JPH07274752A - 病害抵抗性イネ科植物およびその作出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】イネ紋枯病、イネ白葉枯病等の病害に対して抵
抗性を示すイネ科植物を作出する。 【構成】 イネ科植物で機能するプロモーター、β−
１，３−エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列お
よびターミネーターを有するベクターと、イネ科植物由
来のプロトプラストとを液体媒体に懸濁し、該ベクター
を該プロトプラストに導入した後、イネ科植物培養細胞
を含有する培地で培養してコロニーを形成させ、該コロ
ニーから植物体を再生させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、農業生産上重要な各種
病害に対し抵抗性を示すイネ科植物、およびその作出方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】各種
病原微生物により引き起こされる農作物の病害は、作物
栽培において減収の主要な要因となっている。そこでこ
のような病害の発生を防除するために、現在、耕種的
な防除、抵抗性品種の育成、薬剤による防除等が行
われている。この中でも抵抗性品種の育成が、コスト
的に、また環境への影響を考慮した場合、農家にとって
最も有利な方法である。

【０００３】日本において基幹作物であるイネでは、イ
ネイモチ病、イネ縞葉枯病、イネ紋枯病、イネ白葉枯病
等の病害が古くから大きな被害を与えてきた。そこでこ
れらの病害防除のために多くの抵抗性品種が作出され、
農業生産に貢献してきた。しかし、イネ紋枯病は、その
発生面積はいもち病に次いで大きいにもかかわらず、抵
抗性を示す品種は外国稲をも含めた広範なスクリーニン
グでも見いだされておらず（堀ら，近畿中国農研，６
２，３−９（１９８１））、抵抗性品種の育成には成功
していない（大畑，稲の病害，ｐｐ５６５，全農協（東
京）（１９８９））。

【０００４】一方、近年の分子生物学的な手法の発展に
より、植物と病原微生物の相互関係が明らかにされつつ
ある。各種病原微生物の感染に対して、植物は物理的・
生化学的変化を含む様々な防御反応を起こす。例えば生
化学的防御反応の一例として、細菌や糸状菌等の病原微
生物に対して抗菌活性を有するファイトアレキシンの合
成・蓄積が挙げられる。また、ＰＲタンパク質は病原の
感染や細胞壊死に関して特異的に誘導されるタンパク質
群であるが、それらの中には既にクローニングされ詳細
な役割が検討されているものもある（Ｗａｒｄ ｅｔ
ａｌ，ＴｈｅＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３，１０８５−１
０９４（１９９１）；Ｌｉｎｔｈｏｒｓｔ，Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，１０，１２３−１５０
（１９９１））。しかし、分子生物学的手法を応用して
各種病害に対して抵抗性を示すイネはいまだに作出され
ていないのが現状であった。

【０００５】ところで、β−１，３−エンドグルカナー
ゼ（以下、「β−１，３−ＥＧ」と略記する）は、植物
の防御反応の引き金物質（エリシター）を遊離させ、病
害菌抵抗性を発揮させる植物に内在する酵素である。例
えばダイズ由来のβ−１，３−ＥＧは、ダイズの疫病菌
に対する抵抗性反応の初期段階に関与しており（Ｙｏｓ
ｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，７３，４９７（１９８３））、疫病菌の細胞壁か
ら糖鎖を切り出す役割を有している。疫病菌から切り出
された糖鎖はエリシターとしての活性を有しており、宿
主の抵抗性反応を誘導することが知られている。

【０００６】また、β−１，３−ＥＧ自身はin vitroで
の抗菌活性はない（Ｍａｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８８，９３６（１９８８））も
のの、最近、このβ−１，３−ＥＧ遺伝子を導入したタ
バコは赤星病（病原：Phytophtora parasitica var. ni
cotianae）、疫病（病原：Alternaria alternata tobac
co pathotype）に対して抵抗性を示し、抵抗性の誘導さ
れた形質転換タバコでは、植物の抵抗性反応で重要な役
割をしているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ph
enylalanine ammonia-lyase:PAL）の誘導が高まってい
ることが報告されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ
ａｌ，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，８
０，４１７−４２０（１９９３））。

【０００７】しかし、β−１，３−ＥＧが一般的に植物
の防護反応に関わっているか否かは明らかではなく、β
−１，３−ＥＧ遺伝子をイネ科植物に導入して病害抵抗
性を付与するという試みも知られていない。

【０００８】本発明はかかる観点からなされたものであ
り、病害に対して抵抗性を示すイネ科植物を作出するこ
とを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を行い、β−１，３−ＥＧがイ
ネ科植物の抵抗性反応を増強する作用があると考え、β
−１，３−ＥＧ遺伝子をイネ科植物に導入することによ
り、病害に対して抵抗性を示すイネ科植物を作出するこ
とに初めて成功し、本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち本発明の要旨は、β−１，３−エ
ンドグルカナーゼ遺伝子を導入して形質転換された、病
害抵抗性イネ科植物に存する。さらに本発明は、イネ科
植物で機能するプロモーター、β−１，３−エンドグル
カナーゼをコードするＤＮＡ配列およびターミネーター
を有するベクターと、イネ科植物由来のプロトプラスト
とを液体媒体に懸濁し、該ベクターを該プロトプラスト
に導入した後、イネ科植物培養細胞を含有する培地で培
養してコロニーを形成させ、該コロニーから植物体を再
生させることを特徴とする、病害抵抗性イネ科植物の作
出方法を提供する。

【００１１】尚、本発明において、β−１，３−ＥＧ遺
伝子とは、β−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列、
あるいはこれにプロモーター及びターミネーター及び／
又はイントロンを含むＤＮＡ配列をいう。

【００１２】以下、本発明につき詳細に説明する。

【００１３】＜１＞本発明の病害抵抗性イネ科植物及び
その作出方法 本発明の病害抵抗性イネ科植物は、β−１，３−エンド
グルカナーゼ遺伝子を導入して形質転換することにより
得られる。本発明を適用することができる植物はイネ科
植物であり、イネ科に属するものであれば特に制限はさ
れない。具体的には、イネ、ムギ（コムギ、オオムギ、
ライムギ等）、ヒエ、アワ、シバ、トウモロコシ等が挙
げられ、本発明においては特にイネが好ましい。

【００１４】一方、本発明において用いられるβ−１，
３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列としては、例えばダイ
ズ由来のβ−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列が利
用できる（特開平１−２５２２９２号公報、Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６７３−６８２（１９９
０））。β−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列は、
大豆等の植物細胞から染色体遺伝子を単離してもよい
が、β−１，３−ＥＧをコードするｃＤＮＡのクローニ
ングによっても得られる。以下に、β−１，３−ＥＧを
コードするＤＮＡ配列の取得法及びこのＤＮＡ配列をイ
ネ科植物に導入して形質転換する方法を説明する。

【００１５】（１）β−１，３−ＥＧをコードするＤＮ
Ａ配列の取得 ｃＤＮＡクローニングは常法により行えばよいが、β−
１，３−ＥＧに対する抗体が得られている場合には、ク
ローニング断片を宿主内で発現させることができるベク
ターを用いると、抗体によるスクリーニングが可能とな
る。また、β−１，３−ＥＧのアミノ酸配列をもとにオ
リゴヌクレオチドプローブを作製し、ハイブリダイゼー
ションによりβ−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列
を有するクローンを選択することもできる。

【００１６】例えば、ダイズ由来のβ−１，３−ＥＧを
コードするＤＮＡ配列は、上記文献に記載の方法に従っ
て得ることができる。すなわち、まずダイズ種子（例え
ばHarosoy 63）を発芽させ、４〜５日目の幼植物をエチ
レンで処理して、β−１，３−ＥＧの誘導を行う。その
後子葉よりＲＮＡをフェノール法で抽出し、ｏｌｉｇｏ
−ｄＴセルロース・カラムによりｐｏｌｙＡ⁺ ＲＮＡ分
画を得る。このｐｏｌｙＡ⁺ ＲＮＡを基に、改良Ｇｕｂ
ｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法（Ｇｅｎｅ，２５，２６３
（１９８３））により二本鎖のｃＤＮＡを合成し、得ら
れたｃＤＮＡの末端を平滑化した後、ＥｃｏＲＩサイト
をメチル化し、さらに平滑化した末端にＥｃｏＲＩリン
カーを付けて、ラムダファージベクター、例えばλｇｔ
１１のＥｃｏＲＩサイトに挿入する。λｇｔ１１は、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターがクローニン
グサイトに隣接しているので、同プロモーターの制御に
よりｃＤＮＡを発現させることができる。

【００１７】こうして得られる組換えファージＤＮＡの
ファージ粒子へのパッケージングを行った後、ファージ
粒子を大腸菌Ｙ１０８８株に導入してｃＤＮＡライブラ
リーを作製する。ライブラリーから目的のクローン、す
なわちβ−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列を保持
するクローンを選択するには、クローンが保持するファ
ージＤＮＡ中の挿入ＤＮＡ断片を発現させ、ウサギ等を
用いて作製した抗β−１，３−ＥＧ抗体を用いた免疫反
応によりβ−１，３−ＥＧを発現していることを確認す
ればよい。

【００１８】こうして選択されたクローンからファージ
ＤＮＡを調製し、挿入断片を回収することによって、β
−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列が得られる。ま
た、β−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列は、β−
１，３−ＥＧ遺伝子の両末端に相補的なＤＮＡ配列を有
するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーと
したＰＣＲにより、大豆染色体ＤＮＡからβ−１，３−
ＥＧ遺伝子を増幅することによっても得られる。

【００１９】（２）発現ベクターの構築 次に、β−１，３−ＥＧ遺伝子をイネ科植物へ導入する
に当たって、β−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列
と、イネ科植物中で発現するプロモーターと、必要に応
じてターミネーターをベクターに導入して、β−１，３
−ＥＧ遺伝子発現ベクターを構築する。このとき、β−
１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列の転写方向の５’
側から、プロモーター、β−１，３−ＥＧをコードする
ＤＮＡ配列、ターミネーターの順となるようにベクター
に導入されるように設計される。

【００２０】プロモーターとしては、β−１，３−ＥＧ
をコードするＤＮＡ配列をイネ科植物体で十分量発現さ
せるために、イネ科植物に特異的なプロモーターを用い
ることが好ましい。このようなプロモーターとして、イ
ネ科植物の細胞内で効率よく発現するものであれば特に
制限されないが、現在、イネでの発現が確認されている
プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３
５Ｓプロモーター（Ｔｅｒａｄａ ａｎｄ Ｓｈｉｍａ
ｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２０，３
８９−３９２（１９９０））、イネＷｘプロモーター
（Ｈｉｒａｎｏａｎｄ Ｓａｎｏ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３２，９８９−９９７（１９９
１））、トウモロコシＡｄｈ１プロモーター（Ｋｙｏｚ
ｕｋａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２８，４０
−４８（１９９１））、イネＲｂｃＳプロモーター（Ｋ
ｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，１０２，９９１−１０００（１９９３））等が知
られており、本発明に好適に使用することができる。

【００２１】ターミネーターは、効率よく遺伝子の転写
を終結させ、またＲＮＡを安定させるために用いられ
る。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子ＮＯＳのター
ミネーター（ｐＢＩ２２１；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０７（１９８７）ある
いはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（１９Ｓ）Ｒ
ＮＡターミネーター（ｐＧＬ２；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６
（１９８９））等が挙げられる。

【００２２】また、遺伝子の発現効率を上げるため、あ
るいは転写されたｍＲＮＡの安定性を上げるために、イ
ネ科植物で機能するイントロンをβ−１，３−ＥＧ遺伝
子に導入することも効果的である。イントロンが遺伝子
の発現に及ぼす影響については、例えばトウモロコシＡ
ｄｈ１のイントロン１がトウモロコシで有効（Ｃａｌｌ
ｉｓ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１，１１
８３−１２００（１９８７））であるだけでなく、イネ
でも効果的であること（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔａｌ，Ｍ
ａｙｄｉｃａ，３５，３５３−３５７（１９９０））
や、ヒマのカタラーゼの第１イントロンがイネで有効に
働くこと（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．，１８，６７６７−６７７０（１９９
０））などの報告がある。かかるイントロンは、プロモ
ーターとβ−１，３−ＥＧをコードするＤＮＡ配列との
間に導入されることが望ましい。

【００２３】本発明に用いられるベクターとしては、ｐ
ＵＣ１９等のｐＵＣ系列（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１
９８５））のプラスミド等が好適に用いられる。

【００２４】本発明においては、さらに、発現ベクター
を保持する細胞を有効に選択することができるように、
ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝
子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝
子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子、β−グルキュロニダーゼ遺伝子等から選ばれ
る、いわゆる選択マーカー遺伝子を用いることが好まし
い。これらの遺伝子の内では、ハイグロマイシンフォス
フォトランスフェラーゼ遺伝子が好ましい。選択マーカ
ー遺伝子は、β−１，３−ＥＧ遺伝子と同一のベクター
中に有するものを使用してもよいし、β−１，３−ＥＧ
遺伝子を有するベクターと別に、選択マーカー遺伝子を
有するベクターとを併用してもよい。このような選択マ
ーカー遺伝子を有するベクターとしては、ハイグロマイ
シンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子発現ベクター
（ｐＧＬ２；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３３８，２７４−２７６（１９８９）等が知ら
れている。

【００２５】（３）β−１，３−ＥＧ遺伝子発現ベクタ
ーのイネ科植物細胞への導入 次に、β−１，３−ＥＧ遺伝子発現ベクターをイネ科植
物に導入する。これは、通常、β−１，３−ＥＧ遺伝子
発現ベクターとイネ科植物由来のプロトプラストとを液
体媒体に懸濁し、例えば、電気パルスを印加する方法
や、ポリエチレングリコールを用いる方法により行われ
る。

【００２６】イネ科植物由来のプロトプラストは、次の
様にして調製することができる。例えば、ササニシキ、
キヌヒカリ、日本晴等のイネ栽培種の完熟及び未熟種
子、葉鞘、根の組織に由来するサスペンション細胞ある
いはカルスを、通常使用され得る液体培地で培養した
後、常法に従い、例えばセルラーゼやマセロザイム等の
細胞壁分解酵素を含む酵素液中で、２５〜３０℃、３〜
１６時間程度酵素処理する。酵素処理終了後濾過して未
消化物を除き、濾液に２〜５倍量のＫＭＣ液（塩化カリ
ウム０．１１８Ｍ、塩化マグネシウム０．０８１７Ｍ、
塩化カルシウム０．０８５Ｍ、ｐＨ６．０）（Ｈａｒｍ
ｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，５３，５７−６３（１９７８））等を加え遠心分
離し、精製されたプロトプラストを得ることができる。

【００２７】次に、このようにして得られるイネ栽培種
（ササニシキ、キヌヒカリ、日本晴等）由来のプロトプ
ラスト、例えば、（２〜１０）×１０⁶個／ｍＬと、β
−１，３−ＥＧ遺伝子を有する発現用ベクター、例えば
１〜１００μｇ／ｍＬと、ハイグロマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼ遺伝子等の選択マーカー遺伝子発現
用ベクター（ｐＧＬ２；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａ
ｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６（１９８
９）、例えば１〜１００μｇ／ｍＬを、３０〜２００ｍ
Ｍ塩化カリウム、０〜５０ｍＭ塩化マグネシウム、０．
２〜０．６Ｍマニトールを含む緩衝液等の液体媒体中に
懸濁し、これに電気パルスを印加する方法やポリエチレ
ングリコールを用いる方法により、各々の発現用ベクタ
ーをプロトプラスト中に導入する。

【００２８】または、β−１，３−ＥＧ遺伝子とハイグ
ロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子等の選
択マーカー遺伝子を両方発現するように構築されたベク
ター１種類のみ、例えば１〜１００μｇ／ｍＬと、イネ
栽培種（ササニシキ、キヌヒカリ、日本晴等）由来のプ
ロトプラスト、例えば（２〜１０）×１０⁶個／ｍＬ
を、３０〜２００ｍＭ塩化カリウム、０〜５０ｍＭ塩化
マグネシウム、０．２〜０．６Ｍマニトールを含む緩衝
液等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印加す
る方法やポリエチレングリコールを用いる方法により、
前記ベクターをプロトプラスト中に導入してもよい。

【００２９】電気パルスの印加は、１００〜１０００μ
Ｆのコンデンサーを用いて得られる２００〜１０００Ｖ
／ｃｍの初期電圧の直流パルスで、パルス幅１〜３０ｍ
ｓｅｃ程度の条件で行うのが好適である（特開平１−１
８１７９１号公報参照）。

【００３０】ポリエチレングリコールを用いる方法は、
例えば、Mol. Gen. Genet., 204, 204-207 (1986)に記
載の方法により行うことができる。

【００３１】（４）プロトプラストの再生 上記のようにして、β−１，３−ＥＧ遺伝子発現ベクタ
ー、あるいはβ−１，３−ＥＧ遺伝子発現ベクターと選
択マーカー発現ベクターとを、イネ科植物由来のプロト
プラストに導入した後、イネ科植物培養細胞（ナース細
胞）を含有する培地で培養してコロニーを形成させ、該
コロニーから植物体を再生させる。

【００３２】例えば、Ｒ２培地（Ｏｈｉｒａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１
４，１１１３（１９７３））の無機成分とＢ５培地（Ｇ
ａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ．，５０，１５１−１５（１９６８））のビタミン混
合液を含む液体培地（Ｒ２／Ｂ５）、またはＲ２培地の
無機成分とＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ
ｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，１５，４７３
−４９７（１９６２））のビタミン混合液を含む液体培
地（Ｒ２／ＭＳ）あるいはＭＳ培地等に、いずれも好ま
しくは窒素源として硝酸カリウムを０．２〜０．５％を
配合し、これに電気パルス処理により遺伝子発現用ベク
ターを導入したプロトプラストを懸濁し、このプロトプ
ラスト懸濁液に１．０〜３．０％程度のアガロースを含
むＲ２／Ｂ５培地またはＲ２／ＭＳあるいはＭＳ培地等
と等量ずつ混ぜ、速やかにシャーレ中に広げてうすく固
める。この時のプロトプラストの密度は約（５〜５０）
×１０⁵個／ｍＬとなるようにし、またアガロースの厚
さは平均０．７ｍｍ程度となるようにするのがよい。

【００３３】固化したアガロースゲルを５〜２０ｍｍ程
度の大きさに切り、上記液体培地中で培養する。その
際、イネのプロトプラストを使用した場合には、好まし
くは培地中にナース細胞としてイネ培養細胞を１００〜
３００ｍｇＦＷ（Fresh Weight）／シャーレ程度共存さ
せ、回転数２０〜５０ｒ．ｐ．ｍ．でゆっくり振とうし
ながら、暗条件下２７〜３３℃で培養する。

【００３４】プロトプラストをイネ科植物培養細胞と共
存させる方法は、上記の方法のほかに、底にメンブレン
フィルターを設けた容器内にプロトプラストを含む液体
培地を入れ、その容器をイネ科植物培養細胞と共に液体
培地を入れたシャーレに浸して共存させる方法がある。
ここに示すイネ科植物培養細胞は、旺盛に分裂している
細かい細胞塊から成るものが好ましい。このような培養
細胞を得るには、たとえばイネ科植物の種子、茎、根あ
るいは葯より得られたカルスを液体培地中に継代して分
裂速度の早い細胞を繰り返して選抜する等の公知の方法
に準じて容易に得られる。

【００３５】尚、プロトプラストと共存させるイネ科植
物の培養細胞は、プロトプラストと同一のイネ科植物に
由来する培養細胞を用いるのが好ましい。例えば、ベク
ターの導入にイネのプロトプラストを用いた場合には、
これをイネ培養細胞を含有する培地で培養してコロニー
を形成させる。

【００３６】培養後３〜４週間で、０．５〜１ｍｍφ程
度のコロニーが形成される。その際、例えば選択マーカ
ー遺伝子としてハイグロマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子を導入しておいた場合には、培養開始後７〜
２０日にハイグロマイシンを１０〜５０μｇ／ｍＬ程度
培養液中に添加し、更に培養を続けることで形質転換細
胞の一次選択を効率よく行うことができる。その他のマ
ーカー遺伝子を使用した場合には、マーカーに応じた薬
剤等を培地に適宜添加する。

【００３７】次いでこのコロニーを増殖培地、例えばＮ
６基本培地（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，
１６，６５９−６８８（１９７５））またはＲ２培地に
植物ホルモン、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）を２ｍｇ／Ｌ程度、アガロースを０．１
〜１．０％加えた寒天培地上で２〜４週間、照明下（１
０００〜４０００ｌｕｘ）、２７〜３３℃で培養し、３
〜６ｍｍφのカルスを得る。

【００３８】得られたカルスから、目的遺伝子（β−
１，３−ＥＧ遺伝子）が取り込まれた形質転換カルスを
二次選択することが好ましい。この二次選択は、カルス
の一部からゲノムＤＮＡを、例えばＷａｌｂｏｔ ａｎ
ｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２
１１，２７−３４（１９８８）に準じて単離し、このゲ
ノムＤＮＡ約１００ｎｇを以下に述べるＰＣＲ法に供
し、β−１，３−ＥＧ遺伝子の存在を確認する方法が挙
げられる。また、β−１，３−ＥＧ遺伝子の存在は、サ
ザン法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０５（１９
８０））によっても確認することができる。

【００３９】ＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２３９，４８７−４９１（１９８８））は、鋳型ＤＮＡ
の熱変性、鋳型ＤＮＡの標的領域の末端配列に相補的な
配列を有するプライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング
及び耐熱性ポリメラーゼによる伸長方法からなる工程を
繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡの標的領域を増幅する
方法である。本発明においては、形質転換カルスから得
られたゲノムＤＮＡを９４℃、１分程度で熱変性して＋
鎖と−鎖の１本鎖に解離し、これを、導入されたβ−
１，３−ＥＧ遺伝子の一部に相補的なプライマー、例え
ばプロモーター領域とβ−１，３−ＥＧコーディング領
域に相補的なプライマーとアニーリングした後、耐熱性
ポリメラーゼにより相補鎖ＤＮＡを合成（７２℃、３分
程度）するという工程を２０〜３０回繰り返して該相補
鎖ＤＮＡを増幅する。適当な大きさの増幅産物が得られ
れば、β−１，３−ＥＧ遺伝子が細胞内に取り込まれて
いることが確認できる。

【００４０】さらに、個々のカルスを単独に分離し、例
えば選択マーカー遺伝子としてハイグロマイシンフォス
フォトランスフェラーゼ遺伝子を導入した場合には、ハ
イグロマイシン２０〜５０μｇ／ｍＬを含む前記増殖培
地に置床して培養し、ハイグロマイシン耐性を確認す
る。このカルスを、例えば０．５〜１．５％アガロース
を含むＲ２／ＭＳ培地（但しホルモンフリーあるいはサ
イトカイニンを１〜１０ｍｇ／Ｌ添加）で２７〜３３
℃、２０００−４０００ｌｕｘの条件下で培養すれば、
２〜１０週間で不定胚または不定芽の形成が認められ
る。

【００４１】この不定胚または不定芽を、２〜３週間ホ
ルモンを含まないＲ２／ＭＳ培地等で培養することによ
り、移植可能な幼植物体が得られる。こうして得られた
幼植物体は、バーミュキュライト等に移植して成長させ
ると、目的とする遺伝子発現ベクターで形質転換された
イネの植物体を得ることができる。 （５）病害抵抗性イネ科植物の選択及び病害抵抗性の試
験 形質転換植物にβ−１，３−ＥＧ遺伝子が組み込まれて
いることは、植物体からＤＮＡを、例えばＷａｌｂｏｔ
らの方法（Ｗａｌｂｏｔ ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，２７−３４，（１
９８８））に準じた方法で単離し、ＰＣＲ法（Ａｍ．
Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３７，１７２（１９８
５））もしくはサザン法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９
８，５０５（１９８０））により確認できる。

【００４２】また、形質転換植物がゲノムに組み込まれ
たβ−１，３−ＥＧ遺伝子を発現している事は、例え
ば、β−１，３−ＥＧ遺伝子あるいはその一部をプロー
ブとして用いるノザン法（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５２０１−
５２０５（１９８０））によりβ−１，３−ＥＧ遺伝子
転写産物を確認する方法、あるいはβ−１，３−ＥＧに
対する抗血清を用いたウエスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４（１９７９））によ
りβ−１，３−ＥＧ遺伝子産物を確認する方法等により
明らかにできる。

【００４３】得られた形質転換体は、各種病原に対する
抵抗性試験に供試される。病原としては対象とする植物
に応じて異なることもあるが、例えばイネの場合、イネ
イモチ病、イネ縞葉枯病、イネ紋枯病、イネ白葉枯病等
が代表的な病害として挙げられ、特にイネ紋枯病および
イネ白葉枯病に対する効果が顕著である。かかる抵抗性
検定試験には再生当代の個体（Ｒ₀ 世代）を用いてもよ
いし、自殖次世代の個体群（Ｒ₁ 世代）を用いてもよ
い。

【００４４】接種用のイネ紋枯病菌の菌糸懸濁液は、常
法によりイネ紋枯病菌を３〜５日間ＹＧ液体培地（水１
Ｌに対しグルコース２０ｇ、酵母エキス３ｇ）で振盪培
養し得られる。紋枯病に対する抵抗性は、かかる紋枯病
菌菌糸懸濁液を植物体に接種することにより容易に判定
できる。例えば、常法により栽培したイネの３〜５葉期
苗に、例えばＴｗｅｅｎ２０等の展着剤を０．１〜１．
０％加えたイネ紋枯病菌の菌糸懸濁液を噴霧接種する。
または、常法により栽培したイネ、好ましくは移植後約
４週間以降の茎数が３本以上のイネに、紋枯病菌菌糸懸
濁液を充分しみこませたウレタンディスク（径３０ｍｍ
×厚さ１５ｍｍ）を、イネの茎をはさむように固定させ
接種する。接種後２〜５日間程度湿室（湿度ほぼ１００
％）中におき、以降温室にて栽培する。抵抗性は各個体
の菌糸の伸長程度または接種後の病斑の伸長程度により
検定できる。

【００４５】白葉枯病に対する抵抗性の検定は、常法の
針接種または剪葉接種により行われる。２日間ポテトシ
ュークロース寒天培地（ＰＳＡ培地：ジャガイモ２００
ｇ、ショ糖２０ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１リットル）で
培養した白葉枯病菌の懸濁液を、針につけ葉面を刺すこ
とにより（針接種）、またはハサミにつけ葉先を切るこ
とで（剪葉接種）、白葉枯病菌の接種が可能である。接
種後３〜４週間で白葉枯病に特異的な病斑が形成される
ので、その病斑長を比較することにより抵抗性の強弱を
判定できる

【００４６】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り本例
に制約されるものではない。

【００４７】

【実施例１】 β−１，３−ＥＧ遺伝子発現用ベクター
の構築 β−１，３−ＥＧ遺伝子発現用ベクターの構築を、図１
に基づいて説明する。プロモーター、イントロン及びタ
ーミネーターを有するベクターとして、カリフラワーモ
ザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ヒマのカタラ
ーゼ第１イントロン、アグロバクテリウムのノパリンシ
ンターゼ遺伝子由来のターミネーターを有するプラスミ
ドｐＩＺＩを用いた。ｐＩＺＩは、カリフラワーモザイ
クウイルス３５Ｓプロモーターとヒマのカタラーゼ第１
イントロンを含む高発現ベクターｐＩＧ２２１（Ｔａｎ
ａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，１８，６７６７−６７７０（１９９
０））のβ−グルキュロニダーゼのコーディング領域を
ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼのコー
ディング領域と交換し、イントロン上流のＡＴＧを欠失
させたイネ高発現用ハイグロマイシン耐性ベクターであ
る。

【００４８】このｐＩＺIをＢａｍＨIで切断し、酵素Ｔ
４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを利用したＤＮＡ
Ｂｌａｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造製）を用いて末端を
平滑化した後、ＳａｃIで消化して得られた大断片と、
これとは別にｐＥＧ４８８（β−１，３−ＥＧをコード
するＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社）上に含むプラスミド（特開平１−２５
２２９２号公報：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９
３，６７３−６８２（１９９０）））をＨｉｎＣＩＩ及
びＳａｃIで切断して得られたβ−１，３−ＥＧをコー
ドするＤＮＡを含む断片とを、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）を用いて連結し、環状化させることに
より、β−１，３−ＥＧ遺伝子発現用プラスミドｐＧｌ
ｕを構築した。

【００４９】得られた組換えプラスミドで大腸菌ＤＨ５
αを形質転換し、アンピシリン耐性を指標として形質転
換株を選抜し、その細胞からｐＧｌｕを回収した。こう
して得られるｐＧｌｕは、カリフラワーモザイクウイル
ス３５Ｓプロモーターとヒマのカタラーゼ第１イントロ
ンの下流にβ−１，３−ＥＧ及びアグロバクテリウムの
ノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネーターを有す
るものである。

【００５０】

【実施例２】 病害抵抗性イネ科植物の作出 実施例１で得られたβ−１，３−ＥＧ遺伝子発現用ベク
ターを用いてイネの形質転換を行い、病害抵抗性イネ科
植物を作出した。

【００５１】（１）イネプロトプラストの単離 本発明に使用したイネ植物由来のプロトプラストは、栽
培イネ（品種：ササニシキ）の完熟種子に由来するもの
で、以下のようにして得た。完熟種子のサスペンション
細胞をＲ２培地で培養した後、４％セルラーゼＲＳ、１
％マセロザイムＲ１０、０．４Ｍマニトールを含む酵素
液（ｐＨ５．６）で３〜４時間３０℃で処理した。酵素
処理液を濾過した後、濾液に４倍量のＫＭＣ液（塩化カ
リウム０．１１８Ｍ、塩化マグネシウム０．０８１７
Ｍ、塩化カルシウム０．０８５Ｍ、ｐＨ６．０）を加
え、遠心分離して沈降したプロトプラストを集め、さら
にＫＭＣ液で２回洗浄した。

【００５２】（２） 電気パルスによるβ−１，３−Ｅ
Ｇ遺伝子発現用ベクターのプロトプラストへの導入 （１）で調製したプロトプラストを、ＥＰ３緩衝液（７
０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．４Ｍマニト
ール、０．１％ＭＥＳを含む緩衝液（ｐＨ５．８））に
４×１０⁶／ｍＬとなるように懸濁した。この懸濁液
に、上記実施例１で得たプラスミドｐＧｌｕ（６０μｇ
／ｍＬ）並びに選択マーカーとしてハイグロマイシンフ
ォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミド
ｐＧＬ２（Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２７４−２７６（１
９８９））（６０μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で５分間
冷却した後、滅菌したプラスチックセルに移し、並行電
極を用い、直流の電気パルスを印加した。その際、８０
μＦのコンデンサーを用いて３００Ｖ／ｃｍの初期電圧
をかけ、パルス幅は１０ｍｓｅｃとした。パルス印加後
４℃で１０分間冷却した後、等量のＲ２／ＭＳプロトプ
ラストアガロース培地（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ，
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０６，４０８−４１
３（１９８７））と混合し、プレートに広げて０．７ｍ
ｍの厚さとなるように固化させた。この時の細胞密度は
約３×１０⁶個／ｍＬであった。

【００５３】（３） プロトプラストの培養 電気パルスにより遺伝子発現用ベクターを導入したプロ
トプラストを含むアガロースを１０ｍｍ×１０ｍｍ大の
大きさに切断し、Ｒ２液体プロトプラスト培地５ｍＬを
入れた６ｃｍφのプレートに入れ、更に約１００ｍｇ
（ＦＷ）のイネ培養細胞をナース細胞として入れた。プ
ロトプラストの培養は約２５℃で約１０日間、５０ｒ．
ｐ．ｍの回転数でゆっくり振とうしながら、暗条件下で
培養した。

【００５４】このナ−ス細胞として用いたイネ培養細胞
は次のようにして調製した。実生のイネ（Ｏｃ ｌｉｎ
ｅ）の根に由来するカルスを液体培地中で週１回植継
ぎ、作製した懸濁培養細胞中に存在する分裂旺盛な細か
い細胞（１ｍｍφ）を用いた。

【００５５】１０日間培養後、ナース細胞をＫＭＣ液を
用いて取り除いた。さらに培養２〜４日後に２０μｇ／
ｍＬとなるようにハイグロマイシンＢを培地に加え、２
〜３週間培養した。

【００５６】次いでこのアガロース片をＲ２ソフトアガ
ー培地（２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２．４−
Ｄ）２ｍｇ／Ｌ、６％ショ糖、０．２５％アガロース）
に置いて培養し、２〜４週間後さらに大きくなったコロ
ニーを個々に分けて、Ｒ２ソフトアガー培地に移した。

【００５７】このカルスをＲ２再生培地（３％ソルビト
ール、２％ショ糖、１％アガロース（ｐＨ５．８））に
移し、２５℃，２０００−４０００ｌｕｘの条件下で３
〜１０週間培養すると、芽及び根が現れた。芽が２ｃｍ
程度に成長したところで、Ｒ２再生培地を入れたプラス
チックボックスに移し、幼植物へと成長させた。さらに
バーミュキュライトポットに移植して成育させたとこ
ろ、成熟した完全な形質転換イネ植物体が得られた。

【００５８】（４） 形質転換イネ植物体のβ−１，３
−ＥＧ発現の確認 再生した形質転換イネ植物体の葉からＳＤＳ可溶性タン
パク質を抽出し、ウエスタン法（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７６，４３５０（１９７９））によりβ−１，３−
ＥＧタンパク質の検出を試みた。

【００５９】イネの葉を約２×０．５ｃｍの大きさに切
り、乳鉢中で２×Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆ．（２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、８ｍ
ＭＤＴＴ、２０％ グリセロール、０．００４％ ＢＰ
Ｂ、２００μＭ ロイペプチン）１００μＬで抽出後、
遠心（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を
サンプルとして、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリア
クリルアミドゲル電気泳動）にかけた。泳動後のゲルを
Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎメンプラン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ
社）に密着させ、Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆ．（２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％
ＭｅＯＨ）に入れ、２００ｍＡ、３５Ｖ、１時間の条件
で通電することによりゲルからメンブランにタンパク質
を転写した。

【００６０】メンブラン上のβ−１，３−ＥＧタンパク
質の検出は、１次抗体としてウサギをβ−１，３−ＥＧ
で免疫して得られたβ−１，３−ＥＧタンパク質に対す
る抗血清から精製されたイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）
を、２次抗体としてウサギＩｇＧに対するアルカリフォ
スファターゼを結合したヤギＩｇＧ（ＪＡＣＫＳＯＮ
社）を用い、これらを含む溶液及びアルカリフォスファ
ターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＴ
Ｔ）及びブロモクロロインドールフォスフェート（ＢＣ
ＩＰ）を含む溶液にメンブランを順次浸漬し、基質を発
色させることによって行った。

【００６１】その結果、β−１，３−ＥＧタンパク質に
対する抗血清から精製されたイムノグロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）に反応する約３３．５ＫＤのタンパク質が検出され
た（図２）。

【００６２】

【実施例３】 自殖次世代へのβ−１，３−ＥＧ遺伝子
の伝達 実施例２で得られた再生植物体を温室にて常法により育
成することにより、約４ヶ月後には自殖種子を得た。

【００６３】それら自殖種子を常法により播種育苗し、
苗の若い葉よりＤＮＡを抽出した（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．，２１１，２７（１９８８））。約２〜３ｍ
ｍ長φの葉片を１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ内で、
Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆ．（２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）２５０μＬと共にホ
モジナイズし、２０％ ＳＤＳを２０μＬ加えて、６８
℃で１５分間加温した。ここに、７．５Ｍ Ａｍｍｏｎ
ｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ １５０μＬを加えて氷上で３
０分間置き、１５０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心
後、上清にＥｔＯＨ（エタノール）１ｍＬを加えて再度
同様の条件で遠心してＤＮＡを沈澱させた。得られたＤ
ＮＡを７０％ＥｔＯＨで洗い、乾燥させた後、ＴＥ ｂ
ｕｆ．（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ）３０μＬに溶かした。

【００６４】このＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によるβ−
１，３−ＥＧ遺伝子の検出を行った。使用したプライマ
ーは、配列表の配列番号１および２に示すもので、遺伝
子発現ベクター上における部位を図３に示した（矢
印）。尚、図３のかっこ内の数字は、開始コドンを１と
したときのβ−１，３−ＥＧ遺伝子配列中の位置（Plan
tPhysiol. 93, 673-682 (1990)参照）を示す。

【００６５】ＰＣＲは、プライマー濃度各１μＭ、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０、０．００５％ ＮＰ−４０、０．００１％
Ｇｅｌａｔｉｎ、ｄＡ，ｄＧ，ｄＣ，ｄＴＴＰ各２００
μＭ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＥＰＬＩＴＨＥＲ
Ｍ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ；ＥＰＩＳＥＮＴＲＥ社）５ｕｎｉｔ、先の方
法で調製したＤＮＡ５μＬを合わせて、全５０μＬの反
応液をＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ１０００（ＰＥＲ
ＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ社）を用いて、９４℃
１分、５０℃２分、７２℃３分からなる反応を１サイク
ルとし、これを３０〜３５回繰り返し反応させて行っ
た。

【００６６】ＰＣＲ反応産物を常法のアガロース電気泳
動で分析したところ、図４に見られるようにプラスミド
ｐＧｌｕが導入された形質転換植物は０．５Ｋｂの位置
に増幅されたＤＮＡが見られ、自殖次世代への遺伝子の
伝達が確認された。

【００６７】かかる自殖次世代（Ｒ₁ 世代）の１系統
（ＧＲ₁ ９）での分離比は、ＰＣＲ＋個体とＰＣＲ−個
体の比率で１９：７であった。

【００６８】

【実施例４】 形質転換植物の病害抵抗性 （１） イネ紋枯病に対する抵抗性 実施例３で得られた形質転換イネの紋枯病に対する抵抗
性を検定した。検定には、組換えイネのうち、実施例３
で述べたＰＣＲ法により遺伝子が検出された個体（ＰＣ
Ｒ＋）、遺伝子が検出されなかった個体（ＰＣＲ−）、
及び非組換えイネ（栽培品種：ササニシキ）を供試し
た。これらの植物体は、常法により栽培し、移植後４週
間の茎数が３本の植物を育成した。４日間ＹＧ液体培地
（水１Ｌに対しグルコース２０ｇ、酵母エキス３ｇ）で
振盪培養した紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏ
ｌａｎｉ Ｋｕｅｈｎ）懸濁液を、切れ込みを入れたウ
レタンディスク（径３０ｍｍ×厚さ１５ｍｍ）に充分し
みこませ、かかるウレタンディスクを、イネの茎をはさ
むように固定させ、接種を行った。接種後２日間湿室
（湿度ほぼ１００％）中におき、菌糸の伸長程度を比較
した。結果を表１に示す。伸長程度は、ウレタンディス
クから１ｃｍ以上厚く伸長してるものを３、１ｃｍ以上
薄く伸長しているものを２、ほとんど伸長していない
（０．５ｃｍ以下）のものを１、１と２の中間に位置す
るものを１．５とした。ＰＣＲ＋個体であるＧＲ₁ ９−
６、ＧＲ₁ ９−７は、ＰＣＲ−個体であるＧＲ₁９−９
と比較して、菌糸の伸長が著しく抑えられていた。ま
た、他の５個体は遺伝子の有無を検定していないが、栽
培品種のササニシキに比べて菌糸の伸長が阻害されてい
た。

【００６９】

【表１】

【００７０】同様にして接種した植物体を、接種後５日
間湿室中においた後、温室で栽培し７５日後の病斑の伸
長程度を比較した。結果を表２に示す。発病程度は止葉
まで発病しているものを３、稈長の１／２以上の発病を
２、それ以下を１とした。ＰＣＲ＋個体はＰＣＲ−個体
及びササニシキよりも発病程度が低く、β−１，３−Ｅ
Ｇ遺伝子を導入することにより紋枯病抵抗性イネが作出
されることが判明した。

【００７１】

【表２】 紋枯病発病程度 ─────────────────────────── Ｒ１個体番号 ＰＣＲ 発病程度 （平均値） ─────────────────────────── ＧＲ₁ ９−１１ ＋ ２ ＧＲ₁ ９−１２ ＋ １ ＧＲ₁ ９−１４ ＋ １ ＧＲ₁ ９−１６ ＋ ３ ＧＲ₁ ９−１７ ＋ １ １．６ ─────────────────────────── ＧＲ₁ ９−１８ − ３ ＧＲ₁ ９−２３ − ３ ＧＲ₁ ９−２４ − ２ ２．７ ─────────────────────────── ササニシキ１ ３ ササニシキ２ ３ ササニシキ３ ３ ササニシキ４ ３ ササニシキ５ ２ ２．８ ───────────────────────────

【００７２】（２） イネ白葉枯病に対する抵抗性 実施例３で得られた形質転換イネの自殖次世代を用い
て、白葉枯病に対する抵抗性を検定した。常法により栽
培した形質転換イネ（ＧＲ₁ ９）及び栽培イネ（品種：
ササニシキ）の止葉に白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ、
第ＩＩＩ群菌、Ｔ７１３３）を剪葉接種法により感染さ
せた。すなわち、白葉枯病菌をポテトシュークロース寒
天培地（ＰＳＡ培地：ジャガイモ２００ｇ、ショ糖２０
ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１Ｌ）で、９ｃｍφのシャーレ
を用いて２日間２８℃で培養し、それを５ｍＬの滅菌水
に懸濁させ、懸濁液に浸したハサミを用いて止葉の葉先
を切った。接種３０日後に病斑長を測定した。

【００７３】各個体の最長稈の病斑長を表３に示す。供
試した形質転換イネの遺伝子の有無は検定していないも
のの、形質転換イネの集団は、ササニシキに比べ病斑の
伸長が抑えられ、白葉枯病に対する抵抗性が増加してい
た。

【００７４】

【表３】 白葉枯病病斑長 ────────────────────────────────── 系統名 最長稈の病斑長（ｍｍ） （平均値） ────────────────────────────────── ＧＲ₁ ９ １４ １５ １６ １７ ２１ ２５ ２５ ４７ ４９ ２５．４ ササニシキ ３４ ４６ ７７ １２５ １４０ １８０ １８０ ２７３ ３００ １３０．６ ──────────────────────────────────

【００７５】

【発明の効果】本発明の病害抵抗性イネ科植物は、β−
１，３−ＥＧ遺伝子を導入して形質転換されたことによ
り、イネ紋枯病、イネ白葉枯病等の病害に対して抵抗性
を示し、農業生産上重要なイネ科植物を提供することが
できる。

【００７６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCTAAGTAT CATTCAAG 18

【００７７】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：ＹＥＳ 配列 CCAGTATCAA TGGCAGT 17

【００７８】

【図面の簡単な説明】

【図１】形質転換用プラスミドｐＧｌｕの構築手順を示
す図面である。

【図２】形質転換植物当代の葉部のタンパク質を電気泳
動し、β−１，３−ＥＧの存在をウエスタン法で確認し
た結果を示す写真である。

【図３】ＰＣＲ法によるβ−１，３−ＥＧ遺伝子の検出
に用いたプライマーのβ−１，３−ＥＧ遺伝子上におけ
る部位を示した図である。

【図４】形質転換植物の次世代への遺伝子の伝達を、Ｐ
ＣＲ法にて確認した結果を表す電気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/24 (72)発明者 吉川 正明 北海道札幌市北区北24条西12丁目１−７ラ ポールえるむの杜 Ａ−901 (72)発明者 田中 章 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地株式 会社植物工学研究所内 (72)発明者 山本 幹博 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地株式 会社植物工学研究所内 (72)発明者 島本 功 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地株式 会社植物工学研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 β−１，３−エンドグルカナーゼ遺伝子
   を導入して形質転換された、病害抵抗性イネ科植物。
2. 【請求項２】 β−１，３−エンドグルカナーゼ遺伝子
   がダイズ由来のものであることを特徴とする請求項１記
   載の植物。
3. 【請求項３】 イネ科植物がイネであることを特徴とす
   る請求項１または２に記載の植物。
4. 【請求項４】 病害が紋枯病または白葉枯病であること
   を特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の植
   物。
5. 【請求項５】 イネ科植物で機能するプロモーター、β
   −１，３−エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列
   およびターミネーターを有するベクターと、イネ科植物
   由来のプロトプラストとを液体媒体に懸濁し、該ベクタ
   ーを該プロトプラストに導入した後、イネ科植物培養細
   胞を含有する培地で培養してコロニーを形成させ、該コ
   ロニーから植物体を再生させることを特徴とする、病害
   抵抗性イネ科植物の作出方法。