CN108715608B

CN108715608B - 一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的β-伴大豆球蛋白β亚基抗原区域及筛选方法

Info

Publication number: CN108715608B
Application number: CN201810556432.9A
Authority: CN
Inventors: 席俊; 皮江一; 贺梦雪; 李爽; 于秋荣
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: CN108715608A

Abstract

本发明公开了一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的β‑伴大豆球蛋白β亚基抗原区域及筛选方法，所述抗原区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。本发明利用一系列生物信息学软件并参照PDB数据库已解析的β‑伴大豆球蛋白三维晶体结构，以噬菌体展示技术研究超高压破坏β‑伴大豆球蛋白的抗原区域，通过在噬菌体表面呈现β‑伴大豆球蛋白β亚基及其overlapping蛋白，对超高压方法导致β‑伴大豆球蛋白β亚基抗原性降低的区域进行精确定位。为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，也可以进一步发展出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。

Description

一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的β-伴大豆球蛋白 β亚基抗原区域及筛选方法

技术领域

本发明涉及分子生物学、免疫学、生物信息学领域，特别是涉及一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域。

背景技术

大豆富含优质蛋白且其来源广泛，是食用较多且廉价的植物蛋白资源，在我国已有数千年的种植历史，是我国主要粮食作物之一。大豆氨基酸种类多达18种，尤其富含赖氨酸，与谷类食物同时食用可基本满足人体所需氨基酸种类和数量。大豆中油脂含量是仅次于蛋白质的物质，其中富含优质不饱和脂肪酸，对人体心血管的健康有极大的好处。大豆所含的大豆异黄酮，大豆低聚糖，以及含有的丰富维生素及钙质，这些使得大豆有“植物肉”的称号。但是，大豆也是八类过敏食物之一，按成分沉降系数不同分为2S组分8％-22％、7S组分35％、11S组分31％-52％、15S组分5％及少量其它成分。7S组分中85％是β-伴大豆球蛋白，11S组分中约85％是大豆球蛋白。其中7S组分球蛋白中的Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和β-伴大豆球蛋白是大豆的主要致敏原。β-伴大豆球蛋白包含三个亚基，分别是α亚基(72kDa)、α'亚基(76kDa)和β亚基(54kDa)，它们以同源或异源的三聚体形式存在。由于大豆制品广泛应用于食品、工业、医药以及饲料等行业，这样就很容易直接或间接接触大豆过敏原，尽管各行各业都采用不同的方法对大豆过敏原进行加工处理。但是，大豆致敏的危害广泛且风险较高，所产生的直接或间接伤害对过敏患者及家庭，以及卫生系统和全社会都有严重的影响。

B细胞抗原表位是一种能特异性识别并结合B细胞表面受体(B cell receptor,BCR)或者抗体Fab部分的化学基团，是引发体液免疫的基础，B细胞在发展成熟的过程中由于发生基因重排，产生具有识别不同抗原表位的特异性B细胞。根据抗原表位结构和受体细胞不同，抗原表位可分为线性表位和构象表位。其中，线性表位是指几个连续的氨基酸组成的一级结构区域，此类表位一般不位于抗原分子表面，必须由抗原呈递细胞将抗原处理为多肽链且与MHC分子结合才能被T细胞或部分B细胞识别，构象表位由相连或不相连、但在空间上相互临近的氨基酸或者多糖组成。此类表位一般位于天然抗原分子表面，且不必经过吞噬加工处理即可被B细胞识别，所以称为B细胞抗原表位。B细胞抗原表位作为抗原的核心部分，在食品安全领域自然而然成为研究免疫机制和诊断的重点。近些年来随着抗原表位预测及鉴定方法的不断增加，为抗原表位的研究提供了方向，从而避免了传统方法研究的盲目性，节约了大量实验人员研究的工作量。噬菌体展示技术是上个世纪80年代兴起的一种生物学技术，该技术以噬菌体为载体，将外源基因整合到噬菌体基因组中，使得外源蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而实现基因型和表型的筛选。噬菌体展示技术将DNA编码的蛋白质片段作为噬菌体衣壳蛋白的一部分表达出来，从而可以实现在大肠杆菌中表达数百万大库容的文库。随着噬菌体技术的不断发展和完善，该技术在医药、食品、农业领域得到广泛的应用，包括抗生素分析的应用，生物毒素的应用，农兽药小分子的应用，而应用噬菌体展示技术对大豆过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基表位定位的研究还未见报道，特别是定位经超高压处理后破坏的过敏原表位更未见相关文献。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域及其筛选方法，为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，进一步发展出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域，所述抗原区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

所述β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原表位为T7噬菌体展示。

β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原表位为转录或翻译出来的核苷酸序列。

加工破坏为超高压破坏。

一种基于噬菌体展示技术定位加工破坏β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域的方法，包括以下步骤：

(1)对β-伴大豆球蛋白β亚基进行加工破坏，并将加工破坏后的β-伴大豆球蛋白β亚基加入到制备的多克隆抗体中，制得加工破坏的过敏原表位特异性抗体；

(2)根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将β-伴大豆球蛋白β亚基氨基酸序列分为3段，设计β亚基overlapping蛋白；

(3)以噬菌体展示技术研究加工破坏β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域，在噬菌体表面呈现β亚基及其overlapping蛋白；

(4)利用间接阻断ELISA法对加工破坏导致β-伴大豆球蛋白β亚基抗原性降低的区域进行精确定位。

所述β-伴大豆球蛋白β亚基overlapping蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.3所示。

本发明有益效果：

本发明利用一系列生物信息学软件并参照PDB数据库已解析的β-伴大豆球蛋白三维晶体结构，以噬菌体展示技术研究超高压破坏β-伴大豆球蛋白的抗原区域，通过在噬菌体表面呈现β-伴大豆球蛋白β亚基及其overlapping蛋白，对超高压方法导致β-伴大豆球蛋白β亚基抗原性降低的区域进行精确定位。为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，也可以进一步发展出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。

附图说明

图1为β-伴大豆球蛋白β亚基及其片段的PCR扩增结果。图中，M为DNA markerDL2000，1为β亚基片段，2为A片段，3为B片段，4为C片段。

图2为重组质粒的PCR与双酶切鉴定结果。图中，M为DNA marker DL2000，左图为PCR鉴定，右图为双酶切鉴定。1为β亚基片段，2为A片段，3为B片段，4为C片段。

图3为重组噬菌体表面形成的噬菌斑。

图4为重组噬菌体的PCR鉴定结果。图中，M为DNA marker DL2000，1、2下标表示随机挑取的两个重组噬菌斑。

图5为β亚基重组噬菌体及片段表达蛋白ELISA鉴定结果，间接法血清为兔多克隆抗体，阻断法血清为抗原吸收血清。

图6为C片段重组噬菌体及分段表达蛋白ELISA鉴定结果，血清同图5，空白对照(kb)为空载噬菌体蛋白。

图7为C-2片段重组噬菌体及分段表达蛋白ELISA鉴定结果，血清同图5，空白对照(kb)为空载噬菌体蛋白。

具体实施方式

实施例1、超高压处理破坏的过敏原表位特异性抗体的制备

1、超高压处理β-伴大豆球蛋白：

将浓度为15mg/mL的β-伴大豆球蛋白，置于无菌均质袋内，封口抽真空，将封闭好的均质袋置于超高压处理装置的处理腔(23℃)内，开始升压，升压速率为250MPa/min，当压强升至455MPa，保压18min，再卸压，卸压速率为300MPa/min。处理后的β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为49.59％。

2、制备超高压处理破坏的过敏原表位特异性抗体(抗原吸收血清)：

用天然的β-伴大豆球蛋白饲喂新西兰大白兔，制备β-伴大豆球蛋白多克隆抗体(产物1)。将过量的经过超高压处理的β-伴大豆球蛋白加入到制备的多克隆抗体中，37℃温育1h，离心去沉淀，收集上清液，上清液即为抗原吸收血清(产物2)，保存于-20℃。

实施例2、β-伴大豆球蛋白β亚基基因重叠(overlapping)分段克隆

1、β-伴大豆球蛋白β亚基基因的克隆

通过NCBI GenBank数据库检索到β-伴大豆球蛋白β亚基(LOC547465)的氨基酸序列。登录PDB数据库检索β-伴大豆球蛋白β亚基的同源蛋白质，作为三级结构的预测模板。登录SWISS-MODEL同源建模服务器，对β-伴大豆球蛋白β亚基的三级结构进行预测。根据β-伴大豆球蛋白β亚基的三级结构模型，在DiscoTope 2.0网络服务器中预测其构象表位。根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将β-伴大豆球蛋白β亚基氨基酸序列分为3段，每一序列与前一序列重叠约40个氨基酸残基(下划线标出)。β-伴大豆球蛋白β亚基系列overlapping片段设计如下：

A：25aa-200aa(73～600bp)

KVREDENNPFYFRSSNSFQTLFENQNGRIRLLQRFNKRSPQLENLRDYRIVQFQSKPNTILLPHHADADFLLFVLSGRAILTLVNNDDRDSYNLHPGDAQRIPAGTTYYLVNPHDHQNLKIIKLAIPVNKPSRYDDFFLSSTQA QQSYLQGFSHNILETSFHSEFEEINRVLFGEE(SEQ ID NO.1)

B：160aa-310aa(478～930bp)

DFFLSSTQAQQSYLQGFSHNILETSFHSEFEEINRVLFGEEEEQRQQEGVIVELSKEQIRQLSRRAKSSSRKTISSEDEPFNLRSRNPIYSNNFGKFFEITPEKNPQPRDLDIFLSSVDINEGALLLPHFNSKAIVILVINEGD ANIELVG(SEQ ID NO.2)

C：270aa-439aa(808～1317bp)

LDIFLSSVDINEGALLLPHFNSKAIVILVINEGDANIELVGIKEQQQKQKQEEEPLEVQRYRAELSEDDVFVIPAAYPFVVNATSNLNFLAFGINAENNQRNFLAGEKDNVVRQIERQVQELAFPGSAQDVERLLKKQRESYFVDAQPQQKEEGSKGRKGPFPSILGALY(SEQ ID NO.3)

利用DNAstar、primer 5.0软件设计引物，在上下游引物的5′端分别加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点(下划线标出)和保护碱基，序列如下：

βA up 5’-TACGAATTCAAGGTGAGAGAGGATGAG-3’(SEQ ID NO.4)

βA down 5’-CTCAAGCTTTTCCTCTCCAAACAAAAC-3’(SEQ ID NO.5)

βB up 5’-GCGGAATTCGATTTCTTCTTATCTAGC-3’(SEQ ID NO.6)

βB down 5’-CCTAAGCTTGTTCAATGTTTGCATCT-3’(SEQ ID NO.7)

βC up 5’-ACCGAATTCTTGGATATCTTCCTCAGT-3’(SEQ ID NO.8)

βC down 5’-ACTAAGCTTGTAGAGAGCACCTAAGATTG-3’(SEQ ID NO.9)

以β-伴大豆球蛋白β亚基基因的序列信息，作为PCR反应的模板，由上海生工合成并保存于PUC57质粒载体中。PCR反应体系如下：

反应程序：94℃预变性，5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物以2％琼脂糖电泳检查，将PCR产物切胶回收与pMD18-T载体相连，16℃水浴过夜，反应体系为：pMD18-T vector(50ng/mL)2.0μL、DNA 3.0μL、DNA连接酶(350U/μL)5.0μL。

PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶进行分析(图1)。结果表明，利用PCR技术分别扩增的β-伴大豆球蛋白β亚基overlapping分段基因，扩增产物与预期大小一致。

2、β-伴大豆球蛋白β亚基在大肠杆菌中的表达(重组质粒的构建)

将50μL JM109感受态细胞于冰上融化，用预冷枪头吸取10μL连接产物，转移至50μL感受态细胞中，轻摇混匀后至于冰上30min。然后置于42℃水浴锅中热激60-90s，然后置于冰上冷却2-3min，最后加入900μL 37℃预热的LB液体培养基震荡培养1h。与此同时，将50μLx-gal(20mg/mL)和13μL IPTG(50mg/mL)涂布于含50μg/mL氨苄青霉素(Amp⁺)的LB琼脂平板上，37℃预热0.5h。将培养液于4000rpm离心2min，移去上清800μL培养液，将剩余200μL培养液吹打均匀后平铺在预热的上述平板上，37℃恒温培养1h，直至形成肉眼可见的蓝白菌斑。

次日挑取白斑菌落，接种于含50μg/mL Amp⁺的LB液体培养基培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒。

3、质粒的小量提取

依照质粒小提试剂盒说明书进行提取，试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，制备管中的膜可以选择性的吸附DNA，从而可以达到快速提取质粒的目的。取1-4mL菌液12000g离心1min后移弃上清，加入250μL的Buffer S1悬浮沉淀，使液体均匀，然后加入250μLBufferS2，温和的上下翻转EP管使细菌裂解直至澄清，时间不能超过5min，注意Buffer S2使用完需盖紧瓶盖，避免与空气中的CO₂反应从而导致溶液失效，后加入350μL Buffer S3，温和翻转若干次使液体中和，12000g离心10min。吸取上清液体转移到制备管中，制备管置回离心管，12000g离心1min，弃滤液。再次将制备管置于离心管，加入500μL Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液，重复操作一次，最后将制备管置于离心管中，12000g离心1min。将制备管放入干净的1.5mL EP管中，向膜中央加入60μL 50℃预热的Eluent或双蒸水，室温静置1min后12000g离心1min。用核酸测定仪测定DNA溶液的含量。

4、重组质粒的酶切鉴定

用EcoRⅠ、HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下：

混匀后37℃水浴4h，酶切产物用2％琼脂糖凝胶进行分析(图2)。

5、重组质粒的PCR鉴定

应用25μL PCR反应体系鉴定重组质粒：

PCR反应参数如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物以2％琼脂糖电泳检查(图2)。结果发现，ABC三个片段的条带与预期一致，说明β-伴大豆球蛋白β亚基分段基因成功转入大肠杆菌中。

实施例3、Overlapping片段的噬菌体表面呈现

1、β-伴大豆球蛋白β亚基基因及其片段的酶切回收

用EcoRⅠ、HindⅢ对重组质粒进行双酶切，切取β-伴大豆球蛋白β亚基及其片段，方法同实施例2，酶切产物用2％琼脂糖凝胶进行分离，切取目的DNA胶块后，用胶回收试剂盒回收目的片段。

2、噬菌体包装

以1:1-3:1(插入：载体)的摩尔比将回收纯化的目的片段与载体臂连接，连接体系如下：

上下轻吸混匀，然后在16℃孵育3-16h或储存于4℃直至使用。在连接产物中加入5倍体积的包装提取物，移液管尖端轻轻搅拌混合，室温(22℃)下孵育2h，加入9倍体积的无菌LB或TB培养基终止反应。阴性对照噬菌体不连接目的片段，其它操作步骤同上。

3、重组噬菌体滴度测定

用含羧苄青霉素(Carb+)的LB固体培养基活化大肠杆菌BLT5615，挑取形态完整的单菌落接种于M9TB培养基(20×M9盐溶液5mL，20％葡萄糖2mL，1M MgSO₄ 0.1mL，T B/LB培养基100mL)(20×M9盐溶液：NH₄Cl 20g，KH₂PO₄ 60g，Na₂HPO₄·7H₂O 120g，定容至1L，高压蒸汽灭菌20min)的试管中，37℃下震荡培养至OD₆₀₀＝0.5，加入IPTG至终浓度1mM，再培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0。用TB培养基对噬菌体包装产物进行10^-3-10^-9倍比稀释，取不同稀释度的噬菌体100μL，与250mL BLT5615培养物、3mL50℃预热的0.6％上层琼脂糖均匀混合，铺在Carb+LB固体培养基上，37℃培养4h后观察噬菌斑，对噬菌斑进行平板计数，计算噬菌体滴度，由滴度计算公式得出重组噬菌体的滴度为1.6×10⁵pfu。

PFV/mL＝(X pfu/0.1mL)×10^Y(X为平板菌斑数、Y为相应稀释倍数)

4、重组噬菌体的PCR鉴定

随机挑取多个噬菌斑于TE缓冲液(100μL)中65℃加热10min，12000r/min离心，取上清作为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：

2％琼脂糖凝胶电泳检查噬菌体重组率及插入片段大小(图4)。电泳结果显示重组率高达90％，DNA测序结果证明片段正确。

5、重组噬菌体的扩大培养及纯化

重组的噬菌体采用液体培养法扩大培养，宿主菌为BLT5615工程菌，先划线培养-80℃冻藏的BLT5615菌液，挑取形态完整无杂菌的BLT5615菌落，用含羧苄青霉素的M9TB诱导培养0.5h，当OD₆₀₀值0.6-1.0时停止培养。将重组的噬菌体接种于BLT5615宿主菌液中，室温静置培养4h，待培养液澄清后停止培养，离心噬菌体裂解物，弃去沉淀，收集上清液。

噬菌体上清液采用PEG法纯化富集噬菌体颗粒。首先加入DNA和RNA酶室温静置0.5h消化BLT5615菌基因杂段，加入PEG8000和氯化钠溶解上清液并静置冰浴1h以上以沉淀噬菌体颗粒，离心取沉淀，沉淀用无菌SM缓冲液重悬噬菌体颗粒，室温孕育1h后加入氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG及BLT5615细胞碎片，震荡后离心分离上层水相，即为纯化富集的噬菌体。用蛋白质核酸测定仪测定噬菌体含量。

实施例4、被破坏过敏原表位的筛选

重组噬菌体鉴定采用间接和阻断ELISA法，包被抗原为CBS缓冲液稀释的浓度为50μg/mL的噬菌体溶液，间接法一抗为1:1500倍数稀释的兔多克隆抗体(实施例1步骤2产物1)混入同体积PBS溶液，阻断法一抗为1：1500倍数稀释的抗原吸收血清(实施例1步骤2产物2)，二抗为1:5000倍PBST溶液稀释的羊抗兔抗体，37℃孕育0.5h，观察两组实验颜色变化差异，最后加入H₂SO₄终止反应，酶标仪测定其OD₄₅₀值。ELISA实验结果表明(图5)，C段具有明显优势抗原位点且破坏较其它片段显著。

实施例5、精确定位被加工破坏的β-伴大豆球蛋白β亚基抗原区域

精确定位被超高压破坏的β亚基抗原区域：对所筛选到的所有阳性噬菌体克隆片段进行进一步的overlapping分段：第二轮分段的氨基酸序列：

(C1)LDIFLSSVDINEGALLLPHFNSKAIVILVINEGDANIELVGIKEQQQKQKQEEEPLEVQRYRAELSEDDVFVIPA(SEQ ID NO.10)

(C2)YRAELSEDDVFVIPAAYPFVVNATSNLNFLAFGINAENNQRNFLAGEKDNVVRQIERQVQELAFPGSAQD(SEQ ID NO.11)

(C3)ERQVQELAFPGSAQDVERLLKKQRESYFVDAQPQQKEEGSKGRKGPFPSILGAL Y(SEQ IDNO.12)

第二轮分段中，C2片段较其它两个片段具有优势抗原位点，且加入超高压破坏抗原的抗体的OD值较其它高，说明该段为超高压破坏抗原的优势片段(图6)。

第三轮分段的氨基酸序列：

(C2-1)YRAELSEDDVFVIPAAYPFVVNATSNLNF(SEQ ID NO.13)

(C2-2)PFVVNATSNLNFLAFGINAENNQRNFLAGEKDNVVRQ(SEQ ID NO.14)

(C2-3)DNVVRQIERQVQELAFPGSAQD(SEQ ID NO.15)

同上分析，最后得到超高压处理破坏最显著片段为(图7)：C2-3段：

³⁷⁹DNVVRQIERQVQELAFPGSAQD⁴⁰⁰

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南工业大学

<120> 一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的β-伴大豆球蛋白β亚基抗原区域及筛选方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 176

<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 1

Lys Val Arg Glu Asp Glu Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Arg Ser Ser Asn

1 5 10 15

Ser Phe Gln Thr Leu Phe Glu Asn Gln Asn Gly Arg Ile Arg Leu Leu

20 25 30

Gln Arg Phe Asn Lys Arg Ser Pro Gln Leu Glu Asn Leu Arg Asp Tyr

35 40 45

Arg Ile Val Gln Phe Gln Ser Lys Pro Asn Thr Ile Leu Leu Pro His

50 55 60

His Ala Asp Ala Asp Phe Leu Leu Phe Val Leu Ser Gly Arg Ala Ile

65 70 75 80

Leu Thr Leu Val Asn Asn Asp Asp Arg Asp Ser Tyr Asn Leu His Pro

85 90 95

Gly Asp Ala Gln Arg Ile Pro Ala Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Val Asn

100 105 110

Pro His Asp His Gln Asn Leu Lys Ile Ile Lys Leu Ala Ile Pro Val

115 120 125

Asn Lys Pro Ser Arg Tyr Asp Asp Phe Phe Leu Ser Ser Thr Gln Ala

130 135 140

Gln Gln Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser His Asn Ile Leu Glu Thr Ser

145 150 155 160

Phe His Ser Glu Phe Glu Glu Ile Asn Arg Val Leu Phe Gly Glu Glu

165 170 175

<210> 2

<211> 151

<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 2

Asp Phe Phe Leu Ser Ser Thr Gln Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Gln Gly

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Ile Asn Arg Val Leu Phe Gly Glu Glu Glu Glu Gln Arg Gln Gln Glu

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65 70 75 80

Phe Asn Leu Arg Ser Arg Asn Pro Ile Tyr Ser Asn Asn Phe Gly Lys

85 90 95

Phe Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn Pro Gln Pro Arg Asp Leu Asp

100 105 110

Ile Phe Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Glu Gly Ala Leu Leu Leu Pro

115 120 125

His Phe Asn Ser Lys Ala Ile Val Ile Leu Val Ile Asn Glu Gly Asp

130 135 140

Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly

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<210> 3

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<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 3

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Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly Ile Lys Glu Gln Gln Gln Lys

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Gln Lys Gln Glu Glu Glu Pro Leu Glu Val Gln Arg Tyr Arg Ala Glu

50 55 60

Leu Ser Glu Asp Asp Val Phe Val Ile Pro Ala Ala Tyr Pro Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe Leu Ala Phe Gly Ile Asn Ala

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Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Glu Lys Asp Asn Val Val

100 105 110

Arg Gln Ile Glu Arg Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe Pro Gly Ser Ala

115 120 125

Gln Asp Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gln Arg Glu Ser Tyr Phe Val

130 135 140

Asp Ala Gln Pro Gln Gln Lys Glu Glu Gly Ser Lys Gly Arg Lys Gly

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Pro Phe Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Tyr

165 170

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tacgaattca aggtgagaga ggatgag 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ctcaagcttt tcctctccaa acaaaac 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

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<400> 6

gcggaattcg atttcttctt atctagc 27

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cctaagcttg ttcaatgttt gcatct 26

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

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accgaattct tggatatctt cctcagt 27

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<212> DNA

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actaagcttg tagagagcac ctaagattg 29

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<212> PRT

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Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly Ile Lys Glu Gln Gln Gln Lys

35 40 45

Gln Lys Gln Glu Glu Glu Pro Leu Glu Val Gln Arg Tyr Arg Ala Glu

50 55 60

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<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 11

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Tyr Pro Phe Val Val Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe Leu Ala Phe

20 25 30

Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Glu Lys

35 40 45

Asp Asn Val Val Arg Gln Ile Glu Arg Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe

50 55 60

Pro Gly Ser Ala Gln Asp

65 70

<210> 12

<211> 55

<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 12

Glu Arg Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe Pro Gly Ser Ala Gln Asp Val

1 5 10 15

Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gln Arg Glu Ser Tyr Phe Val Asp Ala Gln

20 25 30

Pro Gln Gln Lys Glu Glu Gly Ser Lys Gly Arg Lys Gly Pro Phe Pro

35 40 45

Ser Ile Leu Gly Ala Leu Tyr

50 55

<210> 13

<211> 29

<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 13

Tyr Arg Ala Glu Leu Ser Glu Asp Asp Val Phe Val Ile Pro Ala Ala

1 5 10 15

Tyr Pro Phe Val Val Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe

20 25

<210> 14

<211> 37

<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 14

Pro Phe Val Val Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe Leu Ala Phe Gly

1 5 10 15

Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Glu Lys Asp

20 25 30

Asn Val Val Arg Gln

35

<210> 15

<211> 22

<212> PRT

<213> β-伴大豆球蛋白β亚基()

<400> 15

Asp Asn Val Val Arg Gln Ile Glu Arg Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe

1 5 10 15

Pro Gly Ser Ala Gln Asp

20

Claims

1.一种基于噬菌体展示技术定位加工破坏β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域的氨基酸序列方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用天然的β-伴大豆球蛋白饲喂新西兰大白兔，制备β-伴大豆球蛋白多克隆抗体；将过量的经过超高压处理的β-伴大豆球蛋白加入到制备的β-伴大豆球蛋白多克隆抗体中，37℃温育1h，离心去沉淀，收集上清液，保存于-20℃，制得超高压处理破坏的过敏原表位特异性抗体；

（2）根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将β-伴大豆球蛋白β亚基氨基酸序列分为3段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示，设计β亚基重叠蛋白；

（3）以噬菌体展示技术研究加工破坏β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域，在噬菌体表面呈现β亚基及其重叠蛋白；

（4）利用间接ELISA法、阻断ELISA法进行被破坏过敏原表位的筛选：包被抗原为CBS缓冲液稀释的浓度为50 μg/mL的噬菌体溶液，间接ELISA法一抗为1:1500倍数稀释的多克隆抗体混入同体积PBS溶液，所述多克隆抗体即为步骤（1）中制备的多克隆抗体；阻断ELISA法一抗为1：1500倍数稀释的抗原吸收血清，所述抗原吸收血清即为步骤（1）中制备的加工破坏的过敏原表位特异性抗体；二抗为1:5000倍PBST溶液稀释的羊抗兔抗体，37℃孕育0.5h，观察两组实验颜色变化差异，最后加入H₂SO₄终止反应，酶标仪测定其OD₄₅₀值；

精确定位被超高压破坏的β亚基抗原区域：对所筛选到的所有阳性噬菌体克隆片段进行进一步的重叠分段，第二轮分段的氨基酸序列：SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12；第三轮分段的氨基酸序列：SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15，最后得到超高压处理破坏最显著片段的氨基酸序列为SEQ ID NO.15。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原区域为T7噬菌体展示。