KR100218194B1 - 담배 모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 형질전환된 담배 식물체 제조방법 - Google Patents

Abstract

이 발명은 TMV(담배 모자이크 바이러스)에 대한 저항성을 갖고있는 형질전환된 식물체를 얻기위한 것임. TMV에 대한 저항성을 갖는 식물체, 특히 담배는 TMV의 C-말단을 결손시킨 434bp의 외피 단백질의 결손 유전자를 함유하는 플라스미드 pSK101 벡타를 담배 식물체에 형질 전환하여 얻음. 형질 전환된 담배식물체는 2-4세대 선발하면 완전히 TMV 저항성을 갖는 담배 식물체가 얻어짐.

Description

담배 모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 형질전환된 담배 식물체 제조방법

본 발명은 항바이러스성 단백질 발현 벡타와 담배 모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 형질전환된 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV)는 95%의 단백질과 5%의 RNA로 구성되었으며, 단백질 부의는 2130개의 단백질 작은 단위로 구성되고 각각의 단백질 단위는 153개의 아미노산으로 이루어져 있는 두께가 18nm이고 길이가 300nm인 막대모양의 바이러스이다. TMN는 연초의 대표적인 바이러스 병원체로서 연초뿐만 아니라 토마토, 고추, 콩과식물 등 많은 작물에 피해를 주고 있으며, 연초의 경우는 발병되면 품질의 30-40%, 수량의 50% 손실이 나타나는 것으로 보고되어 있다.

전술한 TMV는 숙주에 침입되어 세포내로 들어가면 입자가 팽윤되어 RNA의 숙주 세포의 80S 리보좀에 결합하여 단백질을 합성하게 되는데 이 단백질은 TMV RNA의 3¹-말단 근처에 결합하여 (-)RNA를 합성하므로서 TMV RNA의 복제에 관여하는 것으로 알려졌다. 이때 합성된 외피 단백질은 서브 유니트인 20S 티스크가 합성된 RNA 3¹-말단의 약 800-100번째 염기부위에 결합되고 이어서 서브 유니트가 각각 3¹- 및 5¹- 말단의 방향으로 자동 신장되어 바이러스가 증식하고 증식된 바이러스는 플라스모데스마타를 통하여 세포와 세포사이를 이동하면서 그물막 구조를 통하여 식물에 전반적인 감염이 이루어지는 것으로 알려졌다. TMV 바이러스의 감염으로 증상이 나타나기까지 일정한 시일이 소요되며, 감염 초기에는 연초 재배자들이 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 없기 때문에 TMV 바이러스에 한번 감염이 되면 조기에 방재할 수 없어서 연초의 품질이 저하되고 수확량이 감소되지만 아직 뚜렷한 방제 대책이 없는 실정이다. TMV 바이러스에 감염되어 나타나는 증상으로는 국부 감염 또는 전체 감염으로 이루어지는데 그 기작의 원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않고 있다.

특히, TMV는 연초 재배지에 연작하였을 때 감염되는 확률이 높아지므로 전년도에 TMV에 감염된 재배지에는 연작을 할 수 없으므로 일단 담배를 경작한 재배지에는 담배는 물론이고 TMV에 감염될 수 있는 다른 농작물도 경작할 수 없는 문제점이었다. 따라서 담배를 동일한 재배지에 연작하기 위하여는 TMV에 대한 저항성이 높은 담배 식물을 개발할 필요가 있다.

MO1. Plant Microbe. Interact.,6(3):323-330에서 레이만-필립 유와 비치알. 엔.은 TMV 외피 단백질 유전자 전체를 식물의 특정조직에서만 발현되는 프로모터, 예를 들면 식물의 물관부 및 최외각 층에서만 발현될 수 있는 pa12 프로모터 및 도관부 및 세근의 끝 부분에서만 발현되는 roIC 프로모터에 재조합하여 TMV에 저항성인 연초(N 유전자 포함됨)와 비저항성인 연초에 각각 형질전환하여 저항성 정도를 비교할 실험을 보고 하고 있다. 이 문헌에는 식물 세포 자체에는 존재하지 않는 바이러스의 외피 단백질이 식물 세포 내에 존재하게 함으로서 TMV에 감염이되어도 바이러스 증상을 완화시킬 수 있다는 내용은 있으나 연초 재배에 이용할 수 있는 구체적인 방법은 제시되지 않았다. 또한 TMV 바이러스 외피 단백질의 발현정도가 높은 형질전환 연추식물체는 1g/1 농도의 바이러스로 접종했을 때에도 전체 감염 증상이 나타나지 않았으나, 외피 단백질이 발현되지 않는 식물체에서는 0.001mg/l 농도의 바이러스로 접종했을 때에도 바이러스 증상이 나타난다는 넬슨등(1988)의 보고도 있었다.

또한, Virology, 173(1): 11-20에는 TMV 균주 L의 외피 단백질 유전자를 TMV에 대한 비저항성 N¹유전자를 포함하는 연초 식물에 형질전환하여 유전자를 돌연변이시키면서 외피 단백질의 어느 부위가 TMV 저항성에 관여하는 지를 조사한 연구 결과가 보고되었다. 이 연구는 TMV에 대한 저항성 부위를 조사하기 위한 것으로서 연초재배에 이용할 수 있는 TMV에 대한 저항성을 갖는 연초 식물을 얻기 위한 것이 아니다.

최근에는 이러한 담배 모자이크 바이러스에 대한 각종 방제방법이 연구되고 있으나 대부분의 방제 방법은 예방효과에 역점을 두고 있어서 일단 발병된 후에는 방제가 어려운 것으로 나타나고 있다. 특히 담배 모자이크 바이러스는 황색종 연초 산지에서 방제하기 어려운 병으로 알려져 있고 실제적으로 감염지역이 확산되고 있는 실정이다.

사이엔스 232; 738-743에서 아벨등은 TMV 외피 단백질 유전자를 연초에 형질전환하면 TMV의 병 증상이 지연되어 나타난다고 보고한바가 있고, EMBO J 6; 1181-1188와 바이오테크놀로지 6;403-409에서 튜머와 넬슨은 담배 래틀 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 자주개자리 모자이크 바이러스, 감자바이러스 X등의 외피 단백질 유전자를 식물에 형질전환하여 바이러스에 대한 저항성을 향상시켰다고 보고하고 있다.

다우손 등은 Proc, Natl. Acad. Sci. USA83; 1832-1836에서 TMV 는 RNA바이러스로서 약 6400개의 염기 서열로 이루어졌고 3개의 유전자 부위를 갖고 있으며, 이러한 유전자 부위 중 마지막 유전자 부위는 TMV외피 단백질로 번역되는 부분으로서 염기 서열 5712에서 시작하여 6191에서 번역이 종결되어, 약 17.6킬로달톤의 외피 단백질을 번역하는 부위로 약 480개의 염기들로 구성되어 있다고 보고하고 있다

그러나 TMV외피 단백질을 이용한 종래의 방법에 따르면 접종 바이러스의 농도가 높아지면 저항성이 나타나지 않는 경우가 있으므로 고농도의 바이러스에 대한 저항성이 있는 연초식물이 요구되고 있다.

또한 한국 특허 공보 95-12900호에는 식물체인 양자리공에서 발현되는 항바이러스성 단백질인 PAP 유전자를 cDNA 라이브러리로부터 분리하여 재조합 유전자를 제조한 후 식물 세포내에 도입하여 평질전환된 식물체를 얻는 방법이 가재되어있다. 그러나 이 방법은 현재까지 산업적으로 이용되고 있지 않다.

전술한 종래의 연구보고서들에 따르면 외피 단백질 유전자의 조직 특이적 발현 프로모터에 따른 발현정도의 차이를 분석하기 위한 연구나 또는 바이러스 대한 저항성을 갖는 식물체를 얻기 위한 연구가 있었으나, 현재까지 연초생산에 직접 사용될 수 있는 TNV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체가 얻어지지 않고 있다. 이러한 사실은 현재까지의 연구가 산업적으로 이용할 수 있는 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 생산하기 위한 목적보다는 TMV의 감염 및 병증 발현 경로를 확인하기 위한 학술적인 연구가 대부분이고 또한 담배 식물체의 형질전환에 사용되는 유전자를 적절히 선택하지 못한데서 기인하는 것으로 생각된다.

본 발명자들은 TMV의 C-말단을 결손시킨 434 bp의 외피 단백질의 결손 유전자를 사용하여 담배 식물체를 형질전환하고, TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 계속적으로 선발하는 방법에 의하면 TMV에 대한 높은 저항성을 갖는 담배 식물체를 산업적으로 대량 생산할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 연초 식물 재배에 산업적으로 이용할 수 있는 보다 우수한 TMV 항바이러스성 연초식물체를 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 TMV의 외피 단백질 746bp 중 C-말단을 결손시킨 434bp를 식물발현 벡타인 pBI 121의 CaMv 35S와 VOS 말단에 의하여 조절되는 GUS유전자를 제거한 부위에 삽입하여 제조한 pSK 101을 담배 식물체의 형질 전환에 이용하는 본 발명의 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물 생산방법에 의하여 달성된다.

본 발명은 또한 전술한 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물의 생산에 사용하는 TMV의 C-말단을 결손시킨 434 bp의 외피 단백질의 결손 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pSK 101 벡타에도 관계된다.

제1도는 플라스미드 pSK 101, 102, 103에서의 유전자 배치도.

제2도는 형질전환된 담배에 도입된 유전자를 확인하기 위한 서던 블럿 결과를 보여주는 사진.

제3도는 형질전환된 담배에 도입된 유전자가 RNA로 발현된 것을 확인하기 위한 RT-PCP 반응결과를 보여주는 사진.

제4도는 형질전환된 담배에 도입된 유전자가 단백질로 발현된 것을 확인하기 위한 웨스턴 블럿 결과를 보여주는 사진.

제5도는 연초에 도입된 유전자 434 베이스 페어(5708-6141)의 담배모자이크 바이러스 외피단백질 유전자 염기서열.

본 발명은 또한 TMV의 C-말단을 결손시킨 434bp의 외피 단백질의 결손 유전자를 함유하고 있는 pSK 101 벡타를 담배 식물체에 형질전환하여 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 생산하는 방법으로 구성된다.

본 발명은 또한 TMV의 C-말단을 결손시킨 323bp의 외피 단백질의 결손 유전자를 함유하고 있는 pSK 101 벡타에도 관계된다.

본 발명에 사용된 바이러스는 예들 들면 미국 ATCC사에서 구입할 수 있는 ATCC45061이다. 이 바이러스는 TMV 유전자중 외피 단백질 유전자를 포함하는 1320 염기(5081-6400)가 pUC 18 플라스미드에 삽입된 유전자 클론 4.2인 플라스미드이다, 이 플라스미드를 Hind Ⅲ와 Pst 1 제한 효소로 2중 처리하여 1320 절편을 분고 분리한 절편을 pBT 1.3 플라스미드를 재조합하였다. 전기한 pBSⅡ KS(+)에 해당하는 2.9kb 벤드 외에 Dra I과 Sac I을 2중 처리하여 GUS 유전자를 제거한 다음 전술한 유전자 제거 부위에 전술한 434염기(5708-6141) 절편을 재조합하여 본 발명의 항바이러스성 단백질 발현 벡타(pSK 101)를 얻는다.

전술한 방법으로 C-말단이 결손된 434bp 크기의 TMV 외피 단백질 DV전자를 형질 전환시킨 담배 식물체에서 TMV에 대한 완전한 저항성을 갖는 담배 식물체를 2-4세대 선발하는 과정을 반복하면 TMV에 대해 완전한 저항성을 갖는 품종이 얻어 진다. 따라서 본 발명에 의하면 종래 항생제를 첨가한 배지에서 스크리닝 해야하는 번거로움을 덜 수 있게 되었다.

본 발명은 TMV 외피 단백질 유전자를 갖고있는 플라스미드 pBT 1.3으로부터 C-말단을 제거하여 434bp 크기의 TMV 외피 단백질 유전자를 갖고있는 프라스미드 pSK 101을 제조하는 공정, 아그로 박테리움을 이용하여 프라스미드 pSK 101을 담배에 형질 전환하여 재분화시키고 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체 1세대를 선발하는 공정, 형질전환된 식물체에서 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 2-4세대에 걸쳐 선발하여 최종적으로 TMV에 대한 완전한 저항성을 갖는 식물체를 얻는 공정으로 구성된 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체의 생산방법도 관계된다.

본 발명은 다양하게 변이가 나타나는 TMV나 오이 모자이크 바이러스 변이주에 대하여 저항성을 갖는 담배 품종의 개발에 이용할 수 있음은 물론이고 TMV에 대한 저항성을 갖는 고추의 품종 개발에도 이용될 수 있다.

본 발명에 의하면 TMV에 대한 저항성이 우수한 담배 식물체가 얻어지므로 동일한 경작지에서 담배를 연가할 때 나타나는 담배 모자이크 바이러스에 의한 감염을 우려하지 않아도 되므로 동일한 경작지에서의 연작이 가능하며, 또한 담배의 수확량을 높이고 담배의 품질이 향상되도록 산업적으로 이용할 수 있게 된다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예]

1. 외피 단백질 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pBT 1.3의 제조방법

TMV의 3¹-말단의 5080-6395 bp cDNA를 플라스미드 pUC 18에 끼워넣은 유전자 콜론 4.2(ATCC 45061)로부터 315 bp를 추출하여 플라스미드 pBS Ⅱ KS(+)(스트라타겐사 제품)의 제한 효소 Hind Ⅲ와 Pst Ⅰ의 위치에 끼워 넣어 플라스미드 pBT 1.3을 제조하였다.

외피단백질 유전자중 크기를 434, 688, 732 bp로 다양하게 조작하게 식물발현벡타 pBI 121 또는 pGA 643에 끼워 넣어 플라스미드 pSK 101-103를 제조하였다(제1도 참조). 이들 플라스미드는 조절유전자로서 CaMV 358 프로모터와 NOS 터미네이터 및 선별형질 유전자로서 카나마이신에 대한 내성 유전자를 갖고 있다.

1) 플라스미드 pSK 101

식물발현벡타인 pBI 121 (클론텍크사 제품: 제퍼슨 등, EMBO J, 6, 3901, 1987)을 제한효소 Sma I을 처리하여 CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터에 의해 조절되는 GUS 유전자를 제거하고 제거된 부위에 외피단백질 유전자의 C 말단을 제거한 434 bp를 삽입하였다.

2) 플라스미드 pSK 102

pBI 121를 제한효소 Sac I로 절단하여 생성된 3¹ 접착형 말단을 T4 폴리머리에스의 3¹->5¹ 엑소뉴클리에이스의 활성을 이용하여 블런트 말단을 만들고, 그 말단에 블런트 Bam HI 어댑터를 붙이고, 제한효소 Sam I로 절단하여 GUS 유전자를 제거하였다. 제거된 위치에 pBT 1.3의 제한효소 Dra I과 Bam HI의 절편인 696 bp를 삽입하였다. 696 bp는 외피단백질의 5708-6395와 pBS Ⅱ KS (+)의 Bam HI 까지의 8 bp를 포함하고 있다.

3) 플라스미드 pSK 103

실물 발현 벡타인 pGA 643 (안진홍 박사로부터 분양받을 수 있다. An et al Binary Vectors in ＆ Schilperoot ed, Plant Moleclar Biology Manual Kluwer Academic Publ, up A3¹ 1-19, 1988)을 제한효소 Cla I과 Bgl Ⅱ을 처리하고, 플라스미드 pBT 1.3을 제한효소 Cla I과 Bgl Ⅱ을 처리하고, 플라스미드 pBT 1.3을 제한효소 Cla I과 Bam Ⅲ을 처리한 후 결합시켜, 745 bp를 갖고 있는 플라스미드 pSK 103를 제조하였다. pSK 103은 외피단백질 유전자인 5664-6400 까지의 737 bp와 pBSⅢ까지의 8bp를 포함하고 있다.

3. 아그로박테리움에의 형질전환

안의 방법(An Plant PHYSIOL, 79, 568, 1985)을 이용하여 플라스미드 pSK 101-103을 아그로박테리움 투메패시언스(Agrobacterium tumefaciens)에 형질전화하였다.

플라스미드 pSK 101-103 각각 11g을 아그로박테리움 트메해시언스 LBA 4404 또는 A281 균주에 해동법으로 형질전환하고, 카나마이신 50mg/1를 첨가한 AB배지(NH₄Cl 1000mg, MgSO₄ 300mg, KCl 150mg, CaCl₂ 10mg, FeSO₄ 2.5mg, K₂HPO₄ 3000mg, NaH₂PO₄ 1150mg, 글루코스 5000mg/l, pH 7.0)에서 28℃에서 48시간 동안 배양하여 A 101, A 102, A 103, L 101, L 102, L 103을 선발하였다.

본 플라스미드 pSK 101을 아그로박테리움 투메패시언스 LBA 4404에 도입하여 한국과학기술원 유전자은행에 1966년 5월 20일 KCTC8743P로 기탁하였다.

4. 담배의 재분화

온실에서 4-8주 재배한 담배 품종 NC 82 또는 KF109의 잎을 차아염소산으로 표면살균하고 11cm 크기로 절단한 엽육 조직에 카나마이신 50mg/l을 첨가한 YEP배지(이스트익스트렉트 10g, 박토펩톤 10g, NaCl 5/l, pH 7.0)에서 24시간 배양한 형질전환된 아그로박테리움 A 101, A 102, A 103, L 101, L 102, L 103 균주를 접종하고 2일 동안 동시 배양하였다. 동시 배양 후 카나마이신 100mg/l과 세포탁심 300mg/l을 첨가한 재분화 배기(6-벤질아데닌 0.5mg/l를 첨가한 무라시게-스쿠그 배지)에서 28 ±2℃에서 형광등으로 2500록스로하여 16시간 동안 배양하여 재분화 담배식물체 200여 주를 얻었다.

본 발명에서 TMV에 대한 저항성은 인공적으로 감염시키는 방법을 사용하여 확인하였다.

5. TMV에 저항성을 나타내는 재분화 식물체의 선발

바이러스에 대하여 저항성을 나타내는 재분화 식물체를 선발하는 방법(Noordam, Identification of Plant viruses, Medthods and exreriments, p19, Center for Agricultral Publishing and Documentation, Wagenigen, 1973)을 이용하여 TMV에 저항성을 나타내는 재분화 식물체를 선발하였다.

1)재분화 담배 식물체

각 식물체를 카나마이신 100mg/l이 함유된 무라시게-스쿠그 배지에 옮겨 뿌리를 유기하고, 내부온도를 25℃로 유지하는 온실에서 자연광을 이용하여 매일 오전에 한번씩 급수하는 조건으로 재분화 식물체를 재배하고, 꽃이 피면 7-8송이만 남겨놓고 나머지 꽃송이를 제거한 뒤 자가수분용 봉지를 씌워 완숙된 종자를 수화하였다.

종자를 파종하고, 자엽이 나왔을 때 육묘용 포트에 가식하고 본엽이 나오면 플라스틱 포크에 이식하거나 또는 1포기씩 포장에 이식하였다. 포장에서 휴주간 거리는 10545cm(2116주/10아르)이며, 시비량은 10아르당 연초용 복합비료 80Kg, 퇴비 1320Kg을 전량 기비로 시비하여 개량 멀칭법으로 재배하였다.

2)TMV에 대한 저항성 조사

담배 품종 NC 82에 접종하여 증식한 TMV를 0.01M 인산 완충액(pH7.0)으로 희석하여 TMV 50mg/l을 카보란덤과 솜방망이를 이용하여 물리적인 방법으로 4-5엽시기에 최대 엽을 포함한 2-3엽에 접종하고 초기 접종 후 2주 후부터 일주일 간격으로 8주까지 병증 발현을 조사하였다.

병증 발현 지연주가 pSK 101로부터 9주, pSK 103로부터 3주 선발되었고, 이를 #1120, #1122, #1123, #1125, #1126, #1128, #11211, #1210, #1220, #3210, #3121, #3122로 명명하였다. 그러나 pSK 102로부터는 색물체가 재분화되었으나, 병증 발현 지연주를 선발하지는 못하였다.

6. 분자생물학적으로 형질전환된 외피단백질 유전자 발현의 확인

카나마이신 내성 검사, 서던블럿과 RT-PCR 방법 등 분자생물학적인 시술의하여 재분화된 형질전환 담배 식물체에서 외피단백질 유전자가 확인되었다. 그러나 대조군으로 사용한 형질전환되지 않은 담배에서는 음성으로 나타났다.

1)카나마이신 내성 검사

형질전환 식물체의 엽육 조직을 11cm 크기로 절단하여 카나마이신 100mg/l이 함유된 재분화 배지에서 배양하였다. 대조군인 정상적인 NC 82는 카나마이신이 함유된 배지에서는 생장하지 못하였지만, 표지유전자로 삽입한 NPT Ⅱ 유전자가 발현된 형질전환 식물체들은 모두 생장하였다.

2) 서던블럿

형질전환된 담배 식물체 엽 조직으로부터 추출액(0.1M Tris, pH 8.0, 50mM EDTA, 0.5M NaCl, 10mM 2-머캅토에타놀)을 사용하여 염색체 DNA를 추출하였다(Roger ＆ Bendlich, Extractin of DNA from plant tissues. in Gelvin ＆ Schilperoort ed, Plant molecular biology manual, Kluwer Acadomic Publ, Dordrecht A 6.1 -10 1988). 추출한 DNA를 제한효소 Eco RI와 Hind Ⅲ로 이중처리하여 0.8% 아가로스 겔에서 분리하여 나일론 막에 이동시키고, 플라스미드 pSK 101을 제한효소 Eco RI와 Hind Ⅲ로 이중처리하여 얻은 1.5 kb 절편을 32P-CTP로 라벨하여 제조한 프로브와 65℃, 24시간 반응시킨 후, X선 필름에 24시간 노출시켰다. 서던블럿에서 재분화된 형질전환 담배 식물체는 외피단백질 유전자를 갖고 있는 것으로 나타났다( 제2도 참조 )

각 열을 소개하면, 1열 NC 82(대조군); 2열 #1210, 3열 #1214, 4열 #1120, 5열 #1123(pSK 101로 형질전환시킨 식물체); 6열 #3120, 7열 #3122(pSK 103으로 형질전환시킨 식물체)이다. 각 열에서 1열은 형질전환하지 아니한 대조군이고, 2-5열은 pSK 101로 형질전환시킨 식물체이다. 각 열에서 1열은 형질전환하지 아니한 대조군이고, 6,7열은 pSK 103으로 형질전환시킨 식물체이다.

pSK 101로 형질전환시킨 식물체에서는 1.5Kb 크기의 밴드가, pSK 103으로 형질전환시킨 식물체에서는 1.8Kb 크기의 밴드가 확인되었다.

3) RT-PCR

형질전환 식물체의 엽육 조직으로부터 구아니듐 티오시안네이트법으로 RNA를 추출하였다(Vries et al. Isolation of total and polysomal RNA from plant tissues in Gelvin ＆ Schilperoort ed. Plant molecular biology manual, Kluwer Academic Publ Dordreeht A 6.1 - 10 1988). 추출한 RNA 2.51g에 몰로니나 무린 류케미아 바이러스 RNA 의존성 DNA 폴리머레이스(뵈링거 만하임사 제품) 100U/㎕을 처리하여 cDNA를 합성하고, 프라이머 1: 5¹-ACTCC-ATCTC-AGTTC-GTGTT C-3¹와 프라이머 2: 5¹-CGAGT AGCAT CTAAC GTTTC C-3¹ 및 역전사 효소(뵈링거 만하임사 제품)을 첨가하여 25℃에서 5분간 방치하고 42℃에서 60분간 반응하여 얻어진 RT-PCR 반응물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.

결과는 제3도와 같다.

각 열을 소개하면, 1열 NC 82(대조군); 2열 #1214, 3열 #1120, 4열 $1123, 5열 #1210(pSK 101로 형질전환시킨 식물체); 6열 #3120, 7열 #3122(pSK 103을 형질전환시킨 식물체)이다.

제3도의 1열은 정상 NC 82로서 DNA 밴드를 볼 수 없었고, 2-7열은 현질전환 식물체로서 320bp 크기의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 따라서 형질전화 식물체 DNA에 삽입된 TMV 외피 단백질 유전자는 mRNA로 전사됨을 알 수 있었다.

4)웨스턴 블럿

형질전환 담배 실물체의 엽육 조직 1g을 액체질소에 얼린 후 마쇄하여 추출한 단백질을 12.5% SDS-PAGE로 분리한 다음, 완충용액 내에서 세미드라이 트랜스칙셀을 이용하여 니트로-셀룰로우스 페이퍼에 전이하였다. 전이된 니트로-셀룰로우스 페이퍼를 TMV 항체를 일차 항체로, 고트 안티래빗 포옥시데이스를 이차 항체로 이용하여 웨스턴블럿을 실시하였다(제4도 참조). TNV에 대한 항체는 순수 분리한 바이러스를 토끼에 주사하여 항체가 형성된 것을 확인한 후 토끼의 혈청에서 항체를 분리한 것으로, 한국인삼연초연구원에서 제조하였다.

제4도의 각 열을 설명하면 1열 NC 82(대조군); 2열 #1210, 3열 #1214, 4열 #1120, 5열 #1123(pSK 101로 형질전화시킨 식물체); 6열 #3120, 7열 #3172(pSK 103로 형질전환시킨 식물체)이다.

형질전환 식물체에서 약 14.2Kb 크기의 밴드를 확인할 수 있었다.

이상에서 TMV에 대한 저항성을 갖는 형질전환 식물체에는 TMV의 외피단백질 유전자가 존재하며, 외피단백질로 발현됨을 알 수 있었다.

5) #1210의 특성

TMV 농도를 1mg/l 이상으로 증가시켜도 TMV 증식 억제효과는 유지되었는데, 이러한 결과는 TMV의 농도를 높였을 때 종래 방법으로 형질전환된 품종이 TMV에 감염되었다는 보고 (Powell et al. SCIENCE. 232, 738, 1986)와 다른 것이다.

#1210과 대조구로서 담배 품종 NC 82에 TMV를 접종하고 각각 38℃와 28℃에서 1 또는 2주간 처리하고, 반엽접종법을 행하였다. 반엽접종법은 접종엽과 그 상층부에 위치하는 엽을 차례로 취하여 인산완충액으로 50배 희석한 후 TMV 병증이 용이하게 나타나는 담배 품종 잔티-NC 에 접종하여 나타난 반점의 수를 비교하는 방법이다(Noordam, Identification of Plant viruses, Medthods and experiments, p19, Center for Agricultural Publishing and Documentation, Wagenigen, 1973).

결과는 표 1과 같다.

1210은 38로 처리하였을 때, 실온에서 보다 TMV 증식이 억제되었으며, 병증 발현을 지연시켰다. 그러나 대조군에서는 1주간 처리한 경우에도 접종엽과 상위엽에 100% 감염되었다.

이상에서 #1210는 TMV에 감염되었다 할지라도 뜨거운 여름철에 병증발현이 없고 생장할 수 었음을 확인하였다.

7. 후대 검정

#1210(제1세대)를 중심으로 형질전환 식물체들을 2세대에서 4세대까지 검정하여 저항성주를 선발하였다.

1) 2세대 검정

#1210, #1128, #1126, #1122, #1214 등 형질전환된 6개 식물체 각각을 자가수분하여 종자를 얻었다. 2세대를 온실에 이식하였으며, 이식묘의 잎이 2-3개로 전개될 때 TMV를 접종하였다. 일부는 포장에서 재배하였으며, 이식 후 4-5엽기의 어린 묘에 TMV를 접종하였고, 접종후 3주에서 9주까지 4차에 걸쳐 조사하였다.

저항율은 포장 또는 온실에 이식한 담배 식물체에 TMV를 인공 감염한 후 병증이 전혀 나타나지 않은 식물체 수를 실험에 사용한 저제 식물체 수로 나눈 백분율이다.

결과는 표 2와 같다.

#1210의 2세대 식물체의 저항율은 TMV 접종 1개월 후 68%, 2개월 후, 57%이었다. 그러나 나머지 식물체들의 저하율은 #1128이 3.8%, #1126은 11.11%, #1122는 13.58%, #1120은 8.75%이었고, #1214, #3120, #3121, #3122등은 0%로 매우 저조하였다.

이상에서 외피단백질 유전자 전체가 형질전환되었을 때 보다 C-말단이 결손된 유전자가 형질전환되었을 때 저항율이 높아지는 것으로 판단되어, 담배 품종을 육성하기 위한 후대검정에서는 C-말단이 결손된 유전자로 형질전환된 식물체를 대상으로 실험하였다.

2) 3세개 검정

#1210의 2세대에서 저항성 식물로 구분된 251주를 자가수분하여 종자를 얻었으며 3세대는 온실에서 재배하여 4-5염기의 어린 묘에 TMV를 접종하고, 매주 한 번씩 8회에 거쳐 저항률을 조사하였다.

결과는 표 3과 같다.

3세대 식물체의 저항률은 TMV 접종 4주 후에는 최고 77% (V138)에서 최저 36%(F 3-13), 평균 60%이었으며 8주 후에는 최고 65%(V139)에서 최저 17%(F 3-13), 평균 50%이었다.

3세대 식물체에 대하여 항혈청학적인 방법을 도입하였을 때에도 TMV는 검출 되지 않았으며, 연초수확 시기가 되도록 TMV는 나타나지 않았다.

3) 4세대 검정

3세대 선발된 지향성 식물체 530주를 자가수정하여 종자를 체종하고 선발된 식물체의 종자를 발아시킨 가식묘를 포장에 이식하였다. 이식 2주후에 카보란덤을 이용한 물리적인 방법으로 TMV를 접종하여 매주 한번씩 모두 9회에 걸쳐 지항률을 조사하였다.

결과는 표 4와 같다.

4세대 식물체들의 저항률은 접종 4주후에 최고 100%(# 0816)에서 최저 50%(# 1105), 평균 77.8%이었으며, 8주 후에는 최고 100%(# 0816)에서 최저 30%(#0125), 평균 70%이었다.

이상의 결과를 저항률 면에서 정리하면 2세대에서는 접종 4주 후 0-69%, 8주후 O-64%, 3세대에서는 접종 4주 후 32-77%, 8주 후 16-64%, 4세대에서는 접종 4wnn후 50-100%, 8주 후 80-100%로 세대가 증가함에 따라 지항률이 증가하였다.

특히 4세대에서 완전 지항성인 #0816 식물체를 선발할 수 있었다.

#0816 식물체 101주를 포장에 이식하고 55주를 온실에 이식하여 TMV를 인공 접종하고 저항률을 조사한 결과 접종 4주 후나 8주 후까지도 100%의 저항률을 나타내었다. 이 식물체는 #1210(1세대)에서 유래된 것이다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이 TMB의 외피단백질 745 bp중 C-말단을 결손시켜 434bp를 식물에서 발현되는 벡타에 제조합하고, 상기 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pSK 101을 담배에 형질전환하였을 때 나타나는 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체(제1세대)를 선발하고, TMV에 대한 저항성을 기준으로 계속적으로 선발하여 4세대만에 완전히 저항성을 갖는 담배 품종 #0816을 육종할 수 있었다.

Claims (4)

1. TMV의 C-말단을 결손시킨 434 bp의 외피 단백질의 결손 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pSK 101 벡타.
2. 제1항에서, 전술한 벡타가 TMV의 외피 단백질 746bp 중 C-말단을 결손시킨 434bp를 식물발현 벡타인 pBI 121의 CaMv35S와 NOS 말단에 의하여 조절되는 GUS 유전자를 제거한 부위에 삽입하여 제조한 것임을 특징으로 하는 pSK 101 벡타.
3. TMV의 C-말단을 결손시킨 434 bp의 외피단백질의 결손 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pSK 101을 담배에 형질전환하고, TMV에대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 계속적으로 선발하는 방법으로 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 계속적으로 선발하는 방법으로 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 얻는 방법.
4. 제3항에서, 이 방법이 TMV의 C-말단을 결손시킨 434 bp 외피단백질의 결손유전자를 담배에 형질전환하여 얻어진 담배 식물체 중에서 TMV에 대한 저항성을 갖는 담배 식물체를 4세대까지 선발하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.