JP2693443B2 - ホモノ科植物を形質転換する方法 - Google Patents
ホモノ科植物を形質転換する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
土壌細菌アグロバクテリウム・テュメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）の病原性株（virulent
strains）は双子葉植物に感染してこれらの植物に新生
物形成応答を引き起こさせることが知られている。該細
菌中の腫瘍誘導剤はそのDNAのいくつかを宿主植物細胞
中に伝達し、そこで宿主植物細胞の染色体に組み込まれ
ることによって機能するプラスミドである。このプラス
ミドはTiプラスミドと呼ばれ、A.テュメファシエンスの
種々の株の病原性はTiプラスミドの、Ｔ−DNAの可動化
及び伝達に関するvir領域によってある程度決定され
る。Ｔ−DNA部はそれぞれ右境界部（right border）及
び左境界部（left border）と名づけられる２つのの23
塩基対反復によって境界が定められている。これら２つ
の境界部配列の間に位置する遺伝情報はいずれも可動性
であり、感受性宿主に伝達される。ひとたび染色体中に
入るとＴ−DNA遺伝子は通常の優勢な植物遺伝子と同様
にふるまう。すなわちＴ−DNA遺伝子は形質転換された
植物によって安定に維持され、発現されそして有性的に
伝えられ、通常のメンデル形式で遺伝される。 A.テュメファシエンス感染の部位で未分化状態で生長
する植物腫瘍組織の瘤はクラウンゴールと呼ばれる。A.
テュメファシエンスによって引き起こされたクラウンゴ
ールの細胞はオパインと呼ばれる通常でないアミノ酸を
合成する。A.テュメファシエンスの異なる菌株がクラウ
ンゴール細胞による異なったオパインの合成を指示し、
誘導された特定のオパインは植物に感染した菌株の１つ
の特性となる。さらに与えられた菌株によって誘導され
た特定のオパインを異化する能力もその菌株の特性であ
る。 オパインは通常A.テュメファシエンスや未感染宿主植
物によっては合成されない。オパインの合成に関与する
酵素、オパインシンターゼをコードするのはＴ−DNAで
あるが、これらの遺伝子は感染した植物組織中でのみ発
現される。このような発現はこれらの遺伝子がＴ−DNA
上の真核調節配列の調節のもとにあるという所見と一致
する。 もっとも通常のオパインはオクトピン及びノパリンで
ある。オクトピンの合成を触媒するオパインシンターゼ
はリゾピンデヒドロゲナーゼであり、ノパリンの合成を
触媒するオパインシンターゼはノパリンデヒドロゲナー
ゼである。 クラウンゴール細胞を培養すると、通常の植物細胞が
培養物中で生長するようにするために加えねばならない
植物ホルモンを欠く培地中でも生長してカルス培養物を
生ずる。カルス培養物は比較的に未分化な植物細胞の組
織化されていない塊である。クラウンゴール細胞の無ホ
ルモン培地中で生長する能力も結質転換された宿主細胞
中のＴ−DNAの存在に帰せられる。なぜなら、植物ホル
モンの合成を指示する遺伝子も又Ｔ−DNAと連合してい
るからである。 A.テュメファシエンス及び遺伝子操子操作によってＴ
−DNAを挿入される宿主植物の双方にとって外来のDNA分
節もA.テュメファシエンスによって宿主細胞中に伝達さ
れる。このようにTiプラスミドは宿主植物の遺伝子工学
のためのベクターとして用いることができる。野性型A.
テュメファシエンスにおいては細菌あたり１個のTiプラ
スミドしかないが、遺伝学的にA.テュメファシエンスで
はＴ−DNAの伝達が起こるために、vir領域とＴ−DNAと
は同じTiプラスミド上に担持される必要はない。vir領
域とＴ−DNAとは同じアグロバクテリムウに含まれる別
のプラスミド上に担持することができる。 A.テュメファシエンスの宿主範囲は双子葉類に限り、
単子葉類の形質転換はこの細胞では行われないと一般に
考えられてきた。実際A.テュメファシエンスの感染によ
る単子葉類ホモノ科植物の形質転換についても誰も報告
していない。 しかしながら、最近Hooykaas−Van SlogterenらはNat
ure 311、763（1984）でユリ科及びヒガンバナ科の単子
葉類にA.テュメファシエンスが感染した傷部位に小さな
ふくれが生成することを報告した。感染植物の傷部から
取り出した植物細胞中にオパインが検出された。 又、HernalsfeensらはThe EMBO Journal、３、3083
（1984）において、A.テュメファシエンスC58株に感染
したユリ科の１メンバーである、単子葉類アスパラガス
・オフィシナリス（officinalic）の培養した茎断片が
腫瘍状増殖を発展させることを報告した。これらの腫瘍
状増殖物の１つは無ホルモン培地で増殖でき、又この腫
瘍状増殖物から導かれた樹立カルス培養物中にオパイン
が検出された。 1982年に、Anne C.F.Gravesは“Some Tumorigenic Ac
tivities of Agrobacterium Tumefaciens（Smith and T
own）Conn."（アナロバクテリウム・テュメファシエン
スのいくつかの腫瘍発生活性）（Bowling Green State
University）題する彼女の博士論文中でA.テュメファシ
エンスC58N及びB6の植菌によってグラジオラス円板上に
組織の不規則な塊りが発育することを報告した。これら
の組織塊はじゃがいもも塊茎円板に発育させた組織塊と
同じようであり、同様な細胞形態を有しているように見
えた。電気泳動中オクトピン標品と一緒に移動した化合
物はB6株によって誘導されたグラジオラス円板上の増殖
物中に見い出された。又、オクトピン標品のすぐ後を移
動した化合物はC58N株によって誘導されたグラジオラス
円板上の増殖物中に生じていた。オクトピンデヒドロゲ
ナーゼも又A.テュメファシエンスB6によって誘導された
細胞増殖物抽出液中に見い出されたが、A.テュメファシ
エンスC58Nによって誘導された細胞増殖物抽出液中には
見い出されなかった。 Dr.Gravesは又他のある端子葉植物のA.テュメファシ
エンスの植菌に対する応答について記述した。しょうが
根茎円板上には細胞増殖はみられず、チューリップ球根
円板についての結果ははっきりしなかった。がま及びざ
ぜんそうの根茎円板上での細胞増殖は早春における維管
束の先端（end）での輪郭がくっきりした細胞（clean c
ells）のいくつかの層に限られた。 DeCleene及びDeLeyはThe Botanical Review、42、389
（1976）において、A.テュメファシエンスの植物宿主範
囲についての広範囲に亘る研究の結果を報告した。彼ら
の論文はLiliales及びArales目の単子葉植物はA.テュメ
ファシエンスの感染に感受性であるが、一般に単子葉類
はA.テュメファシエンス感染に非感受性であることを教
示している。特に彼らの論文はホモノ科（Gramineae）
植物がA.テュメファシエンス感染に感受性でないことを
報告している。A.テュメファシエンスに対する感受性は
傷部位でふくれや腫瘍が発育するかどうかによって決定
された。 Longらは、Mol.Gen.Genet.,199、178（1985）におい
て、FrommらはNature、319、791（1986）において、及
びPortrykusらはMol.Gen.Genet.,199、183（1985）にお
いて、プロトプラストへの直接遺伝子伝達によるホモノ
科の形質転換について報告した。プロトプラストは細胞
壁が酵素による消化によって取り除かれた植物細胞であ
る。 Longらはノパリンシンターゼプロモーター、及びオク
トピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化調節シグナル
を含有するDNAを用いるTriticummonococcumのプロトプ
ラストを形質転換した。FrommらはプラスミドpCaMVNEO
（カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター、ト
ランスポゾンTn 5からのネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼIl遺伝子、及びノパリンシンターゼ３′領域を
含有する）のとうもろこしプロトプラストへのエレクト
ロポレーションによる伝達の結果として、カナマイシン
抵抗性の、安定に形質転換されたとうもろこし細胞が得
られることを開示している。 Hooykaas−Van Slogterenら、Hernalsteensら、Grave
s、及びDeCleene及びDeLeyの感染技術、又はLongら、Fr
ommら及びPortrykusらの直接遺伝子伝達技術を用いて発
生した、形質転換された細胞から形質転換された植物を
得るためには、プロトプラスト又は単一細胞培養物から
植物が再生（regenerated）されなければならない。し
かしながらホモノ科植物のプロトプラスト又は単一細胞
培養物から植物を再生することに未だ誰も成功していな
い。実際、ホモノ科の形質転換された植物又は他の形質
転換された分化した器官もしくは組織を再生する手段は
現在知られておらず、又ホモノ科植物の農業上重要な形
態又は部分、例えば種子、花粉、穂（ears）又は植物体
において外来のDNAの発現を許容する手法でホモノ科植
物を形質転換する手段は未だ存在しない。 最後に、1986年２月13日に発行されたPCT国際公開第W
O86/00931（Simpsonら）は完全な植物体を形質転換し再
生する生体内手法を教示している。この特許出願はの発
明の方法はA.テュメファシエンス苗条（shooty）変異株
の感染につづいて苗条腫瘍（shooty tumor）を形成する
いかなる植物の形質転換にも用いることができることが
できると記載している。しかしながら上記したごとく、
ホモノ科植物がA.テュメファシエンスの植菌によって腫
瘍又はふくれさえも生ずることは知られていない。この
発明の実施においてA.テュメファシエンスの植菌による
いかなる種類の腫瘍、ふくれ（swellings）又は細胞増
殖もホモノ科植物に観察されていない。 発明の内容 本発明によれば今ここに、急速に分裂している細胞を
含む実生（seedling）部分に傷をつけ、ついでその傷に
vir+ A.テュメファシエンスを植菌することを特徴とす
る、結質転換されたホモノ科植物（禾本科植物、Gramin
eae）の生産方法が提供される。本発明の好ましい態様
において、その傷は生殖系列細胞のもととなる実生部分
につけられる。又好ましくは遺伝学的に設計された（ge
netically−engineered）Ｔ−DNAを含有するベクターを
含有するvir+ A.テュメファシエンスが用いられる。 本発明の別の面によれば、（１）形質転換された花粉
粒、（２）vir+ A.テュメファシエンスに感染した実生
から生長した植物によって生産された、形質転換された
花粉粒、（３）遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有す
るベクターを含有するvir+ A.テュメファシエンスに感
染する実生から生長した植物によって生産された形質転
換された花粉粒、（４）その細胞がＴ−DNAの少なくと
も１つの分節（segment）を含む花粉粒、及び（５）こ
れら４つの花粉粒から導かれるホモノ科植物が提供され
る。さらに（１）形質転換されたホモノ科植物体（Gram
ineae plant。以下、同様にGramineaeに対してはホモノ
科植物、Gramineae plantに対してはホモノ科植物体と
いう）、（２）vir+ A.テュメファシエンスに感染した
実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物体、
（３）遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有するベクタ
ーを含有するvir+ A.テュメファシエンスに感染した実
生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物体、及び
（４）その細胞がＴ−DNA分節を含有するホモノ科植物
体が提供される。最後にvir+ A.テュメファシエンスに
感染した実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植
物体、及び遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有するベ
クターを含有するvir+ A.テュメファシエンスに感染し
た実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物が提
供される。 本発明は葉、植物体及び花粉のような形質転換され
た、分化した器官及び組織の生産に帰結するホモノ科植
物を形質転換する方法をはじめて提供するので明らかに
有用である。かくのごとく、本発明はホモノ科植物の農
業上重要な形態や部分に外来のDNAの発現を可能にす
る、ホモノ科植物を形質転換する方法をはじめて提供す
る。ホモノ科植物（例えばとうもろこし、オート麦、ラ
イ麦、大麦、ソルガム、米及び小麦）の多くはもちろん
人及び他の動物の商業上重要な食料源であり、本発明は
変更した特性又はより優れた特性を有するホモノ科株、
例えばより高い収量をもたらす株、除草剤抵抗性又はよ
りよい栄養価値を有する株の開発を、そのような特性を
コードする外来DNAをホモノ科植物に入れることによっ
て可能にする。 本発明によれば、急速に分裂している細胞を含む実性
部分に傷をつけ、その傷にvir+ A.テュメファシエンス
を植菌することを特徴とする、形質転換されたホモノ科
植物を生産する方法が提供される。ここで用いられるホ
モノ科植物（Gramineae）の語は植物体（plants）、種
子、実性、花粉、穀粒（kernels）、穂（ears）、葉、
茎（stalks）、胚を含むホモノ科植物のすべての形態及
び部分をいうものとする。同様に「とうもろこし」、
「オート麦」、「小麦」、「ライ麦」及び「大麦」の語
はとうもろこし、オート麦、ライ麦及び大麦のすべての
形態及び部分を含むことを意味する。「形質転換され
た」の語は外来DNAを細胞中に入れることによって遺伝
的に修飾されることを意味するものとしてここでは用い
られる。「外来DNA」（exogeous DNA）の語は形質転換
されるホモノ科株中に通常では見い出されないDNAを意
味する。外来DNAは形質転換されるホモノ科株以外のホ
モノ科株を含んで原核源または真核源から得ることでき
る。 本発明の方法を実施するにあたり、形質転換されたホ
モノ科株は殺菌され、ついで種子から幼根（最初の根）
及び茎が出るまで発芽させる。この状態は発芽後約４日
で到来するが、この期間は最初に種子を浸漬することに
よって短縮することができる。 傷は生殖系列細胞（germ line cells）のもととなる
急速に分裂している細胞の部分につけるのが好ましい。
傷をつけた後、実生に傷の中にvir+ A.テュメファシエ
ンスの溶液をもたらすことによって植菌する。vir+ A.
テュメファシエンスはＴ−DNAを宿主細胞中に可動化し
伝達することができる細菌であり、これらの機能をコー
ドする天然の又は合成のプラスミドを担持するA.テュメ
ファシエンスはvir+である。かくして、野性型のTiプラ
スミドを担持するA.テュメファシエンス株はvir+であ
り、本発明に用いることができる。かかる菌株は数多く
知られており、又公衆が入手することができる。例えば
American Type Culture Collection Catalogue（ATCC）
of Starin I,p66（15th eddition,1982）参照。野性型
Tiプラスミドのvir+領域を同じTiプラスミド上のＴ−DN
Aを可動化し伝達するために、又は同じ細菌中に含まれ
る別のプラスミド上のＴ−DNAをっ引き渡すために用い
ることができる。さらに可動化及び伝達機能はヘルパー
プラスミドによって供給され得る。そのようなヘルパー
プラスミドは、DittaらによってPNAS,77,7347（1980）
及びBagdasarianらによってGene,16,237（1981）に記述
されている。したがって、ヘルパープラスミドを担持す
るA.テュメファシエンス株もvir+である。最後に可動化
及び伝達機能はＴ−DNAを含有する同じ設計の（enginee
ered）プラスミドにコードすることができ、かかるプラ
スミドを含有する細菌もvir+である。 vir+ A.テュメファシエンスによって伝達されるＴ−D
NAは生来のＴ−DNAであってもよいが、好ましくは遺伝
学的に設計されたＴ−DNAであるのがよい。遺伝学的に
設計されたＴ−DNAは作動できる順序に結合したＴ−DNA
境界配列、異種構造遺伝子（heterologous gene）及び
転写単位を含有するDNA構築物である。かかる構築物を
調製する方法は当業界で公知である。 異種構造遺伝子はＴ−DNA中に通常見い出されず、か
つ形質転換されるホモノ科株のDNA中にも通常見い出さ
れない遺伝子である。異種構造遺伝子は形質転換される
株以外のホモノ科株を含め原核及び真核源から単離する
ことができる。それらを含有する植物に耕種学上重要な
特性を授与する異種構造遺伝子が特に興味深い。 異種構造遺伝子の横には形質転換されたホモノ科株中
での当該異種構造遺伝子を発現することができる、例え
ばプロモーター及びターミネーターを含有する転写単位
が並んでいる。この異種構造遺伝子−転写単位構築物の
横には境界配列が位置する。生来のものであろうと合成
されたものであろうといかなるＴ−DNA境界配列も、そ
れが異種構造遺伝子を形質転換されるホモノ科株の細胞
ゲノム中に組み込むように機能する限り、異種構造遺伝
子−転写単位構築物にとなりあわせるために用いること
ができる。遺伝子学的に設定されたＴ−DNAはホモノ科
株中で機能的であるレプリコンを含むDNA断片に結合し
てベクターを形成させる。 実生にvir+ A.テュメファシエンスを植菌した後、こ
れを形質転換が起こるまでインキュベートし、ついで植
え、少なくとも花粉を生ずるようになるまで生長させ
る。本発明方法を用いることによってクラウンゴール、
カルスもしくは腫瘍状生長過多を含めいずれの種類の腫
瘍生長も観察されなかった、最初に植菌された実生にで
さえも観察されなかったことは興味深いことである。 実生の好ましい部位に植菌することによって花粉の形
質転換がなされた。得られた形質転換された花粉は結椎
転換され及びされていない植物体を受精させるのに用い
ることができる。得られる子孫の穂から胚を切り取り、
これを生長させることにより形質転換された植物体を得
ることができる。又は、もちろんこの交配により得られ
る植物体に種子をつくらせ、これを種子の別の収穫を生
ずる形質転換された植物体を生長させるために用いるこ
ともできる。かくのごとく、有性生殖によって最初に形
質転換された実生からの後の世代を導くことができる。
当業者は種々の多くの外来遺伝子によってコードされた
特性を担持する子孫を既知の育種技術を用いて生産する
ことができることを認識するであろう。 とうもろこしの形質転換 実施例１ A.殺菌の調製 A.テュメファシエンスB6株の単一コロニーを水中に溶
解した0.1％酵母エキス、0.8％栄養ブロス及び0.5％シ
ョ糖を含有する酵母抽出ブロス（YEB）に植菌した。酵
母抽出ブロス及び栄養ブロスはDifco Laboratories、デ
トロイト、ミシガンより購入した。ショ糖はFisher Sci
entific、デトロイト、ミシガン又はSigma、セントルイ
ス、ミズーリより購入した。細菌は振盪させた水浴中該
YEBで27℃で48時間インキュベートするか、最終濃度が
3.8×109cells/mlになるまでインキュベートした。 B6株はA.テュメファシエンスの標準野性型株である。
該菌は病原性（virulent）（vir+）で適当な植物宿主中
でリゾピンデヒドロゲナーゼを生産するためのコードを
有している。この株はNorthwestern大学、Evanston、イ
リノイのJames及びBarbaraによって取得された。この株
の性質のいくつかはStonier,J.Bact.,79,889（1960）に
記述されている。B6株は又アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ATCC）、Rockville、メリーランドに寄
託されており、受入れ番号23308を与えられている。 B.とうもろこしの調製 とうもろこしの生得の黄色Iochief株の種子はAnderso
ns,Maumee、オハイオ又はBotzum,43 East Market,Akro
n、オハイオより取得した。この株は商業的に購入でき
る標準株である。 黄色Iochief種子は以下の手法により殺菌した。種子
をまず95％エタノール７部及び蒸留水2.5部を含有する
溶液に２分間浸漬した。ついで、種子を蒸留水中の0.5
％（w/v）HgCl2溶液中で５分インキュベートした。種子
を蒸留水中の15％（v/v）Clorox（Cloroxは5.25％次亜
塩素酸ナトリウムを含有する水溶液である）及び0.1％
（v/v）のPalmoliveのような皿洗い用液体洗剤または他
の適当な湿潤剤の溶液中で全部で30分洗浄した。最後に
種子を殺菌した２度蒸留した水中で５回洗った。 殺菌した種子を胚側を上にしてペトリ皿中の殺菌し湿
らせたWhatman No.3濾紙上に置いた。種子を一定の暗さ
に保つべくカバーしたペトリ皿中25℃で４日間インキュ
ベートした。濾紙はインキュベート期間中湿りを維持さ
せた。 C.実生へのA.テュメファシエンスの植菌 とうもろこしの実生中で急速に細胞が分裂している２
つの基本的な場所は根冠、及び胚盤瘤（scutellar nod
e）のふもとから中茎を通って子葉鞘瘤（coleoptile no
de）よりわずかに先にまでまたがる部分である。これら
の場所は第1A図及び第1B図に示されている。中茎は胚盤
瘤と子葉鞘瘤の間の部分である。 本発明を好ましく行うためには胚盤瘤のふもとから子
葉鞘瘤を通ってその少し先までにまたがる部分に傷をつ
ける。その理由は生殖系列細胞（germ line cells）の
もととなる組織がその領域に含まれているからである。
特にこの領域に葉腋原子細胞（axillary primordia）の
もとになる組織が見い出され、この組織は今度は若木
（tillers）及び穂（ears）（雌生殖器官）のもとにな
る。この領域には又ふさ毛のもととなる頂端分裂組織が
あり、ふさ毛は今度は花粉（雄生殖器官）のもととな
る。この好ましい領域の実生に接種することにって、生
殖系列細胞の形質転換体が得られる。 この実施例のＣ部で調製した、発芽しつつある各とう
もろこし実生の表面の、胚盤瘤のふもとから子葉鞘瘤を
通ってその少し先までにまたがる部分に全部で４つの傷
をつけた。実生は前面から第1B図に示すようにみえる
が、この傷はこの地域を縦に２分する線（中心線）を目
にみえるようにつけることによってなされた。切込みは
中心線に垂直に、中心線から実生の外側の縁に向けて、
実生を第1B図のようにみるときは実生の前面から切込み
がなされる部分におけるすべての組織を通して、なされ
た。切込みは胚盤瘤の部位になすときは前面からすべて
の組織を通して胚盤中にまで、中茎になすときは前面か
らすべての組織を完全に通してなされた。４つの傷は第
1B図の数字１によって示す。 これら４つの傷に上記Ａ部で記述したようにして培養
したYEB中のA.テュメファシエンスB6株の109cells/ml懸
濁液を全部で100μｌたらすことによって接種した。コ
ントロールとしていくつかの実生には0.9％NaCl（食塩
水）を接種した。接種後、実生を胚側を上にしてペトリ
皿中のバクト寒天（Bactoagar）層上に、皿あたり５実
生置いた。ペトリ皿は蒸留水中20g/の濃度の殺菌バク
ト寒天（Difco Laboratoriesより購入）20mlを含んでい
た。カバーしたペトリ皿を一定の暗さで27℃でさらに７
−14日インキュベートした。 D.検定 1. 実生中の酵素活性の検定 ７−14日のインキュベーション期間の終りに実生を0.
5Mショ糖、0.1％（w/v）アスコルビン酸及び0.1％（w/
v）システイン−HClを含有する0.1Mトリス−HClバッフ
ァー（pH8.0）中でWheaton組織粉砕機を用いてホモゲナ
イズ物が均質性を有するに至るまでホモゲナイズした。
実生は暗やみで生長したので、色素形成は遅れ、細胞壁
は通常と異なり柔軟なまま残された。従って実生の細胞
は容易に破れた。ついでホモゲナイズ物をFisher Micro
fuge中で13,000×ｇで２分間回転して細胞のない抽出物
を得た。 この細胞抽出物の一部を同量の、リゾピンデヒドロゲ
ナーゼ活性を検出すべく企画した反応培地に加えた。こ
の培地は0.2Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）中
溶解した30mM L−アルギニン、75mMピルベート及び20mM
NADHよりなっていった。酸素反応は室温で以下に示す
時間行わせた。 酵素反応生成物はWheaton3MM紙上で電気泳動によって
分離した。酵素反応の開始時点（時間零）で反応混合物
の５μサンプルを紙の陽極部位につけ、乾燥させた。
ついで、合成オクトピン（Calbiochem,Division of Ame
riacn Hoescht,La Jolla,Californiaより購入）の100μ
g/ml溶液５μサンプル、及び合成ノパリン（Sigma,S
t.Louis,Missouriより購入）の100μg/ml溶液の５μ
サンプルを紙の上につけ乾燥させた。 電気泳動はギ酸（90.8％）／氷酢酸／水（5:15:80、v
/v）溶液（pH1.8）中、450ボルトで2.5時間行われた。
紙を乾燥させ、ついで無水エタノール中の0.02％（w/
v）フェナントレンキノン１部及び60％（v/v）エタノー
ル中の10％（w/v）NaOHl部を含有する溶液に浸して汚し
た（stained）。乾燥後、スポットを長波長紫外線灯（3
66nm）のもとで視覚化した。 B6植菌実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナー
ゼ反応培地に加えて調製した生産物の電気泳動の結果を
第2A図に示す。この図中、レーン（lane）１は時間零点
で10個のB6植菌実生の無細胞抽出液の一部を同量のリゾ
ピンデヒドロゲナーゼ反応培地に加えて生産した反応混
合物のサンプルを含み、レーン２は10個のB6植菌実生の
無細胞抽出液の一部を同量のリゾピンデヒドロゲナーゼ
反応培地で15時間インキュベートして生産した生産物を
含み、レーン３は合成オクトピンを含み、レーン４は時
間零点で10個の食塩水接種実生の無細胞抽出液を同量の
リゾピンデヒドロゲネーゼ反応培地に加えて作成した生
産物を含み、レーン５は10個の食塩水接種実生の無細胞
抽出液の一部を同量のリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培
地で15時間インキュベートして作成した生産物を含み、
レーン６は合成ノパリンを含む。 第2A図はオクトピン生産がB6植菌とうもろこし実生の
無細胞抽出液によって引き起こされるが（レーン２）、
食塩水コントロールでは引き起こされない（レーン５）
ことを示している。さらに、フェナントレンキノリン螢
光の増加で測定される、生産されたオクトピンの量はイ
ンキュベーションの時間に比例して増加する。時間零点
ではオクトピンは検出されないのに（レーン１）、15時
間のインキュベーションの後では明らかに存在している
（レーン２）。このような結果は反応が酵素によって触
媒され、B6感染とうもろこし実生から抽出した酵素がリ
ゾピンデヒドロゲナーゼであるという提案と一致する。
形質転換された植物組織のみがオパイン合成遺伝子を発
現することが知られているので、これらの結果はとうも
ろこし実生がvir+A.テュメファシエンスB6株の感染で形
質転換されたとする提案とも一致する。 2. 基質特異性の検定 リゾピデヒドロゲナーゼはオクトピンの合成を触媒す
るが、ノパリンの合成は触媒しない。実生抽出液をノパ
リンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出に許容される試薬
を含有する反応培地に加えることによって得た生産物の
電気泳動の結果を第2B図に示す。ノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地は0.2Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.
0）中に溶解した60mM L−アルギニン、60mMα−ケトグ
ルタレート及び16mM NADHよりなる。α−ケトグルタレ
ートはノパリンデヒドロゲナーゼによってのみ基質とし
て用いられる。第2B図のレーン１〜６は第2A図のレーン
１〜６と反応培地がノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地
であることを除き同じである。第2B図はB6株を植菌した
実生の無細胞抽出液はアルギニンとの縮合反応でα−ケ
トグルタレートを用いてノパリンを生産することができ
ないことを示している。この基質特異性はB6株によって
形質転換された実性によって生産された酵素のリゾピン
デヒドロゲナーゼとしての同定を確認するものである。 3. 形質転換効率 この問題に対処するために、単一実性の検定を行い、
オクトパンを生産した単一実性の無細胞抽出液の数を決
定した。結果を第3A図に示すが、そこですべてのレーン
は単一B6植菌実生からの無細胞抽出液をリゾピンデヒド
ロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得た生
産物を含有する。第3A図に示されるごとく、10のレーン
のうち８つはフェナントレンキノンをつけ、オクトピン
標品と共に移動するスポットを有している。すなわち、
この実験での形質転換効率は80％であった。 4. コントロール 生産されたオクトピンがある第２の及び興味のないで
きごとの結果であったという可能性を除外するために、
いくつかの追加のコントロールを用いた。第4A図に示す
ごとく、上記Ａ部に記述したようにして48時間培養した
B6の懸濁液の無細胞超音波処理液の電気泳動は、蓄積し
たオクトピンを記していない（レーン１及び２）。さら
に、これらの超音波処理液をリゾピンデヒドロゲナーゼ
反応培地と混合して４時間インキュベートしたとき、リ
ゾピンデヒドロゲナーゼ活性は検出されなかった。第4B
図、レーン１、２及び３参照（そこではこのインキュベ
ーションの生産物が電気泳動された）。かくのごとく、
リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は48時間細菌培養物中に
見い出されない。又、リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培
地単独はオクトピンを含有していなかった。第4B図は、
レーン４参照（そこではこの反応培地単独が電気泳動さ
れた）。同様にこのデヒドロゲナーゼが未感染とうもろ
こし実生中に存在するという証拠は見い出されていな
い。第4C図参照（該図は電気泳動図であり、そこでレー
ン１〜５は未感染単一実生の無細胞抽出液をリゾピンデ
ヒドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得
た生産物を含有している）。これらの結果はB6植菌実生
の無細胞抽出液中におけるリゾピンデヒドロゲナーゼ活
性の存在が実生の形質転換によるものであり、ある第２
の又は興味のないできごとによるものでないことを確認
している。 実施例２ A.微生物の調製： A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーをYEBに接種
し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6について
記載したようにしてインキュベートした。C58菌株はA.
ツメファシエンスの標準野外タイプの菌株である。この
菌株はvir+であり適当な植物宿主中でノパリンデヒドロ
ゲナーゼの産生をコードする。この菌株はイリノイ州エ
バンストンのノースウエスタン大学のジェムス（Jame
s）氏およびバーバラ リッピンコット氏（Barbara Lip
pincott）からあるいはカルホルニア州デービスのカル
ホルニア大学植物病理学部門のクラレンス カド（Clar
ence Kado）氏より入手した。この菌株はデピッカー（D
epicker）等の“プラスミド（Plasmid）、３、193（198
0）”およびカオ（Kao）等の“Molec.Gen.Genet.,188、
425（1982）”に記載されている。菌株C58はまたATCCに
寄託してあり、寄託番号3397Dが与えられている。 B.とうもろこしの形質転換： とうもろこしの近交黄色イオチーフ（Jochief）系を
滅菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢ
およびＣに記載したようにして７〜14日間インキュベー
トしたが、とうもろこし実生（seedlings）は菌株B6で
はなくて菌株C58を接種した。 C.アッセイ： 1. 実生中の酵素活性のアッセイ： ７〜14日インキュベーション期間の終了時に、細胞を
含まない抽出物（エキス）、即ち、無細胞抽出物を調製
し実施例１、パートＤに記載したようにして酵素活性を
アッセイした。使用した反応培地はノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性をアッセイするように意図したものであっ
た。この培地は実施例１、パートＤで示したように、0.
2Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH＝7.0）中に溶解させた6
0mMのＬ−アルギニン、60mMのα−ケトグルタル酸およ
び16mMのNAOHとからなっていた。 結果は第2B図に示す。第2B図のレーン８は時間零で10
回Ｃ−58接種実生無細胞抽出物部分を等容量のノパリン
デヒドロゲナーゼ反応培地と混合することによって生成
させた生成物を含み、レーン７は10回Ｃ−58接種実生の
無細胞抽出物の部分を等容量のノパリンデヒドロゲナー
ゼ反応培地で15時間インキュベートすることによって生
じた生成物を含む。即ち、第2B図はノパリンがC58接種
とうもろこし実生の無細胞抽出物によって産生されるが
（レーン７）、そのような産生は塩水対照では生じない
（レーン５）ことを示している。さらに、フェナンスレ
ンキノン螢光の増加によって測定したときの産生ノパリ
ン量はインキュベーション時間に比例して増大するが、
時間零ではノパリンは反応混合物中に検出されず（レー
ン８）、15時間のインキュベーション後に明らかに存在
し（レーン８）、かかる結果は反応が酵素触媒されかつ
C58接種実生から抽出した酵素はノパリンデヒドロゲナ
ーゼであるとい命題に従っている。形質転換植物組成の
みがオパインシンターゼ遺伝子を発現することは知られ
ているので、これらの結果はまたとうもろこし実生がvi
r+A.ツメファシエンス菌株C58による感染によって形質
転換されるという命題によっている。 2. ピロノパインアッセイ： C58により形質転換した実生からの抽出物によるノパ
リンの合成は電気泳動性よりはむしろ他の基準によって
確認される。ノパリンを水によるペーパークロマトグロ
ラムにより溶出し、減圧により蒸発させて容量を減じ等
容量のホット（100℃）2M酢酸と１時間反応させると、
ピロノパリンが生成する。この転換反応はノパリン用の
検証であり他のオパリン用ではない。 第2C図において、レーン１は合成ノパリンを上述した
ようにホット2M酢酸で処理することによって合成ノパリ
ンから生成させたピロノパリンであり、レーン２は合成
ノパリン（そのいく分かが同時にピロノパリンに転換す
る）であり、レーン３は10回Ｃ−58接種の実生からの無
細胞抽出物の部分を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ
反応培地で15時間インキュベートすることによって産生
させた生成物であり、レーン４はこの生成物を上述のよ
うにしてホット2M酢酸によって処理したものである。明
らかに、C58接種実生からの無細胞抽出物をノパリンデ
ヒドロゲナーゼ反応混合物でインキュベートすることに
よって産生させた生成物（レーン３）はピロノパリン
（レーン４）に完全に転換されており、C58接種実生が
ノパリンデヒドロゲナーゼを産生していることが確認さ
れる。 3. ノパリンの異化作用： 最後に、ノパリンをC58でインキュベートしノパリン
がC58の唯一のエネルギー源として作用する場合には、
この微生物はノパリンを分解させるにつれて増殖するで
あろう。しかしながら、ノパリンの唯一のエネルギー源
として含む培地で増殖させたB6はノパリンを破壊せず分
解しないであろう。何故ならば、B6はノパリンの異化作
用に必要な特異性オパインオキシダーゼを欠如している
からである。 この原理に基づくアッセイを用いてC58接種実生の無
細胞抽出物により産生された生成物のノパリン同一性を
確認した。このアッセイの結果は第2D図に示しており、
レーン１は合成ノパリンを含み、レーン２は10回C58接
種実生の無細胞抽出物の等容量のノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地で15時間インキュベートすることによって
産生させた生成物であって、ピロノパリンアッセイに関
して上述したようにして電気泳動させ、水で溶出し、蒸
発し、菌株B6で24時間インキュベートさせたものを含
み、レーン３は10回CP58接種実生の無細胞抽出物の部分
を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で15時間
インキュベートすることによって産生させた生成物であ
って、電気泳動させ、溶出しさらに菌株C58で24時間イ
ンキュベートさせたものを示す。C58接種実生の無細胞
抽出物により産生させた生成物は菌株C58により消滅し
た（レーン３）が、菌株B6によって消滅せず（レーン
２）、生成物がノパリであることを確認した。 4. 形質転換の効率： A.ツメファシエンス菌株C58を用いた近交黄色イオチ
ーフとうもろこしの形質転換の効率を試験した。結果は
第3C図に示されており、10ヶのレーンすべてが１回C58
接種実生からの無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナー
ゼ反応培地で６時間インキュベートすることによって産
生した生成物を含んでいる。明らかなように、10の実生
のうちの９つが形質転換されていた。追加の１回接種実
生のアッセイをB6またはC58のいずれかで形質転換させ
た実生を用いて行った。菌株B6またはC58のいずれかで
１回接種し実生の合計150回のアッセイうち、60％が形
質転換されていた。 5. 対照（コントロール）： 産生したノパリンがある二次的な興味のない事実の結
果である可能性を排除するために、いくつかの対照試験
を行った。第4A図に示すように、実２のパートＡで記載
したようにして48時間培養したC58の懸濁液の無細胞音
波処理物の電気泳動は何らの含有ノパリンを示さなかっ
た（レーン３および４）。さらに、これらの音波処理物
をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地と混合し25℃で24
時間インキュベートさせたときも、ノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性は検出できなかった。このインキュベーショ
ンの生成物を電気泳動させている第4B図のレーン６およ
び７を参照されたい。即ち、ノパリンデヒドロゲナーゼ
活性は48時間後の微生物培養物中で見い出されなかっ
た。また、ノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地単独も何
らのノパリンを含んでなかった。この反応培地単位を電
気泳動させている第4B図レーン５を参照されたい。同様
に、未感染とうもろこし実生中にもこのデヒドロゲナー
ゼの証拠は見い出せなかった。レーン６〜10の未感染単
実生の無細胞抽出物を６時間ノパリンデヒドロゲナーゼ
反応培地でインキュベートすることによって産生させた
生成物を含んでいる電気泳動図を示す第4C図を参照され
たい。これらの結果は、C58接種実生の無細胞抽出物中
のノパリンデヒドロゲナーゼ活性が上記実生の形質転換
に基づくものであり何らかの二次的な興味のない事実に
よるものでないことを明確にしている。 実施例３ A.とうもろこしの形質転換： 菌株C58を実施例２、パートＡに記載したようにして
培養し、近交系黄色イオチーフとうもろこしを実施例
２、パートＢで記載したようにして滅菌し、発芽させ、
接種し、インキュベートさせた。７日間のインキュベー
ション後に、感染実生を鉢植え土壌を含む鉢に植付け
た。 B.アッセイ： 1. 萌芽系の葉の中の酵素活性のアッセイ： 植付け３週間後に、３本の別々の植付物からの萌芽系
（embryonic origin）の３枚の葉をノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性の存在を測定するためにアッセイした。アッ
セイ用に選定した葉はまだ大きくなってない植付物の幹
からの第１葉であった。各萌芽葉は接種時に各実生中に
存在する分化構造に由来するが、これらの分化構造は接
種領域には存在しない。 アッセイを行うために、３枚の各萌芽葉をそれぞれト
リス−HClバッファー中で均質化し、遠心して実施例
２、パートＣにおいて実生について記載したようにして
酵素活性をアッセイした。３枚の各萌芽葉の無細胞抽出
物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で24時間インキ
ュベートすることによって産生した生成物の電気泳動の
結果は第5A図に示され、この図においては、レーン１、
２および３がこのインキュベーションの生成物を含んで
いる。第5A図から明らかなように、各萌芽葉の無細胞抽
出物はノパリンデヒドロゲナーゼを含むものはなくこれ
らの葉は上記の接種手順によっては形質転換されてない
ことを示していた。 2. 分裂系の葉中の酵素活性のアッセイ： 分裂組織に由来する葉（萌芽葉以外のすべての葉）
を、実生の植え付け７週間後に、ノパリンデヒドロゲナ
ーゼの存在についてアッセイした。分裂組織は分裂して
器官および他の分化組織を形成できる急速分裂生の未分
化小細胞からなる組織である。葉に分化する分裂組織は
接種領域に存在している。 アッセイを行うために、分裂組織由来の葉から一部を
切り取り、各葉から切り取った部分をトリス−HClバッ
ファー中で一緒に均質化し、遠心し、実施例２のパート
Ｃで実生について記載したようにして酵素活性について
アッセイした。アッセイに用いた各葉の部分は第5B図の
数字２および３で示される。数字３で示される部分は線
６および７に沿って切り取った。線７は葉の中央脈と一
致している。部分３は通常植物に結合している葉の基幹
部に位置する。この葉の基幹部は葉の成長端であり、こ
の領域は葉の最も新しい細胞を含んでいる。数字２で示
される部分は中央脈４に水平である線５に沿って切るこ
とによって切り取った。部分２、２は葉の先端部にあ
り、葉の最も古い細胞を含んでいる。各部分２および３
は葉の表面積の約1/6を占める。分裂組織系の４枚の葉
の上記部分の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ
反応培地でインキュベーションすることによって産生し
た生産物の電気泳動の結果を第5C図に示す。第5C図にお
いて、レーン１はノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を
含み、レーン２〜５は葉の無細胞抽出物をノパリンデヒ
ドロゲナーゼ培地で12時間インキュベートすることによ
って産生した生成物を含んでいる。図示するように、４
枚の葉のうちの３枚の無細胞抽出物がノパリンを産生し
これらはノパリンデヒドロゲナーゼ活性を含むことを示
していた。これらの葉は細胞分裂および分化による分裂
組織に由来するので、これらの結果は実生の接種領域中
の細胞がとうもろこし細胞の次の世代に対してノパリン
デヒドロゲナーゼを合成する能力を促進できることを示
してる。即ち、これらの結果は接種した領域の細胞およ
びこれらの細胞に由来する細胞の形質転換が起っている
ことを示している。 3. 花粉中の酵素活性のアッセイ： 実生植付け60日後に、２本の植付物の花粉サンプルを
それぞれノパリンデヒドロゲナーゼの存在についてアッ
セイした。アッセイを行うために、約５〜10×105個の
花粉粒子を含む0.5〜1.0mlの花粉をトリス−HClバッフ
ァー中で均質化し、遠心し実施例２、パートＣで実生に
ついて記載したようにして酵素活性をアッセイした。２
本の植付け物からの花粉の無細胞抽出物をノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で12時間インキュベートすること
によって産生した生成物の電気泳動の結果は第5D図示に
示しており、レーン２と３がこのインキュベーションの
生成物を含んでおり、レーン１はノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地を含んでいる。この図から分るとおり、２
本の植付け物からの花粉はノパリンデヒドロゲナーゼ活
性を含んでいた。花粉は細胞分裂および分化により頂端
分裂組織から誘導されるので、これらの結果は、上記の
分裂組織系の葉の結果同様に、形質転換が起っているこ
とを示している。 4. 形質転換花粉からの実生中の酵素活性のアッセイ： 上記パートＢの３で示した２本の形質転換植付け物か
らの花粉を用いて未感染黄色イオチーフとうもろこし種
から成長した植付け物の穂に受精させた。この交配の結
果として受精植付け物により育成したF1種実を収穫し、
発芽させ、実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして（ただし、実生は接種させなかった）、インキュ
ベートした。７〜14日のインキュベーション後に、実生
を実施例２のパートＣに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセイした。これらの実生の無細胞抽出物はノ
パリンを産生することが分かり、この実生のF1世代が形
質転換されていることを示している。 5. 形質転換花粉からの作物から採取した萌芽系の葉の
酵素活性のアッセイ： 本実施例のパートＢの４で記載した交配により生じた
種実を収穫し、発芽させ、実生を接種しないことを除い
ては実施例１のパートＢおよびＣで記載したようにして
インキュベートする。７〜14日のインキュベーション後
に、実生を本実施例のパートＡで記載したようにして植
え付ける。植付け３週間後に、萌芽葉を本実施例のパー
トＢの１で記載したようにしてノパリンデヒドロゲナー
ゼ活性についてアッセイし、この萌芽葉の無細胞抽出物
はノパリンを産生し、形質転換されていることを示して
いる。 実施例４ A.とうもろこしの形質転換： 黄色イオチーフとうもろこしを滅菌し、発芽させ、接
種し、さらに実施例１のパートＢおよびＣで記載したよ
うにして７〜14日間インキュベートした。ただし、とう
もろこし実生の別々のグループをA.ツメファシエンスの
菌株A348、菌株JK195または菌株238MXのいずれかで接種
した。 A348菌株は菌株A6NCからの広域宿主範囲のプラスミド
pTiA6NCを担持する。この菌株はvir+であり適当な植物
ホスト中でリソパインデヒドロゲナーゼの産生をコード
する。菌株A6NCとプラスミドpTiA6NCはシアキイ（Sciak
y）等の“プラスミド（Plasmid）、１、238（1977）”
に記載されている。使用したA348はワシントン州シアト
ルのワシントン大学の微生物学および免疫学部門のユー
ゲン ネスター（Eugene Nester）氏より入手した。こ
の菌株は実施例１のパートＡで菌株B6について記載した
ようにして培養した。 菌株JK195と238MXは、それそれ、臨界的なvir領域に
突然変異を有しておりvir-である。従って、これらはそ
のそれぞれの宿主へTiプラスミドの必要な部分を運ぶこ
とができない。結果として、これらの微生物を接種した
材料から製せられた植物抽出物は適当な反応培地に加え
たとき何らのオパインも産生することは期待されないで
あろう。 238MXは背景的および起源的にはA348菌株と同じであ
るが、vir領域をvir-とするvir領域に挿入された微生物
トランスポズンTn3を有する。菌株238MXはユーゲン ネ
スター氏（前出）から入手した。この菌株は実施例１の
パートＡで菌株B6について記載したようにしてインキュ
ベートし100μg/mlのカルベニシリンを含むYEB上で用い
た。 JK195は菌株はC58由来のvir-ミュータントである。こ
の菌株はvir領域の相補群VI中に挿入された微生物トラ
ンスポズンTn5を有する。菌株JK195の詳細な記載はカオ
（Kao）等の“Mol.Gen.Genet.,188、425（1982）”およ
びランギスト（Lundguist）等の“Mol.Gen.Genet.,193,
1（1984）”に見い出し得る。使用したJK195はクラーレ
ンス カオ氏（前出）より入手した。また、この菌株は
実施例１のパートＡで記載したようにしてインキュベー
トし、50μg/mlのリファムピシンを含むYEBで使用し
た。 B.アッセイ： 1. 実生中の酵素活性のアッセイ： 第3B図および第3D図に示すように、238MX菌株またはJ
K195菌株を接種した実生の無植細胞抽出物はオパイン類
を産生しない。第3B図においては、レーン６〜10が238M
X接種単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナ
ーゼ反応媒質で４時間インキュベートすることによって
生じた生成物を含む。明らかに、オクトパインが無細胞
抽出物によって合成されないので実生は何ら形質転換さ
れない。第3D図においては、10のレーンすべてがJ195接
種単実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地で６時間インキュベートすることによって生じた
生成物を含んでいる。こゝでも、ノパリンが産生されな
いので実生はどれも形成転換されてない。 しかしながら、A348株は形質転換に関して適格性があ
る。第3B図においては、レーン１〜５はA348接種単実生
の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地
で４時間インキュベートすることによって生じた生成物
を含んでいる。明らかに、リソパインデヒドロゲナーゼ
がA348を接種した５つの単実生のうちの１つの無細胞抽
出物中に見出されて実生が形質転換されていることを示
している。 即ち、Ｔ−DNAを転写できるvir+A.ツメファシエンス
菌株のみがとうもろこし実生を形質転換している。vir
領域に突然変異を有し従って転写マイナスであるものは
感染植物から生成させた抽出物中のオパインシンターゼ
活性を刺激しない。 実施例５ A.ツメファシエンス菌株T37の単コロニーをYEB中に接
種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6につい
て記載したようにしてインキュベートした。 T37菌株はA.ツメファシエンスの標準野外タイプ菌株
である。この菌株はvir+であり、適当な植物ホスト中で
ノパリンデヒドロゲナーゼの産性をコードする。T37は
ワシントン州マジソンのワシントン大学植物生理学部門
のジョン ケンプ（John Kemp）氏から入手したが、オ
ハイオ州トレンドのトレンド大学生理学部門のアンC.F.
グレーブス（Anne C.F.Graves）氏からも入手できる。
この菌株はチューゲオン（Turgeon）等の“PNAS、73、3
562（1976）”およびシアキイ（Sciaky）等の“Slasmi
d,1,238（1978）”に記載されている。 近交黄色イオチーフ系とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、さらに実施例１のパートＢおよびＣで記載し
たようにして７〜14日間インキュベートした。ただし、
とうもろこし実生は菌株B6ではなく菌株T37で接種し
た。 ７〜14日インキュベーション期間終了時に、実生を実
施例２のパートＣで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。この手順により、T37接種とうもろこ
し実生の細胞なし抽出物によるノパリン産生が示され実
生は形質転換されていることを示した。 実施例６ A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーをYEB中に接
種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載したよう
にしてインキュベートした。とうもろこしの近交PA91株
の種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１
のパートＢとＣで近交黄色イオチーフ株について記載し
たようにして７〜14日間インキュベートした。PA91株は
商業的に入手できる標準のとうもろこし近交株である。
この株はインデアナ州グリーンビルのイーラル リリー
社のジーン ロバーツ（Jean Roberts）氏より入手し
た。 ７〜14日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例２のパートＤで記載したようにしてアッセイし
た。第７図に示すように、無細胞抽出物によるノパリン
産生が示されPA91株とうもろこしは形質転換されている
ことを示された。第６図においては、レーン１〜10が一
回C58接種実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地で６時間インキュベートすることにより生
じた生成物を含んでいる。明らかに、無細胞抽出物の10
すべてがノパリンを産生し実生が形質転換されているこ
とを示していた。 実施例７ A.ツメファシエンス菌株B6の単コロニーを酵母エキス
ブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡで
記載したようにしてインキュベートした。近交黄色イオ
チーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種
し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したようにし
て７〜14日間インキュベートしたが、種実は次のように
して発芽させた。滅菌後、種実を約12時間滅菌蒸留水に
浸した。次いで、種実を滅菌ペトリ皿中の滅菌湿潤ワッ
トマンNo.3紙上でインキュベートしたが、浸漬した種実
は浸漬しない種実よりも短時間で発芽するので1.5〜2.0
日間インキュベートさせたのみであった。 ７〜14日間のインキュベーション期間の終了時点で、
実生を実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活
性についてアッセイした。この手順により、感染実生の
無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ実生が
形質転換されていることを示していた。 実施例８ A.ツメファシエンス菌株LBA4013の単コロニーをYEB中
に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6に
ついて記載したようにしてインキュベートした。LBA401
3菌株はA.ツメファシエンス菌株Ach5由来の変異株であ
る。LBA4013はvir+である野外タイプTiプラスミドpTiAc
h5を含んでおり、またLBA4013は適当な植物宿主中でリ
ソパインデヒドロゲナーゼの産生をコードする。LBA401
3はインデアナ州インデアナポリスのイーライリリー社
のクレッグワルドロン（Clegg Wardron）氏より入手し
た。この菌株はマートン（Marton）等の“Mature,277、
129（1979）”に記載されている。 近交黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記
載したようにして７〜14日間インキュベートしたが、と
うもろこし実生は菌株B6ではなく菌株LBA4013を接種し
た。 ７〜14日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例１にパートＤに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセした。この手順によりLAB4013形質転換実
生の無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ、
実生は形質転換していることが示されていた。 実施例９ A.微生物の調製： A.ツメファシエンス菌株CA19の単コロニーをYEB中に
接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6につ
いて記載したようにしてインキュベートした。CA19菌株
は菌株LBA4013に由来し、実施例８で記載したようにvir
+であるpTiA ch5を含んでおり、また菌株CA19は適当な
植物宿主中でリソパインデヒドロゲナーゼの産生をコー
ドする。 菌株CA19はまたミクロ−TiプラスミドpCEL44を含んで
いる。ミクロプラスミドpCEL44はオクトパインシンター
ゼ遺伝子の５′プロモーターと会合アミノ末端領域をコ
ードしている配列およびオクトパインシンターゼ遺伝子
の３′末端配列間に挿入されたハイグロマイシンホスホ
トランスフェラーゼ（aph IV）をコードする遺伝子から
なる構築体である。この構築体は広域宿主範囲のベクタ
ーpKT210中のＴ−DNAのよい広いフラグメント間に集ま
っている。ミクロプラスミドpCEL44は植物細胞を形質転
換しハイグロマイシン耐性とすることができる。 菌株CA19は次の如くして調製する。 1. エシェリキア コリ（Escherichia coli） RR1ΔM15/pCEL30の培養とプラミドpCEL30の単離： プラミドpCEL30はＴ−DNAの右手方向に広い配列およ
びプラスミドpTiA66由来のオクトパインシンターゼ（oc
s）の５′末端からなる。特異なBgl IIサイトを含むリ
ンカーをocs遺伝子の11番目のコドンに結合している。
リンカーにはプラスミドpTiC58のノパリンシンターゼ遺
伝子の未端化およびポリアデニル化信号が結合されてい
る。これらの配列にはプラスミドpTiA66由来のＴ−DNA
の左手方向に広い配列を含む配列が結合している。プラ
スミドpCEL30の制限サイトと機能マップは第８図に示さ
れている。 プラスミドpCEL30はエシエリキアコリK12RR1ΔM15/pC
EL30から都合よく単離される。E.コリRR1ΔM15/pCEL30
はイリノイ州ペオリア61604のノーサン リージョナル
リサーチ ラボラトリー（National Regional Resear
ch Laboratoyr:NRRL）に寄託されており、寄託番号NRRL
B−15915を有している。 単離は次のようにして行う。E.コリRR1ΔM15/pCEL30
を50mg/mlのアンピシリンを含むＬ培地（10g/のカゼ
イン水解物、5g/の酵母抽出物、5g/のNaCl、1g/
のグルコース、pH7.4）の750ml中で通常の微生物手法に
より増殖させる。この培養株は激しく振とうさせながら
37℃で24時間インキュベートさせた後に収穫する。 培養株を遠心し、細胞ペレットを50mlの新に調製した
溶解バッファー（50mMのトリスーHCl、pH8.0、10mM EDT
A、9mg/mlのグルコース、2mg/のリソザイム）に再懸
濁させる。45分間の氷上インキュベーションの後、懸濁
液を0.2M NaOHと１％のSDSである溶液100mlと混合す
る。続いて懸濁液をさらに５分間氷上に保持する。3Mの
酢酸ナトリウムにさらに90mlを加え、混合物をさらに追
加の60分間氷上に保持する。 細胞片を遠心により除去し、上清を500mlのエタノー
ルと混合する。−20℃で２時間後、核酸を遠心によりペ
レット化し、10mMのトリス−HCl、pH8、10mM EDTAの90m
l中に再懸濁させる。 核酸溶液を90gmの塩化セシウム、および10mg/mlの臭
化エチジウム含有溶液0.9mlと混合する。この混合物を
次いで40,000rpmで24時間遠心してプラスミドDNAを精製
する。プラスミドDNAバンドを回収し次いで40,000rpmで
16時間遠心する。プラスミドDNAバンドを再び回収し通
常の方法により塩化セシウムと臭化エチジウムを除去す
る。次にプラスミドDNAバンドを90g/の酢酸アンモニ
ウムを含む２容量のエタノールで沈澱させる。ペレット
化DNAをTEバッファー（10mMトリス−HCl、pH8、1mM EDT
A）に0.2mg/mlの濃度で溶解させる。 2. E.コリJA221/pOW20の培養およびプラスミドpOW20の
単離： E.コリJA221/pOW20を本実施例のパートＡの１でE.コ
リRR1AΔM15/pCEL30について記載したようにして増殖さ
せ、プラスミドpOW20を本実施例のパートＡの１でプラ
スミドpCEL30について記載したようにして調製する。 3. E.コリRR1ΔM15/pCEL40の構築： ５μｇのプラスミドpCEL30DNAを酵素製造業者により
推奨される組成の１反50μ応混合物中の50単位のBal
II制限酵素によって消化する。制限酵素および他の酵素
は次の供給者より容易に入手できる： ベセスダ リサーチ、ラボラトリーズ、インコーボレ
ッド （メイランド州 ロックビル20850、ボックス601
0） ベーリンガー マンハイム ビオケミカルズ （インデアナ州 インデアナポリス 46250、P.D.
ボックス50816） ニューイングランド バイオ ラボラトリーズ、イン
コーポレッド （マサチュセッツ州、ベバリー01915、32トーゼル
ロード） 消化は37℃、90分で進行せしめる。 反応混合物を先ず0.5Mトリス−HCl、pH8、1mMのEDTA
の8.75μと混合し、次いで1.25単位の子牛腸ホスファ
ターゼ（ベーリンガーマンハイム社より購入できる）と
混合し、37℃で15分間インキュベートする。混合物を次
に緩衝化フェノールで次いでエーテルで抽出し、酢酸ア
ンモニウム含有エタノール２容量で沈澱させる。−70℃
で30分間後に、DNAをペレット化しTEバッファー中に10
μg/mlの濃度で再溶解する。 約20μｇのプラスミドpOW20DNAを制限酵素BamH IとBg
l IIにより酵素製造業者が推奨する手順に従って消化し
aph IV遺伝子を得る。aph IV遺伝子はハイグロマイシン
に耐性の遺伝子を含む植物を形成するE.コリ遺伝子であ
る。 この消化により得たDNAフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動の通常方法により分画しアガロースゲル中に
挿入したNA−45 DEAE紙（ニューハンプシャー州03431の
キーンのシュレイチャー アンド シェウェル社）上に
電気泳動中に包括させることによって単離した。DNAを
上記の紙から上記紙を５秒間十分量の高塩バッファー
（1.0M NaCl、0.1mM EDTA、および20mMトリス、pH8.0）
でスピニングすることにより溶出して紙をミクロ遠心機
中に回収する。この紙を55〜60℃で10〜45分間必要に応
じて渦巻かせることによってインキュベートする。バッ
ファーを除去し、紙を約50μのバッファーで洗浄す
る。DNAを先ずフェノールで次いでエーテルで抽出し、T
Eバッファー中に約25μg/mlの濃度で再懸濁させる。 10ngのホスホターゼ処理Bal II切断プラスミドpCEL30
を15μの0.8ユニットT4DNAリガーゼ含有リガーゼバッ
ファー（50mMトリス−HCl、pH7.6、10mM MgCl2、10mM D
TT、および1mM ATp）中で50ngの精製〜1.3kbBam−Bal I
Iフラグメントと混合する。この混合物を一夜15℃でイ
ンキュベートする。 この連結反応混合物を15μの滅菌60mM CaCl2溶液と
混合する。次に−70℃で30mM CaCl2、15％グリセロール
中で20倍濃縮で貯蔵した適格E.コリRR1ΔM15細胞の懸濁
液70μを加える。氷上で60分経過後、形質転換混合物
を42℃で２分間加熱処理し、次いで0.5mlL培地で37℃、
90分間インキュベートする。 混合物のサンプルをアンピシリンを50mg/で含むＬ
培地上に拡散させ寒天により15g/で固化する。これら
のサンプルを次いで一夜37℃でインキュベートして形質
転換細胞からのコロニーの増殖を行う。 形質転換により得られるコロニーをアンピシリンを50
mg/で含む5mlのＬ培地中に接種し、37℃で一夜増殖さ
せる。プラスミドDNAは、これら培養物の1mlサンプルか
ら、ホルメス（Holmes）とキーグレイ（Quigley）の“A
nalytical Biochemistyr,114、193（1981）”の方法に
より調製し、50μのTEバッファー中に再溶解させる。 4. ミクロTiプラスミドpCEL44の構築： プラスミドpCEL40はアグロバクテリウム中の複製たり
得ないので、プラスミドpCEL40のミクロＴ−DNAを先ずE
coRIフラグメントとして広域宿主範囲のベクターpKT210
中に転写した。この広域宿主範囲ベクターはカルホルニ
ア州（94305）のパロアルトのスタンフオード大学のプ
ラスミドリファレンスセンターより入手できる。 ５μｇのプラスミドpKT210を酵素製造業者の推奨する
組成の150μの反応液中でEcoRI制限酵素の50単位で消
化する。37℃で90分後に、反応物を本実施例のパートＡ
の３で記載したような子牛腸ホスファターゼで処理しTE
バッファ中に10μg/mlの濃度に溶解する。 本実施例のパートＡの３で記載したようにして増殖さ
せたプラスミドpCEL40DNA調製物15μを10単位のEcoRI
制限酵素で20μ反応液中で37℃、90分間消化し、次い
でフェノールで抽出し、エーテルで抽出する。消化した
DANを酢酸アンモニウム含有エタノールの２容量で−20
℃で沈澱させ、20μのTEバッファー中に再溶解する。 10ngのホスファターゼ処理EcoRI切断pKT210を本実施
例をパートＡの３で記載したようにして５μのEcoRI
切断pCEL40と連結反応させて本実施例のパートＡの３で
記載したようにしてE.コリRR1ΔM15に形質転換する。 pCEL44含有の形質転換細胞をその能力により用いてク
ロラムフェニコールを10mg/含む固化Ｌ培地上で繁殖
させる。pCEL44の制限サイトおよび機能マップは第９図
に示される。 5. 菌株CA19を形成するためのpCEL44のA.ツメファシエ
ンスLBA4013への接合： RR1ΔM15/pCEL44とE.コリpRK2013を固化Ｌ培地上で37
℃、一夜増殖させる。A.ツメファシエンスLBA4013は固
化Ｌ倍地上で28℃、２日間増殖させる。 E.コリK12 RR1ΔM15/pCEL44の１個のループ、E.コリ
pRK2013の１個のループおよびA.ツメファシエンスLBA40
13の１個のループとを1mlの30mM硫酸マグネシウム溶液
中に混合する。次に、この混合物の１滴を固化TY培地
（5g/のカゼイン水解物、5g/の酵母抽出物、15g/
の寒天）上に乗せ20℃で一夜インキュベートする。 上記細菌増殖物を3mlの10mM硫酸マグネシウム溶液に
再懸濁し、0.1mlの階階希釈サンプルを100mg/のナリ
ジキシン酸と2mg/のクロラムフェニルコールとを含む
固化TY培地上に拡散し28℃でインキュベートする。 接合完了体は２〜４日間増殖後個々のコロニーに生長
する。これらのコロニーを100mg/のナリシキシン酸と
2m/のクロラムフェニコールを含む液体TY培地25ml中
に１回接種しさらに２日間振とうさせながら28℃でイン
キュベートする。接合完了のプラスミド含有量を次いで
カッセ（Casse）等の方法（Journal of General Microb
iology,113、229−242、1979）によりチェックし、野外
タイプpTiAch5プラスミドとpCEL44プラスミドを含む菌
株CA19を単離する。 本発明の方法を実施するのに用いるCA19はインジアナ
州インジアナポリスのイライ リリー社のクレック ウ
ォルトロン氏より入手した。菌株CA19の調製はウォルト
ロン等の“Plant Molec.Bjol.,5、103（1985）”にも記
載されており、その記載は本明細書に参考として引用す
る。 B.とうもろこしの形質転換： 近交黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、接種しさらに実施例１のパートＢとＣで記載
したようにして７〜14日間インキュベートしたが、とう
もろこし実生は菌株B6でなく菌株CA19で接種した。 C.アッセイ： 1. 実生のリソパインデヒドロゲナーゼ活性のアッセ
イ： ７〜14日間インキュベーション期間終了時に、実生を
実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。結果は第６図に示すとおりであり、
レーン１〜10は一回CA19接種実生の無細胞抽出物をリソ
パインヒドロキゲナーゼで４時間インキュベートするこ
とによって生じた生成物を含んでいる。それより明らか
なように、１回接種CA19とうもろこし実生の無細胞抽出
物10のうちの９つにおいてオクトパイン産生が認めら
れ、実生がリソパインデヒドロゲナーゼを含有して形質
転換されていることが示された。 2. 実生のハイグロマイシン耐性のアッセイ： 菌株CA19を接種したいくつかの実生を接種後３〜４日
間のみインキュベートし、その時点で次のようにしてハ
イグロマイシン耐性をアッセイした。実生を内乳および
胚盤（第1A図および第1B図参照）から切り取り約3mmの
断面積に切断した。これらの断面切断物を各々200μg/m
lのカルベニシリン（シグマ）とバンコマイシン（リリ
ー）とを加えたダンカン培地（ダンカン等により“Plan
ts,165、322（1985）”中に記載されている）、または
各々200μg/mlのカルベニシリンとバンコマイシンを加
えたBN4培地〔ムラシージ（Mlrashige）およびスクーグ
（Skoog）の主要および微量塩（Physiol.Plant,15,473
（1962）に記載されている）、4mg/のオーキシンとし
ての2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、9g/のデフコバク
トアガー（DifcoBactoager）、および20g/のサクロー
ス〕上で暗中で25〜27℃で３週間培養し、さらに３週間
抗菌剤への通過を行った。 上記とうもろこし実生由来の組織培養のハイグロマイ
シンに対する応答性を試験するためには、全断面プラス
断面から生長した組織または100mgのカルスサンプルの
いずれかをファルコン1005ペトリ皿中の上記濃度のバン
コマイシンおよびカルベニシリンを加え約125μg/mlの
ハイグロマイシンＢ（リリー社）を含む50mlのダンカン
培地またはBN4培地上に乗せる。この試験は27℃での暗
中インキュベーション３週間後に増殖の観察チェックに
より読み取る。増殖中の培養物は淡色であり粒度の増大
を示している。この試験を用いて、正増殖表現型をCA19
接種実生由来の培養物から回収し、実性が異種ハイグロ
マイシン遺伝子により形質転換されていることを示す。 実施例10 A.除草剤グリホサイトに対する耐性を与える遺伝子を担
持するA.ツメファシエンス菌株の調製： 1.E.コリRR1Δ15/pCEL30の培養とプラスミドpCE30の単
離： E.コリRR1ΔM15/pCEL30を実施例９のパートＡの１で
記載したようにして増殖し、プラスミドpCEL30を実施例
９のパート１のＡで記載したようにして単離する。 2.プラスミドpCEL30のBgl II消化と子牛腸ホスファター
ゼによる処理： 5gのプラスミドpCEL30DNAを実施例９のパートＡの３
で記載したようにして消化し子牛腸ホスファターゼで処
理する。 3.グリホサイト耐性EPSPシンターゼ遺伝子の単離： グリホサイト耐性５−エノールピルボイルシキミ酸−
３リン酸シンターゼ遺伝子（GREPSPS遺伝子）をコード
する遺伝子をコマイ（Comai）等の“Nature,317、714
（1985）”およびスタルカー（Stalker）等の“J.Biol.
Chem.,260、4724（1985）”に記載されたようにして単
離する（これら文献の記載は参考として本明細書に引用
する）。この方法の最終工程において、プラスミドpPMG
34から切断されたBamHIのフラグメント中のGREPSPS遺伝
子をプラスミドpUC7にクローン化してプラスミドpPMG38
を得る。GREPSPS遺伝子はその後プラスミドpPMG38からE
coRIフラグメントとして切り取る。EcoR1フラグメント
は次いで適当な商業的に入手できる分子リンカーを用い
て修飾してBgl II消化pCEL30プラスミド上の特異的Bgl
IIサイトと連結反応できるようにまたEcoRIサイトを除
去できるようにする。 除草剤グリホサイト（Ｎ−ホスホノメチル−グリシ
ン）は雑草および作物種の両方を殺す広汎に使用される
広域スペクトル除草剤である。この除草剤は芳香族化合
物の生合成の代謝段階を抑制し、グリホサイトの細胞タ
ーゲットは５−エノールピルボイルシキミ酸−３−リン
酸シンターゼ（EPSPシンターゼ）であり、これはホスホ
エノールピルベイトとシキメートからの５−エノールピ
ルボイルシキミ酸３−リン酸の形成を触媒し、該シキミ
酸塩経路のこの段階の抑制が実際に細胞死をもたらして
いる。GREPSPS遺伝子はサルモネラ チフィリウム（Sal
monella typhimurium）のaro A部位の変異体対立遺伝子
であり、この遺伝子はEPSPシンターゼをコードし、セリ
ンのプロリンへの置換により該酵素のグリホサイトに対
する親和性を減少せしめる。 4.連結反応： 実施例９のパートＡの３で調製した10ngのホスファタ
ーゼ処理Bgl I切断プラスミドpCEL30を15μの0.8ユニ
ットT4DNAリガーゼ含有リガーゼバッファー中で50ngのG
REPSPS遺伝子（結合リンカーを含む）と混合する。混合
物を15℃で一夜インキュベートする。この連結反応混合
物を用いて実施例９のパートＡの３で記載したようにし
て適格E.コリRR1ΔM15細胞を形質転換する。 5. GREPSPS遺伝子を担持するミクローTiプラスミドの
構築： 実施例９のパートＡの３に記載したようなアンピシリ
ン含有Ｌ培地上での本実施例のパートＡの４で記載した
ようにして生成させた形質転換細胞の選定後、形質転換
E.コリRR1ΔM15細胞からのプラスミドを、実施例９のパ
ートＡの４で記載したように、EcoRIフラグメントとし
て、広域宿主範囲のベクターpKT210に転写する。 6. A.ツメファシエンスLBA4013への接合： 広域宿主範囲ベクターpKT210上にGREPSPS遺伝子を担
持するプラスミドを、実施例９のパートＡの５に記載し
たような接合により、A.ツメファシエンス菌株LBA4013
へ転写する。得られた接合完了体を実施例９のパートＡ
の５に記載したようにして選択し、GREPSPS遺伝子を担
持するA.ツメファシエンスの新規な菌株（以下、菌株LB
A4013/GREPSPSと称す）を単離する。 B.とうもろこしの形質転換： 近交黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記
載したようにしてインキュベートしたが、とうもろこし
実生は菌株B6ではなく菌株LBA4013/GREPSPSを接種し
た。７日間のインキュベーション後、この感染実生を鉢
植土壌を含む鉢に植付ける。 C.アッセイ： 1. 花粉中の酵素活性のアッセイ： 実生の植付け60日後に、５本の植付け物の花粉の各サ
ンプルを、それぞれ、実施例３のパートＢで記載したよ
うにして、リンパインデヒドロゲナーゼの存在について
アッセイする。５本の植付け物から花粉の無細胞抽出物
をインキュベートすることによって生じた生成物の電気
泳動の結果は花粉の無細胞抽出物の５つのうちの３つが
オクトパインを産生することを示しており、花粉が形質
転換していることを示している。 2. EPSPシンターゼ活性のアッセイ： 分裂組織からの葉を、実生の植付け７週間後に、ブー
コック（Boocock）とコギンズ（Coggins）の方法（“FE
BS Letters,154、127（1983）";その記載は参考として
本明細書に引用する）により、EPSPシンターゼ活性につ
いてアッセイする。 ５本の個々の植付け物からの５枚の葉をアッセイし、
３枚がEPSPシンターゼ活性を含むことが認められ、形質
転換が起っていることを示している。 3. グリホサイトに対する耐性のアッセイ： 本実施例のパートＣの２の結果として葉中にEPSPシン
ターゼ活性を含んでいることを確認した３本の植付け物
に0.5kg/ヘクタールに等価のグリホサイトイソプロピル
アミン塩を噴霧する。３本の植付け物はすべて対照に比
べ著しいグリホサイト耐性を示す。 好ましい実施態様を示す以上の記載により、特許請求
する本発明の範囲を何ら限定する積りはない。当業者な
らば多くの修正、変形および応用が可能であることは理
解されるであろう。 実施例11 A.とうもろこしの形質転換： 菌株CA19を実施例９のパートＡで記載したように培養
し、黄色イオチーフとうもろこしを滅菌し、発芽させ、
CA19を接種し、実施例１のＢとＣで記載したようにして
インキュベートした。実生をまたA.ツメファシエンス菌
株CA17でも接種した。CA17は菌株CA19と同じであるが、
ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子が反対方向に
挿入されている。さらに、実生はまたYEB単独でも接種
した。７日間のインキュベーション後、接種した実生す
べてを植付けた。 B.アッセイ： 1. 形質転換植付物の上部葉中の酵素活性のアッセイ： 植付け物が成熟に達したとき、その上部の葉を実施例
３のパートＢの２に記載したようにしてリソパインデヒ
ドロゲナーゼ活性の存在についてアッセイした。ただ
し、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いた。CA
19接種実生からの５本の植付け物の葉、CA17接種実生か
らの２本の植付け物の葉およびYEB接種の３本の植付け
物の葉をアッセイした。 結果は第14図に示す。第14図において各レーンは次の
物質を含む。 第14図に示すように、YEB接種実生からの葉の抽出物
はいずれもオクトパインを産生せず、一方CA−19接種お
よびCA−17接種実生の12抽出物のうちの８つがオクトパ
インを産生した。 2. 形質転換植付物の上部葉中の微生物のアッセイ： 本実施例のパートＢの２で記載したリソパインデヒド
ロゲナーゼアッセイに用いた葉の抽出物のアリコートを
塗抹してこれらの抽出物中に何らかの微生物が存在する
かどうかを測定した。これらの塗抹の結果として増殖す
る微生物コロニーをアクロバクテリウム検出用ラクトー
ズ含有培地に転写した。原塗抹の経過として増殖しラク
トースを酸化してラクトン酸とした微生物はなく（YEB
接種実生、CA19接種実生またはCA17接種実生の葉からの
いずれの抽出物においても）、微生物中には実生を接種
するのに用いた種類のアグロバクリウムは存在しないこ
とが示された。 3. F1植付物の葉中の酵素活性のアッセイ： 上記アッセイの結果を用いて、植付物19−５および19
−３を用いてさらに試験を行った。植付物19−５はその
最上部の２枚の葉の抽出物が該植付物が房毛（tassel）
まで拡大する形質転換領域を有し得ることを示すリソパ
インデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性であったので用
いた。植付物19−３はその“穂の苗条”、および“刃状
葉の下の葉”の抽出物が該植付け物が穂まで延びた形質
転換領域および房毛まで延びた形質転換領域を有し得る
ことを示すリソパインデヒドロゲナーゼ活性に対して陽
性であるので用いた。これら２本の植付物は自己受粉さ
せた。次いで、受粉26〜27日後、植付物19−３と19−５
の未成熟穂を採取し表面を滅菌した。これら植付物から
の穂の遅成熟胚を切り取り半強力ムラシゲースリーグ培
地に植付けた。胚を光中で８〜10日間無菌状態で発芽さ
せ、その時点で土壌に植付けた。 土壌に移植して生長したF1種実の分裂組織由来の葉を
実施例３のパートＢの２に記載したようにして、ただ
し、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてリソ
パインデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。オ
クトパインと共遊走（co−migration）した電気泳動図
上のスポットの染色度を評価した。結果は第１表に示
す。そこで示されるように、実生のいくつかはオクトパ
インを産生し、本特性のF1世代への有性伝播を示した。 実施例12 A.ツメファシエンス菌株B6の単コロニーを酵母エキスブ
イヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡで記
載したようにしてイキュベートした。ライムギの種実を
滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１のＢとＣ
で記載したようにして７〜14日間インキュベートした。
実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じる急速分
裂細胞領域に接種した。 ７〜14日インキュベーション期間終了時に、実生を実
施例１のパートＤで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。B6接種ライムギ実生の無細胞抽出物を
リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えることによ
って生じた生成物の電気泳動の結果は第10図に示す。こ
の図においては、レーン１が合成オクトパイン標準物を
含み、レーン２−６は単B6接種ライムギ実生の無細胞抽
出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含む。第10図に
示された結果はオクトパイン産生が試験した４つのB6接
種ライムギ実生（レーン２、３、４および６）のうちの
３つにより生じていることを示している。これらの結果
はライムギ実生vir+A.ツメファシエンス菌株B6による感
染によって形質転換されていることを示している。 実施例13 A.ツメファシエンス菌株B6の単コロニーを酵母エキス
ブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡに
記載したようにしてインキュベートした。オオムギの種
実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１のＢ
とＣに記載したようにして７〜14日間インキュベートし
た。実生を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ずる急
速分裂細胞領域で接種した。 ７〜14日インキュベーション期間の終了時に、実生を
実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。B6接種オオムギ実生の無細胞抽出物
をリンパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えることに
よって生じた生成物の電気泳動の結果は第11図に示す。
この図において、レーン１は合成オクトパイン標準物を
含み、レーン２〜６は単B6接種オオムギ実生の無細胞抽
出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含む。第11図で
示す結果はオクトパイン産生がB6接種オオムギ実生の５
つの無細胞抽出物のうちの５つによって生じていること
および実生が形質転換されていることを示している。 実施例14 A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーのYEBに接種
し、この微生物を実施例２のパートＡで記載したように
してインキュベートした。オートムギの種実を滅菌し、
発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記
載したようにして７〜14日間インキュベートした。実生
を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ずる急速分裂細
胞領域で接種した。 ７〜14日間のインキュベート期間終了時に、実生を実
施例２のパートＤに記載したようにしてアッセイした。
結果は第12図に示す。第12図では、レーン１がノパリン
デヒドロゲナーゼ反応培地のみを含み、レーン２はノパ
リン標準物を含み、レーン３〜11は１回C58接種オート
ムギ実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地でインキュベートすることによって生じた生成物
を含み、レーン12は合成オクトパインを含む。明らか
に、１回C58接種オートムギ実生の無細胞抽出物の９つ
のうちの６つはノパリンを産生し実生が形質転換されて
いることを示している。 実施例15 A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーのYEBに接種
し、この微生物を実施例２のパートＡで記載したように
してインキュベートした。コムギの種実を滅菌し、発芽
させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣに記載し
たようにして７〜14日間インキュベートした。実生は先
端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ずる急速分裂細胞領
域で接種した。 ７〜14日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例２のパートＤに記載したようにしてアッセイし
た。結果は第13図に示す。第13図において、レーン１は
ノパリン標準物を含み、レーン２〜６は１回C58接種コ
ムギ実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地でインキュベートすることによって生じた生成物
を含み、レーン７は合成オクトパインを含み、レーン８
は合成オクトパインとリソパインデヒドロゲナーゼ反応
培地との混合物を含み、レーン９〜15は１回C58接種コ
ムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ
反応培地でインキュベートすることによって生じた生成
物を含む。明らかに、C58接種コムギ実生の５つの無細
胞抽出物のうち３つがノパリンデヒドロゲナーゼ反応培
地とインキュベートさせたのきノパリンを産生し、実生
が形質転換されていることを示している。リソパインデ
ヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベートした場合には
ノパインを産生した無細胞抽出物はなかった。
（Agrobacterium tumefaciens）の病原性株（virulent
strains）は双子葉植物に感染してこれらの植物に新生
物形成応答を引き起こさせることが知られている。該細
菌中の腫瘍誘導剤はそのDNAのいくつかを宿主植物細胞
中に伝達し、そこで宿主植物細胞の染色体に組み込まれ
ることによって機能するプラスミドである。このプラス
ミドはTiプラスミドと呼ばれ、A.テュメファシエンスの
種々の株の病原性はTiプラスミドの、Ｔ−DNAの可動化
及び伝達に関するvir領域によってある程度決定され
る。Ｔ−DNA部はそれぞれ右境界部（right border）及
び左境界部（left border）と名づけられる２つのの23
塩基対反復によって境界が定められている。これら２つ
の境界部配列の間に位置する遺伝情報はいずれも可動性
であり、感受性宿主に伝達される。ひとたび染色体中に
入るとＴ−DNA遺伝子は通常の優勢な植物遺伝子と同様
にふるまう。すなわちＴ−DNA遺伝子は形質転換された
植物によって安定に維持され、発現されそして有性的に
伝えられ、通常のメンデル形式で遺伝される。 A.テュメファシエンス感染の部位で未分化状態で生長
する植物腫瘍組織の瘤はクラウンゴールと呼ばれる。A.
テュメファシエンスによって引き起こされたクラウンゴ
ールの細胞はオパインと呼ばれる通常でないアミノ酸を
合成する。A.テュメファシエンスの異なる菌株がクラウ
ンゴール細胞による異なったオパインの合成を指示し、
誘導された特定のオパインは植物に感染した菌株の１つ
の特性となる。さらに与えられた菌株によって誘導され
た特定のオパインを異化する能力もその菌株の特性であ
る。 オパインは通常A.テュメファシエンスや未感染宿主植
物によっては合成されない。オパインの合成に関与する
酵素、オパインシンターゼをコードするのはＴ−DNAで
あるが、これらの遺伝子は感染した植物組織中でのみ発
現される。このような発現はこれらの遺伝子がＴ−DNA
上の真核調節配列の調節のもとにあるという所見と一致
する。 もっとも通常のオパインはオクトピン及びノパリンで
ある。オクトピンの合成を触媒するオパインシンターゼ
はリゾピンデヒドロゲナーゼであり、ノパリンの合成を
触媒するオパインシンターゼはノパリンデヒドロゲナー
ゼである。 クラウンゴール細胞を培養すると、通常の植物細胞が
培養物中で生長するようにするために加えねばならない
植物ホルモンを欠く培地中でも生長してカルス培養物を
生ずる。カルス培養物は比較的に未分化な植物細胞の組
織化されていない塊である。クラウンゴール細胞の無ホ
ルモン培地中で生長する能力も結質転換された宿主細胞
中のＴ−DNAの存在に帰せられる。なぜなら、植物ホル
モンの合成を指示する遺伝子も又Ｔ−DNAと連合してい
るからである。 A.テュメファシエンス及び遺伝子操子操作によってＴ
−DNAを挿入される宿主植物の双方にとって外来のDNA分
節もA.テュメファシエンスによって宿主細胞中に伝達さ
れる。このようにTiプラスミドは宿主植物の遺伝子工学
のためのベクターとして用いることができる。野性型A.
テュメファシエンスにおいては細菌あたり１個のTiプラ
スミドしかないが、遺伝学的にA.テュメファシエンスで
はＴ−DNAの伝達が起こるために、vir領域とＴ−DNAと
は同じTiプラスミド上に担持される必要はない。vir領
域とＴ−DNAとは同じアグロバクテリムウに含まれる別
のプラスミド上に担持することができる。 A.テュメファシエンスの宿主範囲は双子葉類に限り、
単子葉類の形質転換はこの細胞では行われないと一般に
考えられてきた。実際A.テュメファシエンスの感染によ
る単子葉類ホモノ科植物の形質転換についても誰も報告
していない。 しかしながら、最近Hooykaas−Van SlogterenらはNat
ure 311、763（1984）でユリ科及びヒガンバナ科の単子
葉類にA.テュメファシエンスが感染した傷部位に小さな
ふくれが生成することを報告した。感染植物の傷部から
取り出した植物細胞中にオパインが検出された。 又、HernalsfeensらはThe EMBO Journal、３、3083
（1984）において、A.テュメファシエンスC58株に感染
したユリ科の１メンバーである、単子葉類アスパラガス
・オフィシナリス（officinalic）の培養した茎断片が
腫瘍状増殖を発展させることを報告した。これらの腫瘍
状増殖物の１つは無ホルモン培地で増殖でき、又この腫
瘍状増殖物から導かれた樹立カルス培養物中にオパイン
が検出された。 1982年に、Anne C.F.Gravesは“Some Tumorigenic Ac
tivities of Agrobacterium Tumefaciens（Smith and T
own）Conn."（アナロバクテリウム・テュメファシエン
スのいくつかの腫瘍発生活性）（Bowling Green State
University）題する彼女の博士論文中でA.テュメファシ
エンスC58N及びB6の植菌によってグラジオラス円板上に
組織の不規則な塊りが発育することを報告した。これら
の組織塊はじゃがいもも塊茎円板に発育させた組織塊と
同じようであり、同様な細胞形態を有しているように見
えた。電気泳動中オクトピン標品と一緒に移動した化合
物はB6株によって誘導されたグラジオラス円板上の増殖
物中に見い出された。又、オクトピン標品のすぐ後を移
動した化合物はC58N株によって誘導されたグラジオラス
円板上の増殖物中に生じていた。オクトピンデヒドロゲ
ナーゼも又A.テュメファシエンスB6によって誘導された
細胞増殖物抽出液中に見い出されたが、A.テュメファシ
エンスC58Nによって誘導された細胞増殖物抽出液中には
見い出されなかった。 Dr.Gravesは又他のある端子葉植物のA.テュメファシ
エンスの植菌に対する応答について記述した。しょうが
根茎円板上には細胞増殖はみられず、チューリップ球根
円板についての結果ははっきりしなかった。がま及びざ
ぜんそうの根茎円板上での細胞増殖は早春における維管
束の先端（end）での輪郭がくっきりした細胞（clean c
ells）のいくつかの層に限られた。 DeCleene及びDeLeyはThe Botanical Review、42、389
（1976）において、A.テュメファシエンスの植物宿主範
囲についての広範囲に亘る研究の結果を報告した。彼ら
の論文はLiliales及びArales目の単子葉植物はA.テュメ
ファシエンスの感染に感受性であるが、一般に単子葉類
はA.テュメファシエンス感染に非感受性であることを教
示している。特に彼らの論文はホモノ科（Gramineae）
植物がA.テュメファシエンス感染に感受性でないことを
報告している。A.テュメファシエンスに対する感受性は
傷部位でふくれや腫瘍が発育するかどうかによって決定
された。 Longらは、Mol.Gen.Genet.,199、178（1985）におい
て、FrommらはNature、319、791（1986）において、及
びPortrykusらはMol.Gen.Genet.,199、183（1985）にお
いて、プロトプラストへの直接遺伝子伝達によるホモノ
科の形質転換について報告した。プロトプラストは細胞
壁が酵素による消化によって取り除かれた植物細胞であ
る。 Longらはノパリンシンターゼプロモーター、及びオク
トピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化調節シグナル
を含有するDNAを用いるTriticummonococcumのプロトプ
ラストを形質転換した。FrommらはプラスミドpCaMVNEO
（カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター、ト
ランスポゾンTn 5からのネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼIl遺伝子、及びノパリンシンターゼ３′領域を
含有する）のとうもろこしプロトプラストへのエレクト
ロポレーションによる伝達の結果として、カナマイシン
抵抗性の、安定に形質転換されたとうもろこし細胞が得
られることを開示している。 Hooykaas−Van Slogterenら、Hernalsteensら、Grave
s、及びDeCleene及びDeLeyの感染技術、又はLongら、Fr
ommら及びPortrykusらの直接遺伝子伝達技術を用いて発
生した、形質転換された細胞から形質転換された植物を
得るためには、プロトプラスト又は単一細胞培養物から
植物が再生（regenerated）されなければならない。し
かしながらホモノ科植物のプロトプラスト又は単一細胞
培養物から植物を再生することに未だ誰も成功していな
い。実際、ホモノ科の形質転換された植物又は他の形質
転換された分化した器官もしくは組織を再生する手段は
現在知られておらず、又ホモノ科植物の農業上重要な形
態又は部分、例えば種子、花粉、穂（ears）又は植物体
において外来のDNAの発現を許容する手法でホモノ科植
物を形質転換する手段は未だ存在しない。 最後に、1986年２月13日に発行されたPCT国際公開第W
O86/00931（Simpsonら）は完全な植物体を形質転換し再
生する生体内手法を教示している。この特許出願はの発
明の方法はA.テュメファシエンス苗条（shooty）変異株
の感染につづいて苗条腫瘍（shooty tumor）を形成する
いかなる植物の形質転換にも用いることができることが
できると記載している。しかしながら上記したごとく、
ホモノ科植物がA.テュメファシエンスの植菌によって腫
瘍又はふくれさえも生ずることは知られていない。この
発明の実施においてA.テュメファシエンスの植菌による
いかなる種類の腫瘍、ふくれ（swellings）又は細胞増
殖もホモノ科植物に観察されていない。 発明の内容 本発明によれば今ここに、急速に分裂している細胞を
含む実生（seedling）部分に傷をつけ、ついでその傷に
vir+ A.テュメファシエンスを植菌することを特徴とす
る、結質転換されたホモノ科植物（禾本科植物、Gramin
eae）の生産方法が提供される。本発明の好ましい態様
において、その傷は生殖系列細胞のもととなる実生部分
につけられる。又好ましくは遺伝学的に設計された（ge
netically−engineered）Ｔ−DNAを含有するベクターを
含有するvir+ A.テュメファシエンスが用いられる。 本発明の別の面によれば、（１）形質転換された花粉
粒、（２）vir+ A.テュメファシエンスに感染した実生
から生長した植物によって生産された、形質転換された
花粉粒、（３）遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有す
るベクターを含有するvir+ A.テュメファシエンスに感
染する実生から生長した植物によって生産された形質転
換された花粉粒、（４）その細胞がＴ−DNAの少なくと
も１つの分節（segment）を含む花粉粒、及び（５）こ
れら４つの花粉粒から導かれるホモノ科植物が提供され
る。さらに（１）形質転換されたホモノ科植物体（Gram
ineae plant。以下、同様にGramineaeに対してはホモノ
科植物、Gramineae plantに対してはホモノ科植物体と
いう）、（２）vir+ A.テュメファシエンスに感染した
実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物体、
（３）遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有するベクタ
ーを含有するvir+ A.テュメファシエンスに感染した実
生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物体、及び
（４）その細胞がＴ−DNA分節を含有するホモノ科植物
体が提供される。最後にvir+ A.テュメファシエンスに
感染した実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植
物体、及び遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有するベ
クターを含有するvir+ A.テュメファシエンスに感染し
た実生から導かれた、形質転換されたホモノ科植物が提
供される。 本発明は葉、植物体及び花粉のような形質転換され
た、分化した器官及び組織の生産に帰結するホモノ科植
物を形質転換する方法をはじめて提供するので明らかに
有用である。かくのごとく、本発明はホモノ科植物の農
業上重要な形態や部分に外来のDNAの発現を可能にす
る、ホモノ科植物を形質転換する方法をはじめて提供す
る。ホモノ科植物（例えばとうもろこし、オート麦、ラ
イ麦、大麦、ソルガム、米及び小麦）の多くはもちろん
人及び他の動物の商業上重要な食料源であり、本発明は
変更した特性又はより優れた特性を有するホモノ科株、
例えばより高い収量をもたらす株、除草剤抵抗性又はよ
りよい栄養価値を有する株の開発を、そのような特性を
コードする外来DNAをホモノ科植物に入れることによっ
て可能にする。 本発明によれば、急速に分裂している細胞を含む実性
部分に傷をつけ、その傷にvir+ A.テュメファシエンス
を植菌することを特徴とする、形質転換されたホモノ科
植物を生産する方法が提供される。ここで用いられるホ
モノ科植物（Gramineae）の語は植物体（plants）、種
子、実性、花粉、穀粒（kernels）、穂（ears）、葉、
茎（stalks）、胚を含むホモノ科植物のすべての形態及
び部分をいうものとする。同様に「とうもろこし」、
「オート麦」、「小麦」、「ライ麦」及び「大麦」の語
はとうもろこし、オート麦、ライ麦及び大麦のすべての
形態及び部分を含むことを意味する。「形質転換され
た」の語は外来DNAを細胞中に入れることによって遺伝
的に修飾されることを意味するものとしてここでは用い
られる。「外来DNA」（exogeous DNA）の語は形質転換
されるホモノ科株中に通常では見い出されないDNAを意
味する。外来DNAは形質転換されるホモノ科株以外のホ
モノ科株を含んで原核源または真核源から得ることでき
る。 本発明の方法を実施するにあたり、形質転換されたホ
モノ科株は殺菌され、ついで種子から幼根（最初の根）
及び茎が出るまで発芽させる。この状態は発芽後約４日
で到来するが、この期間は最初に種子を浸漬することに
よって短縮することができる。 傷は生殖系列細胞（germ line cells）のもととなる
急速に分裂している細胞の部分につけるのが好ましい。
傷をつけた後、実生に傷の中にvir+ A.テュメファシエ
ンスの溶液をもたらすことによって植菌する。vir+ A.
テュメファシエンスはＴ−DNAを宿主細胞中に可動化し
伝達することができる細菌であり、これらの機能をコー
ドする天然の又は合成のプラスミドを担持するA.テュメ
ファシエンスはvir+である。かくして、野性型のTiプラ
スミドを担持するA.テュメファシエンス株はvir+であ
り、本発明に用いることができる。かかる菌株は数多く
知られており、又公衆が入手することができる。例えば
American Type Culture Collection Catalogue（ATCC）
of Starin I,p66（15th eddition,1982）参照。野性型
Tiプラスミドのvir+領域を同じTiプラスミド上のＴ−DN
Aを可動化し伝達するために、又は同じ細菌中に含まれ
る別のプラスミド上のＴ−DNAをっ引き渡すために用い
ることができる。さらに可動化及び伝達機能はヘルパー
プラスミドによって供給され得る。そのようなヘルパー
プラスミドは、DittaらによってPNAS,77,7347（1980）
及びBagdasarianらによってGene,16,237（1981）に記述
されている。したがって、ヘルパープラスミドを担持す
るA.テュメファシエンス株もvir+である。最後に可動化
及び伝達機能はＴ−DNAを含有する同じ設計の（enginee
ered）プラスミドにコードすることができ、かかるプラ
スミドを含有する細菌もvir+である。 vir+ A.テュメファシエンスによって伝達されるＴ−D
NAは生来のＴ−DNAであってもよいが、好ましくは遺伝
学的に設計されたＴ−DNAであるのがよい。遺伝学的に
設計されたＴ−DNAは作動できる順序に結合したＴ−DNA
境界配列、異種構造遺伝子（heterologous gene）及び
転写単位を含有するDNA構築物である。かかる構築物を
調製する方法は当業界で公知である。 異種構造遺伝子はＴ−DNA中に通常見い出されず、か
つ形質転換されるホモノ科株のDNA中にも通常見い出さ
れない遺伝子である。異種構造遺伝子は形質転換される
株以外のホモノ科株を含め原核及び真核源から単離する
ことができる。それらを含有する植物に耕種学上重要な
特性を授与する異種構造遺伝子が特に興味深い。 異種構造遺伝子の横には形質転換されたホモノ科株中
での当該異種構造遺伝子を発現することができる、例え
ばプロモーター及びターミネーターを含有する転写単位
が並んでいる。この異種構造遺伝子−転写単位構築物の
横には境界配列が位置する。生来のものであろうと合成
されたものであろうといかなるＴ−DNA境界配列も、そ
れが異種構造遺伝子を形質転換されるホモノ科株の細胞
ゲノム中に組み込むように機能する限り、異種構造遺伝
子−転写単位構築物にとなりあわせるために用いること
ができる。遺伝子学的に設定されたＴ−DNAはホモノ科
株中で機能的であるレプリコンを含むDNA断片に結合し
てベクターを形成させる。 実生にvir+ A.テュメファシエンスを植菌した後、こ
れを形質転換が起こるまでインキュベートし、ついで植
え、少なくとも花粉を生ずるようになるまで生長させ
る。本発明方法を用いることによってクラウンゴール、
カルスもしくは腫瘍状生長過多を含めいずれの種類の腫
瘍生長も観察されなかった、最初に植菌された実生にで
さえも観察されなかったことは興味深いことである。 実生の好ましい部位に植菌することによって花粉の形
質転換がなされた。得られた形質転換された花粉は結椎
転換され及びされていない植物体を受精させるのに用い
ることができる。得られる子孫の穂から胚を切り取り、
これを生長させることにより形質転換された植物体を得
ることができる。又は、もちろんこの交配により得られ
る植物体に種子をつくらせ、これを種子の別の収穫を生
ずる形質転換された植物体を生長させるために用いるこ
ともできる。かくのごとく、有性生殖によって最初に形
質転換された実生からの後の世代を導くことができる。
当業者は種々の多くの外来遺伝子によってコードされた
特性を担持する子孫を既知の育種技術を用いて生産する
ことができることを認識するであろう。 とうもろこしの形質転換 実施例１ A.殺菌の調製 A.テュメファシエンスB6株の単一コロニーを水中に溶
解した0.1％酵母エキス、0.8％栄養ブロス及び0.5％シ
ョ糖を含有する酵母抽出ブロス（YEB）に植菌した。酵
母抽出ブロス及び栄養ブロスはDifco Laboratories、デ
トロイト、ミシガンより購入した。ショ糖はFisher Sci
entific、デトロイト、ミシガン又はSigma、セントルイ
ス、ミズーリより購入した。細菌は振盪させた水浴中該
YEBで27℃で48時間インキュベートするか、最終濃度が
3.8×109cells/mlになるまでインキュベートした。 B6株はA.テュメファシエンスの標準野性型株である。
該菌は病原性（virulent）（vir+）で適当な植物宿主中
でリゾピンデヒドロゲナーゼを生産するためのコードを
有している。この株はNorthwestern大学、Evanston、イ
リノイのJames及びBarbaraによって取得された。この株
の性質のいくつかはStonier,J.Bact.,79,889（1960）に
記述されている。B6株は又アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ATCC）、Rockville、メリーランドに寄
託されており、受入れ番号23308を与えられている。 B.とうもろこしの調製 とうもろこしの生得の黄色Iochief株の種子はAnderso
ns,Maumee、オハイオ又はBotzum,43 East Market,Akro
n、オハイオより取得した。この株は商業的に購入でき
る標準株である。 黄色Iochief種子は以下の手法により殺菌した。種子
をまず95％エタノール７部及び蒸留水2.5部を含有する
溶液に２分間浸漬した。ついで、種子を蒸留水中の0.5
％（w/v）HgCl2溶液中で５分インキュベートした。種子
を蒸留水中の15％（v/v）Clorox（Cloroxは5.25％次亜
塩素酸ナトリウムを含有する水溶液である）及び0.1％
（v/v）のPalmoliveのような皿洗い用液体洗剤または他
の適当な湿潤剤の溶液中で全部で30分洗浄した。最後に
種子を殺菌した２度蒸留した水中で５回洗った。 殺菌した種子を胚側を上にしてペトリ皿中の殺菌し湿
らせたWhatman No.3濾紙上に置いた。種子を一定の暗さ
に保つべくカバーしたペトリ皿中25℃で４日間インキュ
ベートした。濾紙はインキュベート期間中湿りを維持さ
せた。 C.実生へのA.テュメファシエンスの植菌 とうもろこしの実生中で急速に細胞が分裂している２
つの基本的な場所は根冠、及び胚盤瘤（scutellar nod
e）のふもとから中茎を通って子葉鞘瘤（coleoptile no
de）よりわずかに先にまでまたがる部分である。これら
の場所は第1A図及び第1B図に示されている。中茎は胚盤
瘤と子葉鞘瘤の間の部分である。 本発明を好ましく行うためには胚盤瘤のふもとから子
葉鞘瘤を通ってその少し先までにまたがる部分に傷をつ
ける。その理由は生殖系列細胞（germ line cells）の
もととなる組織がその領域に含まれているからである。
特にこの領域に葉腋原子細胞（axillary primordia）の
もとになる組織が見い出され、この組織は今度は若木
（tillers）及び穂（ears）（雌生殖器官）のもとにな
る。この領域には又ふさ毛のもととなる頂端分裂組織が
あり、ふさ毛は今度は花粉（雄生殖器官）のもととな
る。この好ましい領域の実生に接種することにって、生
殖系列細胞の形質転換体が得られる。 この実施例のＣ部で調製した、発芽しつつある各とう
もろこし実生の表面の、胚盤瘤のふもとから子葉鞘瘤を
通ってその少し先までにまたがる部分に全部で４つの傷
をつけた。実生は前面から第1B図に示すようにみえる
が、この傷はこの地域を縦に２分する線（中心線）を目
にみえるようにつけることによってなされた。切込みは
中心線に垂直に、中心線から実生の外側の縁に向けて、
実生を第1B図のようにみるときは実生の前面から切込み
がなされる部分におけるすべての組織を通して、なされ
た。切込みは胚盤瘤の部位になすときは前面からすべて
の組織を通して胚盤中にまで、中茎になすときは前面か
らすべての組織を完全に通してなされた。４つの傷は第
1B図の数字１によって示す。 これら４つの傷に上記Ａ部で記述したようにして培養
したYEB中のA.テュメファシエンスB6株の109cells/ml懸
濁液を全部で100μｌたらすことによって接種した。コ
ントロールとしていくつかの実生には0.9％NaCl（食塩
水）を接種した。接種後、実生を胚側を上にしてペトリ
皿中のバクト寒天（Bactoagar）層上に、皿あたり５実
生置いた。ペトリ皿は蒸留水中20g/の濃度の殺菌バク
ト寒天（Difco Laboratoriesより購入）20mlを含んでい
た。カバーしたペトリ皿を一定の暗さで27℃でさらに７
−14日インキュベートした。 D.検定 1. 実生中の酵素活性の検定 ７−14日のインキュベーション期間の終りに実生を0.
5Mショ糖、0.1％（w/v）アスコルビン酸及び0.1％（w/
v）システイン−HClを含有する0.1Mトリス−HClバッフ
ァー（pH8.0）中でWheaton組織粉砕機を用いてホモゲナ
イズ物が均質性を有するに至るまでホモゲナイズした。
実生は暗やみで生長したので、色素形成は遅れ、細胞壁
は通常と異なり柔軟なまま残された。従って実生の細胞
は容易に破れた。ついでホモゲナイズ物をFisher Micro
fuge中で13,000×ｇで２分間回転して細胞のない抽出物
を得た。 この細胞抽出物の一部を同量の、リゾピンデヒドロゲ
ナーゼ活性を検出すべく企画した反応培地に加えた。こ
の培地は0.2Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）中
溶解した30mM L−アルギニン、75mMピルベート及び20mM
NADHよりなっていった。酸素反応は室温で以下に示す
時間行わせた。 酵素反応生成物はWheaton3MM紙上で電気泳動によって
分離した。酵素反応の開始時点（時間零）で反応混合物
の５μサンプルを紙の陽極部位につけ、乾燥させた。
ついで、合成オクトピン（Calbiochem,Division of Ame
riacn Hoescht,La Jolla,Californiaより購入）の100μ
g/ml溶液５μサンプル、及び合成ノパリン（Sigma,S
t.Louis,Missouriより購入）の100μg/ml溶液の５μ
サンプルを紙の上につけ乾燥させた。 電気泳動はギ酸（90.8％）／氷酢酸／水（5:15:80、v
/v）溶液（pH1.8）中、450ボルトで2.5時間行われた。
紙を乾燥させ、ついで無水エタノール中の0.02％（w/
v）フェナントレンキノン１部及び60％（v/v）エタノー
ル中の10％（w/v）NaOHl部を含有する溶液に浸して汚し
た（stained）。乾燥後、スポットを長波長紫外線灯（3
66nm）のもとで視覚化した。 B6植菌実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナー
ゼ反応培地に加えて調製した生産物の電気泳動の結果を
第2A図に示す。この図中、レーン（lane）１は時間零点
で10個のB6植菌実生の無細胞抽出液の一部を同量のリゾ
ピンデヒドロゲナーゼ反応培地に加えて生産した反応混
合物のサンプルを含み、レーン２は10個のB6植菌実生の
無細胞抽出液の一部を同量のリゾピンデヒドロゲナーゼ
反応培地で15時間インキュベートして生産した生産物を
含み、レーン３は合成オクトピンを含み、レーン４は時
間零点で10個の食塩水接種実生の無細胞抽出液を同量の
リゾピンデヒドロゲネーゼ反応培地に加えて作成した生
産物を含み、レーン５は10個の食塩水接種実生の無細胞
抽出液の一部を同量のリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培
地で15時間インキュベートして作成した生産物を含み、
レーン６は合成ノパリンを含む。 第2A図はオクトピン生産がB6植菌とうもろこし実生の
無細胞抽出液によって引き起こされるが（レーン２）、
食塩水コントロールでは引き起こされない（レーン５）
ことを示している。さらに、フェナントレンキノリン螢
光の増加で測定される、生産されたオクトピンの量はイ
ンキュベーションの時間に比例して増加する。時間零点
ではオクトピンは検出されないのに（レーン１）、15時
間のインキュベーションの後では明らかに存在している
（レーン２）。このような結果は反応が酵素によって触
媒され、B6感染とうもろこし実生から抽出した酵素がリ
ゾピンデヒドロゲナーゼであるという提案と一致する。
形質転換された植物組織のみがオパイン合成遺伝子を発
現することが知られているので、これらの結果はとうも
ろこし実生がvir+A.テュメファシエンスB6株の感染で形
質転換されたとする提案とも一致する。 2. 基質特異性の検定 リゾピデヒドロゲナーゼはオクトピンの合成を触媒す
るが、ノパリンの合成は触媒しない。実生抽出液をノパ
リンデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出に許容される試薬
を含有する反応培地に加えることによって得た生産物の
電気泳動の結果を第2B図に示す。ノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地は0.2Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.
0）中に溶解した60mM L−アルギニン、60mMα−ケトグ
ルタレート及び16mM NADHよりなる。α−ケトグルタレ
ートはノパリンデヒドロゲナーゼによってのみ基質とし
て用いられる。第2B図のレーン１〜６は第2A図のレーン
１〜６と反応培地がノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地
であることを除き同じである。第2B図はB6株を植菌した
実生の無細胞抽出液はアルギニンとの縮合反応でα−ケ
トグルタレートを用いてノパリンを生産することができ
ないことを示している。この基質特異性はB6株によって
形質転換された実性によって生産された酵素のリゾピン
デヒドロゲナーゼとしての同定を確認するものである。 3. 形質転換効率 この問題に対処するために、単一実性の検定を行い、
オクトパンを生産した単一実性の無細胞抽出液の数を決
定した。結果を第3A図に示すが、そこですべてのレーン
は単一B6植菌実生からの無細胞抽出液をリゾピンデヒド
ロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得た生
産物を含有する。第3A図に示されるごとく、10のレーン
のうち８つはフェナントレンキノンをつけ、オクトピン
標品と共に移動するスポットを有している。すなわち、
この実験での形質転換効率は80％であった。 4. コントロール 生産されたオクトピンがある第２の及び興味のないで
きごとの結果であったという可能性を除外するために、
いくつかの追加のコントロールを用いた。第4A図に示す
ごとく、上記Ａ部に記述したようにして48時間培養した
B6の懸濁液の無細胞超音波処理液の電気泳動は、蓄積し
たオクトピンを記していない（レーン１及び２）。さら
に、これらの超音波処理液をリゾピンデヒドロゲナーゼ
反応培地と混合して４時間インキュベートしたとき、リ
ゾピンデヒドロゲナーゼ活性は検出されなかった。第4B
図、レーン１、２及び３参照（そこではこのインキュベ
ーションの生産物が電気泳動された）。かくのごとく、
リゾピンデヒドロゲナーゼ活性は48時間細菌培養物中に
見い出されない。又、リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培
地単独はオクトピンを含有していなかった。第4B図は、
レーン４参照（そこではこの反応培地単独が電気泳動さ
れた）。同様にこのデヒドロゲナーゼが未感染とうもろ
こし実生中に存在するという証拠は見い出されていな
い。第4C図参照（該図は電気泳動図であり、そこでレー
ン１〜５は未感染単一実生の無細胞抽出液をリゾピンデ
ヒドロゲナーゼ反応培地で４時間インキュベートして得
た生産物を含有している）。これらの結果はB6植菌実生
の無細胞抽出液中におけるリゾピンデヒドロゲナーゼ活
性の存在が実生の形質転換によるものであり、ある第２
の又は興味のないできごとによるものでないことを確認
している。 実施例２ A.微生物の調製： A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーをYEBに接種
し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6について
記載したようにしてインキュベートした。C58菌株はA.
ツメファシエンスの標準野外タイプの菌株である。この
菌株はvir+であり適当な植物宿主中でノパリンデヒドロ
ゲナーゼの産生をコードする。この菌株はイリノイ州エ
バンストンのノースウエスタン大学のジェムス（Jame
s）氏およびバーバラ リッピンコット氏（Barbara Lip
pincott）からあるいはカルホルニア州デービスのカル
ホルニア大学植物病理学部門のクラレンス カド（Clar
ence Kado）氏より入手した。この菌株はデピッカー（D
epicker）等の“プラスミド（Plasmid）、３、193（198
0）”およびカオ（Kao）等の“Molec.Gen.Genet.,188、
425（1982）”に記載されている。菌株C58はまたATCCに
寄託してあり、寄託番号3397Dが与えられている。 B.とうもろこしの形質転換： とうもろこしの近交黄色イオチーフ（Jochief）系を
滅菌し、発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢ
およびＣに記載したようにして７〜14日間インキュベー
トしたが、とうもろこし実生（seedlings）は菌株B6で
はなくて菌株C58を接種した。 C.アッセイ： 1. 実生中の酵素活性のアッセイ： ７〜14日インキュベーション期間の終了時に、細胞を
含まない抽出物（エキス）、即ち、無細胞抽出物を調製
し実施例１、パートＤに記載したようにして酵素活性を
アッセイした。使用した反応培地はノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性をアッセイするように意図したものであっ
た。この培地は実施例１、パートＤで示したように、0.
2Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH＝7.0）中に溶解させた6
0mMのＬ−アルギニン、60mMのα−ケトグルタル酸およ
び16mMのNAOHとからなっていた。 結果は第2B図に示す。第2B図のレーン８は時間零で10
回Ｃ−58接種実生無細胞抽出物部分を等容量のノパリン
デヒドロゲナーゼ反応培地と混合することによって生成
させた生成物を含み、レーン７は10回Ｃ−58接種実生の
無細胞抽出物の部分を等容量のノパリンデヒドロゲナー
ゼ反応培地で15時間インキュベートすることによって生
じた生成物を含む。即ち、第2B図はノパリンがC58接種
とうもろこし実生の無細胞抽出物によって産生されるが
（レーン７）、そのような産生は塩水対照では生じない
（レーン５）ことを示している。さらに、フェナンスレ
ンキノン螢光の増加によって測定したときの産生ノパリ
ン量はインキュベーション時間に比例して増大するが、
時間零ではノパリンは反応混合物中に検出されず（レー
ン８）、15時間のインキュベーション後に明らかに存在
し（レーン８）、かかる結果は反応が酵素触媒されかつ
C58接種実生から抽出した酵素はノパリンデヒドロゲナ
ーゼであるとい命題に従っている。形質転換植物組成の
みがオパインシンターゼ遺伝子を発現することは知られ
ているので、これらの結果はまたとうもろこし実生がvi
r+A.ツメファシエンス菌株C58による感染によって形質
転換されるという命題によっている。 2. ピロノパインアッセイ： C58により形質転換した実生からの抽出物によるノパ
リンの合成は電気泳動性よりはむしろ他の基準によって
確認される。ノパリンを水によるペーパークロマトグロ
ラムにより溶出し、減圧により蒸発させて容量を減じ等
容量のホット（100℃）2M酢酸と１時間反応させると、
ピロノパリンが生成する。この転換反応はノパリン用の
検証であり他のオパリン用ではない。 第2C図において、レーン１は合成ノパリンを上述した
ようにホット2M酢酸で処理することによって合成ノパリ
ンから生成させたピロノパリンであり、レーン２は合成
ノパリン（そのいく分かが同時にピロノパリンに転換す
る）であり、レーン３は10回Ｃ−58接種の実生からの無
細胞抽出物の部分を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ
反応培地で15時間インキュベートすることによって産生
させた生成物であり、レーン４はこの生成物を上述のよ
うにしてホット2M酢酸によって処理したものである。明
らかに、C58接種実生からの無細胞抽出物をノパリンデ
ヒドロゲナーゼ反応混合物でインキュベートすることに
よって産生させた生成物（レーン３）はピロノパリン
（レーン４）に完全に転換されており、C58接種実生が
ノパリンデヒドロゲナーゼを産生していることが確認さ
れる。 3. ノパリンの異化作用： 最後に、ノパリンをC58でインキュベートしノパリン
がC58の唯一のエネルギー源として作用する場合には、
この微生物はノパリンを分解させるにつれて増殖するで
あろう。しかしながら、ノパリンの唯一のエネルギー源
として含む培地で増殖させたB6はノパリンを破壊せず分
解しないであろう。何故ならば、B6はノパリンの異化作
用に必要な特異性オパインオキシダーゼを欠如している
からである。 この原理に基づくアッセイを用いてC58接種実生の無
細胞抽出物により産生された生成物のノパリン同一性を
確認した。このアッセイの結果は第2D図に示しており、
レーン１は合成ノパリンを含み、レーン２は10回C58接
種実生の無細胞抽出物の等容量のノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地で15時間インキュベートすることによって
産生させた生成物であって、ピロノパリンアッセイに関
して上述したようにして電気泳動させ、水で溶出し、蒸
発し、菌株B6で24時間インキュベートさせたものを含
み、レーン３は10回CP58接種実生の無細胞抽出物の部分
を等容量のノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で15時間
インキュベートすることによって産生させた生成物であ
って、電気泳動させ、溶出しさらに菌株C58で24時間イ
ンキュベートさせたものを示す。C58接種実生の無細胞
抽出物により産生させた生成物は菌株C58により消滅し
た（レーン３）が、菌株B6によって消滅せず（レーン
２）、生成物がノパリであることを確認した。 4. 形質転換の効率： A.ツメファシエンス菌株C58を用いた近交黄色イオチ
ーフとうもろこしの形質転換の効率を試験した。結果は
第3C図に示されており、10ヶのレーンすべてが１回C58
接種実生からの無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナー
ゼ反応培地で６時間インキュベートすることによって産
生した生成物を含んでいる。明らかなように、10の実生
のうちの９つが形質転換されていた。追加の１回接種実
生のアッセイをB6またはC58のいずれかで形質転換させ
た実生を用いて行った。菌株B6またはC58のいずれかで
１回接種し実生の合計150回のアッセイうち、60％が形
質転換されていた。 5. 対照（コントロール）： 産生したノパリンがある二次的な興味のない事実の結
果である可能性を排除するために、いくつかの対照試験
を行った。第4A図に示すように、実２のパートＡで記載
したようにして48時間培養したC58の懸濁液の無細胞音
波処理物の電気泳動は何らの含有ノパリンを示さなかっ
た（レーン３および４）。さらに、これらの音波処理物
をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地と混合し25℃で24
時間インキュベートさせたときも、ノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性は検出できなかった。このインキュベーショ
ンの生成物を電気泳動させている第4B図のレーン６およ
び７を参照されたい。即ち、ノパリンデヒドロゲナーゼ
活性は48時間後の微生物培養物中で見い出されなかっ
た。また、ノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地単独も何
らのノパリンを含んでなかった。この反応培地単位を電
気泳動させている第4B図レーン５を参照されたい。同様
に、未感染とうもろこし実生中にもこのデヒドロゲナー
ゼの証拠は見い出せなかった。レーン６〜10の未感染単
実生の無細胞抽出物を６時間ノパリンデヒドロゲナーゼ
反応培地でインキュベートすることによって産生させた
生成物を含んでいる電気泳動図を示す第4C図を参照され
たい。これらの結果は、C58接種実生の無細胞抽出物中
のノパリンデヒドロゲナーゼ活性が上記実生の形質転換
に基づくものであり何らかの二次的な興味のない事実に
よるものでないことを明確にしている。 実施例３ A.とうもろこしの形質転換： 菌株C58を実施例２、パートＡに記載したようにして
培養し、近交系黄色イオチーフとうもろこしを実施例
２、パートＢで記載したようにして滅菌し、発芽させ、
接種し、インキュベートさせた。７日間のインキュベー
ション後に、感染実生を鉢植え土壌を含む鉢に植付け
た。 B.アッセイ： 1. 萌芽系の葉の中の酵素活性のアッセイ： 植付け３週間後に、３本の別々の植付物からの萌芽系
（embryonic origin）の３枚の葉をノパリンデヒドロゲ
ナーゼ活性の存在を測定するためにアッセイした。アッ
セイ用に選定した葉はまだ大きくなってない植付物の幹
からの第１葉であった。各萌芽葉は接種時に各実生中に
存在する分化構造に由来するが、これらの分化構造は接
種領域には存在しない。 アッセイを行うために、３枚の各萌芽葉をそれぞれト
リス−HClバッファー中で均質化し、遠心して実施例
２、パートＣにおいて実生について記載したようにして
酵素活性をアッセイした。３枚の各萌芽葉の無細胞抽出
物をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地で24時間インキ
ュベートすることによって産生した生成物の電気泳動の
結果は第5A図に示され、この図においては、レーン１、
２および３がこのインキュベーションの生成物を含んで
いる。第5A図から明らかなように、各萌芽葉の無細胞抽
出物はノパリンデヒドロゲナーゼを含むものはなくこれ
らの葉は上記の接種手順によっては形質転換されてない
ことを示していた。 2. 分裂系の葉中の酵素活性のアッセイ： 分裂組織に由来する葉（萌芽葉以外のすべての葉）
を、実生の植え付け７週間後に、ノパリンデヒドロゲナ
ーゼの存在についてアッセイした。分裂組織は分裂して
器官および他の分化組織を形成できる急速分裂生の未分
化小細胞からなる組織である。葉に分化する分裂組織は
接種領域に存在している。 アッセイを行うために、分裂組織由来の葉から一部を
切り取り、各葉から切り取った部分をトリス−HClバッ
ファー中で一緒に均質化し、遠心し、実施例２のパート
Ｃで実生について記載したようにして酵素活性について
アッセイした。アッセイに用いた各葉の部分は第5B図の
数字２および３で示される。数字３で示される部分は線
６および７に沿って切り取った。線７は葉の中央脈と一
致している。部分３は通常植物に結合している葉の基幹
部に位置する。この葉の基幹部は葉の成長端であり、こ
の領域は葉の最も新しい細胞を含んでいる。数字２で示
される部分は中央脈４に水平である線５に沿って切るこ
とによって切り取った。部分２、２は葉の先端部にあ
り、葉の最も古い細胞を含んでいる。各部分２および３
は葉の表面積の約1/6を占める。分裂組織系の４枚の葉
の上記部分の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ
反応培地でインキュベーションすることによって産生し
た生産物の電気泳動の結果を第5C図に示す。第5C図にお
いて、レーン１はノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を
含み、レーン２〜５は葉の無細胞抽出物をノパリンデヒ
ドロゲナーゼ培地で12時間インキュベートすることによ
って産生した生成物を含んでいる。図示するように、４
枚の葉のうちの３枚の無細胞抽出物がノパリンを産生し
これらはノパリンデヒドロゲナーゼ活性を含むことを示
していた。これらの葉は細胞分裂および分化による分裂
組織に由来するので、これらの結果は実生の接種領域中
の細胞がとうもろこし細胞の次の世代に対してノパリン
デヒドロゲナーゼを合成する能力を促進できることを示
してる。即ち、これらの結果は接種した領域の細胞およ
びこれらの細胞に由来する細胞の形質転換が起っている
ことを示している。 3. 花粉中の酵素活性のアッセイ： 実生植付け60日後に、２本の植付物の花粉サンプルを
それぞれノパリンデヒドロゲナーゼの存在についてアッ
セイした。アッセイを行うために、約５〜10×105個の
花粉粒子を含む0.5〜1.0mlの花粉をトリス−HClバッフ
ァー中で均質化し、遠心し実施例２、パートＣで実生に
ついて記載したようにして酵素活性をアッセイした。２
本の植付け物からの花粉の無細胞抽出物をノパリンデヒ
ドロゲナーゼ反応培地で12時間インキュベートすること
によって産生した生成物の電気泳動の結果は第5D図示に
示しており、レーン２と３がこのインキュベーションの
生成物を含んでおり、レーン１はノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地を含んでいる。この図から分るとおり、２
本の植付け物からの花粉はノパリンデヒドロゲナーゼ活
性を含んでいた。花粉は細胞分裂および分化により頂端
分裂組織から誘導されるので、これらの結果は、上記の
分裂組織系の葉の結果同様に、形質転換が起っているこ
とを示している。 4. 形質転換花粉からの実生中の酵素活性のアッセイ： 上記パートＢの３で示した２本の形質転換植付け物か
らの花粉を用いて未感染黄色イオチーフとうもろこし種
から成長した植付け物の穂に受精させた。この交配の結
果として受精植付け物により育成したF1種実を収穫し、
発芽させ、実施例１のパートＢおよびＣで記載したよう
にして（ただし、実生は接種させなかった）、インキュ
ベートした。７〜14日のインキュベーション後に、実生
を実施例２のパートＣに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセイした。これらの実生の無細胞抽出物はノ
パリンを産生することが分かり、この実生のF1世代が形
質転換されていることを示している。 5. 形質転換花粉からの作物から採取した萌芽系の葉の
酵素活性のアッセイ： 本実施例のパートＢの４で記載した交配により生じた
種実を収穫し、発芽させ、実生を接種しないことを除い
ては実施例１のパートＢおよびＣで記載したようにして
インキュベートする。７〜14日のインキュベーション後
に、実生を本実施例のパートＡで記載したようにして植
え付ける。植付け３週間後に、萌芽葉を本実施例のパー
トＢの１で記載したようにしてノパリンデヒドロゲナー
ゼ活性についてアッセイし、この萌芽葉の無細胞抽出物
はノパリンを産生し、形質転換されていることを示して
いる。 実施例４ A.とうもろこしの形質転換： 黄色イオチーフとうもろこしを滅菌し、発芽させ、接
種し、さらに実施例１のパートＢおよびＣで記載したよ
うにして７〜14日間インキュベートした。ただし、とう
もろこし実生の別々のグループをA.ツメファシエンスの
菌株A348、菌株JK195または菌株238MXのいずれかで接種
した。 A348菌株は菌株A6NCからの広域宿主範囲のプラスミド
pTiA6NCを担持する。この菌株はvir+であり適当な植物
ホスト中でリソパインデヒドロゲナーゼの産生をコード
する。菌株A6NCとプラスミドpTiA6NCはシアキイ（Sciak
y）等の“プラスミド（Plasmid）、１、238（1977）”
に記載されている。使用したA348はワシントン州シアト
ルのワシントン大学の微生物学および免疫学部門のユー
ゲン ネスター（Eugene Nester）氏より入手した。こ
の菌株は実施例１のパートＡで菌株B6について記載した
ようにして培養した。 菌株JK195と238MXは、それそれ、臨界的なvir領域に
突然変異を有しておりvir-である。従って、これらはそ
のそれぞれの宿主へTiプラスミドの必要な部分を運ぶこ
とができない。結果として、これらの微生物を接種した
材料から製せられた植物抽出物は適当な反応培地に加え
たとき何らのオパインも産生することは期待されないで
あろう。 238MXは背景的および起源的にはA348菌株と同じであ
るが、vir領域をvir-とするvir領域に挿入された微生物
トランスポズンTn3を有する。菌株238MXはユーゲン ネ
スター氏（前出）から入手した。この菌株は実施例１の
パートＡで菌株B6について記載したようにしてインキュ
ベートし100μg/mlのカルベニシリンを含むYEB上で用い
た。 JK195は菌株はC58由来のvir-ミュータントである。こ
の菌株はvir領域の相補群VI中に挿入された微生物トラ
ンスポズンTn5を有する。菌株JK195の詳細な記載はカオ
（Kao）等の“Mol.Gen.Genet.,188、425（1982）”およ
びランギスト（Lundguist）等の“Mol.Gen.Genet.,193,
1（1984）”に見い出し得る。使用したJK195はクラーレ
ンス カオ氏（前出）より入手した。また、この菌株は
実施例１のパートＡで記載したようにしてインキュベー
トし、50μg/mlのリファムピシンを含むYEBで使用し
た。 B.アッセイ： 1. 実生中の酵素活性のアッセイ： 第3B図および第3D図に示すように、238MX菌株またはJ
K195菌株を接種した実生の無植細胞抽出物はオパイン類
を産生しない。第3B図においては、レーン６〜10が238M
X接種単実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナ
ーゼ反応媒質で４時間インキュベートすることによって
生じた生成物を含む。明らかに、オクトパインが無細胞
抽出物によって合成されないので実生は何ら形質転換さ
れない。第3D図においては、10のレーンすべてがJ195接
種単実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地で６時間インキュベートすることによって生じた
生成物を含んでいる。こゝでも、ノパリンが産生されな
いので実生はどれも形成転換されてない。 しかしながら、A348株は形質転換に関して適格性があ
る。第3B図においては、レーン１〜５はA348接種単実生
の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地
で４時間インキュベートすることによって生じた生成物
を含んでいる。明らかに、リソパインデヒドロゲナーゼ
がA348を接種した５つの単実生のうちの１つの無細胞抽
出物中に見出されて実生が形質転換されていることを示
している。 即ち、Ｔ−DNAを転写できるvir+A.ツメファシエンス
菌株のみがとうもろこし実生を形質転換している。vir
領域に突然変異を有し従って転写マイナスであるものは
感染植物から生成させた抽出物中のオパインシンターゼ
活性を刺激しない。 実施例５ A.ツメファシエンス菌株T37の単コロニーをYEB中に接
種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6につい
て記載したようにしてインキュベートした。 T37菌株はA.ツメファシエンスの標準野外タイプ菌株
である。この菌株はvir+であり、適当な植物ホスト中で
ノパリンデヒドロゲナーゼの産性をコードする。T37は
ワシントン州マジソンのワシントン大学植物生理学部門
のジョン ケンプ（John Kemp）氏から入手したが、オ
ハイオ州トレンドのトレンド大学生理学部門のアンC.F.
グレーブス（Anne C.F.Graves）氏からも入手できる。
この菌株はチューゲオン（Turgeon）等の“PNAS、73、3
562（1976）”およびシアキイ（Sciaky）等の“Slasmi
d,1,238（1978）”に記載されている。 近交黄色イオチーフ系とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、さらに実施例１のパートＢおよびＣで記載し
たようにして７〜14日間インキュベートした。ただし、
とうもろこし実生は菌株B6ではなく菌株T37で接種し
た。 ７〜14日インキュベーション期間終了時に、実生を実
施例２のパートＣで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。この手順により、T37接種とうもろこ
し実生の細胞なし抽出物によるノパリン産生が示され実
生は形質転換されていることを示した。 実施例６ A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーをYEB中に接
種し、この微生物を実施例２のパートＡに記載したよう
にしてインキュベートした。とうもろこしの近交PA91株
の種実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１
のパートＢとＣで近交黄色イオチーフ株について記載し
たようにして７〜14日間インキュベートした。PA91株は
商業的に入手できる標準のとうもろこし近交株である。
この株はインデアナ州グリーンビルのイーラル リリー
社のジーン ロバーツ（Jean Roberts）氏より入手し
た。 ７〜14日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例２のパートＤで記載したようにしてアッセイし
た。第７図に示すように、無細胞抽出物によるノパリン
産生が示されPA91株とうもろこしは形質転換されている
ことを示された。第６図においては、レーン１〜10が一
回C58接種実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地で６時間インキュベートすることにより生
じた生成物を含んでいる。明らかに、無細胞抽出物の10
すべてがノパリンを産生し実生が形質転換されているこ
とを示していた。 実施例７ A.ツメファシエンス菌株B6の単コロニーを酵母エキス
ブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡで
記載したようにしてインキュベートした。近交黄色イオ
チーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、発芽させ、接種
し、さらに実施例１のパートＢとＣで記載したようにし
て７〜14日間インキュベートしたが、種実は次のように
して発芽させた。滅菌後、種実を約12時間滅菌蒸留水に
浸した。次いで、種実を滅菌ペトリ皿中の滅菌湿潤ワッ
トマンNo.3紙上でインキュベートしたが、浸漬した種実
は浸漬しない種実よりも短時間で発芽するので1.5〜2.0
日間インキュベートさせたのみであった。 ７〜14日間のインキュベーション期間の終了時点で、
実生を実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活
性についてアッセイした。この手順により、感染実生の
無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ実生が
形質転換されていることを示していた。 実施例８ A.ツメファシエンス菌株LBA4013の単コロニーをYEB中
に接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6に
ついて記載したようにしてインキュベートした。LBA401
3菌株はA.ツメファシエンス菌株Ach5由来の変異株であ
る。LBA4013はvir+である野外タイプTiプラスミドpTiAc
h5を含んでおり、またLBA4013は適当な植物宿主中でリ
ソパインデヒドロゲナーゼの産生をコードする。LBA401
3はインデアナ州インデアナポリスのイーライリリー社
のクレッグワルドロン（Clegg Wardron）氏より入手し
た。この菌株はマートン（Marton）等の“Mature,277、
129（1979）”に記載されている。 近交黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記
載したようにして７〜14日間インキュベートしたが、と
うもろこし実生は菌株B6ではなく菌株LBA4013を接種し
た。 ７〜14日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例１にパートＤに記載したようにして酵素活性に
ついてアッセした。この手順によりLAB4013形質転換実
生の無細胞抽出物によるオクトパイン産生が認められ、
実生は形質転換していることが示されていた。 実施例９ A.微生物の調製： A.ツメファシエンス菌株CA19の単コロニーをYEB中に
接種し、この微生物を実施例１のパートＡで菌株B6につ
いて記載したようにしてインキュベートした。CA19菌株
は菌株LBA4013に由来し、実施例８で記載したようにvir
+であるpTiA ch5を含んでおり、また菌株CA19は適当な
植物宿主中でリソパインデヒドロゲナーゼの産生をコー
ドする。 菌株CA19はまたミクロ−TiプラスミドpCEL44を含んで
いる。ミクロプラスミドpCEL44はオクトパインシンター
ゼ遺伝子の５′プロモーターと会合アミノ末端領域をコ
ードしている配列およびオクトパインシンターゼ遺伝子
の３′末端配列間に挿入されたハイグロマイシンホスホ
トランスフェラーゼ（aph IV）をコードする遺伝子から
なる構築体である。この構築体は広域宿主範囲のベクタ
ーpKT210中のＴ−DNAのよい広いフラグメント間に集ま
っている。ミクロプラスミドpCEL44は植物細胞を形質転
換しハイグロマイシン耐性とすることができる。 菌株CA19は次の如くして調製する。 1. エシェリキア コリ（Escherichia coli） RR1ΔM15/pCEL30の培養とプラミドpCEL30の単離： プラミドpCEL30はＴ−DNAの右手方向に広い配列およ
びプラスミドpTiA66由来のオクトパインシンターゼ（oc
s）の５′末端からなる。特異なBgl IIサイトを含むリ
ンカーをocs遺伝子の11番目のコドンに結合している。
リンカーにはプラスミドpTiC58のノパリンシンターゼ遺
伝子の未端化およびポリアデニル化信号が結合されてい
る。これらの配列にはプラスミドpTiA66由来のＴ−DNA
の左手方向に広い配列を含む配列が結合している。プラ
スミドpCEL30の制限サイトと機能マップは第８図に示さ
れている。 プラスミドpCEL30はエシエリキアコリK12RR1ΔM15/pC
EL30から都合よく単離される。E.コリRR1ΔM15/pCEL30
はイリノイ州ペオリア61604のノーサン リージョナル
リサーチ ラボラトリー（National Regional Resear
ch Laboratoyr:NRRL）に寄託されており、寄託番号NRRL
B−15915を有している。 単離は次のようにして行う。E.コリRR1ΔM15/pCEL30
を50mg/mlのアンピシリンを含むＬ培地（10g/のカゼ
イン水解物、5g/の酵母抽出物、5g/のNaCl、1g/
のグルコース、pH7.4）の750ml中で通常の微生物手法に
より増殖させる。この培養株は激しく振とうさせながら
37℃で24時間インキュベートさせた後に収穫する。 培養株を遠心し、細胞ペレットを50mlの新に調製した
溶解バッファー（50mMのトリスーHCl、pH8.0、10mM EDT
A、9mg/mlのグルコース、2mg/のリソザイム）に再懸
濁させる。45分間の氷上インキュベーションの後、懸濁
液を0.2M NaOHと１％のSDSである溶液100mlと混合す
る。続いて懸濁液をさらに５分間氷上に保持する。3Mの
酢酸ナトリウムにさらに90mlを加え、混合物をさらに追
加の60分間氷上に保持する。 細胞片を遠心により除去し、上清を500mlのエタノー
ルと混合する。−20℃で２時間後、核酸を遠心によりペ
レット化し、10mMのトリス−HCl、pH8、10mM EDTAの90m
l中に再懸濁させる。 核酸溶液を90gmの塩化セシウム、および10mg/mlの臭
化エチジウム含有溶液0.9mlと混合する。この混合物を
次いで40,000rpmで24時間遠心してプラスミドDNAを精製
する。プラスミドDNAバンドを回収し次いで40,000rpmで
16時間遠心する。プラスミドDNAバンドを再び回収し通
常の方法により塩化セシウムと臭化エチジウムを除去す
る。次にプラスミドDNAバンドを90g/の酢酸アンモニ
ウムを含む２容量のエタノールで沈澱させる。ペレット
化DNAをTEバッファー（10mMトリス−HCl、pH8、1mM EDT
A）に0.2mg/mlの濃度で溶解させる。 2. E.コリJA221/pOW20の培養およびプラスミドpOW20の
単離： E.コリJA221/pOW20を本実施例のパートＡの１でE.コ
リRR1AΔM15/pCEL30について記載したようにして増殖さ
せ、プラスミドpOW20を本実施例のパートＡの１でプラ
スミドpCEL30について記載したようにして調製する。 3. E.コリRR1ΔM15/pCEL40の構築： ５μｇのプラスミドpCEL30DNAを酵素製造業者により
推奨される組成の１反50μ応混合物中の50単位のBal
II制限酵素によって消化する。制限酵素および他の酵素
は次の供給者より容易に入手できる： ベセスダ リサーチ、ラボラトリーズ、インコーボレ
ッド （メイランド州 ロックビル20850、ボックス601
0） ベーリンガー マンハイム ビオケミカルズ （インデアナ州 インデアナポリス 46250、P.D.
ボックス50816） ニューイングランド バイオ ラボラトリーズ、イン
コーポレッド （マサチュセッツ州、ベバリー01915、32トーゼル
ロード） 消化は37℃、90分で進行せしめる。 反応混合物を先ず0.5Mトリス−HCl、pH8、1mMのEDTA
の8.75μと混合し、次いで1.25単位の子牛腸ホスファ
ターゼ（ベーリンガーマンハイム社より購入できる）と
混合し、37℃で15分間インキュベートする。混合物を次
に緩衝化フェノールで次いでエーテルで抽出し、酢酸ア
ンモニウム含有エタノール２容量で沈澱させる。−70℃
で30分間後に、DNAをペレット化しTEバッファー中に10
μg/mlの濃度で再溶解する。 約20μｇのプラスミドpOW20DNAを制限酵素BamH IとBg
l IIにより酵素製造業者が推奨する手順に従って消化し
aph IV遺伝子を得る。aph IV遺伝子はハイグロマイシン
に耐性の遺伝子を含む植物を形成するE.コリ遺伝子であ
る。 この消化により得たDNAフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動の通常方法により分画しアガロースゲル中に
挿入したNA−45 DEAE紙（ニューハンプシャー州03431の
キーンのシュレイチャー アンド シェウェル社）上に
電気泳動中に包括させることによって単離した。DNAを
上記の紙から上記紙を５秒間十分量の高塩バッファー
（1.0M NaCl、0.1mM EDTA、および20mMトリス、pH8.0）
でスピニングすることにより溶出して紙をミクロ遠心機
中に回収する。この紙を55〜60℃で10〜45分間必要に応
じて渦巻かせることによってインキュベートする。バッ
ファーを除去し、紙を約50μのバッファーで洗浄す
る。DNAを先ずフェノールで次いでエーテルで抽出し、T
Eバッファー中に約25μg/mlの濃度で再懸濁させる。 10ngのホスホターゼ処理Bal II切断プラスミドpCEL30
を15μの0.8ユニットT4DNAリガーゼ含有リガーゼバッ
ファー（50mMトリス−HCl、pH7.6、10mM MgCl2、10mM D
TT、および1mM ATp）中で50ngの精製〜1.3kbBam−Bal I
Iフラグメントと混合する。この混合物を一夜15℃でイ
ンキュベートする。 この連結反応混合物を15μの滅菌60mM CaCl2溶液と
混合する。次に−70℃で30mM CaCl2、15％グリセロール
中で20倍濃縮で貯蔵した適格E.コリRR1ΔM15細胞の懸濁
液70μを加える。氷上で60分経過後、形質転換混合物
を42℃で２分間加熱処理し、次いで0.5mlL培地で37℃、
90分間インキュベートする。 混合物のサンプルをアンピシリンを50mg/で含むＬ
培地上に拡散させ寒天により15g/で固化する。これら
のサンプルを次いで一夜37℃でインキュベートして形質
転換細胞からのコロニーの増殖を行う。 形質転換により得られるコロニーをアンピシリンを50
mg/で含む5mlのＬ培地中に接種し、37℃で一夜増殖さ
せる。プラスミドDNAは、これら培養物の1mlサンプルか
ら、ホルメス（Holmes）とキーグレイ（Quigley）の“A
nalytical Biochemistyr,114、193（1981）”の方法に
より調製し、50μのTEバッファー中に再溶解させる。 4. ミクロTiプラスミドpCEL44の構築： プラスミドpCEL40はアグロバクテリウム中の複製たり
得ないので、プラスミドpCEL40のミクロＴ−DNAを先ずE
coRIフラグメントとして広域宿主範囲のベクターpKT210
中に転写した。この広域宿主範囲ベクターはカルホルニ
ア州（94305）のパロアルトのスタンフオード大学のプ
ラスミドリファレンスセンターより入手できる。 ５μｇのプラスミドpKT210を酵素製造業者の推奨する
組成の150μの反応液中でEcoRI制限酵素の50単位で消
化する。37℃で90分後に、反応物を本実施例のパートＡ
の３で記載したような子牛腸ホスファターゼで処理しTE
バッファ中に10μg/mlの濃度に溶解する。 本実施例のパートＡの３で記載したようにして増殖さ
せたプラスミドpCEL40DNA調製物15μを10単位のEcoRI
制限酵素で20μ反応液中で37℃、90分間消化し、次い
でフェノールで抽出し、エーテルで抽出する。消化した
DANを酢酸アンモニウム含有エタノールの２容量で−20
℃で沈澱させ、20μのTEバッファー中に再溶解する。 10ngのホスファターゼ処理EcoRI切断pKT210を本実施
例をパートＡの３で記載したようにして５μのEcoRI
切断pCEL40と連結反応させて本実施例のパートＡの３で
記載したようにしてE.コリRR1ΔM15に形質転換する。 pCEL44含有の形質転換細胞をその能力により用いてク
ロラムフェニコールを10mg/含む固化Ｌ培地上で繁殖
させる。pCEL44の制限サイトおよび機能マップは第９図
に示される。 5. 菌株CA19を形成するためのpCEL44のA.ツメファシエ
ンスLBA4013への接合： RR1ΔM15/pCEL44とE.コリpRK2013を固化Ｌ培地上で37
℃、一夜増殖させる。A.ツメファシエンスLBA4013は固
化Ｌ倍地上で28℃、２日間増殖させる。 E.コリK12 RR1ΔM15/pCEL44の１個のループ、E.コリ
pRK2013の１個のループおよびA.ツメファシエンスLBA40
13の１個のループとを1mlの30mM硫酸マグネシウム溶液
中に混合する。次に、この混合物の１滴を固化TY培地
（5g/のカゼイン水解物、5g/の酵母抽出物、15g/
の寒天）上に乗せ20℃で一夜インキュベートする。 上記細菌増殖物を3mlの10mM硫酸マグネシウム溶液に
再懸濁し、0.1mlの階階希釈サンプルを100mg/のナリ
ジキシン酸と2mg/のクロラムフェニルコールとを含む
固化TY培地上に拡散し28℃でインキュベートする。 接合完了体は２〜４日間増殖後個々のコロニーに生長
する。これらのコロニーを100mg/のナリシキシン酸と
2m/のクロラムフェニコールを含む液体TY培地25ml中
に１回接種しさらに２日間振とうさせながら28℃でイン
キュベートする。接合完了のプラスミド含有量を次いで
カッセ（Casse）等の方法（Journal of General Microb
iology,113、229−242、1979）によりチェックし、野外
タイプpTiAch5プラスミドとpCEL44プラスミドを含む菌
株CA19を単離する。 本発明の方法を実施するのに用いるCA19はインジアナ
州インジアナポリスのイライ リリー社のクレック ウ
ォルトロン氏より入手した。菌株CA19の調製はウォルト
ロン等の“Plant Molec.Bjol.,5、103（1985）”にも記
載されており、その記載は本明細書に参考として引用す
る。 B.とうもろこしの形質転換： 近交黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、接種しさらに実施例１のパートＢとＣで記載
したようにして７〜14日間インキュベートしたが、とう
もろこし実生は菌株B6でなく菌株CA19で接種した。 C.アッセイ： 1. 実生のリソパインデヒドロゲナーゼ活性のアッセ
イ： ７〜14日間インキュベーション期間終了時に、実生を
実施例１のパートＤに記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。結果は第６図に示すとおりであり、
レーン１〜10は一回CA19接種実生の無細胞抽出物をリソ
パインヒドロキゲナーゼで４時間インキュベートするこ
とによって生じた生成物を含んでいる。それより明らか
なように、１回接種CA19とうもろこし実生の無細胞抽出
物10のうちの９つにおいてオクトパイン産生が認めら
れ、実生がリソパインデヒドロゲナーゼを含有して形質
転換されていることが示された。 2. 実生のハイグロマイシン耐性のアッセイ： 菌株CA19を接種したいくつかの実生を接種後３〜４日
間のみインキュベートし、その時点で次のようにしてハ
イグロマイシン耐性をアッセイした。実生を内乳および
胚盤（第1A図および第1B図参照）から切り取り約3mmの
断面積に切断した。これらの断面切断物を各々200μg/m
lのカルベニシリン（シグマ）とバンコマイシン（リリ
ー）とを加えたダンカン培地（ダンカン等により“Plan
ts,165、322（1985）”中に記載されている）、または
各々200μg/mlのカルベニシリンとバンコマイシンを加
えたBN4培地〔ムラシージ（Mlrashige）およびスクーグ
（Skoog）の主要および微量塩（Physiol.Plant,15,473
（1962）に記載されている）、4mg/のオーキシンとし
ての2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、9g/のデフコバク
トアガー（DifcoBactoager）、および20g/のサクロー
ス〕上で暗中で25〜27℃で３週間培養し、さらに３週間
抗菌剤への通過を行った。 上記とうもろこし実生由来の組織培養のハイグロマイ
シンに対する応答性を試験するためには、全断面プラス
断面から生長した組織または100mgのカルスサンプルの
いずれかをファルコン1005ペトリ皿中の上記濃度のバン
コマイシンおよびカルベニシリンを加え約125μg/mlの
ハイグロマイシンＢ（リリー社）を含む50mlのダンカン
培地またはBN4培地上に乗せる。この試験は27℃での暗
中インキュベーション３週間後に増殖の観察チェックに
より読み取る。増殖中の培養物は淡色であり粒度の増大
を示している。この試験を用いて、正増殖表現型をCA19
接種実生由来の培養物から回収し、実性が異種ハイグロ
マイシン遺伝子により形質転換されていることを示す。 実施例10 A.除草剤グリホサイトに対する耐性を与える遺伝子を担
持するA.ツメファシエンス菌株の調製： 1.E.コリRR1Δ15/pCEL30の培養とプラスミドpCE30の単
離： E.コリRR1ΔM15/pCEL30を実施例９のパートＡの１で
記載したようにして増殖し、プラスミドpCEL30を実施例
９のパート１のＡで記載したようにして単離する。 2.プラスミドpCEL30のBgl II消化と子牛腸ホスファター
ゼによる処理： 5gのプラスミドpCEL30DNAを実施例９のパートＡの３
で記載したようにして消化し子牛腸ホスファターゼで処
理する。 3.グリホサイト耐性EPSPシンターゼ遺伝子の単離： グリホサイト耐性５−エノールピルボイルシキミ酸−
３リン酸シンターゼ遺伝子（GREPSPS遺伝子）をコード
する遺伝子をコマイ（Comai）等の“Nature,317、714
（1985）”およびスタルカー（Stalker）等の“J.Biol.
Chem.,260、4724（1985）”に記載されたようにして単
離する（これら文献の記載は参考として本明細書に引用
する）。この方法の最終工程において、プラスミドpPMG
34から切断されたBamHIのフラグメント中のGREPSPS遺伝
子をプラスミドpUC7にクローン化してプラスミドpPMG38
を得る。GREPSPS遺伝子はその後プラスミドpPMG38からE
coRIフラグメントとして切り取る。EcoR1フラグメント
は次いで適当な商業的に入手できる分子リンカーを用い
て修飾してBgl II消化pCEL30プラスミド上の特異的Bgl
IIサイトと連結反応できるようにまたEcoRIサイトを除
去できるようにする。 除草剤グリホサイト（Ｎ−ホスホノメチル−グリシ
ン）は雑草および作物種の両方を殺す広汎に使用される
広域スペクトル除草剤である。この除草剤は芳香族化合
物の生合成の代謝段階を抑制し、グリホサイトの細胞タ
ーゲットは５−エノールピルボイルシキミ酸−３−リン
酸シンターゼ（EPSPシンターゼ）であり、これはホスホ
エノールピルベイトとシキメートからの５−エノールピ
ルボイルシキミ酸３−リン酸の形成を触媒し、該シキミ
酸塩経路のこの段階の抑制が実際に細胞死をもたらして
いる。GREPSPS遺伝子はサルモネラ チフィリウム（Sal
monella typhimurium）のaro A部位の変異体対立遺伝子
であり、この遺伝子はEPSPシンターゼをコードし、セリ
ンのプロリンへの置換により該酵素のグリホサイトに対
する親和性を減少せしめる。 4.連結反応： 実施例９のパートＡの３で調製した10ngのホスファタ
ーゼ処理Bgl I切断プラスミドpCEL30を15μの0.8ユニ
ットT4DNAリガーゼ含有リガーゼバッファー中で50ngのG
REPSPS遺伝子（結合リンカーを含む）と混合する。混合
物を15℃で一夜インキュベートする。この連結反応混合
物を用いて実施例９のパートＡの３で記載したようにし
て適格E.コリRR1ΔM15細胞を形質転換する。 5. GREPSPS遺伝子を担持するミクローTiプラスミドの
構築： 実施例９のパートＡの３に記載したようなアンピシリ
ン含有Ｌ培地上での本実施例のパートＡの４で記載した
ようにして生成させた形質転換細胞の選定後、形質転換
E.コリRR1ΔM15細胞からのプラスミドを、実施例９のパ
ートＡの４で記載したように、EcoRIフラグメントとし
て、広域宿主範囲のベクターpKT210に転写する。 6. A.ツメファシエンスLBA4013への接合： 広域宿主範囲ベクターpKT210上にGREPSPS遺伝子を担
持するプラスミドを、実施例９のパートＡの５に記載し
たような接合により、A.ツメファシエンス菌株LBA4013
へ転写する。得られた接合完了体を実施例９のパートＡ
の５に記載したようにして選択し、GREPSPS遺伝子を担
持するA.ツメファシエンスの新規な菌株（以下、菌株LB
A4013/GREPSPSと称す）を単離する。 B.とうもろこしの形質転換： 近交黄色イオチーフ株とうもろこしの種実を滅菌し、
発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記
載したようにしてインキュベートしたが、とうもろこし
実生は菌株B6ではなく菌株LBA4013/GREPSPSを接種し
た。７日間のインキュベーション後、この感染実生を鉢
植土壌を含む鉢に植付ける。 C.アッセイ： 1. 花粉中の酵素活性のアッセイ： 実生の植付け60日後に、５本の植付け物の花粉の各サ
ンプルを、それぞれ、実施例３のパートＢで記載したよ
うにして、リンパインデヒドロゲナーゼの存在について
アッセイする。５本の植付け物から花粉の無細胞抽出物
をインキュベートすることによって生じた生成物の電気
泳動の結果は花粉の無細胞抽出物の５つのうちの３つが
オクトパインを産生することを示しており、花粉が形質
転換していることを示している。 2. EPSPシンターゼ活性のアッセイ： 分裂組織からの葉を、実生の植付け７週間後に、ブー
コック（Boocock）とコギンズ（Coggins）の方法（“FE
BS Letters,154、127（1983）";その記載は参考として
本明細書に引用する）により、EPSPシンターゼ活性につ
いてアッセイする。 ５本の個々の植付け物からの５枚の葉をアッセイし、
３枚がEPSPシンターゼ活性を含むことが認められ、形質
転換が起っていることを示している。 3. グリホサイトに対する耐性のアッセイ： 本実施例のパートＣの２の結果として葉中にEPSPシン
ターゼ活性を含んでいることを確認した３本の植付け物
に0.5kg/ヘクタールに等価のグリホサイトイソプロピル
アミン塩を噴霧する。３本の植付け物はすべて対照に比
べ著しいグリホサイト耐性を示す。 好ましい実施態様を示す以上の記載により、特許請求
する本発明の範囲を何ら限定する積りはない。当業者な
らば多くの修正、変形および応用が可能であることは理
解されるであろう。 実施例11 A.とうもろこしの形質転換： 菌株CA19を実施例９のパートＡで記載したように培養
し、黄色イオチーフとうもろこしを滅菌し、発芽させ、
CA19を接種し、実施例１のＢとＣで記載したようにして
インキュベートした。実生をまたA.ツメファシエンス菌
株CA17でも接種した。CA17は菌株CA19と同じであるが、
ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子が反対方向に
挿入されている。さらに、実生はまたYEB単独でも接種
した。７日間のインキュベーション後、接種した実生す
べてを植付けた。 B.アッセイ： 1. 形質転換植付物の上部葉中の酵素活性のアッセイ： 植付け物が成熟に達したとき、その上部の葉を実施例
３のパートＢの２に記載したようにしてリソパインデヒ
ドロゲナーゼ活性の存在についてアッセイした。ただ
し、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いた。CA
19接種実生からの５本の植付け物の葉、CA17接種実生か
らの２本の植付け物の葉およびYEB接種の３本の植付け
物の葉をアッセイした。 結果は第14図に示す。第14図において各レーンは次の
物質を含む。 第14図に示すように、YEB接種実生からの葉の抽出物
はいずれもオクトパインを産生せず、一方CA−19接種お
よびCA−17接種実生の12抽出物のうちの８つがオクトパ
インを産生した。 2. 形質転換植付物の上部葉中の微生物のアッセイ： 本実施例のパートＢの２で記載したリソパインデヒド
ロゲナーゼアッセイに用いた葉の抽出物のアリコートを
塗抹してこれらの抽出物中に何らかの微生物が存在する
かどうかを測定した。これらの塗抹の結果として増殖す
る微生物コロニーをアクロバクテリウム検出用ラクトー
ズ含有培地に転写した。原塗抹の経過として増殖しラク
トースを酸化してラクトン酸とした微生物はなく（YEB
接種実生、CA19接種実生またはCA17接種実生の葉からの
いずれの抽出物においても）、微生物中には実生を接種
するのに用いた種類のアグロバクリウムは存在しないこ
とが示された。 3. F1植付物の葉中の酵素活性のアッセイ： 上記アッセイの結果を用いて、植付物19−５および19
−３を用いてさらに試験を行った。植付物19−５はその
最上部の２枚の葉の抽出物が該植付物が房毛（tassel）
まで拡大する形質転換領域を有し得ることを示すリソパ
インデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性であったので用
いた。植付物19−３はその“穂の苗条”、および“刃状
葉の下の葉”の抽出物が該植付け物が穂まで延びた形質
転換領域および房毛まで延びた形質転換領域を有し得る
ことを示すリソパインデヒドロゲナーゼ活性に対して陽
性であるので用いた。これら２本の植付物は自己受粉さ
せた。次いで、受粉26〜27日後、植付物19−３と19−５
の未成熟穂を採取し表面を滅菌した。これら植付物から
の穂の遅成熟胚を切り取り半強力ムラシゲースリーグ培
地に植付けた。胚を光中で８〜10日間無菌状態で発芽さ
せ、その時点で土壌に植付けた。 土壌に移植して生長したF1種実の分裂組織由来の葉を
実施例３のパートＢの２に記載したようにして、ただ
し、リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてリソ
パインデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。オ
クトパインと共遊走（co−migration）した電気泳動図
上のスポットの染色度を評価した。結果は第１表に示
す。そこで示されるように、実生のいくつかはオクトパ
インを産生し、本特性のF1世代への有性伝播を示した。 実施例12 A.ツメファシエンス菌株B6の単コロニーを酵母エキスブ
イヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡで記
載したようにしてイキュベートした。ライムギの種実を
滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１のＢとＣ
で記載したようにして７〜14日間インキュベートした。
実生は先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生じる急速分
裂細胞領域に接種した。 ７〜14日インキュベーション期間終了時に、実生を実
施例１のパートＤで記載したようにして酵素活性につい
てアッセイした。B6接種ライムギ実生の無細胞抽出物を
リソパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えることによ
って生じた生成物の電気泳動の結果は第10図に示す。こ
の図においては、レーン１が合成オクトパイン標準物を
含み、レーン２−６は単B6接種ライムギ実生の無細胞抽
出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含む。第10図に
示された結果はオクトパイン産生が試験した４つのB6接
種ライムギ実生（レーン２、３、４および６）のうちの
３つにより生じていることを示している。これらの結果
はライムギ実生vir+A.ツメファシエンス菌株B6による感
染によって形質転換されていることを示している。 実施例13 A.ツメファシエンス菌株B6の単コロニーを酵母エキス
ブイヨンに接種し、この微生物を実施例１のパートＡに
記載したようにしてインキュベートした。オオムギの種
実を滅菌し、発芽させ、接種し、さらに、実施例１のＢ
とＣに記載したようにして７〜14日間インキュベートし
た。実生を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ずる急
速分裂細胞領域で接種した。 ７〜14日インキュベーション期間の終了時に、実生を
実施例１のパートＤで記載したようにして酵素活性につ
いてアッセイした。B6接種オオムギ実生の無細胞抽出物
をリンパインデヒドロゲナーゼ反応培地に加えることに
よって生じた生成物の電気泳動の結果は第11図に示す。
この図において、レーン１は合成オクトパイン標準物を
含み、レーン２〜６は単B6接種オオムギ実生の無細胞抽
出物をリソパインデヒドロゲナーゼ反応培地でインキュ
ベートすることによって生じた生成物を含む。第11図で
示す結果はオクトパイン産生がB6接種オオムギ実生の５
つの無細胞抽出物のうちの５つによって生じていること
および実生が形質転換されていることを示している。 実施例14 A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーのYEBに接種
し、この微生物を実施例２のパートＡで記載したように
してインキュベートした。オートムギの種実を滅菌し、
発芽させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣで記
載したようにして７〜14日間インキュベートした。実生
を先端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ずる急速分裂細
胞領域で接種した。 ７〜14日間のインキュベート期間終了時に、実生を実
施例２のパートＤに記載したようにしてアッセイした。
結果は第12図に示す。第12図では、レーン１がノパリン
デヒドロゲナーゼ反応培地のみを含み、レーン２はノパ
リン標準物を含み、レーン３〜11は１回C58接種オート
ムギ実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地でインキュベートすることによって生じた生成物
を含み、レーン12は合成オクトパインを含む。明らか
に、１回C58接種オートムギ実生の無細胞抽出物の９つ
のうちの６つはノパリンを産生し実生が形質転換されて
いることを示している。 実施例15 A.ツメファシエンス菌株C58の単コロニーのYEBに接種
し、この微生物を実施例２のパートＡで記載したように
してインキュベートした。コムギの種実を滅菌し、発芽
させ、接種し、さらに実施例１のパートＢとＣに記載し
たようにして７〜14日間インキュベートした。実生は先
端分裂組織、即ち、生殖系細胞を生ずる急速分裂細胞領
域で接種した。 ７〜14日間のインキュベーション期間終了時に、実生
を実施例２のパートＤに記載したようにしてアッセイし
た。結果は第13図に示す。第13図において、レーン１は
ノパリン標準物を含み、レーン２〜６は１回C58接種コ
ムギ実生の無細胞抽出物をノパリンデヒドロゲナーゼ反
応培地でインキュベートすることによって生じた生成物
を含み、レーン７は合成オクトパインを含み、レーン８
は合成オクトパインとリソパインデヒドロゲナーゼ反応
培地との混合物を含み、レーン９〜15は１回C58接種コ
ムギ実生の無細胞抽出物をリソパインデヒドロゲナーゼ
反応培地でインキュベートすることによって生じた生成
物を含む。明らかに、C58接種コムギ実生の５つの無細
胞抽出物のうち３つがノパリンデヒドロゲナーゼ反応培
地とインキュベートさせたのきノパリンを産生し、実生
が形質転換されていることを示している。リソパインデ
ヒドロゲナーゼ反応培地でインキュベートした場合には
ノパインを産生した無細胞抽出物はなかった。
【図面の簡単な説明】
第１図は96時間令のとうもろこし実生を示す。第1A図は
実生の側面図であり、第1B図は同じ実生の前面図であ
る。 第2A図はA.テュメファシエンスB6株を植菌した黄色Iocn
iefとうもろこし実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒド
ロゲナーゼ酵素活性の検出ができる試薬を含有する反応
培地（リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地）を用いてイ
ンキュベートすることによって生産した生産物の電気泳
動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図
である。ある種のコントロールも電気泳動した。 第2B図は黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液
をノパリンデヒドロゲナーゼ酵素活性を検出することが
できる試薬を含有する反応培地（ノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地）を用いてインキュベートすることによっ
て生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペ
ーパー電気泳動グラムの図である。ある種のコントロー
ルも電気泳動した。 第2C図は種々の物質中のピロノパリンの存在又は不存在
を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第2D図は展開したペーパー電気泳動グラムの図である。
電気泳動された物質はA.テュメファシエンスC58を植菌
した黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物をA.テュメファシエ
ンスのある菌株によって異化することによって生産され
た。ある種のコントロールも電気泳動した。 第3A図は単一B6植菌黄色Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラム
の図である。 第3B図はA.テュメファシエンスA348株または238MX株を
植菌した単一黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽
出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイン
キュベートすることによって生産した生産物の電気泳動
の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図で
ある。 第3C図は単一C58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラム
の図である。 第3D図はA.テュメファシエンスJK195株を植菌した単一
黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液をノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第4A図はA.テュメファシエンスB6及びC58株の無細胞超
音波処理液の電気泳動の結果である、展開したペーパー
電気泳動グラムの図である。 第4B図はA.テュメファシエンスB6及びC58株の無細胞超
音波処理液を適当な反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。反応
培地単独も電気泳動した。 第4C図はとうもろこしの黄色Iochief株の単一未感染実
生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地
又はノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて４時間
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。 第5A図はC58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生から生長
した植物からの単一のほう芽期の葉の無細胞抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果で
ある、展開した電気泳動グラムの図である。 第5B図はノパリンデヒドロゲナーゼ活性の検定のために
切開した部分を示す分裂起源（meristematic origin）
のとうもろこし葉の図である。 第5C図はC58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生から生長
した４つの植物体からの４つの分裂葉の切開部の無細胞
抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイ
ンキュベートすることによって生産した生産物の電気泳
動の結果を示す、展開した電気泳動グラムの図である。 第5D図はC58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生から生長
した個々の植物体からの花粉の無細胞抽出液をノパリン
デヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動を結果を示す、
展開した電気泳動グラムの図である。 第６図はA.テュメファシエンスCA19株を植菌した、黄色
Iochiefとうもろこしの単一実生の無細胞抽出液をリゾ
ピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベート
することによって生産した生産物の電気泳動の結果であ
る、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第７図はとうもろこしPA91株の単一C58植菌実生の無細
胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。 第８図はプラスミドpCEL30の制限部位及び機能地図であ
る。 第９図はプラスミドpCEL44の制限部位及び機能地図であ
る。 第10図は単一B6植菌ライ麦実生の無細胞抽出液をリゾピ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第11図は単一B6細菌大麦実生の無細胞抽出液をリゾピン
デヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第12図は単一CB58細菌オート麦実生の無細菌抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果を
示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第13図は単一C58細菌小麦実生の無細胞抽出液をノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地及びリゾピンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによって
生産した生産物の電気泳動の結果である、展開した電気
泳動グラムの図である。 第14図はCA19接種実生からの５本の植付け物の葉、CA17
接種実生からの２本の植付け物の葉およびYEB接種の３
本の植付け物の葉の無細胞抽出液をリソパインデヒドロ
ゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによ
って生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開した
電気泳動グラムの図である。 これらすべての図において、「Ｏ」及び「OCT」はオク
トピンを、「Ｎ」又は「NOP」はノパリンを表わす。こ
れらの記号は各図において、合成オクトピン又はノパリ
ン標品を含有する電気泳動グラムのレーンに言及するた
め、又電気泳動後の合成オクトピン又はノパリン標品に
よって生じたスポットの位置を示すために用いられてい
る。 いくつかの図面においては、合成オクトピン又はノパリ
ン標品と共に移動しないスポットがある。これらのスポ
ットは反応培地中の未反応試薬によって、又とうもろこ
し実生の無細胞抽出液中に見い出される天然に生じた物
質によって形成される。
実生の側面図であり、第1B図は同じ実生の前面図であ
る。 第2A図はA.テュメファシエンスB6株を植菌した黄色Iocn
iefとうもろこし実生の無細胞抽出液をリゾピンデヒド
ロゲナーゼ酵素活性の検出ができる試薬を含有する反応
培地（リゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地）を用いてイ
ンキュベートすることによって生産した生産物の電気泳
動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図
である。ある種のコントロールも電気泳動した。 第2B図は黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液
をノパリンデヒドロゲナーゼ酵素活性を検出することが
できる試薬を含有する反応培地（ノパリンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地）を用いてインキュベートすることによっ
て生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開したペ
ーパー電気泳動グラムの図である。ある種のコントロー
ルも電気泳動した。 第2C図は種々の物質中のピロノパリンの存在又は不存在
を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第2D図は展開したペーパー電気泳動グラムの図である。
電気泳動された物質はA.テュメファシエンスC58を植菌
した黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物をA.テュメファシエ
ンスのある菌株によって異化することによって生産され
た。ある種のコントロールも電気泳動した。 第3A図は単一B6植菌黄色Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラム
の図である。 第3B図はA.テュメファシエンスA348株または238MX株を
植菌した単一黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽
出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイン
キュベートすることによって生産した生産物の電気泳動
の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図で
ある。 第3C図は単一C58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生の無
細胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用い
てインキュベートすることによって生産した生産物の電
気泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラム
の図である。 第3D図はA.テュメファシエンスJK195株を植菌した単一
黄色Iochiefとうもろこし実生の無細胞抽出液をノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第4A図はA.テュメファシエンスB6及びC58株の無細胞超
音波処理液の電気泳動の結果である、展開したペーパー
電気泳動グラムの図である。 第4B図はA.テュメファシエンスB6及びC58株の無細胞超
音波処理液を適当な反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。反応
培地単独も電気泳動した。 第4C図はとうもろこしの黄色Iochief株の単一未感染実
生の無細胞抽出液をリゾピンデヒドロゲナーゼ反応培地
又はノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて４時間
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。 第5A図はC58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生から生長
した植物からの単一のほう芽期の葉の無細胞抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果で
ある、展開した電気泳動グラムの図である。 第5B図はノパリンデヒドロゲナーゼ活性の検定のために
切開した部分を示す分裂起源（meristematic origin）
のとうもろこし葉の図である。 第5C図はC58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生から生長
した４つの植物体からの４つの分裂葉の切開部の無細胞
抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてイ
ンキュベートすることによって生産した生産物の電気泳
動の結果を示す、展開した電気泳動グラムの図である。 第5D図はC58植菌黄色Iochiefとうもろこし実生から生長
した個々の植物体からの花粉の無細胞抽出液をノパリン
デヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動を結果を示す、
展開した電気泳動グラムの図である。 第６図はA.テュメファシエンスCA19株を植菌した、黄色
Iochiefとうもろこしの単一実生の無細胞抽出液をリゾ
ピンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベート
することによって生産した生産物の電気泳動の結果であ
る、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第７図はとうもろこしPA91株の単一C58植菌実生の無細
胞抽出液をノパリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いて
インキュベートすることによって生産した生産物の電気
泳動の結果を示す、展開したペーパー電気泳動グラムの
図である。 第８図はプラスミドpCEL30の制限部位及び機能地図であ
る。 第９図はプラスミドpCEL44の制限部位及び機能地図であ
る。 第10図は単一B6植菌ライ麦実生の無細胞抽出液をリゾピ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートす
ることによって生産した生産物の電気泳動の結果を示
す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第11図は単一B6細菌大麦実生の無細胞抽出液をリゾピン
デヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートする
ことによって生産した生産物の電気泳動の結果を示す、
展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第12図は単一CB58細菌オート麦実生の無細菌抽出液をノ
パリンデヒドロゲナーゼ反応培地を用いてインキュベー
トすることによって生産した生産物の電気泳動の結果を
示す、展開したペーパー電気泳動グラムの図である。 第13図は単一C58細菌小麦実生の無細胞抽出液をノパリ
ンデヒドロゲナーゼ反応培地及びリゾピンデヒドロゲナ
ーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによって
生産した生産物の電気泳動の結果である、展開した電気
泳動グラムの図である。 第14図はCA19接種実生からの５本の植付け物の葉、CA17
接種実生からの２本の植付け物の葉およびYEB接種の３
本の植付け物の葉の無細胞抽出液をリソパインデヒドロ
ゲナーゼ反応培地を用いてインキュベートすることによ
って生産した生産物の電気泳動の結果を示す、展開した
電気泳動グラムの図である。 これらすべての図において、「Ｏ」及び「OCT」はオク
トピンを、「Ｎ」又は「NOP」はノパリンを表わす。こ
れらの記号は各図において、合成オクトピン又はノパリ
ン標品を含有する電気泳動グラムのレーンに言及するた
め、又電気泳動後の合成オクトピン又はノパリン標品に
よって生じたスポットの位置を示すために用いられてい
る。 いくつかの図面においては、合成オクトピン又はノパリ
ン標品と共に移動しないスポットがある。これらのスポ
ットは反応培地中の未反応試薬によって、又とうもろこ
し実生の無細胞抽出液中に見い出される天然に生じた物
質によって形成される。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭60−210929（ＪＰ，Ａ)
Ｎａｔｕｒｅ，311（1984）ｐ．763−
764
Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，69
［５／６］（1985）ｐ．571−574
Ｎａｔｕｒｅ，319（1986）ｐ．791−
793
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．形質転換されたホモノ科植物を生産する方法であっ
て、該方法が、新たに出現した幼根及び幹を有するホモ
ノ科実生中に傷をつけ、その傷を急速に分裂している細
胞を含む実生の胚盤瘤の基盤から子葉鞘瘤のわずかに先
までまたがるような領域内に傷を作り、その傷にvir+ア
グロバクテリウム・テュメファシエンスを植菌すること
を特徴とする該生産方法。 ２．約４個の傷が実生中に作られ、全体で約108個のア
グロバクテリウム・テュメファシエンスが傷に植菌する
ために使用される請求項１に記載の方法。 ３．vir+アグロバクテリウム・テュメファシエンスが、
遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有するベクターを含
有する請求項１に記載の方法。 ４．ホモノ科植物がトウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦
及びオート麦からなる群から選択された請求項１〜３の
いずれか１項に記載の方法。 ５．形質転換されたトウモロコシを生産する方法であっ
て、該方法が、新たに出現した幼根及び幹を有するトウ
モロコシ実生中に傷をつけ、その傷を急速に分裂してい
る細胞を含む実生の胚盤瘤の基盤から子葉鞘瘤のわずか
に先までまたがるような領域内に傷を作り、その傷にvi
r+アグロバクテリウム・テュメファシエンスを植菌する
ことを特徴とする該生産方法。 ６．vir+アグロバクテリウム・テュメファシエンスが、
遺伝学的に設計されたＴ−DNAを含有するベクターを含
有する請求項５に記載の方法。 ７．約４個の傷が実生中に作られ、全体で約108個のア
グロバクテリウム・テュメファシエンスが傷に植菌する
ために使用される請求項６に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US88027186A | 1986-06-30 | 1986-06-30 | |
| US880271 | 1986-06-30 |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP12116197A Division JP3234534B2 (ja) | 1986-06-30 | 1997-05-12 | 形質転換されたホモノ科植物 |
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|---|---|
| JPS6387921A JPS6387921A (ja) | 1988-04-19 |
| JP2693443B2 true JP2693443B2 (ja) | 1997-12-24 |
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ID=25375913
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| JP12116197A Expired - Lifetime JP3234534B2 (ja) | 1986-06-30 | 1997-05-12 | 形質転換されたホモノ科植物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12116197A Expired - Lifetime JP3234534B2 (ja) | 1986-06-30 | 1997-05-12 | 形質転換されたホモノ科植物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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| AU (1) | AU606874B2 (ja) |
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| CA1340766C (en) | 1984-12-24 | 1999-09-28 | Clive Waldron | Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants |
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| JPS63123325A (ja) * | 1986-08-14 | 1988-05-27 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エ−・ファウ | トランスジェニック単子葉植物、その種子および植物の調製方法 |
-
1987
- 1987-06-29 CA CA 540844 patent/CA1341455C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-30 JP JP62163867A patent/JP2693443B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-30 AU AU74947/87A patent/AU606874B2/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-05-12 JP JP12116197A patent/JP3234534B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，３１１（１９８４）ｐ．７６３−７６４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，３１９（１９８６）ｐ．７９１−７９３ |
| Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６９［５／６］（１９８５）ｐ．５７１−５７４ |
Also Published As
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|---|---|
| CA1341455C (en) | 2004-04-27 |
| JPS6387921A (ja) | 1988-04-19 |
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| JPH1052186A (ja) | 1998-02-24 |
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| AU606874B2 (en) | 1991-02-21 |
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