TWI762488B

TWI762488B - 新穎杉木花粉蛋白質

Info

Publication number: TWI762488B
Application number: TW106120701A
Authority: TW
Inventors: 長田年弘; 田中悠喜
Original assignee: 日商大鵬藥品工業股份有限公司
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2022-05-01
Also published as: KR20180137563A; CN109312325B; JP6813577B2; JPWO2017221910A1; KR102156006B1; CN109312325A; TW201802111A; WO2017221910A1

Abstract

本發明提供一種新穎之杉木花粉蛋白質及起因於杉木花粉之過敏疾病的使用該蛋白質之診斷試劑、預防藥及治療藥等。本發明之杉木花粉蛋白質選自以下之(a)～(c)， (a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質， (b)包含於序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質， (c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質。

Description

新穎杉木花粉蛋白質

本發明係關於一種源自杉木花粉之新穎之蛋白質及該蛋白質之利用。

花粉症係由於吸入空中所飛散之花粉而發病，呈現出眼睛發癢或疼痛等過敏性結膜炎、鼻炎、皮膚炎症或者哮喘等症狀之過敏疾病。已知有眾多引發花粉症之植物，但於日本最常見之花粉症為杉木花粉症(起因於杉木花粉之過敏疾病)。於2003年之報告中，推定杉木花粉症之患病率於2001年時為19.4%(非專利文獻1)，推定至少有2000萬以上人次苦於杉木花粉症，將其稱作國民病亦不為過。有關杉木花粉症之更加嚴重之問題之一可列舉杉木花粉飛散量之逐年增加。已知杉木花粉之飛散量與花粉飛散期前一年之夏季平均氣溫成正比，報告有隨著日本平均氣溫之上升，杉木花粉飛散量在一年年增加(非專利文獻2)。隨之容易預測到今後杉木花粉症患者亦會增加，而有損害日本國民健康之虞。實際上，報告有根據使用38報之統合分析之結果，自1980年至2000年，杉木花粉症患病率已上升2.6倍(非專利文獻3)。關於該等杉木花粉症之治療，採用以抗組胺藥等之使用為首之一系列對症療法，但作為有望根治杉木花粉症之唯一之治療法，期待過敏原免疫療法(減敏療法)。此係藉由對皮下或舌下等投予引發過敏疾病之過敏原而期待過敏症狀緩和之治療法。該等過敏原免疫療法之開發或其治療效果之提昇所必不可少的是特定出原因過敏原及對原因過敏原之瞭解。作為與杉木花粉症之發病相關之主要之杉木花粉過敏原，此前報告有Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3(非專利文獻4、5及6)，尤其關於Cry j 1及Cry j 2，開發有以其等為主成分之標準化杉木花粉萃取物(非專利文獻7)，針對日本杉木花粉症之過敏原免疫療法得以實施。然而，亦存在過敏原免疫療法無效之患者群。有文獻提示杉木花粉中存在目前尚未鑑定出之新穎過敏原(非專利文獻8)，業界要求以有用性更高之杉木花粉症之免疫療法為目標的獨特之新穎過敏原蛋白質。 [先前技術文獻] [專利文獻] [非專利文獻1] Okuda M, Ann Allergy Asthma Immunol., 91：288-296, 2003 [非專利文獻2] Yamada T, et al., J Allergy Clin Immunol., 133：632-639, 2014 [非專利文獻3] Kaneko Y, et al., Int Arch Allergy Immunol., 136：365-371, 2005 [非專利文獻4] Yasueda H, et al., J.Allergy Clin. Immunol., 71：77-86, 1983 [非專利文獻5] Sakaguchi M, et al., Allergy, 45：309-312, 1990 [非專利文獻6] Fujimura T, et al., Allergy, 62：547-553, 2007 [非專利文獻7] Yasueda H, et al., Allergol. Int., 46：135-140, 1997 [非專利文獻8] Fujimura T, et al., Int Arch Allergy Immunol., 133：125-135, 2004

[發明所欲解決之問題] 本發明提供一種新穎之杉木花粉蛋白質及使用其之起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷試劑、預防藥及治療藥等。 [解決問題之技術手段] 本發明者等人為了解決上述問題，經過研究，結果從杉木花粉粗抗原中發現一種與源自杉木花粉症患者之淋巴球及血清中IgE (immunoglobulin E，免疫球蛋白E)顯示出較高之反應性的新穎之蛋白質，發現該新穎之蛋白質作為起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷試劑、預防藥或治療藥有用。即，本發明係關於以下之1)～11)者。 1)一種杉木花粉蛋白質，其選自以下之(a)～(c)。 (a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質 (b)包含於序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質 (c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質 2)一種聚核苷酸，其編碼選自以下之(a)～(c)之杉木花粉蛋白質。 (a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質 (b)包含於序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質 (c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質 3)一種聚核苷酸，其選自以下之(d)～(f)。 (d)包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸 (e)和包含與序列編號1所示之鹼基序列互補的鹼基序列之聚核苷酸於嚴格條件下雜交且編碼具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質之聚核苷酸 (f)包含與序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列且編碼具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質之聚核苷酸 4)一種起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑，其以如上述1)之杉木花粉蛋白質作為有效成分。 5)一種起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷試劑，其以如上述1)之杉木花粉蛋白質作為有效成分。 6)一種抗體，其針對如上述1)之杉木花粉蛋白質。 7)如上述6)之針對杉木花粉蛋白質之抗體，其為單株抗體。 8)一種如上述1)之杉木花粉蛋白質之用途，其用以製造起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑。 9)一種如上述1)之杉木花粉蛋白質之用途，其用以製造起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷試劑。 10)如上述1)之杉木花粉蛋白質，其用以預防或治療起因於杉木花粉之過敏疾病。 11)如上述1)之杉木花粉蛋白質，其用以診斷起因於杉木花粉之過敏疾病。 [發明之效果] 本發明之杉木花粉蛋白質可用於起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷試劑、預防藥及治療藥等。該杉木花粉蛋白質具有與Cry j 1、Cry j 2、其他已知杉木花粉蛋白質不具有同源性之胺基酸一級序列，因此可藉由與該等組合而實現更有用之減敏治療。

杉木花粉蛋白質 本發明之杉木花粉蛋白質係選自以下之(a)～(c)之蛋白質。 (a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質 (b)包含於序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質 (c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質如下蛋白質(上述(b))只要具有杉木花粉過敏原活性則包含於本發明之杉木花粉蛋白質中，該蛋白質(上述(b))包含於該序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列。作為包含此種胺基酸序列之杉木花粉蛋白質，例如，可列舉具有序列編號2所示之胺基酸序列之杉木花粉蛋白質之同功異型物等。此處，所謂缺失、置換或附加之數個胺基酸係指例如1～10個胺基酸，進而較佳為1～5個胺基酸。又，上述附加或缺失包括針對兩末端之1～數個胺基酸之附加或缺失。作為同功異型物之具體例，例如，可列舉C末端之4個殘基之缺失。此處，所謂「杉木花粉過敏原活性」，不僅包括與肥胖細胞上之IgE結合而於異位性人群中引起速發型過敏反應之活性(De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146：177-189, 2008)，亦包括僅與血清中之IgE結合之活性。與IgE結合之活性可藉由國際公開第2012/105541說明書等所記載之方法測定。又，如下蛋白質(上述(c))只要具有杉木花粉過敏原活性則包含於本發明之杉木花粉蛋白質中，該蛋白質(上述(c))包含對序列編號2所示之胺基酸序列中對應之序列適當地進行對準時與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之蛋白質。此處，與序列編號2所示之胺基酸序列之同一性較佳為95%以上，更佳為98%以上。該胺基酸序列之同一性可使用例如使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information，美國國立生物技術信息中心之鹼基局部對準檢索工具)並將選擇性參數設為初始設定值而進行計算之方法。又，本發明之杉木花粉蛋白質亦可與有助於如多重組胺酸殘基之純化的序列、用以確保重組生產時之穩定性的蛋白質等形成融合體。編碼杉木花粉蛋白質之聚核苷酸 本發明之聚核苷酸係編碼上述杉木花粉蛋白質者，可較佳地列舉：(d)包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸；(e)和包含與序列編號1所示之鹼基序列互補的鹼基序列之聚核苷酸於嚴格條件下雜交且編碼具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質之聚核苷酸；(f)包含與序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列且編碼具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質之聚核苷酸。 (e)及(f)之聚核苷酸包含(d)之聚核苷酸之變異體。該變異體包含天然之等位基因變異體或可使用該領域周知之變異誘發技術生成之非天然存在之變異體。本發明之聚核苷酸不僅包含雙鏈DNA(Deoxyribonucleic Acid，脫氧核糖核酸)，亦包含構成其之有義鏈及反義鏈等各種單鏈DNA或RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)。反義鏈可用作探針等。DNA包含如利用例如選殖或化學合成技術或其等之組合而獲得之cDNA或基因組DNA等。進而，針對本發明之聚核苷酸，除編碼本發明之多肽之鹼基序列以外，亦可附加非轉譯區(UTR，Untranslated Regions)之序列或載體序列(包含表現載體序列)等鹼基序列。此處，所謂嚴格條件，例如，可列舉Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Second Edition, J.Sambrook et.al, 1989)所記載之條件等。即，可列舉如下條件等：於包含6×SSC(salt-sodium citrate，鹽水檸檬酸鈉混合緩衝溶液)(1×SSC之組成：0.15 M氯化鈉、0.015 M檸檬酸鈉，pH值7.0)、0.5%SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)、5×鄧哈特溶液及100 mg/mL鯡魚精子DNA之溶液中，與探針一起於65℃下保持恆溫8～16小時而進行雜交。又，與序列編號1所示之鹼基序列之同一性較佳為95%以上，更佳為98%以上。該鹼基序列之同一性可應用例如使用BLAST並將選擇性參數設為初始設定值進行計算之方法。作為上述聚核苷酸之變異體，例如，可列舉序列編號1所示之鹼基序列之第4號a變異為g、第898號t變異為c、第1029號g變異為a、第1643號t變異為a者。編碼杉木花粉蛋白質之聚核苷酸之獲取 編碼本發明之杉木花粉蛋白質之聚核苷酸可從杉木花粉中進行選殖，作為選殖方法，可列舉使用已知方法，例如散彈槍法、PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)法進行選殖之方法。例如，製備與本發明之聚核苷酸之鹼基序列之一部分特異性地雜交之探針，使用該探針，對基因組DNA基因庫或cDNA基因庫進行篩選即可。作為此種探針，只要為與本發明之聚核苷酸或其互補鏈之至少一部分特異性地雜交之探針，則可使用任意序列及長度者。又，可列舉人工合成聚核苷酸之方法。(Kosuri S et.al., Nature Methods 11, 499-507, 2014) 又，本發明之聚核苷酸亦可藉由使用適當之原理獲取用以與包含本發明之聚核苷酸之一部分或整體的聚核苷酸進行雜交之序列而獲得。例如，可列舉將包含上述本發明之聚核苷酸之一部分的聚核苷酸用作引子而進行之PCR法、將包含上述本發明之聚核苷酸之一部分的聚核苷酸用作探針之方法。例如，使用PCR等擴增方法之方法係從本發明之聚核苷酸之5'側及3'側之序列(或其互補序列)之中分別製備引子，使用該等引子，以基因組DNA(或cDNA)等為模板，進行PCR等擴增反應，使夾在兩引子間之DNA區域擴增，藉此，可大量獲取包含該聚核苷酸之DNA片段。又，本發明所提供之聚核苷酸亦可藉由利用例如計劃性之或隨機之變異導入法等方法，改變包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸而製作。此處，計劃性地導入變異時之變異之計劃可藉由例如參酌聚核苷酸序列上之特徵性序列而進行。又，作為隨機地導入變異之方法，例如，可列舉PCR法、利用變異原處理進行之方法。作為計劃性地導入變異之方法，可列舉定點突變誘發法，更具體而言，例如，可使用定點突變誘發系統Mutan-超表現Km套組(Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit)(TAKARA BIO)等而進行。又，亦可使用重組PCR法(PCR protocols, Academic Press, New York, 1990)。杉木花粉蛋白質之製造 本發明之杉木花粉蛋白質可藉由從杉木花粉中分離純化而獲得。分離純化方法並無特別限定，例如，使用凝膠過濾、離子交換層析法、親和層析法等先前公知之方法對杉木花粉萃取液進行分離、純化即可。又，可將重組載體導入至宿主細胞中，使杉木花粉蛋白質於細胞內或者細胞外表現而進行採集選取，該重組載體係藉由將本發明之聚核苷酸組入適當之載體而製作。作為宿主，只要為能夠轉形之活細胞，則並無特別限定，例如，可列舉大腸桿菌、枯草桿菌等細菌、酵母或絲狀菌等真菌類、Sf9細胞等昆蟲培養細胞、蠶等昆蟲、動物細胞、植物或源自植物之細胞等。用以插入本發明之聚核苷酸之載體只要為能夠在上述宿主中複製者，則並無特別限定，可根據所要導入之宿主之種類、導入方法等適當決定。例如，可列舉質體DNA、噬菌體DNA、病毒載體等。表現載體之組建所使用之載體DNA係使用廣泛普及之容易獲取者。例如，可列舉pUC19 (TAKARA BIO)、pTV118N(TAKARA BIO)、pMAMneo (Clontech)、pGEX (GE Healthcare)、pET160 (Invitrogen)、pDEST (Invitrogen)、pIEx (Merck Millipore)、pBacPAK (Clontech)等。又，作為病毒載體，例如，可列舉桿狀病毒載體、反轉錄病毒載體、人類免疫缺陷症病毒(HIV)等慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV載體)、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰白質炎病毒、新德比斯病毒、仙台病毒、猿猴病毒-40(SV-40)等DNA病毒或RNA病毒等。使用該重組載體而進行之宿主之轉形可使用原生質體法、勝任細胞法、電穿孔法等而進行。使用包含可同化碳源、氮源、金屬鹽、維生素等之培養基，將所獲得之轉形體於適當之條件下進行培養即可。從以此方式獲得之培養液中，利用常規方法進行蛋白質之採集選取、純化，而可獲得本發明之杉木花粉蛋白質。例如，於使用大腸桿菌作為宿主之情形時，可列舉pET System Manual, 10th edition (Novagen)所記載之方法等。起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑 本發明之杉木花粉蛋白質成為起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑，可對需要其之人(患者)投予而用以預防或治療起因於杉木花粉之過敏疾病。此處，作為起因於杉木花粉之過敏疾病，可列舉因杉木花粉之特異抗原引起之一切過敏疾病，具體而言，例如，可列舉異位性支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性皮膚炎等。該起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑可例如用作針對起因於杉木花粉之過敏疾病之減敏療法劑。根據使用GENETYX Ver.12之胺基酸同源性分析之結果，本發明之杉木花粉蛋白質未見與Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3之同源性，認為乃與先前公知之Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3不同之蛋白質，藉由與該等組合而可實現更有用之減敏治療，該Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3據報告為與杉木花粉症之發病相關之主要杉木花粉過敏原。於將本發明之起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑用作減敏治療劑之情形時，較佳為將本發明之杉木花粉蛋白質直接使用、或加以乾燥後製成粉末狀，另外視需要利用常規方法添加通常所使用之佐劑或各種添加劑、例如穩定劑、賦形劑、增溶劑、乳濁劑、緩衝劑、鎮靜劑、防腐劑、著色劑等而製備成複合劑。例如，可將粉末狀之經純化之杉木花粉蛋白質溶解於添加有苯酚之生理鹽水中，以用作減敏治療用抗原之原液。本發明之起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑可藉由通常之投予路徑、例如經皮、經口、皮內、皮下、肌內、腹腔內等投予方法而進行。進而，亦可用作例如口含錠、舌下錠、滴眼劑、鼻腔內噴霧劑、敷劑、乳霜劑、洗劑等經皮、經黏膜藥。本發明之起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑之投予量及投予次數根據投予路徑、症狀等而不同，例如，以處於成人每次約0.1～1000 μg之範圍之方式適當選擇，每週投予1至數次左右。起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷 本發明之杉木花粉蛋白質成為起因於杉木花粉之過敏疾病診斷試劑，可用於診斷起因於杉木花粉之過敏疾病。該起因於杉木花粉之過敏疾病診斷試劑可用作例如針對起因於杉木花粉之過敏疾病之皮膚反應診斷、即皮內試驗或點刺試驗(prick test)試劑等。此外，藉由製備特異性IgE抗體檢查用試劑而能夠進行使用患者血清或血漿之診斷。(鼻過敏診療指南-全年性鼻炎與花粉症-2013年版，Life Science股份有限公司) 於用作皮膚反應診斷試劑之情形時，例如將藉由上述方法獲取之本發明之杉木花粉蛋白質加以乾燥後製成粉末狀，使之溶解於包含苯酚或甘油之生理鹽水中，稀釋後使用。作為特異性IgE抗體檢查用試劑，可列舉在水相中或固相上使患者檢體中之IgE抗體與本發明之杉木花粉蛋白質結合，並基於螢光酶免疫檢定(Fluoro enzyme immunoassay)、化學發光酶免疫檢定(Chemiluminescence enzyme immunoassay)、酶免疫檢定(enzyme immunoassay)等原理進行檢測之方法，但檢測方法並不限定於該等。針對杉木花粉蛋白質之抗體 本發明之針對杉木花粉蛋白質之抗體係可與本發明之杉木花粉蛋白質特異性地結合之抗體。上述所謂抗體係指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及該等之Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段)，例如，可列舉多株抗體、單株抗體、單鏈抗體、抗遺傳型抗體及人源化抗體，但並不限定於該等。上述抗體可使用各種公知之方法而製作，製作方法並無特別限定。上述抗體可用於表現本發明之杉木花粉蛋白質的生物體或其組織或細胞之鑑定等。例如，可用於對大氣中或室內空間或人黏膜上有無杉木花粉蛋白質等進行測定。該測定可藉由公知之免疫學方法而進行，例如，可藉由ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯免疫吸附法)而進行。以下，藉由實施例具體地說明本發明，但本發明並不受該等實施例之限定。 [實施例] 實施例1 新穎杉木花粉蛋白質之部分純化＜杉木花粉蛋白質之部分純化＞對2 g杉木花粉添加萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)50 mL，進行10分鐘之超音波破碎。繼而，於室溫下混合10分鐘之後，進行離心(10,000 g，10分鐘)，而獲得上清液。將該上清液進一步超速離心分離(50,000 g，60分鐘)，回收上清液。對該上清液17 mL等量添加利用萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)平衡化之Q-瓊脂糖凝膠(高性能)(Q Sepharose High Performance)樹脂(GE Healthcare)懸浮液，於室溫下振盪30分鐘。藉由離心分離(1,000 g，10分鐘)去除上清液後，利用萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)定容至50 mL，倒置混合後，再次離心分離，藉此將樹脂洗淨。繼而，對洗淨之樹脂添加含有0.0125 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)10 mL，於室溫下振盪5分鐘。藉由離心分離(1,000 g，10分鐘)去除上清液，使吸附於樹脂之蛋白質溶出。利用含有0.025 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)、含有0.05 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)、含有0.1 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)、含有0.2 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)、含有0.4 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)、含有0.6 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)反覆進行相同操作。最後，將使用含有0.6 M NaCl之萃取緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH值9.0)所溶出之蛋白質溶液作為部分純化液進行回收。＜部分內部胺基酸序列之鑑定＞利用100,000MWCO旋轉柱離心管(spin column)對回收之部分純化液進行濃縮操作。針對濃縮之樣品，使用Novex(註冊商標)NuPAGE(註冊商標)SDS-PAGE system(Invitrogen)之一般操作說明，進行還原及SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)。對電泳後之SDS-PAGE凝膠，使用SilverQuest(註冊商標)Silver Staining Kit(ThermoFisher)之標準操作說明，進行銀染色。繼而，為了明確本發明蛋白質內部之部分胺基酸序列，而對利用蛋白酶進行限制性水解而獲得之片段進行分析。即，將分子量70 kDa條帶附近之凝膠切碎後，集中碎片，利用水及乙腈洗淨，供至利用DTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)及碘乙醯胺進行之烷基化處理。繼而，於樣品中添加胰蛋白酶，於37℃下保溫16小時而進行水解反應。反應後，使用25 mM碳酸氫銨、5%甲酸及乙腈，從凝膠片中萃取肽。最後，於減壓下對萃取溶液進行乾燥。使經乾燥之樣品溶解於包含水、乙腈及三氟乙酸之溶劑(體積比為98：2：0.1)中，利用LC-MS/MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，液相色譜-質譜/質譜聯用)系統(Paradigm MS4(Michrom Bioresources公司)，MS/MS：LTQ OrbiTrap XL質譜儀(ThermoFisher))進行分析。管柱係選擇分析用C18管柱L-Column Micro(化學物質評價研究機構)，選擇流動相A([水]：[乙腈]：[甲酸]＝98：2：0.1(體積比))及流動相B([水]：[乙腈]：[甲酸]＝5：95：0.1(體積比))。添加樣品後，於乙腈送液梯度(分鐘，%B)：(0，5)→(20，35)→(25，90)→(30，90)→(30.01，5)→(40，5)之條件下進行溶出、區分，利用MS/MS測定肽分子量。對於所獲得之分子量，使用Mascot(Matrix Science)軟體確定肽序列。其結果，獲得部分序列WIVDEATGLR。實施例2 純化重組蛋白質之製備＜杉木總RNA(total RNA)之萃取＞將在液氮中冷凍粉碎之杉木雄花(花藥)2 g添加至放入有25 mL之植物RNA分離試劑(Plant RNA Isolation Reagent)(Invitrogen)之50 mL管中並混合後，於室溫下靜置5分鐘。於4℃下離心(2600×g，5分鐘)之後，藉由傾析利用網眼尺寸100 μm之篩網對上層進行過濾。繼而，於回收之濾液中添加1/5倍量之5 M NaCl及3/5倍量之氯仿。於4℃下離心(2600×g，30分鐘)之後，回收上層20 mL，添加9/10倍量之異丙醇，進行攪拌。於室溫下靜置10分鐘之後，於4℃下離心(2600×g，30分鐘)，使RNA沈澱。去除上清液後，對RNA顆粒添加75%乙醇10 mL而進行洗淨。進而，於4℃下離心(2600×g，5分鐘)之後，去除上清液，之後將總RNA於室溫下乾燥，之後使其溶解於200 μL之無RNA酶水(RNase free water)中。於室溫下離心(12000×g，3分鐘)後，使用無RNA酶之DNA酶試劑盒(RNase-Free DNase Set)(Qiagen)進行DNA酶處理(DNase處理)。即，於總RNA溶液上清液180 μL中添加15 μL之緩衝液RDD(Buffer RDD)、5 μL之DNA酶I儲備溶液(DNase I stock solution)後於室溫下靜置10分鐘而實施。繼而，使用RNeasy迷你套組(RNeasy mini kit)(Qiagen)實施總RNA之提純(clean up)。即，於DNA酶處理後，於樣品200 μL中添加700 μL之緩衝液RLT(Buffer RLT)、500 μL之乙醇後，添加至附帶RNeasy迷你套組之管柱中並進行離心(8000×g，15秒)。繼而，於管柱中添加500 μL之緩衝液RPE(Buffer RPE)，於室溫下離心(8000×g，15秒)，反覆進行本操作2次。其次，將30 μL之無RNA酶水添加至管柱中，於室溫下離心(8000×g，1分鐘)，對所獲得之溶液提純，完成後，作為總RNA進行回收。＜杉木cDNA之製作＞從所獲得之提純完成之總RNA中，使用適用於RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction，逆轉錄-聚合酶鏈反應)之Superscript III第一鏈合成系統(Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR)(Invitrogen)合成cDNA。將2 μg之總RNA溶解於8 μL之純化水中，添加1 μL之50 μm多聚胸腺嘧啶(oligo(dT))20、1 μL之10 mM dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸)後，於65℃下培養5分鐘。使樣品在冰上冷卻之後，添加2 μL之10X RT緩衝液(RT buffer)、4 μL之25 mM MgCl₂ 、2 μL之0.1M DTT、1 μL之RNaseOUT(40 U/μL)、1 μL之SuperScript III反轉錄酶(SuperScript III Reverse Transcriptase)，並進行混合。於50℃下培養50分鐘之後，於85℃下處理5分鐘，使反應停止。繼而，於樣品中添加1 μL之RNA酶H(RNase H)，於37℃下培養20分鐘，藉此製成杉木cDNA。＜選殖＞針對所獲得之部分序列WIVDEATGLR，使用GENETYX版本12.0.4軟體，進行cDNA序列之推定，利用ForestGEN(http：//forestgen.ffpri.affrc.go.jp/ja/index.html)資料庫進行同源性檢索。其結果，檢索到簇ID(cluster ID)：Cj5792。進而，發現所檢索到之Cj5796之同源基因即源自Vitis vinifera之未鑑定蛋白質基因序列gi|157358255|emb|CAO65892.1|包含ForestGEN cluster ID：Cj822。此外，Cj5792及Cj822分別與杉木cDNA基因庫BY882225.1、BY900252.1具有較高之同源性。基於該等資訊，設計用於選殖之引子組，並供至下述研究。即，為了獲得序列編號1所示之聚核苷酸，將杉木之cDNA作為模板，使用引子(Primer)1(GATTTCATGRCAGCGACAG：序列編號3)及其下游之引子2(CATGRCAGCGACAGSGAT：序列編號4)作為同義引子，使用引子3(TCAAAGTTGATGCAACAATTG：序列編號5)作為反義引子，藉由KOD Fx Neo(TOYOBO)進行巢式PCR(nested PCR)。利用Wizard SV凝膠及PCR提純系統(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)(Promega)對PCR產物進行純化。使用TOPO TA選殖測序套組(TOPO TA Cloning Kit for Sequencing)(Thermo Fischer)套組，將純化之PCR產物組入至pCR 2.1-TOPO TA載體(TOPO TA Vector)，從而製作包含序列編號1所示之聚核苷酸之載體。＜重組蛋白質之純化＞利用Sysmex股份有限公司之ProCube(註冊商標)service，按照日本專利特開2014-195411公報之方法，對在序列編號2所示之胺基酸一級序列(去除推測為訊息序列部分之第1至26號胺基酸)之C末端附加Flag標籤而成之重組蛋白質實施純化。即，從上述所製作之載體中將序列編號1所示之聚核苷酸(去除編碼推測為訊息序列部分之第1-26號胺基酸的第1-78號聚核苷酸)重組至具有蠶表現用訊息序列且於C末端融合表現Flag標籤之轉移質體，製成桿狀病毒後，接種至蠶蛹後，將第7天所獲得之蛹利用磨碎緩衝物(20 mM Trs-HCl、100 mM NaCl、Complete EDTA free 1錠/50 mL、苯硫脲)磨碎。對磨碎物進行超速離心後，回收上清液，使用DDDDK標籤蛋白純化凝膠(DDDDK-tagged Protein PURIFICATION GEL)(MBL)，按照隨附說明書進行親和純化，藉此製備純化重組蛋白質。利用SDS-PAGE對純化之重組蛋白質進行分析，將分析結果示於圖1。實施例3 純化重組蛋白質之過敏原活性確認 (i)杉木花粉症患者淋巴球增殖應答從自杉木花粉症患者(ImmunoCAP評分≧2)採集之30 mL末梢血中單離出末梢血液單核細胞，使之以成為1.11×10⁶ cells/mL之方式懸浮於含10%滅活自體血漿之RPMI-1640培養基中。將180 μL之所製備之細胞懸浮液及20 μL之本發明之重組蛋白質溶液(濃度100 μg/mL)播種至96孔板中(2×10⁵ cells/well)。於37℃、5%CO₂ 條件下培養3天之後，添加³ H-胸苷，測定經過16小時後之攝入量作為放射活性，藉此對細胞增殖進行評價。將用添加純化重組蛋白質時之³ H-胸苷攝入量除以非添加時之攝入量而得之值作為刺激指數(Stimulation index)，計算結果示於圖2。一般而言，於臨床檢查之淋巴球刺激試驗中，將刺激指數1.8以上作為陽性基準(內田重行等，肝臟 30卷 4號 439-443，1989)。遵照該基準，判定4例中有3例(75%)為陽性。根據以上之結果，可知杉木花粉症患者高頻率地被本發明之重組蛋白質以T細胞水準致敏。 (ii)杉木花粉症患者嗜鹼性粒細胞之活化已知於被過敏原刺激而活化之嗜鹼性粒細胞中，CD203c之表現增強(De Weck, AL. et al.,Int. Arch. Allergy Immunol., 146：177-189, 2008)。使用基於該原理之Allergenicity套組(Beckman Coulter)，對杉木花粉症患者(ImmunoCAP評分≧2)或健康正常者(ImmunoCAP評分＜2)血液中之嗜鹼性粒細胞活化進行分析。即，於肝素採血之全血100 μL中以最終濃度成為3 μg/mL之方式添加本發明之重組蛋白質溶液20 μL，於陰性對照樣品中添加PBS(-)20 μL。繼而，對全部樣品添加包含CD3-PC7、CRTH2-FITC及CD203c-PE之抗體混合物20 μL，於37℃下培養15分鐘。添加反應停止液100 μL及溶血固定液2 mL，於室溫下反應10分鐘。離心(200×g，5分鐘)後，去除上清液，添加磷酸緩衝液(PBS)3 mL，再次進行離心。去除上清液後，使細胞懸浮於添加有0.1%甲醛之PBS中，利用流式細胞儀(FACScanto，BD Biosciences)進行測定。針對所獲得之資料，以CD3-PC7陰性且CRTH2-FITC陽性為指標，篩選血球中之嗜鹼性粒細胞，對CD203c之表現強度進行分析。資料示出本發明蛋白質溶液刺激樣品中之CD203c陽性嗜鹼性粒細胞比率(%)以及各陰性對照樣品中之CD203c陽性嗜鹼性粒細胞比率(%)，並將相當於健康正常者之最高值0.8%之2倍即1.6以上之值判定為陽性。其結果，如圖3所示，於2例健康正常者中，2例均未出現添加重組蛋白質時CD203c表現增強之情況，另一方面，於杉木花粉症患者中，13例中有7例(54%)確認到CD203c之表現增強，其差顯著(p＜0.05，Welch's t檢驗(Welch's t test))。因此，顯示出杉木花粉症患者具有與本發明之重組蛋白質高頻度結合之IgE，進而，顯示出本發明之重組蛋白質具有過敏原活性。

圖1係利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對純化之重組杉木花粉蛋白質進行分析所得之圖。圖2係表示使用4名杉木花粉症患者(ImmunoCAP評分≧2)之末梢血液單核細胞對因添加純化重組蛋白質引起之增殖反應進行測定所得之結果之圖。圖3係表示流式細胞儀之結果之圖，該流式細胞儀顯示：13名杉木花粉症患者(ImmunoCAP評分≧2)之末梢血液中之嗜鹼性粒細胞藉由純化重組蛋白質而活化，CD203c之表現增強，另一方面，於2名健康正常者(ImmunoCAP評分＜2)之末梢血液中之嗜鹼性粒細胞中，CD203c之表現未變化。

<110> 日商大鵬藥品工業股份有限公司(Taiho Pharmaceutical Co.,Ltd.)

<120> 新穎杉木花粉過敏原

<130> TH0107

<150> JP 2016-122318

<151> 2016-6-21

<160> 5

<170> PatentIn3.5版本

<210> 1

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組杉木花粉蛋白質

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1659)

<400> 1

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成寡DNA

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成寡DNA

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成寡DNA

<400> 5

Claims

一種杉木花粉蛋白質，其選自以下之(a)～(c)， (a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質， (b)包含於序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質， (c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質。
一種聚核苷酸，其編碼選自以下之(a)～(c)之杉木花粉蛋白質， (a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質， (b)包含於序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質， (c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列且具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質。
一種聚核苷酸，其選自以下之(d)～(f)， (d)包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸， (e)和包含與序列編號1所示之鹼基序列互補的鹼基序列之聚核苷酸於嚴格條件下雜交並編碼具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質之聚核苷酸， (f)包含與序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列且編碼具有杉木花粉過敏原活性之蛋白質之聚核苷酸。
一種起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑，其以如請求項1之杉木花粉蛋白質作為有效成分。
一種起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷試劑，其以如請求項1之杉木花粉蛋白質作為有效成分。
一種抗體，其係針對如請求項1之杉木花粉蛋白質。
如請求項6之針對杉木花粉蛋白質之抗體，其為單株抗體。
一種如請求項1之杉木花粉蛋白質之用途，其用以製造起因於杉木花粉之過敏疾病之預防或治療劑。
一種如請求項1之杉木花粉蛋白質之用途，其用以製造起因於杉木花粉之過敏疾病之診斷試劑。
如請求項1之杉木花粉蛋白質，其用以預防或治療起因於杉木花粉之過敏疾病。
如請求項1之杉木花粉蛋白質，其用以診斷起因於杉木花粉之過敏疾病。