CN115073614B - 一种hcmv重组抗原、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种HCMV重组抗原、其制备方法及应用，属于生物工程技术领域。本发明所述的HCMV重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，从N‑末端到C‑末端依次含有人类巨细胞病毒pp150蛋白从N‑末端第977位到第1017位的41个氨基酸、gp52蛋白从N‑末端第269位到第375位的107个氨基酸、gB蛋白从N‑末端第22位到第88位的67个氨基酸以及gB蛋白从N‑末端第783位到第904位的122个氨基酸。所述HCMV重组抗原具有较好的抗原性和特异性，能快速检测人体血清，并依此判断人体是否感染人巨细胞病毒，从而为人巨细胞病毒的快速诊断和此类疾病的防控提供了技术支持。

Description

一种HCMV重组抗原、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种HCMV重组抗原、其制备方法及应用。

背景技术

人类巨细胞病毒(HCMV)为疱疹病毒科β病毒属的一种双链DNA病毒，也称人疱疹病毒5型，在人群中感染非常普遍，不同国家和不同经济状况的地区感染率不同，在亚洲大约90％的人口被感染。一般成人感染HCMV后无明显症状，孕妇感染后会导致流产、死胎、胎儿畸形和和新生儿神经发育迟缓等症状。HCMV初次感染后将持续终身，在免疫功能受到抑制的人群如艾滋病、器官移植及恶性肿瘤患者，可引起严重并发感染。目前对HCMV感染没有合适的预防和治疗措施，因此，研发一种特异性好、灵敏性高，且能够应用于快速检测育龄妇女、孕妇以及血液和器官供体的抗原，对于HCMV感染早期诊断并阻止传播具有重要意义。

HCMV早期感染的临床诊断主要依靠血清学检查。人原发或者继发感染HCMV后免疫系统会产生特异性的抗体，其中IgM抗体是病毒刺激机体后最早出现的抗体，是HCMV急性期感染的标志，因此开发HCMV的IgM抗体检测试剂，对早期诊断HCMV具有重要意义。目前常用的ELISA试剂盒多以全病毒或者全基因重组抗原为抗原，与其他疱疹病毒属的病毒存在交叉反应，导致试剂盒的特异性及敏感性较差，易造成假阳性或假阴性结果，会影响到不同感染阶段HCMV的诊断。同时，HCMV具有很强的种属性，在人工体外培养时，会特异性地在人成纤维细胞中增殖，而且HCMV有一个血清型，可分为三个以上的亚型，只能在活细胞中生长，生长缓慢，DNA复制周期为36-48h，从而难以大规模培养，这也给天然抗原的大规模制备带来困难，并且增加成本。

利用基因工程技术构建HCMV特异性片段的融合重组抗原以取代全病毒等抗原，可提高检测的特异性和敏感性，因此制备具有优势抗原表位的HCMV重组抗原，对HCMV临床诊断具有重要意义。

目前市面上有很多HCMV的重组抗原，也有很多诊断急性期人IgM抗体的诊断试剂盒，但是由于市场存在先入为主的前摄影响，并且最早入市的诊断试剂盒多以天然抗原为诊断抗原，不同厂家的诊断试剂盒同一份血清会出现不一致的现象。这主要是天然抗原中HCMV病毒生长和表达的抗原有差异，还有培养细胞中的残留会导致不同的天然抗原之间有差异，同时也会导致假阳性等问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种HCMV重组抗原，该重组抗原具有特异性好、灵敏度高的特点，从而能够克服现有技术所存在的假阳性等问题。

本发明的技术方案如下：

一种HCMV重组抗原，包含有人类巨细胞病毒pp150蛋白从N-末端第977位到第1017位的41个氨基酸、gp52蛋白从N-末端第269位到第375位的107个氨基酸、gB蛋白从N-末端第22位到第88位的67个氨基酸以及gB蛋白从N-末端第783位到第904位的122个氨基酸。

作为优选，所述HCMV重组抗原，从N-末端到C-末端依次含有人类巨细胞病毒pp150蛋白从N-末端第977位到第1017位的41个氨基酸、gp52蛋白从N-末端第269位到第375位的107个氨基酸、gB蛋白从N-末端第22位到第88位的67个氨基酸以及gB蛋白从N-末端第783位到第904位的122个氨基酸。

作为优选，所述HCMV重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种重组表达载体，是将编码上述HCMV重组抗原的基因序列重组到表达载体中获得。在上述重组表达载体中，所述表达载体的选择并不局限，可优选为PET32a质粒等。

本发明提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌转化有上述重组表达载体，其中，重组工程菌的宿主菌并不局限，可优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供了一种上述HCMV重组抗原的制备方法，具体步骤如下：

将编码HCMV重组抗原的基因序列克隆到表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主菌，得到重组工程菌；诱导重组工程菌表达，经提取纯化获得HCMV重组抗原。

上述HCMV重组抗原可应用于检测HCMV患者血清中的人IgM抗体。本领域技术人员可根据本发明公开内容和相关常识，利用上述HCMV重组抗原制备检测试剂盒，并用于快速检测人巨细胞病毒。

在此基础上，本发明提供了一种HCMV检测试剂盒，其诊断抗原为上述HCMV重组抗原。

本发明的有益效果为：

本发明提供的HCMV重组抗原，特异性好，灵敏度高，能快速检测HCMV IgM抗体，避免与其他疱疹病毒产生交叉反应，具有较高的敏感性，从而大大降低了假阳性概率。同时，由该抗原制备的试剂盒，能快速检测人体血清，并依此判断人体是否具有人IgM抗体，特异性好，为人巨细胞病毒的快速诊断和此类疾病的防控提供了技术支持。

附图说明

图1为pp150蛋白氨基酸序列Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0分析结果；

图2为gp52蛋白氨基酸序列Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0分析结果；

图3为gB蛋白氨基酸序列Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0分析结果；

图4为重组工程菌阳性表达结果的SDS-PAGE结果图；其中，1为对照组，2-4为阳性表达组。

具体实施方式

目前HCMV抗体诊断用抗原多为全病毒提取抗原和重组抗原。全病毒提取抗原虽然有明显的敏感性，但是特异性较差。重组性抗原的特异性相对较好，但是如何选择特异性片段来提高敏感性是一项难题。因此，筛选一个能特异性识别IgM抗体的重组抗原尤为重要，其不仅能避免天然抗原在制备上所存在的周期性长、成本高以及难度大等问题，又能避免产生假阳和漏检等性能指标问题。

HCMV有71种病毒蛋白和70种细胞蛋白，在71种病毒蛋白中，一半为皮层蛋白，其它的为衣壳蛋白和包膜蛋白。其中，最具有诊断价值的蛋白为基质磷蛋白pp150和pp65，主要的DNA结合蛋白gp52和pp38，以及包膜蛋白gB和gH。

在HCMV的结构蛋白中，pp150属于包膜蛋白，它是一种基质磷蛋白，由UL32基因编码，共有1048个氨基酸，表达的蛋白相对分子质量为150KD。pp150与其他疱疹科病毒蛋白同源性很低，并且pp150占病毒包膜蛋白的20％。pp150具有较强的免疫原性，并且能在感染个体中引起强烈的体液免疫反应，是一种特异性细胞反应的免疫优势靶标，所以pp150是一种早期诊断中关键的特异性抗原。但是，如果特异性片段选择不正确或者用全长去做重组抗原仍然会产生假阳性。

在原发感染中，出现gp52抗体比pp150还早，随着时间的推移两者会出现交替出现的现象。所以两者进行结合可以有效的避免漏检。gB蛋白是HCMV包膜糖蛋白中的一种，由UL55基因所编码；它是HCMV感染过程中很重要的T细胞免疫反应的靶蛋白，尤其在体液免疫中具有重要的作用。gB糖蛋白也是疫苗研究的首选靶蛋白，可以产生中和抗体对机体产生保护作用。

由于目前检测HCMV IgM所使用的重组抗原主要是pp150和gp52蛋白片段，其敏感性和特异性有待提高。因此我们将gB的优势抗原表位加入并嵌合表达，获得重组蛋白，可进一步提高HCMV急性期的诊断率。

为此，本发明的设计思路如下：

本发明以HCMV与其他疱疹病毒差异性最大的pp150、gp52和gB蛋白为基础，通过生物信息学软件对HCMV结构蛋白pp150蛋白(NCBI序列号YP-081491.1)、gp52蛋白(NCBI序列号YP-081502.1)和gB蛋白(NCBI序列号YP-081514.1)氨基酸序列进行分析，将筛选得到的优势抗原表位按照一定顺序进行串联，构建并合成多表位融合抗原；同时，进行密码子优化，合成该蛋白的核酸序列，构建高效原核表达载体，纯化高纯度的重组蛋白。

本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明所制备或者所述的融合蛋白，即为HCMV重组抗原。此外，本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

菌种与质粒：宿主菌BL21(DE3)，质粒PET32a，购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司。分子生物学试剂：限制性内切酶BamHⅠ和Notl，T4连接酶购自TaKaRa；质粒纯化试剂盒及DNA片段琼脂糖凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN；IPTG购自Promega；其他试剂为进口或者国产分析纯试剂。基因合成和DNA序列测序由上海生工公司完成。基因克隆方法：DNA酶切、连接、电泳；质粒的提取纯化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般的分子克隆方法按常规方法进行。其他试剂盒按说明书进行。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

HCMV重组抗原的制备，步骤如下：

(1)HCMV优势抗原表位的筛选

根据NCBI中已公布的HCMV三种蛋白(pp150、gp52和gB)的氨基酸序列，利用ExPasy、UniProt等在线分析工具得到蛋白的二级结构和三级结构域，结合BepipredLinear Epitope Prediction 2.0分析结果，筛选出特异性线性抗原pp150(977aa-1017aa)、gp52(269aa-375aa)、gB(22aa-88aa)和gB(783aa-904aa)。pp150、gp52以及gB的Bepipred Linear Epitope Prediction2.0分析结果分别如图1、图2和图3所示。

其中，pp150(977aa-1017aa)位于pp150蛋白从N-末端第977位到第1017位的41个氨基酸，gp52(269aa-375aa)位于gp52从N-末端第269位到第375位的107个氨基酸，gB(22aa-88aa)位于gB从N-末端第22位到第88位的67个氨基酸，gB(783aa-904aa)位于gB从N-末端第783位到第904位的122个氨基酸。

(2)目的基因插入表达载体

将编码上述优势抗原表位的基因按照一定的排列组合串联，其具体顺序为pp150(977aa-1017aa)、gp52(269aa-375aa)、gB(22aa-88aa)和gB(783aa-904aa)，构建含有4个多表位的融合抗原基因，经过稀有密码子在线软件对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌的稀有密码子。最后进行人巨细胞病毒特异性融合蛋白抗原核苷酸序列合成，核苷酸两端增加BamHⅠ和NotⅠ限制性内切位点。

提取PET32a质粒，该质粒用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，电泳后胶回收双酶切的大片段。用BamHⅠ和NotⅠ双酶切连接于T载体的人巨细胞病毒特异性融合蛋白抗原核苷酸序列，电泳后胶回收双酶切的小片段，-20℃备用。将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:5比例，用T4连接酶在16℃下过夜连接。连接后即为重组表达载体，命名为PET32a-HCMV。

(3)重组表达载体的筛选和鉴定

将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布在含氨苄青霉素(60μg/mL)的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜。次日随机挑取5个转化菌落和2个对照菌落(质粒PET32a)，分别提取质粒。PET32a-HCMV用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体片段，结果显示构建重组表达载体成功，即为阳性表达菌。而对照菌质粒酶切后未看见目的片段。

(4)阳性表达菌的高效表达

将阳性表达的菌和对照菌接种至2mL LB培养基(含60ug/mL氨苄青霉素)的试管中，37℃恒温摇床振荡2h，加IPTG(终浓度为1mmol/L)，继续30℃诱导6h。离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测。

试验结果如图4所示：PET32a-HCMV表达的目的蛋白，大小在52KD左右，与ExPSYProtParam在线软件预测结果一致。对照菌中无目的蛋白条带。由此可见，本发明获得了表达HCMV特异性融合蛋白抗原的重组工程菌。

(5)HCMV重组抗原的纯化

收集高效表达的重组工程菌1000mL，10000rpm/min、4℃条件下离心15min，将沉淀的菌体重悬于100mL PBS(0.01M，PH＝7.4)中，充分洗涤，重复此步骤2次，然后在10000rpm/min、4℃条件下离心15min，将沉淀重悬于100mL PBS(0.01M，PH7.4)中，冰浴超声30min，在10000rpm/min、4℃条件下离心20min，PET32a-HCMV表达蛋白以包涵体形式存在，收集沉淀为包涵体蛋白。

包涵体先用PBS(0.01M，PH＝7.4)洗涤2次，然后用包涵体溶解液溶解，包涵体溶解液为50mM NaH₂PO₄·2H₂O，500mM NaCl，8M Urea，4℃溶解6h，然后在10000rpm/min、4℃条件下离心20min，收集上清，经0.22um滤膜过滤后，上镍柱纯化，按4mL/min的流速使上述蛋白样品缓慢流过镍柱，用5倍柱床体积的包涵体溶解液洗涤层析柱。流速不变，用10倍柱体积的洗杂缓冲液洗掉杂蛋白，再按照2mL/min的流速用洗脱Buffer洗脱目的蛋白。

洗脱液经SDS-PAGE检测后，收集含有高纯度目的蛋白的洗脱液，经Urea梯度透析复性，复性液为20mM Tris-HCl，6M Urea，PH＝8.5，逐渐降低Urea的浓度为4M、2M、0M，每个梯度的透析时间为2h，最后用100×目的蛋白体积的20mM Tris-HCl(PH＝8.5)透析72h，在10000rpm/min、4℃条件下离心20min，收集上清液，获得目的蛋白，即为HCMV重组抗原，或称融合蛋白。

HCMV重组抗原的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示：

编码上述HCMV重组抗原的基因序列，如SEQ ID NO:2所示：

实施例2

HCMV重组抗原的应用，如下所示：

(一)制备HCMV重组抗原的多抗血清

将纯化的HCMV重组抗原制备多抗血清。采用抗原和佐剂联合免疫新西兰大耳白兔的方式，制备并纯化兔抗血清，并采用间接ELISA法检测抗HCMV抗体滴度。

1、主要试剂：完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂购自SIGMA公司，其他试剂为国产或进口分析纯试剂。

2、免疫程序

将HCMV重组抗原作为免疫原，免疫5只新西兰大耳兔，每只免疫200μg抗原，免疫方式为背部多点免疫。第一次免疫使用完全弗氏佐剂与HCMV重组抗原混合乳化。两周后第二次免疫，用不完全弗氏佐剂和HCMV重组抗原混合乳化，免疫方式为背部多点免疫。三天后第三次免疫，用100μg的HCMV重组抗原和相同体积的PBS(0.01M，PH＝7.4)混合，免疫方式腹腔免疫。三天后将第三次免疫程序再进行一次。

3、间接ELISA检测兔抗血清效价

最后一次免疫后三天，兔耳缘静脉取血，4000rpm离心10min获取兔抗血清。取融合蛋白用碳酸盐缓冲液(50mM，PH＝9.6)稀释，包被酶联板，融合蛋白量为100μL/孔、100ng/孔，4℃过夜。次日用20％小牛血清封闭，37℃水浴封闭2h，洗板后备用。将兔抗血清梯度稀释，设置梯度为1:100，1:1000和1:10000，作为一抗，做三组重复，同时设置空白对照，37℃水浴孵育1h后，加1:5000二抗羊抗兔，加显色液显色。间接ELISA检测数据如表1所示：

表1

由表1可知，兔抗血清效价高至1:10000以上，说明本发明制备的HCMV重组抗原(融合蛋白)有较好的抗原性和特异性。

(2)制备HCMV IgM抗体检测试剂盒

本发明试剂盒结构与现有技术中试剂盒的结构相同，均包括包被抗原的硝酸纤维素膜与荧光素标记的鼠抗人IgM的释放垫以及其他常规试剂，其中，包被抗原为实施例1中纯化的融合蛋白。

本发明试剂盒采用干式荧光层析技术及捕获法原理检测样本中HCMV IgM抗体的浓度。检测时，将样本加入到检测卡的加样孔中，样本中的人HCMV IgM抗体和荧光标记鼠抗人IgM发生免疫反应从而形成免疫结合物，免疫结合物层析至检测卡T线时，被T线的HCMV融合蛋白捕获，样本层析至C线时，人抗HCMV IgM抗体和荧光标记鼠抗人IgM免疫结合物被C线的羊抗鼠IgG捕获，作为质控线。T线处荧光信号强度与样品中HCMV IgM抗体浓度呈正相关。因此，采用适用的干式荧光仪器便可检测出样本中抗HCMV IgM抗体的相对浓度。

对10例临床阳性患者的血清样本进行检测后，结果显示10例均为阳性，灵敏度为100％。对200例健康对照血清样本进行检测，结果显示，全部为阴性，特异性为100％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种HCMV重组抗原，其特征在于，所述HCMV重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，是由编码权利要求1所述HCMV重组抗原的基因序列重组到表达载体中获得。

3.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌转化有权利要求2所述的重组表达载体。

4.一种如权利要求1所述HCMV重组抗原的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

将编码权利要求1所述HCMV重组抗原的基因序列克隆到表达载体中，得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主菌，得到重组工程菌；诱导重组工程菌表达，经提取纯化获得HCMV重组抗原。

5.权利要求1所述HCMV重组抗原在制备检测人巨细胞病毒患者血清中人IgM抗体的试剂盒中的应用。

6.一种HCMV检测试剂盒，其特征在于，其诊断抗原为权利要求1所述的HCMV重组抗原。