CN111175518A - 一种用于ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种用于ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111175518A CN111175518A CN202010018193.9A CN202010018193A CN111175518A CN 111175518 A CN111175518 A CN 111175518A CN 202010018193 A CN202010018193 A CN 202010018193A CN 111175518 A CN111175518 A CN 111175518A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- fusion protein
- luciferase
- gene sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 16
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 101000591210 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase-like N Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102100035857 Glutamate decarboxylase 2 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 101000873786 Homo sapiens Glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102100034091 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase-like N Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 108010024780 glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 6
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 4
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 4
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 3
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 3
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 3
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- 101100184147 Caenorhabditis elegans mix-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000003453 ammonium sulfate precipitation method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法，试剂盒，包括：融合蛋白‑抗原‑抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA‑2a抗体，IA‑2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA‑512抗体；制备方法通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，再利用细胞转化得到荧光素酶—抗原融合蛋白；再通过裂解基因重组细胞，纯化，捕捉获得融合蛋白‑抗原‑抗体复合物；再加入荧光素酶底物，检测荧光强度；本发明通过联合检测提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和灵敏度，减少了检查次数，减少了漏判率。
Description
技术领域
本发明涉及自身免疫检测领域，特别是一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
I型糖尿病(IDDM)是一种自体免疫疾病，机体受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素诱发而产生异常自身体液和细胞免疫应答，导致胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少，一旦发病需要依赖外源性胰岛素补充以维持生命，所以I型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病。对I型糖尿病的诊断主要通过检测其自身免疫性抗体，抗体主要包括以下几种：谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛细胞抗体(ICA)、酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2a、IA-2b)及胰岛素自身免疫性抗体(IAA)。
现有的Ⅰ型糖尿病自身免疫检测方法如下所述：
ICA(抗胰岛细胞抗体)：①间接免疫荧光法；②组织化学染色法；③免疫沉淀化学法；④ELISA法。
GAD(谷氨酸脱羧酶抗体)：①免疫沉淀酶活性法；②放射免疫法；③ELISA法；④间接免疫荧光法；⑤化学发光法。
ICA 512/IA2ab(抗酪氨酸磷酸酶抗体)：①ELISA法；②放射配体分析法(RLA)；③35S标记的放射免疫沉淀法。
IAA(抗胰岛素自身抗体)：①放免法；②ELISA法。
但是现有的检测方法具有如下问题：ELISA法：对于酶的活性和灵敏度要求很高，其特异性取决于抗原制备的优劣；且其结合物制备尚未标准化，这使得实验结果的可重复性不高，需要进行多次检测。另外，若抗原及酶结合物浓度低，最后吸光度值太小，易出现假阴性。多数国家的临床检测已放弃ELISA法，使用放射免疫法(RIA法)。放射免疫法：具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，并且样品用量少，常可测至皮摩尔量。但本方法有时会出现交叉反应、假阳性反应、组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐，有时会影响结果等。
市场需要一种对Ⅰ型糖尿病的诊断有高特异性和高敏感性的检测试剂盒，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法，通过联合检测提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和灵敏度，减少了检查次数，减少了漏判率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。
前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。
前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，缓冲液包括：磷酸盐吐温缓冲液，磷酸盐缓冲液，荧光素酶底物检测缓冲液。
一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，构建荧光素酶基因与抗原基因的融合载体，
选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列，进行PCR扩增，在kpnl位点-GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；所述多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列；
将获得的目的片段与载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；
步骤二，质粒转化与扩繁提取，
将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，再使用质粒大提试剂盒提取重组质粒；
步骤三，获取融合蛋白，
通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达，裂解基因重组细胞，收集细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；
步骤四，纯化重组融合蛋白，
利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；
步骤五，使用蛋白A/G琼脂糖酶标板捕捉融合蛋白-抗原-抗体复合物，
步骤六，抗原抗体免疫反应，
反应体系包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，PBS缓冲液，PBST缓冲液，荧光素酶底物，标准品，检测样品血清。
前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，载体质粒为PA0815载体质粒。
前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，荧光素酶基因为Ranilla荧光素酶基因。
前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，感受态大肠杆菌的菌种为基因工程转化的含GAD65的重组大肠杆菌。
前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中的步骤包括：
1)将T293细胞经过扩增培养40-60h，和细胞传代培养40-60h；
2)使用重组质粒进行磷酸钙转染，继续培养约48h后，使用PBS缓冲液收集细胞。
本发明的有益之处在于：
GAD65抗体、IA-2a抗体、IA-2b抗体、IAA、GADA抗体和ICA-512抗体这六种抗体的联合检测能够提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性(可达99.6％)和敏感性(可达98％)，对极早预报Ⅰ型糖尿病具有重要的意义；
本发明采用基因重组荧光素酶—多抗原融合蛋白抗体检测技术，减少了检查次数，提高了灵敏度，大大减少了漏判率。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。
融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。
GAD-65抗原基因序列是：
GCCAAACAGAAAGGGTTTGTTCCTTTCCTCGTGAGTGCCACAGCTGGAACCACCGTGTACGGAGCATTTGACCCCCTCT；
IA-2a抗原基因序列：
CCGAGAAGGATATGAGATGGTGTTTGATGGGAAGCCTCAG；
IA-2b抗原基因序列：
TATTTTGTAACATATAGATTTTTATTTTATATAGGTT；
IAA抗原基因序列：
ATGCTAGTTCTTGAGGCATCTTCCAAATAGTATTCTTTTATTAGGTCATTTGAATTAATTAGAGAAAGTAAAAATAAAACCTTATCAGCCTGA；
GADA抗原基因序列：
GAGAAGGCCCTGCCCTTCAACGGGTAGAAATGCCCTACAATATAACATAGAGAAATGCCCTATAATATAACCACAGGATC；
ICA-512抗原基因序列：
GATATGAACATGGCTTTGGGCCCTTTCTGTCTAGAAAAACAAATGGGTTCACTATGA；
(一)试剂盒规格
(二)试剂盒使用方法
1.试剂配制
1.1取融合蛋白冻干粉,加入1.5mL无菌水，将冻干瓶内的蛋白充分溶解。
1.2荧光素酶底物工作液：按照实验所需试剂的量，将海肾荧光素酶底物(100×)和海肾荧光素酶底物缓冲液以1:100的比例稀释，配制成海肾荧光素酶检测工作液。
2.操作步骤
2.1融合蛋白准备：用2ml ddH2O复溶融合蛋白冻干粉，吸打混匀并转移至2mlEP管中，12000rpm离心1min，转移上清至另一新的离心管中，4℃保存备用。
2.2试剂用量及孵育：在酶标板中，分别加入检测样品与阴阳性对照品，加入孵育缓冲液(缓冲液1)，采用一步法进行孵育。
2.3孵育：在微孔中加入10ul样品，20ul融合蛋白，70ul孵育缓冲液的混合液100ul/孔,置全自动荧光测定仪中30℃，300rpm振荡孵育60min。
2.4洗涤：孵育结束后弃上清，每孔加入200ul PBS，弃上清，扣干，再重复四次，共五次。
2.5检测：加入70ulPBS，再加入现配的30ul 1×底物，立即检测。
二、生产制备试剂盒；
包括如下步骤：
步骤一，构建荧光素酶基因与抗原基因的融合载体，
选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列，进行PCR扩增，在kpnl位点-GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列；作为一种优选，荧光素酶基因为Ranilla荧光素酶基因；
将获得的目的片段与载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；作为一种优选，载体质粒为PA0815载体质粒。
步骤二，质粒转化与扩繁提取，
将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，再使用质粒大提试剂盒提取重组质粒；作为一种优选，感受态大肠杆菌的菌种为基因工程转化的含GAD65的重组大肠杆菌。
质粒提取实验：
使用质粒大提试剂盒(天根DP116)提取质粒的操作。
(一)试剂盒储存条件
1.试剂盒应置于室温(15-25℃)干燥条件保存。
2.第一次使用前将RNase A加入溶液P1中，混匀后置于4℃冰箱保存。
(二)推荐菌液使用量
1.高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右。
2.低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200-400μg左右。
(三)操作步骤
1.取200mlLB液体培养基中加入200ul卡那霉素，摇匀后加入20ul基因工程转化的含GAD65的重组大肠杆菌，摇床中200rpm，37℃过夜培养。
2.取100ml(低拷贝推荐用200ml)过夜培养的菌液，室温10000rpm(约11500×g)离心3min收集细菌。菌液较多时，可多次离心并将菌体沉淀收集到一个离心管中。
3.用移液枪尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，倒置在干净的吸水纸上。
4.向菌体沉淀的离心管中加入10ml溶液P1(确认已加入RNase A),用移液枪反复吹打彻底悬浮细菌细胞沉淀。
5.向离心管中加入10ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
6.向离心管中加入10ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次(应立即混匀，避免产生局部沉淀)，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右后，10000rpm离心10min,使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间)，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中(避免倒入大量沉淀)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml管中。
7.向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇和1/2倍异丙醇体积的5M NaCl，上下颠倒充分混匀。(此处无沉淀为正常现象)
8.然后4℃10000rpm离心30min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。
9.向管中加入6ml 70％乙醇充分漂洗沉淀，4℃10000rpm离心10min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。再重复一遍此操作。
10.将离心管敞口室温放置10-20min(也可放入超净工作台用中风吹)，使乙醇充分挥发后加入1-1.5ml洗脱液TB，充分溶解沉淀，得到质粒。
11.提取得到的质粒，可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。高纯度的质粒OD260/OD280通常在1.8-2.0之间。
(四)注意事项
1.溶液P1在使用给钱先加入RNase A,混匀，置于2-8℃保存。
2.使用前先检查溶液P2和P4是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
3.自备约60ml的5M NaCl溶液。
4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
5.使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤器中抽出，避免滤膜因压力而松动。
6.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提取质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70℃水浴中预热。
步骤三，获取融合蛋白，
通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达，裂解基因重组细胞，收集细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；
将T293细胞复苏后，在37℃，5％二氧化碳培养箱，使用DMEM培养基培养40-60h，再进行细胞传代继续培养40-60h后，使用重组质粒进行细胞转染实验(磷酸钙转染方法)，继续在相同条件下培养约48h后，使用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS缓冲液收集细胞。
一，细胞培养实验：
(一)实验室前准备，
1.实验仪器设备、耗材准备，
准备所需实验仪器：1mL移液枪、电动移液枪(检查是否有电)、水浴锅、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、涡旋仪、可移动紫外灯。
准备实验所需的耗材：5mL血清移液管、10mL血清移液管、1mL移液枪头、50mL离心管、15mL离心管、75cm2细胞培养瓶、10cm直径细胞培养皿、离心管架、记号笔。
实验辅助耗材：冻存盒、泡沫漂浮架、75％酒精棉球、纱布、剪刀、镊子、持物钳、酒精喷壶、废液缸、手套、帽子、口罩、拖鞋(或鞋套)、隔离衣。
2.实验场地准备
将移液枪和实验所需耗材及废液缸放入生物安全柜内，用酒精棉擦拭生物安全柜内桌面和周壁。合上生物安全柜玻璃挡板，开启生物安全柜、细胞培养间、缓冲间紫外灯，照射30min。
3.实验试剂准备
检查实验所需的细胞培养基、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青莲双抗是否足量，将试剂放入37℃水浴中预热15min。
(二)实验操作
在缓冲间更换拖鞋(或鞋套)、戴帽子、戴口罩、穿隔离衣。实验准备工作在缓冲间完成，进入细胞培养见要再次更换拖鞋(或鞋套)。用75％的酒精对手表面进行消毒，由助手协助带好手套、传递实验试剂。
关闭紫外灯，向上推开生物安全柜玻璃挡板15cm，打开生物安全柜风机，通风15min，开始实验。
1.细胞培养基的配制
(1)将37℃预热过的DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、100×双抗青链霉素用酒精棉擦拭瓶身和瓶口，放入生物安全柜；
(2)将500mL胎牛血清平均分配至10个50mL离心管中，每管50mL；将100mL100×青链双抗平均分配至20个15mL离心管中，每管5mL；
(3)取一份50mL胎牛血清和5mL100×青链双抗加至500mL DMEM培养中，混合均匀配成完全培养基，在瓶身上标注配制日期、试剂成分、配置人。
2.细胞复苏
(1)准备37℃水浴和预热到37℃的完全细胞培养基，准备好一个75cm2细胞培养瓶，同时加入10ml的完全培养液；
(2)将细胞从-80℃冰箱中取出，放入到水浴锅中，同时轻轻摇动，保证细胞能够在3min内完全溶解，同时应该注意不要把冻存管的管口没入水浴中(可能由水引起污染)。注意要点：溶解的时间过长会影响细胞的活力，导致死细胞多，细胞状态差。
(3)溶解完全的细胞用75％酒精棉球擦冻存管外表面，要快速转移到无菌超净台中。用移液枪将冻存管中细胞悬浮液转移至75cm2含完全培养基的细胞培养瓶中，轻轻吹打混匀，盖紧盖子。再把细胞摇晃均匀，在培养瓶上面标注细胞接种日期。
3.细胞培养
(1)将培养瓶水平放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)第二天进行换液，保证去除死细胞。正常培养过程是2-3天进行一次换液，如果细胞长到90％以上进行传代。
二，细胞转染实验(磷酸钙转染方法)：
(一)实验室前准备
1.实验仪器设备、耗材准备
准备所需实验仪器：1mL移液枪、电动移液枪(检查是否有电)、水浴锅、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、涡旋仪、可移动紫外灯。
准备实验所需的耗材：5mL血清移液管、10mL血清移液管、1mL移液枪头、50mL离心管、15mL离心管、75cm2细胞培养瓶、10cm直径细胞培养皿、离心管架、记号笔。
实验辅助耗材：冻存盒、泡沫漂浮架、75％酒精棉球、纱布、剪刀、镊子、持物钳、酒精喷壶、废液缸、手套、帽子、口罩、拖鞋(或鞋套)、隔离衣。
2.实验场地准备
将移液枪和实验所需耗材及废液缸放入生物安全柜内，用酒精棉擦拭生物安全柜内桌面和周壁。合上生物安全柜玻璃挡板，开启生物安全柜、细胞培养间、缓冲间紫外灯，照射30min。
3.实验试剂配制
(1)4M NaCl：称取11.688g NaCl加水定容至50mL,0.22um滤膜抽滤。
(2)1M KCl：称取0.7455g KCl加水定容至10mL,0.22um滤膜抽滤。
(3)1M Na2HPO4：称取3.5814g Na2HPO4·12H2O加水定容至10mL,0.22um滤膜抽滤。
(4)1M HEPES：称取11.915g HEPES加水定容至50mL,0.22um滤膜抽滤。
(5)25mM氯喹：称取0.128965g氯喹加ddH2O定容至10mL,0.22um滤膜抽滤。
(6)2.5M CaCl2:称取2.7745g CaCl2加ddH2O定容至10mL,0.22um滤膜抽滤。
(7)2×HeBS(pH7.05)：250mM NaCl，10mM KCl，1.5mM Na2HPO4，12mM dextrose，50mM Hepes
(3.125mL of 4M NaCl，0.5mL of 1M KCl，Na2HPO4 75uL of 1M，0.108gDextrose，Hepes 2.5mL of 1M；加水定容至50ml，调pH7.05，0.22uM滤膜抽滤，-20℃保存备用)。
(8)Mix 1：450ul待转染质粒(ddH2O稀释15ug质粒至450ul)+50ul 2.5M CaCl2
(9)Mix 2：500ul 2×HeBS
(二)实验操作；
在缓冲间更换拖鞋(或鞋套)、戴帽子、戴口罩、穿隔离衣。实验准备工作在缓冲间完成，进入细胞培养见要再次更换拖鞋(或鞋套)。用75％的酒精对手表面进行消毒，由助手协助带好手套、传递实验试剂。
关闭紫外灯，向上推开生物安全柜玻璃挡板15cm，打开生物安全柜风机，通风15min，开始实验。
1.细胞培养基的配制
(1)将37℃预热过的DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、100×双抗青链霉素用酒精棉擦拭瓶身和瓶口，放入生物安全柜；
(2)将500mL胎牛血清平均分配至10个50mL离心管中，每管50mL；将100mL100×青链双抗平均分配至20个15mL离心管中，每管5mL；
(3)取一份50mL胎牛血清和5mL100×青链双抗加至500mL DMEM培养中，混合均匀配成完全培养基，在瓶身上标注配制日期、试剂成分、配置人。
(4)取9mL完全培养基至10mL离心管，加入9ul 25mM氯喹，混匀，待使用(每个培养皿的使用量)。
2.将细胞培养皿取出至倒置显微镜下观察细胞生长状态及铺板率。
3.将细胞培养皿转移至生物安全柜，吸去废液，Mix1漩涡混匀，逐滴加入Mix2，制成Mix液，室温静置5分钟。
4.取1mLMix液逐滴加入细胞培养皿中，再加入9mL(含25uM氯喹)完全培养基，轻晃混匀。(注意：加入Mix液后尽快加入完全培养基，以避免贴壁细胞悬浮)
5.将细胞培养皿放置于37℃5％CO2培养箱继续培养48h。
6.将细胞培养皿从培养箱中取出，转移至生物安全柜内，吸去废液，各加1mL PBS洗去完全培养基，再洗去PBS废液。
7.各加入2mL PBS，用细胞刮刀将细胞轻轻刮下，用移液枪反复吸打至细胞悬浊液混合均匀，转移至离心管，-20℃保存。
步骤四，纯化重组融合蛋白，
利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；
将收集的细胞用硫酸铵沉淀法进行分级沉淀，沉淀物经0.05～0.08mol/L Tris-Hcl缓冲液冲洗2～3次，后冻干备用；
所得融合蛋白用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0PBS磷酸盐缓冲液进行一定倍数的梯度稀释得融合蛋白稀释液，要求融合蛋白稀释液每10微升中有107个荧光单位。
步骤五，使用蛋白A/G琼脂糖酶标板捕捉融合蛋白-抗原-抗体复合物，
使用1ug/ml的蛋白A/G包被液，100ul/孔，4℃冰箱过夜包被后，使用0.05％PBST溶液清洗3次后，加入300ul/孔，5％BSA封闭液室温，100rpm，封闭2h后，在室温晾干15min后置于4℃冰箱备用。
步骤六，抗原抗体免疫反应，
反应体系包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，PBS缓冲液，PBST缓冲液，荧光素酶底物，标准品，检测样品血清。
1融合蛋白准备：用2ml ddH2O复溶融合蛋白冻干粉，吸打混匀并转移至2mlEP管中，12000rpm离心1min，转移上清至另一新的离心管中，4℃保存备用。
2试剂用量及孵育：在酶标板中，分别加入检测样品与阴阳性对照品，加入孵育缓冲液(缓冲液1)，采用一步法进行孵育。
3孵育：在微孔中加入10ul样品，20ul融合蛋白，70ul孵育缓冲液的混合液100ul/孔,置全自动荧光测定仪中30℃，300rpm振荡孵育60min。
4洗涤：孵育结束后弃上清，每孔加入200ul PBS，弃上清，扣干，再重复四次，共五次。
5检测：加入70ulPBS，再加入现配的30ul 1×底物，立即检测。
实验目的：进行联合检测试剂盒最低检出限及灵敏度性能分析。
实验使用仪器:全自动化学发光测定仪(重庆科斯迈，SMART300)
移液枪(Thermo，F3系列)
迷你瞬时离心机(美国Andybio，m-micro)
实验使用耗材：移液枪头、离心管(国产)
ProteinA/G包被板(NUNC，1ug/ml杭州纽龙ProteinA/G包被,BSA封闭)
实验试剂及药品：融合蛋白(2017.12.28复溶)
PBS pH7.40(2017.07.06配制，室温保存备用)
0.05％PBST(2017.07.06配制，室温保存备用)
海肾荧光素酶底物(碧云天，RG017，1×)
胎牛血清
实验操作：A样本准备：将1000ng/ml的抗体样本按梯度浓度稀释(牛-)成200,175,150,125,100,75,50,25ng/ml.
B融合蛋白准备：用1.5mlddH2O复溶融合蛋白冻干粉，吸打混匀并转移至2mlEP管中，12000rpm离心1分钟，转移上清至另一新的离心管中，4℃保存备用。
C加样顺序及用量：样本10ul，融合蛋白10ul，PBST80ul，共100ul体系。每种浓度各4孔。
D.LIPS实验：1.加样：在微孔中加入100ul体系的试剂。
2.孵育：在微孔中加入10ul样品，20ul融合蛋白，70ul孵育缓冲液的混合液100ul/孔,置全自动荧光测定仪中30℃，300rpm振荡孵育60min。
3.洗涤：孵育结束后弃上清，每孔加入200ul PBS，弃上清，扣干，再重复四次，共五次。
4.检测：加入70ulPBS，再加入现配的30ul 1×底物，立即检测荧光强度。
实验结果：
结果分析：
上述浓度为0时为阴性样本，其余皆为阳性样本。各阳性样本发光强度均为阴性的2倍以上，说明该实验灵敏度为100％。
根据上述数据做线性方程，得出最低检出限在15～20ng/ml该区间内比值为2。
由此可知：GAD65抗体、IA-2a抗体、IA-2b抗体、IAA、GADA抗体和ICA-512抗体这六种抗体的联合检测能够提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和敏感性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 杭州北角医学检验所有限公司
<120> 一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法
<141> 2020-01-08
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> Human sequence
<400> 1
gccaaacaga aagggtttgt tcctttcctc gtgagtgcca cagctggaac caccgtgtac 60
ggagcatttg accccctct 79
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Human sequence
<400> 2
ccgagaagga tatgagatgg tgtttgatgg gaagcctcag 40
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Human sequence
<400> 3
tattttgtaa catatagatt tttattttat ataggtt 37
<210> 4
<211> 93
<212> DNA
<213> Human sequence
<400> 4
atgctagttc ttgaggcatc ttccaaatag tattctttta ttaggtcatt tgaattaatt 60
agagaaagta aaaataaaac cttatcagcc tga 93
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> Human sequence
<400> 5
gagaaggccc tgcccttcaa cgggtagaaa tgccctacaa tataacatag agaaatgccc 60
tataatataa ccacaggatc 80
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> Human sequence
<400> 6
gatatgaaca tggctttggg ccctttctgt ctagaaaaac aaatgggttc actatga 57
Claims (8)
1.一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；所述抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。
2.根据权利要求1所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。
3.根据权利要求1所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：磷酸盐吐温缓冲液，磷酸盐缓冲液，荧光素酶底物检测缓冲液。
4.一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，构建荧光素酶基因与抗原基因的融合载体，
选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列，进行PCR扩增，在kpnl位点-GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；所述多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列；
将获得的目的片段与载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；
步骤二，质粒转化与扩繁提取，
将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，再使用质粒大提试剂盒提取重组质粒；
步骤三，获取融合蛋白，
通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达，裂解基因重组细胞，收集细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；
步骤四，纯化重组融合蛋白，
利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；
步骤五，使用蛋白A/G琼脂糖酶标板捕捉融合蛋白-抗原-抗体复合物，
步骤六，抗原抗体免疫反应，
反应体系包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，PBS缓冲液，PBST缓冲液，荧光素酶底物，标准品，检测样品血清。
5.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述载体质粒为PA0815载体质粒。
6.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述荧光素酶基因为Ranilla荧光素酶基因。
7.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述感受态大肠杆菌的菌种为基因工程转化的含GAD65的重组大肠杆菌。
8.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中的步骤包括：
1)将T293细胞经过扩增培养40-60h，和细胞传代培养40-60h；
2)使用重组质粒进行磷酸钙转染，继续培养约48h后，使用PBS缓冲液收集细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010018193.9A CN111175518A (zh) | 2020-01-08 | 2020-01-08 | 一种用于ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010018193.9A CN111175518A (zh) | 2020-01-08 | 2020-01-08 | 一种用于ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111175518A true CN111175518A (zh) | 2020-05-19 |
Family
ID=70624340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010018193.9A Pending CN111175518A (zh) | 2020-01-08 | 2020-01-08 | 一种用于ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111175518A (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992006105A1 (en) * | 1990-10-02 | 1992-04-16 | Trigen Incorporated | Antibodies and methods for diagnosis and treatment of diabetes |
| US6770460B1 (en) * | 1998-01-29 | 2004-08-03 | Wallac Oy | Fusion protein and its use in an immunoassay for the simultaneous detection of autoantibodies related to insulin-dependent diabetes mellitus |
| CN102967704A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-03-13 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒 |
| WO2013071055A1 (en) * | 2011-11-10 | 2013-05-16 | Wellstat Diagnostics, Llc | Assay for diabetes-associated autoantibodies |
| CN103116030A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-05-22 | 山东东兴生物科技股份有限公司 | 一种检测i型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法 |
| CN103969234A (zh) * | 2014-04-17 | 2014-08-06 | 山东东兴汇智生物科技有限公司 | 可同时检测四种i型糖尿病自身免疫抗体的方法 |
| CN104560911A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-04-29 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 一种融合抗原蛋白质 |
| CN106632684A (zh) * | 2016-06-01 | 2017-05-10 | 上海领潮生物科技有限公司 | 一种用于快速检测ⅰ型糖尿病的融合蛋白 |
| CN109765370A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-05-17 | 杭州京北生物科技有限公司 | 一种前列腺癌诊断试剂盒及制备方法与应用 |
-
2020
- 2020-01-08 CN CN202010018193.9A patent/CN111175518A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992006105A1 (en) * | 1990-10-02 | 1992-04-16 | Trigen Incorporated | Antibodies and methods for diagnosis and treatment of diabetes |
| US6770460B1 (en) * | 1998-01-29 | 2004-08-03 | Wallac Oy | Fusion protein and its use in an immunoassay for the simultaneous detection of autoantibodies related to insulin-dependent diabetes mellitus |
| WO2013071055A1 (en) * | 2011-11-10 | 2013-05-16 | Wellstat Diagnostics, Llc | Assay for diabetes-associated autoantibodies |
| CN102967704A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-03-13 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒 |
| CN103116030A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-05-22 | 山东东兴生物科技股份有限公司 | 一种检测i型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法 |
| CN103969234A (zh) * | 2014-04-17 | 2014-08-06 | 山东东兴汇智生物科技有限公司 | 可同时检测四种i型糖尿病自身免疫抗体的方法 |
| CN104560911A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-04-29 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 一种融合抗原蛋白质 |
| CN106632684A (zh) * | 2016-06-01 | 2017-05-10 | 上海领潮生物科技有限公司 | 一种用于快速检测ⅰ型糖尿病的融合蛋白 |
| CN109765370A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-05-17 | 杭州京北生物科技有限公司 | 一种前列腺癌诊断试剂盒及制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 田海容等: "糖尿病自身抗体GADA、IA-2A、ICA、IAA、ZnT-8A对T1DM发病风险的预测意义", vol. 7, no. 4, pages 159 - 160 * |
| 黄勇翔等: "联合检测血清GAD-Ab、ICA和IAA 在糖尿病分型 诊断中的应用价值", vol. 41, no. 10, pages 1028 - 1031 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107267628A (zh) | 胚胎植入前染色体异常检测试剂盒 | |
| CN107400668B (zh) | 一种柞蚕微孢子虫模板dna的提取方法及其在分子诊断方面的应用 | |
| CN112029803A (zh) | 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途 | |
| CN115851858A (zh) | 一种生产、纯化rspo1细胞因子方法 | |
| CN111269983A (zh) | 一种膀胱癌基因扩增的fish检测方法、探针及试剂盒 | |
| CN111175518A (zh) | 一种用于ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN116837032A (zh) | 一种表达egfr细胞外结构域a289v错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法 | |
| CN114686486B (zh) | 检测myod1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤或骨肉瘤预后制剂中的应用 | |
| CN115651887A (zh) | 一种人正常角膜上皮细胞的应用 | |
| CN115044639A (zh) | 一种抗衰老药物的筛选方法 | |
| CN113767879A (zh) | 一种癌细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用 | |
| CN113528576A (zh) | 含有nlrp7纯和突变的复发性葡萄胎患者特异性诱导多能干细胞系及构建方法 | |
| CN115322959B (zh) | 一种16p11.2微缺失综合征相关孤独症诱导性多能干细胞、制备方法及应用 | |
| CN111394416A (zh) | 一种极少细胞量的细胞液相染色鉴定方法 | |
| CN112662621B (zh) | 一种逆转间充质干细胞衰老的方法及应用 | |
| CN111893088A (zh) | 一种体外分离培养蒙古马睾丸精原干细胞的方法 | |
| CN111454885A (zh) | 巴氏综合症可诱导多功能干细胞及其制备方法和分化培养基和用途 | |
| CN114634905B (zh) | 一种脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液及其制备方法和脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的方法 | |
| CN115747204A (zh) | 一种镜检分枝杆菌阳性样本dna提取纯化方法 | |
| CN214952520U (zh) | 循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置以及苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置 | |
| CN116875604B (zh) | 一种用于pd-l1阳性细胞检测的dna适配体及其应用 | |
| CN106636132A (zh) | 一种青稞的紫外胁迫相关基因及其应用 | |
| CN109370978B (zh) | 一种栉孔扇贝消化盲囊亚细胞组分分离方法 | |
| CN107663513B (zh) | 一种高效的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法 | |
| CN115404262A (zh) | 水中隐孢子虫感染活性检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20240524 |