JPH06197768A - スギ花粉抗原およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 スギ花粉抗原ＣｒｙｊＩおよびそれをコード
する遺伝子の全ての配列。 【効果】 スギ花粉抗原ＣｒｙｊＩの全部または一部お
よびそれらのアナログは、スギ花粉症の診断、治療ある
いは予防に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］

【産業上の利用分野】本発明は、スギ花粉抗原およびそ
れをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】スギ花粉症は、空中に飛散しているスギ
花粉粒子が、鼻粘膜や眼と接触し、花粉粒子から溶出し
た抗原性物質により鼻炎や眼結膜炎等を引き起こすアレ
ルギー疾患である。Coombsらによる分類（Clinical asp
ect of immunology, Oxford, 1968 ）によれば、Ｉ型ア
レルギー反応である。すなわち、スギ花粉抗原により感
作された肥満細胞および好塩基球の細胞膜表面の抗原特
異的ＩｇＥ抗体と抗原との結合が引き金となり、細胞内
からヒスタミン等のケミカルメディエーターが遊離放出
され、このメディエーターが標的組織を刺激して発症す
る（信太ら、図説スギ花粉症、金原出版、1991）。

【０００３】スギ花粉症の患者は、国民の５−１０％い
るといわれ、大量の花粉飛散と大気汚染により年々増加
の傾向にある。春先には、スギ花粉飛散予報が出される
など社会問題となっている。

【０００４】現在、花粉症の治療は、花粉より抽出した
抗原を少量ずつ投与する減感作療法と抗アレルギー剤を
投与する対症療法とが行なわれている。花粉症の根本的
治療と期待される減感作療法では、抗原特異的ＩｇＥ抗
体の減少、ケミカルメディエーターの遊離の減少、ある
いは遮断抗体の増加等のメカニズムにより、アレルギー
症状が予防、軽減される（八倉隆保，免疫学４，195-21
0 ，中山書店，1982）。しかし、抗原そのものを投与す
るためにアナフィラキシーの危険が伴い、しかも、抗原
を少量ずつ長期にわたり投与する必要があるなどの問題
がある。

【０００５】一方、スギ花粉抗原を重合させることによ
り、アナフィラキシーにつながる抗原性を弱め、上記の
ような減感作療法の効果を上げることができるとの報告
されている（片桐ら，アレルギー，38, 996, 1989 ）。

【０００６】ここで、減感作療法に用いる抗原として
は、必ずしもスギ花粉抗原本体を使う必要はなく、アナ
フィラキシーを引き起こすＩｇＥ抗体の産生を抑制し、
遮断抗体の産生を促進させる部分だけで良い。また、ス
ギ花粉特異的ＩｇＥ抗体産生やスギ花粉特異的ＩｇＧ抗
体産生は、Ｔ細胞により制御されている（Matsudaira,
S. et al., J. Immunology, 138, 109-115, 1987, 本多
ら，アレルギー，40：423-427, 1991 ）。すなわち、ス
ギ花粉抗原中には、ＩｇＥ抗体産生を促進するＴ細胞エ
ピトープと抑制するＴ細胞エピトープとが存在し、後者
を認識するＴ細胞が活性化されている人は花粉症を発症
しない。ＩｇＧ抗体産生では、促進するＴ細胞エピトー
プを認識するＴ細胞が活性化されると、遮断抗体として
のＩｇＧ抗体が産生される。従って、スギ花粉抗原にお
けるこのようなＴ細胞エピトープを同定し、その合成ペ
プチドあるいはそのアナログをスギ花粉症患者に投与す
れば、アナフィラキシーを起こさない安全な減感作療法
剤となりうると考えられる。

【０００７】また、スギ花粉抗原特異的ＩｇＥ抗体のエ
ピトープを同定し、その合成ペプチドおよびそのアナロ
グを投与すれば、抗原とＩｇＥ抗体の結合を中和し、肥
満細胞や好塩基球の脱顆粒を抑制できる。

【０００８】ところで、スギ花粉症の主要抗原は、分子
量約４万の塩基性蛋白質（ＣｒｙｊＩ）であることが同
定され（Yasueda, H. et al., J. Allergy Clin. Immun
ol.71, 77-86, 1983 ）、Ｎ末アミノ酸配列と内部ペプ
チドの一部配列が下記のように決定されている（Tania
i, M. et al., FEBS Letters 239, 329-332, 1988）。 １）Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-Ser-X-Trp-Arg-Gly-Asp-Ser-
Asn-Trp-Ala-Gln-Asn-Arg-Met-Lys ２）Glu-Ala-Phe-Asn-Val-Glu-Asn-Gly-Asn-Ala-Thr-Pr
o-Gln-Leu-Thr-Lys しかし、上記のようなＴ細胞エピトープやＩｇＥ抗体結
合エピトープを検索するためには、抗原の全領域にわた
り合成ペプチドを作製する方法（Huff, J. P.et al.,
J. Exp. Med. 172, 419-429, 1990）や、抗原遺伝子を
改変させて発現させる方法（Del Val, M. et al., J. V
irol. 62, 3965-3972, 1988 ）を行うのが一般的である
ので、抗原の一次配列の決定が必須となる。

【０００９】［発明の概要］

【発明が解決しようとする課題】よって、本発明はスギ
花粉抗原（ＣｒｙｊＩ）およびそれをコードする遺伝子
の全ての配列を提供することを目的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によるスギ花粉抗
原は、配列番号２に示される全てのアミノ酸配列または
１−３５３番で表されるアミノ酸配列を有するもの、で
ある。また、本発明によるＤＮＡは、上記本発明による
スギ花粉抗原をコードする遺伝子を含んでなるもの、で
ある。本発明によるスギ花粉抗原の全部または一部およ
びそれらのアナログは、スギ花粉症の診断、治療あるい
は予防に用いることができる。

【００１１】［発明の具体的説明］ＣｒｙｊＩおよびその遺伝子 配列番号１に示される塩基配列は、スギ雄花から得られ
たｍＲＮＡ由来のライブラリーより得られたクローンの
スギ花粉抗原ＣｒｙｊＩ遺伝子に相補的な配列、すなわ
ちｃＤＮＡ、である。配列番号１に示される塩基配列中
には、配列の６２−６４のＡＴＧコドンから１１８４−
１１８６のＴＧＡ終始コドンで終わるオープンリーディ
ングフレームが存在している。この６２−１１８３番の
配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードす
ると推定される。このアミノ酸配列と精製されたスギ花
粉抗原ＣｒｙｊＩのＮ末端の配列（Taniai, M. et al.,
前掲）とは、１番以降において一致していた。そこで、
この配列番号２に示される配列の−２１−−１番はシグ
ナルペプチドであり、１−３５３番がスギ花粉抗原Ｃｒ
ｙｊＩであると考えられる。

【００１２】従って本発明は、この配列番号１に示され
る塩基配列の全部または一部の塩基配列を含んでなるＤ
ＮＡ配列を提供する。

【００１３】また本発明によれば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列の全部または一部、特に１−３５３番で
表されるアミノ酸配列、を有するスギ花粉抗原が提供さ
れる。このスギ花粉抗原をコードするＤＮＡの典型的な
配列は配列番号１に示される配列１２５−１１８３番の
配列を有する。さらに、蛋白質のアミノ酸配列が与えら
れれば、それをコードする塩基配列はいわゆるコドン表
を参照して容易に定まり、その蛋白質をコードする種々
の塩基配列を適宜選択することができる。従って、本発
明による配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部また
は全部をコードする遺伝子とは、配列番号１に示される
塩基配列の一部または全部の配列を有するものに加え、
その縮重関係にあるコドンが使用されている以外は塩基
配列が配列番号１の配列と同一でかつ同一のペプチドを
コードするものを意味するものとする。

【００１４】ＣｒｙｊＩ遺伝子の取得とその発現 本発明によるＤＮＡは、その塩基配列が定まっているこ
とから、そのＤＮＡを取得する一つの手段は、核酸合成
の手法に従って製造することである。また、本発明によ
るＤＮＡは、スギ由来のｃＤＮＡライブラリーから遺伝
子工学の分野で慣用されている手法によって得ることが
できる。例えば、前記抗原のアミノ酸配列からＤＮＡプ
ローブを作製し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グする方法を用いることができる（Sambrook, J. et a
l., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab. US
A, 1989 ）。

【００１５】ＤＮＡプローブとしては、上記配列よりオ
リゴヌクレオチドを化学合成し、その５′−末端を３２
ｐで標識して直接用いるか、ＰＣＲ（Polymerase Chain
Reaction ）によってｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを鋳
型として比較的長い２本鎖ＤＮＡプローブを作製して用
いることができる。例えば、染色体ＤＮＡは、スギ葉よ
り、Ｍｕｒｒａｙら（Nucleic Acids Res. 8, 4321-432
5, 1980 ）の方法を用いて抽出することができる。ＰＣ
Ｒ用プライマーは、Ｎ末端アミノ酸配列上記１）に対応
するオリゴヌクレオチドと内部ペプチドアミノ酸配列上
記２）に対応するオリゴヌクレオチド（例えば後述実施
例１）を化学合成し、ＰＣＲ反応はPerkin Elmer Cetus
DNA Thermal cycle（Perkin Elmer Cetus社製）を用い
て、使用説明書に従って行えばよい。

【００１６】ｃＤＮＡライブラリーは、“Molecular Cl
oning ”（Cold Spring Harbor Lab. USA, 1989 ）に記
載の方法に従えば作製できる。例えば、成熟期のスギ雄
花よりチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム超遠心法
により全ＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡ合成キット（Pharma
cia 社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、λｇｔ１０に組
み換えることによりｃＤＮＡライブラリーを作製でき
る。

【００１７】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
は、３２ｐ標織したＤＮＡプローブを用いて、サザンハ
イブリダイゼーションを行えばよい。

【００１８】上記のようにして得たＣｒｙｊＩ遺伝子
は、それを適当な宿主細胞内でその遺伝情報が発現可能
な状態で含むＤＮＡ、特に発現ベクター、の形態とし
て、宿主細胞を形質転換して発現させることができる。
この発現のための手順ないし方法は、遺伝子工学の分野
において慣用されているものを用いて行うことができ
る。

【００１９】例えば、上記のようにしてクローニングし
た遺伝子は、大腸菌等で発現させることが可能であり
（Current Protocols in Molecular Biology, 16, Wile
y-Interscience, 1991）、その蛋白質に対する抗体を用
いたウェスタンブロッティング（Antibodies, A Labora
tory Manual, Cold Harbor Labolatory, 1988 ）により
発現蛋白質の同定ができる。例えば、発現ベクターｐＧ
ＥＸ−２Ｔ（Pharmacia社製）にインフレ−ムでＣｒｙ
ｊＩ遺伝子を組み込み、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．の方法
（DNA Cloning, 1, IRL Press, 1985 ）により形質転換
する。得られた形質転換体を培養し、その対数増殖期に
１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド）を培地中に添加することにより組み換え蛋白質
の発現を誘導する。培養菌体を超音波処理し、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、ＰＶＤＦ
（ポリビニリデン ジフルオリド）膜に転写してウェス
タンブロッティングに用いる。一次抗体としては、精製
スギ花粉抗原を免疫したウサギ血清が使用でき、二次抗
体にペルオキシダ−ゼ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体を用
いた酵素抗体染色法により組み換え蛋白質を同定するこ
とができる。

【００２０】ＣｒｙｊＩおよびその遺伝子の用途 スギ花粉抗原ＣｒｙｊＩはそのままスギ花粉症の減感作
療法に用いることができるほか、その配列を基にして改
変ペプチドを設計し、もしくは、そのＢ細胞エピトープ
またはＴ細胞エピトープ部分を同定して、それらの改変
ペプチドまたは部分ペプチドを減感作療法に用いること
ができる。

【００２１】また、スギ花粉抗原ＣｒｙｊＩおよびその
改変ペプチドならびに部分ペプチドはスギ花粉症の診断
にも用いることができる。例えば、それらをヒスタミン
遊離試験や、ＲＡＳＴ（Radioallergosorbent Test）に
用いて、抗原感受性、遮断抗体の有無をもとにスギ花粉
症の診断を行うことができる。さらに、ＣｒｙｊＩ遺伝
子は、ＣｒｙｊＩとホモロジーを持つ他の種のスギ花粉
抗原や、他の植物の花粉抗原を同定するためのプローブ
として用いることができる。

【００２２】さらにまた、このＣｒｙｊＩ遺伝子は、ス
ギ科植物に対し、公知の方法（Stanton, B. et al., Pl
ant Molecular Biology, Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht, 1988）を用いて、ＣｒｙｊＩ遺伝子または
それを人工的に改変した遺伝子を導入することで、分子
育種にも応用することができる。

【００２３】

【実施例】実施例１ ＤＮＡプローブの作製 スギ花粉抗原の部分アミノ酸配列より１）Trp-Ala-Gln-
Asn-Arg-Met-Lys 、２）Glu-Ala-Phe-Asn-Val-Glu-Asn
の配列をもとに、下記配列のオリゴヌクレオチド混合品
を化学合成（Applied Biosystems社製 Model 380A）し
た。

【００２４】スギ染色体ＤＮＡは、ＣＴＡＢ法（Murra
y, H.G. et. al., Nucleic Acids Res. 8:4321-4325,19
80 ）に従って下記のように調製した。すなわち、スギ
の葉４０ｇを液体窒素とともにワーリングブレンダーに
入れ粉砕した。これを、等量のＣＴＡＢ溶液（２％臭化
セチルトリメチルアンモニウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）、１．４Ｍ ＮａＣｌ、１％ポリビニルピロリ
ドン）と混合し、５５℃に加温して可溶化する。この可
溶化物をクロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：
１混合液で処理して精製後、エタノール沈澱によりスギ
染色体ＤＮＡを約４０μｇ得た。

【００２５】ＤＮＡプローブはスギ染色体ＤＮＡを鋳型
にし、上記１）、２）のオリゴヌクレオチド混合品をプ
ライマーにしたＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ法は、
Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler （Perkin Elm
er Cetus社製）を使用して、使用説明書に従って行っ
た。すなわち、スギ染色体ＤＮＡ ０．５μｇ、上記２
種類のプライマー各々２５０ｐｍｏｌ、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．
５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ゼラチン、２００μＭ
ｄＮＴＰ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ２．５Ｕを含
む１００μｌの混合液を９４℃（変性）１分、６５℃
（アニーリング）２分、７２℃（伸長）４分の反応サイ
クルで３０回繰り返した。この混合液を１％アガロース
電気泳動により分離し、２．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収
し、ＤＮＡプローブとした。

【００２６】実施例２ ｃＤＮＡライブラリーの作製 スギ雄花（１２月採取）よりチオシアン酸−塩化リチウ
ム超遠心法（Sambrook, J. et al., Molecular clonin
g, Cold Spring Harbor Lab. USA, 1989 ）によってＲ
ＮＡを下記のように調製した。すなわち、スギ雄花を採
取後、液体窒素とともにワーリングブレンダーに入れ粉
砕した。その１ｇを４Ｍチオシアン酸グアニジン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１．４％（ｖ／
ｖ）β−メルカプトエタノールおよび０．５％（ｗ／
ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム溶液１０ml中
でポリトロンミキサーにてさらに粉砕し、可溶化した。
この混合物を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、そ
の上清を遠心管に入っている５．７Ｍ塩化セシウムおよ
び０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）溶液上に静かにの
せ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０Ｔｉローター（Beckman
社製）にて３６，０００ｒｐｍ、１２時間遠心分離し
た。ＲＮＡの沈澱を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ溶液に溶解した。得られたＲＮＡ約２５μｇから
オリゴテックス−ｄＴ３０（宝酒造社製）を用いて使用
説明書に従ってポリ（Ａ）ｍＲＮＡを抽出した。このポ
リ（Ａ）ｍＲＮＡからタイムセーバｃＤＮＡ合成キット
（Pharmacia 社製）を用いて使用説明書に従ってｃＤＮ
Ａを合成し、λｇｔ１０をベクターとするｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。

【００２７】実施例３ スクリーニング 上記ｃＤＮＡライブラリーから３２ｐでランダムラベル
した上記ＤＮＡプローブを使用してハイブリダイズする
クローンをＧｅｏｆｆｒｅｙ，Ｍ．らの方法（Methods
in Enzymology, 152, 415-423, 1987 ）に従い単離し
た。このファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、約１．
４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をファージＭ１３ｍｐ１８のＥ
ｃｏＲＩ部位にサブクローニングした後、Ｓａｎｇｅｒ
らジデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74,
5463-5467, 1977 ）によりその塩基配列を決定した。そ
の結果は配列番号１に示される通りである。上記塩基配
列より推定されるスギ花粉抗原（ＣｒｙｊＩ）の全アミ
ノ酸配列は配列番号２の通りある。

【００２８】実施例４ ＣｒｙｊＩ ｃＤＮＡの発現 ＣｒｙｊＩの成熟蛋白質のＮ末端およびＣ末端に対応し
たプライマーにＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ部位を付加
して下記のように合成した。 １）５’−ＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＡＡＴＣＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＣ ＢａｍＨＩ ２）５’−ＧＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＴＡＧＡＧＡＧ ＥｃｏＲＩ

【００２９】上記プライマーを用いて、ＣｒｙｊＩが組
み込まれたλｇｔ１０ＤＮＡを基質にＰＣＲ法により制
限酵素切断部位を導入したＣｒｙｊＩ ｃＤＮＡ断片を
得た。

【００３０】上記ＣｒｙｊＩ ｃＤＮＡ断片２μg をＢ
ａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。また、グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェレースとの融合蛋白発現用ベク
ターｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia 社製）５μg を同様に
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。上記２種のＤ
ＮＡをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて、１６℃、３０分反応後、E.coliＪＭ１０９にＨａ
ｎａｈａｎ，Ｄ．の方法（DNA Cloning, 1, IRL Press,
1985 ）により形質転換し、アンピシリン５０μg/mlを
含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、イーストイ
クストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）プレート
上で、３７℃、一晩培養することにより組み換え体を選
別した。

【００３１】ＣｒｙｊＩを挿入した発現ベクターｐＧＥ
Ｘ−２Ｔ ＣＲＹＪ１（図１）を保持するE.coliＪＭ１
０９をアンピシリン５０μg/mlを含むＺＢ培地（ＮＺア
ミンＡ１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ）で、２８℃、一
晩培養した。この培養液０．５mlをＭ９ＺＢ培地（ＮＨ
_４Ｃｌ １ｇ／ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ３ｇ／ｌ、Ｎａ_２Ｈ
ＰＯ_４ ６ｇ／ｌ、グルコース４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ_４
１ｍＭ、ＮＺアミンＡ１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ）
５０mlに添加し、２８℃にて振とう培養した。ＯＤ６０
０が０．４に到達したところで、ＩＰＴＧ（イソプロピ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を１ｍＭになるよう
に添加し、さらに一晩振とう培養した。上記培養液を３
０００ｒｐｍ，２０分遠心後、沈澱をＰＢＳ５mlに懸濁
し、超音波破砕機（３ｍｍ直径プローブ、Branson 社
製）にて菌体を破砕した。上記菌体破砕液１０μｌに３
ｘＳＤＳサンプル緩衝液（１８８ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ６．８）、６％ＳＤＳ、３０％グリセロール、１
５％β−メルカプトエタノール、０．０２４％ブロムフ
ェノールブルー）５μｌを加え５分間煮沸後、ＳＤＳ−
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。コン
トロールとして、ｐＧＥＸ−２Ｔのみを形質転換したE.
coliＪＭ１０９を用いて同様の操作を行った。

【００３２】ＣｒｙｊＩ ｃＤＮＡの発現の確認は、ス
ギ花粉抗原を免疫して得たウサギ血清を用いたウェスタ
ンブロッティング（Harlow, E. et al., Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Harbor Laboratory, 1988）
により行った。すなわち、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動後のゲルを、トランスファー液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，３８０ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ，２０
％メタノール）中で、ＰＶＤＦ膜、イモビロン−Ｐ（Mi
llipore 社製）に転写した。３％スキムミルクでブロッ
キング後、２５０倍希釈ウサギ抗スギ花粉抗原血清と反
応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Or
ganon Teknika 社製）とＰＯＤイムノステインセット
（和光純薬社製）を用いて染色を行った。ＣｒｙｊＩは
グルタチオン−Ｓ−トランスフェレ−スとの融合蛋白質
として６５ｋＤの位置に、また融合蛋白質の部分分解物
と思われるものが５０ｋＤの位置に検出された。その結
果は図２に示される通りである。

【００３３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３１７ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：Cryptomeria japonica 個体・単離生物名：スギ 配列の特徴： ５’末端非翻訳領域：１−６１ シグナルペプチドコード領域：６２−１２４ 成熟型タンパク質コード領域：１２５−１１８３ ３’末端非翻訳領域：１１８４−１３１７ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AATCTGCTCA TAATCATAGC ATAGCCGTAT AGAAAGAAAT TCTACACTCT GCTACCAAAA 60 A ATG GAT TCC CCT TGC TTA GTA GCA TTA CTG GTT TTC TCT TTT GTA ATT 109 Met Asp Ser Pro Cys Leu Val Ala Leu Leu Val Phe Ser Phe Val Ile -20 -15 -10 GGA TCT TGC TTT TCT GAT AAT CCC ATA GAC AGC TGC TGG AGA GGA GAC 157 Gly Ser Cys Phe Ser Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp -5 1 5 10 TCA AAC TGG GCA CAA AAC AGA ATG AAG CTC GCA GAT TGT GCA GTG GGC 205 Ser Asn Trp Ala Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly 15 20 25 TTC GGA AGC TCC ACC ATG GGA GGC AAG GGA GGA GAT CTT TAT ACG GTC 253 Phe Gly Ser Ser Thr Met Gly Gly Lys Gly Gly Asp Leu Tyr Thr Val 30 35 40 ACG AAC TCA GAT GAC GAC CCT GTG AAT CCT GCA CCA GGA ACT CTG CGC 301 Thr Asn Ser Asp Asp Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg 45 50 55 TAT GGA GCA ACC CGA GAT AGG CCC CTG TGG ATA ATT TTC AGT GGG AAT 349 Tyr Gly Ala Thr Arg Asp Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Ser Gly Asn 60 65 70 75 ATG AAT ATA AAG CTC AAA ATG CCT ATG TAC ATT GCT GGG TAT AAG ACT 397 Met Asn Ile Lys Leu Lys Met Pro Met Tyr Ile Ala Gly Tyr Lys Thr 80 85 90 TTT GAT GGC AGG GGA GCA CAA GTT TAT ATT GGC AAT GGC GGT CCC TGT 445 Phe Asp Gly Arg Gly Ala Gln Val Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys 95 100 105 GTG TTT ATC AAG AGA GTT AGC AAT GTT ATC ATA CAC GGT TTG TAT CTG 493 Val Phe Ile Lys Arg Val Ser Asn Val Ile Ile His Gly Leu Tyr Leu 110 115 120 TAC GGC TGT AGT ACT AGT GTT TTG GGG AAT GTT TTG ATA AAC GAG AGT 541 Tyr Gly Cys Ser Thr Ser Val Leu Gly Asn Val Leu Ile Asn Glu Ser 125 130 135 TTT GGG GTG GAG CCT GTT CAT CCT CAG GAT GGC GAT GCT CTT ACT CTG 589 Phe Gly Val Glu Pro Val His Pro Gln Asp Gly Asp Ala Leu Thr Leu 140 145 150 155 CGC ACT GCT ACA AAT ATT TGG ATT GAT CAT AAT TCT TTC TCC AAT TCT 637 Arg Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn Ser Phe Ser Asn Ser 160 165 170 CCT GAT GGT CTG GTC GAT GTC ACT CTT ACT TCG ACT GGA GTT ACT ATT 685 Pro Asp Gly Leu Val Asp Val Thr Leu Thr Ser Thr Gly Val Thr Ile 175 180 185 TCA AAC AAT CTT TTT TTC AAC CAT CAT AAA GTG ATG TTG TTA GGG CAT 733 Ser Asn Asn Leu Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His 190 195 200 GAT GAT GCA TAT AGT GAT GAC AAA TCC ATG AAG GTG ACA GTG GCG TTC 781 Asp Asp Ala Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe 205 210 215 AAT CAA TTT GGA CCT AAC TGT GGA CAA AGA ATG CCC AGG GCA CGA TAT 829 Asn Gln Phe Gly Pro Asn Cys Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr 220 225 230 235 GGA CTT GTA CAT GTT GCA AAC AAT AAT TAT GAC CCA TGG ACT ATA TAT 877 Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Thr Ile Tyr 240 245 250 GCA ATT GGT GGG AGT TCA AAT CCA ACC ATT CTA AGT GAA GGG AAT AGT 925 Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser 255 260 265 TTC ACT GCA CCA AAT GAG AGC TAC AAG AAG CAA GTA ACC ATA CGT ATT 973 Phe Thr Ala Pro Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Gln Val Thr Ile Arg Ile 270 275 280 GGA TGC AAA ACA TCA TCA TCT TGT TCA AAT TGG GTG TGG CAA TCT ACA 1021 Gly Cys Lys Thr Ser Ser Ser Cys Ser Asn Trp Val Trp Gln Ser Thr 285 290 295 CAA GAT GTT TTT TAT AAT GGA GCT TAT TTT GTA TCA TCA GGG AAA TAT 1069 Gln Asp Val Phe Tyr Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Tyr 300 305 310 315 GAA GGG GGT AAT ATA TAC ACA AAG AAA GAA GCT TTC AAT GTT GAG AAT 1117 Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu Asn 320 325 330 GGG AAT GCA ACT CCT CAA TTG ACA AAA AAT GCT GGG GTT TTA ACA TGC 1165 Gly Asn Ala Thr Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys 335 340 345 TCT CTC TCT AAA CGT TGT TGA TGATGCATA TATTC 1200 Ser Leu Ser Lys Arg Cys 350 TAGCATGTTG TACTATCTAA ATTAACATCA ACAAGAAATA TATCATGATG TATATTGTTG 1260 TATTGATGTC AAAATAAAAA TGTATCTTTT ACTATTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1317

【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：３７４ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 起源 生物名：Cryptomeria japonica 個体・単離生物名：スギ 配列の特徴： シグナルペプチド領域：−２１−−１ 成熟型タンパク質領域：１−３５３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Met Asp Ser Pro Cys Leu Val Ala Leu Leu Val Phe Ser Phe Val Ile -20 -15 -10 Gly Ser Cys Phe Ser Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp -5 1 5 10 Ser Asn Trp Ala Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly 15 20 25 Phe Gly Ser Ser Thr Met Gly Gly Lys Gly Gly Asp Leu Tyr Thr Val 30 35 40 Thr Asn Ser Asp Asp Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg 45 50 55 Tyr Gly Ala Thr Arg Asp Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Ser Gly Asn 60 65 70 75 Met Asn Ile Lys Leu Lys Met Pro Met Tyr Ile Ala Gly Tyr Lys Thr 80 85 90 Phe Asp Gly Arg Gly Ala Gln Val Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys 95 100 105 Val Phe Ile Lys Arg Val Ser Asn Val Ile Ile His Gly Leu Tyr Leu 110 115 120 Tyr Gly Cys Ser Thr Ser Val Leu Gly Asn Val Leu Ile Asn Glu Ser 125 130 135 Phe Gly Val Glu Pro Val His Pro Gln Asp Gly Asp Ala Leu Thr Leu 140 145 150 155 Arg Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn Ser Phe Ser Asn Ser 160 165 170 Pro Asp Gly Leu Val Asp Val Thr Leu Thr Ser Thr Gly Val Thr Ile 175 180 185 Ser Asn Asn Leu Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His 190 195 200 Asp Asp Ala Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe 205 210 215 Asn Gln Phe Gly Pro Asn Cys Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr 220 225 230 235 Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Thr Ile Tyr 240 245 250 Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser 255 260 265 Phe Thr Ala Pro Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Gln Val Thr Ile Arg Ile 270 275 280 Gly Cys Lys Thr Ser Ser Ser Cys Ser Asn Trp Val Trp Gln Ser Thr 285 290 295 Gln Asp Val Phe Tyr Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Tyr 300 305 310 315 Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu Asn 320 325 330 Gly Asn Ala Thr Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys 335 340 345 Ser Leu Ser Lys Arg Cys 350

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣｒｙｊＩ遺伝子を挿入した発現ベクターｐＧ
ＥＸ−２Ｔ ＣＲＹＪ１。

【図２】ＣｒｙｊＩ遺伝子発現産物とスギ花粉抗原を免
疫して得たウサギ血清を用いたウェスタンブロッティン
グ。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ Ｑ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号２に示される配列の１−３５３番
   で表されるアミノ酸配列を有する、スギ花粉抗原。
2. 【請求項２】配列番号２に示されるアミノ酸配列を有す
   る、スギ花粉抗原。
3. 【請求項３】請求項１または２記載のスギ花粉抗原をコ
   ードする遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列番号１に示される配列の１２５−１１
   ８３番で表される塩基配列を含んでなる、請求項３記載
   のＤＮＡ。
5. 【請求項５】配列番号１に示される配列の６２−１２４
   番で表される塩基配列を更に含んでなる、請求項４記載
   のＤＮＡ。
6. 【請求項６】配列番号１に示される塩基配列を有する、
   ＤＮＡ。