CN101906420B

CN101906420B - 人聚角微丝蛋白基因原核表达系统及其表达蛋白的应用

Info

Publication number: CN101906420B
Application number: CN 201010105241
Authority: CN
Inventors: 沈波; 徐巍; 朱敏
Original assignee: TAIZHOU HOSPITAL OF ZHEJIANG PROVINCE
Current assignee: TAIZHOU HOSPITAL OF ZHEJIANG PROVINCE
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2030-01-29
Also published as: CN101906420A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及人聚角微丝蛋白基因，即Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)原核表达系统构建及其表达蛋白的应用。本发明涉及人filaggrin基因原核表达系统构建，以及纯化蛋白的应用开发，具体包括人filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的PCR钓取、原核表达载体的构建、工程菌株的建立、目的蛋白分离纯化，以及ELISA检测试剂盒的研制。

Description

人聚角微丝蛋白基因原核表达系统及其表达蛋白的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人聚角微丝蛋白基因，即Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)原核表达系统构建及其表达蛋白的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的系统性自身免疫性疾病，由于早期临床表现不典型，极容易被忽视。因缺乏高效、特异的早期诊断技术和方法，以致错过最佳治疗时机，预后较差，严重影响生活质量。

RA特异性自身抗体中有一类重要的抗体，包括抗核周因子抗体(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗丝集蛋白(filaggrin)抗体及抗瓜氨酸抗体(抗CCP抗体)。由于这几种自身抗体具有共同抗原决定簇环瓜氨酸肽，而瓜氨酸是上述抗体识别filaggrin表位的组成成分，而被称之为抗filaggrin相关抗体。这类抗体的敏感性＞97％，特异性50～91％，其敏感性和特异性均较其他指标高(RF、抗Sa蛋白抗体、抗BiP/p68抗体和抗GPI抗体等)。研究显示抗filaggrin相关抗体在RA早期即出现，是反映早期RA的重要指标。但由于APF和AKA的抗原的特殊性(人颊黏膜上皮细胞和大鼠食道中段角质层)以及检测手段不易标准化，使它们的常规化有一定难度。目前，国内部分实验室有使用filaggrin单抗用于RA早期诊断，但因成本较高，未能广泛应用。

关于fiaggrin蛋白来源主要有以下三方面：一是从组织、细胞中直接抽提、纯化获得filaggrin蛋白，由于该方法受组织、细胞来源的局限，目前仅用于研究。二是通过人工体外合成filaggrin蛋白CCP，但因人工合成的CCP造价比较昂贵且技术要求较高，同时此种肽与体内filaggrin蛋白空间结构存在的必然差异，限制了以CCP为抗原的AFA试剂盒的研制。三是采用基因工程技术构建filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的蛋白表达系统，从而诱导filaggrin蛋白表达、纯化获得目的蛋白。此种方法较前两种方法复杂，目前国内外尚未见相关报道，但有其不可逾越的优点：通过原核表达载体表达filaggrin，蛋白经复性后，形成具有生物活性的空间结构，与体内AFA上的结合位点基本一致，为试剂盒的批量生产提供足够的、高纯度且低成本的包被抗原，从而弥补了人工合成方法带来的不足。

发明内容

本发明涉及人filaggrin基因原核表达系统构建，以及纯化蛋白的应用开发，具体包括人filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的PCR钓取、原核表达载体的构建、工程菌株的建立、目的蛋白分离纯化，以及ELISA检测试剂盒的研制。

根据人filaggrin基因序列，本发明构建了含瓜氨酸肽序列pET28a(+)-filaggrin原核表达质粒，并诱导其在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达。分离纯化蛋白，Western Blot鉴定。

将纯化蛋白定量，包被酶标反应板，经牛血清白蛋白封闭，洗涤，用于检测样本血清，测定血清抗体效价。

人聚角微丝蛋白重组基因，其特征在于该重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

所述的人聚角微丝蛋白重组基因的表达蛋白。

含有人聚角微丝蛋白重组基因的表达载体。

含有人聚角微丝蛋白重组基因的宿主菌。

含有所述表达蛋白的检测试剂盒，包括用所述表达蛋白溶液包被的酶标反应板、PBS稀释液、羊抗人IgG-HRP溶液、TMB-H2O2底物工作液、阳性对照、阴性对照。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：

重组人Filaggrin蛋白(含瓜氨酸肽)，其特征在于编码Filaggrin蛋白的核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

所述的人Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的表达蛋白属于本发明保护范围。

所述的pET28a(+)-filaggrin重组质粒所用的表达载体及工程菌株应用也属于本发明保护范围，表达载体是包含该基因的pET28a(+)-filaggrin重组质粒，工程菌株为Rosetta-gami(DE3)菌株。

所述的重组人Filaggrin蛋白(含瓜氨酸肽)在临床检测试剂开发及应用也属于本发明的保护范围。

本发明的详细描述：

1、PCR扩增人Filaggrin基因

以人淋巴细胞提取出的DNA为模板，PCR特异性扩增目的片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定及扩增产物割胶回收纯化。

2、人Filaggrin基因原核表达质粒的构建与鉴定

目的片段经酶切，连接至经同样酶切的pET-28a(+)原核表达载体，挑选阳性克隆进行酶切鉴定，并作测序验证。

3、原核表达及纯化

将重组质粒pET28a(+)-filaggrin转化入表达菌株DE3，IPTG诱导表达，过柱纯化，经SDS-PAGE和Western blot鉴定后，经Bradford蛋白浓度定量后，-70℃保存。

4、ELISA检测抗filaggrin抗体(AFA)的方法学建立及评价

纯化蛋白经定量稀释后，包被酶标反应板，洗涤、封闭，作血清标本AFA测定。

本发明提供了包含人Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)重组体的构建、含该基因的表达型重组体的工程菌建立及诱导表达的方法，为重组人Filaggrin蛋白(含瓜氨酸肽)的大规模制备、纯化，以及试剂盒的研发提供了技术路线。

本发明采用基因工程技术获得人filaggrin重组蛋白，并以纯化蛋白为包被抗原，研制RA特异性早期诊断试剂盒。通过联合多中心采样，检测RA初诊患者、确诊患者、随访患者及骨关节炎、正常体检人群等血清中AFA效价，分析该试剂盒的诊断特异性及灵敏度，建立一套较为完善的RA新型ELISA检测试剂盒，并予以推广应用，以提高RA早期诊断水平，促进治疗，改善患者预后。

附图说明

图1是pET-28a(+)-filaggrin重组质粒限制性酶切分析图。

图2是SDS-PAGE分析filaggrin蛋白表达情况图。

图3是SDS-PAGE和WB检测filaggrin蛋白图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术路线做进一步的阐述，但不仅仅局限于所述的实施例：

实施例1：编码重组人Filaggrin蛋白的基因获得

(1)人Filaggrin基因的获得：

健康体检者静脉血5mL，EDTA-Na₂抗凝，灭菌蒸馏水低渗破红细胞，PBS洗涤，酚/氯仿法抽提基因组DNA。

根据GenBank人filaggrin基因全长cDNA序列(NM_002016)，通过DNAstar软件分析其潜在的优势抗原表位，使用Primer Premier 5.0软件在主要抗原表位编码区的两侧设计1对引物。上游引物为5′-CCGGAATTCCACGGACAGACTGCACCCAGCACT-3′(划线为EcoR I限制性酶切位点)；下游引物为：5′-CCGCTCGAGGTGCCTGG-AGCCGTCTCCTGATT-3′(划线为Xho I限制性酶切位点)，其扩增片段含瓜氨酸编码序列。

以上述人基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段。PCR反应体系50μl，含DNA模板1.5μl，引物各25pmol，10mmol/L dNTP 1μl，DNA聚合酶3U。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物以1.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并割胶纯化回收得到324bp左右的DNA片断。

人filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的DNA序列为：

5′-CCGGAATTC ca cggacagact gcacccagca ctggaggaag acaaggatcc

4441 cgccatgagc aggcacgaaa cagctctagg cactcagcat cccaagacgg tcaggacacc

4501 attcgtggac acccggggtc aagcagagga ggaaggcagg gatcctacca cgagcaatca

4561 gtagataggt ctggacactc agggtaccat cacagccaca ccacacccca gggaaggtct

4621 gatgcctccc atgggcagtc aggacccaga agtgcaagca ggcaaacaag aaatgaggaa

4681 caatcaggag acggctccag gcac CTCGAGCGG-3′

重组人fiaggrin基因编码的氨基酸序列为：

HGQTAPSTGGRQGSRHEQARNSSRHSASQDGQDTIRGHPGSSRGGRQGSYHEQSVDRSGHSGYHHSHTTPQGRSDASHGQSGPRSASRQTRNEEQSGDGSRH

实施例2：pET28a(+)-filaggrin原核表达质粒的构建及蛋白表达

(1)原核表达质粒的构建及鉴定

PCR扩增出的目的片段及pET-28a(+)经EcoRI和Xho I双酶切后，分别纯化回收后，经T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜，转化到E.coli DH5α中，涂布到卡那霉素抗性的LB培养板上，37℃培养12～16h，挑选单克隆进行菌落PCR及质粒双酶切鉴定，挑选2个阳性克隆进行测序，鉴定目的片段的序列及编码框是否正确。

(2)蛋白原核表达、纯化及鉴定

将重组质粒pET28a(+)-filaggrin转化入表达菌株Rosetta-gami(DE3)。挑取单克隆于LB培养基(含卡那霉素100μl/ml)中培养过夜。然后以1∶10的比例转接到3ml培养基中，37℃培养至A值约为0.6～0.8 (约2h)，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG在30℃诱导5h，取100μl菌液离心，加30μl 1×上样缓冲液悬浮沉淀，煮沸5min后12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后脱色。以上述方法在1000ml培养基中大量诱导含His-filaggrin融合蛋白的表达。离心收集细菌经超声波破碎后收集上清液，过0.45μm滤膜后，使用Ni离子柱纯化。样品过柱后依次使用洗涤缓冲液(pH 7.9)洗脱过柱。然后使用500mmol/L的咪唑缓冲液过柱，将目的蛋白洗脱下来，取样进行SDS-PAGE和WB分析。纯化的蛋白通过超滤管去除咪唑并浓缩，经Bradford蛋白浓度定量后，-70℃保存。

洗脱后收集的重组蛋白按常规进行SDS-PAGE并转移至硝酸纤维膜，用5％脱脂奶粉的PBS 4℃封闭过夜后，加入鼠抗filaggrin单克隆抗体(1∶1000稀释)，室温下反应2h；再加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶2000稀释)，室温下反应1h，最后用DAB显色试剂显色。

实施例3：基于重组filaggrin纯化蛋白ELISA检测试剂盒的研制

用包被稀释液将纯化的重组蛋白溶解稀释至1μg/ml，包被酶标反应板，4℃过夜。TPBS洗涤4次，加3％牛血清白蛋白封闭，37℃孵育30min。洗涤后分别加1∶100PBS稀释的待测标本血清100μl，37℃孵育2h，洗涤4次。加1∶10000羊抗人IgG-HRP 100μl，37℃孵育1h，洗板5次，每孔加TMB/H₂O₂底物工作液100μl，置37℃温箱10min。终止反应后置酶标仪450nm处读取A值，健康对照组x±3S作为临界值。

表1

表1是各组AFA检测结果，其中：RA组AFA的A值均值分别与SLE组、OA组、健康对照组比较，t值分别为12.004、14.464、18.078，P均＜0.01

表2

表2是AFA检测对RA的诊断价值，其中RA组AFA阳性率与非RA组比较，差异有统计学意义(χ2＝67.088，P＜0.01)。AFA对RA诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为48.2％、96.9％、93.2％和67.9％，非RA组包括SLE和OA患者及健康体检者

表3

表3是AFA与抗CCP抗体在RA诊断中的相关性，其中AFA与抗CCP抗体检测结果呈相关性(r＝0.42，P＜0.05)。两者经平行效度检验，提示AFA与抗CCP抗体检测结果具有一致性，kappa＝0.41，说明两种方法一致性较好。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省台州医院

<120>人聚角微丝蛋白基因原核表达系统及其表达蛋白的应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>309

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cacggacaga ctgcacccag cactggagga agacaaggat cccgccatga gcaggcacga 60

aacagctcta ggcactcagc atcccaagac ggtcaggaca acattcgtgg acacccgggg 120

tcaagcagag gaggaaggca gggatcctac cacgagcaat cagtagatag gtctggacac 180

tcagggtacc atcacagcca caccacaccc cagggaaggt ctgatgcctc ccatgggcag 240

tcaggaccca gaagtgcaag caggcaaaca agaaatgagg aacaatcagg agacggctcc 300

aggcactaa

309

<210>2

<211>102

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

His Gly Gln Thr Ala Pro Ser Thr Gly Gly Arg Gln Gly Ser Arg His

1 5 10 15

Glu Gln Ala Arg Asn Ser Ser Arg His Ser Ala Ser Gln Asp Gly Gln

20 25 30

Asp Asn Ile Arg Gly His Pro Gly Ser Ser Arg Gly Gly Arg Gln Gly

35 40 45

Ser Tyr His Glu Gln Ser Val Asp Arg Ser Gly His Ser Gly Tyr His

50 55 60

His Ser His Thr Thr Pro Gln Gly Arg Ser Asp Ala Ser His Gly Gln

65 70 75 80

Ser Gly Pro Arg Ser Ala Ser Arg Gln Thr Arg Asn Glu Glu Gln Ser

85 90 95

GlyAsp Gly Ser Arg His

100

Claims

1.人聚角微丝蛋白重组基因原核表达质粒的构建方法，其特征在于该质粒构建方法包括以下步骤：

1)人聚角微丝蛋白重组基因的获得：

根据GenBank人聚角微丝蛋白基因全长cDNA序列NM_002016为模板，进行PCR扩增，上游引物为

5′-CCGGAATTCCACGGACAGACTGCACCCAGCACT-3′；

下游引物为：

-

5′-CCGCTCGAGGTGCCTGG-AGCCGTCTCCTGATT-3′，

其扩增片段含瓜氨酸编码序列；

其中，PCR反应体系50μl，含DNA模板1.5μl，引物各25pmol，10mmol/L dNTP 1μl，DNA聚合酶3U；PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸10min；扩增出的人聚角微丝蛋白重组基因核苷酸序列如SEQ IDNO：1；

2)原核表达质粒的构建：

PCR扩增出的人聚角微丝蛋白重组基因核苷酸序列及pET-28a(+)经EcoRI和Xho I双酶切后，分别纯化回收后，经T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜，转化到E.coli DH5α中，涂布到卡那霉素抗性的LB培养板上，37℃培养12～16h，挑选单克隆进行菌落PCR及质粒双酶切鉴定。