WO2023058337A1 - 新規ビャクシン花粉タンパク質 - Google Patents

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WO2023058337A1
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juniper
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juniper pollen
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悠喜 田中
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Definitions

  • the present disclosure relates to a novel protein derived from juniper pollen and uses of the protein.
  • Hay fever is an allergic disease that develops by inhaling pollen scattered in the air and presents with symptoms such as allergic conjunctivitis such as itching and pain in the eyes, rhinitis, skin inflammation, and asthma. Plants of the Cupressaceae family are the main cause of pollinosis worldwide, and in Japan, pollinosis caused by cedar of the genus Sugi and cypress of the genus Hinoki is well known (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 Juniperus ashei, which belongs to the genus Juniperus of the Cupressaceae family, is the main cause of hay fever, and measures such as banning tree planting are being taken. Also in Japan, it has been reported that 26.5% of allergic patients are sensitized to juniper in areas where juniperus juniper (Juniperus rigida) is widely distributed. Therefore, pollinosis caused by juniper genus plants is suggested to be an allergen that should be emphasized like cedar and cypress (Non-Patent Document 3).
  • Antihistamines, steroidal anti-inflammatory drugs, anti-leukotriene drugs, degranulation inhibitors, Th2 cytokine inhibitors, etc. are used to treat these allergic diseases, but all are symptomatic.
  • allergen immunotherapies such as subcutaneous allergen immunotherapy (SCIT) and sublingual allergen immunotherapy (SLIT) have been developed one after another and have been approved under the Pharmaceutical Affairs Law.
  • SCIT subcutaneous allergen immunotherapy
  • SLIT sublingual allergen immunotherapy
  • Allergen immunotherapy is a therapeutic method that controls the immune response to allergens by administering small amounts of allergens into the body. At present, it is considered the only method that can completely cure allergic diseases, and is a treatment option for hay fever. is increasing.
  • Non-Patent Documents 7 and 8 Non-Patent Documents 7 and 8
  • allergen immunotherapy uses pollen-specific allergens that cause allergies. It is considered essential to use Therefore, there is a high medical need for novel Juniperus allergen immunotherapy using allergens specific to the Juniperus genus.
  • the present disclosure relates to providing a novel juniper pollen protein, and diagnostic, preventive, and therapeutic agents for allergic diseases caused by juniper pollen using the same.
  • the present disclosure relates to the discovery of a novel protein from juniper pollen crude antigen that exhibits high reactivity with lymphocytes derived from Japanese cypress pollinosis patients and serum IgE, and diagnostic and prophylactic agents for allergic diseases caused by juniper pollen. , or for being useful as a therapeutic agent.
  • (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and juniper Protein having pollen allergen activity
  • (c) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having Juniperus pollen allergen activity
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and juniper Protein having pollen allergen activity (c) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having Juniperus pollen allergen activity [3] A polynucleotide selected from (d) to (f) below.
  • [5] A transformant containing the recombinant vector described in [4].
  • [6] A method for producing a protein, which comprises culturing the transformant according to [5] and collecting juniper pollen protein from the resulting culture.
  • a prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases caused by juniper pollen comprising the juniper pollen protein of [1] as an active ingredient.
  • a prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases caused by cedar pollen and/or cypress pollen containing the juniper pollen protein of [1] as an active ingredient.
  • a diagnostic agent for allergic diseases caused by juniper pollen containing the juniper pollen protein of [1] as an active ingredient.
  • a diagnostic kit for allergic diseases caused by juniper pollen comprising the juniper pollen protein of [1] as an active ingredient.
  • a method for detecting an allergic disease caused by juniper pollen which comprises reacting the protein of juniper pollen according to [1] with a sample.
  • a diagnostic agent for allergic diseases caused by cedar pollen and/or cypress pollen containing the juniper pollen protein according to [1] as an active ingredient.
  • juniper pollen protein according to [1] for producing a prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases caused by juniper pollen.
  • the juniper pollen protein of [1] for preventing or treating allergic diseases caused by juniper pollen.
  • a method for preventing or treating an allergic disease caused by juniper pollen which comprises administering the protein of juniper pollen according to [1] to a patient.
  • a method for diagnosing an allergic disease caused by juniper pollen which comprises administering the protein of juniper pollen according to [1] to a patient.
  • one aspect of the present disclosure includes the following.
  • a kit for detecting juniper pollen protein comprising the antibody of [13] or [14] as an active ingredient.
  • a method for detecting juniper pollen protein which comprises reacting the antibody of [13] or [14] with juniper pollen protein to detect the juniper pollen protein.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure can be used as a diagnostic agent, preventive agent, therapeutic agent, etc. for allergic diseases caused by juniper pollen.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measuring the proliferative response of the cells by addition of purified juniper protein using peripheral blood mononuclear cells of two subjects having tree allergy symptoms (hay fever symptoms) in spring and one healthy subject.
  • FIG. 4 shows the results of flow cytometry; Basophils in the peripheral blood of 9 subjects with tree allergy symptoms in spring were activated by the purified recombinant protein, and CD203c expression was enhanced. On the other hand, it was shown that the expression of CD203c did not change in basophils in the peripheral blood of two healthy subjects.
  • Juniperus pollen protein of the present disclosure is a protein selected from (a) to (c) below.
  • (a) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and juniper Protein having pollen allergen activity
  • (c) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having Juniperus pollen allergen activity
  • the juniper pollen protein of the present disclosure includes a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, as long as it has juniper pollen allergen activity ( (b) above is included.
  • the juniper pollen protein having such an amino acid sequence includes, for example, an isoform of the juniper pollen protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • "one or several amino acids" to be deleted, substituted or added means, for example, 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids.
  • the above addition or deletion includes addition or deletion of one to several amino acids to both ends.
  • Specific examples of isoforms include, for example, a deletion of 4 residues at the C-terminus.
  • junction pollen allergen activity refers to the activity of binding to IgE on mast cells and causing immediate allergic reactions in atopic humans (De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol. , 146:177-189, 2008) as well as activity that simply binds to IgE in serum.
  • activity to bind to IgE can be measured by the method described in International Publication No. 2012/105541 pamphlet and the like.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure has 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 when the corresponding sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are properly aligned, as long as it has juniper pollen allergen activity.
  • a protein consisting of a protein having the identity of ((c) above) is included.
  • the identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 is preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information
  • juniper pollen proteins of the present disclosure may form fusions with sequences useful for purification such as multiple histidine residues, proteins for ensuring stability during recombinant production, and the like.
  • juniper pollen protein of the present disclosure can be obtained by an artificial process.
  • juniper pollen proteins of the present disclosure can be obtained as recombinant proteins.
  • juniper pollen proteins of the present disclosure can be obtained by artificially extracting, isolating and purifying pollen.
  • Known plants belonging to the Juniperus genus include mountain cedar (Juniperus ashei), Japanese juniper (Juniperus chinensis), common juniper (Juniperus communis), and Japanese juniper (Juniperus conferta), but are not limited to these.
  • Polynucleotide encoding juniper pollen protein encodes the above juniper pollen protein, preferably (d) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, (e) SEQ ID NO: (f) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by 1 and that encodes a protein having juniper pollen allergen activity, (f) represented by SEQ ID NO: 1
  • Polynucleotides comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence and encoding a protein having juniper pollen allergen activity can be mentioned.
  • the polynucleotides of (e) and (f) include variants of the polynucleotide of (d). Such variants include naturally occurring allelic variants as well as non-naturally occurring variants that can be generated using mutagenesis techniques well known in the art.
  • Polynucleotides of the present disclosure include not only double-stranded DNA, but also various single-stranded DNAs and RNAs such as the sense strand and antisense strand that constitute it. Antisense strands can be used as probes and the like.
  • DNA includes isolated cDNAs, such as those obtained by cloning or chemical synthesis techniques, or a combination thereof. DNA also includes genomic DNA.
  • nucleotide sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences) are added. may be
  • stringent conditions include, for example, the conditions described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition, J. Sambrook et.al, 2012). That is, in a solution containing 6 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardt and 100 mg / mL herring sperm DNA Examples include conditions such as incubating with the probe at a constant temperature of 65° C. for 8 to 16 hours for hybridization.
  • the identity with the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • identity of the base sequence for example, BLAST can be used, and a method of calculating optional parameters with default values can be applied.
  • the 86th g of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with t
  • the 154th g is replaced with c
  • the 242nd g is replaced with c
  • the 265th a is replaced with g.
  • a polynucleotide encoding a juniper pollen protein of the present disclosure can be cloned from juniper pollen, and cloning methods include known means such as the shotgun method and the PCR method. and a method using
  • a probe that specifically hybridizes with a portion of the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present disclosure may be prepared, and a genomic DNA library or cDNA library may be screened using the probe.
  • Such probes may be of any sequence and length as long as they specifically hybridize to at least a portion of the polynucleotides of the present disclosure or their complementary strands.
  • Another example is a method of artificially synthesizing a polynucleotide. (Kosuri S et. al., Nature Methods 11, 499-507, 2014)
  • Polynucleotides of the present disclosure can also be obtained by using appropriate principles to obtain sequences that hybridize to polynucleotides containing part or all of the polynucleotides of the present disclosure. Examples include a PCR method using a polynucleotide containing a portion of the polynucleotide of the present disclosure as a primer, and a method of using a polynucleotide containing a portion of the polynucleotide of the present disclosure as a probe.
  • primers are prepared from the 5′ and 3′ sequences of the polynucleotide of the present disclosure (or their complementary sequences), and genomic DNA ( or cDNA) or the like as a template to amplify the DNA region sandwiched between the two primers, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide can be obtained.
  • the polynucleotide provided in the present disclosure can also be produced by modifying a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 by methods such as deliberate or random mutagenesis.
  • mutation planning when introducing mutations intentionally can be carried out, for example, by taking into account characteristic sequences on the polynucleotide sequence.
  • Methods for randomly introducing mutations include, for example, PCR and mutagen treatment.
  • a method for systematically introducing mutations includes site-directed mutagenesis, more specifically, for example, using Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit (Takara Bio). can be done.
  • a recombinant PCR method (PCR protocols, Academic Press, New York, 1990) can also be used.
  • juniper pollen protein of the present disclosure can be obtained by separating and purifying juniper pollen.
  • the separation and purification method is not particularly limited, but for example, juniper pollen extract may be separated and purified using conventionally known techniques such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • Pollen sources include, but are not limited to, mountain cedar (Juniperus ashei), Japanese juniper (Juniperus chinensis), common juniper (Juniperus communis), common juniper (Juniperus conferta), and the like. Mountain cedar (Juniperus ashei) is preferred.
  • a recombinant vector prepared by incorporating the polynucleotide of the present disclosure into an appropriate vector can be introduced into host cells to express juniper pollen proteins intracellularly or extracellularly and collect them. .
  • the vector into which the polynucleotide of the present disclosure is inserted is not particularly limited as long as it is replicable in the host described above, and can be appropriately determined according to the type of host into which it is introduced, the method of introduction, and the like.
  • Examples include plasmid DNA, phage DNA, virus vectors and the like. Widely used and easily available vector DNAs are used for construction of expression vectors. Examples include pUC19 (Takara Bio), pTV118N (Takara Bio), pMAMneo (Clontech), pGEX (GE Healthcare), pET160 (Invitrogen), pDEST (Invitrogen), pIEx (Merck Millipore), pBacPAK (Clontech), etc.
  • viral vectors examples include baculovirus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors such as human immunodeficiency virus (HIV), adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors (AAV vectors), herpes virus, vaccinia virus, Examples include DNA viruses and RNA viruses such as poxvirus, poliovirus, Simbis virus, Sendai virus, and simian virus-40 (SV-40).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • AAV vectors adeno-associated virus vectors
  • herpes virus examples include DNA viruses and RNA viruses such as poxvirus, poliovirus, Simbis virus, Sendai virus, and simian virus-40 (SV-40).
  • the host is not particularly limited as long as it is a living cell that can be transformed. Examples include animal cells, plants or plant-derived cells.
  • the host can be transformed with the recombinant vector using the protoplast method, the competent cell method, the electroporation method, or the like.
  • the resulting transformant may be cultured under appropriate conditions using a medium containing assimilable carbon sources, nitrogen sources, metal salts, vitamins and the like.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure can be obtained by collecting and purifying the protein from the culture medium thus obtained (Sambroock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012). For example, when Escherichia coli is used as the host, the method described in pET System Manual, 10th edition (Novagen) and the like can be used.
  • juniper pollen protein of the present disclosure serves as a preventive or therapeutic agent for allergic diseases caused by juniper pollen, and is administered to a human (patient) in need thereof. It can be used to prevent or treat allergic diseases caused by pollen.
  • Allergic diseases caused by juniper pollen include all allergic diseases caused by specific antigens of juniper pollen. dermatitis and the like.
  • a prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases caused by juniper pollen can be used, for example, as a desensitization therapeutic agent for allergic diseases caused by juniper pollen.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure is reported as a major pollen allergen related to the onset of cedar pollinosis and cypress pollinosis as a result of amino acid homology analysis using GENETYX Ver.12 Cry j 1, Cry j 2 , Cryj 3, Chao 1 and Chao 2, a protein having an amino acid sequence different from that of conventionally known Cryj 1, Cryj 2, Cryj 3, Chao 1 and Chao 2 become. Therefore, by combining the juniper pollen protein of the present disclosure with the known protein described above, a more effective desensitization treatment becomes possible. In addition, since the juniper pollen protein of the present disclosure is different from known proteins, it becomes possible to newly detect allergic diseases caused by juniper pollen that cannot be detected with known proteins.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure showed a positive reaction in all subjects with tree allergy symptoms in spring as a result of BAT (basophil activation test) that measures the phenomenon induced in basophil cells by IgE binding. (Example 2). This is clearly higher than the IgE binding of Juna 1 (71.4%, Non-Patent Document 2) and Juna 3 (42.9%, Non-Patent Document 6), which are known pollen proteins. Regarding Juna2, it has been reported that the IgE binding positive rate of its homolog Chao2 is 82.5% (Allergology International, 70 [2021]:281-290). Therefore, the prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases caused by juniper pollen using the juniper pollen protein of the present disclosure has applicability to a wider range of patients and can be said to be a useful means capable of solving the current problems.
  • allergen identification has traditionally been based on the detection of specific IgE on total extracts containing allergenic and non-allergenic components extracted from allergen sources, but in recent years patients have become sensitized individuals.
  • Molecular or component-resolved diagnostics which detects IgE antibodies against molecules (allergen components) of, that is, analyzes and diagnoses allergens at the causative protein level, has come to be performed.
  • novel allergenic protein of the present disclosure it is not necessary to consider the effect compared with conventional allergenic proteins, and if it has an allergenic activity that is clearly different from that of conventional allergenic proteins, it can be used like CRD. It can be said that it can contribute to the diagnosis of various allergic diseases and the treatment based thereon, and its industrial utility value will be high.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure is used as it is, or dried and powdered, or if necessary, general Adjuvants and various additives such as stabilizers, excipients, solubilizers, emulsifiers, buffers, soothing agents, preservatives, coloring agents, etc. preferably.
  • powdery purified Juniperus pollen protein can be dissolved in phenol-added physiological saline and used as a stock solution of antigen for desensitization treatment.
  • prophylactic or therapeutic agents for allergic diseases caused by juniper pollen of the present disclosure are administered via normal administration routes, for example, oral or parenteral (transdermal, transmucosal, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, etc.) topical or Systemic administration methods can be used.
  • Dosage forms applicable to these administration methods include, for example, troches, sublingual tablets, injections, eye drops, intranasal sprays, poultices, creams, lotions and the like.
  • the method of diagnosing an allergic disease caused by juniper pollen of the present disclosure includes a normal administration route, for example, oral or parenteral (transdermal, transmucosal, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, etc.) local or systemic It can be performed according to the administration method.
  • Dosage forms applicable to these administration methods include, for example, troches, sublingual tablets, injections, eye drops, intranasal sprays, poultices, creams, lotions and the like.
  • the dosage and administration frequency of the preventive or therapeutic agent for allergic diseases caused by juniper pollen of the present disclosure vary depending on the route of administration, symptoms, etc., but for example, the range is about 0.1 to 1000 ⁇ g per adult. , and administered once to several times a week.
  • Juniper pollen is also known as an allergen for hay fever caused by Mountain Cedar pollen, and is a cypress family plant that causes hay fever in regions such as France, Italy, and Australia.
  • the present disclosure can be expected to be effective in treating hay fever caused not only by juniper pollen, cedar pollen and cypress pollen, but also by Mountain Cedar pollen.
  • Japanese cedar pollinosis patients have a high positive rate of juniper antibody, and it is known that the positive rate of juniper antibody is particularly high in Japanese cypress pollinosis patients.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present disclosure can be used to treat Japanese cedar pollinosis and cypress pollinosis, and effects can be expected.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure serves as a diagnostic agent for allergic disease caused by juniper pollen, and can be used for diagnosing allergic disease caused by juniper pollen.
  • a diagnostic agent for allergic diseases caused by juniper pollen is used, for example, as a skin reaction diagnosis for allergic diseases caused by juniper pollen, that is, as an intradermal test or prick test reagent.
  • diagnosis using patient serum or plasma is possible by preparing a specific IgE antibody test reagent.
  • the juniper pollen protein of the present disclosure obtained by the above method is, for example, dried and powdered, which is dissolved in a physiological saline containing phenol or glycerin, diluted and used. .
  • the IgE antibody in the patient specimen is bound to the juniper pollen protein of the present disclosure in the aqueous phase or on the solid phase, Fluoro enzyme immunoassay, Chemiluminescence enzyme immunoassay, enzyme immunoassay, etc. Based on the principle Detection methods include, but are not limited to.
  • the present disclosure provides a skin reaction detection method characterized by reacting a juniper pollen protein with a sample.
  • the present disclosure also provides a skin reaction detection kit comprising juniper pollen protein.
  • "reacting” includes any aspect of contacting the juniper pollen protein of the present disclosure with a patient sample and binding the IgE antibody in the sample to the juniper pollen protein of the present disclosure.
  • the protein can be combined with other solvents and solutes to form a composition.
  • distilled water, pH buffer reagents, surfactants and the like can be combined.
  • Juniperus pollen protein can also be used after being labeled with an enzyme or biotin.
  • HRP horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase malate dehydratase
  • ⁇ -glucosidase ⁇ -galactosidase
  • colloidal gold and the like can be used as labeling enzymes.
  • the solvent, solute, enzyme labeling reagent, substrate solution, reaction stop solution, washing solution, instructions for use, etc. can be included.
  • Antibodies to Juniper Pollen Proteins are antibodies capable of specifically binding junixin pollen proteins of the present disclosure.
  • the above antibody means immunoglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and antigen-binding fragments thereof (Fab fragment, F(ab')2 fragment, Fc fragment, scFv, etc.), for example, polyclonal antibody , monoclonal antibodies, single-chain antibodies, anti-idiotypic antibodies, humanized antibodies, and the like, but are not limited to these.
  • the above antibodies can be produced using various known methods, and the production method is not particularly limited.
  • a non-human mammal is immunized with a juniper pollen protein or a partial peptide thereof, and antibody-producing cells (eg, B cells) are collected from the immunized animal.
  • antibody-producing cells eg, B cells
  • myeloma cells are fused to produce a hybridoma (fused cell line).
  • Antibodies produced from this hybridoma are collected to obtain the desired monoclonal antibody.
  • the basic amino acid sequence for synthesizing the antigenic peptide is a partial sequence of the full-length amino acid sequence of the juniper pollen protein, and an arbitrarily continuous amino acid sequence with a length of about 10 to 50 is selected from the amino acid sequence.
  • a partial peptide can be synthesized by methods known to those skilled in the art, such as the Fmoc method and the tBoc method.
  • the type of non-human mammal to be immunized is not particularly limited, and examples thereof include mice, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, goats, etc. Mice are preferred.
  • the total dose of antigen per animal is 10-150 ⁇ g.
  • an adjuvant and an antigen solution are generally mixed, and examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, or subcutaneous injection into the footpad.
  • the immunization interval is not particularly limited, and 1 to 10 immunizations are performed at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 3 weeks.
  • Antibody-producing cells are prepared from spleen cells, etc., or regional lymph nodes, etc. of immunized non-human mammals.
  • Cell fusion is a work performed to fuse the antibody-producing cells and myeloma cells (myeloma cells) described above to produce cells (hybridoma) that continue to proliferate semipermanently while producing antibodies.
  • myeloma cells myeloma cells
  • Those skilled in the art can fuse antibody-producing cells and myeloma cells using known cell fusion methods.
  • hybridomas producing the desired antibody are selected from the cells after the cell fusion treatment. 10-14 days after cell fusion, cells selected in HAT medium form colonies. The culture supernatant of each well of the colony-positive culture plate is collected, and the antibody titer against juniper pollen protein is confirmed by ELISA or the like.
  • the cells in the final selected well are cloned to make them into single cells.
  • cloning for example, after appropriately diluting the cell suspension with RPMI1640 medium containing 10 to 20% FCS, cells are seeded into each well of a 96-well culture plate so that one cell can fit into each well. After seeding the cells, collect the culture supernatant of the colony-positive wells. Furthermore, the cells in the selected wells are increased to some extent to establish a hybridoma strain. Cloning may be performed several times as needed.
  • the epitope (antigenic determinant) of the antibody against the juniper pollen protein of the present disclosure is not limited as long as it is at least a part of the juniper pollen protein that is the antigen.
  • the antibody against juniper pollen protein is not limited to the monoclonal antibody itself against juniper pollen protein produced by the above hybridoma, as long as it binds to the epitope recognized by the monoclonal antibody produced by these hybridomas, included in the antibodies of the present disclosure.
  • the term "epitope" refers to an epitope recognized by a monoclonal antibody produced by the hybridoma.
  • the monoclonal antibodies of the present disclosure can also be genetically engineered antibodies or antigen-binding fragments that are prepared and expressed by recombinant means.
  • the antibodies of this disclosure can be chimeric, humanized, or fully human.
  • Recombinant antibodies of this disclosure can be produced by recombinant expression of heavy and light chains.
  • a recombinant expression vector having nucleic acids encoding antibody heavy and light chains is introduced into a host cell, and the host cell into which the vector has been introduced is cultured. Then, the antibody of interest is recovered from the culture of the host cell.
  • a recombinant expression vector having nucleic acids encoding antibody heavy and light chains is introduced into a host cell, and the host cell into which the vector has been introduced is cultured. Then, the antibody of interest is recovered from the culture of the host cell.
  • standard recombinant methods in the art Standard recombinant methods in the art (Sambroock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012) can be adopted.
  • a non-human mammal is immunized with a juniper pollen protein or a partial peptide thereof, blood is collected after 3 to 4 immunizations, and an ELISA method or the like is performed. Measure the antibody titer. After confirming that the antibody titer has sufficiently increased, the whole blood is collected and the antibody is separated and purified by a conventional method.
  • the above antibodies can be used to identify organisms expressing the juniper pollen protein of the present disclosure, or their tissues or cells. For example, it can be used to measure the presence or absence of juniper pollen protein in the atmosphere, indoor space, or human mucosa. The measurement can be performed by a known immunological method, such as ELISA.
  • Juniperus pollen protein is an allergen in Japanese cypress pollinosis, so the antibody of the present disclosure is allowed to react with a sample, and the juniperus pollen protein in the sample is measured to detect the juniperus pollen protein. Accordingly, the present disclosure provides a method for detecting a juniper pollen protein, which comprises reacting the antibody of the present disclosure or a fragment thereof with the juniper pollen protein to detect the juniper pollen protein. Also, in the present disclosure, antibodies against juniper pollen proteins or fragments thereof can be used as reagents or kits for detecting juniper pollen proteins. The kit in the present disclosure is applicable in the same way as juniper pollen protein is used as a kit.
  • Example 1 Purification of Juniperus protein Add 200 mL of extraction buffer (25 mM Tris buffer, pH 8.0) to 5 g of juniper pollen (Juniperus ashei), crush with an ultrasonic generator (UD-201, TOMY), and centrifuge (10,000 x g). , 10 min) and the supernatant was collected. This supernatant was added to Vivapure Q Maxi H (Sartorius) equilibrated with 25 mM Tris buffer (pH 8.0), and the non-adsorbed fraction was collected.
  • extraction buffer 25 mM Tris buffer, pH 8.0
  • UD-201, TOMY ultrasonic generator
  • Fig. 1 shows the results of electrophoresis of the purified juniper protein by SDS-PAGE.
  • Example 2 Confirmation of allergen activity of purified juniper protein (i) lymphocyte proliferation response to purified juniper protein
  • the cells were suspended in RPMI-1640 medium containing 10% inactivated autologous plasma at 1 ⁇ 10 6 cells/mL. 180 ⁇ L of the prepared cell suspension and 20 ⁇ L of purified juniper protein solution (concentration 100 ⁇ g/ml) were seeded in a 96-well plate (2 ⁇ 10 5 cells/well). After culturing for 3 days at 37°C and 5% CO2, 3H-thymidine was added, and cell proliferation was evaluated by measuring radioactivity uptake up to 16 hours later.
  • Fig. 2 shows the results of calculation of a value obtained by dividing the amount of 3H-thymidine uptake with the addition of purified juniper protein by the amount of uptake without addition as a stimulation index.
  • a stimulation index of 1.8 or higher is considered a positive criterion (Shigeyuki Uchida et al., Liver Vol. 30, No. 4, 439-443, 1989). According to this criterion, 2 out of 2 subjects with allergic symptoms (100%) were determined to be positive. On the other hand, healthy subjects were negative. From the above results, it was shown that people with tree allergy symptoms in spring are frequently sensitized to the protein of the present disclosure at the T cell level.
  • 20 ⁇ L of the purified juniper protein solution of the present disclosure was added to 100 ⁇ L of heparinized whole blood to a final concentration of 100 ng/mL, and 20 ⁇ L of PBS (-) was added to the negative control sample. All samples were then added with 20 ⁇ L of antibody cocktail containing CD3-PC7, CRTH2-FITC and CD203c-PE and incubated at 37° C. for 15 minutes. 100 ⁇ L of reaction stop solution and 2 mL of hemolyzed fixative were added, and reacted at room temperature for 10 minutes. After centrifugation (200 x g, 5 minutes), the supernatant was removed, 3 mL of phosphate buffered saline (PBS) was added, and centrifugation was performed again.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells were suspended in 0.1% formaldehyde-added PBS and measured using a flow cytometer (FACSVerse, BD Biosciences). Based on the obtained data, basophils in the blood cells were selected by using CD3-PC7 negative and CRTH2-FITC positive as an index, and the expression intensity of CD203c was analyzed.
  • the data show the percentage of CD203c-positive basophils in the protein solution-stimulated samples of the present disclosure minus the percentage of CD203c-positive basophils in each negative control sample, with a maximum value of 0.75% in healthy subjects. A value of 1.5 or more, which is twice the value, was determined to be positive.
  • Example 3 Determination of Partial Internal Amino Acid Sequence of Purified Juniperus Protein
  • a peptide mixture obtained by trypsin digestion of the purified juniperus protein was analyzed. After the purified juniper protein was subjected to SDS-PAGE, the protein band to be analyzed was excised from the SDS gel. A peptide mixture was obtained from the excised gel piece through tryptic hydrolysis.
  • the peptide mixture was analyzed by LC-MS/MS, LPLLAR [partial amino acid sequence 1 (SEQ ID NO: 3)], WIVDETTGL [partial amino acid sequence 2 (SEQ ID NO: 4)], ATVGETFAR [partial amino acid sequence 3 (SEQ ID NO: 5 )], YFNPNTWVK [partial amino acid sequence 4 (SEQ ID NO: 6)], and IRNPDFIAR [partial amino acid sequence 5 (SEQ ID NO: 7)] were obtained.
  • Example 4 Determination of the Nucleotide Sequence of Purified Juniperus Protein ⁇ Extraction of Juniperus total RNA>
  • 25 mL of Plant RNA Isolation Reagent Invitrogen
  • the upper layer was decanted and filtered through a mesh with a mesh size of 100 ⁇ m.
  • 1/5 volume of 5M NaCl and 3/5 volume of chloroform were added to the recovered filtrate.
  • RNA pellet was washed with 10 mL of 75% ethanol. After further centrifugation at 4°C (2600 xg, 5 minutes), the supernatant was removed, the total RNA was dried at room temperature, and dissolved in 200 ⁇ L of RNase free water.
  • RNeasy Mini kit Qiagen
  • RNA was synthesized from the resulting cleaned-up total RNA using Superscript IV First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). 2 ⁇ g of total RNA was dissolved in 11 ⁇ L of purified water, 1 ⁇ L of 50 ⁇ M oligo(dT)20 and 1 ⁇ L of 10 mM dNTP were added, and incubated at 65° C. for 5 minutes. After cooling the sample on ice, 4 ⁇ L of 5 x SSIV Buffer, 1 ⁇ L of 100 mM DTT, 1 ⁇ L of Ribonuclease Inhibitor, and 1 ⁇ L of SuperScript IV Reverse Transcriptase were added and mixed.
  • PCR was performed by KOD Fx Neo (TOYOBO) using juniper cDNA as a template, Primer 1 (ATGACGATGGCGGCGCTA: SEQ ID NO: 8) as a sense primer, and Primer 2 (TCAAAGTTGATGCAACAATTGTTTGTTG: SEQ ID NO: 9) as an antisense primer.
  • PCR reaction solution composition 5 ⁇ PrimeSTAR GXL Buffer 10 ⁇ L, dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 ⁇ L, cDNA 0.5 ⁇ L, Primer 10 mM each 1.5 ⁇ L, PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 ⁇ l, sterilized purified water up to 50 ⁇ l Cycle conditions: 35 cycles of 98°C for 10 sec and 68°C for 2 min
  • the PCR product was purified with Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
  • the purified PCR product was incorporated into the pCR 2.1-TOPO TA Vector using the TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Thermo Fischer) kit. Sequence information was obtained by analyzing the nucleotide sequence of the obtained vector.
  • 5'/3' RACE kit 2nd generation (Roche) was used to construct juniper cDNA with an anchor sequence added to the 3' end.
  • Nested PCR was performed with KOD Fx neo using two-step primers Primer 3 (AGTGGATGTGTTTAGATGGG: SEQ ID NO: 10) and Primer 4 (AGCAGTGGTTTAAAGTCATAA: SEQ ID NO: 11).
  • the PCR product was purified with Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
  • the purified PCR product was incorporated into the pCR 2.1-TOPO TA Vector using the TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Thermo Fischer) kit.
  • the nucleotide sequence of the resulting vector was analyzed to obtain the 3' terminal sequence.
  • the cDNA encoding the juniper protein of the present disclosure was encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:2) contained partial amino acid sequences 1-5, indicating that the disclosed protein was the protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO:1.
  • SEQ ID NOs: 1-7 synthetic peptides
  • SEQ ID NOs: 8-11 synthetic DNA

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Abstract

本開示は、以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるビャクシン花粉タンパク質に関する。　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質

Description

新規ビャクシン花粉タンパク質
　本開示は、ビャクシン花粉に由来する新規なタンパク質、及び該タンパク質の利用に関する。
　花粉症は、空中に飛散している花粉を吸入することにより発症し、眼のかゆみや痛み等のアレルギー性結膜炎、鼻炎、皮膚の炎症あるいは喘息等の症状を呈するアレルギー疾患である。ヒノキ科の植物は世界中で花粉症の主原因となっており、日本においては、スギ属のスギ、ヒノキ属のヒノキによる花粉症が良く知られている（非特許文献１）。
　一方、アメリカにおいては、ヒノキ科ビャクシン属であるJuniperus asheiが花粉症の主原因となっており、植樹の禁止等の対策が行われている（非特許文献２）。また、日本においてもビャクシン属のネズ（Juniperus rigida）が多く分布している地域において、アレルギー患者の26.5 %がネズに感作されていることが報告されている。そのため、ビャクシン属植物による花粉症は、スギ、ヒノキ同様重視するべきアレルゲンであることが示唆されている（非特許文献３）。
　これらアレルギー疾患の治療には、抗ヒスタミン薬、ステロイド系抗炎症薬、抗ロイコトリエン薬、脱顆粒阻害薬、Th2サイトカイン阻害薬等が用いられるが、いずれも対症療法に留まる。しかしながら近年、皮下アレルゲン免疫療法（SCIT）や、舌下アレルゲン免疫療法（SLIT）をはじめとするアレルゲン免疫療法が相次いで開発され、薬事承認されている。アレルゲン免疫療法は、アレルゲンを少量ずつ体内に投与することにより、アレルゲンに対する免疫応答を制御する治療法であり、現時点でアレルギー疾患を根治可能な唯一の方法と考えられており、花粉症の治療選択肢が増えてきている。
　アレルゲン免疫療法の開発においては、原因となるアレルゲンに関する研究と理解が欠かせない。アメリカにおいて、 Juniperus asheiの花粉においては、Jun a 1、Jun a 2、Jun a 3と呼ばれる抗原性の高いアレルゲンが報告され（非特許文献４、５、6）、既にクローニングされている。しかしながら、Juniperus asheiアレルゲンを用いたSCIT、SLIT薬は実用化されていないのが現状である。ビャクシン属花粉症において、有効性の高いアレルゲン免疫療法を実現するためには、更なる新規アレルゲンタンパク質を用いる必要がある。
また、ヒノキ科の花粉に含まれる抗原には交叉反応性が報告されている。しかしながら、スギ花粉に対するSCITやSLITはヒノキ花粉症に対して奏功しない場合が多いことが報告されており（非特許文献7、8）、アレルゲン免疫療法においてはアレルギーの原因となる花粉特有のアレルゲンを用いることが必須であると考えられる。そのためビャクシン属固有のアレルゲンを用いた新規ビャクシン属アレルゲン免疫療法の医療ニーズは高い。
Gabriella Di Felice, et al., Int Arch Allergy Immunol., 126: 280-289, 2001 Midoro-Horiuti T, et al., J Allergy Clin Immunol., 104:608-612, 1999 岡 鐵雄、アレルギー　vol 43, No 2-2, 301, 1994 Midoro-Horiuti T, et al., J Allergy Clin Immunol., 104:613-617, 1999 Yokoyama, et al., Biochem Biophys Res Commun., 275.1:195-202, 2000 Midoro-Horiuti, et al., J. Immunol., 164, 2188-2192, 2000 湯田厚司、日鼻誌　54巻4号, 503-508，2015 湯田厚司、日耳鼻　120巻6号, 833-840，2017
　本開示は、新規なビャクシン花粉タンパク質、及びそれを用いたビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等を提供することに関する。
　本開示は、ビャクシン花粉粗抗原から、ヒノキ花粉症患者由来のリンパ球ならびに血清中ＩｇＥと高い反応性を示す新たなタンパク質の発見、およびこれがビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、又は治療薬として有用であることに関する。
　すなわち、本開示のある一態様は、以下が挙げられる。
[１]　以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるビャクシン花粉タンパク質。
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
[２]　以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるビャクシン花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
[３]　以下の（ｄ）～（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
　（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
　（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　（ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[４]　 [３]記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。 
[５]　 [４]記載の組換えベクターを含む形質転換体。
[６]　 [５]記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からビャクシン花粉タンパク質を採取することを特徴とする、当該タンパク質の製造方法。
[７]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
[８]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉及び／又はヒノキ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
[９]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。
[１０]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断用キット。
[１１]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質と検体とを反応させることを特徴とする、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の検出方法。
[１２]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉及び／又はヒノキ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。
[１３]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質に対する抗体。
[１４]　モノクローナル抗体である１３記載のビャクシン花粉タンパク質に対する抗体。 
[１５]　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を製造するための、[１]記載のビャクシン花粉タンパク質の使用。
[１６]　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、[１]記載のビャクシン花粉タンパク質の使用。
[１７]　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するための、[１]記載のビャクシン花粉タンパク質。
[１８]　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するための、[１]記載のビャクシン花粉タンパク質。
[１９]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療方法。
[２０]　 [１]記載のビャクシン花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断方法。
　また、本開示のある一態様は、以下が挙げられる。
[２１]　 [１３]又は [１４]記載の抗体を有効成分とするビャクシン花粉タンパク質の検出用キット。
[２２]　  [１３]又は [１４]記載の抗体とビャクシン花粉タンパク質とを反応させて、ビャクシン花粉タンパク質を検出することを特徴とする、ビャクシン花粉タンパク質の検出方法。
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等に利用することができる。
ビャクシン花粉の粗抽出物及び精製タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で解析した図である。 春季に樹木アレルギー症状（花粉症症状）を有する被験者2名、及び健常者1名の末梢血単核細胞を用いて、精製ビャクシンタンパク質添加による当該細胞の増殖反応を測定した結果を示す図である。 フローサイトメトリーの結果を示す図である。　春季に樹木アレルギー症状を有する被験者9名の末梢血中の好塩基球は、精製リコンビナントタンパク質により活性化され、CD203cの発現が増強した。これに対し、健常者２名の末梢血中の好塩基球では、CD203cの発現が変化しないことを示した。
ビャクシン花粉タンパク質
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるタンパク質である。
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　本開示のビャクシン花粉タンパク質には、ビャクシン花粉アレルゲン活性を有する限り、当該配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（上記（ｂ））が包含される。このようなアミノ酸配列からなるビャクシン花粉タンパク質としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するビャクシン花粉タンパク質のアイソフォーム等が挙げられる。
　ここで、欠失、置換又は付加される「１個又は数個のアミノ酸」とは、例えば１～１０個、さらに好ましくは１～５個のアミノ酸を意味する。また、上記の付加又は欠失には、両末端への１～数個のアミノ酸の付加や欠失が含まれる。
　アイソフォームの具体例としては、例えば、Ｃ末端の４残基の欠失が挙げられる。
　ここで、「ビャクシン花粉アレルゲン活性」とは、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、アトピー性のヒトに即時型アレルギー反応を引き起こす活性（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）のみならず、単に血清中のＩｇＥと結合する活性が包含される。なお、ＩｇＥと結合する活性は、国際公開第２０１２／１０５５４１パンフレット等に記載の手法で測定できる。
　また、本開示のビャクシン花粉タンパク質には、ビャクシン花粉アレルゲン活性を有する限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質からなるタンパク質（（上記（ｃ））が包含される。
　ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該アミノ酸配列の同一性は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）を使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
　また、本開示のビャクシン花粉タンパク質は、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保するためのタンパク質等との融合体を形成してもよい。
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、人為的工程により得ることができる。例えば本開示のビャクシン花粉タンパク質は、組み換えタンパク質として得ることができる。例えば本開示のビャクシン花粉タンパク質は、花粉から人為的に抽出、単離、精製することにより得ることができる。
　ビャクシン属に属する植物としては、マウンテンシダー（Juniperus ashei）、イブキ（Juniperus chinensis）、セイヨウネズ（Juniperus communis）、ハイネズ（Juniperus conferta）などが知られているが、これらに限定されるものではない。
ビャクシン花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本開示のポリヌクレオチドは、上記ビャクシン花粉タンパク質をコードするものであり、好適には、（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ｅ）及び（ｆ）のポリヌクレオチドには、（ｄ）のポリヌクレオチドの変異体が含まれる。当該変異体には、天然の対立遺伝子変異体や、当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る天然に存在しない変異体が包含される。
　本開示のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各種１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する。アンチセンス鎖は、プローブ等として利用可能である。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるような単離されたｃＤＮＡが含まれる。またＤＮＡには、ゲノムＤＮＡが含まれる。さらに、本開示にかかるポリヌクレオチドに対し、本開示にかかるポリペプチドをコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列が付加していてもよい。
　ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual (Fourth Edition, J.Sambrook et.al, 2012)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
　また、配列番号１で示される塩基配列との同一性は９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該塩基配列の同一性は、例えばBLASTを使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
　上記ポリヌクレオチドの変異体としては、例えば、配列番号１に示す塩基配列の８６番目のｇがｔに、１５４番目のｇがcに、２４２番目のｇがｃに、２６５番目のaがｇに、２７８番目のｃがaに、２８９番目のaがｇに、３４１番目のｃがｔに、４２４番目のｃがｔに、４５４番目のｇがaに、４６１番目のaがｇに、４６６番目のｃがｔに、４８４番目のｃがaに、４９０番目のaがｃに、６２５番目のｇがaに、６４５番目のｃがｔに、７２７番目のｔがｃに、７６３番目のaがｇに、７９９番目のaがｔに、９０７番目のｇがaに、９８８番目のｃがｔに、１１５４番目のｃがｔに、１１５６番目のｇがaに、１２５３番目のｇがaに、１４３９番目のaがｔに、それぞれ変異したものが挙げられ、これらの変異のうち少なくとも１つの変異を有する。
ビャクシン花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得
　本開示のビャクシン花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ビャクシン花粉からクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う方法が挙げられる。
　例えば、本開示のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、当該プローブを用いてゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行えばよい。このようなプローブとしては、本開示にかかるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いかなる配列および長さのものを用いてもよい。また人工的にポリヌクレオチドを合成する方法が挙げられる。(Kosuri S et. al., Nature Methods 11, 499-507, 2014)
　また、本開示のポリヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの一部又は全部を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより得ることもできる。例えば、上記の本開示のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うＰＣＲ法、上記の本開示のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が挙げられる。
　例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法は、本開示のポリヌクレオチドの５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等の増幅反応を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、当該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
　また、本開示で提供するポリヌクレオチドは、例えば、計画的な又はランダムな変異導入法等の方法により、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを改変することにより作製することもできる。
　ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、ポリヌクレオチド配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。また、ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット（タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ法(PCR protocols,Academic Press,New York,1990)を用いることもできる。
ビャクシン花粉タンパク質の製造
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、ビャクシン花粉から分離精製することにより得ることができる。分離精製方法は特に限定されるものではないが、例えば、ビャクシン花粉抽出液をゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等の従来公知の手法を用いて分離・精製すればよい。
　花粉源としては、マウンテンシダー（Juniperus ashei）、イブキ（Juniperus chinensis）、セイヨウネズ（Juniperus communis）、ハイネズ（Juniperus conferta）、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくはマウンテンシダー（Juniperus ashei）である。
　また、適当なベクターに本開示のポリヌクレオチドを組み込むことにより作製された組換えベクターを宿主細胞に導入して、ビャクシン花粉タンパク質を細胞内或いは細胞外に発現させて、採取することが可能である。
　本開示のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、上記の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜決定できる。
　例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスベクター等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤＮＡは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、pUC19（タカラバイオ）、pTV118N（タカラバイオ）、pMAMneo（クロンテック）、pGEX（GEヘルスケア）、pET160（Invitrogen）、pDEST（Invitrogen）、pIEx（メルクミリポア）、pBacPAK（クロンテック）等が挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス－４０（ＳＶ－４０）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が挙げられる。
　宿主としては、形質転換が可能な生細胞であれば特に限定されず、例えば大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母や糸状菌等の真菌類、Ｓｆ９細胞等の昆虫培養細胞、カイコ等の昆虫、動物細胞、植物又は植物由来細胞等が挙げられる。
　当該組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。斯くして得られた培養液から、一般的な方法によってタンパク質の採取、精製を行い、本開示のビャクシン花粉タンパク質を得ることができる（Sambroock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012）。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合は、pET System Manual, 10th edition (Novagen)に記載の方法等が挙げられる。
ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤となり、それを必要とするヒト（患者）に投与してビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するために使用できる。
　ここで、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患としては、ビャクシン花粉の特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患が挙げられ、具体的には、例えばアトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
　斯かるビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、例えば、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患に対する減感作療法剤として用いることができる。
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、GENETYX Ver.12を用いたアミノ酸相同性解析の結果、スギ花粉症及びヒノキ花粉症の発症に関連する主な花粉アレルゲンとして報告されているCry j 1、Cry j 2、Cry j 3、Cha o 1及びCha o 2とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、従来公知のCry j 1、Cry j 2、Cry j 3、Cha o 1及びCha o 2とは異なるアレルゲンとなる。従って、本開示のビャクシン花粉タンパク質は、上記既知のタンパク質と組み合わせることによって、より有用な減感作治療が可能となる。また、本開示のビャクシン花粉タンパク質は、既知のタンパク質と異なることから、既知タンパク質では検出されないビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患を新たに検出することが可能となる。
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、ＩｇＥ　Ｂｉｎｄｉｎｇにより好塩基球細胞に引き起こされる現象を測定するＢＡＴ（好塩基球活性化試験）の結果、春季に樹木アレルギー症状を有する全ての被験者において陽性反応を示した（実施例２）。これは、既知花粉タンパク質であるJun a 1 (71.4%、非特許文献2)、Jun a 3(42.9%、非特許文献6)のＩｇＥ　Ｂｉｎｄｉｎｇに比し明らかに高い。Jun a 2に関しては、そのホモログであるCha o 2のＩｇＥ　Ｂｉｎｄｉｎｇ陽性率が82.5%との報告がある (Allergology International, 70 [2021] :281-290)。従って、本開示のビャクシン花粉タンパク質を用いたビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、より広い患者への適用可能性を有し、現有課題を解決しうる有用な手段といえる。
　さらに、アレルゲン免疫療法において、その奏効率を高めるためには、個々の患者にとってアレルゲンとなり得るタンパク質を特定し、これを用いて感作することが有用である。アレルゲンの特定は、従来、アレルゲン原料から抽出されたアレルゲン性および非アレルゲン性成分を含む総抽出物に対する特定のＩｇＥの検出に基づいて行われていたが、近年、患者が感作されている個々の分子（アレルゲンコンポーネント）に対するＩｇＥ抗体を検出、すなわちアレルゲンを原因タンパク質レベルで解析及び診断する、分子又は成分分解診断（Component-resolved diagnostics（ＣＲＤ）)が行われるようになってきた。
　ＣＲＤによれば、個々のＩｇＥプロファイルとアレルゲンパターンにより、交差反応、リスク分子、及び予後的に有意な感作についてより詳細な検査が可能となり（Curr Allergy Asthma Rep (2013) 13:110-117）、個々の患者毎に最適なアレルゲン免疫療法を提供することが可能となる。従って、本開示の新規アレルゲン性タンパク質の提供は、より多くのアレルギー患者に対して有効なアレルゲン免疫療法を実現することができる点で大きな意義を有する。この場合、当該アレルゲン性タンパク質は、既存のアレルゲン性タンパク質に置き換わるものではなく、既存のアレルゲン性タンパク質と共に利用され、個々の患者に感作させるアレルゲンの選択余地の拡大に寄与するという位置づけを有する。よって、本開示の新規アレルゲン性タンパク質については、従来のアレルゲン性タンパク質と比較した効果を問題とする必要はなく、従来のアレルゲン性タンパク質と明確に異なるアレルゲン活性を有するものであれば、ＣＲＤのようなアレルギー疾患の診断及びそれに基づく治療に貢献でき、その産業的利用価値は高くなると言える。
　本開示のビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を減感作治療剤として用いる場合、本開示のビャクシン花粉タンパク質をそのまま、或いは乾燥して粉末状とし、又は必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として調製されるのが好ましい。
　例えば、粉末状の精製されたビャクシン花粉タンパク質を、フェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いることができる。
　本開示のビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、通常の投与経路、例えば経口又は非経口（経皮、経粘膜、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等）の局所又は全身の投与方法により行うことができる。これらの投与法に適用される剤型として、例えば、トローチ、舌下錠、注射剤、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等が挙げられる。
　本開示のビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断方法は、通常の投与経路、例えば経口又は非経口（経皮、経粘膜、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等）の局所又は全身の投与方法により行うことができる。これらの投与法に適用される剤型として、例えば、トローチ、舌下錠、注射剤、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等が挙げられる。
　本開示のビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて異なるが、例えば、成人１回あたり約0.1～1000μgの範囲となるように適宜選択し、毎週１から数回程度投与される。
　ビャクシン花粉は、Mountain Cedar花粉を原因とする花粉症のアレルゲンとしても知られており、フランスやイタリア、オーストラリア等の地域で花粉症の原因となっているヒノキ科植物である。本開示はビャクシン花粉、スギ花粉及びヒノキ花粉だけでなく、Mountain Cedar花粉を原因とする花粉症の治療においても効果を期待できる。
　日本人のスギ花粉症患者におけるビャクシン抗体の陽性率は高く、特にヒノキ花粉症患者でビャクシン抗体の陽性率が高いことが知られている。本開示は日本人のスギ花粉症及びヒノキ花粉症の治療に使用することができ、効果を期待できる。
ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断
　本開示のビャクシン花粉タンパク質は、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患診断薬となり、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するために使用できる。
　斯かるビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患診断薬は、例えばビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患に対する皮膚反応診断、すなわち皮内テスト又はプリックテスト試薬等として用いられる。加えて、特異的ＩｇＥ抗体検査用試薬を調製することで患者血清または血漿を用いた診断が可能である。（鼻アレルギー診療ガイドライン－通年性鼻炎と花粉症－2013年版、株式会社ライフ・サイエンス）
　皮膚反応診断試薬として用いる場合、前記の方法により取得された本開示のビャクシン花粉タンパク質を、例えば乾燥して粉末状とし、これをフェノールまたはグリセリンを含む生理食塩水に溶解し、希釈して用いられる。特異的ＩｇＥ抗体検査用試薬としては、水相中または固相上で本開示のビャクシン花粉タンパク質に患者検体中のＩｇＥ抗体を結合させ、Fluoro enzyme immunoassay、Chemiluminescence enzyme immunoassay、enzyme immunoassay等の原理に基づき検出する方法が挙げられるが、検出方法はこれらに限定されない。
　従って本開示は、ビャクシン花粉タンパク質と検体とを反応させることを特徴とする皮膚反応検出方法を提供する。また本開示は、ビャクシン花粉タンパク質を含む、皮膚反応検出キットを提供する。ここで「反応させる」とは、本開示のビャクシン花粉タンパク質と患者検体とを接触させること、本開示のビャクシン花粉タンパク質に検体中のＩｇＥ抗体を結合させることのいずれの態様も含む。
　本開示のビャクシン花粉タンパク質をキットとして用いる場合には、当該タンパク質を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。例えば蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、界面活性剤などを組み合わせることができる。また、ビャクシン花粉タンパク質を酵素標識やビオチン標識して用いることもできる。標識酵素として、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、金コロイドなどを用いることができる。
　本開示をキットに用いる場合には、本開示のタンパク質の他に、上記の溶媒、溶質、酵素標識試薬、基質液、反応停止液、洗浄液、使用説明書などを含めることができる。
ビャクシン花粉タンパク質に対する抗体
　本開示のビャクシン花粉タンパク質に対する抗体は、本開示のビャクシン花粉タンパク質と特異的に結合することができる抗体である。上記抗体とは免疫グロブリン(ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらの抗原結合断片（Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fcフラグメント、あるいはscFv等））を意味し、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　上記抗体は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、作製方法は特に限定されるものではない。
　例えば、本開示のモノクローナル抗体を得る方法としては、まず、ビャクシン花粉タンパク質又はその部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（例えばＢ細胞）を採取する。この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製する。そして、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得る。
  抗原ペプチドを合成する基本となるアミノ酸配列はビャクシン花粉タンパク質の全長アミノ酸配列の部分配列であり、そのアミノ酸配列の中から任意に連続する１０～５０個程度の長さのアミノ酸配列を選択する。部分ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ法やｔＢｏｃ法等の当業者に公知の方法によって行うことができる。
　免疫する非ヒト哺乳動物の種類は特に限定されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等などが挙げられ、マウスが好ましい。抗原の動物1匹あたりの投与量は、全体で１０～１５０μgである。抗原を免疫する際は、アジュバントと抗原溶液を混ぜることが一般的であり、アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～３週間間隔で、1～１０回免疫を行う。
　抗体産生細胞は、免疫した非ヒト哺乳動物の脾臓細胞等又は所属リンパ節等から調製する。
　細胞融合は、上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させ、抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞（ハイブリドーマ）を作製するために行う作業である。当業者であれば、公知の細胞融合方法を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることができる。
　次に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する。細胞融合から１０～１４日後に、ＨＡＴ培地で選択された細胞がコロニーを形成する。そのコロニー陽性培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、ＥＬＩＳＡ等によりビャクシン花粉タンパク質に対する抗体価を確認する。
　最終的に選択されたウェルの細胞は、単一の細胞にするためにクローニングを行う。クローニングは、例えば細胞懸濁液を１０～２０％のＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希釈後、９６穴培養プレートの各ウェルに１個入るように細胞を播き込む。細胞播き込み後、コロニー陽性ウェルの培養上清を回収する。さらに選択されたウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立する。クローニングは必要に応じて数回行っても良い。
　樹立したハイブリドーマ株から、ビャクシン花粉タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を精製及び採取する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。
　本開示のビャクシン花粉タンパク質に対する抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるビャクシン花粉タンパク質の少なくとも一部であればよく限定はされない。
　また、ビャクシン花粉タンパク質に対する抗体は、上記ハイブリドーマにより産生されるビャクシン花粉タンパク質に対するモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本開示の抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープを指す。
　本開示のモノクローナル抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体又は抗原結合断片とすることもできる。例えば、本開示の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であってもよい。本開示の組換え抗体は、重鎖及び軽鎖の組換え発現によって製造することができる。
　遺伝子組換え抗体を発現させるには、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を有する組換え発現ベクターを、宿主細胞に導入し、当該ベクターが導入された宿主細胞を培養する。そして、当該宿主細胞の培養物から目的の抗体を回収する。抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を入手し、これらの核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、当分野で標準的な組換え方法（Sambroock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012）を採用することができる。
　また、本開示のポリクローナル抗体を得る方法としては、ビャクシン花粉タンパク質又はその部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、３～４回の免疫を行った時点で採血を行い、ELISA法等により抗体価を測定する。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し通常行われる方法などにより抗体を分離精製する。
　上記抗体は、本開示のビャクシン花粉タンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞の同定などに利用することができる。例えば、大気中や屋内の空間またはヒトの粘膜におけるビャクシン花粉タンパク質の有無等を測定するために利用することができる。該測定は公知の免疫学的方法により行うことができ、例えばELISA法により行うことができる。
　ビャクシン花粉タンパク質は、ヒノキ花粉症のアレルゲンとなるため、本開示の抗体を試料と反応させ、試料中のビャクシン花粉タンパク質を測定することにより、ビャクシン花粉タンパク質を検出することができる。
  従って、本開示は、本開示の抗体又はその断片とビャクシン花粉タンパク質とを反応させて、ビャクシン花粉タンパク質を検出することを特徴とする、ビャクシン花粉タンパク質の検出方法を提供する。
　また本開示においては、ビャクシン花粉タンパク質に対する抗体又はその断片をビャクシン花粉タンパク質の検出用試薬又はキットとして使用することができる。本開示におけるキットは、ビャクシン花粉タンパク質をキットとして用いる場合と同様に適用可能である。
　以下、実施例により本開示を具体的に説明するが、本開示はこれらの実施例により限定されるものではない。
　実施例１　
ビャクシンタンパク質の精製
ビャクシン花粉（Juniperus ashei）5gに200mLの抽出緩衝液（25mM Tris緩衝液、pH8.0）を加え、超音波発生器（UD-201、TOMY）にて破砕し、遠心（10,000 x g、10分）して上清を回収した。この上清を25mM Tris緩衝液（pH8.0）で平衡化させたVivapure Q Maxi H（ザルトリウス）に添加し、非吸着画分を集めた。これを20mM 酢酸緩衝液（pH5.2）にて平衡化させたVivapure S Maxi H（ザルトリウス）に添加して吸着させ、0.35M NaCl含有20mM 酢酸緩衝液（pH5.2）にて洗浄後、0.5M NaCl含有20mM 酢酸緩衝液（pH5.2）にて溶出した。精製したビャクシンタンパク質をSDS-PAGEにて泳動した結果を図1に示す。
　実施例２
精製ビャクシンタンパク質のアレルゲン活性確認
（i）精製ビャクシンタンパク質に対するリンパ球増殖応答
　春季に樹木アレルギー症状を有する被験者2名、及び健常者1名より得た末梢血30mLより末梢血単核細胞を単離し、10%非働化自己血漿入りRPMI-1640培地に1×106cells/mLとなるよう懸濁した。調製した細胞懸濁液180μLと、20μLの精製ビャクシンタンパク質溶液（濃度100μg/ml）を96 穴プレートに播種した（2×105cells/well）。37℃、5% CO2条件で3日間培養した後、3H-チミジンを添加し、16時間後までの取込量を放射活性として測定することにより細胞増殖を評価した。精製ビャクシンタンパク質添加時の3H-チミジン取込量を非添加時の取込量で除した値をStimulation indexとして算出した結果を、図2に示す。
　一般に、臨床検査におけるリンパ球刺激試験では、Stimulation index 1.8以上が陽性基準とされている（内田重行ら、肝臓　30巻4号439-443、1989）。この基準に則ることにより、アレルギー症状を有する被験者2例中2例（100%）が陽性と判定された。一方健常者においては、陰性であった。以上の結果より、春季に樹木アレルギー症状を有する人において、高頻度に本開示のタンパク質にT細胞レベルで感作されていることが示された。
（ii）精製ビャクシンタンパク質による好塩基球の活性化
　アレルゲンで刺激され活性化された好塩基球では、CD203cの発現が増強することが知られている（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）。この原理に基づくAllergenicityキット（ベックマン・コールター）を用いて、春季に樹木アレルギー症状を有する被験者又は健常者血液中の好塩基球活性化を解析した。
　すなわち、ヘパリン採血した全血100μLに本開示の精製ビャクシンタンパク質溶液20μLを最終濃度100ng/mLとなるように加え、陰性対照サンプルにはPBS（-）20μLを加えた。続いて全てのサンプルにCD3-PC7、CRTH2-FITC及びCD203c-PEを含む抗体カクテル20μLを加え、37℃で15分間インキュベートした。反応停止液100μLと溶血固定液2mLを加え、室温で10分間反応させた。遠心（200 x g、5分）後、上清を除去し、リン酸緩衝液（PBS）3mLを加えて再び遠心した。
　上清を除去後、細胞を0.1%ホルムアルデヒド添加PBSに懸濁し、フローサイトメーター（FACSVerse、BD Biosciences）により測定した。得られたデータについて、CD3-PC7陰性かつCRTH2-FITC陽性であることを指標として血球の中の好塩基球を選別し、CD203cの発現強度を解析した。データは、本開示タンパク質溶液刺激サンプルにおけるCD203c陽性好塩基球割合（％）から各陰性対照サンプルにおけるCD203c陽性好塩基球割合（％）を差し引いた値を示しており、健常者における最高値0.75%の2倍にあたる1.5以上の値を陽性と判定した。
　その結果、図3で示した通り健常者2例中2例とも、精製ビャクシンタンパク質添加時におけるCD203cの発現増強は認められなかった一方、春季に樹木アレルギー症状を示す被験者においては、9例中9例（100％）においてCD203cの発現増強が認められ、その差は有意であった（p<0.05、Welch's t test）。従って、春季に樹木アレルギー症状を有する被験者は高頻度に本開示の精製ビャクシンタンパク質に結合するＩｇＥを有しており、さらに本開示タンパク質にアレルゲン活性があることが示された。
　実施例３　
精製ビャクシンタンパク質の部分内部アミノ酸配列の決定
　本開示タンパク質内部の部分アミノ酸配列を明らかにするために、精製ビャクシンタンパク質をトリプシン分解して得られるペプチド混合物の解析を行った。精製ビャクシンタンパク質をSDS-PAGE後、SDSゲルから分析対象のタンパク質バンドを切り出した。切り出したゲル片より、トリプシン加水分解を経てペプチド混合物を得た。ペプチド混合物をLC-MS/MSにて解析を行い、LPLLAR［部分アミノ酸配列１（配列番号３）〕、WIVDETTGLR［部分アミノ酸配列２（配列番号４）〕、ATVGETFAR［部分アミノ酸配列３（配列番号５）〕、YFNPNTWVK［部分アミノ酸配列４（配列番号６）〕、IRNPDFIAR［部分アミノ酸配列５（配列番号７）〕で示されるペプチドを得た。 
　実施例４
精製ビャクシンタンパク質のヌクレオチド配列の決定
＜ビャクシンtotal RNAの抽出＞
　凍結したビャクシン花粉2gに、Plant RNA Isolation Reagent （Invitrogen）25mLを添加して混和した後、室温にて5分間静置した。4℃にて遠心（2600 x g、5分）の後、上層をデカントにより網目サイズ100μmのメッシュで濾過した。続いて回収した濾液に1／5倍量の5M NaClと3／5倍量のクロロホルムを加えた。4℃にて遠心（2600 x g、30分）の後、上層20mLを回収し、9／10倍量のイソプロピルアルコールを加え、撹拌した。室温にて10分間静置した後、4℃にて遠心（2600 x g、30分）し、RNAを沈殿させた。上清を除去後、RNAペレットに75%エタノール10mLを加えて洗浄した。さらに4℃にて遠心（2600 x g、5分）の後、上清除去後Total RNAを室温で乾燥してから、200μLのRNase free waterに溶解させた。
Total RNA溶液をRNeasy Mini kit （Qiagen）を用いて、以下の操作でRNAを精製した。Total RNA溶液に70%エタノール水溶液200μLを添加後、RNeasy Miniカラムに添加し、遠心した（10000rpm　15秒）。さらにカラムをBuffer RW1 350μLにて洗浄後、RNase-Free DNase set （Qiagen）にてDNase処理を行った。 カラムをBuffer RW1 350μLにて洗浄後、カラムにBuffer RPE 500μLにて2回洗浄を行った。洗浄後、RNase Free H2O 30μLを添加し、得られた溶液をクリーンアップ済みtotal RNAとして回収した。
　＜ビャクシンcDNAの作製＞
　得られたクリーンアップ済みtotal RNAから、Superscript IV First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した。Total RNA 2μgを11μLの精製水に溶解し、50μM oligo（dT）20を1μL、10mM dNTPを1μL加えてから、65℃で5分間インキュベートした。サンプルを氷上で冷却した後、5 x SSIV Bufferを4μL、100mM DTTを1μL、Ribonuclease Inhibitorを1μL、SuperScript IV Reverse Transcriptaseを1μL加えて混和した。50℃で10分間インキュベートした後、80℃で10分間処理して反応を停止した。続いてサンプルにRNase Hを1μL加え37℃で20分間インキュベートを行い、ビャクシンcDNAを得た。
　＜クローニング＞
　ビャクシンのcDNAを鋳型として、センスプライマーとしてPrimer 1（ATGACGATGGCGGCGCTA：配列番号８）、アンチセンスプライマーとしてPrimer 2（TCAAAGTTGATGCAACAATTGTTTGTTG：配列番号９）を用いて、KOD Fx Neo（TOYOBO）によりPCRを行った。ＰＣＲの反応液組成：5 × PrimeSTAR GXL Buffer 10μL、dNTP Mixture（2.5 mM each）4μL、cDNA 0.5μL、Primer 10mM 各1.5μL、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μl、滅菌精製水 up to 50 μl
サイクル条件：98℃ 10sec 68℃ 2minの35サイクル
　PCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System （Promega）にて精製した。精製したPCR産物をTOPO TA Cloning Kit for Sequencing（Thermo Fischer）キットを用いてpCR 2.1-TOPO TA Vectorに組み込んだ。
得られたベクターより塩基配列を解析し、配列情報を取得した。
　更に3'側配列の解析のために5'/3' RACE kit 2nd generation (Roche)を用いて3'末端にアンカー配列を付加したビャクシンcDNAを作製した。Primer 3 （AGTGGATGTGTTTAGATGGG：配列番号１０）、及びPrimer 4（AGCAGTGGTTTAAAGTCATAA：配列番号１１）の2段階のプライマーを用いてKOD Fx neoによるnested PCRを行った。
　PCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System （Promega）にて精製した。精製したPCR産物をTOPO TA Cloning Kit for Sequencing（Thermo Fischer）キットを用いてpCR 2.1-TOPO TA Vectorに組み込んだ。得られたベクターの塩基配列を解析し、3'末端配列を取得した。
　本開示のビャクシンタンパク質をコードするcDNAは、配列番号1で示すポリヌクレオチドによってコードされていた。配列番号1によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）は、部分アミノ酸配列１～５を含んでおり、本開示タンパク質が配列番号1のポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質であることが示された。
　配列番号１～７：合成ペプチド
　配列番号８～１１：合成ＤＮＡ

Claims (20)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるビャクシン花粉タンパク質。
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
  2. 　以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるビャクシン花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
  3. 　以下の（ｄ）～（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
    　（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
    　（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    　（ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つビャクシン花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  4. 　請求項３記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  5. 　請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
  6. 　請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からビャクシン花粉タンパク質を採取することを特徴とする、当該タンパク質の製造方法。
  7. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
  8. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉及び／又はヒノキ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
  9. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。  
  10. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断用キット。
  11. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質と検体とを反応させることを特徴とする、ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の検出方法。
  12. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉及び／又はヒノキ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。
  13. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質に対する抗体。
  14. 　抗体がモノクローナル抗体である請求項１３記載のビャクシン花粉タンパク質に対する抗体。
  15. 　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を製造するための、請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質の使用。
  16. 　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質の使用。
  17. 　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するための、請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質。
  18. 　ビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するための、請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質。
  19. 　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療方法。
  20. 　　請求項１記載のビャクシン花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするビャクシン花粉を原因とするアレルギー疾患の診断方法。
     
     
     
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