KR100809923B1

KR100809923B1 - 잎응애 알레르겐

Info

Publication number: KR100809923B1
Application number: KR1020010047633A
Authority: KR
Inventors: 김유영; 민경업; 박해심; 조상헌; 김윤근
Original assignee: (주) 바이오알레텍
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2001-08-08
Publication date: 2008-03-06
Also published as: KR20030013564A

Abstract

본 발명은 잎응애 주요 알레르겐의 N-말단 아미노산 서열 및 전장 cDNA 서열, 이를 이용한 재조합 단백질 및 주요 알레르겐 특이 단일클론 항체를 제공한다.

잎응애, 귤응애, 점박이응애, 사과응애, 알레르겐, 알레르기성 질환

Description

잎응애 알레르겐{Allergens from Spider Mites}

본 발명은 잎응애(귤응애, 점박이응애, 사과응애) 주요 알레르겐의 아미노산 서열, cDNA 서열 및 그 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 잎응애 주요 알레르겐의 N-말단 아미노산 서열 및 전장 cDNA 서열, 이를 이용한 재조합 단백질 및 주요 알레르겐 특이 단일클론 항체의 생산 및 그 이용에 관한 것이다.

기관지 천식 및 알레르기 비염 등 알레르기 질환을 일으키는 흡입 알레르겐은 집먼지 진드기, 애완동물 털, 바퀴벌레, 실내 곰팡이 등에서 분비되는 실내 알레르겐과과 나무, 잔디, 잡초 화분, 실외 곰팡이 등의 실외 알레르겐으로 나눌 수 있다[Kim YY et al., Prevalence of childhood asthma based on questionnaire and methacholine bronchial provocation test, Clin. Exp. Allergy 1997; 27: 761-8면 참조]. 최근에, 본 발명자들은 과수원 근처 주민 및 도시 주민들에게 까지 원인 불명의 알레르기성 호흡기 질환이 잎응애에 속하는 귤응애, 사과응애 및 점박이응애에 의한 것일 수 있음을 보고한 바 있다[Kim YK et al., New occupational allergen in citrus farmers: citrus red mite (Panonychus citri), Ann. Allergy Asthma Immunol. 1999; 82: 223-8면; Kim YK et al., Citrus red mite is the most common sensitizing allergen in citus farmers with asthma and rhinitis, Clin. Exp. Allergy 1999; 29: 1102-9면; Kim YK et al., Citrus red mite (Panonychus citri) is a common sensitizing allergen among children living around citrus orchards, Ann. Allergy Asthma Immunol. 2000; 80: 200-4면; Kim YK et al., Spider mite allergy in apple-cultivating farmers: european red mite (Panonychus ulmi) and two-spotted spider mite (Tetranychus urticae) may be important allergens in the development of work-related asthma and rhinitis symptoms. J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 104: 1285-92면; Jee YK et al., Two-spotted spider mite (Tetranychus urticae): an important allergen in asthmatic non-farmers symptomatic in summer and fall months, Ann. Allergy Asthma Immunol. 2000; 84: 543-8면).

잎응애는 식물의 잎에 기생하여 엽록소를 흡즙하여 생활하는 소형 동물로서 이들은 계통분류학적으로 집먼지진드기나 저장진드기와는 같은 응애목에 속한다. 점박이응애는 사과, 배, 포도 등의 과수 뿐만 아니라 화훼, 채소, 잡초 등의 잎에도 기생하는 기주 식물의 범위가 광범위하게 분포하여, 우리 나라 뿐만 아니라 전세계적으로도 높은 밀도로 분포한다. 특히, 점박이응애는 농약 살포가 빈번하고, 전정 등 집약적인 재배 관리가 이루어지는 작물에서 발생 밀도가 높은 특징이 있다. 이는 농약에 의해 천적이 제거됨에 따라 점박이응애에 대한 천적의 밀도 억제 작용이 큰 역할을 하지 못하여, 기주 식물의 영양 조건이 향상되어 점박이응애의 생존과 번식률이 높아졌기 때문인 것으로 추정된다. 실제로 과수에 해를 주는 해 충 중에서 점박이응애를 포함한 잎응애는 제2차 세계 대전 이전까지는 문제되지 않았으나, 2차 대전 이후 농약이 광범위하게 사용되기 시작하면서 다른 해충은 많이 제거되었으나, 잎응애는 오히려 그 밀도가 증가하기 시작하여, 최근 조사에 의하면 과수 농사에서 가장 문제가 되는 해충으로 지적되고 있다[Kim YK et al., Spider mites: common outdoor allergens among individuals living in rural areas (Review), Clin. Exp. Allergy 2000; 30: 1364-70면].

우리 나라 인구의 약 20-30%가 알레르기 질환에 이환되어 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 점에 비추어 볼 때, 알레르기 비염, 기관지 천식, 아토피 피부염 등의 만성 알레르기 질환은 국민 보건의 관점에서 매우 중요한 질환이다. 이들 만성 알레르기 질환은 주변에 있는 원인 알레르겐에 의한 알레르기 염증 반응의 결과로 인하여 발생한다. 알레르기 질환의 원인 알레르겐은 주변 환경에 따라 매우 다양한 양상을 보인다. 즉, 우리 나라에서 알레르기 질환의 원인 알레르겐으로 지목되고 있는 것들은 외국의 예와 상당히 다르다.

이들 질환을 치료하기 위한 방법으로는 면역 치료법을 고려해 볼 수 있다. 면역 치료를 위해서는 다량의 단백질이 필요하고 이를 위해서는 재조합 단백질의 생산이 필수적이다. 최근에는 면역 치료 분야에서 DNA 백신을 이용하는 기술이 적지 않게 시도되고 있는데, DNA 백신을 이용한 면역 치료에 있어서는 원인 알레르겐의 cDNA의 염기 서열의 규명이 필수적이다.

이와 관련하여, 본 발명자들은 귤응애, 점박이응애, 사과응애 등의 잎응애가 기관지 천식, 알레르기 비염, 아토피 피부염 등의 만성 알레르기 질환의 주요한 원 인이 된다는 사실을 최초로 발견하게 되었고, 이러한 발견을 기초로 하여 이들 잎응애의 조항원을 유효 성분으로 하여 원인 불명의 기관지 천식 및 알레르기 비염의 진단 시약 및 진단 키트를 특허 출원(대한민국 특허출원 제2001-15868호)한 바 있다. 나아가, 본 발명자들은 잎응애의 조항원 중 알레르기 질환을 유발하는 핵심 물질인 주요 알레르겐을 찾아내고 그 아미노산 서열 및 핵산 서열을 밝힘으로써 이를 이용한 재조합 단백질 및 주요 알레르겐 특이 단일클론 항체의 생산 및 그 이용을 가능하게 하였다.

본 발명은 잎응애의 주요 알레르겐의 아미노산 서열을 제공함을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 제공함을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 형질 전환된 세균에서 상기 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 벡터, 이 발현 벡터를 이용하여 형질전환체를 제공하고, 이 형질전환체를 이용하여 재조합 단백질을 제공함을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 주요 알레르겐에 대한 단일 클론 항체를 제공함을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 알레르겐 또는 유전자를 유효 성분으로 포함하는 잎응애 알레르기성 질환 치료용 제약학적 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 하기 아미노산 서열(서열 1)을 함유하는 잎응애 알레르겐 또는 그 단편을 제공한다.

Ser-Arg-Leu-His-Asp-Ile-Asn-Gly-Asp-Asp-Val-Arg-Ala-Gln (서열 1)

본 발명은 하기 아미노산 서열(서열 2)을 함유하는 잎응애 알레르겐 또는 그 단편을 제공한다.

Glu-Asp-Thr-Pro-Ile-Ser-Phe-X-Phe-Pro-Pro-Ser-X-Ala-X (서열 2)

본 발명은 하기 아미노산 서열(서열 3)을 함유하는 잎응애 알레르겐 또는 그 단편을 제공한다.

Thr-Val-Gly-Ala-Leu-Lys-Pro-Thr-Phe-Ile (서열 3)

본 발명은 하기 아미노산 서열(서열 4)을 함유하는 잎응애 알레르겐 또는 그 단편을 제공한다.

Val-Ile-Glu-Leu-Tyr-Gln-Leu-Pro-Phe-Ser-Ala-Pro-X-Arg-Gln (서열 4)

본 발명은 하기 아미노산 서열(서열 5)을 함유하는 잎응애 알레르겐 또는 그 단편을 제공한다.

X-Lys-Glu-Ile-Lys-Phe-Gly-Ala-Asp-Val-Arg-Ala-Lys-Met-Ser (서열 5)

다른 일면에서, 본 발명은 상기 서열 1 내지 5의 아미노산 또는 그 단편을 코딩하는 유전자들을 제공한다.

또 다른 일면에서, 본 발명은 형질 전환된 세균에서 상기 서열 1 내지 5의 아미노산 또는 그 단편을 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 세균을 제공하고, 이 형질전환체를 이용하여 발현시킨 재조합 알 레르겐을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 1 내지 5의 알레르겐 또는 그 단편에 대한 모노클로날 항체를 제공한다.

일면에서, 본 발명은 상기 서열 1 내지 5의 알레르겐 또는 그 단편을 유효 성분으로 포함하는 잎응애 알레르기성 질환 치료용 제약학적 조성물을 제공한다.

다른 일면에서, 본 발명은 상기 서열 1 내지 5의 아미노산 또는 그 단편을 코딩하는 유전자를 유효 성분으로 포함하는 잎응애 알레르기성 질환 치료용 제약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 이용될 수 있는 아미노산 서열은 상기 서열 1 내지 5로 나타낸 아미노산 서열에 한정되지 않는다. 즉, 상기 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 전위에 의하여 여러 가지로 변이된 것(단편 포함)도 잎응애 알레르겐의 활성을 갖는 것이라면 본 발명의 아미노산 서열에 포함된다. 예컨대, 상기 서열 1 내지 5로 나타낸 아미노산과 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지고 잎응애 알레르겐 활성을 가지는 변이체를 포함한다.

본 발명에서, 재조합 (알레르겐) 단백질의 발현은 이미 당업계에 공지되어 널리 사용되고 있는 비융합 발현 및 융합 발현 모두에 의할 수 있다. 비융합 발현이라 함은 알레르겐 단백질만을 발현시키는 것을 의미하고, 융합 발현이라 함은 알레르겐 단백질을 다른 단백질과 융합된 형태로 발현시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 발현 벡터라 함은 형질 전환된 세균, 효모 또는 포유 동물 세포 중에서 상기 본 발명에 따른 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 말한다. 따라서, 이러한 성질을 갖춘 것이면 어느 것이나 무방하다.

본 발명에서 재조합 잎응애 알레르겐의 제조 방법은, 상기 정의한 발현 벡터로 형질 전환시킨 세균, 효모 또는 포유 동물 세포를 본 발명에 따른 유전자를 발현시킬 수 있는 최적의 조건에서 배양하여 재조합 알레르겐 단백질을 생산, 회수함에 의한다.

본 발명의 알레르겐(재조합 알레르겐 포함) 또는 그들 단편 또는 이들을 코딩하는 유전자는 알레르기성 질환의 치료 목적으로 사용될 수 있다. 즉, 알레르기성 질환의 치료를 위해 본 발명에 따른 알레르겐 또는 그 단편을 유효 성분으로 함유하는 제약학적 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명에서 알레르기성 질환이라 함은 잎응애의 특이 항원이 발병 원인이 되는 모든 알레르기성 질환을 의미한다. 예를 들면, 알레르기 비염, 기관지 천식, 아토피 피부염 등이 포함된다.

상기 제약학적 조성물의 제조 방법은 특정의 방법으로 한정되는 것은 아니다. 즉, 통상적으로 사용되는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 본 발명의 알레르겐 또는 그 단편, 또는 이를 코딩하는 유전자만을 사용하여도 되나, 바람직하기로는 일반적으로 사용되는 보조제 내지는 첨가제(예: 안정제, 부형제, 용해 보조제, 유화제, 완충제, 무통화제, 보존제, 착색제 등)가 첨가될 수도 있다.

또한 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 통상의 투여 경로에 의해 투여 가능하다. 예를 들면 경구, 피내, 피하, 근육내, 복강내 등의 경로로 투여될 수 있다. 또한, 예를 들면 트로치, 설하정, 점안제, 비강내 분무제, 파프제, 크림제, 로숀제 등의 경피, 경점막 약의 형태일 수 있다.

본 발명의 알레르기 질환 치료용 조성물의 투여량 및 투여 회수는 투여 경로, 증상에 따라 적절히 선택되어질 수 있다. 바람직하게는, 성인을 기준으로 1회당 약 50㎍ 이하로 매월 1회 정도 피하 주사된다.

이하에서, 본 발명은 바람직한 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명되나 이에 의해 제한되는 것은 결코 아니다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련된 당업자라면 본 발명의 청구범위 내에서 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 개질 및 변경이 가능함을 이해해야 할 것이다.

<실시예 1>

잎응애 주요 알레르겐의 규명

채집한 잎응애(귤응애, 점박이응애, 사과응에)에서 단백질 추출액을 얻은 후 주요 알레르겐 성분을 규명하기 위하여 20명의 환자 혈청을 이용하여 면역 블롯 분석을 시행하였다. 90 x 40mm의 미니-겔(mini-gel) 기구(캘리포니아주 샌프란시스코 소재 호에퍼 싸이언티픽사 제품)를 사용하여 12% 겔로 SDS-PAGE를 시행하였다. 3.5mm와 80mm의 2가지 폭을 갖는 콤(comb)을 만들어 왼쪽부터 분자량 측정을 위한 표지 단백질 시약(스웨덴 파마시아사 제품)과 정제된 항원을 넣고 긴 쪽에는 잎응애(귤응애, 점박이응애, 사과응애) 조항원을 넣은 후 전기영동 후 니트로셀룰로스 막으로 전위시켰다. 이후 표지 단백질과 잎응애 단백질의 전위 부위를 절단하여 폰세우 에스(Ponceu S) 용액으로 염색하여 표지 단백질의 위치와 항원 단백질의 위 치를 확인하였다. 항원이 전이된 니트로셀룰로스 막을 3 mm 간격으로 절단한 후 각각을 1% 소 혈청 알부민과 0.05% Tween 20이 포함된 PBS용액에 1 시간 동안 반응시켜 비특이적인 단백질 결합을 차단시킨 후 각 분절에 혈청(IgE, IgG4는 혈청 원액으로) 500㎕을 넣어 상온에서 16시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween 20이 포함된 PBS용액(이하 "PBS-T")으로 3회 세척후 바이오틴이 부착된 항-인간 IgE 항체(공급처: 캘리포니아주 부르링에임 소재 벡터 레보라토리스)를 실온에서 3시간 반응시켰다. 다시 PBS-T로 3회 세척 후 스트렙타비딘-퍼옥시다제(streptavidin-peroxidase; 세인트루이스 소재 시그마 케미칼사 제품) 1:500 희석액을 분절 당 500㎕씩 넣어 1시간 작용시켰다. 다시 5회 세척 후 메탄올에 용해시킨 0.3% 4-카이로-1-나프톨(시그마사 제품) 3 ㎖와 트리스 완충 식염 용액 50㎖ 및 30% H₂O₂용액 25㎕를 혼합한 용액을 분절당 1㎖씩 넣어 15분간 반응시킨 후 증류수로 3회 세척하여 반응을 관찰하였다. 면역 블롯 분석에서 20명의 환자의 혈청과 반응하는 단백질띠가 50% 이상일 경우 이를 주요 알레르겐으로 판정하였다. 본 연구 결과 귤응애인 경우 14, 24, 34 kda, 점박이응애인 경우 10, 29, 67 kda, 사과응애인 경우 33, 41, 51 kda 크기의 주요 알레르겐을 확인하였다.

이들 중 귤응애와 점박이응애의 N-말단 아미노산 서열 결정을 위해 잎응애 항원을 2 차원 SDS-PAGE 방법으로 전기영동을 실시하였다. 이를 PVDF 막에 전이시킨 다음 쿠마시 블루 염색을 시행하여 주요 알레르겐으로 확인한 단백질 항원을 잘라낸 후 에드만 분해법에 따라 N-말단 아미노산 염기 배열 순서를 결정하였다. 확 인한 N-말단 아미노산 배열을 미국 내쇼날 센터 바이올로직 인포매이션(National Center Biologic Information)의 알레르겐 데이터 베이스와 비교 분석하여 기존에 보고된 알레르겐과의 유사성을 평가하였다. 귤응애와 점박이응애 주요 알레르겐 중 귤응애인 경우 24, 34 kda 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 규명한 결과, 현재까지 보고된 알레르겐과 유사성이 전혀 없었다(표1). 또한, 점박이응애인 경우에도 10, 29, 67 kda 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 타 알레르겐과 전혀 유사성이 없었다(표2).

주요 알레르겐	N-말단 아미노산 서열
24kDa	Ser-Arg-Leu-His-Asp-Ile-Asn-Gly-Asp-Asp-Val-Arg-Ala-Gln
35kDa	Glu-Asp-Thr-Pro-Ile-Ser-Phe-X-Phe-Pro-Pro-Ser-X-Ala-X

X : 확인않됨

주요 알레르겐	N-말단 아미노산 서열
10kD	Thr-Val-Gly-Ala-Leu-Lys-Pro-Thr-Phe-Ile
29kD	Val-Ile-Glu-Leu-Tyr-Gln-Leu-Pro-Phe-Ser-Ala-Pro-X-Arg-Gln
67kD	X-Lys-Glu-Ile-Lys-Phe-Gly-Ala-Asp-Val-Arg-Ala-Lys-Met-Ser

X : 확인않됨

<실시예 2>

잎응애 주요 알레르겐 cDNA 서열 규명 및 재조합 단백질 합성

1) cDNA 라이브러리의 제조

귤응애와 점박이응애를 채집하여 각 1 mg의 응애를 액체 질소 존재 하에서 잘게 부순 다음, 핸드 균질기를 이용하여 균질화 시키고 단백질 분해효소를 이용하 여 단백질을 제거하였다. 잎응애가 완전 균질화되면 먼저 모든 RNA를 분리해 내고, 이렇게 분리한 RNA로부터 poly(A⁺) RNA만을 Poly A 트랙 키트(미국 프로메가사 제품)를 이용하여 순수 분리하였다. poly(A⁺) RNA로부터 역전사 효소를 이용한 PCR 방법으로 cDNA를 제조하고, 이로부터 다시 이중 가닥 cDNA를 재차 합성한 다음, 라이브러리를 만들기 위해 λZapII 파지미드 벡터(공급처: 영국 클론테크 레보라토리스)와 연결시키고 숙주 세포인 E. Coli XL-1 Blue에 형질전환시켰다. cDNA 라이브러리의 p.f.u(플레이크 형성 단위)가 10⁹ 이상이 되게 준비한 다음 알레르겐을 위한 클로닝 실험을 수행하였다.

2) 주요 알레르겐의 cDNA 클로닝을 위한 면역선별검사

상기에서 제조한 cDNA 라이브러리로부터 영(Young)과 데이비스(Davis)의 방법[Proc. Nat. Acad. Sci. 80, 1194-1198, 1983]에 의하여 잎응애의 주요 알레르겐을 부호화하는 cDNA를 면역선별검사하여 탐색하였다. 우선 E.Coli XL-1 Blue를 건강한 상태로 배양하고, 세포만 수집한 뒤 10mM MgSO₄에 현탁시켜 OD₆₀₀= 2이 되도록 희석하여 숙주세포로 사용하였다. 1차 선별은 10⁴ pfu 정도의 파지를 숙주세포와 섞어 LB 플레이트에 부은 뒤, 42 ^oC에서 3-4시간 방치하여 플레이크가 생기도록 하였다. 플레이크가 일단 보이기 시작하면, 10 mM IPTG 용액에 미리 포화시킨 후 건조시켜 놓은 니트로셀룰로스 필터를 조심스럽게 덮어 놓고, 다시 37 ^oC에서 4시간 정도 방치하여 자라난 플레이크에서 재조합 단백질이 발현되도록 유도하였다. 그 후 니트로셀룰로스 필터를 플레이트에서 떼어내어 많은 양의 TNT(10mM Tris.HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20) 용액을 이용하여 닦아 준 다음, 2% 무지방 건유를 함유한 TNT 용액에 넣어 상온에서 1시간 가량 흔들어 주며 단백질이 결합되지 않은 부분을 차단하였다. 그 후 잎응애의 주요 알레르겐을 발현한 플레이크를 선별하기 위하여 환자의 혈청을 1/5 정도로 희석한 다음 필터와 상온에서 1시간 가량 반응시켰다. 다시 TNT 용액으로 약 15분 간격으로 3번 씻어주면서 필터에 붙지 않은 항체를 제거하고, 2차 항체를 TNT 용액에 희석한 후 역시 상온에서 1시간 가량 반응시키고 10분간 3번 TNT용액으로 씻어 주어 붙지 않은 2차 항체를 완전히 제거하였다. 반응이 끝난 니트로셀룰로스 필터를 발색 반응 혹은 형광을 나타내게 하여 양성 플레이크를 선별하였다. 강하게 양성 반응을 나타내는 플레이크를 선택하여 멸균된 파스퇴르 피펫으로 찍어 내어 1㎖의 파지 완충액(20mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgSO₄, 0.1 M NaCl)에 넣고 4 ^oC에서 12시간 방치해서 파지가 완충액속으로 확산되도록 유도하였다. 이렇게 얻은 파지의 용액을 다시 pfu가 5000 정도 되도록 파지 완충액에 희석한 후 2차 선별을 수행하였다. 2차 선별은 1차 선별과 동일한 방법으로 수행하였고, 다만 단일 플레이크를 얻기 위해 플레이크의 역가를 낮추고, 좀 더 크게 키웠다. 3차 선별 역시 동일한 방법으로 수행하였고 양성반응을 보인 단일 플레이크를 각각 1㎖의 파지 완충액에 넣고 용출시켜 pfu를 결정하였다. 3차 선별을 마친 후, 강한 양성 반응을 보이는 파지를 헬퍼(helper) 파지 와 함께 SOLR 균주에 감염시켜 생체내 절단(in vivo excision) 방법에 의해 벡터로부터 cDNA 삽입체를 분리해 내고, 이렇게 얻어진 콜로니를 배양시킨 뒤 DNA를 얻어 서열 분석 및 재조합 단백질 발현을 위해 사용하였다.

3) 염기서열 분석과 재조합 단백질의 발현

생체내 절단 방법에 의해 분리된 알레르겐의 cDNA를 플라스미드 미디 프렙 키트(미국 퀴아젠사 제품)를 이용하여 순수 분리 정제한 뒤, 자동 서열 분석기를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 잎응애의 주요 알레르겐으로 알려진 단백질의 아미노산 서열과 이 염기서열로부터 유추되는 아미노산 서열을 서로 비교함으로써 앞서 면역선별검사 방법에 의해 클로닝한 cDNA가 원하는 알레르겐의 cDNA인지를 확인할 수 있었다. 핵산 염기서열과 아미노산 염기서열의 비교를 통하여 잎응애의 주요 알레르겐의 cDNA로 확인하였고, 이를 대장균으로부터 대량 발현시키기 위하여 E. coli 발현 벡터인 6X-히스티딘 융합 발현 시스템(독일 노바젠사 제품)의 pET 벡터에 서브 클로닝시키고 E. coli JM 109 (DE3) 균주에 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 100㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 OD₆₀₀ = 0.6 내지 0.8이 되게 배양하고, 최종 농도가 0.5 mM되게 IPTG 를 첨가한 뒤 3-4시간 정도 추가로 배양하여 재조합 단백질을 생산하도록 유도하였다. 이렇게 유도한 세포를 수집한 후, 초음파 처리 등으로 파쇄하고 SDS-PAGE 방법에 의하여 재조합 단백질의 발현 여부와 크기를 확인하고, 환자의 혈청을 항체로 사용하여 웨스턴 블롯 검사로 재조합 단백질이 목저하는 주요 알레르겐인지 여부를 확인할 수 있었다.

재조합 단백질의 발현 여부와 크기 및 항원 항체 반응에 의한 특이성을 확인하고, 벌크 His-결합 정제 키트(미국 노바젠사 제품)을 이용한 1 단계 친화성 크로마토그래피법에 의하여 재조합 단백질을 대장균으로부터 순수 분리 정제하였다. 상기한 방법으로 발현된 재조합 단백질은 N-말단에 여섯 개의 히스티딘이 융합되어 있기 때문에 니켈-세파로스를 이용하여 손쉽게 정제할 수 있었다. 정제한 효소의 순도는 SDS-PAGE 방법을 이용하여 확인하였고, 브래드포드 검정법을 통해 정량하였다.

<실시예 3>

단일 클론 항체의 제조 및 응용

상기와 같은 방법으로 제조한 재조합 단백질을 순수 분리 정제하여 단일 클론 항체를 생산하는 데에 사용하였다.

1) 재 료

송아지 혈청은 하이클론 랩사 제품을, 기타 단일 클론 항체(monoclonal antibodies) 생성에 필요한 시약, 배지 및 항생제는 집코-비알엘(Gibco-BRL; 미국 뉴욕 소재)사 제품을, 염소 항-마우스 IgG 항체는 벡터 ABC 키트(미국 산 라몬 소재 바이오제넥스 랩사 제품)를 사용하였다. 완전 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)와 불완전 프로인트 보조제 등은 디프코(DIFCO)사 제품을, NADPH, NADP+, 코마시 브릴리언트 블루 R-250, 프로테인 A-세파로스 등은 시그마사 제품을 사용하였다.

2) 면역화

단백질의 면역성을 증가시키고 웨스턴 블롯에서 보다 좋은 반응성을 가진 항체를 얻기 위해서, 정제된 재조합 단백질을 소듐 도데실 설페이트(SDS: 최종 농도, 0.1%)를 가하고 100℃에서 5분 정도 열처리해서 변성시켰다. 초음파를 이용하여 변성된 단백질 용액과 동일 부피의 완전 프로인트 보조제를 잘 섞은 후, 항원 200㎍을 포함한 보조제 용액 0.4㎖를 암컷 BALB/c 마우스(6-8주)의 복강에 주입하였다. 원하는 효소에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻기 위하여, 첫번째 주입 후 3주 간격으로 불완전 프로인트 보조제를 섞은 동일량의 항원을 3회 부스터 주사(booster injection)하였다. 세포 융합 3-4일 전에 최종 주사를 시행하였고, 이 때에는 프로인트 보조제 없이 효소만을 주사하였다.

3) 세포 융합

세포 융합 1-2 일전에 피이더(feeder) 층 세포를 먼저 준비하였다. 12-18주 된 BALB/c 마우스의 경추를 탈골시켜 죽인 다음, 복부 피부를 조심스럽게 제거하였다. 11.6% 슈크로스의 냉각 용액 5㎖를 복강 내 주입한 다음, 주입된 용액 약 3㎖를 다시 뽑아내어 650 x g에서 5분 동안 원심 분리하여 복막 세포를 수집하였다. 이를 96 웰 배양 플레이트에서 미리 배양하여 세포의 효율적 성장을 위해 필요한 성장 인자의 분비와 세포 역가를 유지하였다.

세포 융합은 다음과 같이 실시하였다. 면역된 BALB/C 마우스를 죽인 다음 70% 알코올로 세척하였다. 비장(spleen)을 가능한 한 상처를 입히지 않고 적출하여 세척 배지로 피를 잘 세척한 후, 원추형 원심 분리관 위에 철망을 올려놓고 비장을 집게로 눌러 잘 터뜨린 후 15분간 방치하였다. 상층액을 피펫으로 뽑아 미리 송아지의 혈청을 담아 놓은 원심 분리관에 옮겼다. 실온에서 300 x g로 10분간 원심분리하고, 다시 상층액을 취하여 여기에 0.83% NH₄Cl 2㎖를 가하여 침전된 세포를 분산시켰다. 이를 37℃에서 2분간 흔들면서 적혈구를 용혈시켜 다시 송아지 혈청이 들어 있는 원심분리관에 넣어 섞어준 후 원심분리하였다. 상기와 같은 방법을 2회 더 반복하여 최종적으로 침전된 세포를 세척 배지 5㎖에 분산시켰다.

골수종 세포는 8-아자구아닌 배지에서 중기 로그 성장 상태로 분열하는 골수종 세포를 원심분리하여 수확하였다. 이를 세척 배지 5㎖에 현탁시켜 사용하였다. 제거한 비장의 세포와 SP2/o-Ag-14 마우스 골수종 세포를 섞은 다음 50% 폴리에틸렌 글리콜 1500-DME(무혈청) 1㎖을 천천히 가하였다. 융합 과정은 37℃에서 90초간 유지하고 DME를 가함으로써 반응을 중단시켰다. 삼투압 충격을 방지하기 위하여 DME 1㎖을 처음 1분 동안 천천히 가하고 두번째 1분 동안 DME 2㎖을 가하며 10분 동안 DME 총 20㎖를 가한 다음 650 x g에서 1분간 원심분리하여 세포를 모아 선택성 HAT 배지(HAT, 항체, 20% FBS을 더한 DME) 20㎖로 분산시킨 다음 650 x g에서 1분간 원심분리하여 얻은 침전물을 HAT 배지 120㎖로 다시 분산시켰다. 세포 분산액 1㎖을 24-웰 플레이트의 각 웰에 옮겼다. 모든 배양 과정은 습기가 포화된 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 2-3일에 한번씩 1x HAT 배지를 바꾸어 주었다. 세포 융합 약 2주 후 하이브리도마가 웰의 70% 정도로 자라나면 배양액을 모아 면역 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석 방법으로 선별하여 양성 클론을 선별해 나갔다. 선별한 클론들은 6-웰 플레이트로 옮기고 다시 조직배양 플라스크 (75cm²)로 옮겨 배양한 후, 액체 질소 가스로 얼려 저장한 다음 사용하였다.

4) 단일 클론 항체의 정제

하이브리도마 배양액 120㎖를 15,000g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 상층액을 0-70% (NH₄)₂SO4를 처리하여 단백질을 농축하였다. 농축한 단백질을 PBS로 충분히 투석시켜 프로테인 A-아가로스 컬럼에 로딩한 다음 PBS로 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거하고 0.1 M glycin (pH 2.5)로 항체를 유출시켰다. 이때 용출된 용액을 받을 시험관에 받을 용액의 부피에 대해 1/10정도가 되도록 1.0 M 트리스 완충 용액(pH 8.0)을 미리 넣어 두어 항체가 산성 조건으로 인해 파괴되는 것을 방지하였다. 이렇게 얻어낸 항체는 충분한 양의 PBS buffer를 이용하여 투석시킨 다음 보관하였다.

본 발명은 잎응애 알레르겐 또는 그 단편, 그 유전자, 재조합 단백질, 단일 클론 항체 및 알레르기성 질환 치료용 제약학적 조성물을 제공한다.

<110> Bio Alletech <120> allergens from spider mites <130> 5522 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Panonychus citri <300> <301> KIM, Hee-Yeon PARK, Hae-Sim KIM, Yoon-Keun SON, Jee-Woong KIM, Hyun-Ah SUH, Jung-Hee NAHM, Dong-Ho CHO, Sang-Heon MIN, Kyung-Up KIM, You-Young <302> Identification of IgE-binding components of citrus red mite in sera of patients with citrus red mite-induced asthma <303> J ALLERGY CLIN IMMUNOL <304> 107 <305> 2 <306> 244-248 <307> 2001-02-28 <313> 1-14 <400> 1 Ser Arg Leu His Asp Ile Asn Gly Asp Asp Val Arg Ala Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Panonychus citri <300> <301> KIM, Hee-Yeon PARK, Hae-Sim KIM, Yoon-Keun SON, Jee-Woong KIM, Hyun-Ah SUH, Jung-Hee NAHM, Dong-Ho CHO, Sang-Heon MIN, Kyung-Up KIM, You-Young <302> Identification of IgE-binding components of citrus red mite in sera of patients with citrus red mite-induced asthma <303> J ALLERGY CLIN IMMUNOL <304> 107 <305> 2 <306> 244-248 <307> 2001-02-28 <313> 1-15 <400> 2 Glu Asp Thr Pro Ile Ser Phe Xaa Phe Pro Pro Ser Xaa Ala Xaa 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Tetranychus urticae <400> 3 Thr Val Gly Ala Leu Lys Pro Thr Phe Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Tetranychus urticae <400> 4 Val Ile Glu Leu Tyr Gln Leu Pro Phe Ser Ala Pro Xaa Arg Gln 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Tetranychus urticae <400> 5 Xaa Lys Glu Ile Lys Phe Gly Ala Asp Val Arg Ala Lys Met Ser 1 5 10 15

Claims

하기 아미노산 서열(서열 1)을 함유하는 잎응애 알레르겐.

Ser-Arg-Leu-His-Asp-Ile-Asn-Gly-Asp-Asp-Val-Arg-Ala-Gln (서열 1)
하기 아미노산 서열(서열 2)을 함유하는 잎응애 알레르겐.

Glu-Asp-Thr-Pro-Ile-Ser-Phe-X-Phe-Pro-Pro-Ser-X-Ala-X (서열 2)
하기 아미노산 서열(서열 3)을 함유하는 잎응애 알레르겐.

Thr-Val-Gly-Ala-Leu-Lys-Pro-Thr-Phe-Ile (서열 3)
하기 아미노산 서열(서열 4)을 함유하는 잎응애 알레르겐.

Val-Ile-Glu-Leu-Tyr-Gln-Leu-Pro-Phe-Ser-Ala-Pro-X-Arg-Gln (서열 4)
하기 아미노산 서열(서열 5)을 함유하는 잎응애 알레르겐.

X-Lys-Glu-Ile-Lys-Phe-Gly-Ala-Asp-Val-Arg-Ala-Lys-Met-Ser (서열 5)
서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
서열 번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
서열 번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
서열 번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제11항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제12항의 형질전환된 숙주세포에 의해 발현된 재조합 알레르겐.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 알레르겐에 대한 모노클로날 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 알레르겐을 유효 성분으로 포함하는, 잎응애 알레르기성 질환 치료용 제약학적 조성물.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 유전자를 유효 성분으로 포함하는, 잎응애 알레르기성 질환 치료용 제약학적 조성물.