ES2371262T3 - Proteínas hipoalergénicas obtenidas del alérgeno principal de parietaria judaica. - Google Patents

Abstract

Una proteína hipoalergénica obtenible mediante mutagénesis del alérgeno principal de Parietaria judaica Par j 1 (SEC ID Nº: 1), en la que dicha proteína se selecciona entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 7.

Description

Proteínas hipoalergénicas obtenidas del alérgeno principal de Parietaria judaica

La presente invención proporciona proteínas hipoalergénicas obtenidas a partir del alérgeno principal de Parietaria judaica Par j 1, composiciones farmacéuticas que las contienen y su uso en la profilaxis y terapia de enfermedades alérgicas causadas por el polen de plantas de las especies Parietaria.

Antecedentes de la invención

Las alergias están causadas por una disfunción en el sistema inmune, que reacciona produciendo anticuerpos de clase IgE frente a proteínas contenidas principalmente en el polen, ácaros, epitelios y algunos alimentos, proteínas que de por sí son completamente inocuas.

Estimaciones recientes indican que más del 10% de la población en los países occidentales sufre de esta enfermedad, que puede inducir a un empeoramiento de los síntomas (por ejemplo, aparición de asma) y una sensibilización a otros alérgenos con el tiempo, haciendo más complicada de esta manera la elección de una terapia apropiada.

La inmunoterapia específica (SIT), al contrario de la terapia farmacológica, es el único tipo de tratamiento etiológico de enfermedades alérgicas capaz de influir favorablemente sobre algunos parámetros inmunológicos que son la base de esta enfermedad.

La SIT consiste en la administración de dosis crecientes de extractos estandarizados (vacunas) obtenidos a partir de la misma sustancia que provoca la enfermedad.

De esta manera, una especie de tolerancia inmunológica a dicha sustancia aumenta gradualmente en el paciente, que viene acompañada por la desaparición de todos los síntomas alérgicos.

Sin embargo, el riesgo de provocar efectos secundarios (1), que pueden ser incluso graves aunque marcadamente reducidos con el uso de vacunas de liberación lenta o vacunas administradas a través de vías que son alternativas a inyecciones, ha limitado el uso de SIT en el tratamiento de enfermedades alérgicas.

En los últimos años, la atención se ha enfocado en el desarrollo de vacunas eficaces y más seguras. En particular, una diana importante es el desarrollo de vacunas que consisten en proteínas recombinantes mutagenizadas, es decir, variantes hipoalergénicas capaces de influir favorablemente en la progresión natural de la enfermedad sin provocar efectos secundarios indeseados (2).

El polen de Parietaria es una de las causas más importantes de alergia en el área mediterránea. Los dos alérgenos principales de este polen, Par j 1 (cuya secuencia de nucleótidos corresponde al número de acceso de GenBank AC X77414) y Par j 2 (AC X95865), son proteínas que tienen un peso molecular de aproximadamente 12 kD y son parcialmente homólogas en sus secuencias y funciones (3, 4, 5).

Descripción de la invención

Ahora se ha encontrado que el efecto alergénico de Par j 1 se puede disminuir modificando su secuencia a través de la sustitución o supresión de uno o más restos de aminoácidos.

De acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona una proteína hipoalergénica que es una variante de secuencia del alérgeno principal de Parietaria judaica (Par j 1) y que, en comparación con Par j 1 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 1), tiene reactividad reducida hacia IgE y contiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona entre SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 7.

La reactividad a IgE de las proteínas SEC ID Nº: 6-7 a partir de una combinación de sueros de sujetos alérgicos se ha ensayado en un ensayo de ELISA (Figura 1). A 5 µg/ml estas variantes redujeron la reactividad a IgE en un alcance del 50% (SEC ID Nº: 6) y el 82% (SEC ID Nº: 7) (Figura 2), en comparación con el alérgeno Par j 1 wt (SEC ID Nº: 1).

Además, se ha ensayado la reactividad a IgE de variantes de SEC ID Nº: 6-7 en cada suero de once sujetos alérgicos a Parietaria en un ensayo de ELISA. También en este caso, todas las variantes mostraron una alergenicidad reducida en los sueros analizados (Tabla 1 y Figura 3). En promedio, esta fue una reducción de al menos el 50%.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de alérgeno Par j 1 descrita en el presente documento o un péptido obtenido a partir de la misma.

Las variantes de sustitución y/o supresión de acuerdo con la invención se pueden preparar fácilmente mediante mutagénesis de la secuencia de ADNc de Par j 1 (SEC ID Nº: 14) usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.

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Las secuencias de ADNc que codifican las variantes de sustitución de SEC ID Nº: 6-7 se presentan en SEC ID Nº: 12-13.

La invención se refiere además a un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de las variantes hipoalergénicas definidas anteriormente. Un vector de este tipo puede ser un plásmido, virus, fago o cualquier otro vector que se usa comúnmente con fines de ingeniería genética y puede comprender, además de la molécula de ácido nucleico de la invención, elementos de control para la expresión en células eucariotas o procariotas, tales como promotores o potenciadores de la transcripción, secuencias señal u otras secuencias para la regulación de la transcripción.

La invención comprende además una célula huésped procariota o eucariota que se transforma o transfecta con el vector de la invención. Las células procariotas tales como Escherichia coli o Bacillus subtilis o las células eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae se usan generalmente para la clonación de vector y expresión de ADNc.

Además, las variantes hipoalergénicas de acuerdo con la invención se pueden producir como proteínas de fusión.

Dada la reactividad reducida a IgE, las variantes de Par j 1 de acuerdo con la presente invención se pueden usar de forma conveniente para la preparación de composiciones farmacéuticas para la inmunoterapia de individuos alérgicos al polen de Parietaria.

En un aspecto adicional la invención se refiere por lo tanto a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una variante hipoalergénica de Par j 1, combinada opcionalmente con otros alérgenos de Parietaria, junto con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, la composición farmacéutica es una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades alérgicas, tales como asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica y conjuntivitis alérgica. Los principios y procedimientos de vacunación se conocen por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en (6) y (7).

Descripción de las figuras

Figura 1: Análisis de reactividad a IgE de alérgeno rPar j 1 y sus variantes hipoalergénicas a través de un ensayo de ELISA. Figura 2: Reactividad a IgE de una combinación de sueros de rPar j 1 y sus variantes hipoalergénicas (5 µg/ml). Figura 3: Reactividad a IgE de sueros individuales de rPar j 1 y sus variantes hipoalergénicas.

Los siguientes ejemplos describen la invención con mayor detalle.

Ejemplos

A menos que se indique de otra manera, los procedimientos usados en los siguientes ejemplos se describen en Sambrook, Fritsch ET Maniatis "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", II ed. vol. 1-2-3, CSH Lab Press, 1989.

Ejemplo 1 – Mutagénesis específica de sitio del ADNc que codifica Par

Alérgeno i 1

La mutagénesis específica de sitio de ADNc que codifica el alérgeno Par j 1 (SEC ID Nº: 14) se llevó a cabo mediante amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) del mismo ADNc que se había clonado en un vector procariota (pBlue-script, nº de acceso de GenBank X52327). Los oligonucleótidos usados como cebadores en la reacción de PCR (Tabla 1) tenían las sustituciones de base apropiadas. Para cada mutagénesis, se usó un oligonucleótido complementario que se une a una región correspondiente de la cadena de la molécula de ADN (8). A continuación de la amplificación, el molde original no modificado se degradó de forma selectiva durante una digestión enzimática catalizada por la enzima de restricción DpnI. Células de Escherichia coli después se transformaron con las moléculas mutagenizadas. Los clones obtenidos a partir de colonias bacterianas únicas se secuenciaron mediante el procedimiento de Sanger para evaluar la modificación de base correcta y la ausencia de mutaciones inespecíficas en el ADNc.

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos usados como cebadores en reacciones de mutagénesis específica de sitio. Las bases que tienen la mutación están en negritas. Las bases subrayadas corresponden al sitio de restricción BamHI, que se usó para clonación.

Código de oligonucleótido

Secuencia del oligonucleótido

Pj1 23 Pj1 23.27 Pj1 66

cag ggg aaa gag gca gag ccg tca aag g cag ggg aaa gag gca gag ccg tca gcg ggg tgc tgc gac atc gac ggg gca ctc gtc agc gag g

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(continuación)

Código de oligonucleótido

Secuencia del oligonucleótido

Pj1 73 Pj1 41 Pj1 41.42.46 Pj1 92 Pj1 121 Pj1 138

agc gag gtc ccc gcg cac tgc ggc atc g c ggg gag acg gcg acg ggg ccg g gag acg gcg gcg ggg ccg cag gcg gtg cac gct tg aac atg gac tgc gcg aca ctt gga gtg g gac ccc gcc cac gca gca cgg ttg gag ccc gca ccg gaa gca gcc taa gga tcc

Ejemplo 2 – Producción de proteína de Par j 1 y sus variantes

Par j 1 wt (SEC ID Nº: 14) y ADNc mutagenizados (SEC ID Nº: 8-13), enlazados a una secuencia codificante que codifica seis histidinas, se expresaron en células de Escherichia coli de acuerdo con protocolos convencionales (9, 10) después de clonación en un vector de expresión. Las células se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en un tampón de NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8. Las proteínas recombinantes se aislaron a continuación de lisis de células bacterianas mediante sonicación y eliminación de sedimentos celulares a través de centrifugación. Las proteínas se purificaron a partir del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad usando columnas de agarosa unidas a ácido nitrilotriacético que quelan los iones de níquel que interaccionan con la parte de seis histidinas fusionada al alérgeno.

Ejemplo 3 – Características de los sueros de sujetos alérgicos

Los sueros se recogieron a partir de individuos con una historia clínica de alergia estacional a polen de Parietaria y una reactividad específica RAST 3+ y 4+ a alérgenos de Parietaria. La combinación de sueros se obtuvo recogiendo sueros con un nivel elevado de IgE de clase RAST 4+ específicas para alérgenos de Parietaria.

Ejemplo 4 – Análisis de ELISA de la reactividad de variantes de Par j 1 a IgE a partir de una combinación de sueros

Partiendo de una concentración de 10 µg/ml, diluciones dobles en serie de alérgeno normal y sus variantes mutagenizadas en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6, se adsorbieron en pocillos de placas de poliestireno para ensayos de ELISA mediante incubación a 4 ºC durante 16 horas. Cantidades equivalentes de albúmina sérica humana (HSA) se adsorbieron como controles negativos. Después los pocillos se lavaron con solución de lavado (tampón fosfato 60 mM, pH 6,5, que contiene Tween-20 al 0,05%) y se bloquearon con solución de dilución (suero de caballo al 25%, EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,05%, Thiomersal al 0,01% en tampón fosfato 150 mM, pH 7,4). Alícuotas iguales (100 µl) de una dilución 1:5 de una combinación de sueros humanos con reactividad RAST 4+ se añadieron a cada muestra y se incubaron a 25 ºC durante 2 horas. Después de tres lavados, se añadió el antisuero anti-IgE humana conjugado con peroxidasa (diluido 1:1500 en tampón de dilución), seguido por incubación a 25 ºC durante 1,5 horas. Después de tres lavados, se obtuvo desarrollo de la reacción colorimétrica añadiendo 100 µl de reactivo TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando durante 15 minutos a 25 ºC. La reacción se detuvo añadiendo 100 µl de HCl 1 N y se midió en un espectrofotómetro a 450 nm.

Ejemplo 5 – Análisis de ELISA de reactividad de IgE de variantes de Par j 1 en sueros individuales

Cantidades equivalentes (0,2 µg) de alérgeno normal, sus variantes mutagenizadas y albúmina sérica humana (HSA), usándose esta última como un control negativo, en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6, se adsorbieron en pocillos de placas de poliestireno para ensayos de ELISA mediante incubación a 4 ºC durante 16 horas. Después los pocillos se lavaron con solución de lavado (tampón fosfato 60 mM, pH 6,5, que contiene Tween20 al 0,05%) y se bloquearon con solución de dilución (suero de caballo al 25%, EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,05%, Thiomersal al 0,01% en tampón fosfato 150 mM, pH 7,4). Alícuotas iguales (50 µl) de una dilución 1:5 de suero humano con reactividad RAST 3+ y 4+ se añadieron a cada muestra y se incubaron a 25 ºC durante 2 horas. Después de tres lavados, se añadió el antisuero anti-IgE humana conjugado con peroxidasa (diluido 1:1500 en tampón de dilución), seguido por incubación a 25 ºC durante 1,5 horas. Después de tres lavados, la reacción colorimétrica se desarrolló añadiendo 100 µl de reactivo TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando durante 15 minutos a 25 ºC. La reacción se detuvo añadiendo 100 µl de HCl 1 N y se analizó en un espectrofotómetro a 450 nm.

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Tabla 2. Reactividad de IgE de sueros individuales a rPar j 1 y sus variantes hipoalergénicas

variante Suero

SEC ID Nº: 1 SEC ID Nº: 2 SEC ID Nº: 3 SEC ID Nº: 4 SEC ID Nº: 5 SEC ID Nº: 6 SEC ID Nº: 7 HSA

1

100,0 68,2 61,1 52,8 95,2 71,1 49,1 7,7

2

100,0 48,1 44,6 33,6 59,2 33,6 39,2 13,7

3

100,0 15,7 17,8 13,1 82,8 37,6 11,8 7,1

4

100,0 59,7 47,1 37,9 127,5 62,9 48,7 14,7

5

100,0 59,5 36,9 26,5 52,6 33,3 25,3 6.9

6

100,0 30,7 61,9 47,5 88,8 48,6 27,7 6,8

7

100,0 27,2 44,7 21,4 60,6 20,9 26,8 4,7

8

100,0 43,3 19,0 14,8 54,6 24,9 6,9 12,3

9

100,0 25,0 37,0 27,3 66,3 19,1 34,4 9,4

10

100,0 71,0 35,4 18,3 62,1 81,4 23,2 3,2

11

100,0 35,2 27,8 16,0 57,6 20,4 32,6 11,4

Reactividad de IgE media

100,0 45,0 41,8 31,1 74,8 41,9 32,4 12,3

Bibliografía

1. Toubi E., Kessel A., Blant A., Golan T. D., (1999) "Follow-up after systemic adverse reactions of immunotherapy". 5 Allergy, 54(6): 617-620.

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Duro G., Colombo P., Costa M. A., Izzo V., Porcasi R., Di Fiore R., Locorotondo G., Mirisola M. G., Cocchiara R., Geraci D., (1996). "cADN cloning, sequence analysis and allergological characterization of Par j 2.0101, a new major allergen of the Parietaria judaica pollen". FEBS Lett., 399: 295-298.

5.

Colombo P., Kennedy D., Ramsdale T., Costa M. A., Duro G., Izzo V., Salvadori S., Guerrini R., Cocchiara R.,

15 Mirisola M. G., Wood S., Geraci D., (1998). "Identification of an immunodominant IgE epitope of the Parietaria judaica major allergen". J. Immunol., 160: 2780-2785.

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Cryz, S. J. (1991), "Immunotherapy and Vaccines", VCH Verlagsgesellschaft.

8. Wang W., Malcolm BA. (2002). " Two-stage polymerase chain reaction protocol allowing introduction of multiple 20 mutations, deletions, and insertions, using QuikChange site-directed mutagenesis". Methods Mol Biol.; 182: 37-43.

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Listado de secuencias

<110> LOFARMA

<120> proteínas hipoalergénicas obtenidas a partir del alérgeno principal de Parietaria judaica

<130> 7474Meur 5 <160> 14

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 139

<212> PRT 10 <213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 de tipo silvestre

<400> 1

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante

<400> 2

<210> 3

<211> 139

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante

<400> 3

<210> 4

<211> 139

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante

<400> 4

<210> 5

<211> 139

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante

<400> 5

<210> 6

<211> 139

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante

<400> 6

<210> 7

<211> 139

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante

<400> 7

<210> 8

<211> 420

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante (secuencia codificante)

<400> 8 <210> 9

<211> 420

<212> AND

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante (secuencia codificante)

<400> 9

10 <210> 10

<211> 420

<212> AND

<213> Desconocido

<220> 15 <223> Par j 1 mutante (secuencia codificante)

<400> 10

<210> 11

<211> 420

<212> AND

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante (secuencia codificante)

<400> 11

10 <210> 12

<211> 420

<212> AND

<213> Desconocido

<220> 15 <223> Par j 1 mutante (secuencia codificante)

<400> 12

<210> 13

<211> 420

<212> AND

<213> Desconocido

<220>

<223> Par j 1 mutante (secuencia codificante)

<400> 13

10 <210> 14

<211> 420

<212> AND

<213> Desconocido

<220> 15 <223> Par j 1 de tipo silvestre (secuencia codificante)

<400> 14

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una proteína hipoalergénica obtenible mediante mutagénesis del alérgeno principal de Parietaria judaica Par j 1 (SEC ID Nº: 1), en la que dicha proteína se selecciona entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 7.

2. 2.

   Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 1.

   5 3. Una molécula de ácido de acuerdo con la reivindicación 2, que se selecciona entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 12-13.

3. 4.

   Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 2 ó 3.

4. 5.

   Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 4.

5. 6. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína hipoalergénica de Parietaria 10 de acuerdo con la reivindicación 1.

6. 7.

   Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en forma de una vacuna.

7. 8.

   Uso de una proteína hipoalergénica de Parietaria de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades alérgicas causadas por polen de plantas de las especies Parietaria.

   15 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 para el tratamiento de asma bronquial, rinitis, dermatitis o conjuntivitis alérgica.