KR20020032445A

KR20020032445A - 한국형 잔디의 유전적 형질전환 방법

Info

Publication number: KR20020032445A
Application number: KR1020020003850A
Authority: KR
Inventors: 토이야마고이찌; 배창휴; 강정구; 송필순; 박충모; 이효연
Original assignee: 박찬구; 금호석유화학 주식회사
Priority date: 2001-11-15
Filing date: 2002-01-23
Publication date: 2002-05-03
Also published as: US6646185B2; KR100458138B1; US20030106108A1

Abstract

본 발명은 한국형 잔디(Zoysia japonicaSteud.)의 효과적인 유전적 형질전환 시스템을 제공한다. 또한 한국형 잔디 형질전환의 최적화된 배지 조성 및 배양 조건을 제공한다. 한국형 잔디의 확실한 형질전환 시스템은 캘러스 생장 및 식물 재생에 유의적으로 영향을 미치는 일부 최적화 인자에 의해 발달되었다. 캘러스 타입 및 동시-배양 기간은 형질전환 효율성에 절대적으로 영향을 미친다. 또한 2,4-D, CaCl₂및 아세토시린곤의 농도는 중요한 인자이다. 최상의 결과는 타입 3 캘러스가 2,4-D-없는 동시-배양 배지 상에서 6일 동안 동시-배양될 때 달성되었다. 동시-배양 동안의 칼슘의 제거 및 50mg/L의 아세토시린곤의 첨가는 효율성을 매우 강화시킨다. 또한 본 발명은 유지비용을 줄이기 위해 골프 코스 및 운동용 필드에 사용될 수 있는 비알라포스-저항성 한국형 잔디를 제공한다.

Description

한국형 잔디의 유전적 형질전환 방법{Genetic transformation method for zoysiagrass}

본 발명은 한국형 잔디라고 불리는 조이시아그래스(zoysiagrass)(ZoysiajaponicaSteud.) 의 효과적인 유전적 형질전환 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다른 관련된 터프그래스(turfgrass) 종에도 적용 가능하다. 또한 본 발명은 제초제에 저항성의 형질전환 한국형 잔디 및 이러한 제초제-저항성 한국형 잔디의 생성을 위한 실험적인 방법 및 처리를 제공한다.

본 발명은 효과적인 한국형 잔디의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개 유전적 형질전환 방법, 형질전환 효율성에 크게 영향을 미치는 최적화된 배지 조성과 배양 조건 및 제초제 저항성을 지니고, 이러한 비알라포스(bialaphos) 저항성 유전자(bar)를 지닌 형질전환 한국형 잔디의 발달을 위한 실험 절차와 관련된 형질전환 한국형 잔디를 제공한다.

한국형 잔디는 터프그래스의 가장 중요한 종 중의 하나이고, 전세계적인 온난기후 뿐만 아니라 한국, 일본 및 중국 동부를 포함하는 극동 아시아에서 널리 재배된다. 최근 한국형 잔디의 재배 지역은 가뭄 저항성과 같은 특별한 특성 및 교통 재해로부터 빠르게 회복되는 능력에 기인하여 미국 및 다른 나라에 빠르게 확산되고 있다. 더욱이 이는 사실상 모든 기후에서 척박한 토양에서 잘 자란다. 골프 코스, 운동경기장, 대로변, 집 정원 및 강둑 등에 널리 사용된다. 이들의 유용한 특색으로 인해 골프 코스, 운동경기장, 대로변, 집 정원 및 강둑 등에 널리 사용된다. 이들의 시장 규모가 빠르게 증가함에 따라 소비자들은 병원균, 제조제 및 환경 스트레스에 대한 증가된 저항성을 지닌 새로운 다양한 것들을 요구한다.최근까지는 고전적인 품종 개량 방법이 터프그래스 내에서 이러한 새로운 특색을 발달시키기 위해 이용되어왔다. 그러나 점점 더 많은 실험실과 연구소들은 분자생물학적 방법을 이용함으로서 예측 가능한 방법으로 유용한 특색을 발달시키거나 변형시키는 것이 가능하기 때문에 터프그래스를 유전적으로 설계하는데 이러한 방법을 적용하도록 노력하고 있다(Inokuma et al. 1998; Park and Ahn 1998).

대부분의 단자엽식물이 아그로박테리움 투메파시엔스에 의해 용이하게 감염되지 않더라도 효과적인 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 시스템은 최근 쌀, 옥수수 및 호밀과 같은 콩과식물의 몇 개의 종에서 성공적으로 발달되었다. 그러나 불행히도 이러한 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 방법이 벤트그래스를 제외하고는 터프그래스에 대해서 수립되지 않았다. 특히 한국형 잔디의 유전적 형질전환은 부가적인 기술적 문제에 의해 제한된다. 예를 들어 터프그래스 종자 발아율은 매우 낮고, 재생 가능한 캘러스의 생성이 어렵다.

캘러스 형태학은 다양한 식물 종에서 증명된 바와 같이 식물 재생능에 밀접하게 관련되어 있다. 최근에 우리는 2001년 10월 12일 특허 제2001-62889호로 출원된 한국형 잔디의 효과적인 캘러스 유도 및 식물 재생 시스템을 수립하였다.

본 발명에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스 감염에 의해 목적 유전자로 한국형 잔디를 유전적으로 형질전환하는 것이 가능하다.

한국형 잔디의 유전적 형질전환을 위한 일부 잠재적 타겟 특색은 증가된 지면-커버링 능력, 교통 재해 내성, 손상 후 빠른 회복, 생물적 및 비생물적 스트레스 저항성 및 그늘 회피를 포함한다. 특정한 목적 중에 생장율 및/또는 그늘 회피를 설계하여 관수 및 잔디 베기의 유지 비용이 크게 감소되도록 할 수 있다.

최근 분자생물학적 기술의 빠른 축적 및 효과적인 조직 배양 및 식물 내 유전적 형질전환 시스템의 수립으로 농경적으로 중요한 유전자는 수확량, 질 및 환경 적응력을 강화시키고자 하는 목적으로 원하는 식물 내로 용이하게 도입될 수 있다. 본 발명에서 우리는 효과적인 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 한국형 잔디 형질전환 방법 및 제초제 저항성으로 형질전환된 한국형 잔디를 제공한다.

여기에 이용된 바와 같이 "유전적 형질전환"이라는 용어는 예측 가능한 방법으로 고등 식물 내로 유전자(들) 또는 유전적 물질(들)을 도입하는 절차를 나타낸다. 유전자 또는 유전적 물질은 식물 게놈 내로 안정하게 통합되고, 세대를 통해 전달된다.

본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 한국형 잔디의 효과적인 유전적형질전환 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다른 관련된 터프그래스(turfgrass) 종에도 적용 가능하다. 또한 본 발명은 제초제에 저항성의 형질전환 한국형 잔디 및 이러한 제초제-저항성 한국형 잔디의 생성을 위한 실험적인 방법 및 처리를 제공한다.

도 1은 캘러스 생장 배지 상에서 생장된 캘러스의 4가지의 다른 타입을 나타낸 것이다. (A) 타입 1 캘러스는 약간 흰-노란색 또는 옅은-초록색을 지니고, 촘촘하고 부서지지 않는 구조를 지닌다. (B) 타입 2 캘러스는 흰색이고, 촘촘하고 부서지기 쉬운 구조를 지닌다. (C) 타입 3 캘러스는 노란색이고, 촘촘하고 매우 부서지기 쉬운 구조이다. (D) 타입 4 캘러스는 부드럽고 물기가 많은 외형을 지닌 투명한 것이다. 4가지의 캘러스 타입은 표 2에 요약된 바와 같이 생장 조절자의 다른 조합으로 보충된 캘러스 생장 배지 상에서 수득되었다.

도 2는 pGPTV-HB 벡터를 잠복시킨(harbouring)(도 7 참조) 아그로박테리움 투메파시엔스로 감염된 한국형 잔디 캘러스 내의 형질전환 GUS 발현을 나타낸 것이다. (A) 한국형 잔디 캘러스 내의 형질전환 GUS 발현. (B) 아그로박테리움 투메파시엔스의 감염 후 여과지가 놓이고, 항생제가 없는 MSCGCB 배지 상에서의 캘러스의 빠른 생장. (C) 여과지가 놓이고, 항생제가 없는 슈트 유도 배지 상에서의슈트 유도. (D) 비알라포스-함유 배지 상에서의 슈트 신장 및 루팅(rooting). 아그로박테리움 투메파시엔스-감염된 캘러스로부터 유도된 슈트는 5mg/L 비알라포스를 함유한 선택적 루팅 배지 MSRS 상에서 배양되었다.

도 3은 형질전환 효율성 상의 2,4-D의 효과를 나타낸 것이다. 다른 농도의 2,4-D를 함유한 캘러스 생장 배지 상에서 배양된 그램 프레쉬 중량 당 청색점이 카운트되었다.

도 4는 형질전환 효율성 상의 CaCl₂의 효과를 나타낸 것이다. 아그로박테리움 투메파시엔스-감염된 캘러스는 도 3에 기술된 바와 같이 배양되었으나 배지는 다른 농도의 CaCl₂를 함유한다.

도 5는 형질전환 효율성 상의 아세토시린곤의 효과를 나타낸 것이다. 실험은 도 3에서 기술된 바와 같이 수행되었으나 다양한 농도의 아세토시린곤으로 수행되었다.

도 6은 형질전환(우측) 및 어버이(좌측) 한국형 잔디 식물체를 나타낸 것이다. 한국형 잔디 식물체는 2주 동안 매일 제초제 용액(5g/L 비알라포스)으로 스프레이되었다. (A) 식물체는 제초제 용액으로 스프레이되지 않았다. (B) 식물체는 2주 동안 제초제 용액으로 매일 스프레이되었다.

도 7은 형질전환 벡터 및 식물 게놈 내에서의 제초제 저항성(bar) 유전자의 존재를 확인하기 위한 서던 블럿(Southern blot) 분석을 나타낸 것이다. (A) 형질전환 벡터 pGPTV-HB의 벡터 맵(map).Pnos, 노팔린 신타제(nopaline synthase) 유전자;HygR, 하이그로마이신(hygromycin)-저항성 유전자(hpt);NOS, 노팔린 신타제 유전자이 종결자,Ubi-P, 옥수수의 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터;Bar, 비알라포스-저항성 유전자; B, BamHI; E, EclRI; H, HindⅢ; S ScaⅠ. (B) 및 (C) 형질전환 한국형 잔디 식물체의 서던 블럿 분석. 게노믹 DNA는 HindⅢ(레인 1) 또는BamHI(레인 2)로 분해되었다. 멤브레인은bar(B) 또는hpt(C) 프로브로 하이브리다이즈되었다. 형질전환되지 않은 식물체의 게노믹 DNA는 음성의 대조군(레인 c)으로 포함되었다.

본 발명은 한국형 잔디 또는 밀접하게 관련된 터프그래스 종에 통상적으로 이용되는 믿을 수 있는 한국형 잔디의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 : ⅰ) 다양한 호르몬을 함유한 변형된 MS 배지 상에서의 한국형 잔디 캘러스를 유도하고, 생장시키고; ⅱ) 비알라포스 저항성bar유전자를 도입하기 위해 아그로박테리움 세포로 한국형 잔디 캘러스를 감염시키고; ⅲ) 2,4-디클로로페녹시아세트산(dichlorophenoxyacetic acid)과 칼슘이 없이 아세토시린곤(acetosyringone)을 함유한 동시-배양 배지 내에서 한국형 잔디의 캘러스 및 아그로박테리움 세포를 동시-배양하고; ⅳ) 동시-배양 배지로부터 아그로박테리움 세포를 제거하고; ⅴ) 형질전환 한국형 잔디를 재생시키는 단계로 구성된 한국형 잔디(조이시아 속)를 유전적으로 형질전환하는 방법을 제공한다.

더욱이 아그로박테리움 세포는 pGPT-HB 형질전환 벡터를 포함하고, 타입 3 캘러스(앞선 미국특허 출원번호 제09/915,924호에서 정의됨)는 동시 배양 배지 내에서 5∼7일 동안 동시-배양되었다.

또한 본 발명은 식물-특이적 프로모터의 조절 하에서bar유전자로 안정하게 형질전환되는 상기 방법에 의한 형질전환 한국형 잔디를 제공한다. 특정한 프로모터는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터이다.

본 발명에서 평가된 중요한 배지 조성물 또는 배양 조건은 캘러스 타입, 동시-배양 기간, 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산), CaCl₂및 아세토시린곤을 포함한다. 가장 높은 형질전환 효율은 타입 3 캘러스가 2,4-D가 없는 배지 상에서 5∼7일 동안 동시-배양될 때 수득되었다. 더욱이 동시-배양 동안 칼슘의 제거 및 30∼70 mg/L의 아세토시린곤의 포함은 형질전환 효율을 크게 강화시켰다.

최적화된 형질전환 프로토콜이 bar 유전자로의 한국형 잔디의 형질전환을 위해 이용될 때 선택 배지 상에 플레이트된 슈트(shoot)의 약 20.5% 까지가 제초제-저항성을 나타냈다.

또한 제초제 저항성을 지닌 형질전환 한국형 잔디가 본 발명에서 제공된다.형질전환 한국형 잔디는 2주 동안 매일 허비아스(herbiace) 용액 5g/L가 스프레이된 후에도 살아 남아서 결국 성체로 생장할 수 있었고, 반면에 대조군 식물은 동일한 실험 조건 하에서 처리될 때 생장을 멈추고, 죽게 되었다.

따라서 본 발명은 제초제 저항성을 지닌 한국형 잔디 캘러스(기탁번호: KCTC-10076BP)를 더욱 제공한다.

상기 캘러스는 기탁번호 제KCTC-10076BP로 2001년 9월 21일 부다페스트 조약에 의거 한국 대전 유성구 오운동 52번지에 소재하는 한국타입 컬쳐컬렉션(KCTC)에 기탁되었다.

농경적으로 중요한 식물의 유전적 형질전환은 신규하거나 증진된 유용한 특색을 지닌 새롭고 다양한 식물 종을 발달시키는 잠재적인 방법이다. 농작물에 관련된 타겟 특색은 증진되거나 지연된 생장율, 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 강화된 저항성, 증가된 수확량 및 환경적 변이에 대한 유연한 적응력을 포함한다. 성공적인 식물 유전적 형질전환의 필수조건은 조직 배양 및 식물체 재생을 위한 확실한 시스템 및 유전적 물질의 일관된 전달 장치이다. 최근 식물 분자생물학 및 방법론의 진보와 함께 목적 유전자는 원하는 어떤 식물 종에도 용이하게 전달될 수 있다. 그러나 일부 농작물, 특히 단자엽식물은 유전적 조작이 어렵고, 일반적인 실험실에서 식물 재생을 수행하기가 쉽지 않다. 터프그래스는 골프 코스, 잔디그라운드, 가정 정원 및 레크레이션 공원을 포함한 다양한 목적으로 널리 사용되고, 최근에는 식물 생물공학적 적용을 위한 잠재적인 상업적 타겟 식물로 떠오르고 있다. 그러나 어떤 효과적인 조직 배양 및 유전적 형질전환 시스템도 발달되지 않았다. 그 결과로 터프그래스의 생물공학적 유전적 조작은 아직까지 진보되지 않았다.

본 발명은 한국형 잔디의 종자-유래된 캘러스로부터의 효과적인 유전적 형질전환 및 식물 재생을 위한 최적화된 배지 및 배양 조건을 제공한다. 따뜻한 계절 터프그래스의 서브타입인 한국형 잔디는 극동 아시아를 포함한 온난기후 지역에 널리 분포되있고, 재배된다. 더욱이 재배 지역은 가뭄 및 교통 재해 저항성과 같은 일부 장점에 기인하여 최근 미국 및 다른 나라에 빠르게 확산되고 있다. 본 발명에서 가장 효과적인 형질전환은 타입 3 캘러스가 2,4-D가 없고 50mg/L의 아세토시린곤을 함유한 동시-배양 배지 내에서 6일 동안 동시-배양될 때 달성되었다. 다른 식물에서 형질전환 효율성을 증가시킨다고 알려진 칼슘은 부정적인 효과를 나타내었다. 식물 조직 배양 및 재생 실험은 잘-확립된 식물 분자 실험실에서 일상적으로 수행되었다.

또한 본 발명은 2주 동안 매일 비알라포스 용액의 스프레이 후에도 생존할 수 있는 제초제-저항성 한국형 잔디에 관한 것이다. 골프 코스 및 운동용 필드 내에 이러한 형질전환 한국형 잔디를 재배함으로서 제초제를 뿌리는 것만으로도 잡초를 선택적으로 제거하기 더욱 용이해지고, 유지 바용은 급감할 것이다. 더욱이 영양-소비 잡초가 효과적으로 제거되기 때문에 더욱 적은 양의 비료가 필요할 것으로 기대된다. 형질전환 한국형 잔디는 어떤 형태적으로 찌그러짐도 나타내지 않았고, 어버이 식물과 구별할 수 없이 잘 자란다.

또한 본 발명은 콩과식물에 속하는 다른 단자엽식물 종 뿐만 아니라 다른 밀접하게 관련된 터프그래스 종에도 적용 가능하다. 이러한 유전적으로 설계된 식물의 발달을 위한 실험 절차는 당 분야에 잘 알려져 있다. 이는 높게 재생 가능한 캘러스 라인을 이용함으로서 효과적인 한국형 잔디의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환에 대한 첫 번째 발명이다.

(실시예)

재생 가능한 캘러스의 준비

한국형 잔디(Zoysia japonicaSteud.)의 약 100개의 성숙 종자는 튜브 믹서(mixer)를 이용한 교반으로 2-ml 원심분리 튜브 내에서 15분 동안 2% 차아염소산나트륨 1ml로 표면-멸균되었다. 그 후 이러한 종자는 멸균된 이중-증류수로 두 번 세척되었다. 캘러스 유도를 위해 약 100개의 종자는 3%의 슈크로스(w/v), 100mg/L의 α-케토글루타르산, 4mg/L의 티아민-HCL, 2mg/L의 2,4-D, 0.2mg/L BA 및0.2% 겔라이트(gelrite)(w/v)를 함유한 여과지가 놓인 MS(Murashige and Skoog 1962) 배지 페트리디쉬 상에 플레이트되었다. 배지는 1.2∼1.3kg/㎠ 압력으로 121℃에서 20분 동안 오토클레이브(autoclave)하기 전 HCl을 이용하여 pH5.8로 적정되었다. 캘러스 유도는 3개원 동안 완전한 암조건으로 배양실에서 26±1℃으로 수행되었다. 각각의 페트리디쉬(직경 90㎜)는 약 30ml의 배지를 함유하였고, 파라필름(American National Can, USA)으로 단단하게 밀봉되었다. 형광 튜브에 의해 제공된 30μmolm^-2s^-1강도의 연속적인 백광 하에서의 부가적인 3일 유도 후 초록색 조직만 1mg/L의 2,4-D 및 0.2mg/L BA를 함유한 MS 배지로 옮겨지고, 뒤이어 더한 생장을 위해 암조건으로 배양되었다. 암조건에서의 5주 동안의 배양 후 초록색을 지닌 독립적인 종자-유래 캘러스가 암조건으로 2,4-D 및 BA의 다른 호르몬 조합을 함유한 여과지가 놓인 MS 배지 상으로 옮겨지고, 더욱 배양되었다. 캘러스의 4가지 타입이 최종적으로 수득되었다. 4주 간격으로 이차배양한 후 타입 1, 2 및 4 캘러스는 1mg/L의 2,4-D-함유 배지 상에서 생성되었고, 타입 3 캘러스는 4mg/L의 2,4-D-함유 배지 상에서 생성되었다(도 1). 각각의 페트리디쉬(직경 90㎜)는 25ml의 배지를 함유하였고, Micropore Surgical Tape(3M Health Care, USA)로 밀봉되었다.

4가지 캘러스 타입의 특성

타입 1 캘러스 이차배양 상에서 발생하는 형태적 변화를 연구하기 위해 타입 1 캘러스는 암조건에서 2,4-D(1, 4 및 8mg/L) 및 BA(0, 0.01 및 0.1mg/L)의 다른 호르몬 조합을 함유한 MS 배지로 옮겨졌다. 암조건에서 5주 동안의 이차배양 후 4가지의 캘러스 타입이 관찰되었다. 각각이 캘러스 타입의 중량이 측정되었고, 중량 비율이 산출되었다. 또한 타입 2, 3 및 4의 캘러스는 타입 1 캘러스에서와 동일한 방법으로 측정되었다.

아그로박테리움-감염의 최적화된 조건

pIG121Hm을 함유한 무장해제된 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA101이 실험에 사용되었다. pIG121Hm의 T-DNA는 하이그로마이신-저항성 유전자(hpt), 카나마이신-저항성 유전자(npt) 및 인트론-거스(intron-gus) 유전자(uidA)를 포함한다. 아그로박테리움 투메파시엔스 세포는 50mg/L의 하이그로마이신, 100mg/L의 카나마이신 및 100mg/L의 스펙티노마이신(pGPTV-HB)으로 보충된 20ml LB 배지를 함유한(표 1) 100ml Erlenmeyer 플라스크 내에서 160 rpm으로 진탕하면서 28℃에서 오버나이트로 생장시켰다.

표 1은 한국형 형질전환 시스템 내에 사용된 다른 배지 및 그의 조성을 나타낸 것이다.

한국형 잔디 형질전환 시행에 사용된 배지

캘러스 유도(MSCI)	MS 염 및 변형된 비타민(4mg/L 티아민-HCl), 30g/L 슈크로스, 2mg/L 2,4-D, 0.2mg/L BA, 2g/L 겔라이트, pH 5.8
캘러스 생장(MSCG1)	MS 염 및 비타민, 30g/L 슈크로스, 1mg/L 2,4-D, 0.01mg/L BA, 2g/L 겔라이트, pH 5.8
캘러스 생장(MSCG2)	MSCG1 + 4mg/L 2,4-D
아그로박테리움 배양(LB)	1% 트립톤, 5g/L 효모추출물, 5g/L NaCl, 1g/L D-글루코스, 100mg/L 카나마이신, 50mg/L 하이그로마이신, 100mg/L 스펙티노마이신(pGPTV-HB일때만), pH 7.0
아그로박테리움 재현탁(LqMSAS)	칼슘 없는 MS 염 및 비타민, 30g/L 슈크로스, 10g/L 글루코스, 100mg/L 베타인, 50mg/L 아세토시린곤, 0.01% 플루로닉 F68, pH 5.2
동시-배양(MSAS)	LqMSAS + 0.01mg/L BA, 2g/L 겔라이트 및 0.01% 플루로닉 F68, pH 5.2
캘러스 생장 및 아그로박테리움 제거(MSCGCB)	MSCG1 + 500mg/L 칼베니실린
슈트 유도(MSSI)	MS 염 및 비타민, 30g/L 말토스, 1mg/L BA, 2g/L 겔라이트, 250mg/L 칼베니실린, pH 5.8
뿌리 유도 및 선택(MSRS)	MS 염 및 비타민, 30g/L 슈크로스, 1mg/L GA₃, 2g/L 겔라이트, 250mg/L 칼베니실린, 5mg/L 비알리포스 또는 10mg/L 하이그로마이신 pH 5.8
식물체 생장(MSPG)	MS 염 및 비타민, 30g/L 슈크로스, 8g/L 한천, pH 5.8

10ml의 현탁 배양액의 세포는 20분 동안 2500 rpm으로의 원심분리에 의해 50ml의 폴리프로필렌 튜브 내로 수집되었고, 약한 볼텍싱(votexing)에 의해 10ml 액상 감염 배지(표 1의 LqMSAS) 내에 재현탁되었다.

아세토시린곤은 적당한 양의 분말을 100mg/ml의 농도로 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 내에 용해시킴으로서 준비되었고, 어두운 곳에서 4℃로 보관되었다. 필요할 때마다 적당한 최종 농도가 되도록 멸균 배지로 첨가되었다. MSCG4 배지 상에서 증식된 캘러스는 1분 동안 아그로박테리아 세포 현탁액 내에 담궈진다. 멸균 여과지 상에서의 탈수 후 캘러스는 암조건으로 15일 동안 26 ±1℃에서 4mg/L의 2,4-D를 지닌 동시-배양 배지(MSAS) 상에서 배양되었다. 동시-배양 후 캘러스는 세척액이 투명해질 때까지 계면활성제(0.02% 플루로닉 F68)로 보충된 멸균 이중-증류수내에서 볼텍싱함으로서 완전하게 세척되었고, 1000mg/L의 칼베니실린과 0.02% 계면활성제를 함유한 멸균 이중-증류수로 최종적으로 세척되었다. 세척 후 캘러스의 반은 Schenk et al.(1998)에 의해 기술된 방법에 의한 GUS 활성 에세이에 사용되었다.

일부 인자는 형질전환 효율성을 최적화하는데 시험되었다. (1) 침해 상의 다른 캘러스 타입의 비교를 위해 타입 1, 2 및 3 캘러스는 6일 동안 2,4-D 없는 MSAS 배지 상에서 동시-배양되었다; (2) 동시-배양 기간을 비교하기 위해 캘러스는 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 및 27일 동안 동시-배양되었다; (3) 배지 구성성분의 측정을 위해 다른 양의 2,4-D(0, 1, 2, 4 및 8mg/L), CaCl₂(0, 11, 110, 220 및 440mg/L) 및 아세토시린곤(0, 10, 50, 100 및 200mg/L)이 MSAS 배지 내로 첨가되었다.

pGPTV-HB 동시-배양

한국형 잔디의 아그로박테리움 투메파시엔스 감염을 위한 최적화된 조건은 도너(donor)로서 타입 3 캘러스의 사용, 9일 동안의 동시-배양 기간, 2,4-D 및 CaCl₂의 배지로부터의 배제 및 100mg/L의 아세토시린곤의 사용을 포함한다. 실험에 사용된 모든 배지 및 그의 조성은 표 1에 요약되어 있다. pGPTV-HB 동시-배양 후 캘러스는 여과지가 놓인 MSCG 배지로 옮겨지고, 암조건으로 2∼4주간 배양되었다. 그 후 캘러스는 슈트 유도를 위해 여과지가 놓인 MSSI 배지로 옮겨졌다. 다양한 농도의 칼베니실린(125, 250 및 500mg/L)이 슈트 유도 배지에 첨가되었다. 유도된 슈트는 뒤이어 루팅(rooting) 및 선택을 위한 MSRS 배지로 4주 동안 옮겨졌다. 5mg/L의 비알라포스 및 10mg/L 하이그로마이신은 비알라포스- 및 하이그로마이신-저항성 식물체의 선택을 위해 사용되었다. 선택 배지 상의 루팅 식물체는 항생제 및 비알라포스 없는 MSPG 배지로 옮겨지고 더욱 생장되었다. 그 후 충분히 자란 식물체는 토양을 함유한 화분으로 옮겨지고, 30℃에서 80% 상대습도 및 시원한 흰색 형광 튜브에 의해 제공된 30μmlom-2s-1 조사도로 18시간 광주기로 환경적으로 조절된 생장 챔버 내에서 생장되었다.

형질전환된 한국형 잔디의 분석

추정되는 형질전환 한국형 잔디 식물체는 제초제에 대한 저항성을 지니는지를 검사하기 위해 5g/L의 허비아스(herbiace) 용액(1g/L의 비알라포스, MeijiSeika, Japan)으로 스프레이되었다. 더욱이 제초제 저항성 유전자가 식물체 게놈 내로 통합되었는지 여부를 연구하기 위해 게노믹 DNA는 Roger and Bendich(1985)의 하기 방법에 의해 형질전환 식물체의 잎으로부터 분리되었다. 20㎍의HindⅢ- 또는BamHI-분해된 게노믹 DNA는 0.8% 아가로스 겔 상에서 분리되었고, 표준 방법(Southern 1075)에 의해 나일론 멤브레인 상에 블럿되었고(Hybond-N⁺),³²P-표지된 hpt 유전자 서열 또는 bar 유전자 서열로 프로브되었다. 프로브는 무작위 프라이밍(priming)(Sambrook et al. 1989)에 의해 준비되었다.

결과

아그로박테리아 감염에 적당한 캘러스 형태

다양한 조합의 2,4-D 및 BA를 함유한 MS 배지 상의 성숙 종자-유래된 타입 1 캘러스의 배양은 캘러스 타입 1∼4(표 2)의 혼합물을 나타냈다.

표 2는 다른 조합의 생장 조절자를 함유한 배지 상의 한국형 타입 1 캘러스의 다른 생장을 나타낸 것이다. 10mg의 타입 1 캘러스는 다양한 조합의 2,4-D와 BA 및 2g/L의 겔라이트를 지닌 MS 배지 상에서 28℃의 암조건에서 5주 동안 생장되었다. 각각의 수치는 10개의 캘러스로부터 계산된 평균값을 나타낸다. 캘러스형태는 : 1 = 흰-노란색, 촘촘하고 부서지기 쉽지 않음, 2 = 흰색, 촘촘하고 부서지기 쉬움, 3 = 노란색, 촘촘하고 매우 부서지기 쉬움, 4 = 투명하고 부드럽고 물기가 많음.

타입 1 캘러스 생장 상의 다른 조합의 생장 호르몬의 효과

GRC (mg/L)	캘러스 프레쉬 중량 (mg ±SE)	혼합물 비(타입1:2:3:4)
2,4-D	BA	혼합물 비(타입1:2:3:4)	총계	타입 1	타입 2	타입 3	타입 4
1	0	81.5 ±19.1	45.8 ±16.3	22.3 ±5.2	0	13.4 ±2.7	56:27:0:16
1	0.01	115.7 ±11.8	67.4 ±9.1	32.3 ±5.2	6.1 ±3.7	9.9 ±3.2	58:28:5:9
1	0.1	68.0 ±18.3	36.0 ±15.5	10.3 ±4.3	2.9 ±2.2	18.8 ±3.1	53:15:4:28
2	0	37.0 ±11.3	18.8 ±12.5	2.3 ±0.9	1.5 ±1.5	14.5 ±3.7	51:6:4:39
2	0.01	85.2 ±19.3	31.9 ±10.8	9.5 ±2.9	27.2 ±12.3	16.6 ±4.1	37:11:32:19
2	0.1	43.7 ±9.0	10.9 ±4.9	2.7 ±1.5	12.8 ±5.0	17.3 ±3.0	25:6:27:40
4	0	29.6 ±4.2	11.4 ±3.4	0	0.9 ±0.9	17.2 ±3.2	39:0:3:58
4	0.01	57.0 ±9.6	13.4 ±4.3	0	33.7 ±11.3	9.9 ±2.6	24:0:59:17
4	0.1	38.4 ±13.1	18.0 ±6.0	7.4 ±5.6	7.7 ±3.4	5.3 ±2.1	47:19:20:14
8	0.01	17.8 ±6.5	2.1 ±1.1	0	5.5 ±5.3	10.1 ±3.0	12:0:31:57

캘러스의 결과적인 4가지 타입은 형태적으로 특성화되었다. 타입 1 캘러스는 촘촘하고 부서지기 쉽지 않은 구조를 지닌 흰-노란색 또는 옅은 초록색이었다. 다수의 슈트는 일부 타입 1 캘러스의 표면에서 관찰되었다(도 1A). 타입 2 캘러스는 촘촘하고 부서지기 쉬운 구조를 지녔다(도 1B). 타입 3 캘러스는 노란색이고, 촘촘하고 매우 부서지기 쉬운 구조를 지녔다(도 1C). 타입 4 캘러스는 부드럽고 물기 많은 외형을 지닌 투명한 것이라는 점에서 유일하다(도 1D). 타입 1∼3 캘러스는 재생 가능한 반면 타입 4 캘러스는 그렇지 않다. 타입 1-2 캘러스(각각 67.4 ±9.1mg, 58% 및 32.3 ±5.2mg, 28%) 및 타입 3 캘러스(33.7 ±11.3mg, 59%)의 최상의 증식 및 발생률은 각각 1 및 4mg/L 2,4-D의 조합으로 0.01mg/L BA를 함유한 MS 배지 상에서 수득되었다(표 2). 비-재생가능 타입 4 캘러스의 발생률은 2,4-D와 조합한 0.01mg/L BA를 첨가함으로서 1.8∼3.4배 감소하였다. 따라서 1 또는 4mg/L 2,4-D와 조합한 0.01mg/L의 BA는 각각 타입 1-2 또는 3 캘러스의 더한 생장에 사용되었다. 타입 2 및 3 캘러스의 이차배양은 타입 1 캘러스 이차배양과 유사한 발생률을 지닌 타입 1, 2, 3 및 4 캘러스이 혼합물을 유발하였다. 그러나 타입 4 캘러스의 이차배양은 타입 4 캘러스만을 유발하였다. 흥미롭게는 타입 1-3 캘러스는 다른 호르몬 조합이 사용될 때 형태적 변형을 나타내었다. 더욱이 캘러스가 이차배양 전에 3일 동안 광조건 하에서 이차배양되면 슈트 유도 배지 상에서 약간의 색소결핍 식물체가 재생되는 초록색 캘러스가 나타났다(도 2C). 타입 4 캘러스 발생을 억제하고 모든 이차배양 단계에서 초록색 캘러스를 선택함으로서 캘러스 라인으로부터의 초록색 식물체의 재생성은 2년 이상 어떤 유해한 효과없이 유지될 수 있다(도 2C).

캘러스 형태와 슈트 재생성 사이의 밀접한 관계는 다양한 식물 종에서 기술되어있다. 켄터키 블루그래스(bluegrass)(Poa pratensisL.)에서 콜레옵타일(coleoptile) 및 엠브리오(embryo)로부터 유도된 캘러스는 형태와 부서지기 쉬운 성질에 기초한 4가지의 타입으로 분류되었다. 켄터키 블루그래스의 타입 4 캘러스는 부드럽고, 비-구조적이고, 투명하고, 슈트가 재생하지 않았다. 이러한 결과는 한국형 잔디에서 수득된 것과 유사하다. 켄터키 블루그래스 내의 타입 4 캘러스의 유도는 옥신에 의해서만 제어될 수 있는 반면 한국형 잔디는 시토키닌(cytokinin) 수준을 감소시킴으로서 제어될 수 있었다. 또한 아스트란갈러스 아드수르겐스(Astrangalus adsurgens)에서 배축-유도된 캘러스는 4가지의 타입으로 분류되었으나 4가지의 캘러스 타입의 어떤 것도 8개월 동안의 이차배양 후 형태적 변화를 나타내지 않았다. 이와는 반대로 타입 4를 제외한 한국형 잔디 캘러스 1-3 타입의 각각의 이차배양은 4가지의 캘러스 타입을 유발하였다. 이러한 한국형 잔디, 켄터키 블루그래스 및 아스트란갈러스 아드수르겐스 사이의 차이는 다른 종간의 차별적 재생성을 반영한다.

형질전환 효율성에 영향을 미치는 인자

캘러스 타입의 효과

MSCG1 배지 상에서 증식된 타입 1 및 2 캘러스 및 MSCG4 배지 상에서 증식된 타입 3 캘러스는 2,4-D-없는 동시-배양 배지 상에서 6일 동안 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA101(pIG121Hm)과 동시-배양되었고, 다른 캘러스 타입과 형질전환 효율성 사이의 관계를 측정하기 위해 GUS 발현 측정이 사용되었다(표 3, 도 2A).

표 3은 다른 캘러스 타입의 형질전환 효율성을 나타낸 것이다. 3가지 캘러스 타입은 2,4-D-없는 MSAS 배지 상에서 6일 동안 26℃의 암조건으로 동시-배양되었다. 3반복이 측정되었고 평균을 내었다.

한국형 잔디의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 상의 캘러스 타입의 효과

캘러스 타입	GUS 청색점/g 프레쉬 중량
1	21 ±4
2	0
3	721 ±201

GUS 발현은 타입 1 및 3 캘러스 상에서 검출되었으나 청색점은 타입 2 캘러스 상에서는 검출되지 않았다. 타입 3 캘러스는 캘러스 g 프레쉬 중량 당 721 ±201개의 청색점의 가장 높은 GUS 발현 빈도를 나타내었고, 이는 타입 1 캘러스 상에서 관찰된 것 보다 34배 더 높은 것이었다. 이러한 결과는 타입 3 캘러스가 다른 어떤 캘러스 타입 보다 더 용이하게 형질전환된다는 것을 나타낸다.

2,4-D 농도의 효과

단위 프레쉬 중량 당 청색점의 수에 의해 판단된 각각의 캘러스 타입의 형질전환 빈도는 또한 표 2에 나타난 바와 같이 동시-배양 배지 내의 2,4-D 농도에 의해 영향을 받는다. 동시-배양 배지 내의 2,4-D 농도의 효과는 MSCG4 배지 상에서 증식된 캘러스 상의 청색점의 수를 셈으로서 측정되었다(도 3). 동시-배양 9일 후 청색점은 2,4-D-없는 동시-배양 배지 상의 캘러스의 g 프레쉬 중량 당 793 ±145개였다. 그러나 청색점의 수는 2,4-D 농도가 증가함에 따라 감소하였다(도 3). 이러한 관찰은 2,4-D가 아그로박테리움-매개 형질전환 효율성 상에 부정적 효과를 지닌다는 것을 나타낸다. 아그로박테리움-매개 형질전환에서의 활성적 세포 분열에 대한 양성적 역할은 다양한 식물 종에서 논의되었다. 아마 및 가지나무에서 아그로박테리움-감염 전에 2,4-D를 함유한 재생 배지 상에서의 외식편의 전-배양은 효과적인 유전자 전달에 필수적이다. 상처난 외식편의 활성적 세포 분열은 식물 게노믹 DNA 내로의 T-DNA 단편의 통합을 크게 증진시켰다. 정확한 분자 메카니즘이 설명되어야 하지만 2,4-D-없는 동시-배양 배지가 한국형 캘러스의 세포 분열을 활성화시키거나 유전자 자체의 전달을 증진시킨다는 것이 가능하다.

동시-배양 기간

2∼3일의 동시-배양 기간은 일반적으로 콩과식물 형질전환에 사용되어온 반면 5∼7일 까지 연장된 동시-배양 기간은 릴리움 우시타티시뮴(Lilium usitatissimum), 시트랜지(citrange) 및 아가판서스(agapanthus)에서 아그로박테리움-매개 형질전환 효율성을 증가시키는 것으로 나타났다. 연장된 동시-배양 기간은 박테리아 세포의 거대한 증식을 유발하고, 일반적으로 재생 빈도를 감소시킨다. 박테리아 세포의 과생장(overgrowth)이 6일 동시-배양 기간 동안 관찰되더라도 볼텍싱에 의한 완전한 세척은 박테리아 오염으로부터 세포를 방지할 수 있고, 형질전환 빈도는 감소하지 않는다(데이터는 나타내지 않음).

동시-배양 배지 내의 CaCl ₂ 농도

아그로박테리움 투메파시엔스 형질전환 빈도 상의 CaCl₂의 효과가 연구되었다. 칼슘-없는 동시-배양 배지는 청색점을 나타내는 GUS의 수를 유의적으로 증가시켰다(도 4). 청색점은 CaCl₂-없는 동시-배양 배지 상에서 1g 프레쉬 중량 캘러스 당 1368개였고, CaCl₂농도가 증가함에 따라 감소하였다. 그러나 캘러스 생장은 칼슘-함유 배지 상에서 보다 칼슘-없는 동시-배양 배지 상에서 더 느렸다. 따라서 캘러스는 동시-배양 후 칼슘-함유 캘러스 생장 배지로 바로 옮겨져야 한다. 유사한 칼슘 효과가 히비아 브라술리엔시스(Hevea brasuliensis)에서 관찰되었다.

칼슘은 식물 내에서 병원성 감염에 반응하여 중요한 역할을 하고, 최근에는 생리학적 연구에서 논의되고 있다. 또한 아그로박테리아 세포로 감염될 때 칼슘-매개 식물 방어 기작이 한국형 잔디 내에서 작동된다. 이는 한국형 잔디 캘러스가 칼슘-없는 동시-배양 배지 상에서 더욱 용이하게 감염되는 이유를 설명한다.

아세토시린곤 농도의 효과

페놀 화합물 아세토시린곤은 아그로박테리움의 Ti 플라스미드 내의 vir 유전자 발현을 활성화시키는 유도 인자로 잘 알려져 있다. 아세토시린곤은 자포니카(japonica) 및 인디카(indica) 쌀, 파라에놉시스(pharaenopsis) 난 및 아가판서스와 같은 단자엽식물 내에서의 아그로박테리움-매개 형질전환에 중요함을 나타내었다. 또한 오이, 브로콜리, 대두 및 시트랜지와 같은 쌍자엽식물 내의 형질전환 효율성도 크게 증가시킨다.

아세토시린곤-없는 동시-배양 배지가 사용될 때 형질전환 효율성은 1g 프레쉬 중량 캘러스 당 86.3 ±24.0개의 청색점으로 매우 낮았다. 50mg/L의 아세토시린곤의 동시-배양 배지 내로의 첨가는 청색점 수를 9개까지 유의적으로 증가시켰다(도 5). 그러나 100mg/L의 농도 이상은 형질전환에 부정적인 효과를 나타냈다. 특히 200mg/L의 아세토시린곤-함유 배지 상에서 동시-배양된 캘러스는 동시-배양 후 캘러스 생장 배지 상에서 생장하지 않았다.

bar 유전자로의 한국형 잔디의 형질전환

한국형 잔디의 최적화된 형질전환 시스템을 평가하기 위해 수립된 프로토콜이 제초제-저항성 유전자(bar)를 포함한 pGPTV-HB 형질전환 벡터로 한국형 잔디 식물을 유전적으로 형질전환하느데 적용되었다. 프로토콜의 주요한 구성성분은 타입 3 캘러스의 사용 및 9일 기간의 동시-배양이었다. 동시-배양 배지는 2,4-D가 없으나 50mg/L의 아세토시린곤을 포함하였다. 동시-배양된 캘러스는 캘러스 생장 배지 상에서 증식되었고, 하이그로마이신 및 비알라포스 선택 없이 슈트가 유도되었다. 아그로박테리아 세포 오염이 125mg/L 칼베니실린-함유 배지 상에서 종종 발견되었기 때문에 2509mg/L의 칼베니실린이 슈트 유도 배지에 사용되었다.

선택은 10mg/L의 하이그로마이신 또는 5mg/L의 비알라포스를 함유한 루팅 배지 상에서만 수행되었다. 루트된(rooted) 슈트는 4주 후 나타났다. 루트된 슈트가 2∼4주 동안 신선한 선택 배지 상에서 다시 이차배양되었을 때 첫 번째 선택 배지 상에서 루트된 이스케이프(escape)는 결국 시들게 되는 반면 추정되는 형질전환 식물체는 루트되고 왕성하게 신장되었다. 저항성 식물의 빈도는 약 20.5%였다(표 4).

표 4는 아그로박테리움 투메파시엔스-감염된 캘러스로부터 재생된 슈트의 생존율을 나타낸 것이다. EHA101 (pGPTV-HB)-감염된 캘러스로부터 재생된 슈트는 5mg/L 비알라포스(B) 및 10mg/L 하이그로마이신(H)를 함유한 MSRS 배지 상에서 4주 동안 배양되었다. 생존율은 생산된 저항성 식물/플레이트된 슈트에 100배수한 수를 나타낸다.

아그로박테리움 투메파시엔스-감염된 캘러스로부터 생존된 슈트

실험	선택	플레이트된슈트	생산된 저항성식물	생존율 (%)
1	B	36	2	5.6
2	B	57	0	0
3	H	44	9	20.4
4	H	62	6	9.7
5	H	38	3	7.9
6	H	54	0	0
EHA101 (pGPTV-HB)-감염된 캘러스로부터 재생된 슈트는 5mg/L 비알라포스(B) 및 10mg/L 하이그로마이신(H)를 함유한 MSRS 배지 상에서 4주 동안 배양되었다.생존율 = 생산된 저항성 식물/플레이트된 슈트 ×100

형질전환 한국형 잔디 식물 상의 제초제 저항성 에세이

형진전환 및 비-형질전환 식물이 토양에 심어진 후 2주 동안 매일 5g/L의 허비아스 용액이 스프레이되었다. 제초제 적용 2주 후 형질전환 식물은 비알라포스 페인팅에 대해 생존하여 성체로 자랐다. 그러나 대조군 식물은 생장을 멈췄고 시들었다(도 3). 결과는 bar 유전자가 형질전환 식물 내에서 정상적으로 발현됨을 나타낸다.

DNA 겔 블럿 분석

한국형 잔디 식물의 제초제 저항성이 식물 게놈 내로 통합된bar유전자로부터 유래했음을 입증하기 위해 비알라소프-저항성 식물이 DNA 겔 블럿 분석에 의해분석되었다. 게노믹 DNA는 형질전환 식물로부터 분리되었고,HindⅢ에 의해 분해되었으며bar- 또는hpt-특이적 프로브로 하이브리다이즈되었다(도 6A). 동시에 대조군으로부터의 게노믹 DNA이 동일한 방법으로 분석되었다. 대조군 표본은 어떤 밴드도 나타내지 않은 반면(도 7B, 레인 c; 도 7C, 레인 c) 형질전환 식물로부터의 표본은bar- 또는hpt-특이적 프로브에 특이적으로 하이브리다이즈된 밴드를 나타내었다(도 7B, 레인 1; 도 7C, 레인 1). p-GPTV-HB의 T-DNA 단편이 단일 HindⅢ 사이트를 지니고 있기 때문에(도 7A), 하이브리다이즈된 밴드의 수는 형질전환 한국형 잔디 식물 내의 통합된 유전자 복제의 복제 수를 반영하였다. 검출된 밴드는 p-GPTV-HB의 맵으로부터 예측된 바와 같이(도 7A) 각각bar- 또는hpt-특이적 프로브의 1.6 또는 1.8 kb이상의 단편을 나타내었다. 이는 통합된 유전자의 복제수가 2개였음을 나타내었다(도 7B, 레인 1; 도 7C, 레인 1). BamHI 및bar유전자로 수행된 게노믹 DNA 서던 블럿은 또한 복제수가 2개였음을 나타내는 동일한 결과를 나타냈다(도 7B, 레인 2). 이러한 결과는 2개의 안정한 통합 이베트가 있고, 이는 형질전환 식물에서 관찰된 제초제 저항성은 통합된bar유전자에 의해 결정된다는 것을 나타내었다.

본 발명은 한국형 잔디의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 시스템은 밀접하게 관련된 터프그래스 뿐만 아니라 한국형 잔디의 유전적 설계를 가속시킬 것이다. 본 발명은 한국형 잔디의 유전적 형질전환, 특히 목적 유전자가 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 증진시키고 생장률을 조절하고자 하는 목적으로 한국형 잔디에 도입될 때를 위한 최적화된 배지 조성 및 배양 조건을 제공한다.

Claims

ⅰ) 다양한 호르몬을 함유한 변형된 MS 배지 상에서의 한국형 잔디 캘러스를 유도하고 생장시키고;

ⅱ) 비알라포스 저항성bar유전자를 도입하기 위해 아그로박테리움 세포로 한국형 잔디 캘러스를 감염시키고;

ⅲ) 2,4-디클로로페녹시아세트산(dichlorophenoxyacetic acid)과 칼슘이 없이 아세토시린곤(acetosyringone)을 함유한 동시-배양 배지 내에서 한국형 잔디의 캘러스 및 아그로박테리움 세포를 동시-배양하고;

ⅳ) 동시-배양 배지로부터 아그로박테리움 세포를 제거하고;

ⅴ) 형질전환 한국형 잔디를 재생시키는

단계로 구성된 한국형 잔디(조이시아(Zoysia) 속)를 유전적으로 형질전환하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 아그로박테리움 세포는 pGPT-HB 형질전환 벡터를 포함함을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 타입 3 캘러스는 동시-배양 배지 내에서 5∼7일 동안동시-배양됨을 특징으로 하는 방법
식물-특이적 프로모터의 조절 하에서bar유전자로 안정하게 형질전환되는 제 1항에 따른 방법에 의한 형질전환 한국형 잔디
제 4항에 있어서, 상기bar유전자는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터의 조절 하에서 발현됨을 특징으로 하는 형질전환 한국형 잔디
비알라포스 저항성bar유전자가 도입된 형질전환 한국형 잔디(KCTC-10076BP)