) para la administración de vacunas y la producción de variantes hipoalergénicas de las proteínas usadas como vacunas, obtenidas por la modificación de los alérgenos por tratamientos químicos o mutagénesis específica del sitio [5].
La modificación química de alérgenos Der p mediante reacción de cianato potásico con grupos lisina se ha usado con anterioridad con el fin de reducir su potencia alergénica [9].
Descripción detallada
Se ha aislado por RT-PCR ahora un nuevo ADNc que codifica el alérgeno mayoritario Der p 2 de Dermatophagoides pteronyssinus, cuya secuencia de nucleótidos se describe en la SEQ ID Nº 1. Ésta difiere de la secuencia presente en GenBank en 8 posiciones. La proteína codificada por el clon aislado, descrita en la SEQ ID Nº 3, se diferencia del alérgeno Der p 2 en dos residuos, Ala16 y Ser63.
Se ha descubierto ahora que el efecto alergénico de la proteína madura Der p 2, que se produce por eliminación de los residuos 1-16 de SEQ ID Nº 3, se puede reducir cambiando su secuencia de aminoácidos en las posiciones 33, 48, 82, 96, 100, 126, en la que está presente un residuo lisina.
"Cambio" se refiere en la presente memoria a sustituir residuos en las posiciones especificadas, con preferencia con aminoácidos neutros o polares, o eliminar residuos Lys presentes en la forma natural, o sustituir y eliminar de forma simultánea residuos.
Las mutaciones por sustitución introducen un residuo del aminoácido alanina en cada una de las 6 posiciones indicadas antes. La variante que lleva las seis sustituciones Lys a Ala se indica en la SEQ ID Nº 4.
\newpage
La presente invención también comprende las variantes de la proteína Der p 2, homóloga a la misma en más de un 85%, que tiene en las posiciones correspondientes de su secuencia de aminoácidos el mismo modelo de sustitución/eliminación que se describe antes para Der p 2, en particular la proteína Der f 2.
La invención comprende además un péptido inmunológicamente activo derivado de la secuencia de aminoácidos de Der p 2, o de una de sus secuencias homólogas, y que contiene las sustituciones/eliminaciones descritas antes.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una variante mutación de Der p 2, una variante homóloga de la misma, o un péptido derivado de la misma, como se ha precisado antes.
Las variantes de secuencia conforme a la invención se pueden preparar fácilmente partiendo del ADNc de Der p 2 maduro, o de una de sus variantes homólogas, en la que la región que codifica el péptido señal no está presente y se han introducido las mutaciones deseadas.
La secuencia de ADNc (bases mutagenizadas en negrita) que codifican la variante preferida (SEQ ID Nº 4), se describe en la SEQ ID Nº 2.
La proteína recombinante producida tiene una reactividad de IgE reducida en el suero de sujetos alérgicos a ácaros Dermatophagoides pteronyssinus. En particular, los ensayos de transferencia Western llevados a cabo usando una mezcla de sueros de sujetos alérgicos a ácaros con reactividad RAST 4+, demostraron que la reactividad de IgE de la variante descrita en la SEQ ID Nº 4 reducía la media en aproximadamente un 90% comparada con la de la proteína normal producida en Escherichia coli [Fig. 1]. Este resultado se confirmó con ensayos ELISA, que permitieron identificar epítopos en proteínas en la conformación nativa, incluyendo epítopos conformacionales [Fig. 2].
La invención se refiere además a un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera de las variantes hipoalergénicas definidas antes.
Dicho vector puede ser un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago o cualquier otro vector usado corrientemente en ingeniería genética y puede incluir, además de la molécula de ácido nucleico de la invención, elementos eucarióticos o procarióticos para el control de la expresión, tales como secuencias de regulación para el inicio y la terminación de la transcripción, potenciadores, promotores, secuencias señal y similares.
Por otro lado, la invención comprende una célula hospedadora procariótica o eucariótica transformada en, o transformada con, el vector de la invención. En principio, para clonar el vector y expresar el ADNc se usarán células procarióticas tales como Escherichia coli o Bacillus subtilis, o células eucarióticas tales como Saccharomyces cerevisiae.
Las variantes de proteína de la invención se pueden producir bien como tales o como proteínas de fusión.
Gracias a la reducida reactividad de IgE, dichas variantes se pueden usar con fines terapéuticos en la preparación de vacunas que se van a usar en la inmunoterapia de alergias debidas a los ácaros del polvo.
Otro aspecto más de la invención se refiere por tanto a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de la variante hipoalergénica de la invención, opcionalmente en combinación con otros alérgenos, naturales o modificados de ácaros del género Dermatophagoides o de géneros similares, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
En una realización preferida, dicha composición farmacéutica es una vacuna para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades alérgicas, tales como asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, conjuntivitis alérgica. Los principios de vacunación y su práctica son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en [7] y [8].
Los siguientes ejemplos ilustran la invención con más detalle.
Ejemplos
Los procedimientos usados en los siguientes ejemplos, si no se indica de otro modo, son los descritos por Sambrook, Fritsch ET Maniatis "Molecular cloning. A laboratory manual" II Ed vol. 1-2-3 CSH Lab Press 1989.
Ejemplo 1 Aislamiento de ADNc de Der p 2 con RT-PCR
Se usó ARNm de Dermatophagoides pteronyssinus para producir el ADNc correspondiente por RT-PCR, usando un oligonucleótido poli-dT como cebador para la reacción catalizada por la enzima transcriptasa inversa. Después de esto, se amplificó el ADNc correspondiente al alérgeno Der p 2 por PCR (Reacción en Cadena con Polimerasa), usando dos cebadores específicos, cada uno de 15 nucleótidos, que corresponde al extremo de la región génica que codifica la proteína. Se clonó el ADNc de Der p 2 en un vector (pBluescript-Stratagene) para la amplificación en células de Escherichia coli y se realizó el secuenciamiento de acuerdo con el procedimiento de Sanger con un secuenciador automatizado.
Ejemplo 2 Mutagénesis específica del sitio del ADNc que codifica el alérgeno Der p 2
La mutagénesis específica del sitio del ADNc que codifica el alérgeno Der p 2 se lleva a cabo por amplificación por PCR (Reacción en Cadena con Polimerasa) del mismo ADNc clonado en un vector procariótico (pBluescript). Los oligonucleótidos usados como cebadores para la reacción PCR tienen las sustituciones requeridas de bases. Para cada mutagénesis, se ha usado una pareja complementaria de dichos oligonucleótidos, que se une a las regiones correspondientes de las dos cadenas de ADN. Después de la amplificación se degrada de forma selectiva el molde original sin modificar por digestión catalizada por enzimas mediante la enzima de restricción Dpn 1. Se transforman entonces células de Escherichia coli con moléculas mutagenizadas. Los clones obtenidos a partir de colonias bacterianas sencillas se secuencian de acuerdo con el procedimiento de Sanger para verificar la correcta modificación de las bases y la ausencia de mutaciones específicas del ADNc.
Ejemplo 3 Producción de la proteína Der p 2 y de su variante
Se expresan de acuerdo con protocolos convencionales en células de Escherichia coli ADNc normal de Der p 2 y ADNc mutagenizado que corresponde a la SEQ ID Nº 2, después de clonar en un vector de expresión (pCALn-Stratagene), en los que el cultivo en crecimiento exponencial (D. O. 600 nm = 0,6) se añade con IPTG (isopropil-[beta]-D-tiogalactopiranosido) para inducir la expresión de ADNc. Las proteínas recombinantes se aíslan 2 horas después de la inducción de su síntesis por lisis de las células bacterianas a través de sonicación y separación de las partículas celulares por centrifugación. Las proteínas se purifican en el líquido sobrenadante por cromatografía de afinidad, usando columnas en las que la matriz se une a la proteína calmodulina, que interacciona con la porción CBP (Proteína de Unión a Calmodulina) fusionada con el alérgeno.
Ejemplo 4 Ensayo de Transferencia Western de la Capacidad Alergénica de la Variante de Der p 2
Se analizan por electroforesis en gel de poliacrilamida cantidades iguales del alérgeno recombinante normal y de la variante mutagenizada indicada en la SEQ ID Nº 4 y luego se transfieren a membrana de nitrocelulosa por electroinmunotransferencia, de acuerdo con la técnica descrita por Towbin [6].
La membrana se incuba durante una hora en TBS que contenía 5% de leche en polvo (tampón de saturación) y luego durante toda la noche con suero sencillo de pacientes alérgicos a los ácaros con reactividad RAST 4+. Después de tres lavados con TBS que contenía Tween-20 al 0,05%, se detectan los anticuerpos IgE unidos a la membrana por incubación durante una hora con antisuero conjugado con peroxidasa de anticuerpos IgE humanos y, después de varios lavados, con el sistema de detección basado en el uso de una solución de DAB (diaminobenzidina) que contiene H_{2}O_{2} como sustrato para la peroxidasa.
Ejemplo 5 Ensayo ELISA para la Reactividad a IgE de la Variante de Der p 2
Se adsorben cantidades iguales (0,1 \mug) de alérgeno normal y de sus variantes mutagenizadas en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6 en pocillos de placas de poliestireno para ensayos ELISA por incubación a 4ºC durante 16 horas. Los antígenos se lavan seguidamente con solución de lavado (tampón fosfato 60 mM, pH 6,5 que contenía Tween-20 al 0,05%) y los sitios libres se saturan con solución diluyente (suero de caballo al 25%, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,05%, Thiomersal al 0,01% en tampón fosfato 150 mM, pH 7,4). Se preparan diluciones en serie de mezcla de sueros humano con reactividad RAST 4+ en una relación 1:2 en tampón diluyente. Se añaden cantidades iguales (100 \mul) de las diversas diluciones de suero a cada muestra y se incuban a 25ºC durante 2 horas. Después de tres lavados, el antisuero conjugado con peroxidasa de anticuerpos IgE humanos diluido 1:1500 en tampón diluyente, y se incuba a 25ºC durante 1,5 horas. Después de tres lavados se desarrolla una reacción colorimétrica mediante la adición de 100 \mul de reactivo Ultra Blu (Intergen, Milford, Mass.) y se incuba durante 15 minutos a 25ºC. La reacción se detiene mediante la adición de 100 \mul de HCl 1 N y se evalúa a 450 nm con un espectrofotómetro.
Bibliografía
[1] Chua K. Y., Doyle C. R., Simpson R. J., Turner K. J., Stewart G. A., Thomas W. R., (1990) "Isolation of cDNA coding for the major mite allergen Der p II by IgE plaque immunoassay". Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91 (2): 118-123
[2] Smith A. M., Chapman M. D., (1996) "Reduction of IgE binding to allergen variants generated by site-directed mutagenesis: contribution of disulfide bonds to the antigenic structure of the major house dust mite allergen Der p 2". Mol. Immunol. 33 (4-5): 399-405
[3] Theodoropoulos D. S., Lockey R. F., (2000) "Allergen immunotherapy: guidelines, update, and recommendations of the World Health Organization". Allergy Asthma Proc. 21 (3): 159-166
[4] Ohashi Y., Nakai Y., Tanaka A., Kakinoki Y., Washio Y., Ohno Y., Yamada K., Nasako Y., (1998). "Risk factors for adverse systemic reactions occurring during immunotherapy with standardized Dermatophagoides farinae extracts". Acta Otolaryngol. Suppl. 538: 113-117
[5] Ferreira F., Ebner C., Kramer B., Casari G., Briza P., Kungl A. J., Grimm R., Jahn-Schmid B., Breiteneder H., Kraft D., Breitenbach M., Rheinberger H. J., Scheiner O., (1998). "Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: potential use of hypoallergenic variants for immunotherapy". FASEB J. 12: 231-242
[6] Towbin J., Staehelin T., Gordon J., (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedures and some applications". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354
[7] Paul, (1989), "Fundamental Immunology", Raven press, New York.
[8] Cryz, S. J. (1991), "Immunotherapy and Vaccines", VCH Verlagsgesellschaft.
[9] Mistrello G., Brenna O., Roncarolo D., Zanoni D., Gentili M., Falagiani P. (1986): "Monomeric chemically modified allergens: immunologic and physicochemical characterization". Allergy 51:8-15.
<110> CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VARIANTES DE PROTEINAS ALERGÉNICAS DEL GRUPO 2 DE DERMATOPHAGOIDES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Cons Naz Ric
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dermatophagoides pteronyssinus 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 390
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dermatophagoides pteronyssinus 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dermatophagoides pteronyssinus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dermatophagoides pteronyssinus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
5

Claims (12)

1. Un alérgeno de Dermatophagoides que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos con Der p 2 de tipo salvaje mayor que el 85% y en el que los residuos Lys que coinciden con la secuencia Der p 2 de tipo salvaje en las posiciones 33, 48, 82, 96, 100 y 126 están sustituidos y/o eliminados.
2. Un alérgeno según la reivindicación 1, que se selecciona de Der p 2 y Der f 2.
3. Un alérgeno según las reivindicaciones 1-2, en el que dichos residuos Lys están sustituidos con aminoácidos neutros o polares.
4. Un alérgeno según la reivindicación 3, en el que los residuos Lys están sustituidos con el aminoácido alanina.
5. Un alérgeno según la reivindicación 4, que tiene la secuencia SEQ ID Nº 4.
6. Un fragmento peptídico del alérgeno de las reivindicaciones 1-5, adecuado para usar en una vacuna contra los ácaros del polvo, teniendo dicho fragmento peptídico todas las sustituciones y/o eliminaciones Lys indicadas en la reivindicación 1.
7. Una molécula de ácido nucleico que codifica un alérgeno de Dermatophagoides según las reivindicaciones 1 - 5 o un péptido según la reivindicación 6.
8. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, de secuencia SEQ ID Nº 2.
9. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 7-8.
10. Una célula hospedadora transducida con el vector de la reivindicación 9.
11. Una composición farmacéutica que comprende un alérgeno según las reivindicaciones 1-5, o un péptido según la reivindicación 6, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables, para usar en la inmunoterapia de alergias causadas por los ácaros del polvo.
12. Una composición según la reivindicación 11, en forma de una vacuna.
ES01984645T 2000-09-12 2001-09-11 Variantes de proteinas alergenicas del grupo 2 dermatophagoides. Expired - Lifetime ES2252315T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITMI00A1986 2000-09-12
IT2000MI001986A IT1318691B1 (it) 2000-09-12 2000-09-12 Varianti di proteine allergeniche del gruppo 2 di dermatophagoides.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2252315T3 true ES2252315T3 (es) 2006-05-16

Family

ID=11445782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01984645T Expired - Lifetime ES2252315T3 (es) 2000-09-12 2001-09-11 Variantes de proteinas alergenicas del grupo 2 dermatophagoides.

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6800290B2 (es)
EP (1) EP1317483B1 (es)
CN (1) CN100469789C (es)
AT (1) ATE311407T1 (es)
AU (1) AU2002220545A1 (es)
DE (1) DE60115475T2 (es)
ES (1) ES2252315T3 (es)
IT (1) IT1318691B1 (es)
WO (1) WO2002022677A2 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22983A1 (es) * 2002-05-08 2004-09-09 Inst Finlay Composición vacunal contra las alergias y método para su obtención y empleo en el tratamiento de las mismas
EP1572091A4 (en) * 2002-07-09 2008-03-05 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING TUMORS
DE60322120D1 (de) * 2003-02-07 2008-08-21 Genentech Inc Zusammensetzungen und verfahren für verstärkte apoptose
EP1621615B1 (en) * 2003-05-07 2010-03-17 Juridical Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Method of purifying modified acarian main allergen
WO2006042558A2 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Novozymes A/S Group 2 mite polypeptide variants
US8449894B2 (en) * 2006-05-26 2013-05-28 City Of Hope Aspergillus vaccine preparation and methods of making and using thereof
EP2384336B1 (en) * 2008-12-30 2014-03-05 Chua, Kaw Yan A variant of mite allergen and uses thereof
EP3269730A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-17 Universität Salzburg Allergen variant
WO2020046217A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 Chulalongkorn University A nucleic acid construct for inhibiting the house dust mite allergic response

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3350794B2 (ja) * 1993-09-29 2002-11-25 アサヒビール株式会社 改変したダニ主要アレルゲン

Also Published As

Publication number Publication date
US6800290B2 (en) 2004-10-05
ATE311407T1 (de) 2005-12-15
IT1318691B1 (it) 2003-08-27
US20020054881A1 (en) 2002-05-09
WO2002022677A2 (en) 2002-03-21
DE60115475D1 (de) 2006-01-05
CN100469789C (zh) 2009-03-18
WO2002022677A3 (en) 2002-10-03
ITMI20001986A0 (it) 2000-09-12
EP1317483A2 (en) 2003-06-11
DE60115475T2 (de) 2006-07-06
EP1317483B1 (en) 2005-11-30
ITMI20001986A1 (it) 2002-03-12
CN1454213A (zh) 2003-11-05
AU2002220545A1 (en) 2002-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2252315T3 (es) Variantes de proteinas alergenicas del grupo 2 dermatophagoides.
ES2341367T3 (es) Variantes hipoalergenicas del alergeno principal del polen de betula verrucosa.
ES2354820T3 (es) Proteínas de fusión que comprenden alérgenos modificados de la familia ns-ltps, utilización de las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden.
EP1846556B1 (en) Cloning of honey bee allergen
ES2286150T3 (es) Variantes del alergeno principal par j2 de parietaria judaica.
ES2238487T3 (es) Variantes de la proteina alergica phl p1 de phleum pratense.
BRPI0715331A2 (pt) derivados de citoquina
JP2002534996A (ja) アルファ−コノトキシン・ペプチド
ES2441252T3 (es) Epítopos promiscuos de linfocitos T CD4 HER-2/NEU
ES2371262T3 (es) Proteínas hipoalergénicas obtenidas del alérgeno principal de parietaria judaica.
Marconi et al. In planta expression of a mature Der p 1 allergen isolated from an Italian strain of Dermatophagoides pteronyssinus
ES2209563A1 (es) Produccion en la levadura pchia pastoris y sistema de purificacion del alergeno recombinante de olea europaea ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de largias.
ES2396540T3 (es) Clonación y secuenciación del alérgeno Dac g5 y del polen de Dactylis glomerata, su preparación y su utilización
WO2001030821A1 (fr) Nouveau polypeptide, arn cyclase humaine 41, et polynucleotide codant pour ce polypeptide
JPH05507207A (ja) 線虫ワクチン