CN104371020B - 一种多特异性融合抗体及其应用 - Google Patents

一种多特异性融合抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多特异性融合抗体及其应用，特别是一种能同时与四种残留药物发生免疫学反应的抗体，属于免疫学检测技术领域。本发明通过将氯霉素单链抗体、环丙沙星单链抗体、磺胺二甲嘧啶单链抗体和克伦特罗单链抗体的VH和VL基因进行整合，得到能同时与上述四种残留药物发生反应的多特异性抗体。以此多联特异性融合单链抗体为探针建立一种快速的免疫学检测方法，从而达到一次性、快速、筛检多种残留药物的目的。

Description

一种多特异性融合抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种多特异性融合抗体，特别是一种能同时与四种残留药物发生免疫学反应的抗体，属于免疫学检测技术领域。
背景技术
传统的单克隆抗体由于其分子本身FC庞大结构特点使得其在疾病诊断和治疗方面存在许多问题：首先，传统单克隆抗体都是异源性的，诱发免疫反应普遍较强；其次，在体内代谢快，特异性稍差；再次，杂交瘤技术筛选的单克隆抗体多数只能保持天然抗体的活性，且挑选的抗体无中和抗原生物活性的能力，要挑选中和性抗体是相当复杂和困难的。最后，许多特异性抗体在体内并不能够完全发挥其预期的凝集活性；许多优良的抗体杂交瘤细胞株在传代过程中稳定性不强，容易丢失。再附以制备工作过程繁琐拖沓和费时费力，使得单克隆抗体技术的普及一度受限。
单链抗体，是在DNA水平上将抗体轻链和重链可变区基因用一段适当的寡核苷酸(Linker)连起来，使之在适当生物体中表达成为一条单一肽链，称为单链抗体(SinglechainFv，ScFv)。作为一个重要基因工程抗体，ScFv更易于在原核细胞进行表达和在基因水平进行改造。对ScFv的进一步研究中，在取得了重大进展的同时，一些应用于临床出现的问题也暴露出来，如亲和力较低，稳定性较差，半衰期短等缺点，这些缺点也限制着ScFv在治疗过程中的普及性。
利用两种不同的单链抗体的VH和VL基因，使其在表达过程中实现重新组合，形成具有双特异性的单链抗体，这种双特异性单链抗体可以同时与两种抗原特异性地结合。与传统的双特异性抗体相比，双特异性单链抗体既保持了特异性结合抗原的特点，又具有以下优点：缺失Fc片段，减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的可能性；最大限度地降低了鼠源性蛋白和免疫变态反应的可能性；分子量小，有利于穿透肿瘤组织；避免了传统制备双特异性抗体需要进行细胞杂交的步骤，减少了工作量，提高了制备的成功率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多特异性融合抗体，是将来源于小鼠的4种单链抗体的VH和VL基因进行整合得到，含有8个抗体重链与8个抗体轻链。
所述4种单链抗体分别是氯霉素单链抗体、环丙沙星单链抗体、磺胺二甲嘧啶单链抗体和克伦特罗单链抗体。
所述多特异性抗体，包含（a）氯霉素单链抗体的VH和VL基因片段；（b）环丙沙星单链抗体的VH和VL基因片段；（c）磺胺二甲嘧啶单链抗体的单链抗体片段；（d）克伦特罗单链抗体的单链抗体片段；所述片段（a）、（b）、（c）、（d）通过有别于组装单链抗体基因的连接肽连接。
所述融合抗体包含4个结构域，第一结构域可与氯霉素的表位结合，第二结构域可与磺胺二甲嘧啶的表位结合，第三结构域可与环丙沙星的表位结合，第四结构域可与克伦特罗的表位结合。
编码所述融合抗体的基因序列为SEQ ID NO:1所示。
获得所述融合抗体的方法是通过PCR获得氯霉素单链抗体、环丙沙星单链抗体、磺胺二甲嘧啶单链抗体和克伦特罗单链抗体的VH和VL，并通过重叠PCR将4个片段连接起来，纯化后双酶切、回收、连接到表达载体pGEX-6P-1，得到重组质粒pGEX-CCSC，转化DH5α感受态细胞，测序验证后，将重组质粒pGEX-CCSC转化DE3在20℃条件下培养表达融合抗体。
本发明所提供的多特异性融合抗体具有广谱特异、低耗高效和灵敏便捷地同步筛检多种残留兽药的优点。
附图说明
图1为构建重组蛋白pET-22b-CPFX–ScFv的载体。
图2为pET--22b-CAP-ScFv不同时间内的诱导表达SDS-PAGE；
（1：未诱导，2～5：1～4h诱导，6：空载体对照，7：Marker，8～10：5～7h诱导）。
图3为pET--22b-CPFX-ScFv不同时间内的诱导表达SDS-PAGE；
（1：0h，2：1h，3：2h，4：3h，5：4h，6：5h，7：Marker，8、9：空载体对照）。
图4为pET--22b-SM2-ScFv不同时间内的诱导表达SDS-PAGE；
（1：未诱导，2～5：1～4h诱导，6：Marker，7～9：5～7h诱导，10：空载体对照）。
图5为pET--22b-CL-ScFv不同时间内的诱导表达SDS-PAGE；
（1：未诱导，2～5：1～4h诱导，6：Marker，7～9：5～7h诱导，10：空载体对照）。
图6为重组质粒pGEX-CCSC（DE3）梯度诱导表达产物的SDS-PAGE；
（M：蛋白Marker(200，130，97.4，66.2，43ku)，1：诱导的pGEX-6P-1载体，2：诱导的pGEX-CCS载体，3、4：未诱导的pGEX-CCS载体，5-9：诱导的pGEX-CCSC1h-5h）。
具体实施方式
实施例1氯霉素、环丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克伦特罗单链抗体的制备
采用化学合成的方法分别获得氯霉素、环丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克伦特罗单链抗体。编码氯霉素单链抗体、环丙沙星单链抗体、磺胺二甲嘧啶单链抗体、克伦特罗单链抗体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
实施例2氯霉素、环丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克伦特罗单链抗体在pET-22b(+)原核载体中表达
利用实施例1中的4个基因与pET-22b表达系统，分别构建pET-22b-CAP-ScFv、pET-22b-CPFX-ScFv、pET-22b-SM2-ScFv表达载体和pET-22b-CL-ScFv。以pET-22b-CPFX–ScFv的构建为例进行说明，详见图1，其余质粒的构建参见pET-22b-CPFX–ScFv的构建方法。
目的基因产物与表达载体质粒的双酶切体系为如表1。双酶切的目的片段纯化回收，按表2体系连接，瞬时离心混匀于管底。4℃连接过夜，备用。
表1双酶切体系
表2双酶切的连接体系
将上述重组质粒分别转化大肠杆菌DE3，将鉴定的阳性重组质粒重新接种于Amp+/LB的 平板，提取单个菌落后接种于5mL Amp+/LB液体培养基中，37℃振荡培养其D600值约达0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，分别于37℃和25℃振荡诱导培养，取不同诱导时间的菌液进行SDS-PAGE分析，同时设空载体pET-22b转化的DE3诱导与未诱导菌液作对照。
SDS-PAGE分析：将培养好的菌液在6000rpm4℃离心16min，弃上清，用pH7.4的PBS悬起后-20℃冻存。冰水浴中超声破碎融化的离心菌体悬液，裂解条件为：超声15s，间歇15s，共15min，波幅85%。待超声菌液稍浑浊时4℃12000rpm离心30min，收集蛋白上清液。配制10%分离胶和5%积层胶聚丙烯酰胺浓缩胶。对表达的全菌体蛋白上清液进行SDS-PAGE定位分析。为了寻找最佳的表达条件，我们研究了不同的诱导时间和不同浓度的诱导剂IPTG对工程菌表达的影响。
（1）pET-22b-CAP-ScFv融合蛋白表达及SDS-PAGE的鉴定：取诱导后的细菌进行全菌体蛋白上清液电泳分析，SDS-PAGE结果表明IPTG诱导后的转化子均有表达，在相对分子量约26ka处有一新增的蛋白带，与理论推算的分子量相符。而未诱导DE3或诱导后的pET-22b-DE3没有相应的蛋白带。
pET-22b-CAP-ScFv（DE3）菌分别在诱导前、后0h-7h取样，进行全菌体电泳分析。结果见图2。表达定位分析表明：在IPTG终浓度为1mM时表达量即可达到最高，上清的表达量可达到35%。另外，37℃条件下目的蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达，以包涵体形式表达为主，在25℃条件下目的蛋白全部为可溶性蛋白。
离心1L在25℃诱导5h的菌体，提取可溶性表达蛋白（上清），上清经浓缩后进行SDS-PAGE，切下目的蛋白带，利用蛋白浸提液浸提可溶性表达蛋白，经透析、浓缩，并通过SDS-PAGE电泳回收、蛋白浸提液浸提纯化，将非特异的菌体蛋白除去。BCA蛋白试剂盒测定蛋白质浓度为2.016mg/mL。
（2）pET--22b-CPFX-ScFv融合蛋白表达及SDS-PAGE的鉴定，全菌体电泳分析见图3。表达定位分析显示：在IPTG终浓度为1mM时表达量即可达到最高，上清表达量可达到42%。另外，37℃条件下目的蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达，以包涵体表达为主，在25℃的目的蛋白全部以可溶性蛋白为主。试剂盒测定蛋白浓度为1.973mg/mL。
（3）pET-22b-SM2-ScFv融合蛋白表达及SDS-PAGE鉴定。表达定位分析如图4显示：在IPTG终浓度为1mM时表达量最高，上清表达量可达到23.5%。37℃条件下目的蛋白仍以包涵体和可溶性两种形式表达，包涵体表达为主，在25℃目的蛋白基本均为可溶性蛋白。测定蛋白质浓度为1.73mg/mL。
（4）pET-22b-CL-ScFv融合蛋白表达及SDS-PAGE鉴定。表达定位分析如图5显示：在IPTG终浓度为1mM时表达量最高，上清表达量可达到27.6%。37℃条件下目的蛋白仍以包 涵体和可溶性两种形式表达，包涵体表达为主，在25℃目的蛋白基本均为可溶性蛋白。测定蛋白质浓度为1.85mg/mL。
实施例3融合抗体的构建
设计并合成了4对扩增单链抗体可变区基因的引物（由上海Sangon合成），各引物的序列、在全基因组中的起始位置及添加的酶切位点见表3。
表3扩增各基因的引物
（“—”为加入的保护性碱基，下划线部分为引入的酶切位点，酶切位点分别为BamHⅠ和EagⅠ，斜体黑 框为加入的连接肽，黑体为加入的终止密码）
分析单链抗体系列基因序列特征，设计合成4对引物，每对引物引入有别于组装单链抗体基因的第二种连接肽，通过PCR方法从制备的四个重组菌中扩增获得四个单链抗体的融合基因片段，再通过重叠PCR组装将4个单链抗体片断连接起来，目的基因纯化后双酶切回收连接到表达载体pGEX-6P-1的相应位点，得到重组质粒pGEX-CCSC，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取白色的菌落接菌培养后小提质粒，酶切鉴定正确的质粒送上海联合基因公司测序。
表4融合ScFv的PCR反应体系
表5串联四种ScFv的不同PCR反应体系
表6双酶切体系
实施例4融合蛋白pGEX-CCSC的纯化
（1）将测序正确的重组质粒pGEX-CCSC转化E.coli感受态BL21(DE3)，在20℃条件下诱导20h后表达。
应用MicroSpinTM GST Purification Module Kit GST-CCS纯化上清蛋白，步骤如下：
1）轻轻悬浮Glutathione Sepharose4B Microspin柱子的胶。
2）将盖子打开1/4圈，打开底部螺栓。
3）将MicroSpin柱子放入一个清洁的1.5mL离心管内，在室温下以3000rpm离心1min，弃掉缓冲液。
4）加入600μL含有融合蛋白的上清，关闭底部螺栓。室温轻轻摇动MicroSpin纯化柱，使融合蛋白与Glutathione Sepharose4B基质混合均匀。
5）打开MicroSpin纯化柱底部螺栓，将其放入一个清洁的1.5mL离心管内，在室温下以3000rpm离心1min，弃掉缓冲液。
6)将MicroSpin纯化柱装入1.5mL离心管内，加入250μL-600μL的1×PBS，在室温下以3000rpm离心1min，弃掉缓冲液。洗涤2次。
7)加入100-200μL的谷胱甘肽洗脱缓冲液（还原型谷胱甘肽），在室温下孵育5-10min。
8)打开底部螺栓，将MicroSpin纯化柱装入1.5mL离心管内，在室温下以3000rpm离心1min，收集洗脱的样品。
SDS-PAGE检测洗脱样品，考马斯亮蓝染色，脱色后照相。
（2）纯化的目的蛋白含量测定：Pierce BCA蛋白定量试剂盒测定纯化的融合蛋白含量。pGEX-CCSC质粒转化E.coli感受态BL21(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示，37℃时IPTG诱导表达，重组质粒pGEX-CCSC出现明显的表达带，其大小与理论预测分子量136ku相符(GST-Tag为26ku)，且1mM IPTG诱导4h时表达量达到最高（见图6）。pGEX-CCSC在20℃条件下诱导20h，目的蛋白在上清中表达量增加，但相对较低，仅为21.4%。
实施例5融合蛋白的含量测定及反应原性
（1）应用Pierce BCA试剂盒测定蛋白含量，通过标准曲线计算出融合蛋白的浓度为0.265mg/mL。
（2）梯度稀释纯化的融合蛋白pGEX-CCSC，间接ELISA检测反应原性，抗原通过重氮化法制备。如表7、8所示。通过实际样品的检测试验来鉴定融合多联单链抗体的敏感性、特异性和交叉性，最终以此多联特异性融合单链抗体为探针建立一种快速的免疫学检测方法，从而达到一次性、快速、筛检多种残留药物的目的。突出优势体现在：不仅正面的、充分的利用了单抗可能产生的广泛交叉谱进而筛检出多于四种的疑似残留药物，而且克服传统检验检疫中存在的设备昂贵、步骤繁琐、检测目标单一和费时耗力等缺点，轻松达到简便快捷灵敏高效的目的，更能详尽分析、比较不同类型抗体间的结合位点的特异性和功能域的差别。为最终利用一种融合抗体同时与相关的四种残留药物发生免疫学反应，所建立的方法也能同时筛检四种药物。
表7间接ELISA初步鉴定pGEX-CCSC表达产物免疫学活性（OD490）
注：*为OD值高于3.5(酶标仪检测范围)，下划线表示最低的有效值。
表8间接ELISA比较三种单抗、单链抗体及其融合表达产物的敏感性
注：下划线表示最低的有效值。
表9间接ELISA同步测定pGEX-CCSC表达产物对四种兽药的免疫学活性（OD490）
注：*为OD值高于3.5(酶标仪检测范围)，下划线表示最低的有效值。
从表9可以看出，当不同种偶联的兽药抗原同时包被时（采用之前实验获得的最低、最佳作用效果验证），间接ELISA检测结果证明，pGEX–CCSC融合抗体的灵敏度没发生明显改变，说明该融合抗体能分别与每一抗原反应时无空间上的阻碍，而且可以同时与四种药物发生特异反应，作用效果良好。

Claims (6)

1.一种多特异性融合抗体，其特征在于，是将氯霉素单链抗体、环丙沙星单链抗体、磺胺二甲嘧啶单链抗体和克伦特罗抗体的VH和VL基因进行整合得到；所述多特异性融合抗体，包含(a)氯霉素单链抗体的VH和VL基因片段；(b)环丙沙星单链抗体的VH和VL基因片段；(c)磺胺二甲嘧啶单链抗体的单链抗体片段；(d)克伦特罗单链抗体的单链抗体片段；所述片段(a)、(b)、(c)、(d)通过有别于组装单链抗体基因的连接肽连接；编码所述融合抗体的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的融合抗体，其特征在于，所述融合抗体包含4个结构域，第一结构域可与氯霉素的表位结合，第二结构域可与磺胺二甲嘧啶的表位结合，第三结构域可与环丙沙星的表位结合，第四结构域可与克伦特罗的表位结合。
3.编码权利要求1所述融合抗体的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.含有权利要求3所述基因的质粒或细胞。
5.获得权利要求1所述融合抗体的方法，其特征在于，是化学合成序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的4条单链抗体基因，连接表达载体pET-22b，分别构建pET-22b-CAP-ScFv、pET-22b-CPFX-ScFv、pET-22b-SM2-ScFv和pET-22b-CL-ScFv；设计合成引物，通过PCR方法从制备的四个重组质粒中扩增获得四个单链抗体的VH和VL基因片段，再通过重叠PCR组装起来，所得目的基因纯化后连接到表达载体pGEX-6P-1上，得到重组质粒pGEX-CCSC，转化DH5α感受态细胞，筛选测序正确的重组质粒pGEX-CCSC转化E.coli感受态BL21(DE3)，在20℃条件下诱导表达。
6.权利要求1所述融合抗体在残留药物检测中的应用；所述残留药物为氯霉素、环丙沙星、磺胺二甲嘧啶和克伦特罗。
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