CN102827292B - 一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用。所说的融合蛋白TgMEP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其构建和制备方法：对TgMEP的基因序列进行优化得到SEQ ID NO.1所示序列，优化后的基因序列使用重叠PCR的方法体外合成，通过Nco1和Xho1两个酶切位点定向克隆至pET-32c表达型载体中，构建的多表位肽重组表达载体TgMEP/pET-32c转化BL21宿主菌，经诱导表达出约23kDa大小的可溶性的融合蛋白，表达菌经超声破碎后分离得到上清，滤膜过滤上清后使用镍柱进行亲和纯化，获得融合蛋白TgMEP。该融合蛋白TgMEP可用于检测弓形虫病血清IgG及IgM抗体。

Description

一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用。涉及利用分子克隆和基因优化的手段在大肠杆菌中生产可溶性融合蛋白TgMEP。另外涉及如何筛选获得具有较强免疫反应性B细胞表位、将B细胞表位组合成多表位抗原、优化并合成该抗原对应的基因序列、以及如何将合成的基因序列导入表达载体。另外还涉及诱导转化有融合蛋白TgMEP基因的大肠杆菌可溶性表达TgMEP蛋白的方法、以及如何从细菌可溶性上清液中纯化。另外还涉及利用纯化的重组融合蛋白TgMEP建立酶联免疫吸附试验，以及对建立的酶联免疫吸附试验进行方法学评价和初步的临床应用。

背景技术

弓形虫是一种世界范围内寄生的原虫，全世界大约有1/3的人感染弓形虫。正常人感染弓形虫后无明显的临床症状，但对孕妇来说，弓形虫可以穿过胎盘屏障，引起流产、畸胎或死胎；尤其对AIDS患者，弓形虫性脑炎可能是致命的。除了感染人，弓形虫还可以感染家畜，引起羊和猪的流产。目前虽已建立了多种弓形虫病诊断试剂盒，但至今似还没有令人十分满意的弓形虫病诊断试剂盒，所以研制高质量的血清检测试剂盒，对于弓形虫病的防治具有较为重要的意义。目前市场上弓形虫病诊断试剂盒所用的检测抗原主要为弓形虫速殖子抗原，其来源于细胞培养或感染小鼠的腹水，由于纯化技术限制使得纯化的速殖子抗原纯度不够，导致检出的准确率不高，此外，速殖子抗原制备的成本很高，基于速殖子抗原的检测试剂盒由于批间差异使得方法学很难标准化。应用基因工程技术是大量制备高纯度的重组抗原的可行之路。随着分子生物学技术不断进展，越来越多的弓形虫抗原编码基因被克隆出来。这些基因表达的重组蛋白纯化后可作为诊断抗原，但单一抗原分子的诊断效率似还不够理想。因此，通过计算机软件预测和在原核表达系统中表达鉴定的方法，筛选出具有较高诊断价值的弓形虫B细胞表位，进一步构建复合多表位抗原用于弓形虫病的免疫诊断具有较好的应用前景，但目前尚未有基于重组复合多表位抗原的商品化的检测试剂盒应用于临床弓形虫病的检测。

发明内容

为了解决目前弓形虫病诊断抗原的诊断效率低、制备成本高和难以标准化等的不足，本发明利用基因工程技术构建并诱导表达重组弓形虫多表位融合蛋白TgMEP，解决了现有技术的不足。

本发明的基本原理是通过免疫印迹筛选获得具有较强免疫反应性的B细胞表位、将B细胞表位组合成多表位抗原、优化并合成该抗原对应的基因序列、将合成的基因序列导入表达载体，转化到大肠杆菌中进行诱导表达，纯化目的蛋白，我们把这种蛋白叫做TgMEP。

本发明所说的融合蛋白TgMEP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述所说的融合蛋白TgMEP可通过下述步骤制得：首先通过免疫印迹筛选获得具有较强免疫反应性的B细胞表位，将B细胞表位之间通过柔性氨基酸接头（GGGGSGGGGSGGGGS）连接组合成多表位抗原，优化并合成该抗原对应的基因序列并在两端添加相应的酶切位点，克隆至pET-32c表达载体中，转化BL21（λDE3）宿主菌，用0.1-1.0mM的IPTG进行诱导表达，表达菌经超声破碎后分离得到上清，将分离得到的上清使用0.22um孔径的滤膜过滤，再使用镍柱进行亲和纯化，0.5M的咪唑缓冲液洗脱，获得的目的蛋白TgMEP。目的蛋白经聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定，纯度大于95%，测定蛋白质浓度并计算得到的产率为1mg/L。

进一步地，本发明还公开了所述的融合蛋白TgMEP在制备检测弓形虫病血清IgG和IgM抗体试剂盒中的应用。

一种检测弓形虫病血清IgG抗体试剂盒，包括融合蛋白TgMEP酶标反应板、抗人IgG酶结合物、弓形虫病IgG阳性及阴性对照、PBST洗涤液、底物TMB及过氧化氢溶液、终止液硫酸，其中所述融合蛋白TgMEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种检测弓形虫病血清IgM抗体试剂盒，包括融合蛋白TgMEP酶标反应板、抗人IgM酶结合物、弓形虫病IgM阳性及阴性对照、PBST洗涤液、底物TMB及过氧化氢溶液、终止液硫酸；其特征在于其中所述融合蛋白TgMEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了融合蛋白TgMEP在检测弓形虫病血清IgG和IgM抗体检测中的应用。具体的方法是：用含有5μg/ml rMEP碳酸缓冲液100μl/孔包被聚苯乙烯酶标条，4℃过夜，用含5%脱脂奶粉的PBST 37℃封闭1h，0.05%PBST洗板3次；分别与1:100稀释的待检阳性和阴性血清于37℃反应1h，0.05%PBST洗板3次；再分别与1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 37℃反应1h，0.05%PBST洗板3遍；每孔加底物TMB 100μl，37℃显色5min；加50μl 2mol/L H2S04终止反应，在酶标仪450nm处测吸光度A值。

本发明利用分子克隆的手段结合基因优化，在大肠杆菌中可溶性表达融合蛋白TgMEP，利用亲和纯化获得具有较高纯度的重组弓形虫复合多表位肽抗原TgMEP，免疫印迹实验显示该融合蛋白TgMEP对弓形虫病阳性血清具有较好的免疫反应性，纯化的重组融合蛋白能被弓形虫病阳性的人混合血清特异性地识别，而阴性人混合血清则不与之反应。以此重组融合蛋白TgMEP建立的酶联免疫吸附试验用于弓形虫病抗体的检测具有较好的敏感性和特异性，与进口的弓形虫病抗体检测试剂盒具有相似的诊断效率，具有制备简便，成本低及易于标准化等优点。

附图说明

图1.表位重组质粒构建(A)泳道1，2：合成的表位寡核苷酸单链；泳道3：退火形成表位寡核苷酸双链；泳道M：DNA分子量标准。(B)退火形成的表位双链DNA克隆至经Nco I和Xho I酶切的表达载体pET-32c，限制性内切酶Eco I酶切鉴定。

图2.重组表位肽融合蛋白的纯化及免疫印迹筛选(A)12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的表位肽融合蛋白。(B)弓形虫病阳性混合血清对纯化的表位肽融合蛋白的筛选和鉴定。

图3.12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析融合蛋白TgMEP的表达、纯化(A)泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：大肠杆菌BL21细胞裂解液；泳道2：含空载体pET-32c大肠杆菌BL21细胞裂解液；泳道3：含重组表达载体载体TgMEP/pET-32c大肠杆菌BL21细胞裂解液。(B)泳道1：纯化的目的蛋白TgMEP；泳道2：纯化的标签蛋白Trx。

图4.纯化的重组融合蛋白TgMEP的三个不同血清组抗IgG和IgM抗体免疫印迹分析血清组Ⅰ：近期感染组；血清组Ⅱ：既往感染组；血清组Ⅲ：未感染组；anti-E.coli Ab：抗大肠杆菌抗体。

图5.酶联免疫吸附试验检测三个不同血清组抗IgG和IgM抗体血清组Ⅰ（58例）：近期感染组；血清组Ⅱ（68例）：既往感染组；血清组Ⅲ（35例）：未感染组。注：纵坐标代表450nm处的吸光度；横坐标上代表IgG抗体；横坐标下代表IgM抗体。

图6.双盲试验分别对每组随机挑选的10例标本进行抗体检测分析血清组Ⅰ（10例）：近期感染组；血清组Ⅱ（10例）：既往感染组；血清组Ⅲ（10例）：未感染组。注：纵坐标代表450nm处的吸光度；横坐标代表血清标本。

图7TgMEP多表位肽模式图。

具体实施方式

本发明通过计算机软件预测和在原核表达系统中表达鉴定的方法，筛选出具有较高诊断价值的弓形虫细胞表位，利用密码子优化的手段，人工合成两条多表位抗原氨基酸序列相应的核苷酸序列，退火形成双链后克隆至原核表达载体中，构建复合多表位抗原重组表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，进一步采用亲和纯化的方法，得到具有较强免疫反应性的重组融合蛋白TgMEP，实验表明重组融合蛋白TgMEP能够被弓形虫病混合人阳性血清特异性识别，采用TgMEP建立的酶联免疫吸附试验对弓形虫病具有较高的诊断价值。

实施例一弓形虫多表位肽重组融合蛋白TgMEP的表达、纯化及免疫反应性检测

[1]弓形虫主要诊断抗原B细胞表位的筛选和鉴定

采用分子生物学软件BioSun、DNAstar结合Hopp&woods亲水性参数、可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构参数对6个弓形虫常用诊断抗原分子主要表面抗原1（SAG1）、主要表面抗原2（SAG2）、主要表面抗原3（SAG3）、速殖子表面抗原P35、致密颗粒蛋白1（GRA1）、致密颗粒蛋白6（GRA6）的B细胞表位进行分析；每一抗原分子选取2个预测的B细胞表位，根据每个表位的序列设计两条互补的寡核苷酸单链，退火形成双链后克隆至原核表达载体pET-32c(购自中国Merck Millipore公司)中，EcoR I单酶切鉴定阳性重组质粒，进一步采用DNA测序验证序列的正确。采用IPTG对重组表位质粒进行诱导表达，Ni²⁺chelating HiTrap HP column亲和柱纯化重组表达的融合蛋白，WB检测各候选表位的免疫反应性。经软件预测得到12个弓形虫B细胞抗原候选表位（表1）。15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，经退火后形成寡核苷酸双链（图1A）。将退火形成的12对寡核苷酸片段分别亚克隆至质粒pET-32c的NcoI、XhoI两酶切位点之间，亚克隆成功使NcoI、XhoI两酶切位点间EcoR I酶切位点消失，通过EcoR I单酶切不能切开的为表位重组质粒（图1B），测序结果表明，克隆基因的核苷酸序列与设计的DNA序列完全一致，且阅读框正确，说明表达载体构建成功。经IPTG诱导表达和Ni²⁺亲和柱纯化后获得较纯的表位融合蛋白（图2A）,WB结果表明，通过筛选获得3个具有较强免疫反应性的B细胞表位（图2B）。

表1.软件对6个弓形虫诊断抗原进行预测得到的12个B细胞表位序列

[2]弓形虫多表位肽重组表达载体TgMEP/pET-32c的设计与构建

将筛选得到的三个表位分子SAG1_EP2（氨基酸序列：GLIGSFAACV）,SAG2_EP1（氨基酸序列：SYDGTPEKPQ）,SAG3_EP2（氨基酸序列：QPGTEGESQA）按顺序通过柔性的氨基酸“接头”（Gly₄Ser）₃连接起来，组合成弓形虫多表位肽TgMEP（图7），根据设计的多表位肽相应的碱基序列合成两条互补的寡核苷酸单链片段，在片段的两端分别加上限制性内切酶Nco1和Xho1粘性末端，两条互补的寡核苷酸片段通过退火形成双链的多表位肽基因（SEQ ID NO.1中484－663部分为优化部分）。将多表位肽基因克隆至经Nco1和Xho1双酶切的原核表达载体pET-32c中，采用菌落PCR方法筛选重组克隆，阳性克隆进一步进行测序验证。经菌落PCR筛选及测序验证，表明成功地将设计的多表位肽基因克隆至原核表达载体pET-32c中，得到弓形虫多表位肽重组表达载体TgMEP/pET-32c。

[3]弓形虫多表位肽的表达与纯化

接种含TgMEP/pET-32c的BL21单菌落至10ml LB肉汤，Amp终浓度为1μg/ml，37℃200g振荡培养过夜。1:100转种至1000ml肉汤，振荡培养3.5h左右，加IPTG至终浓度1mmol/L,继续培养3h。取1ml菌液，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测多表位肽的表达情况。12000g离心10min，收集细菌，用50ml的PBS悬浮菌体，对悬浮菌体进行了冻融超声，18000g离心30min，对超声后的上清和沉淀进行12%SDS-PAGE检测。采用Ni²⁺对上清中的多表位肽重组融合蛋白进行纯化。在AKTA Prime高压液相色谱仪用HiTrap Desalting column进行脱盐，脱盐后的重组融合蛋白被转移至新的缓冲液1×PBS中，在核酸蛋白测定仪上测其浓度。含重组表达质粒TgMEP/pET-32c的BL21菌经1mmol/L的IPTG诱导后表达出一约23000大小的融合蛋白（图3A）；对表达菌液超声后上清和沉淀的SDS-PAGE检测表明，融合表达的TgMEP主要以可溶性的形式存在于超声上清中。弓形虫多表位肽基因融合表达产物经Ni²⁺柱亲和纯化后，获得较纯的TgMEP重组融合蛋白，浓度为0.6mg/ml。（图3B）。

[4]重组融合蛋白的免疫反应性检测

取50μl多表位肽重组融合蛋白12%SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维膜，切成小条，分别加1:100稀释的弓形虫阳性和阴性混合血清37℃轻摇孵育2h，1×PBST（含0.05%Tween-20）洗膜3次，再加1:200稀释的羊抗兔IgG-HRP，37℃轻摇孵育2h，同上洗膜；加邻苯二胺显色10min，水洗终止反应。纯化的重组融合蛋白能被弓形虫阳性人混合血清特异性地识别，而弓形虫阴性人混合血清则不与融合蛋白TgMEP反应，采用纯化的融合标签蛋白Trx做为对照，与弓形虫阳性及阴性人混合血清均无反应，此外，融合蛋白TgMEP与大肠杆菌抗体没有反应，说明阳性血清对TgMEP的识别是由特异性的抗弓形虫抗体介导的（图4）。

实施例二重组融合蛋白TgMEP在弓形虫病诊断试剂盒中的应用

[1]重组融合蛋白TgMEP酶联免疫吸附试验的建立

采用正交试验分别确定用于弓形虫病IgG和IgM抗体检测的酶联免疫吸附试验的最佳检测条件，用于IgG和IgM抗体检测的重组融合蛋白TgMEP的包被浓度分别为：1μg/ml和2μg/ml。诊断界值采用15份阴性血清的检测均值加2个标准差，用于IgG和IgM抗体检测的酶联免疫吸附试验的诊断界值分别为0.14和0.16。具体检测步骤为：用含有重组融合蛋白的碳酸缓冲液100μl/孔包被聚苯乙烯酶标条，4℃过夜，用含5%脱脂奶粉的PBST 37℃封闭1h，0.05%PBST洗板3次；分别与1:100稀释的待检阳性和阴性血清于37℃反应1h，0.05%PBST洗板3次；再分别与1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 37℃反应1h，0.05%PBST洗板3遍；每孔加底物TMB 100μl，37℃显色5min；加50μl 2mol/L H2S04终止反应，在酶标仪450nm处测吸光度A值。

[2]重组融合蛋白TgMEP对弓形虫病IgG及IgM抗体的检测

采用融合蛋白TgMEP建立的酶联免疫吸附试验对161例临床标本进行了IgG及IgM抗体的检测，35例未感染组血清没有检测IgG及IgM抗体，68例既往感染组血清标本有66例IgG抗体为阳性，未检测到IgM抗体阳性，58例近期感染组血清标本中IgG及IgM抗体阳性分别为56例和15例（图5）。为排除人为因素对检测结果的影响，我们在三组血清标本各随机挑选了10份标本进行了双盲试验，10份来源于未感染组的血清标本IgG及IgM抗体检测均为阴性，10例染组血清标本有9例IgG抗体检测阳性，没有检测到IgM抗体阳性，而10例近期感染组血清标本中分别有9例IgM抗体阳性和3例IgG抗体阳性。以上结果表明我们获得的重组融合蛋白TgMEP不仅能够较好地检测弓形虫病IgG及IgM抗体，而且对于区分弓形虫病近期或既往感染具有潜在的临床应用价值（图6）。

[3]采用融合蛋白TgMEP建立的酶联免疫吸附试验与进口试剂盒比较

我们分别采用融合蛋白TgMEP建立的酶联免疫吸附试验与进口检测试剂盒（SERIONELISA classic Toxoplasma gondii IgG/IgM kit，德国）对161例临床标本进行了IgG及IgM抗体检测，IgG抗体检测结果一致的标本有150例，包括74例阳性和76例阴性，检测符合率为93.2%，两种IgG抗体检测方法的相关性为0.76（表2）。IgM抗体检测结果一致的标本有154例，包括53例阳性和101例阴性，检测符合率为95.7%，两种IgM抗体检测方法的相关性为0.85（表3）。

表2.采用融合蛋白TgMEP建立的IgG酶联免疫吸附试验与进口IgG抗体试剂盒比较

+：阳性；-：阴性。

表3.采用融合蛋白TgMEP建立的IgM酶联免疫吸附试验与进口IgM抗体试剂盒比较

+：阳性；-：阴性。

采用融合蛋白TgMEP建立的用于IgG抗体检测的酶联免疫吸附试验敏感性和特异性分别为96.4%和98.7%，用于IgM抗体检测的酶联免疫吸附试验敏感性和特异性分别96.6和100%。以上结果证实采用融合蛋白TgMEP建立的酶联免疫吸附试验不仅具有较好的敏感性和特异性，而且具有较好的临床应用和推广价值。

Claims (6)

1.一种融合蛋白TgMEP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种制备权利要求1所述的融合蛋白TgMEP的方法，其特征在于，采用基因合成优化软件对TgMEP对应的基因序列进行优化为SEQ ID NO.1所示的序列，优化后的基因序列使用重叠PCR的方法体外合成，并在两端添加相应的酶切位点，克隆至pET-32c表达型载体中得到TgMEP/pET-32c，将构建的多表位肽重组表达载体TgMEP/pET-32c转化BL21（λDE3）宿主菌，表达菌经超声破碎后分离得到上清，将分离得到的上清使用滤膜过滤，再使用镍柱进行亲和纯化，0.5M的咪唑缓冲液洗脱，获得的目的蛋白TgMEP。

3.权利要求1所述的融合蛋白TgMEP在制备检测弓形虫病血清IgG抗体试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述的融合蛋白TgMEP在制备检测弓形虫病血清IgM抗体试剂盒中的应用。

5.一种检测弓形虫病血清IgG抗体试剂盒，包括融合蛋白TgMEP酶标反应板、抗人IgG酶结合物、弓形虫病IgG阳性及阴性对照、PBST洗涤液、底物TMB及过氧化氢溶液、终止液硫酸，其特征在于其中所述融合蛋白TgMEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.一种检测弓形虫病血清IgM抗体试剂盒，包括融合蛋白TgMEP酶标反应板、抗人IgM酶结合物、弓形虫病IgM阳性及阴性对照、PBST洗涤液、底物TMB及过氧化氢溶液、终止液硫酸；其特征在于其中所述融合蛋白TgMEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

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