CN1665530A - 免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了免疫原性组合物，其包括融合蛋白和皂苷佐剂。所述融合蛋白包括融合于核心多肽N－端和/或C－端的异源疏水肽。所述核心多肽包括至少一个保护性表位。该组合物中皂苷佐剂以游离形式存在。同样提供的还有疫苗，其包括该免疫原性组合物以及任选的附加免疫活性成分。还提供了制备此类疫苗的方法、以及所述免疫原性组合物用于制造疫苗的用途。

Description

免疫原性组合物
本发明涉及免疫原性组合物，其包括融合蛋白和皂苷佐剂。也涉及疫苗、制备疫苗的方法、以及免疫原性组合物的用途。
在现代人类和兽医学中，人类和动物将会被定期接种疫苗以或多或少地预防令人虚弱的疾病或传染病，或者确保一定的经济收益性。在2000年仅用作兽医疫苗接种的生物制品的市场价值就为25亿美元(Wood-Mackenzie，2001)。任何疫苗接种策略的目的在于在受试者中实现免疫系统激活的状态，这将保护其免于感染或疾病(的症状)。为产生免疫保护，将感染性因子(的一部分)以能够使免疫系统产生保护性应答的方式呈递给受试者。通过免疫记忆现象，当将来发生此疫苗接种所瞄准的真正感染时，受试者的免疫系统被触发，以更加容易且强烈地作出反应。
为此目的，疫苗通常是由靶向的感染性因子或其部分制备的，例如通过使用活性、活性减毒或杀死形式的传染微生物，或者其蛋白质亚单位或核酸。理想地，所有这些都将包括(或编码)可在人类或动物靶标中诱发期望的保护性免疫应答的抗原性结构。
出于安全性的原因，优选亚单位疫苗。亚单位则可介由(重组)核酸分子的表达通过表达系统的细胞产生。
只有当抗原能够诱发降低感染或疾病迹象的免疫应答时，它才被称之为保护性抗原或免疫原。
因此在亚单位疫苗领域，表达的蛋白可能是抗原性的，但多数时候发现不是免疫原性的。更别提具有足够的免疫原性，以产生在实地条件下有效而且经济上可行的疫苗了。
然而，亚单位免疫原性的优化可能负面地干扰获得足够的表达产率。这可能是由于过表达可能会导致用于蛋白表达的细胞机器超负荷并崩溃、或者用于表达异源蛋白的表达系统多数时候并不表现出与蛋白天然地表达的细胞中所发生的相同的翻译后修饰的事实而引起的。例如，提供分泌或表面暴露的疏水信号序列的加工通过与细胞的细胞器或外膜相互作用，可能会在表达系统的细胞中产生问题。因此常见的作法是在细胞表达系统中生产没有C-端疏水锚定信号的蛋白亚单位，并缺失或修饰N-端信号序列。然而该途径的不利之处在于这通常导致低免疫原性。
为克服以这种方式产生的蛋白的低免疫原性的问题，通常采用的是向亚单位抗原添加佐剂(免疫刺激物质)。此类物质相对便宜，且能够非常有效。通常利用的佐剂有铝盐、油乳剂、脂质A和皂苷。然而这些物质大多数在施用部位以组织刺激的形式导致某种局部反应。这造成受试者的不适，并且在兽医应用的情况下，可能导致生产力(如奶或蛋产量、饲料转化)下降或屠宰场肉或畜体的禁止食用。
这些佐剂之中，发现有效浓度下具细胞毒性的一个是奎拉雅属(Quillaja)皂苷。当然，施用皂苷的局部反应类型和强度取决于使用的量，并且也取决于该材料的纯度或者所使用的特定批次。B.Rnnberg等(1995，Vaccine，vol.13，p.1375-1382)描述了奎拉雅属皂苷衍生物不同级分的溶血细胞毒性。对不同级分而言，毒性浓度在5和100μg/ml之间变化。局部反应据观察从肿胀到皮肤退化变化不一，并且甚至有实验所用小鼠的死亡。在类似的研究中，Pillion等(1996，J.Pharm.Sci.，vol.85，p.518-524)描述了奎拉雅属皂苷衍生物在0.006和1.5mM之间的浓度造成红细胞溶血。Leung等(1997，BBA vol.1325，p.318-328)描述细胞溶解的原因在于游离皂苷与细胞膜中的胆固醇反应。
防止皂苷的毒性压倒其佐剂活性的常见方式是掺入到免疫刺激复合物(ISCOM)(WO 9611711)中。这些复合物是通过混合皂苷、磷脂和胆固醇形成的。在正确条件下形成具笼状结构的颗粒。当整合了抗原性蛋白时，可产生微粒结构，该结构将这些抗原呈递到表面，由此模拟抗原在感染细胞上的“天然”呈递(综述于Morein，B.和K.L.Bengtson，1999，Methods，vol.19，p.94-102和EP109.942之中)。
或者可以生产ISCOM-基质颗粒。这些是ISCOM-样颗粒，其中亚单位抗原并不整合，而是后来添加的。
在这两种情况下，奎拉雅属皂苷的细胞毒性效应都得以中和。通过在ISCOM中整合携带表位的融合肽，Hsu等(1996，Vaccine，vol.14，p.1159-1166)选择了这样的途径。
不幸的是，ISCOM及ISCOM-基质的产生复杂且昂贵，因此使得其对于例如兽医学上的一般应用来说不经济。使用游离形式的皂苷(即不整合到ISCOM中)不太复杂，且便宜。然而，在作为佐剂正常有效的浓度下，可能出现皂苷细胞毒性的不利之处，如上文所提到的那样。
本发明的目的在于首次提供佐以皂苷的蛋白质抗原的免疫原性组合物，其按成本有效生产水平计，确实提供有效的免疫刺激，而没有显著的不利局部效应。
现在令人惊讶地发现，通过将疏水肽与免疫原性蛋白质的核心融合，该融合蛋白能够与如此低浓度的游离皂苷组合，从而所得组合物不会导致不利的局部效应，而仍然诱导有效的免疫应答。
这与在ISCOM和ISCOM-基质颗粒中掺入皂苷以克服细胞毒性的普通习惯相反。同样这也与由在异源表达系统中表达的亚单位蛋白习惯性去除疏水氨基酸(aa)区段相抵触。表达系统中融合蛋白产量可能的损失通过就游离皂苷而言提高的免疫原性以及下降的不利局部反应而得到了弥补。
因此，本发明首次提供了佐以皂苷的亚单位疫苗，其足够安全、在免疫学上有效且具有经济可行性。
因此，在第一方面，本发明提供了免疫原性组合物，包括融合蛋白和皂苷佐剂，其特征在于所述融合蛋白包括融合于核心多肽N-端和/或C-端的异源疏水肽，所述核心多肽包括至少一个保护性表位，所述皂苷佐剂以游离形式存在。
免疫原性组合物应理解为经给受试者给药后，诱导该受试者的免疫应答，使感染或疾病下降的组合物。这意味着刺激免疫系统成分。这些可以是细胞成分例如B或T淋巴细胞、巨噬细胞、杀伤细胞、抗原提呈细胞(APC)等，或者免疫系统的体液成分，例如抗体、细胞因子(如干扰素或白介素)等。
为了本发明的目的，术语“蛋白”是指氨基酸分子链。蛋白并不限于特定长度，且如需要，可在体内或在体外通过例如糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修饰。其中，肽、寡肽和多肽包含在该定义之内。蛋白或肽可以是天然或合成来源的。
融合蛋白是两条或更多条氨基酸链的天然不存在的集合。所述氨基酸链可以等长，但通常它们长度不同，其中异源疏水肽优选短于核心多肽。氨基酸链的结合可通过多种手段实现，如
-化学上，通过脱水、酯化等直接或间接通过中间体结构对氨基酸序列进行偶联、缀合或交联。
-物理上，通过在高分子结构之中或之上的俘获进行偶联。
-通过联合包含了编码两蛋白中每一个的核酸片断的重组核酸分子进行分子生物学融合，从而单个连续的表达产物得以最终产生。
皂苷为表面活性的糖苷，可通过提取自植物中获得。众所周知的皂苷是，其由南美皂树奎拉雅属皂树(Quillaja saponaria[Molina])的树皮提取而得的Quillaja皂苷(Dalsgaard，K.，1974，Arch.Gesamte Virusforsch.vol.44，p.243-254)。取决于提取方法，将获得不同的皂苷制剂。多种奎拉雅属皂苷是商业上可获得的：Iscotec AB，Sweden的SpikosideTM、Superfos AS，Denmark的QuilATM、Nor-Vet，Denmark的Q-vacTM以及Antigenics，USA的QS-21TM和Desert King，Chili的Vax-SapTM。有些是粗制品，而其它的是更为纯化的制剂。
为了本发明的目的，如果皂苷还没有被有目的地与胆固醇和磷脂混合以产生ISCOM或ISCOM-基质颗粒，它是游离形式的。
一般而言佐剂是以非特异性方式加强接受受试者的免疫应答的物质。
待与疏水肽相连的核心多肽系不含存在于该蛋白天然形式之中的N-端或C-端疏水区的多肽。因而本发明的核心蛋白是来自因子或生物体的蛋白组分。不含疏水末端的蛋白无需对其天然组成进行进一步修饰，以天然形式就可作为“核心”。
这些疏水区可利用化学或酶学操作自蛋白切除。优选地，编码此种蛋白的核酸序列通过遗传工程技术以这种方式修饰，从而使这些疏水区不再表达。
原则上任何具有医学重要性的蛋白都可作为本发明的核心多肽。优选核心多肽为已知或预期可对人类或动物造成疾病的感染性因子或生物学因子的组分。例如导致癌症、HIV或AIDS、(自身)免疫病、神经学、神经退行性变、呼吸道或皮肤疾病的感染性因子或因子。
更优选核心多肽为在疫苗接种研究中(例如在由感染性因子分离之后，通过用作活重组运载微生物(LRCM)中的插入物，在表达系统中表达后，或者在用作为DNA疫苗之后)已表现出免疫原性潜能的蛋白组分。
能够用作本发明的核心多肽的此类蛋白的实例有来自包膜、基质蛋白、细胞器或细胞核的蛋白，或者来自寄生虫、细菌或病毒的非结构性蛋白或糖蛋白，以及它们在宿主中诱导或与之相互作用的蛋白。
甚至更为优选地，核心多肽是下列蛋白的组分：
·寄生虫蛋白：例如来自艾美球虫属的寄生虫酶(可溶的或内部的)、或者可溶保护性抗原例如来自巴贝虫属(Babesia)的外抗原或裂殖子(merozoite)表面抗原。
·病毒蛋白：如来自逆转录病毒的蛋白：包膜蛋白gp20、gp40、gp120、rev、tat或nef蛋白、逆转录病毒组特异性抗原；新城疫病毒融合或血凝素-神经氨酸酶蛋白；流感病毒血凝素或神经氨酸酶蛋白；双RNA病毒VP2；冠状病毒刺突或基质蛋白；瘟病毒包膜蛋白Ems、E1或E2；猪生殖和呼吸道疾病病毒的病毒蛋白。
·细菌蛋白：例如毒素、粘附素、纤维蛋白、纤毛蛋白、基柱蛋白或外膜蛋白。
·诱导的蛋白：例如白介素；干扰素；癌抗原例如来自p53级联、HER-2/Neu、癌胚抗原；肿瘤诱导的血管发生因子象纤连蛋白或神经节苷脂；受体分子。
用于本发明之目的的术语异源是指疏水肽相对于其待连接的核心多肽而言的来源。因而如果肽不是特定物种的生物体或因子中核心多肽作为其组分的同一蛋白的一部分，它是异源来源的。例如，如果来自牛巴贝虫(Babesia bovis)的Bd37蛋白的C-端疏水肽待与来自分歧巴贝虫(B.divergens)的Bd37蛋白同系物的核心多肽融合，则其符合作为异源肽的要求。
一般而言，疏水肽应理解为对非极性环境具有偏好的氨基酸链。此类肽在本领域也被称作亲脂性或水不溶性的。以建立了多种能够评估肽的疏水性的计算机算法。为了本发明的目的，采用的是Kyte &Doolittle的亲水性算法(J.Kyte和R.F.Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，vol.157，p.105-132)。这种广泛采用的程序计算某一窗口氨基酸自由转移能的移动平均值(moving average)，由此产生可表现为数据点表格或表现为图表的疏水性分布图。表格中移动平均值数字为正指示疏水氨基酸；图表描述的疏水性分布图中，低于中线的部分是疏水性的。
该算法在多数用于蛋白分析或结构预测的软件包中、以及通过互联网借助于多数生物信息学研究所的网页可获得。
对于本发明，如果60％或更多个来自Kyte-Doolittle疏水性分析的数据点显示疏水值，则肽被认为是疏水性的；所述疏水性必需利用5个氨基酸的窗口计算。疏水性百分比由来自这种分析的数据表计算：疏水数据点(移动平均值数字为正)的数目除以肽的氨基酸总数。优选70％来自Kyte-Doolittle疏水性分析的数据点是疏水性的，更优选80％、85％、90％、95％、98％或100％，优选等级渐增。
为举例说明Kyte-Doolittle疏水性分布图，表1描述了可用于产生本发明的融合蛋白的来自多种来源的疏水肽，而与之相伴的疏水性分布图示于图1。该图也列出了疏水性百分比。
用于本发明的疏水肽优选包含3到200个氨基酸之间的序列，更优选4到150个，甚至更优选4到100个，还甚至更优选5到75个，并且更优选6到50个氨基酸。
可用于产生本发明的融合蛋白的疏水肽可来自其来源的供体蛋白的不同区域。例如：
·N-端：
N-端疏水肽例如信号序列可来自各种各样的蛋白质如蜂毒肽(蜂蜜毒)、人组织纤溶酶原激活剂(TPA)、酵母交配信息素α-因子、杆状病毒包膜糖蛋白gp67或假狂犬病病毒gX。这些信号序列由Izard和Kendall(1994，Mol.Microbiol.，vol.13，p.765-773)、Claros等(1997，Curr.Opin.Struct.Biol.，vol.7，p.394-398)以及Lammertyn和Anne(1998，FEMS Microbiol.Lett.，vol.1，p.1-10)综述。
·内部：
内部疏水肽序列有例如跨膜区(TMR)，这些肽可位于蛋白的N-端或C-端附近，而且也还在内部，例如在具有跨膜片断的蛋白的情况下。实例有来自麻疹病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的膜锚点；跨膜信号受体象“七跨膜结构域”受体；膜通道；细胞孔隙及泵等。此类信号由Goder和Spiess(2001，FEBS Lett.，vol.31，p.87-93)、von Heijne和Manoil(1990，Protein Eng.，vol.4，p.109-112)以及普通教科书象Alberts等的《细胞分子生物学》(2002，Garland Sciencepubl.，ISBN：0815340729)综述。
·C-端：
C-端疏水肽有例如糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号，例如来自人类CD14(单核细胞分化抗原(NCBI蛋白数据库登录号P08571)，鸡TGF-β神经营养因子受体1(NCBI登录号013156)，以及酿酒酵母胞壁蛋白1(见表1和图1)的C-端。此类GPI锚点的特征由P.Englund(1993，Ann.Rev.Biochem.，vol.62，p.121-138)以及Chatterjee和Mayor(2001，Cell.Mol.Life Sci.，vol.58，p.1969-1987)综述。
NB：NCBI蛋白和核酸序列数据库可通过互联网http：//www.ncbi.nlm.nih.gov进入，而且其用于获得核酸或蛋白序列目的的用途是本领域众所周知的。
表1：可用于本发明的疏水肽的实例
供体蛋白            NCBI   供体中肽的定位   肽的氨基酸序列(自N-端到C-端)
  登录号   氨基酸编号
  蜂毒肽   AAK92098   1-21   N-端   MKFLVNVALVFMVVYISYIYA
DAF B26359 352-381 C-端   TSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT
  CWP1   BAA07193   219-239   C-端   GAKAAVGMGAGALAVAAAYLL
  MV HN   P35971   35-58   内部   PYVLLAVLFVMFLSLIGLLAIAGI
  HHV-4 EBNA-3C   S27922   281-300   内部   EENLLDFVRFMGVMSSCNSS
DAF＝衰变加速因子(CD 55)；CWP 1＝酵母菌胞壁蛋白1；MV HN＝麻疹病毒血凝素-神经氨酸酶；HHV-4 EBNA-3C＝人类疱疹病毒4，核抗原EBNA-3C。
用来计算示于图1的疏水性分布图的计算机包(Clone Manager，SeiEd software，Durham，USA)将超过零的数值归结于疏水氨基酸段，而亲水段得分为负值。移动平均值以5个氨基酸的窗口计算。
不用说当使用不同的计算机包计算此分布图时，可能稍有差异。不过，疏水和亲水氨基酸区之间的区别将依然清晰。
文献中，通常表达融合蛋白以便于下游加工期间的纯化。然而，用于彼目的的融合肽不符合作为本发明的疏水肽的要求。
表位应理解为T细胞受体会对其作出应答、或者B细胞将对其产生抗体的抗原性分子的一部分。因此用于本发明的保护性表位将诱导特异性T细胞、或激活B细胞产生特异性抗体，从而这些细胞或抗体引起免疫反应，干涉侵染或疾病的病程。因而，通过此类保护性表位，可产生保护性免疫应答。
保护性表位包含在用于本发明的融合蛋白的核心多肽部分中。
与核心多肽相连的异源疏水肽也可以包含表位。融合蛋白中不止一个表位的存在甚至可以增强本发明的融合蛋白的免疫功效。
当前，存在多种技术可用来容易地识别蛋白表位。一种尤其适于检测B细胞表位的经验性方法是所谓的PEPSCAN法。这由Geysen等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.81，p.3998-4002(1984)、J.Imm.Meth.vol.102，p.259-274(1987)和专利申请WO84/03564及WO 86/06487以及美国专利号no.4,833,092中描述。所述PEPSCAN法是容易实施、快速且为大家所公认的用于表位检测的方法。它包括合成与待研究的蛋白渐进地重叠的系列肽片断，并随后用该蛋白的特异性抗体测试这些多肽。
同样，给定任何蛋白(其编码基因)的氨基酸(或核酸)序列，都存在能够基于其与目前已知表位的序列和/或结构一致性，标明作为免疫学上重要的表位的特定蛋白区的计算机算法。这些区域的确定是建立在根据Hopp和Woods(Hopp T.P and Woods，K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，vol.78，p.3824-3828)的亲水性标准与根据Chou和Fasman(Adv.In Enzymology，vol.47，p.45-148(1987)以及美国专利4,554,101)的二级结构方面的组合的基础上的。采用此类算法组合的程序实例是PepPlot(Gribskov等，1986，Nucl.Acids Res.vol.14，p.327-334)。
由于T细胞表位正常地隐藏在蛋白的疏水区，其折叠远离极性亲水的外部(这里通常是B细胞表位的位置)，待与核心多肽融合的异源肽的疏水特点尤其适用于掺入T细胞表位。
如由Berzofsky等(1987，Immunol，Rev.，vol.98，p.9-52)所综述的那样，T细胞表位由短的氨基酸线性区段组成，并且只能在MHC-I的环境下，在其被APC加工后呈递给免疫系统。
许多实例中的一个是来自人疱疹病毒4的EBNA-3C核抗原(NCBI登录号S27922)，也描述在表1和图1中。
T细胞表位可象B细胞表位一样，通过计算机借助于Berzofsky的两亲性标准(1987，Science，vol.235，p.1059-1062)自序列中预测。这由Lu等(1992，Vaccine vol.10，p.3-7)综述。采用这些方法的功效的举例说明由H.Margalit等(1987，J.of Immunol.，vol.138，p.2213-2229)公开，其描述运用此类方法预测T细胞表位的成功率为75％。
所述异源疏水肽和/或核心多肽也可以含有其它免疫激活特征。此类特征可包括象来自趋化因子或免疫毒素的免疫刺激信号。
产生本发明的融合蛋白的优选方式是使用遗传工程技术和重组表达系统。这些可包括使用(重组)核酸序列、LRCM及宿主细胞。
可用于编码本发明的融合蛋白的核酸序列可通过熟练技术人员众所周知的标准分子生物学技术获取、操作和表达，并且在标准教科书如Sambrook和Russll：Molecular doning：a laboratorymanual(2000，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；ISBN：0879695773)中极为详细地进行了说明。
为构建编码本发明的融合蛋白的核酸，优选采用DNA质粒。此类质粒可用于例如增大DNA-插入物的含量、用作为探针、以及作为进一步操作的工具。用于克隆的此类质粒的实例有pBR、pUC及pGEM系列，所有这些都可从多家商业供货商获得。
编码多肽核心和疏水肽的DNA可以例如克隆到不同的质粒上，经修饰以获得期望的构象，然后组合到一个重组质粒中；所述肽及核心的读框以此方式排列，从而使可表达单个连续的融合蛋白。
能够编码本发明的疏水肽和/或核心多肽的核酸序列的修饰可通过例如限制性酶消化、通过定点突变、或通过聚合酶链式反应(PCR)技术实施。例如，用于实施PCR的标准技术和方案详尽地描述在C.Dieffenbach和G.Dveksler；PCR primers：a laboratory manual(1995，CSHL Press，ISBN879694473)中。
为了蛋白纯化、检测、或提高表达水平的目的，可添入附加序列。这可导致重组核酸分子或质粒中的最终插入物大于编码疏水肽和核心多肽融合物的序列。当此类附加元件以正确的读码插入时，这些元件变成本发明融合蛋白的完整的一部分。
由重组核酸分子表达核酸序列的必要条件是核酸可操作地连接于转录调控序列，从而使它能够控制核酸序列的转录。转录调控序列是本领域众所周知的，并且包含启动子和增强子。对本领域技术人员显而易见的是启动子的选择延及能够指导基因转录的任何真核、原核或病毒启动子，只要该启动子在所用的表达系统中具有功能。
细菌、酵母、真菌、昆虫和脊椎动物细胞表达系统被极为频繁地利用。此类表达系统是本领域众所周知的，并且一般可在商业上例如由Invitrogen(the Netherlands)获得。
可用于表达本发明的融合蛋白的宿主细胞可以是细菌来源的细胞，如来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)或新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)，并联合应用细菌来源的质粒或噬菌体，用以表达编码融合蛋白的序列。宿主细胞也可以是真核来源的，如酵母细胞联合酵母特异性载体分子，或者高等真核细胞，象昆虫细胞(Luckow等Bio-technology 6：47-55(1988))联合载体或重组杆状病毒；植物细胞联合如基于Ti-质粒的载体或植物病毒载体(Barton，K.A.等Cell vol.32，p.1033(1983))；或者哺乳动物细胞如Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或Crandell-Rees猫肾细胞，连同合适的载体或重组病毒。
表达的本发明的融合蛋白的实例是禽流感病毒H5 HA蛋白核心(如可来源于NCBI登录号CAC28131)，融合于异源疏水序列，并在杆状病毒表达载体系统中表达，见实施例4。
除了这些表达系统，植物细胞或基于寄生虫的表达系统是有吸引力的表达系统。寄生虫表达系统描述在例如法国专利申请公开号2 714074和美国NTIS公开号US 08/043109(Hoffman，S.和Rogers，W.，1993)中。用于生物学应用的多肽的植物细胞表达系统在例如R.Fischer等(1999，Eur.J.of Biochem.，vol.262，p.810-816)以及J.Larrick等(2001，Biomol.Engin.vol.18，p.87-94)中讨论。
表达也可以在所谓的无细胞表达系统中进行。此类系统包括用于由可操作地连接于在此特定系统中行使功能的启动子的合适的重组核酸表达的所有必需因子。实例有大肠杆菌裂解物系统(Roche，Basel，Switzerland)或兔网织红细胞裂解物系统(Promega corp.，Madison，USA)。
在本发明这方面优选的形式中，根据本发明的免疫原性组合物的特征在于所述核心多肽是顶端复合物门(Apicomplexa)生物体的蛋白质的组分。
属于顶端复合物门的多个分类组具有(兽医)医学相关性，如梨浆虫目(Piroplasmida)、球虫纲(Coccidia)和Hemosporida。例如，本发明可极好地用于产生融合蛋白，其包括融合于异源疏水肽的Plasmodium yoelii MSP-119核心(Ling等，1994，Parasite Immunol.，vol.16，p.63-67)。
在更为优选的形式中，根据本发明的免疫原性组合物特征在于所述核心多肽为梨浆虫目(Piroplasmida)或球虫纲(Coccidia)生物体的蛋白质的组分。
属于梨浆虫目的有若干相关的分类组，如Babesiidae和Theileriidae，具有各自相应的属例如巴贝虫属(Babesia)和泰勒尔梨浆虫属(Theileria)。
属于球虫纲的有艾美球虫科(Eimeriidae)、Cryptosporidiidae和Sarcocystidae，包括相关属例如艾美球虫属(Eimeria)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、Neospora和弓形体属(Toxoplasma)。
在这方面甚至更为优选的方面，根据本发明的免疫原性组合物特征在于所述核心多肽为艾美球虫属或巴贝虫属生物体的蛋白质的组分。
如上文所概括的，可用于产生本发明的融合蛋白的疏水肽可来自其来源供体蛋白的不同区域。例如N-端、内部或C-端。
因此，在本发明第一方面替代的优选实施方案中，异源疏水肽来自N-端疏水序列。
在本发明第一方面其它替代的优选实施方案中，异源疏水肽来自内部疏水序列。
在本发明第一方面其它又一替代的优选实施方案中，异源疏水肽来自C-端疏水序列。
在优选的实施方案中，C-端疏水序列来自衰变加速因子(DAF)。
衰变加速因子也称之为CD 55，在其C-端具有疏水氨基酸区。它起着GPI锚点的作用(由Nicholson-Weller和Wang，1994，J.Lab.Clin.Med.，vol.123，p.485-491综述)。其疏水性分布图在图1中举例说明。如表1所示，所用的DAF C-端氨基酸序列对应于氨基酸Thr-352直到且包括Thr-381，这是所述肽序列的最后一个氨基酸(NCBI登录号B26359)。
DAF C-端疏水区在融合蛋白构建体中的应用以前已有描述(如Field等，1994，J.Biol.Chem.vol.8，p.10830-10837)。不过这总是针对研究表面蛋白锚定及释放机制的目的。
本发明的融合蛋白克隆和表达的举例说明为例如将人类DAF C-端融合于分歧巴贝虫Bd37核心多肽，如实施例1和2所述。基于该融合蛋白的免疫原性组合物的免疫接种描述在实施例3中。
又在本发明第一方面另一优选的实施方案中，皂苷佐剂为奎拉雅属皂苷。
皂苷已在上文详尽描述。
在本发明第一方面最为优选的实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物特征在于所述融合蛋白包括C-端融合于来自DAF的C-端疏水序列的分歧巴贝虫Bd37核心多肽，而皂苷佐剂为Quil A。
寄生虫分歧巴贝虫通过节肢动物宿主传播，造成牛的巴贝虫病，并且对于人类而言是公知的动物源性寄生虫病。这由Kuttler，K.L.(″Babesiosis of domestic animals and man″，M.Ristic编辑，1988，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F1，USA综述。
分歧巴贝虫Rouen 1987分离物来源于人类巴贝虫病患者，并且被用于研究Bd37外抗原，如B.Carcy等(1995，Infect.& Immun.，vol.63，p.811-817)所述。相应cDNA的核苷酸序列可通过登录号AJ422214由NCBI数据库获取。可用作为本发明的核心多肽的Bd37的核心多肽包括所述Bd37序列(由NCBI登录号CAD19563可获得的蛋白序列)，不含N-端和C-端疏水序列。例如Bd37-核心由NCBI登录号CAD19563的Ser-25直到并包括Ser-316组成。
存在描述Bd37核心多肽的接种实验的出版物：N.Grande等(1998，Parasitology Int.，vol.47，p.269-279)用分歧巴贝虫外抗原(其中含类似于核心多肽的可溶性形式Bd37)以游离Quil A进行接种实验。然而未使用或考虑本发明的融合蛋白。
本发明的另一个方面涉及用于疫苗的免疫原性组合物。
本发明的另一方面涉及疫苗，特征在于它包括根据本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体应理解为不会不利地影响待接种受试者的健康的化合物，至少不到副作用比受试者未接种时看到的效应还严重的地步。
药学上可接受的载体可以是例如无菌水或无菌生理盐水溶液。在更为复杂的形式中，载体可以是例如缓冲液。
根据本发明的疫苗或具有附加免疫活性成分的疫苗可以还包括所谓的“运载体”。运载体是融合蛋白粘附在其上、但不与之共价结合的化合物。此类运载体有例如生物微胶囊、微褐藻酸盐、脂质体和macrosols，都是本领域公知的。另外，疫苗可包括一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂如SpanTM或TweenTM。
通常，疫苗与稳定剂混合，例如以防止倾向于降解的蛋白被降解，增加疫苗的保存期限，或提高冻干效率。可用的稳定剂有SPGA(Bovarnik等，1950，J.Bacteriology，vol.59，p.509)，糖类如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，以及缓冲液例如碱金属磷酸盐。另外，疫苗在施用前可悬浮于生理上可接受的稀释剂中。无需多说，添加辅料、添加运载化合物或稀释剂、乳化或稳定蛋白的其它方式也包括在本发明之中。
根据本发明的疫苗的优选实施方案涉及特征在于其包括至少一种附加免疫活性成分的疫苗。
附加免疫活性成分可以是抗原、免疫增强物质和/或疫苗；这些成分中的每一个都可包括佐剂。
当附加免疫活性成分为抗原形式时，所述成分可由具有人类或兽医重要性的任何抗原性实体组成。例如它可以包括生物学或合成的分子，例如蛋白、糖类、脂多糖、编码蛋白质性抗原的核酸、或包含可操作地连接于转录调控序列的此种核酸的重组核酸分子。同样，包含此种核酸、重组核酸分子的宿主细胞，或含此种核酸的LRCM可以是递送所述核酸或附加抗原的方式。或者，它可以包括分级分离的或杀死的微生物，例如寄生虫、细菌或病毒。
免疫增强物质形式的附加免疫活性成分可以例如包括趋化因子和/或免疫刺激序列(如CpG基序)。
备选地，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗本身可添加到疫苗中。
根据本发明的疫苗可根据本领域公知的方法向受试者给药，这取决于待预防的特定疾病。
此类方法包括如肠胃外施用，例如通过所有途径注射到皮肤中或通过皮肤注射：如肌内、静脉内、腹膜内、皮内、粘膜下或皮下。同样，它们可作为液滴、喷雾、凝胶或油膏通过局部施用于眼、鼻、口、肛门或阴道的粘膜上皮，或者身体任何部分的外表皮上而施用。其它可能的施用路径有喷雾、气溶胶、或经由呼吸道通过吸入的粉剂施用。在最后一种情况下，所用的颗粒大小将决定颗粒究竟深入到呼吸道多深。或者，施用可经由食道，作为粉剂、液体或片剂通过与食物、饲料或饮用水混合，或者作为液体、凝胶、片剂或胶囊通过直接给药到口中，或者作为栓剂给药到肛门。
无需多说，最佳的施用途径将取决于待预防或改善的感染或疾病特性，以及所用免疫原性组合物或疫苗的特点。
根据本发明额疫苗的靶标受试者可以是人类或动物；动物可以是鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类或哺乳动物。这些靶标可以是健康或患病的，并且可以是血清反应阳性或阴性的。靶标受试者可以是其易于接种和/或意欲预防的感染或疾病易感的任何年龄。
建立在本发明的融合蛋白基础上的疫苗能够非常适合于以每个受试者0.1和100微克蛋白之间的量给药，更小或更大的剂量原则上可以使用。
在已向受试者施用疫苗或药物化合物的部位可能观察到的副作用，在本领域通常称之为“局部”或“不利”反应，可以有各种方式观察和评分。
·观测：受试者的不适或嗜眠、体温升高、运动机能障碍、摄食量减少、产量(如奶、蛋)或者饲料转换率下降。
·宏观上：肿块大小、颜色、出血或水肿的存在、组织一致性、脓肿形成或坏死。
·微观上：病变在特定组织或细胞类型的定位、病变类型、严重度等。
本发明的优点之一在于皂苷佐剂能够以如此低浓度的游离形式使用，从而没有此类局部反应迹象的显著发展。
为了本发明的目的，根据特定的组合物和靶标物种，可使用每剂量1μg和5mg之间的皂苷浓度。
优选皂苷如此使用，使得不有意形成皂苷胶束(micelles)。例如对Quil A而言，这将意味着使用低于300μg/ml(0.03％)临界胶束浓度(cmc)的浓度(Morein，B.等，1984，Nature，vol.308，p.457-460)，而对于QS-21，低于26μM cmc的浓度(C.R.Kensil，Chapter 15，in：″Vaccine adjuvants″，D.T.O′Hagan编辑，Humanapress 2000，ISBN：0896037355)。在cmc处胶束形成的概念是本领域技术人员众所周知的，并且描述在例如Remington：″The scienceand practice of pharmacy″(chapter 21，20th ed.2000，Lippincot，USA，ISBN：683306472)中。
建立在根据本发明的免疫原性组合物基础之上的疫苗也非常适合于作为标记疫苗。
出于例如稳定性或经济的原因，本发明的疫苗或者具有附加免疫活性成分的疫苗可以被冻干。一般这将能够在高于零摄氏度的温度下延长贮藏。
冻干操作是本领域技术人员公知的；商业上可获得任何规模的冻干设备。
因此，在更为优选的实施方案中，本发明的疫苗特征在于它是冻干形式的。
本发明的其它方面是制备根据本发明的疫苗的方法，特征在于该方法包括混合根据本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。
所述免疫原性组合物和药学上可接受的载体能够以多种方式如通过混合组合为疫苗。所得疫苗可以是多种形式的，如液体、凝胶、油膏、粉剂、片剂或胶囊，取决于期望的向靶标施用的方法。
本发明的其它方面包括根据本发明的免疫原性组合物用于生产疫苗的用途。
现在本发明将参照以下非限制性的实施例进一步描述。
实施例
实施例1：重组构建体的克隆
Bd37 cDNA：
来自寄生虫分歧巴贝虫株系Rouen 1987的Bd37基因的分离和克隆已详尽地描述在EP 1050541，实施例1中。简要地，由分歧巴贝虫株系Rouen 1987侵染的人类红血球mRNA制备cDNA表达文库。用抗-Bd37多克隆抗血清对所述文库进行筛选。由阳性克隆回收插入物，并亚克隆产生质粒pBK-CMV-Bd37。
His+Bd37-核心
利用pBK-CMV-Bd37质粒(EP 1050541，实施例1)作为模板，扩增不含N-或C-端疏水序列的Bd37基因中央部分即Bd37插入物，使用的是引物pQEUp和pQEDown(见表2)，20个循环的1分钟94℃、1分钟55℃和1分钟72℃，使用200μM各种dNTP、200nM各引物、2.5UTurboPfuTM聚合酶(Stratagene)，终体积50μl。模板DNA根据期望的产量以50ng和1μg之间的量使用。
引物pQEUp产生符合读框的BamHI位点，而引物pQEDown产生HindIII位点。在BamHI-HindIII消化后获得核酸，其包括编码由Ser-25直到且包括Ser-316在内的Bd37蛋白核心(NCBI登录号CAD19563)的部分。
引物由Sigma-Genosys(Cambridge，UK)合成。
所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，上样到0.8％琼脂糖凝胶(电泳级，Eurobio，France)中，在0.5×TAE(由25×TAE贮液制备，Euromedex)中以100V于run-OneTM电泳系统(Bioblock，France)中跑胶纯化。从凝胶中切下对应于期望产物的条带，并利用凝胶提取旋转试剂盒(gel-extraction Spin kitTM)(Q-Bio-Gene)从凝胶中分离DNA，所述DNA片断由BamHI和HindIII消化，并再次凝胶纯化。
将所得片断连接到BamHI-HindIII消化的pQE-30载体(Qiagen)中，由T4 DNA连接酶(MBI Fermentas，France)在补充有2mM ATP(Sigma)的1×连接酶缓冲液(MBI Fermentas)中于室温下在3小时的期间内连接。载体∶插入物的比例通常为1∶3，其中所用消化载体的量在0.5和1μg之间。
在消化后连接前，质粒由小牛肠碱性磷酸酶(CIAP，Promega)在1×CIAP缓冲液(Promega)中于37℃进行磷酸酶处理1小时。
将连接混合物转化到JM109 supercompetentTM大肠杆菌细胞(Promega)中。将这些细胞涂布到含氨苄青霉素的琼脂板上，并通过蛋白小量表达对菌落进行Bd37蛋白表达的检查。简要地，由过夜培养物的10倍稀释液在LB培养基中起始小规模(5ml)细菌培养，在于37℃摇动温育2小时后，通过添加1mM IPTG(Euromedex)诱导重组蛋白的表达。诱导3小时之后，通过离心(15分，4000×g)收集细胞，并在1ml变性裂解缓冲液中裂解(8M尿素，1％v/v TritonX-100，50mMTris，pH＝8)。裂解物置于冰上以2秒脉冲-中断循环超声破碎2分钟并离心(15000×g，10分)。澄清的裂解物于冰上温育20分钟，在50μlNiNTA琼脂糖树脂(Qiagen)的存在下偶尔摇动。上样的树脂由1ml洗涤缓冲液(8M尿素，1％v/v TX-100，50mM Tris，pH＝6.3)洗涤3次，而蛋白由洗脱缓冲液(8M尿素，1％v/v TX-100，50mM Tris，pH＝4.5)洗脱。在由考马斯亮兰(CBB)染色的12％聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE并由抗-His标签单克隆抗体(Qiagen)通过蛋白质印迹评估重组蛋白的存在。
由Bd37表达阳性的氨苄青霉素抗性菌落在5ml LB培养基中于37℃摇动过夜温育制备细菌培养物，并利用JetQuickTM miniprep试剂盒(Q-Bio-Gene，France)由2ml过夜培养物分离质粒pQE-His-Bd37。
通过利用pQE-30载体，6aa的组氨酸接头以正确的框架融合于Bd37核心多肽。
His+GST
利用类似于上文所述用于6xHis-Bd37-核心构建体的操作制备pQE-His-GST。利用质粒pGEX4T1TM(Amersham biosciences)作为引物pQEGSTUp和pQEGSTDown(见表2)的模板，以这种方式扩增谷胱甘肽-S-转移酶基因。凝胶纯化PCR产物，BamHI和HindIII消化，并连接到消化的去磷酸化的pQE-30载体中。以这种方式6×组氨酸多肽和GST肽以正确的框架融合在一起。
His+Bd37-核心+DAF
编码6xHis-Bd37-DAF蛋白的DNA片断在三轮PCR之后构建：在第一轮中，利用pBK-CMV-Bd37质粒作为引物T3和Bd37recursUpo(见表2)的模板。所得PCR产物以凝胶纯化，并用作为第二轮PCR的模板：100ng PCR产物用50nM引物Bd37recursEnd以及引物T3和Bd37DAFc各400nM扩增。所得PCR产物含Bd37核心，带有其天然的N-端疏水序列和C-端融合的DAF C-端疏水区。该PCR产物由凝胶纯化，并通过与Taq聚合酶(Sigma)在包含1mM ATP的扩增缓冲液中于72℃温育30分钟提供3′脱氧腺苷突出，然后利用TOPO TATM克隆试剂盒(Invitrogen)克隆到质粒pCR-II(Invitrogen)中。最后该构建体用作为引物pQEUp和pQEBd37DAF的模板，以引入BamHI和HindIII限制性位点，并除去N-端信号序列。将该片断如上所述克隆到消化的去磷酸化的pQE-30载体中。完成的构建体通过DNA-序列分析验证，由Genome Express S.A.(Meylan，France)利用Big Dye终止剂法进行。所得插入物包括N-端融合于6xHis而C-端融合于DAF-C-端疏水区的Bd37-核心。
GST+Bd37-核心
利用与上文所概括的相似的操作，构建能够表达以正确读框融合的GST肽和Bd37核心多肽的质粒。为此目的，利用pBK-CMV-Bd37质粒作为引物pQEUp和pQE70N的模板。这些引物为所得扩增片断提供正确读框的BamHI限制性位点。所得PCR产物用BamHI消化，并连接到BamHI消化且去磷酸化的pGEX载体中。将连接产物转染到JM109细胞中，细胞涂板，分离pGEX-GST-Bd37质粒，并通过蛋白小量表达法验证重组蛋白的表达，如上文所述那样(除了裂解缓冲液为含1mg/ml溶菌酶和1％v/v TX-100的PBS，洗涤缓冲液与所述裂解缓冲液相同，且洗脱在含45mM谷胱甘肽(Sigma)的50mM Tris，pH＝8中进行以外)。
能够由这些质粒插入物表达的各种重组(rec)蛋白以图表的形式示于图2之中。
表2：Bd37构建体的构建中所用的引物和接头
 名称  DNA引物序列(从5’到3’) SEQ ID NO
 T3  ATTAACCCTCACTAAAGGGA     1
 pQEUp  AATGGCAATAATGGATCCTGCACCAATCTC     2
 pQEDown  GAAGGATGGCTTAAGCTTACTAGATCCCTG     3
 pQEGSTUp  ACACAGGAAACAGGATCCATGTCCCCTATA     4
 pQEGST-Down  CGCGAGGCAGATAAGCTTTCAGTCACGATG     5
 Bd37recursUp  CGTGTGCCCAGATAGAAGACGGGTAGTACCTGAAGTACTAGATCCCTGACCTGATCCTGCAGC     6
 Bd37recurs-End  CGTCTTCTATCTGGGCACACGTGTTTCACGTTGACAGGTTTGCTTGGGACGCTAGTAACCATGGGCTTGCTGACTTAG     7
 Bd37DAFc  CTAAGTCAGCAAGCCCATGGTTAC     8
 pQEBd37-DAF  CCCAAGCTTCTAAGTCAGCAAGCCCAT     9
 pQE7ON  TGGCTTCTTAGGACTGGATCCCTGACCTGA     10
 Bd37HG3’-forw  CGATTTCGCTGCTGTACCTTCTTCTTTGTCTGCCATTGTCTTCGGTATCATTGTATCAATGTTCCG     11
 Bd37HG3’-rev  GTCCGGAACATTGATACAATGATACCGAAGACAATGGCAGACAAAGAAGAAGGTACAGCAGCGAAAT     12
实施例2：重组蛋白的表达
细菌蛋白表达：
细菌转染：
对于每一个待表达的重组蛋白，通过电穿孔转染大肠杆菌过夜预培养物。将pQE质粒的构建体转染到大肠杆菌菌株M15[pREP4](Qiagen)中，而pGEX-GST-Bd37质粒转染到大肠杆菌BL 21(Amershambiosciences)中。电穿孔利用GenePulser IITM(Bio-Rad)原核生物模块在1mm电穿孔管(Bio-Rad)中于272mM葡萄糖、3mM MgCl2和10％(v/v)甘油的水电穿孔基质中进行。电脉冲设置在1.5kV、200Ω、25μF。下一步细胞在SOC培养基中于37℃温育1小时，并涂布到含氨苄青霉素的LB琼脂板上。第二天利用JetQuick miniprep试剂盒(Q-Bio-Gene)通过质粒小量制备对单个菌落检查正确质粒的拥有，并如上文所述通过蛋白小量表达对其中有些菌落测试期望重组蛋白的正确表达。
细菌表达：
pQE构建体：
含不同pQE质粒构建体的大肠杆菌M15[pRE4]细胞分别于37℃在含100μg氨苄青霉素、25μg/ml卡那霉素及0.01％v/v消泡剂209(Sigma)的LB培养基中培养过夜。第二天早晨，培养物在新鲜培养基中以1∶10稀释，并再培养1小时。然后通过添加1mM IPTG诱导插入物片断的表达。培养再继续另外4小时。下一步细胞通过离心(4000×g，20分钟)沉淀，并重悬于含1％v/v Triton X-100TM、1mg/ml溶菌酶和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)(Sigma)的组氨酸标签裂解缓冲液中。裂解物贮存于-80℃备用。
融化后，添加500U DNAse I酶(Life Technologies)，于冰上温育20分钟，然后悬浮液于冰上以2秒的脉冲-中断循环超声破碎2分钟。超声破碎物以9000×g离心20分钟。上清相继通过1.2、0.45并最后通过0.22μm的过滤器(Pall Gelman，France)过滤。最后过滤液在FPLC Ni2+HiTrapTM柱(Pharmacia)上分离。加样的柱子用补充有20mM咪唑(Sigma)的组氨酸标签裂解缓冲液洗涤。最后重组蛋白洗脱在含200mM咪唑的组氨酸标签裂解缓冲液中。
pGex构建体：
含pGEX质粒构建体的大肠杆菌BL21细胞分别于37℃在含100μg氨苄青霉素和0.01％v/v消泡剂209(Sigma)的LB培养基中培养过夜。培养物在新鲜培养基中以1∶10稀释，并继续培养1小时。蛋白表达通过添加0.1mM IPTG诱导，培养再继续另外3小时。细胞如上所述沉淀，重悬于含1％v/v Triton X-100TM、1mg/ml溶菌酶和1mM PMSF的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。如上文所述，裂解物贮存于-80℃，融化，与DNase I混合，超声破碎并离心。上清在谷光甘肽-琼脂糖凝胶珠子(Sigma)上纯化。珠子用PBS/1％TX-100TM洗涤，且重组蛋白洗脱在含50mM Tris(pH 8)和45mM谷光甘肽(Sigma)的缓冲液中。
SPA-Rouen 1987
可溶性寄生虫抗原(SPA)是分歧巴贝虫侵染的红血球培养物的培养物上清。如Carcy等(1995，Infect.Imm.vol.63，p.811-817)所述。根据对Bd37疏水末端区域切割的计算机推测，SPA形式包括与用于重组构建体的Bd37-核心多肽相比在N-端侧稍稍更大的Bd37-核心多肽形式；据推测其由Asn-20直到且包括Ser-316在内的Bd37蛋白组成。另外，红血球及细菌宿主细胞之间可能存在翻译后加工的差异。
简要地，人类红血球在RPMI 1640(Invitrogen)和5g/l Albumax(纯化的牛血清白蛋白，Invitrogen)中于37℃在5％CO2大气下培养。该培养物在5％的红细胞压积下以1％的初始寄生虫血症用来自法国人分离物：Rouen 1987的分歧巴贝虫寄生虫感染。培养基每日更新，直到达到30-40％的寄生虫血症。此时培养基被用来和Quil A一起制备照疫苗。
图3描绘了由CBB染色的SDS-PAGE凝胶，其上观察到数个重组蛋白。凝胶利用标准条件跑样。简要地：将来自如上所述的细菌的重组蛋白样品在样品缓冲液中煮沸，加样到12％聚丙烯酰胺凝胶中，并在Tris-甘氨酸-SDS跑样缓冲液中于140V跑样，直到SDS-PAGE样品缓冲液中所含的溴酚蓝条带到达凝胶底部为止。然后凝胶染色，在甲醇-乙酸-CBB中固定并过夜脱色。凝胶在真空下于80℃干燥1小时，最后扫描以数字形式贮存。
由于每一个泳道中施加了相同量的细菌样品，条带强度的相对差异反映了持有疏水肽的构建体表达效率的降低。例如比较泳道2和3：6xHis+Bd37-核心比6xHis+Bd37-核心+DAF更为有效地表达。
实施例3：接种-攻击实验：
实验疫苗：
利用考马斯亮蓝基蛋白测定试剂盒(Pierce)，对纯化的细菌表达的重组蛋白通过分光光度计参比标准样品定量。然后在不含血清的RPMI培养基中稀释至250μl体积RPMI中1μg的蛋白终浓度，并制备3ml疫苗(足够12只沙鼠用)。
对于SPA疫苗，以相似的方式使用3ml分歧巴贝虫Rousen 1987Albumax培养基。
在RPMI培养基中制备10mg/ml的批号为L77-163的皂苷Quil A(Superfos，Denmark)新鲜贮液，添加90μl该液，并通过敲打试管(室温3-4次)与3ml疫苗溶液混合。因此每250μl疫苗剂量中皂苷的最终含量为75μg。
沙鼠免疫：
将每一种重组蛋白疫苗施加给每组10只8-9周龄、圈养于一个笼子中的沙鼠(长爪沙鼠(Meriones unguiculatus))的动物。对动物进行标记以便于个体识别。以3周的间隔皮下施与两次250μl的注射。
作为对照，250μl/剂量的SPA(分歧巴贝虫Rousen1987培养物上清)包括在内。
一组沙鼠未接种，并作为攻击对照。
在第二次接种后3周，施加攻击感染，包括腹膜内注射感染了分歧巴贝虫慕尼黑株的1000个沙鼠红血球。攻击的寄生虫事先已经通过沙鼠传代3次以确保其毒性。
数次采取攻击前后的血样，以监测贫血症和寄生虫血症的发展。为减轻动物压力，在每个取样日对半数沙鼠测定这些数值，在随后的日子里变换小组。对于每一个实验组，汇总某一取样日的血样。红细胞压积表达为％压紧细胞体积(％PCV)，而寄生虫血症通过显微镜由薄的血涂片读取。
结果和讨论：
表3：接种-攻击实验的结果
疫苗-蛋白    剂量(μg)  沙鼠寄生感染率(％) ↓ht＞30％的沙鼠百分比(1)   存活率(％)
 His+GST     1     100     100     0
 His+Bd37-核心     1     100     100     0
 His+Bd37-核心+DAF     1     10     10     90
 GST+Bd37-核心     1     100     90     20
 SPA-Rouen 1987     250μl     100     70     60
 未接种的     -     90     90     10
(1)每组红细胞压积下降大于30％的沙鼠百分比
除了一只动物之外，所有未接种的对照动物在攻击感染后死亡，表明所述攻击足够严重，能够对疫苗功效作出结论。免疫了6xHis+GST和6xHis+Bd37-核心融合蛋白的沙鼠获得了相似的结果，在这些组中所有的动物因完全的寄生虫血症和重度的贫血症而死亡(红细胞压积值下降＞30％)。这表明由6xHis或GST肽成分不能实现有效的保护，Bd37-核心多肽本身也不行。如预期的那样，6xHis不能够作为本发明的异源疏水肽。
在接受GST+Bd37-核心融合蛋白疫苗的动物中观察到某些程度的攻击保护。很可能这是归因于融合蛋白的大小(GST：28+Bd37-核心：32kDa)引起的。
然而这种水平的保护比由His+Bd37-核心+DAF融合蛋白疫苗获得的保护水平要小得多。具有疏水C-端的这个融合蛋白在Quil A中能够保护除一只之外的所有接种动物免于死亡，甚至免遭感染迹象(寄生虫血症和贫血症)。存活率的这种差异与对照相比具有统计学显著性(p＜0.01，X2检验)。
如EP1050541中所述，Quil A中的天然Bd37 SPA Rouen 1987保护沙鼠免受异源攻击感染。然而，在本实验中，异源攻击的严重度使得仅有6/10的动物存活，而7/10的沙鼠患上贫血症。
由于所用的攻击株系(Munchen)与用来获得Bd37-核心多肽和SPA蛋白的株系(Rouen 1987)不同，故称之为异源攻击。正如本领域众所周知的，针对此种异源攻击的保护的获得要比对同源攻击获得保护困难得多。
对于这些疫苗接种中所用Quil A的含量(75μg/剂量)，未观察到明显的负面局部反应。
结论：
这些疫苗接种-攻击实验证明，通过融合于Bd37-核心的异源疏水序列的存在，Quil A中的该融合蛋白能够保护9/10的动物抵抗杀死9/10未接种动物的严重异源攻击感染的影响力。对照融合蛋白或未融合的Bd37-核心多肽在Quit A中的疫苗几乎未观察到任何保护。由Quil A中的“天然Bd37-核心”多肽(SPA)免疫接种诱导中等程度的保护。
实施例4：具有异源疏水C-端融合物的AIV H5蛋白的构建、表达和免 疫接种应用
具有疏水C-端融合物的AIV HA5基因的构建：
来自禽流感病毒(AIV)株系A/小鸡/意大利/8/98(H5N2)的HA5基因作为cDNA获得。将其克隆到杆状病毒表达系统Bac-2-BacTM(invitrogen)的pFastbacl载体中。然后用ClaI和RsrII限制性酶消化载体，这从HA5基因中除去了包括C-端42个氨基酸的片断，由此缺失了相应H5蛋白跨膜区的完整编码区。
设计两个接头：Bd37HG3′-正向和Bd37HG3′-反向(见表2)，它们编码Bd37基因C-端的20个氨基酸，这是具有氨基酸序列：FAAVPSSLSAIVFGIIVSMF的疏水区。这两个接头也包含限制性位点：5′ClaI位点和3′RsrII位点，其在两接头退火时形成。
两接头退火并连接到ClaI-RsrII消化的pFastBacHA5质粒中，以构建质粒pFastBacHA5-Bd37。现在所述HA5-Bd37构建体编码C-端融合了Bd37蛋白疏水C-端的AIV H5蛋白。该HA5-Bd37构建体C-端的氨基酸序列为(起始于AIV-H5氨基酸516)：EISGVKLEFAAVPSSLSAIVFGIIVSMF。
杆状病毒中的表达：
根据制造商的说明(Invitrogen)由质粒pFastBacHA5产生重组杆状病毒。用于表达的细胞为Sf9和Sf158细胞，这些在100和250ml的Bellco微载体旋转摇瓶中培养。所用培养基为无血清培养基CCM3TM(Hyclone)和SF900-IITM(Invitrogen)。细胞以0.1-0.5的感染复数感染，并培养3-4天。收集感染的昆虫细胞，并通过免疫荧光和蛋白质印迹测试H5蛋白的存在。
纯化含HA5-Bd37蛋白的昆虫细胞，并由标准H5-抗原Elisa定量H5蛋白。含该蛋白的昆虫细胞将与Quil ATM皂苷佐剂进行配制，用于免疫接种小鸡，从而每ml疫苗中存在2μg HA5-Bd37和30μg QuilA。
用杆状病毒表达的HA5-Bd37免疫接种小鸡：
用QuilA中含HA5-Bd37蛋白的昆虫细胞接种小鸡，并测量血清转变。为此目的，置于隔离装置中的15只3-周龄SPF白色来亨鸡在腿上肌内注射0.25ml HA5-Bd37/QuilA疫苗(含5g HA5-Bd37/剂量)。在免疫接种后3、4和5周抽取血样。由结块的血中收集血清，56℃失活，并利用标准H5-抗体Elisa测试H5的抗体。
附图说明：
图1：根据Kyte和Doolittle疏水算法的疏水性分布图。氨基酸数目沿横轴表示。纵轴列出了亲水/疏水相对值；正值表示在中线(横轴)以下，与疏水氨基酸相关。窗口大小为5aa。该图右侧列出了疏水数据点的数目，及其相对于肽氨基酸总数的百分比。所示的肽为(也在表1中描述)：
·蜂毒肽，N-端
·DAF，C-端
·CWP 1：酵母细胞壁蛋白1，C-端
·MV HN：麻疹病毒血凝素-神经氨酸酶，内部区域
·HHV-4 EBNA-3C：人类疱疹病毒4 EBNA-3C核抗原，内部区域
图2：实验中所用重组蛋白的示意图。
图3：用于沙鼠接种的recBd37蛋白的SDS-PAGE；recBd37蛋白在细菌中表达，利用Ni-柱层析纯化，并上样到SDS-PAGE凝胶中。电泳后，将凝胶染色、干燥并扫描。
泳道如下：
M：分子量标记
1：6xHis+GST
2：6xHis+Bd37-核心
3：6xHis+Bd37-核心+DAF
序列表
<110>AKZO Nobel NV
<120>免疫原性组合物
<130>
<150>EP 02077800.7
<151>2002-07-10
<160>12
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物、探针、接头等
<400>1
attaaccctc actaaaggga                                                20
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物、探针、接头等
<400>2
aatggcaata atggatcctg caccaatctc                                     30
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物、探针、接头等
<400>3
gaaggatggc ttaagcttac tagatccctg                                     30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物、探针、接头等
<400>4
acacaggaaa caggatccat gtcccctata                                     30
<210>5
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物、探针、接头等
<400>5
cgcgaggcag ataagctttc agtcacgatg                                     30
<210>6
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<213>人工
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<223>引物、探针、接头等
<400>6
cgtgtgccca gatagaagac gggtagtacc tgaagtacta gatccctgac ctgatcctgc    60
agc                                                                  63
<210>7
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>7
cgtcttctat ctgggcacac gtgtttcacg ttgacaggtt tgcttgggac gctagtaacc    60
atgggcttgc tgacttag                                                  78
<210>8
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<220>
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<400>8
ctaagtcagc aagcccatgg ttac                                           24
<210>9
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cccaagcttc taagtcagca agcccat                                        27
<210>10
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<213>人工
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tggcttctta ggactggatc cctgacctga                                     30
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cgatttcgct gctgtacctt cttctttgtc tgccattgtc ttcggtatca ttgtatcaat    60
gttccg                                                               66
<210>12
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>12
gtccggaaca ttgatacaat gataccgaag acaatggcag acaaagaaga aggtacagca    60
gcgaaat                                                              67

Claims (14)

1.免疫原性组合物，包括融合蛋白和皂苷佐剂，其特征在于所述融合蛋白包括融合于核心多肽N-端和/或C-端的异源疏水肽，所述核心多肽包括至少一个保护性表位，所述皂苷佐剂以游离形式存在。
2.根据权利要求1的免疫原性组合物，其特征在于所述核心多肽为顶端复合物门(Apicomplexa)生物体的蛋白质的组分。
3.根据权利要求2的免疫原性组合物，其特征在于所述核心多肽为梨浆虫目(Piroplasmida)或球虫纲(Coccidia)生物体的蛋白质的组分。
4.根据权利要求3的免疫原性组合物，其特征在于所述核心多肽为艾美球虫属(Eimeria)或巴贝虫属(Babesia)生物体的蛋白质的组分。
5.根据权利要求1至4中任何一项的免疫原性组合物，其特征在于所述异源疏水肽来自N-端疏水序列。
6.根据权利要求1至4中任何一项的免疫原性组合物，其特征在于所述异源疏水肽来自内部疏水序列。
7.根据权利要求1至4中任何一项的免疫原性组合物，其特征在于所述异源疏水肽来自C-端疏水序列。
8.根据权利要求7的免疫原性组合物，其特征在于所述C-端疏水序列来自衰变加速因子(DAF)。
9.根据权利要求1至8中任何一项的免疫原性组合物，其特征在于所述皂苷佐剂为奎拉雅属(Quillaja)皂苷。
10.疫苗，其特征在于它包括根据权利要求1至9中任何一项的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10的疫苗，其特征在于它包括至少一种附加的免疫活性组分。
12.根据权利要求10或11的疫苗，其特征在于它是冻干形式的。
13.制备根据权利要求10的疫苗的方法，其特征在于所述方法包括将根据权利要求1至9中任何一项的免疫原性组合物与药学上可接受的载体混合。
14.根据权利要求1至9中任何一项的免疫原性组合物用于制造疫苗的用途。
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