CN114685636A

CN114685636A - 蒿属植物花粉过敏原、应用及试剂盒

Info

Publication number: CN114685636A
Application number: CN202210213007.6A
Authority: CN
Inventors: 欧阳昱晖; 张罗; 许昭俊; 杨军
Original assignee: Beijing Institute Of Otolaryngology Beijing Otolaryngology Head And Neck Surgery Research Center; Beijing Tongren Hospital
Current assignee: Beijing Institute Of Otolaryngology Beijing Otolaryngology Head And Neck Surgery Research Center; Beijing Tongren Hospital
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2042-03-04
Also published as: CN114685636B

Abstract

本发明提供一种蒿属植物花粉过敏原，属于生物医药技术领域，所述蒿属植物花粉过敏原为热休克蛋白70kDa，所述热休克蛋白70kDa的氨基酸序列如SEQNO.1所示，编码所述热休克蛋白70kDa的基因的碱基序列如SEQNO.2所示。本发明提供花粉过敏的新的检测基因，进一步完善了现有花粉过敏原数据库，进一步诠释了花粉过敏的机制；提供了筛选花粉过敏的生物样本的方法、筛选花粉过敏的生物样品的系统，用于筛选花粉过敏的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防花粉过敏的药物的方法；所提供的的试剂盒可用于临床对花粉过敏基因的检测，为花粉过敏的诊断提供了快速、可靠、准确的新途径。

Description

蒿属植物花粉过敏原、应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种蒿属植物花粉过敏原、应用及试剂盒。

背景技术

花粉致敏物质的分离鉴定在过敏性疾病的预防和治疗非常重要。掌握过敏原可以用于病人的过敏原的筛选鉴定，过敏原特异性免疫治疗，抗过敏药物的开发和药效的判断，过敏原蛋白刺激产生的抗体可以用于疾病的诊断。

目前在花粉抗原数据库中艾蒿(Artemisia vulgaris)报告有6种花粉过敏蛋白，分子量分别为10kDa(Art v5)，12kDa(Art v3)，14kDa(Art v4)，20kDa(Art v2)，28kDa(Artv1)和44kDa(Art v6)，青蒿(Artemisia annua)有24-26kDa的Art an1和62kDa的Art an7，而在其他蒿中如加州蒿(Artemisia californica)和冷蒿(Artemisia frigida)等则只报告一种和Art 1相似的24-26kDa的具有丰富聚脯氨酸结构域的Defensin样蛋白。

在临床上病人血清抗体和蒿花粉提取物反应的过敏源检测中发现，除了以上报道的相应分子量的蛋白以外，在大多数的蒿花粉过敏病人的抗体还检测到一强反应的分子量在70kDa的蛋白。通过对这一蛋白的质谱分析和对比青蒿蛋白的数据库，发现70kDa是热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)。HSP70的功能被报道在各种应激反应起重要的作用，但没有作为蒿过敏成分的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的70kDa的HSP70，其是沙蒿花粉过敏的主要过敏原之一，并按照国际花粉数据库命名原则将其命名为Art s8。Art s8作为新的过敏蛋白，可以应用于花粉引起的过敏性鼻炎、过敏性结膜炎和哮喘等变应性过敏性疾病靶目标的相关花粉过敏病人的筛查、诊断、脱敏治疗、诊断试剂、新的治疗药物、治疗方法和保健食品的开发应用，以解决上述背景技术中存在的至少一项技术问题。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一方面，本发明提供一种蒿属植物花粉过敏原，所述蒿属植物花粉过敏原为热休克蛋白70kDa，所述热休克蛋白70kDa的氨基酸序列如SEQ NO.1所示，编码所述热休克蛋白70kDa的基因的碱基序列如SEQ NO.2所示。

第二方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在花粉过敏诊断中的应用。

第三方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在制备检测花粉过敏试剂中的应用。

第四方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在制备花粉过敏检测试剂盒中的应用。

第五方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在制备用于治疗花粉过敏的药物中的应用。

第六方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在花粉过敏病人筛查中的应用。

第七方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在花粉过敏诊断中的应用。

第八方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在制备用于预防花粉过敏的保健食品中的应用。

第九方面，本发明提供如上所述的花粉过敏原在制备用于预防花粉过敏的抗体中的应用。

第十方面，本发明提供一种花粉过敏检测试剂盒，所述花粉过敏检测试剂盒包括如上所述的花粉过敏原。

本发明有益效果：提供花粉过敏的新的检测基因，进一步完善了现有花粉过敏原数据库，进一步诠释了花粉过敏的机制；提供了筛选花粉过敏的生物样本的方法、筛选花粉过敏的生物样品的系统，用于筛选花粉过敏的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防花粉过敏的药物的方法；所提供的的试剂盒可用于临床对花粉过敏基因的检测，为花粉过敏的诊断提供了快速、可靠、准确的新途径。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得容易理解，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例所述的过敏原Art s8电泳检测结果图。

图2为本发明实施例所述的花粉过敏蛋白检测结果示意图。

具体实施方式

1、蒿花粉蛋白提取：青蒿和沙蒿花粉在花粉季节分别取自北京和内蒙古包头。取2g花粉悬浮于35ml的PBS中，4℃振荡15min,14000g离心后，收集上清液，0.22-μM过滤器过滤(微孔),用BCA法测定蛋白提取物的浓度。青蒿和沙蒿花粉在秋天取自包头地区。将花粉浸泡在PBS，旋转混合24小时，离心分离上清，用BCA进行蛋白定量。

2、蛋白组分鉴定：青蒿和沙蒿总蛋白用12％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行蛋白电泳并对胶进行银染色(试剂来源：Skim Milk,BD,Difco公司；PAGE凝胶银染试剂盒，索来宝公司)，展现提取液中不同分子量的蛋白图谱(如图1所示)。

3、重要致敏蛋白的确定：1).采集数份血清样品，有蒿过敏的临床表现，并且已通过血清学检测及点刺手段证明对黄花蒿/大籽蒿/艾蒿过敏呈明显阳性，2)用上述沙蒿提取液和血清样品进行Western Blot试验，转到PVDF膜，用花粉过敏病人血清进行反应，获得不同的条带图谱(图2)。(试剂来源：Pierce BCA^TM Protein Assay试剂盒、Thermo公司，ECLplus western blotting试剂盒、GE Healthcare公司，PVDF膜,默克merck millipore公司，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，索来宝公司)。

4、花粉过敏成分的分离和质谱分析：将与病人血清结合的花粉蛋白在SDS-PAGE电泳分离后将相应分子量的胶切除，用胰蛋白酶进行消化，MS/MS氨基酸测序，并对比蒿基因库(uni_Artemisia Artemisia(68,182sequences；25,811,778residues)。基因库检索表明沙蒿花粉70kDa的过敏蛋白是热休克蛋白(Heat shock protein，分子量：71,354)，其氨基酸序列和核酸序列分别如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。

综上所述，本发明实施例提供了花粉过敏原抗原70kDa蛋白的核酸分子1800个碱基序列，命名为Art s8，其编码植物Heat shockprotein70.提供了花粉过敏源抗原70kDa蛋白的600个氨基酸的蛋白序列。其表达在细胞质中。提供的核酸，蛋白系列不仅可以提供有价值的研究工具，用于许多应用，包括但不限于花粉过敏病人的诊断，治疗。可以用于包含Art s8的实验试剂盒的引物探针。应用在鉴定分离植物的相关基因，同源物。可以用于包含Art s8的实验试剂盒的抗原。可以用于包含Art s8的转基因实验动物的构建，应用这些动物在花粉过敏研究中应用。可以用于包含Art s8的部分或者全长的特异性免疫抗体。可以用于包含Art s8的细胞应用于变应性疾病药物筛选，药物治疗效果的鉴定。可以用于包含Art s8应用于构建Art s8变异，缺损，抑制，过表达细胞的构建。应用在变应性疾病药物筛选，药物治疗效果的鉴定。可以用于包含Art s8或者以Art s8作为载体的化合物单独或者合用应用于花粉过敏患者的预防或者治疗。包括Art s8应用质粒或病毒载体，整合入原核或者真核生物的基因组。Art s8包括在沙蒿花粉过敏源，也包括在青蒿，黄花蒿等蒿科植物过敏源在相关变应性疾病的诊断试剂，过敏源检测，过敏源脱敏，药物筛选，药物开发以及临床治疗。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京同仁医院

<120> 蒿属植物花粉过敏原、应用及试剂盒

<130> S20211473

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 651

<212> PRT

<213> 热休克蛋白70kDa(Heat shock protein 70kDa)

<400> 1

Pro Arg Thr Met Ala Gly Leu Gly Gly Gly Pro Ala Ile Gly Ile Ala

1 5 10 15

Leu Gly Thr Thr Thr Ser Cys Val Gly Val Thr Gly Ala Ala Ala Val

20 25 30

Gly Ile Ile Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Thr Pro Ser Thr Val

35 40 45

Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Leu Ile Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Val Ala Met Ala Pro Thr Ala Thr Val Pro Ala Ala Leu Ala Leu Ile

65 70 75 80

Gly Ala Ala Pro Ser Ala Ala Ser Val Gly Ser Ala Ile Leu Leu Thr

85 90 95

Pro Pro Leu Val Thr Ser Gly Pro Ala Gly Leu Pro Met Ile Ala Val

100 105 110

Ala Thr Leu Gly Gly Gly Leu Gly Pro Ser Ala Gly Gly Ile Ser Ser

115 120 125

Met Val Leu Ile Leu Met Leu Gly Ile Ala Gly Ala Pro Leu Gly Thr

130 135 140

Thr Val Leu Ala Ala Val Val Thr Val Pro Ala Thr Pro Ala Ala Ser

145 150 155 160

Gly Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Gly Val Ile Ser Gly Leu Ala Val

165 170 175

Met Ala Ile Ile Ala Gly Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Thr Gly Leu

180 185 190

Ala Leu Leu Ala Ser Ser Val Gly Gly Leu Ala Val Leu Ile Pro Ala

195 200 205

Leu Gly Gly Gly Thr Pro Ala Val Ser Leu Leu Thr Ile Gly Gly Gly

210 215 220

Ile Pro Gly Val Leu Ser Thr Ala Gly Ala Thr His Leu Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ala Pro Ala Ala Ala Met Val Ala His Pro Val Gly Gly Pro Leu Ala

245 250 255

Leu His Leu Leu Ala Ile Thr Gly Ala Pro Ala Ala Leu Ala Ala Leu

260 265 270

Ala Thr Ala Cys Gly Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ser Ser Thr Ala Gly

275 280 285

Thr Thr Ile Gly Ile Ala Ser Leu Thr Gly Gly Val Ala Pro Thr Ser

290 295 300

Thr Ile Thr Ala Ala Ala Pro Gly Gly Leu Ala Met Ala Leu Pro Ala

305 310 315 320

Leu Cys Met Gly Pro Val Gly Leu Cys Leu Ala Ala Ala Leu Met Ala

325 330 335

Leu Ser Thr Val His Ala Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Ala Ile

340 345 350

Pro Leu Val Gly Gly Leu Leu Gly Ala Pro Pro Ala Gly Leu Gly Leu

355 360 365

Cys Leu Ser Ile Ala Pro Ala Gly Ala Val Ala Thr Gly Ala Ala Val

370 375 380

Gly Ala Ala Ile Leu Ser Gly Gly Gly Ala Gly Leu Val Gly Ala Leu

385 390 395 400

Leu Leu Leu Ala Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Leu Gly Thr Ala Gly

405 410 415

Gly Val Met Thr Val Leu Ile Pro Ala Ala Thr Thr Ile Pro Thr Leu

420 425 430

Leu Gly Gly Val Pro Ser Thr Thr Ser Ala Ala Gly Pro Gly Val Leu

435 440 445

Ile Gly Val Thr Gly Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Leu

450 455 460

Leu Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Ile Pro Pro Ala Pro Ala Gly Val

465 470 475 480

Pro Gly Ile Thr Val Cys Pro Ala Ile Ala Ala Ala Gly Ile Leu Ala

485 490 495

Val Ser Ala Gly Ala Leu Thr Thr Gly Gly Leu Ala Leu Ile Thr Ile

500 505 510

Thr Ala Ala Leu Gly Ala Leu Ser Leu Gly Gly Ile Gly Leu Met Val

515 520 525

Gly Gly Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ala Gly Gly His Leu Leu Leu

530 535 540

Val Gly Ser Leu Ala Ala Leu Gly Ala Thr Ala Thr Ala Met Ala Ala

545 550 555 560

Thr Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Gly Leu Leu Ser Pro Gly Ala Leu

565 570 575

Leu Leu Ile Gly Ala Ala Ile Ala Gly Ala Ile Ala Thr Leu Ala Ser

580 585 590

Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Ala Leu Val Leu Gly Leu

595 600 605

Gly Ser Ile Cys Ala Pro Ile Ile Ala Leu Met Thr Gly Gly Gly Ala

610 615 620

Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ser Met Gly Ala Ala Val Pro Ala Gly Ala

625 630 635 640

Ala Gly Ala Gly Pro Leu Ile Gly Gly Val Ala

645 650

<210> 2

<211> 1943

<212> DNA

<213> 热休克蛋白70kDa(Heat shock protein 70kDa)

<400> 2

atggctggta aaggtgaagg acctgctatt ggaatagatc taggaacaac atattcttgt 60

gttggtgttt ggcaaaacga ccgtgtcgag atcattgcta atgatcaagg gaacagaacg 120

acaccgtctt atgtcgcatt tactgattcc gagaggctca ttggtgatgc tgctaagaac 180

caggtcgcca tgaacccaac caacactgtt tttgatgcca aacgtcttat tgggcggaga 240

tttagtgatg catctgtaca aagtgacatc aagttatggc ctttcaaggt taattctggc 300

cccgctgaga aaccaatgat tgctgtcaac tacaaaggtg aagagaagca attctctgca 360

gaggaaatct cttcaatggt tttaatcaaa atgaaggaaa ttgccgaagc tttccttggg 420

acaacggtaa aaaatgctgt ggtcactgtc cctgcttatt tcaatgactc acaaaggcag 480

gcaaccaagg atgctggtgt gatctcgggt ctaaatgtca tgcgtatcat caatgagcca 540

actgctgctg cgattgctta tggtcttgac aaaaaagcaa ccagcgttgg tgagaagaac 600

gtgctgatct ttgatcttgg tggcggtact tttgatgtgt ctcttttgac aatcgaagag 660

ggtatttttg agtttaaatc gacagctggt gacactcacc ttggtggtga ggattttgat 720

aacagaatgg tgaaccactt tgtgcaagag tttaagagaa agaataagaa ggatattacc 780

gggaacccaa gagctcttag gaggttgagg acatcctgtg aaagagccaa gagaacttta 840

tcgtccactg ctcagaccac tattgaaatt gattctttgt acgagggtgt tgatttctat 900

tccacaatta ctcgtgctag attcgaggaa ctgaatatgg atctattcag gaagtgtatg 960

gagcctgttg agaagtgttt aagagatgct aagatggaca aaagtacagt ccatgaaatt 1020

gttctagttg gtgggtctac cagaatccca aaagtgcaac aactacttca agatttcttt 1080

aacggcaaag agctctgtaa gagcatcaat cctgatgaag cagttgcata tggtgcagca 1140

gttcaagctg caatcttgag cggcgaggga aacgagaagg ttcaagattt acttcttttg 1200

gatgtcactc ctctgtcaac tggacttgag actgctggtg gtgtcatgac tgttttgatt 1260

ccacgaaaca caaccatccc gacaaagaaa gagcaagtat tctcaacata ttcagacaac 1320

caaccgggtg tcttgattca ggtttatgaa ggtgagagaa caaggacaag agataacaat 1380

ttgcttggta aatttgagct ttctggcatt cctcctgccc caagaggcgt cccacaaatc 1440

acagtctgct tcgacattga tgccaatggc attcttaatg tctcggctga agacaagacc 1500

actgggcaga agaacaagat caccatcacc aacgacaagg gaaggctttc aaaggatgaa 1560

attgagaaga tggttcaaga ggcagagaag tacaaggcag aggatgaaga gcataagaag 1620

aaggtcgagt ctaagaatgc attggagaat tatgcataca acatgagaaa cacgatccag 1680

gatgagaaga ttggggagaa gcttagctcc gacgagaaga agaagattga ggatgctatt 1740

gatgaagcga tcacttggtt agataacaac cagcttgcgg aggctgatga gtttgatgac 1800

aaagtgaaag agcttgagag cgtttgtaac ccaatcattg caaaaatgta tcaaggtggt 1860

gctggggatg ctgctggtgc gtcaatgggt gatgatgtac ctgctggtgc aaacggtgct 1920

ggccctaaaa ttgaggaggt taa 1943

Claims

1.一种蒿属植物花粉过敏源，其特征在于，所述蒿属植物花粉过敏源为热休克蛋白70kDa，所述热休克蛋白70kDa的氨基酸序列如SEQ NO.1所示；编码所述热休克蛋白70kDa的基因的碱基序列如SEQ NO.2所示。

2.如权利要求1所述的花粉过敏源在花粉过敏诊断中的应用。

3.如权利要求1所述的花粉过敏源在制备检测花粉过敏试剂中的应用。

4.如权利要求1所述的花粉过敏源在制备花粉过敏检测试剂盒中的应用。

5.如权利要求1所述的花粉过敏源在制备用于治疗花粉过敏的药物中的应用。

6.如权利要求1所述的花粉过敏源在花粉过敏病人筛查中的应用。

7.如权利要求1所述的花粉过敏源在花粉过敏诊断中的应用。

8.如权利要求1所述的花粉过敏源在制备用于预防花粉过敏的保健食品中的应用。

9.如权利要求1所述的花粉过敏源在制备用于预防花粉过敏的抗体中的应用。

10.一种花粉过敏检测试剂盒，其特征在于，所述花粉过敏检测试剂盒包括如权利要求1所述的花粉过敏源。