CN108329384B

CN108329384B - 一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的Gly m Bd 60K蛋白抗原区域及筛选方法

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Publication number: CN108329384B
Application number: CN201810166598.XA
Authority: CN
Inventors: 席俊; 贺梦雪; 谢岩黎; 于秋荣; 陈阳
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: CN108329384A

Abstract

本发明公开了一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的Gly m Bd 60K蛋白抗原区域及筛选方法，所述抗原区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。本发明利用一系列生物信息学软件并参照PDB数据库已解析的β‑伴大豆球蛋白三维晶体结构，以噬菌体展示技术研究加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，通过在噬菌体表面呈现Gly m Bd 60K及其overlapping蛋白，对不同加工方法导致Gly m Bd 60K蛋白抗原性降低的区域进行精确定位。为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，也可以进一步发展出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。

Description

一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的Gly m Bd 60K蛋白抗原区域及筛选方法

技术领域

本发明涉及分子生物学、免疫学、生物信息学领域，特别是涉及一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域。

背景技术

大豆原产于中国，迄今为止已有近七千年的种植历史。大豆中蛋白含量为35％-38％，且富含不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和其他营养成分，具有极高的营养价值，是优质蛋白的重要来源，已广泛应用于食品加工中。但是有少部分人却因对大豆及其制品过敏不能从中获益，通常的症状为起疹子、皮肤发痒、腹泻等。同时有调查显示，随着豆制品消费量的增加，大豆过敏的发病率不断上升。另外，大豆过敏原蛋白也能引起仔猪和妊娠母猪、犊牛、小鼠、养殖鱼类等多种动物的过敏反应，导致动物小肠绒毛萎缩、隐窝增生，肠内组胺释放量增加等过敏性损伤，进而导致消化吸收障碍和过敏性腹泻等病理现象的发生，因此限制了大豆及其制品在食品和饲料中的应用。

已有研究证明，大豆的致敏性，主要是由β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、Gly m Bd30K(P34)和Gly m Bd 28K引起的。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白也是大豆中的主要蛋白。β-伴大豆球蛋白是由α’(58～83kDa)、α(58～77kDa)和β(42～53kDa)三种亚基组成的三聚体复合物，其含量分别为45％、35％和20％。β-伴大豆球蛋白的三个亚基均存在过敏原性，目前的研究资料证明Gly m Bd 60K即β-伴大豆球蛋白的α亚基是易感人群的重要过敏原，也是最早被公认的主要过敏原蛋白，能被25％的大豆过敏患者的血清所识别。Gly m Bd 60K的mRNA全长为1955nt，带有poly(A)尾巴，编码605个氨基酸，在N-端含有一个22个氨基酸的信号肽，去除信号肽后的前体肽为583个氨基酸，最后在加工过程中又从N-端剪掉40个氨基酸，形成543个氨基酸的成熟α亚基。

表位(epitope)又称抗原决定簇，是决定抗原特异性的特殊化学基团，也是过敏反应的物质基础。表位通常位于分子表面，大小相当于抗体的结合部位，一般由5-7个氨基酸、单糖或核苷酸组成。根据表位的结构特点分为连续性表位(线性表位)和非连续性表位(构象性表位)；按结合受体细胞不同，分为B细胞表位和T细胞表位。表位类型的不同是造成食物过敏复杂性的关键因素之一。表位定位技术是过敏原表位研究的工具，包括表位定位和表位预测两种。表位预测是运用生物信息学方法对过敏原表位进行预测。传统的表位定位技术如酶解技术、肽扫描技术存在特异性差、费时和昂贵等缺点，而新的过敏原表位定位技术从噬菌体展示技术诞生开始有了新进展。噬菌体展示技术(Phage display technology,PDT)是一种能够将所需性质的多肽从含有大量变异体的集落中提取出来的体外筛选技术。噬菌体展示系统(phage display system)主要分为丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。跟前面几种展示系统相比，T7噬菌体展示系统最大的优点为它能以高拷贝量展示含50个氨基酸残基的多肽片段和以低拷贝量或以中拷贝量展示含1200个氨基酸残基的外源多肽或蛋白质。此外，它还具有生长迅速、性质稳定、无辅助噬菌体进行包装等特殊性质。目前对大豆过敏原Gly m Bd 60K蛋白的研究主要集中在Gly m Bd 60K蛋白致敏性鉴定、线性表位预测及定位、检测分析、脱敏技术研究等，而应用噬菌体展示技术对大豆过敏原Gly m Bd 60K蛋白表位定位的研究还未见报道，特别是定位经加工处理后破坏的过敏原表位更未见相关文献。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，进一步发展出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，所述抗原区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

Gly m Bd 60K蛋白的抗原表位为T7噬菌体展示。

Gly m Bd 60K蛋白的抗原表位为转录或翻译出来的核苷酸序列。

一种基于噬菌体展示技术定位加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域的方法，包括以下步骤：

(1)对β-伴大豆球蛋白进行加工处理，并将处理后的β-伴大豆球蛋白加入到制备的多克隆抗体中，制得处理破坏的过敏原表位特异性抗体；

(2)根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将Gly m Bd 60K氨基酸序列分为4段，设计Gly m Bd 60K overlapping蛋白；

(3)以噬菌体展示技术研究加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，在噬菌体表面呈现Gly m Bd 60K及其overlapping蛋白；

(4)利用间接竞争ELISA法对不同加工处理方法导致Gly m Bd 60K蛋白抗原性降低的区域进行精确定位。

加工处理的方法为超高静压处理、热处理和糖基化处理。

Gly m Bd 60K overlapping蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示。

本发明有益效果：

本发明利用一系列生物信息学软件并参照PDB数据库已解析的β-伴大豆球蛋白三维晶体结构，以噬菌体展示技术研究加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，通过在噬菌体表面呈现Gly m Bd 60K及其overlapping蛋白，对不同加工方法导致Gly m Bd 60K蛋白抗原性降低的区域进行精确定位。为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，也可以进一步发展出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。

附图说明

图1为Gly m Bd 60K基因及其片段的PCR扩增结果。图中，M为DNA marker DL2000，1为A片段，2为B片段，3为C片段，4为D片段。

图2为重组质粒的PCR与双酶切鉴定结果。图中，M为DNA marker DL2000，1为PCR鉴定，2为双酶切鉴定。

图3为重组噬菌体表面形成的噬菌斑。

图4为重组噬菌体的PCR鉴定结果。图中，M为DNA marker DL2000，上图中1-7为重组噬菌斑PCR鉴定，8-9为阴性对照；下图中1-10为重组噬菌斑PCR鉴定。

图5为重组噬菌体纯化结果。图中，1为DNA marker HindIII digest，2为Gly m Bd60K，3为A片段，4为B片段，5为C片段，6为D片段，7为未纯化噬菌体，8为DNA marker DL2000。

图6为纯化噬菌体Western Blot鉴定结果。图中，M为低分子量蛋白Marker，1为阴性对照，2为A片段，3为B片段，4为C片段，5为D片段。

图7为噬菌体表达蛋白与被加工破坏特异性抗体的反应结果。

图8为噬菌体表达蛋白(C片段)与被加工破坏特异性抗体的反应结果。

图9为噬菌体表达蛋白(C片段分段)与被加工破坏特异性抗体的反应结果。

具体实施方式

实施例1、超高静压处理破坏的过敏原表位特异性抗体的制备

1、超高静压处理β-伴大豆球蛋白：

将浓度为15mg/mL的β-伴大豆球蛋白，置于无菌均质袋内，封口抽真空，将封闭好的均质袋置于超高静压处理装置的处理腔(23℃)内，开始升压，升压速率为250MPa/min，当压强升至455MPa，保压18min，再卸压，卸压速率为300MPa/min。处理后的β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为49.59％。

2、制备超静高压处理破坏的过敏原表位特异性抗体(抗原吸收多克隆抗体)：

用天然的β-伴大豆球蛋白饲喂新西兰大白兔，制备β-伴大豆球蛋白多克隆抗体。将过量的经过超高静压处理的β-伴大豆球蛋白加入到制备的多克隆抗体中，37℃温育1h，离心去沉淀，收集上清液，-20℃保存。

实施例2、热处理破坏的过敏原表位特异性抗体的制备

1、热处理β-伴大豆球蛋白：

将浓度为10mg/mL的β-伴大豆球蛋白，置于烧杯中，90℃水浴加热60min。处理后的β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为38.4％。

2、制备热处理破坏的过敏原表位特异性抗体：

方法同实施例1。

实施例3、糖基化处理破坏的过敏原表位特异性抗体的制备

1、糖基化处理β-伴大豆球蛋白：

将β-伴大豆球蛋白与葡萄糖(质量比为4:1)溶解于蒸馏水中，使混合溶液的终浓度为6％，混合均匀后真空冷冻干燥，将冻干后的样品置于恒温恒湿培养箱中，调整相对湿度为79％，温度为60℃，反应2.5天。处理后的β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为42.8％。

2、制备糖基化处理破坏的过敏原表位特异性抗体：

方法同实施例1。

实施例4、Gly m Bd 60K基因重叠(overlapping)分段克隆

1、Gly m Bd 60K基因的克隆

通过NCBI GenBank数据库检索到Gly m Bd 60K(LOC547464)的氨基酸序列。登录PDB数据库检索Gly m Bd 60K的同源蛋白质，作为三级结构的预测模板。登录SWISS-MODEL同源建模服务器，对Gly m Bd 60K的三级结构进行预测。根据Gly m Bd 60K的三级结构模型，在DiscoTope 2.0网络服务器中预测其构象表位。登录SignalP-4.1Server预测信号肽，信号肽一般不会成为抗原表位，分段时不予考虑。根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将Gly m Bd 60K氨基酸序列分为4段，每一序列与前一序列重叠约30-50个氨基酸残基(下划线标出)。Gly m Bd 60K系列overlapping片段设计如下：

A：15-230aa(105-752bp)

LASVSVSFGIAYWEKQNPKHNKCLQSCNSERDSYRNQACHARCNLLKVEKEEECEEGEIPRPRPRPQHPEREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPRQPRQEEEHEQREEQEWPRKEEKRGEKGSEEEQDGREHPRPHQPHDEDEEQDERQFPFPRPPHQKESEERKQEEDEDEEQQRESEESESSESQRELRRHKNKNPFHFGSNRFETLFKNQYG(SEQID NO.1)

B：200-370aa(660-1172bp)

ESQRELRRHKNKNPFHFGSNRFETLFKNQYGRIRVLQRFNQRSPQLQNLRDYRILEFNSKPNTLLLPNHADADYLIAILNGTAILSLVNNDDRDSYRLQSGDALRVPSGTTYYVVNPDNNENLRLITLAIPVNKPGRFESFFLS STEAQQSYLQGFSRNILEASYDTKFEE(SEQ ID NO.2)

C：321-510aa(1023-1592bp)

NLRLITLAIPVNKPGRFESFFLSSTEAQQSYLQGFSRNILEASYDTKFEEINKVLFSREEGQQQGEQRLQESVIVEISKEQIRALSKRAKSSSRKTISSEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKNPQLRDLDIFLSIVDMN EGALLLPHFNSKAIVILVINEGDANIELVGLKEQQQEEQQEEQPLE(SEQ ID NO.3)

D：460-623aa(1440-1931bp)

IVDMNEGALLLPHFNSKAIVILVINEGDANIELVGLKEQQQEEQQEEQPLEVRKYRAELSEQDIFVIPAGYPVVVNATSNLNFFAIGINAENNQRNFLAGSQDNVISQIPSQVQELAFLGSAQAVEKLLKNQRESYFVDAQPKKKEEGNKGRKGPLSSILRAFY(SEQ ID NO.4)

利用DNAstar、primer 5.0软件设计引物，在上下游引物的5′端分别加入EcoRⅠ和HindIII酶切位点(下划线标出)和保护碱基，序列如下：

αA up 5′-AGTGAATTCCTGGCATCAGTTTCTGTC-3′(SEQ ID NO.5)

αA down 5′-CTGAAGCTTACCATATTGGTTTTTGAAG-3′(SEQ ID NO.6)

αB up 5′-GGAGAATTCGAGTCTCAAAGAGAATTAC-3′(SEQ ID NO.7)

αB down 5′-CTAAAGCTTCTCCTCGAATTTGGTATC-3′(SEQ ID NO.8)

αC up 5′-GCGGAATTCAATCTCAGATTAATAACA-3′(SEQ ID NO.9)

αC down 5′-CTTAAGCTTTTCCAAAGGTTGCTCTTC-3′(SEQ ID NO.10)

αD up 5′-TTGGAATTCATTGTGGATATGAACGAG-3′(SEQ ID NO.11)

αD down 5′-CCTAAGCTTGTAAAAAGCCCTCAAAAT-3′(SEQ ID NO.12)

以Gly m Bd 60K基因(NM_001249927)的序列信息，作为PCR反应的模板，由上海生工合成并保存于PUC57质粒载体中。PCR反应体系如下：

反应程序：94℃预变性，5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖电泳检测PCR产物，切胶回收DNA。将PCR回收的片段与pMD18-T载体相连，16℃水浴过夜，反应体系为：pMD18-T vector(50ng/mL)2.0μL、DNA 3.0μL、DNA连接酶(350U/μL)5.0μL。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行分析(图1)。结果表明，利用PCR技术分别扩增的Gly m Bd 60K overlapping分段基因，扩增产物与预期大小一致。

2、Gly m Bd 60K在大肠杆菌中的表达(重组质粒的构建)

将JM109感受态细胞(-80℃保存)置于冰上融化，吸取10μL连接产物，转移至100μL感受态细胞中，轻摇混匀，冰浴10min。然后在42℃水浴锅内热击90s，随后在冰中冷却2min。最后向管中加入900μL LB液体培养基(不含Amp)，37℃振荡培养60min。将100μL IPTG(50mg/mL)和20μL X-Gal(20mg/mL)均匀涂布于含Amp(100μg/mL)的LB平板上，37℃预热。将振荡培养好的转化菌于5,000g，4℃离心3min，弃上清，加入200μL LB液体培养基(不含Amp)重悬菌体。吹打均匀后涂布于预热的平板上，37℃恒温箱内培养过夜(16-18h)。

次日挑取白斑菌落，接种于含100μg/mL Amp的LB液体培养基培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒。

3、质粒的小量提取

按照质粒小量提取试剂盒使用说明进行提取，具体操作过程如下：

(1)取1-4mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12,000g离心1min，弃尽上清；

(2)加250μL Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；

(3)加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；

(4)加350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转6-8次，12,000g离心10min；

(5)吸取步骤(4)中的离心上清并转移到另一个离心管中，将上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，室温放置2min，12,000g离心1min，弃废液；

(6)将吸附柱置回收集管，加入500μL Buffer W1，12,000g离心1min，弃废液；

(7)将吸附柱置回收集管，加入700μL Buffer W2，12,000g离心1min，弃废液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃废液；

(8)将吸附柱置回收集管，12,000g离心1min；

(9)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加60-80μL Eluent或去离子水，室温静置1min，12,000g离心1min。

4、重组质粒的酶切鉴定

用EcoRⅠ、HindIII对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下：

混匀后37℃水浴4h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行分析(图2)。

5、重组质粒的PCR鉴定

应用25μL PCR反应体系鉴定重组质粒：

PCR反应参数如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物以1％琼脂糖电泳检查(图2)。结果发现，A片段中PCR与酶切均在640bp处有大小相同的条带，B片段中PCR与酶切均在510bp处有大小相同的条带，C片段中PCR与酶切均在570bp处有大小相同的条带，D片段中PCR与酶切均在490bp处有大小相同的条带，与预期一致，说明Gly m Bd 60K overlapping基因成功插入到pMD18-Tvector中。

实施例五、Overlapping片段的噬菌体表面呈现

1、Gly m Bd 60K基因及其片段的酶切回收

用EcoRⅠ、HindIII对重组质粒进行双酶切，切取Gly m Bd 60K及其片段，方法同实施例4，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行分离，切取目的DNA胶块后，用胶回收试剂盒回收目的片段。

2、噬菌体包装

以1:1-3:1(插入：载体)的摩尔比将回收纯化的目的片段与载体臂连接，连接体系如下：

上下轻吸混匀，然后在16℃孵育3-16h或储存于4℃直至使用。在连接产物中加入5倍体积的包装提取物，移液管尖端轻轻搅拌混合，室温(22℃)下孵育2h，加入9倍体积的无菌LB或TB培养基终止反应。

3、重组噬菌体滴度测定

用LB琼脂平板(carb⁺)活化大肠杆菌BLT5615，挑起单菌落，接种于5mL M9TB培养基(20×M9盐溶液5mL，20％葡萄糖2mL，1M MgSO₄ 0.1mL，TB/LB培养基100mL)(20×M9盐溶液：NH₄Cl 20g，KH₂PO₄ 60g，Na₂HPO₄·7H₂O 120g，定容至1L，高压蒸汽灭菌20min)的试管中，37℃下震荡培养至OD₆₀₀＝0.5，加入IPTG至终浓度1mM，再培养30min至OD₆₀₀＝0.6-1.0。用TB培养基对噬菌体包装产物进行10^-3-10^-6倍比稀释，分别取不同稀释度的噬菌体100μL，加入250μL BLT5615培养物(OD₆₀₀＝0.6-1.0)于4mL无菌管中。向管中加入3mL顶层琼脂糖并将内容物倒入预热的(37℃)LB琼脂平板(carb⁺)上。温和旋转板以均匀地铺展琼脂糖。静置几分钟，直到顶部琼脂糖硬化，然后在37℃孵育3-4h或在室温下倒置培养过夜。噬菌体包装物经倍比稀释后与宿主菌及顶层琼脂糖混匀铺板，形成噬菌斑(图3)。对噬菌斑进行计数，测定噬菌体滴度。计算得到重组噬菌体滴度为6×10⁵pfu。

4、重组噬菌体的PCR鉴定

随机挑取多个噬菌斑于TE缓冲液(100μL)中65℃加热10min，12000r/min离心，取上清作为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：

1％琼脂糖凝胶电泳检查噬菌体重组率及插入片段大小(图4)。电泳结果显示重组率高达90％，DNA测序结果证明片段正确。

5、重组噬菌体的扩大培养及纯化

5.1重组噬菌体的扩大培养及保存

用LB液体培养基(carb⁺)活化大肠杆菌BLT5615，37℃震荡培养过夜。将培养物接种于50mL M9TB培养基(carb⁺)中，37℃下震荡培养至OD₆₀₀＝0.5，加入IPTG至终浓度100mg/mL，再培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0。取重组噬菌体接种于BLT5615培养物中，培养2-3h，至培养物裂解澄清，4℃，8000g离心10min，弃沉淀。加入无菌甘油保存于-80℃。

5.2重组噬菌体的纯化

噬菌体裂解物中分别加入DNA酶和RNA酶，室温孵育30min消化DNA及RNA。加入NaCl(终浓度为1M)和PEG8000(终浓度为10％(m/v))，轻摇至溶解，冰浴1h以上沉淀噬菌体颗粒，4℃，11000g离心10min收集噬菌体沉淀。用无菌SM缓冲液(每50mL裂解上清用0.8mL无菌SM溶液)重悬噬菌体颗粒，洗净离心管，室温1h后加入等体积氯仿，温和振荡抽提30s，4℃，3000g离心15min，分离噬菌体水相，备用。

5.3纯化噬菌体的鉴定

取10μL纯化重组噬菌体，65℃加热10min，琼脂糖电泳检测DNA条带纯度。WesternBlot法检测纯化噬菌体的分子量及免疫活性。结果表明，纯化后噬菌体的DNA条带单一，而未经纯化的噬菌体有多条杂带(图5)，且能与特异性抗体反应(图6)，具有免疫活性。

实施例六、被破坏过敏原表位的筛选

超高静压破坏过敏原表位的筛选(间接竞争ELISA法)：将表达Gly m Bd 60Koverlapping片段的所有重组噬菌体和无插入的阴性对照包被于96孔酶标板中，37℃温育1h；经洗涤、封闭，再洗涤后，于37℃将超高静压处理破坏的过敏原表位特异性抗体加入包被重组噬菌体的酶标板中，同时设阴性(一抗为阴性血清)和空白(无插入阴性噬菌体裂解纯化的蛋白)对照，孵育2h；再经洗涤后分别加羊抗兔酶标二抗，37℃孵育1h；经洗涤后并加入TMB单组分显色液，37℃避光显色，然后加入2M的H₂SO₄终止反应，酶标仪读A_450nm值。同时测定加入未加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体的OD值。加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体的反应能力比未加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体的反应能力强，且加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体的OD值和未加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体的OD值相差越大，则破坏效果越显著。

糖基化及热加工破坏过敏原表位的筛选同上述的方法。

间接竞争ELISA结果(图7)表明，相对于未处理破坏的过敏原表位特异性抗体，经过加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体与包被原的反应能力更强，由反应结果可以看出超高静压处理、热处理及糖基化处理破坏最显著的片段均在C片段，其氨基酸序列为：

³²¹NLRLITLAIPVNKPGRFESFFLSSTEAQQSYLQGFSRNILEASYDTKFEEINKVLFSREEGQQQGEQRLQESVIVEISKEQIRALSKRAKSSSRKTISSEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKNPQLRDLDIFLSIVDMNEGALLLPHFNSKAIVILVINEGDANIELVGLKEQQQEEQQEEQPLE⁵¹⁰。

实施例7、精确定位被加工破坏的Gly m Bd 60K抗原区域

精确定位被超高静压破坏的Gly m Bd 60K抗原区域(间接竞争ELISA法)：对所筛选到的所有阳性噬菌体克隆片段进行进一步的overlapping分段，每段序列的长度约为100个氨基酸，每一序列与前一序列重叠约30个氨基酸残基，各个片段经PCR扩增后与T7噬菌体载体相连。然后在T7噬菌体表面表达，测定其与被超静高压破坏过敏原表位特异性抗体的结合特性，开展第二轮的筛选与鉴定，经过2-3轮的分段表达和筛选，对被破坏Gly m Bd60K抗原区域进行精确定位。

精确定位糖基化及热加工破坏的Gly m Bd 60K抗原区域与上述方法相同。

间接竞争ELISA结果(图8)表明，相对于未加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体，超高静压处理破坏最显著的片段在C2和C3片段，热处理对于C2片段破坏最显著，糖基化破坏不明显。综合三种处理方法，下一步研究对于C2片段的分段表达与被破坏抗原区域定位，C2片段的氨基酸序列为：

³⁸⁰EGQQQGEQRLQESVIVEISKEQIRALSKRAKSSSRKTISSEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKNPQLRDLDIFLSIVDMNEGALLL⁴⁷⁰(SEQ ID NO.13)。

对C2片段进一步分段表达、展示，与加工破坏过敏原表位特异性抗体反应结果(图9)表明，超高静压处理破坏最显著的片段在C2-2和C2-1片段、热处理对于C2-1、C2-2和C2-3片段均有破坏，其中，C2-1和C2-2最明显。糖基化对C2-1片段破坏较明显。综合三种处理方法，确定被破坏抗原区域为C2-1和C2-2。其氨基酸序列分别为：

C2-1：³⁸⁰EGQQQGEQRLQESVIVEISKEQIRALSKR⁴⁰⁸(SEQ ID NO.14)

C2-2：⁴⁰⁴ALSKRAKSSSRKTISSEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKN⁴⁴⁸(SEQ ID NO.15)

因此精确定位的加工处理破坏最显著的片段为：

³⁸⁰EGQQQGEQRLQESVIVEISKEQIRALSKRAKSSSRKTISSEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKN⁴⁴⁸(SEQ ID NO.16)。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南工业大学

<120> 一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的Gly m Bd60K蛋白抗原区域及筛选方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 1

Leu Ala Ser Val Ser Val Ser Phe Gly Ile Ala Tyr Trp Glu Lys Gln

1 5 10 15

Asn Pro Lys His Asn Lys Cys Leu Gln Ser Cys Asn Ser Glu Arg Asp

20 25 30

Ser Tyr Arg Asn Gln Ala Cys His Ala Arg Cys Asn Leu Leu Lys Val

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Glu Cys Glu Glu Gly Glu Ile Pro Arg Pro Arg Pro

50 55 60

Arg Pro Gln His Pro Glu Arg Glu Pro Gln Gln Pro Gly Glu Lys Glu

65 70 75 80

Glu Asp Glu Asp Glu Gln Pro Arg Pro Ile Pro Phe Pro Arg Pro Arg

85 90 95

Gln Pro Arg Gln Glu Glu Glu His Glu Gln Arg Glu Glu Gln Glu Trp

100 105 110

Pro Arg Lys Glu Glu Lys Arg Gly Glu Lys Gly Ser Glu Glu Glu Gln

115 120 125

Asp Gly Arg Glu His Pro Arg Pro His Gln Pro His Asp Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Gln Asp Glu Arg Gln Phe Pro Phe Pro Arg Pro Pro His Gln Lys

145 150 155 160

Glu Ser Glu Glu Arg Lys Gln Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Gln Gln

165 170 175

Arg Glu Ser Glu Glu Ser Glu Ser Ser Glu Ser Gln Arg Glu Leu Arg

180 185 190

Arg His Lys Asn Lys Asn Pro Phe His Phe Gly Ser Asn Arg Phe Glu

195 200 205

Thr Leu Phe Lys Asn Gln Tyr Gly

210 215

<210> 2

<211> 171

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 2

Glu Ser Gln Arg Glu Leu Arg Arg His Lys Asn Lys Asn Pro Phe His

1 5 10 15

Phe Gly Ser Asn Arg Phe Glu Thr Leu Phe Lys Asn Gln Tyr Gly Arg

20 25 30

Ile Arg Val Leu Gln Arg Phe Asn Gln Arg Ser Pro Gln Leu Gln Asn

35 40 45

Leu Arg Asp Tyr Arg Ile Leu Glu Phe Asn Ser Lys Pro Asn Thr Leu

50 55 60

Leu Leu Pro Asn His Ala Asp Ala Asp Tyr Leu Ile Ala Ile Leu Asn

65 70 75 80

Gly Thr Ala Ile Leu Ser Leu Val Asn Asn Asp Asp Arg Asp Ser Tyr

85 90 95

Arg Leu Gln Ser Gly Asp Ala Leu Arg Val Pro Ser Gly Thr Thr Tyr

100 105 110

Tyr Val Val Asn Pro Asp Asn Asn Glu Asn Leu Arg Leu Ile Thr Leu

115 120 125

Ala Ile Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Phe Glu Ser Phe Phe Leu Ser

130 135 140

Ser Thr Glu Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn Ile

145 150 155 160

Leu Glu Ala Ser Tyr Asp Thr Lys Phe Glu Glu

165 170

<210> 3

<211> 190

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 3

Asn Leu Arg Leu Ile Thr Leu Ala Ile Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Phe Glu Ser Phe Phe Leu Ser Ser Thr Glu Ala Gln Gln Ser Tyr Leu

20 25 30

Gln Gly Phe Ser Arg Asn Ile Leu Glu Ala Ser Tyr Asp Thr Lys Phe

35 40 45

Glu Glu Ile Asn Lys Val Leu Phe Ser Arg Glu Glu Gly Gln Gln Gln

50 55 60

Gly Glu Gln Arg Leu Gln Glu Ser Val Ile Val Glu Ile Ser Lys Glu

65 70 75 80

Gln Ile Arg Ala Leu Ser Lys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Arg Lys Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Glu Asp Lys Pro Phe Asn Leu Arg Ser Arg Asp Pro Ile

100 105 110

Tyr Ser Asn Lys Leu Gly Lys Phe Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn

115 120 125

Pro Gln Leu Arg Asp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Ile Val Asp Met Asn

130 135 140

Glu Gly Ala Leu Leu Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Ile Val Ile

145 150 155 160

Leu Val Ile Asn Glu Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly Leu Lys

165 170 175

Glu Gln Gln Gln Glu Glu Gln Gln Glu Glu Gln Pro Leu Glu

180 185 190

<210> 4

<211> 164

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 4

Ile Val Asp Met Asn Glu Gly Ala Leu Leu Leu Pro His Phe Asn Ser

1 5 10 15

Lys Ala Ile Val Ile Leu Val Ile Asn Glu Gly Asp Ala Asn Ile Glu

20 25 30

Leu Val Gly Leu Lys Glu Gln Gln Gln Glu Glu Gln Gln Glu Glu Gln

35 40 45

Pro Leu Glu Val Arg Lys Tyr Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gln Asp Ile

50 55 60

Phe Val Ile Pro Ala Gly Tyr Pro Val Val Val Asn Ala Thr Ser Asn

65 70 75 80

Leu Asn Phe Phe Ala Ile Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn

85 90 95

Phe Leu Ala Gly Ser Gln Asp Asn Val Ile Ser Gln Ile Pro Ser Gln

100 105 110

Val Gln Glu Leu Ala Phe Leu Gly Ser Ala Gln Ala Val Glu Lys Leu

115 120 125

Leu Lys Asn Gln Arg Glu Ser Tyr Phe Val Asp Ala Gln Pro Lys Lys

130 135 140

Lys Glu Glu Gly Asn Lys Gly Arg Lys Gly Pro Leu Ser Ser Ile Leu

145 150 155 160

Arg Ala Phe Tyr

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

agtgaattcc tggcatcagt ttctgtc 27

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ctgaagctta ccatattggt ttttgaag 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ggagaattcg agtctcaaag agaattac 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ctaaagcttc tcctcgaatt tggtatc 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gcggaattca atctcagatt aataaca 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cttaagcttt tccaaaggtt gctcttc 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ttggaattca ttgtggatat gaacgag 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cctaagcttg taaaaagccc tcaaaat 27

<210> 13

<211> 91

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 13

Glu Gly Gln Gln Gln Gly Glu Gln Arg Leu Gln Glu Ser Val Ile Val

1 5 10 15

Glu Ile Ser Lys Glu Gln Ile Arg Ala Leu Ser Lys Arg Ala Lys Ser

20 25 30

Ser Ser Arg Lys Thr Ile Ser Ser Glu Asp Lys Pro Phe Asn Leu Arg

35 40 45

Ser Arg Asp Pro Ile Tyr Ser Asn Lys Leu Gly Lys Phe Phe Glu Ile

50 55 60

Thr Pro Glu Lys Asn Pro Gln Leu Arg Asp Leu Asp Ile Phe Leu Ser

65 70 75 80

Ile Val Asp Met Asn Glu Gly Ala Leu Leu Leu

85 90

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 14

Glu Gly Gln Gln Gln Gly Glu Gln Arg Leu Gln Glu Ser Val Ile Val

1 5 10 15

Glu Ile Ser Lys Glu Gln Ile Arg Ala Leu Ser Lys Arg

20 25

<210> 15

<211> 45

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 15

Ala Leu Ser Lys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Arg Lys Thr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Glu Asp Lys Pro Phe Asn Leu Arg Ser Arg Asp Pro Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Lys Leu Gly Lys Phe Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn

35 40 45

<210> 16

<211> 69

<212> PRT

<213> Gly m Bd 60K蛋白()

<400> 16

Glu Gly Gln Gln Gln Gly Glu Gln Arg Leu Gln Glu Ser Val Ile Val

1 5 10 15

Glu Ile Ser Lys Glu Gln Ile Arg Ala Leu Ser Lys Arg Ala Lys Ser

20 25 30

Ser Ser Arg Lys Thr Ile Ser Ser Glu Asp Lys Pro Phe Asn Leu Arg

35 40 45

Ser Arg Asp Pro Ile Tyr Ser Asn Lys Leu Gly Lys Phe Phe Glu Ile

50 55 60

Thr Pro Glu Lys Asn

65

Claims

1.一种基于噬菌体展示技术定位加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域的氨基酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用天然的β-伴大豆球蛋白饲喂新西兰大白兔，制备β-伴大豆球蛋白多克隆抗体；将过量的经过超高静压处理的β-伴大豆球蛋白加入到制备的β-伴大豆球蛋白多克隆抗体中，37℃温育1h，离心去沉淀，收集上清液，-20℃保存，制得超高静压处理破坏的过敏原表位特异性抗体；

（2）根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将Gly m Bd 60K氨基酸序列分为4段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示，设计Gly m Bd 60K重叠蛋白；

（3）以噬菌体展示技术研究加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，在噬菌体表面呈现Gly m Bd 60K及其重叠蛋白；

（4）利用间接竞争ELISA法，进行超高静压破坏过敏原表位的筛选：将表达Gly m Bd60K 重叠片段的所有重组噬菌体和无插入的阴性对照包被于96孔酶标板中，37℃温育1h；经洗涤、封闭，再洗涤后，于37℃将超高静压处理破坏的过敏原表位特异性抗体加入包被重组噬菌体的酶标板中，同时设阴性和空白对照，其中阴性对照一抗为阴性血清，空白对照为无插入阴性噬菌体裂解纯化的蛋白，孵育2 h；再经洗涤后分别加羊抗兔酶标二抗，37℃孵育1 h；经洗涤后并加入TMB单组分显色液，37℃避光显色，然后加入2M的H₂SO₄终止反应，酶标仪读A_450nm值；同时测定加入未加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体的OD值；

利用间接竞争ELISA法，精确定位被超高静压破坏的Gly m Bd 60K抗原区域：对所筛选到的所有阳性噬菌体克隆片段进行进一步的重叠分段，每段序列的长度约为100个氨基酸，每一序列与前一序列重叠约30个氨基酸残基，各个片段经PCR扩增后与T7噬菌体载体相连；然后在T7噬菌体表面表达，测定其与被超静高压破坏过敏原表位特异性抗体的结合特性，开展第二轮的筛选与鉴定，经过2-3轮的分段表达和筛选，对被破坏Gly m Bd 60K抗原区域进行精确定位；最后得到精确定位的加工处理破坏最显著的片段的氨基酸序列为SEQ IDNO.16。