JPH07313173A - 形質転換されたイネ縞葉枯ウイルス抵抗性イネおよびその製造法 - Google Patents
形質転換されたイネ縞葉枯ウイルス抵抗性イネおよびその製造法Info
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- JPH07313173A JPH07313173A JP3318211A JP31821191A JPH07313173A JP H07313173 A JPH07313173 A JP H07313173A JP 3318211 A JP3318211 A JP 3318211A JP 31821191 A JP31821191 A JP 31821191A JP H07313173 A JPH07313173 A JP H07313173A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 イネ科植物で機能するプロモーターの下流に
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコードする遺
伝子及びターミネーターを導入したベクターで、イネを
形質転換し、かかる遺伝子を発現させることにより、イ
ネ縞葉枯ウイルスに抵抗性をもつイネを作出する。 【効果】 従来知られているイネ縞葉枯ウイルス外被タ
ンパク質以外の非構造タンパク質を利用して、該ウイル
ス抵抗性のイネを作出することができる。
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコードする遺
伝子及びターミネーターを導入したベクターで、イネを
形質転換し、かかる遺伝子を発現させることにより、イ
ネ縞葉枯ウイルスに抵抗性をもつイネを作出する。 【効果】 従来知られているイネ縞葉枯ウイルス外被タ
ンパク質以外の非構造タンパク質を利用して、該ウイル
ス抵抗性のイネを作出することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イネ縞葉枯ウイルスの
感染特異タンパク質をコードする遺伝子並びにかかる遺
伝子を導入した、イネ縞葉枯ウイルス感染に対する抵抗
性を持つイネ及びその製造方法に関するものである。
感染特異タンパク質をコードする遺伝子並びにかかる遺
伝子を導入した、イネ縞葉枯ウイルス感染に対する抵抗
性を持つイネ及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】従
来、植物ウイルスとしては、タバコモザイクウイルスや
キュウリモザイクウイルスをはじめとする多くのウイル
スが知られている。これらの植物ウイルスは農作物に病
害を与え大きな減収要因となっている。かかるウイルス
の中で、イネ縞葉枯ウイルスは日本、中国、ソ連、韓国
などに分布し、これらの国の稲作に大きな被害を与えて
いる。日本では毎年平均約１０％のイネがイネ縞葉枯ウ
イルスの被害を受けている。
来、植物ウイルスとしては、タバコモザイクウイルスや
キュウリモザイクウイルスをはじめとする多くのウイル
スが知られている。これらの植物ウイルスは農作物に病
害を与え大きな減収要因となっている。かかるウイルス
の中で、イネ縞葉枯ウイルスは日本、中国、ソ連、韓国
などに分布し、これらの国の稲作に大きな被害を与えて
いる。日本では毎年平均約１０％のイネがイネ縞葉枯ウ
イルスの被害を受けている。
【０００３】しかし、実用的な抗ウイルス剤が極めて少
ないため、その防除の多くは、感染源植物の除去や媒介
虫の駆除に頼っているのが現状である。このような物理
的または化学的防除手段の他に、生物的耕種的手段とし
て、弱毒ウイルスや抵抗性品種の利用が挙げられる。弱
毒ウイルスによる防除法は、病徴の弱いウイルスを予め
植物に接種しておくと、後から強い病徴を持つ強毒株が
感染してもその増殖が抑えられ発病しないことを利用し
たもので、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）など一部
のウイルスに対して実用化されている（ Ann. Rev. Phy
topathol. １４，（１９７６）； Phytopathol. ５７,
１３４７ (１９７６）； Plant DiseaseReport ６４,
５３８（１９８０））。こうした現象は古くから知られ
ており、干渉効果（cross protection) と呼ばれてい
る。
ないため、その防除の多くは、感染源植物の除去や媒介
虫の駆除に頼っているのが現状である。このような物理
的または化学的防除手段の他に、生物的耕種的手段とし
て、弱毒ウイルスや抵抗性品種の利用が挙げられる。弱
毒ウイルスによる防除法は、病徴の弱いウイルスを予め
植物に接種しておくと、後から強い病徴を持つ強毒株が
感染してもその増殖が抑えられ発病しないことを利用し
たもので、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）など一部
のウイルスに対して実用化されている（ Ann. Rev. Phy
topathol. １４，（１９７６）； Phytopathol. ５７,
１３４７ (１９７６）； Plant DiseaseReport ６４,
５３８（１９８０））。こうした現象は古くから知られ
ており、干渉効果（cross protection) と呼ばれてい
る。
【０００４】一方、交雑育種によるウイルス抵抗性品種
もイネ、ダイズ、キュウリ、ダイコン、タバコ、トマト
等で作出され、例えば、イネ縞葉枯ウイルス抵抗性遺伝
子をイネの栽培種へ導入する方法（中国農試報 Ａ１
６，３９）等が知られている。近年、ウイルスの外被タ
ンパク質をコードする遺伝子を植物に導入し、それを植
物体内で発現させ、ウイルス抵抗性植物を作出すること
が報告されている（Ann. Rev. Phytopathol. ２８, ４
５１（１９９０））。また、キュウリモザイクウイルス
のサテライトＲＮＡを植物に導入することによってウイ
ルス抵抗性植物を得たこと（Nature ３２８，７９９
（１９８５) ）、さらに、アンチセンスＲＮＡを利用し
たウイルス防除法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８
６, ６９４９（１９８９））が報告されている。イネに
おいては、本発明者などがイネ縞葉枯ウイルスのゲノム
ＲＮＡ３にコードされるイネ縞葉枯ウイルスの外被タン
パク質の遺伝子をイネに導入して、イネ縞葉枯ウイルス
耐性イネを作出することに成功している（平成３年日本
植物病理学会大会講演要旨集 ｐ１９３）。
もイネ、ダイズ、キュウリ、ダイコン、タバコ、トマト
等で作出され、例えば、イネ縞葉枯ウイルス抵抗性遺伝
子をイネの栽培種へ導入する方法（中国農試報 Ａ１
６，３９）等が知られている。近年、ウイルスの外被タ
ンパク質をコードする遺伝子を植物に導入し、それを植
物体内で発現させ、ウイルス抵抗性植物を作出すること
が報告されている（Ann. Rev. Phytopathol. ２８, ４
５１（１９９０））。また、キュウリモザイクウイルス
のサテライトＲＮＡを植物に導入することによってウイ
ルス抵抗性植物を得たこと（Nature ３２８，７９９
（１９８５) ）、さらに、アンチセンスＲＮＡを利用し
たウイルス防除法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８
６, ６９４９（１９８９））が報告されている。イネに
おいては、本発明者などがイネ縞葉枯ウイルスのゲノム
ＲＮＡ３にコードされるイネ縞葉枯ウイルスの外被タン
パク質の遺伝子をイネに導入して、イネ縞葉枯ウイルス
耐性イネを作出することに成功している（平成３年日本
植物病理学会大会講演要旨集 ｐ１９３）。
【０００５】最近、タバコモザイクウイルスの非構造タ
ンパク質（５４ｋＤタンパク質）をコードする遺伝子を
タバコへ導入し、強いタバコモザイクウイルス抵抗性植
物が作出された。その抵抗性の機構については不明の点
が多く、また、他のウイルスについてはこのような非構
造タンパク質を利用したウイルス抵抗性植物の作出は報
告されていない。これまで、その効果が知られていない
非構造タンパク質をイネで発現させ、イネにウイルス抵
抗性を付与することが、本発明の解決すべき問題であ
る。
ンパク質（５４ｋＤタンパク質）をコードする遺伝子を
タバコへ導入し、強いタバコモザイクウイルス抵抗性植
物が作出された。その抵抗性の機構については不明の点
が多く、また、他のウイルスについてはこのような非構
造タンパク質を利用したウイルス抵抗性植物の作出は報
告されていない。これまで、その効果が知られていない
非構造タンパク質をイネで発現させ、イネにウイルス抵
抗性を付与することが、本発明の解決すべき問題であ
る。
【０００６】
【問題点を解決するための手段】イネ縞葉枯ウイルスは
分節粒子構造を有し、植物のテヌイウイルスグループに
属している。ウイルスの粒子内には４種類の２本鎖ＲＮ
Ａと４種類の１本鎖ＲＮＡ（それぞれ２本鎖又は１本鎖
ＲＮＡ１，ＲＮＡ２，ＲＮＡ３，ＲＮＡ４と称する）が
含まれる。２本鎖ＲＮＡ１−４は、各々の１本鎖ＲＮＡ
１−４が複製したものに対応する（J. gen. Virol.７
０, ５０５（１９８９））。ウイルス粒子には、単一の
外被タンパク質とＲＮＡポリメラーゼが認められる。一
方、イネ縞葉枯ウイルス感染イネには、外被タンパク質
やＲＮＡポリメラーゼの他にウイルスゲノム由来の感染
特異タンパク質が検出される（ Microbiological Scien
ces ３，３４７（１９８６））。感染特異タンパク質の
分子量はウイルスの分離株によって異なり（ Proc. Ass
oc. Pl. Pro. Kyushu ５６, ４２３（１９９０））、こ
のタンパク質の生理的役割などについてはまだ明らかに
されていない。イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
はＲＮＡ４に、外被タンパク質はＲＮＡ３にコードされ
ていることが報告された（ Virology １７７，３７１
（１９９０））。
分節粒子構造を有し、植物のテヌイウイルスグループに
属している。ウイルスの粒子内には４種類の２本鎖ＲＮ
Ａと４種類の１本鎖ＲＮＡ（それぞれ２本鎖又は１本鎖
ＲＮＡ１，ＲＮＡ２，ＲＮＡ３，ＲＮＡ４と称する）が
含まれる。２本鎖ＲＮＡ１−４は、各々の１本鎖ＲＮＡ
１−４が複製したものに対応する（J. gen. Virol.７
０, ５０５（１９８９））。ウイルス粒子には、単一の
外被タンパク質とＲＮＡポリメラーゼが認められる。一
方、イネ縞葉枯ウイルス感染イネには、外被タンパク質
やＲＮＡポリメラーゼの他にウイルスゲノム由来の感染
特異タンパク質が検出される（ Microbiological Scien
ces ３，３４７（１９８６））。感染特異タンパク質の
分子量はウイルスの分離株によって異なり（ Proc. Ass
oc. Pl. Pro. Kyushu ５６, ４２３（１９９０））、こ
のタンパク質の生理的役割などについてはまだ明らかに
されていない。イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
はＲＮＡ４に、外被タンパク質はＲＮＡ３にコードされ
ていることが報告された（ Virology １７７，３７１
（１９９０））。
【０００７】本発明者らは、イネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質遺伝子を含むｃＤＮＡが組み込まれたベク
ターＤＮＡでイネを形質転換し、かかる遺伝子を発現さ
せることにより、イネ縞葉枯ウイルスに抵抗性を持つイ
ネが作出できることを見出し、本発明を完成した。即ち
本発明の要旨は、イネ科植物で機能するプロモーターの
下流にイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコード
する遺伝子及びターミネーターを導入してなることを特
徴とするベクター、該ベクターで形質転換されたイネ科
植物及びその製造法に存する。
異タンパク質遺伝子を含むｃＤＮＡが組み込まれたベク
ターＤＮＡでイネを形質転換し、かかる遺伝子を発現さ
せることにより、イネ縞葉枯ウイルスに抵抗性を持つイ
ネが作出できることを見出し、本発明を完成した。即ち
本発明の要旨は、イネ科植物で機能するプロモーターの
下流にイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコード
する遺伝子及びターミネーターを導入してなることを特
徴とするベクター、該ベクターで形質転換されたイネ科
植物及びその製造法に存する。
【０００８】
【発明の構成】本発明は、次に述べるようにして達成す
ることができるがその要旨を越えない限り以下に限定さ
れない。 〔ウイルスおよびウイルスＲＮＡの抽出、精製〕例え
ば、イネ縞葉枯ウイルス分離株Ｔ（農林水産省農業環境
技術研究所鳥山重光博士より分譲入手）に感染したイネ
の葉をリン酸緩衝液（１０ｍＭ ジエチルジチオカーバ
メイト、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム、ｐＨ７．
２）の中で粉砕後、１／５量のトリフルオロトリクロロ
エタンを加え清澄化してから、２０％ショ糖クッション
に重層し１２３，０００×ｇで１．５時間遠心分離す
る。得られた沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解し、４，０００×ｇで１０分間遠心分離す
る。続いて上清に３５％飽和となるように硫安を加え５
分間攪はん後、４，０００×ｇで５分間遠心分離する。
上清を約４倍に希釈後、最終濃度が８％となるようにポ
リエチレングリコールを加え１時間以上攪はんする。こ
れを３０，０００×ｇ、３０分で遠心分離した後、沈澱
をショ糖密度勾配遠心（１０−４０％、１００，０００
×ｇ、２．５時間）にかけることによりウイルス粒子を
精製することができる。この方法により、ウイルス粒子
は、Ｂ，Ｍ，ｎＢ（上層から下層へ）の３成分に分離し
て得られる。本発明に用いたＲＮＡ４は、全成分に含ま
れる。
ることができるがその要旨を越えない限り以下に限定さ
れない。 〔ウイルスおよびウイルスＲＮＡの抽出、精製〕例え
ば、イネ縞葉枯ウイルス分離株Ｔ（農林水産省農業環境
技術研究所鳥山重光博士より分譲入手）に感染したイネ
の葉をリン酸緩衝液（１０ｍＭ ジエチルジチオカーバ
メイト、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム、ｐＨ７．
２）の中で粉砕後、１／５量のトリフルオロトリクロロ
エタンを加え清澄化してから、２０％ショ糖クッション
に重層し１２３，０００×ｇで１．５時間遠心分離す
る。得られた沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解し、４，０００×ｇで１０分間遠心分離す
る。続いて上清に３５％飽和となるように硫安を加え５
分間攪はん後、４，０００×ｇで５分間遠心分離する。
上清を約４倍に希釈後、最終濃度が８％となるようにポ
リエチレングリコールを加え１時間以上攪はんする。こ
れを３０，０００×ｇ、３０分で遠心分離した後、沈澱
をショ糖密度勾配遠心（１０−４０％、１００，０００
×ｇ、２．５時間）にかけることによりウイルス粒子を
精製することができる。この方法により、ウイルス粒子
は、Ｂ，Ｍ，ｎＢ（上層から下層へ）の３成分に分離し
て得られる。本発明に用いたＲＮＡ４は、全成分に含ま
れる。
【０００９】精製したウイルスより全ウイルスＲＮＡの
抽出は例えば、ＳＤＳ−フェノール法を用いて抽出す
る。即ち精製ウイルスの懸濁液にＳＤＳ（２％）とベン
トナイト（１２．５mg／ml）、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）
を加え、さらにフェノールを等量加えてタンパク質を除
去し、その後常法に従ってエタノール沈澱を繰り返して
ＲＮＡを単離精製することができる。ＲＮＡ１−４の混
合液は、ショ糖密度勾配遠心で得られたｎＢ画分より抽
出することができる。ＢとＭ画分からは、ＲＮＡ２−４
の混合液が抽出できる。
抽出は例えば、ＳＤＳ−フェノール法を用いて抽出す
る。即ち精製ウイルスの懸濁液にＳＤＳ（２％）とベン
トナイト（１２．５mg／ml）、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）
を加え、さらにフェノールを等量加えてタンパク質を除
去し、その後常法に従ってエタノール沈澱を繰り返して
ＲＮＡを単離精製することができる。ＲＮＡ１−４の混
合液は、ショ糖密度勾配遠心で得られたｎＢ画分より抽
出することができる。ＢとＭ画分からは、ＲＮＡ２−４
の混合液が抽出できる。
【００１０】〔精製したＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕ｃ
ＤＮＡはＢ又は、Ｍ画分より得たＲＮＡ２−４の混合液
を用いて合成する。まず、ＲＮＡ４の３’末端の塩基配
列（ J. gen. Virol. ７１, ２８１７（１９９０））よ
りＲＮＡ４に特異的な配列を持つプライマー（5' GGGCA
TATCTTTTGAGATTA 3'）を合成する。かかるプライマーを
用いて、全ＲＮＡを鋳型として Gubler-Hoffman の方法
（ Gene ２５, ２６３（１９８３））に従いｃＤＮＡを
合成する。得られたｃＤＮＡは、１本鎖であるので、こ
れを鋳型としてさらに２本鎖ｃＤＮＡを合成する。
ＤＮＡはＢ又は、Ｍ画分より得たＲＮＡ２−４の混合液
を用いて合成する。まず、ＲＮＡ４の３’末端の塩基配
列（ J. gen. Virol. ７１, ２８１７（１９９０））よ
りＲＮＡ４に特異的な配列を持つプライマー（5' GGGCA
TATCTTTTGAGATTA 3'）を合成する。かかるプライマーを
用いて、全ＲＮＡを鋳型として Gubler-Hoffman の方法
（ Gene ２５, ２６３（１９８３））に従いｃＤＮＡを
合成する。得られたｃＤＮＡは、１本鎖であるので、こ
れを鋳型としてさらに２本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００１１】〔ｃＤＮＡのクローニングとシークエン
ス〕つぎに後述の実施例に示すような方法で選んだＲＮ
Ａ４由来のクローンを例えばキロシークエンス用デレー
ションキット（宝酒造製）を用いてクローンの欠損変異
株を作成する。１００から２００塩基程度の割合で欠損
を持つ変異株を選抜し、Sangerらのジデオキシ法（ Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA ７４, ５４６３（１９７
７））で各変異株の塩基配列を決定する。続いて、得ら
れた塩基配列より、例えば、プライマー（5' CAACTTTCA
ACATACTTGTT 3'）を合成し、ＲＮＡ４鎖全長をカバーす
るｃＤＮＡを作成し、上記と同じ方法でクローニングし
て塩基配列を決定する。これによりＲＮＡ４の全塩基配
列を決めることができる。
ス〕つぎに後述の実施例に示すような方法で選んだＲＮ
Ａ４由来のクローンを例えばキロシークエンス用デレー
ションキット（宝酒造製）を用いてクローンの欠損変異
株を作成する。１００から２００塩基程度の割合で欠損
を持つ変異株を選抜し、Sangerらのジデオキシ法（ Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA ７４, ５４６３（１９７
７））で各変異株の塩基配列を決定する。続いて、得ら
れた塩基配列より、例えば、プライマー（5' CAACTTTCA
ACATACTTGTT 3'）を合成し、ＲＮＡ４鎖全長をカバーす
るｃＤＮＡを作成し、上記と同じ方法でクローニングし
て塩基配列を決定する。これによりＲＮＡ４の全塩基配
列を決めることができる。
【００１２】〔形質転換植物の作出〕イネ縞葉枯ウイル
ス感染特異タンパク質は、ＲＮＡ４（２１５７塩基）の
５５塩基目より５９１塩基目までにコードされている
（配列表の配列番号２）。得られたＲＮＡ４のｃＤＮＡ
を基にして、例えば、リバースプライマー（宝酒造製）
と合成プライマー（ 5' TAATGCTAGCACTCGTGG 3' ）を用
いて SaikiらのＰＣＲ法(Nature ３２４，１２６（１９
８６））でベクターｐＵＣ１９（ Gene ３３, １０３
（１９８５））のクローニングサイトも含めて１−６３
３塩基を増幅し、例えばｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に挿
入した。かかる遺伝子を例えば制限酵素ＳａｌＩとＥｃ
ｏＲＩで切り出し、イネ科植物中で発現するプロモータ
ーとターミネーター、もしくは必要に応じてイントロン
を有するプラスミドベクターに組み込む。
ス感染特異タンパク質は、ＲＮＡ４（２１５７塩基）の
５５塩基目より５９１塩基目までにコードされている
（配列表の配列番号２）。得られたＲＮＡ４のｃＤＮＡ
を基にして、例えば、リバースプライマー（宝酒造製）
と合成プライマー（ 5' TAATGCTAGCACTCGTGG 3' ）を用
いて SaikiらのＰＣＲ法(Nature ３２４，１２６（１９
８６））でベクターｐＵＣ１９（ Gene ３３, １０３
（１９８５））のクローニングサイトも含めて１−６３
３塩基を増幅し、例えばｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に挿
入した。かかる遺伝子を例えば制限酵素ＳａｌＩとＥｃ
ｏＲＩで切り出し、イネ科植物中で発現するプロモータ
ーとターミネーター、もしくは必要に応じてイントロン
を有するプラスミドベクターに組み込む。
【００１３】利用するプロモーターとして、例えば CaM
V35S（ pBI221: EMBO.J., ６，３９０１−３９０７，１
９８７）等のカリフラワーモザイクウイルス由来のプロ
モーター、ｒｂｃＳ（ ribulose 1.5-bisphosphate car
boxylase) 、Ｃａｂ（chlorophyll a/b binding protei
n)等 ( Science, ２４４，１７４, １９８９）植物中で
発現する事が確認されたプロモーターがあげられる。
V35S（ pBI221: EMBO.J., ６，３９０１−３９０７，１
９８７）等のカリフラワーモザイクウイルス由来のプロ
モーター、ｒｂｃＳ（ ribulose 1.5-bisphosphate car
boxylase) 、Ｃａｂ（chlorophyll a/b binding protei
n)等 ( Science, ２４４，１７４, １９８９）植物中で
発現する事が確認されたプロモーターがあげられる。
【００１４】ターミネーターとしては、例えばカリフラ
ワーモザイクウイルス由来のターミネーター，ＮＯＳ
（ノパリン合成酵素）遺伝子由来のターミネーター等が
あげられる。また、プロモーターと構造遺伝子の間にイ
ントロンを配するベクターも高発現ベクターとして利用
でき、イントロンとしては、例えばトウモロコシＡｄｈ
ｌ（アルコールデヒドロゲナーゼ）の第一イントロン
（ Genes & Development, １，１１８３−１２００, １
９８７）、ヒマＣａｔ（カタラーゼ）の第一イントロン
(Tanakaら、Nucleic Acids Research, １８, ６７６７
−６７７０，１９９０）等があげられる。
ワーモザイクウイルス由来のターミネーター，ＮＯＳ
（ノパリン合成酵素）遺伝子由来のターミネーター等が
あげられる。また、プロモーターと構造遺伝子の間にイ
ントロンを配するベクターも高発現ベクターとして利用
でき、イントロンとしては、例えばトウモロコシＡｄｈ
ｌ（アルコールデヒドロゲナーゼ）の第一イントロン
（ Genes & Development, １，１１８３−１２００, １
９８７）、ヒマＣａｔ（カタラーゼ）の第一イントロン
(Tanakaら、Nucleic Acids Research, １８, ６７６７
−６７７０，１９９０）等があげられる。
【００１５】本発明においては更に、ハイグロマイシン
フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフ
ォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルキュ
ロニダーゼ遺伝子等から選ばれる２つ以上の外来遺伝子
を使用し、かつその１つは目的とするコロニーを選択す
る際に有効な、いわゆる選択マーカー遺伝子を使用する
のが好ましい。かかる選択マーカー遺伝子としては、ハ
イグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子が
好ましい。
フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフ
ォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルキュ
ロニダーゼ遺伝子等から選ばれる２つ以上の外来遺伝子
を使用し、かつその１つは目的とするコロニーを選択す
る際に有効な、いわゆる選択マーカー遺伝子を使用する
のが好ましい。かかる選択マーカー遺伝子としては、ハ
イグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子が
好ましい。
【００１６】本発明においては、選択マーカー遺伝子と
他の外来遺伝子を同一のプラスミド中に有するものを使
用してもよいし、選択マーカー遺伝子を有するプラスミ
ドと他の外来遺伝子を有するプラスミドとを併用しても
よい。ベクターはイネ科植物を形質転換するのに用いら
れる。すなわち、イネ科植物由来のプロトプラストを液
体媒体に懸濁し、電気パルスを印加して該ベクターを導
入した後、イネ培養細胞を含有する培地で培養しコロニ
ーを形成させ、該コロニーから植物体を再生させる方法
である ( Shimamoto et al., Nature,３３７, ２７４
−２７６，１９８９）。プロトプラストは次のようにし
て調製することができる。例えば、日本晴、コシヒカ
リ、ササニシキ等の栽培イネの完熟及び未熟種子、幼子
葉、根の組織に由来するサスペンション細胞あるいはカ
ルスをＲ２培地等の通常使用される液体培地で培養した
後、常法に従い、例えばセルラーゼやマセロザイム等の
細胞壁分解酵素を含む酵素液中２５−３０℃、０−５０
spmの条件で３−１６時間程度酵素処理する。酵素処理
終了後、濾過して未消化物を除き、ろ液に２−５倍量の
ＫＭＣ液（０．１１８Ｍ塩化カリウム，０．０８１Ｍ塩
化マグネシウム，０．０８５Ｍ塩化カルシウム，ｐＨ
６．０）( Theor. Appl.Genet.,５３，５７−６３，１
９７８）等を加え遠心分離して、精製されたプロトプラ
ストを得ることができる。
他の外来遺伝子を同一のプラスミド中に有するものを使
用してもよいし、選択マーカー遺伝子を有するプラスミ
ドと他の外来遺伝子を有するプラスミドとを併用しても
よい。ベクターはイネ科植物を形質転換するのに用いら
れる。すなわち、イネ科植物由来のプロトプラストを液
体媒体に懸濁し、電気パルスを印加して該ベクターを導
入した後、イネ培養細胞を含有する培地で培養しコロニ
ーを形成させ、該コロニーから植物体を再生させる方法
である ( Shimamoto et al., Nature,３３７, ２７４
−２７６，１９８９）。プロトプラストは次のようにし
て調製することができる。例えば、日本晴、コシヒカ
リ、ササニシキ等の栽培イネの完熟及び未熟種子、幼子
葉、根の組織に由来するサスペンション細胞あるいはカ
ルスをＲ２培地等の通常使用される液体培地で培養した
後、常法に従い、例えばセルラーゼやマセロザイム等の
細胞壁分解酵素を含む酵素液中２５−３０℃、０−５０
spmの条件で３−１６時間程度酵素処理する。酵素処理
終了後、濾過して未消化物を除き、ろ液に２−５倍量の
ＫＭＣ液（０．１１８Ｍ塩化カリウム，０．０８１Ｍ塩
化マグネシウム，０．０８５Ｍ塩化カルシウム，ｐＨ
６．０）( Theor. Appl.Genet.,５３，５７−６３，１
９７８）等を加え遠心分離して、精製されたプロトプラ
ストを得ることができる。
【００１７】上記のようにして調整した遺伝子を含む発
現ベクター、例えば１−１００ｕｇ／mlと、上記植物由
来のプロトプラスト、例えば（２−１０）×１０6 個／
mlとを、３０−２００ｍＭ塩化カリウム、０−５０ｍＭ
塩化マグネシウム、０．２−０．６Ｍマニトールを含む
緩衝液等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印
加してプラスミドをプロトプラスト中に導入する。電気
パルス処理は、１００−１０００ｕＦのコンデンサーを
用いて得られる２００−１０００Ｖ／cmの初期電圧の直
流パルスで、パルス幅１−５０msec程度の条件で印加す
るのが好適である（特開平１−１８１７９１号公報参
照）。
現ベクター、例えば１−１００ｕｇ／mlと、上記植物由
来のプロトプラスト、例えば（２−１０）×１０6 個／
mlとを、３０−２００ｍＭ塩化カリウム、０−５０ｍＭ
塩化マグネシウム、０．２−０．６Ｍマニトールを含む
緩衝液等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印
加してプラスミドをプロトプラスト中に導入する。電気
パルス処理は、１００−１０００ｕＦのコンデンサーを
用いて得られる２００−１０００Ｖ／cmの初期電圧の直
流パルスで、パルス幅１−５０msec程度の条件で印加す
るのが好適である（特開平１−１８１７９１号公報参
照）。
【００１８】上述のように電気パルス処理したプロトプ
ラストを、例えばＲ２培地（ Plant. Cell. Physiol.,
１４，１１１３，１９７３）の無機成分とＭＳ培地（ M
urashigeandSkoog, １５，４７３−４９７，１９６２）
のビタミン混合液を含む液体培地（Ｒ２／ＭＳ）あるい
はＭＳ培地で、好ましくは窒素源として硝酸カリウムを
０．２−０．５％含有する培地に懸濁し、これを１．０
−３．０％程度のアガロースを含むＲ２／ＭＳあるいは
ＭＳ培地等と等量ずつ混ぜ、速やかにシャーレ中に広げ
て薄く固める。この時のプロトプラストの濃度は約（５
−５０）×１０ 5 個／mlとなるようにするのが好まし
い。
ラストを、例えばＲ２培地（ Plant. Cell. Physiol.,
１４，１１１３，１９７３）の無機成分とＭＳ培地（ M
urashigeandSkoog, １５，４７３−４９７，１９６２）
のビタミン混合液を含む液体培地（Ｒ２／ＭＳ）あるい
はＭＳ培地で、好ましくは窒素源として硝酸カリウムを
０．２−０．５％含有する培地に懸濁し、これを１．０
−３．０％程度のアガロースを含むＲ２／ＭＳあるいは
ＭＳ培地等と等量ずつ混ぜ、速やかにシャーレ中に広げ
て薄く固める。この時のプロトプラストの濃度は約（５
−５０）×１０ 5 個／mlとなるようにするのが好まし
い。
【００１９】固化したアガロースを５−２０mm大の大き
さに切断し上記液体培地上で培養する。その際、イネ科
植物由来のプロトプラストを使用した場合には、好まし
くは培地中にイネ培養細胞を１００−３００mgＦＷ／シ
ャーレ程度共存させ、２０−５０rpm の回転でゆっくり
振とうしながら、暗条件下２３−２７℃で培養する。イ
ネ培養細胞と共存させる方法は上記の方法のほかに、プ
ロトプラストを含む液体培地を底にメンブレンフイルタ
ーを設けた容器内にいれ、その容器をイネ培養細胞と共
に液体培地を入れたシャーレに浸して共存させる方法が
ある。ここに示すイネ培養細胞は、旺盛に分裂している
細かい細胞塊から成る物が好ましい。このような培養細
胞は、たとえばイネ植物の種子、茎、根あるいは葯より
得られたカルスを液体培地中に継代して分裂速度の早い
細胞を選抜していく等の公知の方法に準じて容易に得ら
れる。
さに切断し上記液体培地上で培養する。その際、イネ科
植物由来のプロトプラストを使用した場合には、好まし
くは培地中にイネ培養細胞を１００−３００mgＦＷ／シ
ャーレ程度共存させ、２０−５０rpm の回転でゆっくり
振とうしながら、暗条件下２３−２７℃で培養する。イ
ネ培養細胞と共存させる方法は上記の方法のほかに、プ
ロトプラストを含む液体培地を底にメンブレンフイルタ
ーを設けた容器内にいれ、その容器をイネ培養細胞と共
に液体培地を入れたシャーレに浸して共存させる方法が
ある。ここに示すイネ培養細胞は、旺盛に分裂している
細かい細胞塊から成る物が好ましい。このような培養細
胞は、たとえばイネ植物の種子、茎、根あるいは葯より
得られたカルスを液体培地中に継代して分裂速度の早い
細胞を選抜していく等の公知の方法に準じて容易に得ら
れる。
【００２０】培養後２−４週間で、０．５−１mm程度の
コロニーが形成される。その際、例えば外来遺伝子とし
て選択標識遺伝子でもあるハイグロマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）を導入しておいた場
合、培養開始後７−２０日にハイグロマイシンを１０−
１００ug／ml程度培養液中に添加し、さらに培養を続け
ると目的とする形質転換細胞の選択を効率よく行うこと
ができる。次いでこのコロニーを増殖培地、例えばＲ２
培地に植物ホルモン、例えば２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸（２，４−Ｄ）を２mg／リットル程度、アガロー
スを０．１−１．０％加えた寒天培地上で２−４週間、
照明下（１０００−４０００lux ）、２３−２７℃で培
養し３−６mmφのカルスを得る。個々のカルスを単独に
分離し、さらに、例えば外来遺伝子としてｈｐｈ遺伝子
を導入した場合には、ハイグロマイシン２０−５０ug／
mlを含む同増殖培地に置床して培養し、ハイグロマイシ
ン耐性を確認する。
コロニーが形成される。その際、例えば外来遺伝子とし
て選択標識遺伝子でもあるハイグロマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）を導入しておいた場
合、培養開始後７−２０日にハイグロマイシンを１０−
１００ug／ml程度培養液中に添加し、さらに培養を続け
ると目的とする形質転換細胞の選択を効率よく行うこと
ができる。次いでこのコロニーを増殖培地、例えばＲ２
培地に植物ホルモン、例えば２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸（２，４−Ｄ）を２mg／リットル程度、アガロー
スを０．１−１．０％加えた寒天培地上で２−４週間、
照明下（１０００−４０００lux ）、２３−２７℃で培
養し３−６mmφのカルスを得る。個々のカルスを単独に
分離し、さらに、例えば外来遺伝子としてｈｐｈ遺伝子
を導入した場合には、ハイグロマイシン２０−５０ug／
mlを含む同増殖培地に置床して培養し、ハイグロマイシ
ン耐性を確認する。
【００２１】このカルスを例えば０．５−１．５％アガ
ロースを含むＲ２／ＭＳ培地（０．１−１％インドール
酢酸、０．５−２％ゼアチン）で２３−２７℃、２００
０−４０００lux の条件下で培養すれば２−１０週間で
不定胚または不定芽の形成が認められる。さらに２−３
週間ホルモンを含まないＲ２／ＭＳ培地等で培養するこ
とにより、移植可能な幼植物体が得られる。こうして得
られた幼植物体は、バーミュキュライト等に移植して成
長させると目的とする形質転換されたイネの植物体を得
ることができる。
ロースを含むＲ２／ＭＳ培地（０．１−１％インドール
酢酸、０．５−２％ゼアチン）で２３−２７℃、２００
０−４０００lux の条件下で培養すれば２−１０週間で
不定胚または不定芽の形成が認められる。さらに２−３
週間ホルモンを含まないＲ２／ＭＳ培地等で培養するこ
とにより、移植可能な幼植物体が得られる。こうして得
られた幼植物体は、バーミュキュライト等に移植して成
長させると目的とする形質転換されたイネの植物体を得
ることができる。
【００２２】〔縞葉枯ウイルス感染抵抗性の確認〕再生
したイネの葉からタンパク質を抽出し、ウエスタン解析
によりイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現し
た形質転換イネを確認する。かかる形質転換イネと、コ
ントロールとして用いたイネ縞葉枯ウイルス感染特異タ
ンパク質を発現していないイネ、正常のイネとともに、
一定数のウイルス保毒虫（ヒメトビウンカ）を入れた飼
育箱に入れ感染させる。３−５日経過後、虫を払い、殺
虫剤で残った虫を殺してから、隔離温室に出し発病まで
観察する。その後、形質転換体とコントロールのウイル
ス病の感染率から抵抗性を測定した。
したイネの葉からタンパク質を抽出し、ウエスタン解析
によりイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現し
た形質転換イネを確認する。かかる形質転換イネと、コ
ントロールとして用いたイネ縞葉枯ウイルス感染特異タ
ンパク質を発現していないイネ、正常のイネとともに、
一定数のウイルス保毒虫（ヒメトビウンカ）を入れた飼
育箱に入れ感染させる。３−５日経過後、虫を払い、殺
虫剤で残った虫を殺してから、隔離温室に出し発病まで
観察する。その後、形質転換体とコントロールのウイル
ス病の感染率から抵抗性を測定した。
【００２３】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に制約
されるものではない。
本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に制約
されるものではない。
【００２４】〔実施例１〕 ウイルス粒子とウイルスＲ
ＮＡの精製： イネ縞葉枯ウイルス（Ｊ．ｇｅｎ．ｖｉｒｏｌ．７０，
５０５（１９８９））を保有するヒメトビウンカをコム
ギに接種し一週間程度ウイルスを増殖させた後凍結し
た。かかる凍結した感染葉をリン酸緩衝液（１０ｍＭジ
エチルジチオカーバメイト、０．１Ｍリン酸水素２ナト
リウム、ｐＨ７．２）の中で粉砕後、１／５量のトリフ
ルオロトリクロロエタンを加え清澄化してから、２０％
ショ糖クッションに重層し１２３，０００×ｇで１．５
時間遠心分離する。沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に溶解し、４，０００×ｇで１０分間遠心分離
する。続いて上清に３５％飽和となるように硫安を加え
５分間攪はん後、４，０００×ｇで５分間遠心分離す
る。上清を約４倍に希釈後、最終濃度が８％となるよう
にポリエチレングリコールを加え１時間以上攪はんす
る。これを３０，０００×ｇ、３０分で遠心分離した
後、沈澱をショ糖密度勾配遠心（１０−４０％、１０
０，０００×ｇ、２．５時間）にのせた。ウイルス粒子
は、Ｂ，Ｍ，ｎＢ（上層から下層へ）の３成分に分離し
て得られる。ウイルスを含む各層を１２３，０００×
ｇ、３時間遠心分離することによりウイルス粒子を精製
した。本発明に用いたＲＮＡ４は、全成分に含まれる。
ＮＡの精製： イネ縞葉枯ウイルス（Ｊ．ｇｅｎ．ｖｉｒｏｌ．７０，
５０５（１９８９））を保有するヒメトビウンカをコム
ギに接種し一週間程度ウイルスを増殖させた後凍結し
た。かかる凍結した感染葉をリン酸緩衝液（１０ｍＭジ
エチルジチオカーバメイト、０．１Ｍリン酸水素２ナト
リウム、ｐＨ７．２）の中で粉砕後、１／５量のトリフ
ルオロトリクロロエタンを加え清澄化してから、２０％
ショ糖クッションに重層し１２３，０００×ｇで１．５
時間遠心分離する。沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に溶解し、４，０００×ｇで１０分間遠心分離
する。続いて上清に３５％飽和となるように硫安を加え
５分間攪はん後、４，０００×ｇで５分間遠心分離す
る。上清を約４倍に希釈後、最終濃度が８％となるよう
にポリエチレングリコールを加え１時間以上攪はんす
る。これを３０，０００×ｇ、３０分で遠心分離した
後、沈澱をショ糖密度勾配遠心（１０−４０％、１０
０，０００×ｇ、２．５時間）にのせた。ウイルス粒子
は、Ｂ，Ｍ，ｎＢ（上層から下層へ）の３成分に分離し
て得られる。ウイルスを含む各層を１２３，０００×
ｇ、３時間遠心分離することによりウイルス粒子を精製
した。本発明に用いたＲＮＡ４は、全成分に含まれる。
【００２５】精製したウイルスより全ウイルスＲＮＡを
ＳＤＳ−フェノール法を用いて抽出した。即ち精製ウイ
ルスの懸濁液にＳＤＳ（２％）とベントナイト（１２．
５mg／ml）、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を加え、さらにフ
ェノールを等量加えてタンパク質を除去し、その後常法
に従ってエタノール沈澱を繰り返してＲＮＡを単離精製
した。この方法によりショ糖密度勾配遠心で得られたＢ
とＭ画分からは、ＲＮＡ２−４の混合液が抽出できた。
ＳＤＳ−フェノール法を用いて抽出した。即ち精製ウイ
ルスの懸濁液にＳＤＳ（２％）とベントナイト（１２．
５mg／ml）、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を加え、さらにフ
ェノールを等量加えてタンパク質を除去し、その後常法
に従ってエタノール沈澱を繰り返してＲＮＡを単離精製
した。この方法によりショ糖密度勾配遠心で得られたＢ
とＭ画分からは、ＲＮＡ２−４の混合液が抽出できた。
【００２６】〔実施例２〕 ｃＤＮＡの合成とクローニ
ング ｃＤＮＡはＲＮＡ２−４の混合液を用いて合成した。ま
ず、ＲＮＡ４の３’末端の塩基配列を直接シークエンス
により決定し（ J. gen. Virol. ７１，２８７１（１９
９０））、これよりプライマー（5' GGGCATATCTTTTGAGA
TTA 3'）を合成した。ＲＮＡ２から４を鋳型として逆転
写酵素を使用して Gubler-Hoffman の方法（前述）に従
いｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、１本鎖で
あるので、これを鋳型としてさらに２本鎖ｃＤＮＡを合
成した。これをプラスミドｐＵＣ１９（ Gene ３３，１
０３−１１９，（１９８５））のＳｍａＩサイトにつな
ぎ大腸菌ＤＨ５αで形質転換して、クローニングした。
得られたクローンが、３本のＲＮＡのどれに対応するか
調べるために、各クローンの両末端から２００塩基程度
をシークエンスし塩基配列を決定した。これらと既に記
載のあるＲＮＡ４の３’末端の塩基配列（ J. gen. Vir
ol. ７１，２８１７（１９９０））とを比較して、ＲＮ
Ａ４の３’末端約５０塩基との相同性から、ＲＮＡ４由
来のクローンと判断し、かかるクローンを選んだ。Sang
erら（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA７４，５４６３
（１９７７））の方法でかかるクローンの塩基配列を決
定した後、５’端に近く適当な配列を持つ領域に対する
プライマー（5' CAACTTTCAACATACTTGTT 3'）を合成し、
プライマー伸長法でＲＮＡ４全域にわたるｃＤＮＡを合
成した。
ング ｃＤＮＡはＲＮＡ２−４の混合液を用いて合成した。ま
ず、ＲＮＡ４の３’末端の塩基配列を直接シークエンス
により決定し（ J. gen. Virol. ７１，２８７１（１９
９０））、これよりプライマー（5' GGGCATATCTTTTGAGA
TTA 3'）を合成した。ＲＮＡ２から４を鋳型として逆転
写酵素を使用して Gubler-Hoffman の方法（前述）に従
いｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、１本鎖で
あるので、これを鋳型としてさらに２本鎖ｃＤＮＡを合
成した。これをプラスミドｐＵＣ１９（ Gene ３３，１
０３−１１９，（１９８５））のＳｍａＩサイトにつな
ぎ大腸菌ＤＨ５αで形質転換して、クローニングした。
得られたクローンが、３本のＲＮＡのどれに対応するか
調べるために、各クローンの両末端から２００塩基程度
をシークエンスし塩基配列を決定した。これらと既に記
載のあるＲＮＡ４の３’末端の塩基配列（ J. gen. Vir
ol. ７１，２８１７（１９９０））とを比較して、ＲＮ
Ａ４の３’末端約５０塩基との相同性から、ＲＮＡ４由
来のクローンと判断し、かかるクローンを選んだ。Sang
erら（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA７４，５４６３
（１９７７））の方法でかかるクローンの塩基配列を決
定した後、５’端に近く適当な配列を持つ領域に対する
プライマー（5' CAACTTTCAACATACTTGTT 3'）を合成し、
プライマー伸長法でＲＮＡ４全域にわたるｃＤＮＡを合
成した。
【００２７】〔実施例３〕 ｃＤＮＡのシークエンスと
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質遺伝子の決定 上記で選んだＲＮＡ４由来のクローンを宝酒造製キロシ
ークエンス用デレーションキットを用いてクローンの欠
損変異株を作成した。１００から２００塩基程度の割合
で欠損を持つ変異株を選抜し、Sangerらの方法（ジデオ
キシ法；前述）で各変異株の塩基配列を決定した。ＲＮ
Ａ４は、２１５７塩基からなり、ウイルスＲＮＡの５’
端に１７８アミノ酸（配列表の配列番号１）、分子量２
０，５４１のタンパク質をコードする領域を有し、ウイ
ルスＲＮＡに相補的なＲＮＡの５’端に２８６アミノ
酸、分子量３２，４７４のタンパク質をコードする領域
があるアンチセンスＲＮＡであることがわかった。続い
て、コンピューター解析（GENETYX, Software Developm
ent Co.)により、ＲＮＡ４にコードされているタンパク
質の推定アミノ酸配列を求めた。一方、感染イネから精
製したイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質のアミノ
酸組成をＰＩＣＯ・ＴＡＧ法（Waters）によって分析し
た。得られた結果をイネ縞葉枯ウイルスＲＮＡ４にコー
ドされている、イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
のコーティング領域と思われるものから推定したアミノ
酸組成と比較したところ、９８％の相同性が認められ
た。かくして、分子量約２０，０００のタンパク質が、
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質であり、かかる
領域がイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコード
する遺伝子であると決定した。その塩基配列を配列表の
配列番号２に示す。なお、本発明においては、イネにウ
イルス抵抗性を付与させることができる範囲で、一部の
アミノ酸または塩基を除去、置換あるいは追加する等の
改変を行ったものも、本発明に含まれる。
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質遺伝子の決定 上記で選んだＲＮＡ４由来のクローンを宝酒造製キロシ
ークエンス用デレーションキットを用いてクローンの欠
損変異株を作成した。１００から２００塩基程度の割合
で欠損を持つ変異株を選抜し、Sangerらの方法（ジデオ
キシ法；前述）で各変異株の塩基配列を決定した。ＲＮ
Ａ４は、２１５７塩基からなり、ウイルスＲＮＡの５’
端に１７８アミノ酸（配列表の配列番号１）、分子量２
０，５４１のタンパク質をコードする領域を有し、ウイ
ルスＲＮＡに相補的なＲＮＡの５’端に２８６アミノ
酸、分子量３２，４７４のタンパク質をコードする領域
があるアンチセンスＲＮＡであることがわかった。続い
て、コンピューター解析（GENETYX, Software Developm
ent Co.)により、ＲＮＡ４にコードされているタンパク
質の推定アミノ酸配列を求めた。一方、感染イネから精
製したイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質のアミノ
酸組成をＰＩＣＯ・ＴＡＧ法（Waters）によって分析し
た。得られた結果をイネ縞葉枯ウイルスＲＮＡ４にコー
ドされている、イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
のコーティング領域と思われるものから推定したアミノ
酸組成と比較したところ、９８％の相同性が認められ
た。かくして、分子量約２０，０００のタンパク質が、
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質であり、かかる
領域がイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコード
する遺伝子であると決定した。その塩基配列を配列表の
配列番号２に示す。なお、本発明においては、イネにウ
イルス抵抗性を付与させることができる範囲で、一部の
アミノ酸または塩基を除去、置換あるいは追加する等の
改変を行ったものも、本発明に含まれる。
【００２８】〔実施例４〕 形質転換用プラスミドの構
築 形質転換用ベクターとしてｐＩＧ２２１（Plant Cell P
hysiol. ３１，８０５（１９９０））のβ−グルキュロ
ニダーゼのコーディング領域をハイグロマイシンフォス
フォトランスフェラーゼと交換し、イントロン上流のＡ
ＴＧを欠失させたイネ高発現ハイグロマイシン耐性ベク
ター（ｐＩＺＩ）を利用した。かかるｐＩＺＩベクター
には、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモー
ターとヒマのカタラーゼ由来のイントロン、アグロバク
テリウムのノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネー
ターを有するものである。
築 形質転換用ベクターとしてｐＩＧ２２１（Plant Cell P
hysiol. ３１，８０５（１９９０））のβ−グルキュロ
ニダーゼのコーディング領域をハイグロマイシンフォス
フォトランスフェラーゼと交換し、イントロン上流のＡ
ＴＧを欠失させたイネ高発現ハイグロマイシン耐性ベク
ター（ｐＩＺＩ）を利用した。かかるｐＩＺＩベクター
には、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモー
ターとヒマのカタラーゼ由来のイントロン、アグロバク
テリウムのノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネー
ターを有するものである。
【００２９】実施例２と実施例３で選んだＲＮＡ４由来
のｃＤＮＡからイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
の遺伝子（１−６３２）を含むように、リバースプライ
マー（宝酒造製）とプライマー（5' TAATGCTAGCACTCGTG
G 3'）を用いてＰＣＲ法にて増幅させ、Ｔ４ポリメラー
ゼ（宝酒造製）で処理し平滑末端にした後、ｐＵＣ１９
（前述）のＳｍａＩサイトへ挿入した。かかるクローン
を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ポリメラーゼ処理
で平滑末端にし、さらに制限酵素ＳａｌＩで切断し、イ
ネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコードする遺伝
子を含む断片を回収した。ｐＩＺＩベクターをＥｃｏＲ
ＩとＳａｌＩで切断し、ハイグロマイシン耐性遺伝子
（ｈｐｈ）を除去した。この時ＥｃｏＲＩ部位は、Ｔ４
ポリメラーゼにより平滑末端とした。かくして得たカリ
フラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ヒ
マカタラーゼのイントロン、ノパリンシンターゼのター
ミネーターを持つベクターとイネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質をコードしている遺伝子とを、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造製）を用いて環状化させた。
大腸菌ＤＨ５αを用いて形質転換し、アンピシリンで選
抜することにより形質転換用プラスミドｐＬＡＮ１６０
を得た。
のｃＤＮＡからイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
の遺伝子（１−６３２）を含むように、リバースプライ
マー（宝酒造製）とプライマー（5' TAATGCTAGCACTCGTG
G 3'）を用いてＰＣＲ法にて増幅させ、Ｔ４ポリメラー
ゼ（宝酒造製）で処理し平滑末端にした後、ｐＵＣ１９
（前述）のＳｍａＩサイトへ挿入した。かかるクローン
を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ポリメラーゼ処理
で平滑末端にし、さらに制限酵素ＳａｌＩで切断し、イ
ネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコードする遺伝
子を含む断片を回収した。ｐＩＺＩベクターをＥｃｏＲ
ＩとＳａｌＩで切断し、ハイグロマイシン耐性遺伝子
（ｈｐｈ）を除去した。この時ＥｃｏＲＩ部位は、Ｔ４
ポリメラーゼにより平滑末端とした。かくして得たカリ
フラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ヒ
マカタラーゼのイントロン、ノパリンシンターゼのター
ミネーターを持つベクターとイネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質をコードしている遺伝子とを、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造製）を用いて環状化させた。
大腸菌ＤＨ５αを用いて形質転換し、アンピシリンで選
抜することにより形質転換用プラスミドｐＬＡＮ１６０
を得た。
【００３０】〔実施例５〕 エレクトロポーレーション
によるイネプロトプラストの形質転換 （１） イネプロトプラストの単離 本発明に使用したイネ植物由来のプロトプラストは栽培
イネ日本晴の完熟種子に由来するもので、以下のように
して得た。完熟種子のサスペンション細胞をＲ２培地で
培養した後、４％セルラーゼＲＳ、１％マセロザイムＲ
１０、０．４Ｍマニトールを含む酵素液（ｐＨ５．６）
で３〜４時間３０℃で処理した。酵素処理液を濾過した
後、濾液に４倍量のＫＭＣ液（ＫＣｌ ０．１１８Ｍ，
ＣａＣｌ 2 ０．０８５Ｍ、ＭｇＣｌ2 ０．０８１
Ｍ、ｐＨ６．０；前述）を加え、遠心分離して沈降した
プロトプラストを集め、さらにＫＭＣ液で２回洗浄し
た。
によるイネプロトプラストの形質転換 （１） イネプロトプラストの単離 本発明に使用したイネ植物由来のプロトプラストは栽培
イネ日本晴の完熟種子に由来するもので、以下のように
して得た。完熟種子のサスペンション細胞をＲ２培地で
培養した後、４％セルラーゼＲＳ、１％マセロザイムＲ
１０、０．４Ｍマニトールを含む酵素液（ｐＨ５．６）
で３〜４時間３０℃で処理した。酵素処理液を濾過した
後、濾液に４倍量のＫＭＣ液（ＫＣｌ ０．１１８Ｍ，
ＣａＣｌ 2 ０．０８５Ｍ、ＭｇＣｌ2 ０．０８１
Ｍ、ｐＨ６．０；前述）を加え、遠心分離して沈降した
プロトプラストを集め、さらにＫＭＣ液で２回洗浄し
た。
【００３１】（２） 電気パルス処理 （１）で調整したプロトプラストを、ＥＰ３緩衝液（７
０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．４Ｍマニト
ール、０．１％ＭＥＳを含む緩衝液（ｐＨ５．８））に
４×１０6 個／mlとなるように懸濁した。この懸濁液
に、上記実施例４で得たプラスミドｐＬＡＮ１６０（６
０ｇ／ml）並びに選抜マーカーとしてハイグロマイシン
フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドｐＩＺＩ（６０μｇ／ml）を添加し、４℃で５分間冷
却した後、滅菌したプラスチックセルに移し、平行電極
を用い、直流の電気パルスを印加した。その際、８０μ
Ｆのコンデンサーを用いて３００Ｖ／cmの初期電圧をか
け、パルス幅は１０msecとした。パルス印加後４℃で１
０分間冷却した後、等量のＲ２／ＭＳプロトプラストア
ガロース培地（ Mol. Gen. Gent., ２０６，４０８（１
９８７））と混合し、０．７mmの厚さとなるように固化
させた。この時の細胞密度は約３×１０6 個／mlであっ
た。
０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．４Ｍマニト
ール、０．１％ＭＥＳを含む緩衝液（ｐＨ５．８））に
４×１０6 個／mlとなるように懸濁した。この懸濁液
に、上記実施例４で得たプラスミドｐＬＡＮ１６０（６
０ｇ／ml）並びに選抜マーカーとしてハイグロマイシン
フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドｐＩＺＩ（６０μｇ／ml）を添加し、４℃で５分間冷
却した後、滅菌したプラスチックセルに移し、平行電極
を用い、直流の電気パルスを印加した。その際、８０μ
Ｆのコンデンサーを用いて３００Ｖ／cmの初期電圧をか
け、パルス幅は１０msecとした。パルス印加後４℃で１
０分間冷却した後、等量のＲ２／ＭＳプロトプラストア
ガロース培地（ Mol. Gen. Gent., ２０６，４０８（１
９８７））と混合し、０．７mmの厚さとなるように固化
させた。この時の細胞密度は約３×１０6 個／mlであっ
た。
【００３２】（３） プロトプラストの培養 （２）の電気パルス処理を行ったプロトプラストを含む
アガロースを１cm角程度の大きさに切り、Ｒ２／ＭＳ液
体プロトプラスト培地５mlの入った６cm¢のプレートに
入れ、さらに約１００mg（新鮮重）のイネ細胞をナース
細胞として加えた。
アガロースを１cm角程度の大きさに切り、Ｒ２／ＭＳ液
体プロトプラスト培地５mlの入った６cm¢のプレートに
入れ、さらに約１００mg（新鮮重）のイネ細胞をナース
細胞として加えた。
【００３３】かかるイネの培養細胞は以下のようにして
調製した。即ち、完熟胚に由来するカルスを液体培地中
で週１回植え継ぎ、作製した懸濁培養液中に存在する分
裂旺盛な細かい（１mm¢以下）細胞塊を用いてナース細
胞とした。プロトプラストの培養は、約２５℃で約１０
日間、暗所で振とう（５０rpm)しながら培養した。この
培養後、ナース細胞は洗い出した。さらに培養３〜４日
後に３０μｇ／mlとなるようにハイグロマイシンＢを培
地に加え、２〜３週間培養した。その後、アガロース片
をＮ６ソフトアガロース（２mg／リットル ２，４Ｄ、
０．５mg／リットル ベンジルアミノプリン、６％ショ
糖、０．２５％アガロース、ｐＨ５．６）に置き、大き
くなったコロニーを取り、Ｒ２増殖培地（２mg／リット
ル ２，４Ｄ、６％ショ糖、０．５％アガロース、ｐＨ
Ｆ５．６）に移し２〜３週間増殖させた。耐性カルスの
出現頻度は、生成したコロニーに対して約０．５％であ
った。
調製した。即ち、完熟胚に由来するカルスを液体培地中
で週１回植え継ぎ、作製した懸濁培養液中に存在する分
裂旺盛な細かい（１mm¢以下）細胞塊を用いてナース細
胞とした。プロトプラストの培養は、約２５℃で約１０
日間、暗所で振とう（５０rpm)しながら培養した。この
培養後、ナース細胞は洗い出した。さらに培養３〜４日
後に３０μｇ／mlとなるようにハイグロマイシンＢを培
地に加え、２〜３週間培養した。その後、アガロース片
をＮ６ソフトアガロース（２mg／リットル ２，４Ｄ、
０．５mg／リットル ベンジルアミノプリン、６％ショ
糖、０．２５％アガロース、ｐＨ５．６）に置き、大き
くなったコロニーを取り、Ｒ２増殖培地（２mg／リット
ル ２，４Ｄ、６％ショ糖、０．５％アガロース、ｐＨ
Ｆ５．６）に移し２〜３週間増殖させた。耐性カルスの
出現頻度は、生成したコロニーに対して約０．５％であ
った。
【００３４】（４） 植物体の再生 （３）で得たカルスをＲ２／ＭＳ再生培地（１mg／リッ
トル ゼアチン、０．５mg／リットル インドール酢
酸、３％ソルビトール、２％ショ糖、１％アガロース、
ｐＨ５．８）に置き、明所で３〜１０週間培養すると、
芽及び根が現れた。芽が２cm程度に成長したところで、
同様の培地を含むマジェンタボックスへ移し、幼植物へ
と成長させた。さらにバーミキュライトポットへ移して
生育させ形質転換体イネが得られた。
トル ゼアチン、０．５mg／リットル インドール酢
酸、３％ソルビトール、２％ショ糖、１％アガロース、
ｐＨ５．８）に置き、明所で３〜１０週間培養すると、
芽及び根が現れた。芽が２cm程度に成長したところで、
同様の培地を含むマジェンタボックスへ移し、幼植物へ
と成長させた。さらにバーミキュライトポットへ移して
生育させ形質転換体イネが得られた。
【００３５】（５） 形質転換植物の解析 まず（３）で得たカルスより Richards の方法（ Curre
nt Protocol in Molecular Biology 2.3.1（１９８
７））に基づいてＤＮＡを抽出し、３５Ｓプロモーター
の上流側の塩基配列より合成したプライマー（5' CTCAG
AAGACCAAAGGG 3')とイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパ
ク質遺伝子の下流側塩基配列より合成したプライマーを
（5' TAATGCTAGCACTCGTGG 3'）用いてＰＣＲを行った。
外来遺伝子の断片がＰＣＲによって増幅されたものを形
質転換体カルスとしてＮ６再生培地（１mg／リットル
ゼアチン、０．５mg／リットル インドール酢酸、３％
ソルビトール、２％ショ糖、ｐＨ５．８）に移した。こ
の段階では外来遺伝子の導入されたカルスの割合はハイ
グロマイシン耐性カルスの約９０％であった。
nt Protocol in Molecular Biology 2.3.1（１９８
７））に基づいてＤＮＡを抽出し、３５Ｓプロモーター
の上流側の塩基配列より合成したプライマー（5' CTCAG
AAGACCAAAGGG 3')とイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパ
ク質遺伝子の下流側塩基配列より合成したプライマーを
（5' TAATGCTAGCACTCGTGG 3'）用いてＰＣＲを行った。
外来遺伝子の断片がＰＣＲによって増幅されたものを形
質転換体カルスとしてＮ６再生培地（１mg／リットル
ゼアチン、０．５mg／リットル インドール酢酸、３％
ソルビトール、２％ショ糖、ｐＨ５．８）に移した。こ
の段階では外来遺伝子の導入されたカルスの割合はハイ
グロマイシン耐性カルスの約９０％であった。
【００３６】次に、ＰＣＲポジティブなカルスより再生
した形質転換体から幼葉の一部を採取し、１％ＳＤＳ、
１ｍＭヨード酢酸を含むＴｒｉｓ緩衝液中で磨砕し、５
分間１００℃で熱処理を行った。１５，０００×ｇで１
０分間遠心分離することにより清澄化し、上清を１％Ｓ
ＤＳを含む１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気
泳動を行った。電気的にナイロン膜（ Immobilon, ミリ
ポア）にタンパク質を移した後、抗イネ縞葉枯ウイルス
感染特異タンパク質抗体とアルカリフォスファターゼ結
合二次抗体を用いてウエスタン解析を行い、イネ縞葉枯
ウイルス感染特異タンパク質を発現する形質転換体を確
認した。再生した７クローンのうち、４クローンにおい
てイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質の発現を確認
した。
した形質転換体から幼葉の一部を採取し、１％ＳＤＳ、
１ｍＭヨード酢酸を含むＴｒｉｓ緩衝液中で磨砕し、５
分間１００℃で熱処理を行った。１５，０００×ｇで１
０分間遠心分離することにより清澄化し、上清を１％Ｓ
ＤＳを含む１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気
泳動を行った。電気的にナイロン膜（ Immobilon, ミリ
ポア）にタンパク質を移した後、抗イネ縞葉枯ウイルス
感染特異タンパク質抗体とアルカリフォスファターゼ結
合二次抗体を用いてウエスタン解析を行い、イネ縞葉枯
ウイルス感染特異タンパク質を発現する形質転換体を確
認した。再生した７クローンのうち、４クローンにおい
てイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質の発現を確認
した。
【００３７】さらに、Chomczynski とSacchiの方法（An
nal. Biochem. １６２，１５６（１９８７））で形質転
換体の葉よりＲＮＡを抽出した。アマシャム社のプロト
コールに従い、２．２Ｍのホルムアルデヒドを含む１％
アガロースを用いて１０μｇのＲＮＡを電気泳動した。
ナイロン膜（ハイボンドＮ、アマシャム）へ真空ブロッ
ティング装置を用いて移し、イネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質遺伝子のコーディング領域をプローブとし
てノーザン解析を行いｍＲＮＡが発現していることを確
認した。この時、プローブは、マルチプライムラベリン
グキット（アマシャム）を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰでラベ
ルした。
nal. Biochem. １６２，１５６（１９８７））で形質転
換体の葉よりＲＮＡを抽出した。アマシャム社のプロト
コールに従い、２．２Ｍのホルムアルデヒドを含む１％
アガロースを用いて１０μｇのＲＮＡを電気泳動した。
ナイロン膜（ハイボンドＮ、アマシャム）へ真空ブロッ
ティング装置を用いて移し、イネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質遺伝子のコーディング領域をプローブとし
てノーザン解析を行いｍＲＮＡが発現していることを確
認した。この時、プローブは、マルチプライムラベリン
グキット（アマシャム）を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰでラベ
ルした。
【００３８】〔実施例６〕 形質転換体の縞葉枯ウイル
ス感染抵抗性の確認 実施例５で示されたノーザンおよびウエスタン解析によ
りイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現してい
ることが確認された形質転換イネ、４クローン（２２個
体）に対して、イネ縞葉枯ウイルスの保毒虫（ヒメトビ
ウンカ）を用いた感染実験を行った。コントロールとし
てイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現してい
ない形質転換イネや非形質転換イネを用いた。
ス感染抵抗性の確認 実施例５で示されたノーザンおよびウエスタン解析によ
りイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現してい
ることが確認された形質転換イネ、４クローン（２２個
体）に対して、イネ縞葉枯ウイルスの保毒虫（ヒメトビ
ウンカ）を用いた感染実験を行った。コントロールとし
てイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現してい
ない形質転換イネや非形質転換イネを用いた。
【００３９】かかる供試個体をウンカの飼育箱に入れ、
その箱の中に、イネ１個体に対し１０頭になるようにイ
ネ縞葉枯ウイルスを保毒しているヒメトビウンカを入れ
感染させた。３−５日経過後、イネに付いている虫を払
い、さらにイネに残存している虫を殺虫剤で殺してか
ら、隔離温室に移して発病まで観察した。形質転換体と
コントロールとして用いた２種類のイネのイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率を比べた。イネ縞葉枯ウイルス感染特異
タンパク質を発現したイネの形質転換体のイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率は９％で、コントロールとして用いた２
種類のイネのイネ縞葉枯ウイルス病の発病率は共に８３
％であった。このことから、イネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質を発現した形質転換イネがイネ縞葉枯ウイ
ルスに対して抵抗性であることを確認した。
その箱の中に、イネ１個体に対し１０頭になるようにイ
ネ縞葉枯ウイルスを保毒しているヒメトビウンカを入れ
感染させた。３−５日経過後、イネに付いている虫を払
い、さらにイネに残存している虫を殺虫剤で殺してか
ら、隔離温室に移して発病まで観察した。形質転換体と
コントロールとして用いた２種類のイネのイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率を比べた。イネ縞葉枯ウイルス感染特異
タンパク質を発現したイネの形質転換体のイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率は９％で、コントロールとして用いた２
種類のイネのイネ縞葉枯ウイルス病の発病率は共に８３
％であった。このことから、イネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質を発現した形質転換イネがイネ縞葉枯ウイ
ルスに対して抵抗性であることを確認した。
【００４０】
【発明の効果】本発明によれば、ウイルス外被タンパク
質以外の非構造タンパク質であるイネ縞葉枯ウイルスの
感染特異タンパク質の遺伝子をイネに導入して、イネの
中でイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質、あるい
は、かかる遺伝子のｍＲＮＡを発現させ、縞葉枯ウイル
ス感染抵抗性イネを作出することができる。
質以外の非構造タンパク質であるイネ縞葉枯ウイルスの
感染特異タンパク質の遺伝子をイネに導入して、イネの
中でイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質、あるい
は、かかる遺伝子のｍＲＮＡを発現させ、縞葉枯ウイル
ス感染抵抗性イネを作出することができる。
【００４１】
配列番号：１ 配列の長さ：１７８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源：イネ縞葉枯ウイルス 配列 Met Gln Asp Val Gln Arg Thr Ile Glu Val Ser Val Gly Pro Ile Val Gly Leu 1 5 10 15 Asp Tyr Thr Leu Leu Tyr Asp Thr Leu Pro Glu Thr Val Ser Asp Asn Ile Thr 20 25 30 35 Leu Pro Asp Leu Lys Asp Pro Glu Arg Val Thr Glu Asp Thr Lys Lys Leu Ile 40 45 50 Leu Lys Gly Cys Val Tyr Ile Ala Tyr His His Pro Leu Glu Thr Asp Thr Leu 55 60 65 70 Phe Ile Lys Val His Lys His Ile Pro Glu Phe Cys His Ser Phe Leu Ser His 75 80 85 90 Leu Leu Gly Gly Glu Asp Asp Asp Asn Ala Leu Ile Asp Ile Gly Leu Phe Phe 95 100 105 Asn Met Leu Gln Pro Ser Leu Gly Gly Trp Ile Thr Lys Asn Phe Leu Arg His 110 115 120 125 Pro Asn Arg Met Ser Lys Asp Gln Ile Lys Met Leu Leu Asp Gln Ile Ile Lys 130 135 140 Met Ala Lys Ala Glu Ser Ser Asp Thr Glu Glu Tyr Glu Lys Val Trp Lys Lys 145 150 155 160 Met Pro Thr Tyr Phe Glu Ser Ile Ile Gln Pro Leu Leu His Lys Thr Sto 165 170 175 178
【００４２】
【配列表】配列番号：２ 配列の長さ：５３７ 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 起源：イネ縞葉枯ウイルス 配列 ATG CAA GAC GTA CAA AGG ACA ATA GAA GTT TCT GTT GGT CCT ATT GTA 48 GGC CTA GAT TAC ACT CTA TTG TAT GAC ACT CTG CCT GAG ACT GTT AGC 96 GAT AAC ATT ACT CTA CCT GAT TTG AAA GAT CCA GAG AGA GTC ACG GAA 144 GAT ACT AAA AAG CTA ATA CTC AAA GGC TGT GTT TAC ATA GCA TAT CAT 192 CAC CCC TTG GAG ACT GAC ACC CTT TTC ATC AAA GTT CAC AAA CAT ATA 240 CCA GAG TTT TGT CAC TCA TTC CTA TCA CAC CTT CTA GGA GGT GAA GAT 288 GAT GAC AAT GCT CTT ATA GAC ATT GGT CTG TTT TTC AAC ATG TTG CAA 336 CCT TCT TTG GGC GGT TGG ATA ACC AAG AAT TTT CTT AGA CAC CCT AAT 384 AGG ATG TCT AAG GAC CAA ATT AAA ATG CTC CTG GAT CAG ATC ATC AAG 432 ATG GCT AAG GCT GAG AGC TCA GAC ACA GAA GAG TAT GAA AAA GTG TGG 480 AAG AAG ATG CCA ACT TAT TTT GAA TCA ATT ATC CAA CCT CTT CTT CAT 528 AAA ACA TAG 537
【図１】実施例で得られた形質転換用プラスミドｐＬＡ
Ｎ１６０の模式図である。
Ｎ１６０の模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】一方、交雑育種によるウイルス抵抗性品種
もイネ、ダイズ、キュウリ、ダイコン、タバコ、トマト
等で作出され、例えば、イネ縞葉枯ウイルス抵抗性遺伝
子をイネの栽培種へ導入する方法（中国農試報 Ａ１
６，３９）等が知られている。近年、ウイルスの外被タ
ンパク質をコードする遺伝子を植物に導入し、それを植
物体内で発現させ、ウイルス抵抗性植物を作出すること
が報告されている（Ann. Rev. Phytopathol. ２８, ４
５１（１９９０））。また、キュウリモザイクウイルス
のサテライトＲＮＡを植物に導入することによってウイ
ルス抵抗性植物を得たこと（Nature ３２８，７９９
（１９８５) ）、さらに、アンチセンスＲＮＡを利用し
たウイルス防除法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８
６, ６９４９（１９８９））が報告されている。イネに
おいては、本発明者などがイネ縞葉枯ウイルスのゲノム
ＲＮＡ３にコードされるイネ縞葉枯ウイルスの外被タン
パク質の遺伝子をイネに導入して、イネ縞葉枯ウイルス
耐性イネを作出することに成功している（平成３年日本
植物病理学会大会講演要旨集 ｐ１９３；Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA，８９（１９９２））。
もイネ、ダイズ、キュウリ、ダイコン、タバコ、トマト
等で作出され、例えば、イネ縞葉枯ウイルス抵抗性遺伝
子をイネの栽培種へ導入する方法（中国農試報 Ａ１
６，３９）等が知られている。近年、ウイルスの外被タ
ンパク質をコードする遺伝子を植物に導入し、それを植
物体内で発現させ、ウイルス抵抗性植物を作出すること
が報告されている（Ann. Rev. Phytopathol. ２８, ４
５１（１９９０））。また、キュウリモザイクウイルス
のサテライトＲＮＡを植物に導入することによってウイ
ルス抵抗性植物を得たこと（Nature ３２８，７９９
（１９８５) ）、さらに、アンチセンスＲＮＡを利用し
たウイルス防除法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８
６, ６９４９（１９８９））が報告されている。イネに
おいては、本発明者などがイネ縞葉枯ウイルスのゲノム
ＲＮＡ３にコードされるイネ縞葉枯ウイルスの外被タン
パク質の遺伝子をイネに導入して、イネ縞葉枯ウイルス
耐性イネを作出することに成功している（平成３年日本
植物病理学会大会講演要旨集 ｐ１９３；Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA，８９（１９９２））。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】
【発明の構成】本発明は、次に述べるようにして達成す
ることができるがその要旨を越えない限り以下に限定さ
れない。なお、以下は本発明の一例としてイネについて
述べるが、本発明のイネ科植物としては、イネの他、ラ
イムギ、オオムギ、コムギ、カラスムギ／オートムギ、
エノコロ／アワ、ヒエ、メヒシバ、シバ、ススキ／カリ
ヤス、サトウキビ、トウモロコシ、ハトムギ等が挙げら
れる。 〔ウイルスおよびウイルスＲＮＡの抽出、精製〕例え
ば、イネ縞葉枯ウイルス分離株Ｔ（J.gen.Virol.７０，
５０５−５１１（１９８９））に感染したイネの葉をリ
ン酸緩衝液（１０ｍＭ ジエチルジチオカーバメイト、
０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム、ｐＨ７．２）の中
で粉砕後、１／５量のトリフルオロトリクロロエタンを
加え清澄化してから、２０％ショ糖クッションに重層し
１２３，０００×ｇで１．５時間遠心分離する。得られ
た沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
し、４，０００×ｇで１０分間遠心分離する。続いて上
清に３５％飽和となるように硫安を加え５分間攪はん
後、４，０００×ｇで５分間遠心分離する。上清を約４
倍に希釈後、最終濃度が８％となるようにポリエチレン
グリコールを加え１時間以上攪はんする。これを３０，
０００×ｇ、３０分で遠心分離した後、沈澱をショ糖密
度勾配遠心（１０−４０％、１００，０００×ｇ、２．
５時間）にかけることによりウイルス粒子を精製するこ
とができる。この方法により、ウイルス粒子は、Ｂ，
Ｍ，ｎＢ（上層から下層へ）の３成分に分離して得られ
る。本発明に用いたＲＮＡ４は、全成分に含まれる。
ることができるがその要旨を越えない限り以下に限定さ
れない。なお、以下は本発明の一例としてイネについて
述べるが、本発明のイネ科植物としては、イネの他、ラ
イムギ、オオムギ、コムギ、カラスムギ／オートムギ、
エノコロ／アワ、ヒエ、メヒシバ、シバ、ススキ／カリ
ヤス、サトウキビ、トウモロコシ、ハトムギ等が挙げら
れる。 〔ウイルスおよびウイルスＲＮＡの抽出、精製〕例え
ば、イネ縞葉枯ウイルス分離株Ｔ（J.gen.Virol.７０，
５０５−５１１（１９８９））に感染したイネの葉をリ
ン酸緩衝液（１０ｍＭ ジエチルジチオカーバメイト、
０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム、ｐＨ７．２）の中
で粉砕後、１／５量のトリフルオロトリクロロエタンを
加え清澄化してから、２０％ショ糖クッションに重層し
１２３，０００×ｇで１．５時間遠心分離する。得られ
た沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
し、４，０００×ｇで１０分間遠心分離する。続いて上
清に３５％飽和となるように硫安を加え５分間攪はん
後、４，０００×ｇで５分間遠心分離する。上清を約４
倍に希釈後、最終濃度が８％となるようにポリエチレン
グリコールを加え１時間以上攪はんする。これを３０，
０００×ｇ、３０分で遠心分離した後、沈澱をショ糖密
度勾配遠心（１０−４０％、１００，０００×ｇ、２．
５時間）にかけることによりウイルス粒子を精製するこ
とができる。この方法により、ウイルス粒子は、Ｂ，
Ｍ，ｎＢ（上層から下層へ）の３成分に分離して得られ
る。本発明に用いたＲＮＡ４は、全成分に含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】〔実施例３〕 ｃＤＮＡのシークエンスと
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質遺伝子の決定 上記で選んだＲＮＡ４由来のクローンを宝酒造製キロシ
ークエンス用デレーションキットを用いてクローンの欠
損変異株を作成した。１００から２００塩基程度の割合
で欠損を持つ変異株を選抜し、Sangerらの方法（ジデオ
キシ法；前述）で各変異株の塩基配列を決定した。ＲＮ
Ａ４は、２１５７塩基からなり、ウイルスＲＮＡの５’
端に１７８アミノ酸（配列表の配列番号１）、分子量２
０，５４１のタンパク質をコードする領域を有し、ウイ
ルスＲＮＡに相補的なＲＮＡの５’端に２８６アミノ
酸、分子量３２，４７４のタンパク質をコードする領域
があるアンチセンスＲＮＡであることがわかった（J.ge
n.Virol.７３，１３０９−１３１２（１９９２））。続
いて、コンピューター解析（GENETYX, Software Develo
pment Co.)により、ＲＮＡ４にコードされているタンパ
ク質の推定アミノ酸配列を求めた。一方、感染イネから
精製したイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質のアミ
ノ酸組成をＰＩＣＯ・ＴＡＧ法（Waters）によって分析
した。得られた結果をイネ縞葉枯ウイルスＲＮＡ４にコ
ードされている、イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク
質のコーティング領域と思われるものから推定したアミ
ノ酸組成と比較したところ、９８％の相同性が認められ
た。かくして、分子量約２０，０００のタンパク質が、
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質であり、かかる
領域がイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコード
する遺伝子であると決定した。その塩基配列を配列表の
配列番号２に示す。なお、本発明においては、イネにウ
イルス抵抗性を付与させることができる範囲で、一部の
アミノ酸または塩基を除去、置換あるいは追加する等の
改変を行ったものも、本発明に含まれる。
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質遺伝子の決定 上記で選んだＲＮＡ４由来のクローンを宝酒造製キロシ
ークエンス用デレーションキットを用いてクローンの欠
損変異株を作成した。１００から２００塩基程度の割合
で欠損を持つ変異株を選抜し、Sangerらの方法（ジデオ
キシ法；前述）で各変異株の塩基配列を決定した。ＲＮ
Ａ４は、２１５７塩基からなり、ウイルスＲＮＡの５’
端に１７８アミノ酸（配列表の配列番号１）、分子量２
０，５４１のタンパク質をコードする領域を有し、ウイ
ルスＲＮＡに相補的なＲＮＡの５’端に２８６アミノ
酸、分子量３２，４７４のタンパク質をコードする領域
があるアンチセンスＲＮＡであることがわかった（J.ge
n.Virol.７３，１３０９−１３１２（１９９２））。続
いて、コンピューター解析（GENETYX, Software Develo
pment Co.)により、ＲＮＡ４にコードされているタンパ
ク質の推定アミノ酸配列を求めた。一方、感染イネから
精製したイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質のアミ
ノ酸組成をＰＩＣＯ・ＴＡＧ法（Waters）によって分析
した。得られた結果をイネ縞葉枯ウイルスＲＮＡ４にコ
ードされている、イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク
質のコーティング領域と思われるものから推定したアミ
ノ酸組成と比較したところ、９８％の相同性が認められ
た。かくして、分子量約２０，０００のタンパク質が、
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質であり、かかる
領域がイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコード
する遺伝子であると決定した。その塩基配列を配列表の
配列番号２に示す。なお、本発明においては、イネにウ
イルス抵抗性を付与させることができる範囲で、一部の
アミノ酸または塩基を除去、置換あるいは追加する等の
改変を行ったものも、本発明に含まれる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】（２） 電気パルス処理 （１）で調整したプロトプラストを、ＥＰ３緩衝液（７
０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．４Ｍマニト
ール、０．１％ＭＥＳを含む緩衝液（ｐＨ５．８））に
４×１０6 個／mlとなるように懸濁した。この懸濁液
に、上記実施例４で得たプラスミドｐＬＡＮ１６０（６
０ｇ／ml）並びに選抜マーカーとしてハイグロマイシン
フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドｐＩＺＩ（６０μｇ／ml）を添加し、４℃で５分間冷
却した後、滅菌したプラスチックセルに移し、平行電極
を用い、直流の電気パルスを印加した。その際、８００
μＦのコンデンサーを用いて３００Ｖ／cmの初期電圧を
かけ、パルス幅は１０msecとした。パルス印加後４℃で
１０分間冷却した後、等量のＲ２／ＭＳプロトプラスト
アガロース培地（ Mol. Gen. Gent., ２０６，４０８
（１９８７））と混合し、０．７mmの厚さとなるように
固化させた。この時の細胞密度は約３×１０6 個／mlで
あった。
０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．４Ｍマニト
ール、０．１％ＭＥＳを含む緩衝液（ｐＨ５．８））に
４×１０6 個／mlとなるように懸濁した。この懸濁液
に、上記実施例４で得たプラスミドｐＬＡＮ１６０（６
０ｇ／ml）並びに選抜マーカーとしてハイグロマイシン
フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドｐＩＺＩ（６０μｇ／ml）を添加し、４℃で５分間冷
却した後、滅菌したプラスチックセルに移し、平行電極
を用い、直流の電気パルスを印加した。その際、８００
μＦのコンデンサーを用いて３００Ｖ／cmの初期電圧を
かけ、パルス幅は１０msecとした。パルス印加後４℃で
１０分間冷却した後、等量のＲ２／ＭＳプロトプラスト
アガロース培地（ Mol. Gen. Gent., ２０６，４０８
（１９８７））と混合し、０．７mmの厚さとなるように
固化させた。この時の細胞密度は約３×１０6 個／mlで
あった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】かかる供試個体をウンカの飼育箱に入れ、
その箱の中に、イネ１個体に対し１０頭になるようにイ
ネ縞葉枯ウイルスを保毒しているヒメトビウンカを入れ
感染させた。３−５日経過後、イネに付いている虫を払
い、さらにイネに残存している虫を殺虫剤で殺してか
ら、隔離温室に移して発病まで観察した。形質転換体と
コントロールとして用いた２種類のイネのイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率を比べた。イネ縞葉枯ウイルス感染特異
タンパク質を発現したイネの形質転換体のイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率は９％で、コントロールとして用いた２
種類のイネのイネ縞葉枯ウイルス病の発病率は共に８３
％であった。このことから、イネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質を発現した形質転換イネがイネ縞葉枯ウイ
ルスに対して抵抗性であることを確認した。 〔実施例７〕 イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
の次代への遺伝の確認 実施例６で示されたイネ縞葉枯ウイルスに抵抗性を示し
たイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現してい
る形質転換体の種子を採種し発芽させた。実施例５で示
されたと同じ方法を用いてウエスタン解析を行い、形質
転換に用いた遺伝子が次代へ伝えられ、発現しているか
を調査した。２系統の形質転換体について見たところ、
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現している
割合は、２２／２５（８８％）、２３／２７（８５％）
であり、該遺伝子は次代へ遺伝することが確認できた。
その箱の中に、イネ１個体に対し１０頭になるようにイ
ネ縞葉枯ウイルスを保毒しているヒメトビウンカを入れ
感染させた。３−５日経過後、イネに付いている虫を払
い、さらにイネに残存している虫を殺虫剤で殺してか
ら、隔離温室に移して発病まで観察した。形質転換体と
コントロールとして用いた２種類のイネのイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率を比べた。イネ縞葉枯ウイルス感染特異
タンパク質を発現したイネの形質転換体のイネ縞葉枯ウ
イルス病発病率は９％で、コントロールとして用いた２
種類のイネのイネ縞葉枯ウイルス病の発病率は共に８３
％であった。このことから、イネ縞葉枯ウイルス感染特
異タンパク質を発現した形質転換イネがイネ縞葉枯ウイ
ルスに対して抵抗性であることを確認した。 〔実施例７〕 イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
の次代への遺伝の確認 実施例６で示されたイネ縞葉枯ウイルスに抵抗性を示し
たイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現してい
る形質転換体の種子を採種し発芽させた。実施例５で示
されたと同じ方法を用いてウエスタン解析を行い、形質
転換に用いた遺伝子が次代へ伝えられ、発現しているか
を調査した。２系統の形質転換体について見たところ、
イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を発現している
割合は、２２／２５（８８％）、２３／２７（８５％）
であり、該遺伝子は次代へ遺伝することが確認できた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 早川 孝彦 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 株 式会社植物工学研究所内 (72)発明者 鳥山 重光 東京都文京区本郷５−１−10
Claims (7)
- 【請求項１】 イネ科植物で機能するプロモーターの下
流にイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質をコードす
る遺伝子及びターミネーターを導入してなることを特徴
とするベクター。 - 【請求項２】 イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１に記載のア
ミノ酸配列で表されるタンパク質をコードする遺伝子で
あることを特徴とする請求項１記載のベクター。 - 【請求項３】 イネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質
をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１に記載の塩
基配列で表されることを特徴とする請求項２記載のベク
ター。 - 【請求項４】 請求項１〜３に記載のベクターをイネ科
植物のプロトプラストに導入し、コロニーを形成させた
後該コロニーから植物体を再生させて得られたイネ科植
物。 - 【請求項５】 請求項１〜３に記載のベクター及びイネ
科植物由来のプロトプラストを液体媒体中に懸濁し、電
気パルスを印加して該ベクターを導入した後、イネ培養
細胞を含有する培地で培養しコロニーを形成させ、該コ
ロニーから植物体を再生させることを特徴とするイネ科
植物の製造方法。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列で表されるイネ縞葉枯ウイルス感染特異タンパク質を
コードするイネ縞葉枯ウイルスゲノムＲＮＡ４遺伝子。 - 【請求項７】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列で
表されるイネ縞葉枯ウイルスゲノムＲＮＡ４遺伝子。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3318211A JPH07313173A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | 形質転換されたイネ縞葉枯ウイルス抵抗性イネおよびその製造法 |
| TW081109349A TW290426B (ja) | 1991-12-02 | 1992-11-23 | |
| KR1019920022980A KR100255474B1 (ko) | 1991-12-02 | 1992-12-01 | 형질전환된 벼 고엽고 바이러스 저항성 벼 및 그 제조방법 |
| CN92115177A CN1044385C (zh) | 1991-12-02 | 1992-12-02 | 性状转变的抗稻属叶条纹病病毒性稻属及其制造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3318211A JPH07313173A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | 形質転換されたイネ縞葉枯ウイルス抵抗性イネおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07313173A true JPH07313173A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=18096673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3318211A Pending JPH07313173A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | 形質転換されたイネ縞葉枯ウイルス抵抗性イネおよびその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07313173A (ja) |
| KR (1) | KR100255474B1 (ja) |
| CN (1) | CN1044385C (ja) |
| TW (1) | TW290426B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100822742B1 (ko) * | 2007-03-19 | 2008-04-17 | 대한민국 | 애멸구 유래 재조합 그로이엘단백질 유전자 클론 및 이를이용한 벼줄무늬 잎마름병 바이러스의 면역포획역전사효소연쇄중합반응 검정방법 |
| KR101013092B1 (ko) * | 2009-03-25 | 2011-02-14 | 대한민국 | 벼 줄무늬잎마름병 저항성 형질전환 벼 및 이의 제조방법 |
| WO2011036894A1 (ja) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Ｒｎａ干渉によるテヌイウイルス属のウイルスに対して抵抗性植物を得るためのウイルス遺伝子 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101066011B1 (ko) | 2008-09-23 | 2011-09-20 | 경상대학교산학협력단 | 억새 성숙종자로부터 배발생 캘러스 유도 및 식물체 재분화방법 |
| CN109169280B (zh) * | 2018-09-20 | 2022-02-08 | 四川农业大学 | 薏苡再生植株的制备方法及所用培养基 |
-
1991
- 1991-12-02 JP JP3318211A patent/JPH07313173A/ja active Pending
-
1992
- 1992-11-23 TW TW081109349A patent/TW290426B/zh active
- 1992-12-01 KR KR1019920022980A patent/KR100255474B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-12-02 CN CN92115177A patent/CN1044385C/zh not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100822742B1 (ko) * | 2007-03-19 | 2008-04-17 | 대한민국 | 애멸구 유래 재조합 그로이엘단백질 유전자 클론 및 이를이용한 벼줄무늬 잎마름병 바이러스의 면역포획역전사효소연쇄중합반응 검정방법 |
| KR101013092B1 (ko) * | 2009-03-25 | 2011-02-14 | 대한민국 | 벼 줄무늬잎마름병 저항성 형질전환 벼 및 이의 제조방법 |
| WO2011036894A1 (ja) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Ｒｎａ干渉によるテヌイウイルス属のウイルスに対して抵抗性植物を得るためのウイルス遺伝子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1044385C (zh) | 1999-07-28 |
| TW290426B (ja) | 1996-11-11 |
| KR100255474B1 (ko) | 2000-05-01 |
| KR930013120A (ko) | 1993-07-21 |
| CN1075335A (zh) | 1993-08-18 |
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