CN115404262A - 水中隐孢子虫感染活性检测方法 - Google Patents

水中隐孢子虫感染活性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种水中隐孢子虫检测方法，该检测方法能够实现对1份水样单次实验即可获得样品中隐孢子虫密度、感染活性和基因型信息，适用于对水中隐孢子虫风险进行准确评估。具体地，本发明的检测方法包括：1)将待测水样进行浓缩，获得隐孢子虫卵囊；2)对隐孢子虫卵囊进行脱囊预处理；3)将脱囊预处理后的隐孢子虫卵囊接种至细胞板进行感染，直至隐孢子虫卵囊完成脱囊；4)回收空卵囊并计算隐孢子虫密度；5)将回收空卵囊后的细胞板继续培养，计算隐孢子虫的感染活性；6)将步骤5)中的阳性感染孔提取DNA并分析基因型。

Description

水中隐孢子虫感染活性检测方法
技术领域
本发明涉及一种集密度、感染活性和基因型检测于一体的水中隐孢子虫检测方法，涉及病原微生物及细胞生物学技术领域。
背景技术
隐孢子虫是一种寄生于人类和动物肠道的原生动物，易引起腹痛、水样腹泻和吸收不良等症状，是常见的病原微生物。隐孢子虫对氯消毒有很强的耐受性，常规水处理工艺难以完全将其去除，加之其感染剂量很低，常以水介传播导致人群感染，从而引起了国际社会的广泛关注和高度重视。美国环境保护署(USEPA)要求有过滤系统的水处理工艺达到2-log隐孢子虫去除率，并要求其流域保护计划解决处理工艺无过滤系统的隐孢子虫问题。
鉴于隐孢子虫在水体中的安全风险，我国于2006年将隐孢子虫纳入了《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)，相应的检测方法包括《生活饮用水标准检验方法》(GB/T5750-2006)的免疫磁分离荧光抗体法、住房与城乡建设部行业标准《城镇供水水质标准检验方法》(CJ/T 141-2018)的滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法，此两种方法均为检测隐孢子虫密度的常用方法。世界卫生组织2017年发布的《饮用水水质准则》仍然表明，现用的标准分析技术只能间接测定卵囊的活力而不能确定是否对人有感染性。隐孢子虫目前共有44个种，仅有17个已鉴定的有效种有感染人类的案例报道。因此仅有密度的检测无法真实评估其安全风险。分子生物学方法如PCR技术和分子荧光杂交技术等可以通过确定其基因型来判断获得的隐孢子虫卵囊是否是感染型的隐孢子虫。但是此类方法依然会高估样品的感染风险，因为感染型的隐孢子虫在被排放到环境/水体中时可能因各种因素而失活。因此，为更准确评估水体中隐孢子虫的安全风险，发展一项能够进行虫卵有效监测、同时确认活性及人体感染能力的评价技术非常关键。
密度的检测方法均先对水样进行浓缩富集和分离纯化。目前的水样浓缩方法主要包括滤膜浓缩法、滤囊浓缩法和碳酸钙沉淀法。滤膜浓缩方法是将隐孢子虫卵囊通过过滤浓缩至滤膜之后，利用丙酮溶解将卵囊回收至液体中，丙酮溶解过程会导致卵囊失去活性，因此该浓缩方法不适用于后续的感染活性测定。滤囊浓缩法和碳酸钙浓缩法均可用于感染活性样品的浓缩，但是滤囊浓缩法的成本昂贵，约为碳酸钙沉淀法的50倍，而且需全部进口。目前的分离纯化方法主要有免疫磁分离法和密度梯度法，其中免疫磁分离法的纯化效果较好，残余杂质少，而分离纯化步骤的残余杂质较多将会严重影响细胞的生长，进而影响感染活性的测定。
感染活性的测试方法包括动物模型、细胞感染法等。动物模型是直接测定隐孢子虫感染活性的可靠方法，但是该方法除需要牺牲活体动物外，还操作繁琐，具有费时和成本昂贵的问题。细胞培养法则可以相对简便的测定感染活性，并且具有低成本、高灵敏度和高准确度的特点。目前，临床上已有细胞培养法在隐孢子虫感染性方面的应用，但是均未与水中其密度检测结合，也无与水中隐孢子虫基因型结合的检测。即意味着，若要获得单个样品中关于隐孢子虫安全风险的完整信息，必须处理多个采集样品来进行不同的分析，增加了分析成本，或样品浓缩液需要拆分，降低了检测限度。另外，水样中卵囊的非均匀分布以及低浓度等问题，将导致从多次采集样品进行分析中获取数据的成本上升和数据质量的潜在变化。因此，将感染活性的测定与密度和基因型的检测方法有机整合，建立集密度、感染活性和基因型检测于一体的水中隐孢子虫检测方法至关重要，该方法仅使用一个样品即可同时实现密度、感染活性和基因型检测。
虽然细胞培养法已应用于隐孢子虫感染活性的测定，但是为保证感染活性测定的准确性，分离纯化后的卵囊进行感染活性测定时需要确保其在接触细胞后再进行脱囊，且需确保用于感染测定的细胞状态良好且一致，因此需要对卵囊的预处理过程和细胞的准备条件进行详细明确。在感染过程中，感染培养基的组分对隐孢子虫的脱囊和细胞状态均至关重要，如胆酸诱导卵囊脱囊，但是同时也会引起细胞凋亡，因此在现有细胞培养基的基础上优化建立适合细胞培养并适合卵囊脱囊的感染培养基体系，对测定隐孢子虫卵囊的感染活性至关重要。
综上所述，在原有水中隐孢子虫密度检测方法的基础上，建立集密度、活性和基因型检测于一体的规范方法十分必要，同时应有完善的质量控制措施以确保该方法的有效性。
发明内容
本发明旨在解决现有方法仅单独检测密度或基因型，无法准确和全面判断隐孢子虫感染风险的缺点，克服仅检测隐孢子虫密度或基因型造成水体安全风险被过高评估的不足，建立一种集密度、感染活性和基因型检测与一体的检测方法，实现单次实验(即，单个样品)可同时获得水中隐孢子虫密度、感染活性和基因型的目标。该发明对隐孢子虫感染细胞条件进行了完善和优化，建立一体化检测的方法流程，确定方法质量控制措施。该发明是一种全方位、规范化、批量性检测水中隐孢子虫的技术，能够对1份水样单次实验便获得样品中隐孢子虫密度、感染活性和基因型信息。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
首先，将待测水样用碳酸钙沉淀法进行浓缩，浓缩后的样品使用免疫磁珠进行分离纯化，获得隐孢子虫卵囊。其次，对获得的隐孢子虫卵囊进行脱囊预处理，然后接种至准备好的细胞板上进行感染，感染4小时后对培养液中的卵囊进行回收，感染的细胞板继续培养44小时。第三，通过对回收的卵囊进行染色计数获得隐孢子虫密度。第四，细胞感染结束后进行免疫荧光染色，统计感染斑的数量并计算隐孢子虫的感染活性。第五，对阳性感染孔进行DNA提取和隐孢子虫gp60基因的扩增，获得的扩增产物用以测序和基因型分析。
具体地，如下计算卵囊密度：通过样品加标获得样品回收系数，根据计数到的卵囊数目计算卵囊密度。卵囊密度(个/10L)＝(计数到的卵囊数目/回收系数)×样品乘数×浓缩物乘数；其中，回收系数＝(计数到的ColorSeed数目×浓缩物乘数)/添加的ColorSeed数目；样品乘数＝10L/样品体积；浓缩物乘数＝浓缩物重量/后续处理的浓缩物重量。
具体地，如下计算感染活性：通过细胞感染过程中的预脱囊控制组和平板回收控制组计算获得细胞板回收率，通过计数到的卵囊数目计算获得接种至细胞孔的卵囊数目，根据计数到的感染斑计算感染活性。感染活性(％)＝(计数到的感染斑数目/接种至细胞孔的卵囊数目)×100；其中接种至细胞孔的卵囊数目＝计数到的卵囊数目/细胞板回收率；细胞板回收率＝平板回收控制组的平均值/预脱囊控制组的平均值。
具体地，如下获得基因型：对平板回收控制组的感染孔进行DNA提取和隐孢子虫gp60基因扩增，获得基因分析阳性对照。对样品感染孔进行DNA提取和隐孢子虫gp60基因扩增，对获得的扩增产物进行测序，通过系统发育分析确定其基因型。
在本发明中，添加ColorSeed质控样、设置预脱囊控制组和细胞培养板控制组作为质量控制措施，保证单个样品仅一次前处理，在获得密度结果的同时，可靠获得其感染活性以及基因型信息。
本发明对待测水样进行富集浓缩、分离纯化、预脱囊、细胞感染、卵囊回收、感染斑和卵囊免疫荧光染色，通过卵囊数目得出隐孢子虫密度，通过感染斑数目得出隐孢子虫感染活性，通过对感染孔进行DNA提取和基因扩增获得隐孢子虫特征扩增产物，测序分析可获得基因型。
在本发明中，感染活性测定依据为隐孢子虫感染HCT-8细胞后形成的感染斑，感染斑在使用针对隐孢子虫裂殖子的SporoGlo荧光染色试剂(Waterborne)进行染色后，在荧光显微镜的蓝色激发光下呈现亮绿色斑点。
在本发明中，通过对一系列条件参数进行优化，使得其协同作用获得上述技术效果。具体如下：
1)探索水样浓缩条件为1mol/L的氯化钙溶液和1mol/L的碳酸氢钠溶液各100mL，使用NaOH调节pH至10，以保证不破坏隐孢子虫卵囊囊壁从而保证子孢子活性；配制pH为2.4的酸化水与5％的胰蛋白酶溶液按199:1的比例在30℃下孵育20min保证隐孢子虫卵囊的预脱囊。
2)0.1g/L牛胆粉是保证细胞状态、防止细胞凋亡的关键，也是感染过程中卵囊脱囊的重要诱因，使用的感染培养基组分为：以含L-glutamine的RPMI 1640medium为基础，添加了15mM HEPES缓冲液，碳酸氢钠(2g/L)，葡萄糖(1.0g/L)，牛胆粉(0.1g/L)，叶酸(250μg/L)，4-氨基苯甲酸(1mg/L)，泛酸钙(50μg/L),抗坏血酸(8,750μg/L)，青霉素G(100,000U/L)，链霉素(100mg/L)，林可霉素(40mg/L)和庆大霉素(50mg/L)。接种浓度为4×105cells/孔的48孔的HCT-8细胞培养以获取最佳细胞浓度和状态。
在本发明的具体实施方案中，本发明所使用的牛胆粉是指牛胆汁经浓缩后用乙醇萃取，在经蒸发而得的牛胆提纯部分，其可通过商购获得，例如购自Solarbio,货号为G8281-100g，其中在所述牛胆粉中胆酸成分的含量不少于42.0％，其在本发明中所起的作用是保证细胞状态，防止细胞凋亡，同时诱导感染过程中卵囊脱囊。
3)通过全过程密度质控、细胞板回收率、感染活性等3步质量控制过程的设置，建立了集密度、感染活性和基因型检测于一体的水中隐孢子虫检测方法，密度检测回收率达11％～37％，感染活性为24％～32％。
总之，本发明通过上述条件参数的优化，在保证不破坏隐孢子虫卵囊囊壁和子孢子活性的条件下进行富集浓缩，并探索和优化了感染细胞的最佳培养条件，获得水中隐孢子虫基因型信息。本发明可提供待测水样中关于隐孢子虫密度、感染活性和基因型的全方位信息，适用于需要对水中隐孢子虫风险进行准确评估的检测需求。
因此，本发明具体提供了以下技术方案：
1.水中隐孢子虫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测水样进行浓缩，获得隐孢子虫卵囊；
2)对隐孢子虫卵囊进行脱囊预处理；
3)将脱囊预处理后的隐孢子虫卵囊接种至细胞板进行感染，直至隐孢子虫卵囊完成脱囊；
4)回收空卵囊并计算隐孢子虫密度；
5)将回收空卵囊后的细胞板继续培养，计算隐孢子虫的感染活性；
6)将步骤5)中的阳性感染孔提取DNA并分析基因型。
2.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，步骤1)中待测水样浓缩方法为碳酸钙沉淀法；
特别地，在所述碳酸钙沉淀法中，使用的氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液的浓度分别为1-10mol/L，优选为1mol/L，例如使用NaOH调节pH至9.5-10.5，优选为10±0.05。
3.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，步骤1)中样品纯化方法为免疫磁分离法。
4.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，步骤2)中脱囊预处理的试剂为酸化的胰蛋白酶溶液，脱囊预处理的条件为30℃孵育20min；
优选地，所述酸化的胰蛋白酶溶液是将盐酸和纯水配置的pH为2.4的酸化水与5％的胰蛋白酶溶液按199:1的比例混合获得的。
5.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，步骤3)中感染过程所使用的培养基是以含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基为基础培养基，添加了15mM HEPES缓冲液，碳酸氢钠，葡萄糖，牛胆粉，叶酸，4-氨基苯甲酸，泛酸钙，抗坏血酸，青霉素G，链霉素，林可霉素和庆大霉素。
6.根据项目5所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，所述牛胆粉的浓度为0.1g/L。
7.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤3)中，所述在接种隐孢子虫卵囊之前，将48孔细胞板接种4.0～4.5×105cells/孔的细胞(例如HCT-8细胞)培养48小时，培养条件优选为37℃、5％ CO2。
8.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤3)中，所述脱囊预处理后的隐孢子虫卵囊在细胞板上与细胞孵育感染4小时。
9.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤5)中，将回收空卵囊后的细胞板继续培养44小时。
10.根据项目1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤6)中，隐孢子虫DNA提取的方法为用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液裂解细胞，全速离心10min去上清后，加入PCRBuffer进行清洗，然后再次加入PCR Buffer在100℃条件下热裂解10min，全速离心5min，获得的上清液即为隐孢子虫的DNA粗提液。
技术效果
本发明实现了以下技术效果：
1)通过水样浓缩、纯化方法的探索，保证水中隐孢子虫活性状态下的回收检测；
2)通过感染细胞培养条件的优化，保证细胞最佳活性和状态，可用于水样的隐孢子虫感染活性的检测。
3)通过质量控制过程，保证方法同时实现水样中隐孢子虫密度、感染活性和基因型的稳定可靠检测。
本发明通过水样浓缩条件、脱囊预处理等条件参数的优化，在保证不破坏隐孢子虫卵囊囊壁和子孢子活性的条件下进行富集浓缩，并探索和优化了感染细胞的最佳培养条件，获得水中隐孢子虫基因型信息。本发明可提供待测水样中关于隐孢子虫密度、感染活性和基因型的全方位信息，适用于需要对水中隐孢子虫风险进行准确评估的检测需求。
附图说明
图1集密度、感染活性和基因型检测于一体的水中隐孢子虫检测方法流程图；
图2隐孢子虫感染HCT-8细胞后形成感染斑的免疫荧光图；
图3阳性感染孔样品扩增gp60基因后的琼脂糖凝胶电泳图；其中，条带0为阴性对照，条带M为marker，条带1-3为平板回收控制样品的gp60基因扩增条带，S为模拟样品的扩增条带。
图4样品感染孔基因型分析系统发育图。
图5显示了在实施例1“细胞感染”步骤中，不同初始接种浓度对细胞的影响；其中，A-B显示了初始接种浓度为4.0～4.5×105cells/孔培养48h后得到的用于测试的细胞，其中细胞完整，状态正常，confluent约为100％；C显示了初始接种浓度高于4.0～4.5×105cells/孔培养48h后得到的用于测试的细胞，其中细胞confluent大于100％，但细胞排列过于紧密；D显示了初始接种浓度低于4.0～4.5×105cells/孔培养48h后得到的用于测试的细胞，其中细胞confluent小于100％。
具体实施方式
为使该发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明的集密度、感染活性和基因型检测于一体的水中隐孢子虫检测方法，所依据的原理为：将待测水样用碳酸钙沉淀法进行浓缩，浓缩后的样品使用免疫磁珠进行分离纯化，获得隐孢子虫卵囊。使用酸化的胰蛋白酶溶液对隐孢子虫卵囊进行脱囊预处理，然后接种至准备好的HCT-8细胞板上进行感染，等4小时后隐孢子虫卵囊完成脱囊，子孢子侵入HCT-8细胞，回收培养液中的空卵囊，对回收的空卵囊进行染色计数获得隐孢子虫密度。回收卵囊后的细胞板更换新的感染培养基继续培养44小时，结束后用免疫荧光染色隐孢子虫裂殖子，从而可在显微镜的荧光条件下观测到清晰的感染斑，统计感染斑的数量以计算隐孢子虫的感染活性。对阳性感染孔进行DNA提取和隐孢子虫gp60基因的扩增，获得的扩增产物用以测序和基因型分析。
实施例1水中隐孢子虫检测方法
本发明的集密度、感染活性和基因型检测于一体的水中隐孢子虫检测方法的具体步骤包括：
1、水样富集及浓缩：
向水样中加入ColorSeed质控(BioPoint)，将样品桶置于磁力搅拌器上，加入1mol/L的氯化钙溶液和1mol/L的碳酸氢钠溶液各100mL，使用10mol/L的NaOH调节pH至10±0.05，静置12h～16h，去上清液。向沉淀物中加入97g/L的氨基磺酸溶液200mL进行溶解，摇晃混匀，转移至500mL离心杯中，用100mL的PBST分两次洗涤桶并合并至上述500mL离心杯中。在2000g、20℃条件下离心10min，去上清。取两个15mL尖底离心管，做好标记，然后称重并记录重量。将500mL离心杯内沉淀分装至两支15mL尖底离心管内，涡旋混匀。在2 000g、20℃条件下离心10min，去上清。向离心杯中分批次共加入约16mL PBST进行清洗，清洗液平均分配至2个15mL离心管中，在2 000g、20℃条件下离心10min，去上清。对含沉淀物的离心管进行称重，减去离心管重量后，根据液体体积估算残余液体重量，并估算沉淀物重量。若沉淀物重量<0.5g，两支15mL离心管合并，用PBST清洗后，清洗液也合并，并在2 000g、20℃条件下离心10min；若沉淀物重量>1g，后续需分装至多个L型玻璃管。测残余上清液的pH，如果pH值<7，加入PBS至总体积10mL，涡旋混匀，在2000g、20℃条件下离心10min，吸去上清液，保留沉淀物，直至pH值＝7。
2、样品纯化：
将沉淀物用PBS转移至L型玻璃管中，L型玻璃管中总液体体积不超过10mL。向L型玻璃管中加入免疫磁分离试剂盒(例如Dynabeads GC-Comb，购自Dynal)中的10×Buffer A和10×Buffer B各1mL。取出免疫磁珠，涡旋混匀后，取100μL加入L型玻璃管。在旋转混匀仪上20rpm混匀1h。将L型玻璃管贴在其相应的磁力架上，适宜速度下90°旋转2min，然后L型玻璃管平面向上，倒掉旁清液。向L型玻璃管中加入500μL的1×Buffer A，用细长200μL枪头将磁珠转移至1.5mL离心管中，再用500μL的1×Buffer A清洗L型玻璃管，清洗液再次转移至1.5mL离心管。将1.5mL离心管放在其相应的磁力架上，适宜速度下180°翻转2min，用200μL枪头吸走旁清液。向各管中加入1mL pH＝7.4的PBS，并过夜放置。准备一新的1.5mL离心管，对应原离心管做好标记，并在每管中加入1mol/L的NaOH溶液5μL。将含磁珠的1.5mL离心管放在其相应的磁力架上，用200μL枪头吸走旁清液。拔下磁力架的磁条，每管中加入0.1mol/L的HCl溶液50μL，室温下放置10min。酸化结束后，插回磁条，用200μL枪头吸走酸化的溶液至已加入5μL 1mol/L NaOH溶液的离心管中，并轻轻混匀进行中和。含磁珠的离心管保留。
3、预脱囊处理：
准备含100μL中含100个活卵囊的6个试管，其中3个作为平板回收控制组，3个作为预脱囊控制组。将感染培养基放入37℃、5％ CO2培养箱中进行预热；其中，感染培养基组分为：以L-glutamine的RPMI 1640medium为基础，添加了15mM HEPES缓冲液，碳酸氢钠(2g/L)，葡萄糖(1.0g/L)，牛胆粉(0.1g/L)，叶酸(250μg/L)，4-氨基苯甲酸(1mg/L)，泛酸钙(50μg/L),抗坏血酸(8,750μg/L)，青霉素G(100,000U/L)，链霉素(100mg/L)，林可霉素(40mg/L)和庆大霉素(50mg/L)。按照5μL胰蛋白酶母液+995μL酸化水的比例制作酸化的胰蛋白酶溶液。向步骤2样品纯化过程中最后保留的含磁珠的1.5mL离心管中加入945μL酸化的胰蛋白酶溶液，放在1.5mL离心管磁力架上，用1mL枪头吸取旁清液，然后加入其相对应的含卵囊的1.5mL离心管中。向上述6支作为控制组的卵囊试管中各加入900μL酸化的胰蛋白酶溶液。将各1.5mL离心管先30℃下孵育20min，再1800g离心10min。用枪头小心吸走900μL上清液。向其中加入900μL感染培养基，涡旋混匀，1800g离心10min，去上清，完成清洗，由此获得脱囊预处理后的隐孢子虫卵囊。加入900μL预热过的感染培养基。样品和平板回收控制组继续进行细胞感染实验，预脱囊控制组直接进行卵囊染色。
4、细胞感染：
取出培养好的48孔HCT-8(获自ATCC)细胞培养板(HCT-8细胞的培养方法可参考说明书)；其中，用于本实验的初始接种浓度非常关键，应为4.0～4.5×105个细胞/孔，培养48h，此时细胞的confluent约为100％且细胞完整，状态正常，而高于或低于该接种浓度所获得的细胞均无法实现上述效果。在盖子上写上编号，吸走每孔中的培养液。将样品管中预脱囊处理后的卵囊混合物用1mL枪头(设置为700μL)混匀后，用枪头抵触孔壁缓慢加入到对应的孔中。作为平板回收控制组的3个样品进行相同操作。48孔板放置到410g下离心5min，保证卵囊和细胞接触紧密。将48孔板放置到37℃、5％ CO2培养箱中培养。培养4小时后，从培养箱中取出48孔板(此时，隐孢子虫已完成脱囊且释放出的子孢子已侵入HCT-8细胞)，在超净台中用1mL移液枪(调整到700μL)，轻轻吸吐混悬液5-10次进行混匀，混匀后吸出放置于原来的离心管中，之后将剩余的300μL混悬液吸出，放置于相同离心管中(用于后续回收培养液中的卵囊染色计数，以计算获得隐孢子虫密度)。重新向细胞培养板中的每孔中加入1mL已预热好的培养基，继续培养44小时用于后续感染活性测定和基因型分析。
5、感染斑荧光染色：
继续培养44小时后，直接手拿48孔板在水槽中将孔中的悬液倒掉，在纸巾上反吸下液体，向各孔中用枪头加入200μL的100％甲醇，室温暗处固定10min。直接手拿48孔板在水槽中将孔中的甲醇倒掉，在纸巾上反吸下液体，向每孔中加入300μL的染色试剂盒(例如EasyStain，购自BTF)携带的blocking buffer后，用手混匀布满各个孔。暗中室温至少1h。准备好每孔100μL的1×SporoGlo(Waterborne)。直接手拿48孔板在水槽中将孔中的blocking buffer倒掉，在纸巾上反吸下液体，用枪头加入100μL的1×SporoGlo。用锡箔纸将48孔板包好后放置于平板振荡器上振荡染色1h。用枪头吸走各孔中的SporoGlo。各孔中加入400μL无菌PBS，手摇混匀后直接倒掉，重复此步骤4-5次。最后保留各孔中约500μL无菌PBS，手摇混匀。用倒置显微镜进行镜检观察，扫描整个孔底部的全部位置进行感染斑计数。
6、卵囊染色：
将步骤4的预脱囊处理回收的样品卵囊混悬液、回收的平板回收控制组的3个样品卵囊混悬液以及步骤3的3个预脱囊控制组样品，每管中加入30μL的Easy Stain抗体染料，涡旋混匀，室温暗处染色至少1h。染色结束后，取一张直径13mm孔径3μm的醋酸纤维微孔滤膜，使用免疫组化笔画出过滤样品的圆圈范围，在过滤器上滴一滴PBS buffer湿润后放上滤膜，滤膜帖紧后过滤样品。然后吸取0.7mL左右的PBS buffer(不要用水)淋洗离心管并过滤(注意管盖有残留也需要取走过滤)。在载玻片上滴一滴mounting medium，过滤好的滤膜放在mounting medium上，盖上盖玻片，放在暗处冷藏以待镜检。荧光显微镜下进行镜检。在蓝色激发光下，隐孢子虫卵囊囊壁发出绿色荧光，形状为近似圆形，直径4～8μm。确认为隐孢子虫卵囊后，在绿色激发光下进行验证，若发红色荧光为加标的ColorSeed，若仅有绿色荧光则为环境样品中的隐孢子虫卵囊。
7、DNA提取：
将步骤5中确认的阳性孔，加200μL 0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液至阳性孔中，置于37℃二氧化碳培养箱中10min。结束后，用200μL移液枪通过反复吹打将细胞洗脱下来，转移至1.5mL的离心管中，在室温条件下全速离心10min。离心结束后，将200μL移液枪设置为150μL用来去除上清液。吸取200μL提前配置好的PCR Buffer缓冲液于离心管中，不用混匀，室温条件下全速离心10min，相同方法去除上清液。此步骤目的为去除残余的胰蛋白酶-EDTA溶液。离心后小心去除上清液，向沉淀物中加入50μL PCR Buffer缓冲液，然后置于已经到达设定温度的金属浴中培育10min。加热结束后，在室温条件下全速离心5min。所得上清液为粗DNA提取物，存放于冷冻备用。
8、核酸扩增：
进行gp60 gene的扩增。gp60 gene的扩增为巢式PCR，第一轮使用引物为AL3531F1和AL3535 R1，第二轮使用引物为AL3532 F2和AL3534R2，引物序列详见表1。使用thermoscientific品牌的DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix(2X)进行PCR扩增。反应体系见表2。扩增条件：第一阶段94℃保持10min；第二阶段为40个循环的94℃45s、50℃45s、72℃60s；第三阶段为72℃保持10min。第一轮PCR完成后，产物稀释100倍作为模板进行第二轮PCR。引物见表1。反应体系和扩增条件同第一轮。配置2％琼脂糖凝胶，使用琼脂糖凝胶电泳实验验证扩增结果。目的片段大小为871bp。若扩增结果为阳性，琼脂糖凝胶电泳应可见明显的目标大小条带。扩增获得的PCR产物进行测序后与GenBank数据库比对即可确定基因型。
表1gp60 gene扩增使用的引物序列
引物名称 引物序列(5'--3')
AL3531F1 ATAGTCTCCGCTGTATTC
AL3535R1 GGAAGGAACGATGTATCT
AL3532F2 TCCGCTGTATTCTCAGCC
AL3534R2 GCAGAGGAACCAGCATC
表2 25μL反应体系组分
组分 母液浓度 反应浓度 体积/反应
PCR Master Mix(2X) 2X 1X 12.5μL
Primer F 10μM 0.2μM 0.5μL
Primer R 10μM 0.2μM 0.5μL
DNA模板 / / 5μL
H<sub>2</sub>O / / 6.5μL
在检测样品的同时，进行方法质量控制，具体如下：
密度测定：通过加标回收进行。每个样品检测时，均通过加入ColorSeed标准样品进行密度检测的质量控制。加标的ColorSeed回收率检测结果如表3所示。经计算，本发明隐孢子虫密度检测的平均回收率为25％。
表3方法密度检测的准确度测定
Figure BDA0003893430110000131
感染活性测定：通过活的微小隐孢子虫卵囊感染进行测定。每批次实验，同时进行3个预脱囊控制样品和3个平板回收控制样品，计算获得细胞板回收率、平板回收控制样品的感染活性以及感染的阳性对照。细胞板回收率结果和平板回收控制样品的感染活性见表4。感染斑由几个或至几百个不等的绿色荧光亮点组成，参考图片见图2。
表4细胞感染活性
Figure BDA0003893430110000132
基因型的测定：通过平板回收控制样品的感染孔基因扩增进行测定。对平板回收控制样品的感染孔进行DNA提取和gp60基因扩增，对PCR产物进行电泳分析，扩增条带的大小与目标条带大小一致(871bp)，见图3。
实施例2模拟实际水样检测
实验室配置浊度为30NTU的水样10L用来模拟实际地表水水样，进行实验。样品中加入隐孢子虫活卵囊100个及ColorSeed(卵囊数量为100个)，然后浓缩、纯化，纯化后样品进行细胞感染，感染4h后回收卵囊进行染色，计数卵囊数目为6个，ColorSeed数目为11个。感染细胞板染色后，计数到感染斑数目为2个，同批次细胞板回收率为37.5％。依据上述“发明内容”部分的计算公式，计算得该模拟样品的卵囊密度＝(计数到的卵囊数目/回收系数)×样品乘数×浓缩物乘数＝(6/11％)×1×1＝55个/10L，接种至细胞孔的卵囊数目＝计数到的卵囊数目/细胞板回收率＝6/37.5％＝16个，感染活性＝(计数到的感染斑数目/接种至细胞孔的卵囊数目)×100＝(6/16)×100＝12.5％。样品感染孔的gp60基因扩增阳性(图3)，扩增产物测序后系统发育分析结果为Cryptosporidium parvum(图4)。
表5模拟实际样品卵囊密度和感染活性数据汇总
Figure BDA0003893430110000141
以上所述的具体实施例，对本发明的技术方案和有益效果进行进一步的详细说明，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改等同替换、改进等，均为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.水中隐孢子虫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测水样进行浓缩、纯化，获得隐孢子虫卵囊；
2)对隐孢子虫卵囊进行脱囊预处理；
3)将脱囊预处理后的隐孢子虫卵囊接种至细胞板进行感染，直至隐孢子虫卵囊完成脱囊；
4)回收空卵囊并计算隐孢子虫密度；
5)将回收空卵囊后的细胞板继续培养，计算隐孢子虫的感染活性；
6)将步骤5)中的阳性感染孔提取DNA并分析基因型。
2.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，步骤1)中待测水样浓缩方法为碳酸钙沉淀法；
特别地，在所述碳酸钙沉淀法中，使用的氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液的浓度分别为1-10mol/L，优选为1mol/L，例如使用NaOH调节pH至9.5-10.5，优选为10±0.05。
3.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，步骤1)中样品纯化方法为免疫磁分离法。
4.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，步骤2)中脱囊预处理的试剂为酸化的胰蛋白酶溶液，脱囊预处理的条件为30℃孵育20min；
优选地，所述酸化的胰蛋白酶溶液是将盐酸和纯水配置的pH为2.4的酸化水与5％的胰蛋白酶溶液按199:1的比例混合获得的。
5.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，步骤3)中感染过程所使用的培养基是以含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基为基础培养基，添加了15mM HEPES缓冲液，碳酸氢钠，葡萄糖，牛胆粉，叶酸，4-氨基苯甲酸，泛酸钙，抗坏血酸，青霉素G，链霉素，林可霉素和庆大霉素。
6.根据权利要求5所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，所述牛胆粉的浓度为0.1g/L。
7.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤3)中，所述在接种隐孢子虫卵囊之前，将48孔细胞板接种4.0～4.5×105cells/孔的细胞(例如HCT-8细胞)培养48小时，培养条件优选为37℃、5％CO2。
8.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤3)中，所述脱囊预处理后的隐孢子虫卵囊在细胞板上与细胞孵育感染4小时。
9.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤5)中，将回收空卵囊后的细胞板继续培养44小时。
10.根据权利要求1所述的水中隐孢子虫检测方法，其中，在步骤6)中，隐孢子虫DNA提取的方法为用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液裂解细胞，全速离心10min去上清后，加入PCRBuffer进行清洗，然后再次加入PCR Buffer在100℃条件下热裂解10min，全速离心5min，获得的上清液即为隐孢子虫的DNA粗提液。
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