CN106632684A - 一种用于快速检测ⅰ型糖尿病的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种用于快速检测Ⅰ型糖尿病的融合蛋白。所述融合蛋白质为胰岛细胞自身抗原(ICA69)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD2)基因通过融合表达获得的ICA‑GAD融合蛋白质。本发明包括以下步骤:通过DNA star软件对胰岛细胞抗体(ICA69)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD2)基因进行B细胞抗原表位分析并确定其基因序列,通过人工合成目的基因(ICA‑GAD),将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中,然后转化到BL21(DE3)宿主菌中,加入IPTG对目标蛋白进行诱导表达;用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白;对ICA‑GAD融合蛋白的活性进行检测。本发明能够一次性检测抗体中的任意一种或两种,显著提高I型糖尿病的诊断效率,缩短检测时间,降低医疗费用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白,特别是ICA69和GAD2融合表达的ICA-GAD融合蛋白技术领域。
背景技术
目前,随着人们生活水平的提高,使人们糖摄入量高,加上运动量少,导致部分人因过度肥胖诱发糖尿病。
糖尿病是一种常见的以高血糖为特征的内分泌代谢疾病,是由于胰岛素分泌缺陷或其生物性能受损而导致的血糖过高,出现糖尿,进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱,导致各组织,特别是眼、肾、心脏、血管、神经性的慢性损害、功能障碍。糖尿病分为四种类型,即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病。
在I型糖尿病的免疫破坏期间,患者体内会自动产生针对于胰岛细胞自身抗原的抗体。目前已经发现多种胰岛素自身抗体,如:胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛细胞表面抗体(ICSA)、胰岛素抗体(IAA)、热休克蛋白抗体(HSP)、谷氨酸脱羧酶65抗体(GAD65,哺乳动物中GAD的存在形式之一)、蛋白质酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)等。临床上在诊断I型糖尿病常用的指标包括ICA、IAA、GAD、IA-2A等。
目前只能对于I型糖尿病病人中ICA、IAA、GAD、IA-2A等多个自身抗体进行单一测定,步骤繁多且花费较高,效率低,特异性不足,时间长等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有现状,提供一种用于快速检测I型糖尿病的ICA-GAD融合蛋白,这种方法可以一次性检测出抗ICA69和GAD2任意一种或两种抗体。这种方法方便、简捷、高效,降低医疗成本和检测时长。
本发明是通过以下技术方案实现的,具体包括以下步骤:
(1)合成目的基因(ICA-GAD),将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中,然后转化到BL21(DE3)宿主菌中,加入IPTG进行目标蛋白的诱导表达;
(2)用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白;
(3)对ICA-GAD融合蛋白的活性进行检测。
所述的步骤(1)所述的目标蛋白为ICA69基因和GAD2基因通过融合表达获得的蛋白质,其特征在于其氨基酸序列:SEQ ID NO:4。
所述的步骤(1)所述目的基因的合成是选自ICA69和GAD2的基因序列直接进行合成的:SEQ ID NO:3 所示。
所述的步骤(1)所述的蛋白表达宿主是BL21(DE3)。
所述的步骤(3)中所述的融合蛋白活性的检测包括抗原的包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应、结果判定。抗原的包被:用0.05M PH9,碳酸盐包被缓冲液将融和蛋白ICA-GAD稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟;加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml,37℃孵育0.5~1小时,洗涤。加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色剂,于410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
附图说明
图1.载体构建
图1中A部分为PET-28a载体图,其中BamH I和Xho I为酶切位点;B部分为ICA-GAD目标基因图,其中BamH I和Xho I为酶切位点;C部分为插入ICA-GAD目标基因之后的载体图。
具体实施方式
实施例一:基因的融合与表达
(1)目的DNA序列进行人工合成。
(2)目标基因的PCR扩增:为确保得到两者融和表达,利用Primer5.0根据目标基因序列设计特异性扩增引物,引物设计以BamH I和Xho I为酶切位点。引物序列为:
cgggatccat ggcatctccg ggctctggct tttggtct SEQ ID NO:1
ccctcgagtc atgcattgag caattcgtgg ttc SEQ ID NO:2
用高保真DNA扩增系统以合成的DNA序列为模板进行PCR循环获得产物。
(3)扩增后,按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行回收。将目的基因插入载体中:cDNA产物与载体进行连接,转化到PET-28a载体中,根据重组载体的标志(抗Kan或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,进行菌液PCR和双酶切并测序进行阳性验证。将此重组质粒DNA转化到表达宿主菌的感受态细胞BL21(DE3)并涂布于LB培养基平板上。
(4)蛋白表达:挑选含重组质粒的菌体单斑至LB(Kan 100ug/ml)液体培养基中37℃过夜培养。按1∶50比例稀释过夜菌,,37℃振荡培养至OD600值在0.4-1.0(最好0.6,大约3小时)。取部分菌液作为诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃振荡培养3小时。
实施例二:蛋白纯化
诱导的含有目的蛋白的细菌被离心收集,超声破菌,离心收集上清。为了提高目的蛋白的纯化纯度,我们对传统的纯化his融合蛋白的方法进行了相关的改进,在诱导表达后的大肠杆菌上清中加入β-巯基乙醇(使终浓度为5mM)。然后利用含有300mMNacl,20mMTris-Hcl和40mM的咪唑缓冲液把目的蛋白结合到HIS Trap FF亲和柱子上,然后用含有300mM Nacl,20mMTris-Hcl和500mM的咪唑缓冲液把目的蛋白洗脱下来。在PBS缓冲液中4℃透析过夜,BCA法测定蛋白浓度为1mg/ml。
实施例三:利用Elisa检测来测定免疫活性。
1.包被:用0.05M PH9,碳酸盐包被缓冲液将融和蛋白ICA-GAD稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
2.加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml,37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
4.加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
5.终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色剂,于410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
ELISA 试剂盒检测结果
G.实施效果:本发明提高了I型糖尿病的检出率,在所测的样品中,每个样品只要有抗ICA69和GAD2抗体中的一种或两种存在,显著提高I型糖尿病的诊断效率,可用于制作检测I型糖尿病试剂盒。
Claims (5)
1.一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白。所述ICA-GAD融合蛋白质为胰岛细胞自身抗原(ICA69)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD2)基因通过融合表达获得的ICA-GAD融合蛋白质。本发明包括以下步骤:合成目的基因(ICA-GAD),将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中,然后转化到BL21(DE3)宿主菌中,加入IPTG进行目标蛋白的诱导表达;用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白;对ICA-GAD融合蛋白的活性进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种用于快速检测I型糖尿病的ICA-GAD融合蛋白,所述融合蛋白质为ICA69基因和GAD2基因通过融合表达获得的蛋白质,其特征在于其氨基酸序列:SEQ ID NO:4。
3.根据权利要求1所述的一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白,其特征是,所述目的基因的合成是选自ICA69和GAD2的基因序列直接进行合成的:SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求1所述的一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白,其特征是,所述蛋白表达宿主是BL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述的一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白,其特征是,融合蛋白免疫活性高,能够一次性检测抗体中的任意一种或两种,显著提高I型糖尿病的诊断效率。可用于制作检测I型糖尿病试剂盒。
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