DE69306067T2 - Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die das antivirale Protein aus Phytolacca exprimiert - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die das antivirale Protein aus Phytolacca exprimiert

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor für ein antivirales Protein, insbesondere einen rekombinanten Expressionsvektor für das aus Phytolacca americana L. isolierte antivirale Phytolacca-Protein, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer daraus transformierten transgenen Pflanze.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Da Pflanzen aufgrund ihrer Unbeweglichkeit den aufgebrachten Pathogenen nicht entfliehen können, müssen sie dazu in der Lage sein, sich durch eine direkte oder indirekte Antwort auf den pathogenen Angriff zu wehren; wobei in den meisten Fällen die Pflanzen einen gewissen allgemeinen Verteidigungsmechanismus in Kraft setzen, um sich selbst gegen aufgebrachte Pathogene, beispielsweise Pilze, Bakterien und Viren, zu schützen.
  • In diesem Zusammenhang ist berichtet worden, daß der aus Phytolacca americana L. isolierte rohe Extrakt in vivo die Polypeptidsynthese inhibiert (siehe R.A. Owens et al., Virology, 56 (1973), 390-393) und daß dieser Bericht die Untersuchungen des aus Phytolacca americana L. isolierten antiviralen Phytolacca-Proteins ("PAP" = Phytolacca Antiviral Protein) beschleunigt hat. Unter diesen Umständen wurden solche PAP-Proteine, wie PAP-I und PAP-II, die im Frühling bzw. Sommer gebildet werden, und PAP-S, welches aus Samen gebildet wird, seit den frühen 1970-er Jahren entdeckt und isoliert (siehe: J.D. Irvin et al., Arch. Biochem. Biophys., 169 (1975), 522-529; J.D. Irvin et al., Arch. Biochem. Biophys., 200 (1980), 418-425; I. Barbien et al., Biochem. J., 203 (1982), 55-59).
  • Andererseits hat sich als Ergebnis von umfangreichen Untersuchungen des PAP im Molekülbereich gezeigt, daß PAP-Proteine die 60S Ribosom-Untereinheit der eukariotischen Polypeptid-Synthesemaschine inaktivieren, welches ein allgemeines Phänomen ist, da auch andere Ribosom-inaktivierende Proteine (RIP) diese Untereinheit inaktivieren (siehe: L.L. Houston et al., J. Biol. Chem., 258 (1983), 9601-9604). Es ist weiterhin berichtet worden, daß PAP im Cytosol synthetisiert und daraus sekretiert wird und bei der Bekämpfung von pathogenen Viren involviert ist, wenngleich der detaillierte Mechanismus der Virusinaktivierung nicht bewiesen worden ist (siehe: M.P. Ready et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83 (1986), 5053-5056).
  • Die Struktur und die Basensequenz des PAP-Genoms, einer Multigenfamilie, wurde charakterisiert und bestimmt (siehe: Q. Lin et al., Plant Mol. Biol. 17 (1991), 609-614); und daher sind die Anstrengungen auf diesem Gebiet fortgesetzt worden im Hinblick auf die Entwicklung eines Expressionsvektors für PAP und einer daraus transformierten transgenen Pflanze.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, daß PAP durch einen rekombinanten Expressionsvektor gebildet wird.
  • Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, einen neuen rekombinanten Vektor zu schaffen, der das aus der cDNA-Bibliothek von Phytolacca americana L. isolierte PAP-Gen enthält.
  • Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung bestehen darin, ein Verfahren zur Herstellung von PAP, einem antiviralen Protein, aus transgenen Pflanzenzellen, die mit dem rekombinanten Vektor transformiert worden sind, und ein Verfahren zur Steigerung der Pflanzenresistenz gegen infektiöse Viren anzugeben.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die oben angesprochenen und weitere Gegenstände und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, in der auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, in denen:
  • Fig. 1 die vollständige Nucleotidsequenz des aus der cDNA-Bibliothek isolierten PAP-Genoms darstellt;
  • Fig. 2 ein stufenweises Konstruktionsschema des Expressionsvektors pJRM100 wiedergibt;
  • Fig. 3 eine Fotografie darstellt, welche das Agarosegel-Elektrophoresemuster des Expressionsvektors pJRM 100, der mit Restriktionsenzym digeriert worden ist, zeigt;
  • Fig. 4 eine Fotografie zeigt, welche eine mit pJRM 100 transformierte transgene Tabakpflanze wiedergibt;
  • Fig. 5 eine Fotografie zeigt, welche das Ergebnis der Immunodiffusionsuntersuchung von gereinigtem PAP wiedergibt;
  • Fig. 6 eine Fotografie zeigt, welche die Southern Blot-Analyse von aus transgenen Tabakpflanzen isolierter DNA darstellt;
  • Fig. 7 eine Fotografie darstellt, welche die Southern Blot-Analyse der aus transgenen Tabakpflanzen isolierten RNA wiedergibt; und
  • Fig. 8 eine Fotografie zeigt, welche die Ergebnisse der lokalen Verletzungsuntersuchung der transgenen Tabakpflanze verdeutlicht.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfinder haben einen rekombinanten Expressionsvektor pJRM 100, der das aus der cDNA-Bibliothek von Phytolacca americana L. isolierte PAP-Gen enthält, sowie eine daraus unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens als Mediator transformierte transgene Pflanze entwickelt.
  • Zur Isolierung des PAP-Gens haben die Erfinder die gesamte zelluläre mRNA von Blättern von Phytolacca americana L., die in Korea gewonnen worden ist, gereinigt und daraus eine cDNA-Bibliothek erzeugt. Das PAP-Gen wird durch eine Immunoscreening-Methode, bei der Anti-PAP-Antikörper verwendet werden, selektiert und es wird unter Verwendung des Erase-a-Base-Systems (Promega, USA) eine Deletionsmutante aus dem isolierten PAP-Gen hergestellt. Die DNA-Sequenz des PAP-Genoms wird gemäß der Sangerschen Dideoxy-Kettenterminationsmethode bestimmt (siehe: F. Sanger, Science, 214 (1981), 1205-1210).
  • Für die Expression des isolierten PAP-Gens wird die 5'-Stelle des PAP-Gens bezüglich der translationalen Initiationsstelle (d. h. ATG) deletiert und an einen BamHI-Linker ligiert, während die 3'-Stelle mit HindIII gespalten, mit dem Klenowschen Fragment behandelt und mit dem BamHI-Linker verknüpft wird. pJRM100 für die Expression von PAP wird dadurch gebildet, daß man BamHI- Fragmente mit einem binären Vektor pBI121 verknüpft (Clonetech, Lot. #6019- 2). Dieser neue rekombinante Vektor, pJRM100, ist am 07. August 1992 bei der Korean Collection for Type Culture (KCTC), einer internationalen Hinterlegungsstelle (IDA), unter der Hinterlegungsnummer KCTC 0052BP hinterlegt worden.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, ein Mediator für die Pflanzenzellentransformation, wird mit dem pJRM 100 transformiert und es wird eine Transformation der Pflanzenzelle mit dem Organismus angeschlossen. Die Schößlinge werden auf einem MS selektiven Medium, welches 200 mg/ml Kanamycin und 500 mg/ml Carbenicillin enthält, eingebracht und das Wurzelwachstum wird aus den Schößlingen induziert. Die in diese Weise erhaltene Pflanze wird für das kontinuierliche Wachstum in einen Topf überführt. Die Immunodiffusionsuntersuchung wird dazu verwendet, die Expression des PAP-Gens zu untersuchen, wobei Southern- und Northern-Blot-Methoden dazu verwendet werden, die richtige Insertion bzw. Transkription des PAP-Gens zu untersuchen. Die Resistenz der transgenen Pflanze gegenüber Virusinfektionen wird durch lokale Läsionsuntersuchung geprüft.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne die Erfindung jedoch einzuschränken.
    • Beispiel 1: Isolierung des PAP-Genoms
  • Man isoliert PAP nach der Methode von Irvin (siehe: J.D. Irvin et al., Arch. Biochem. Biophys., 169 (1975), 522-528) in Reinkultur. Man löst 480 µg PAP in einer PBS-Lösung und versetzt mit dem vollständigen Freundschen Adjuvans in einem Verhältnis von 1:1 (Vol./Vol.) und verabreicht die erhaltene Mischung intramuskulär an Kaninchen (mit einem Körpergewicht von etwa 3 kg). Nach 3 Wochen wird die Antikörperbildung in einer geringen Menge des dem Kaninchen entnommenen Bluts nachgewiesen und man vereinigt 750 µg PAP mit dem vollständigen Freundschen Adjuvans in einem Verhältnis von 1:1 (Vol./Vol.), um die Antikörperbildung weiter anzuregen. Dann gewinnt man die Plasmafraktion durch Fraktionieren des Bluts durch Zentrifugieren und benützt eine Protein-A-Agarose- Säulenchromatographie zur Isolierung des Antiplasmas. Die Immunodiffusionsuntersuchung und die Elektrophorsetechnik werden dazu angewandt, die Antikörperbildung bzw. die Homogenität des isolierten PAP zu untersuchen. Die gereinigten PAP-Antikörper werden bei -70ºC gelagert und dazu verwendet, das PAP-Gen aus der cDNA-Bibliothek zu isolieren.
  • Zur Isolierung der mRNA aus den Blättern von Phytolacca americana wird das Blattgewebe unter Verwendung von flüssigem Stickstoff homogenisiert, worauf man zu dem in dieser Weise bereiteten Homogenisat eine Pufferlösung zusetzt, um die gesamte RNA zu isolieren, wonach das Material zentrifugiert wird. Man isoliert die gesamte Zell-RNA durch LiCl-Sedimentation aus der überstehenden Flüssigkeit. Die mRNA wird unter Anwendung der Oligo(dT)-Cellulose-Säulenchromatographie aus der gesamten RNA isoliert, worauf die isolierte mRNA für die DNA-Synthese eingesetzt wird.
  • Unter Anwendung der reversen Transkriptase M-MuLV wird aus der Matrix- mRNA ein erster DNA-Strang synthetisiert, woran sich die Synthese des zweiten DNA-Strangs durch E. coli DNA-Polymerase anschließt. Die mit dem E. coli- Adapter verknüpfte, synthetisierte cDNA wird einer Fraktionierung mit einer Sephacryl S-400 beschickten Drehsäule in Abhängigkeit von der Molekulargröße der cDNA unterworfen. Die fraktionierte cDNA wird mit dem Uni-Zap XR-Vektor (Stratagene Co., U.K.) verknüpft, woran sich eine in vitro-Verpackung unter Verwendung eines Packungsextrakts anschließt. Dann wird eine Immunodiffusionsanalyse unter Verwendung von Anti-PAP-Antikörpern durchgeführt zur Isolierung des PAP-Gens aus der in dieser Weise bereiteten cDNA-Bibliothek. Kompetente E. coli XL 1-Blue wird auf Petrischalen mit Phagen unter Bildung einer Plaque von 2 x 10&sup4; pfu infiziert. Die Bakterien werden während 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, worauf nach dem Abdecken mit 3 ml Top-Agarose eine Inkubation während 3,5 Stunden bei 42ºC angeschlossen wird. Dann wird die Platte mit Hybond- N+(Amersham) bedeckt und weiter während 5 Stunden inkubiert. Nach einer Reiheninkubierung wird Hybond-N+ mit Rinderserumalbumin blockiert und es werden 5 mg/ml Anti-PAP-Antikörper zugesetzt. Nach der Entferung der freien Anti- PAP-Antikörper, die nicht an PAP gebunden worden sind, läßt man einen mit Peroxidase konjugierten zweiten Antikörper mit dem Anti-PAP-Antikörper reagieren. Die in dieser Weise gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe werden mit Hilfe einer Chlornaphthol-Behandlung nachgewiesen.
  • Es schließt sich dann eine zweite Immunoscreening-Maßnahme mit 15 Klonen an, die bei der ersten Immunoscreening-Methode erhalten worden sind, wobei in ähnlicher Weise wie oben beschrieben gearbeitet wird, mit dem Unterschied, daß die Plaque-Zahl 5 x 10³ pfu beträgt. Mit den bei dem zweiten Immunoscreening- Verfahren erhaltenen Klonen wird eine dritte Immunoscreening-Maßnahme durchgeführt, wobei die isolierten acht Plaques bei dem weiteren Experiment eingesetzt werden.
  • Um Phagmide von acht rekombinanten Uni-Zap XR-Phagen, die bei der dritten Immunoscreening-Methode erhalten worden sind, zu übertragen, wird eine in vivo-Ausschneidetechnik unter Verwendung des R408 Helper-Phagen durchgeführt. Die Plasmide werden mit Hilfe einer Alkali-Denaturierungsmethode aus den in diese Weise selektionierten vier Kolonien isoliert (siehe: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), S.368-369) und die Kolonien, welche das PAP-Gen bilden, werden mit Hilfe einer Restriktionsenzym-Exzisionsmethode gescreent.
  • Von in diese Weise gescreenten Klonen werden Plasmide aus zwei Klonen isoliert und die PAP-cDNA-Insertion wird mit Hilfe der Dideoxy-Kettenterminationsmethode sequenziert. Zur Bestimmung der vollständigen Basensequenz des PAP- Gens wird die DNA aus das PAP-Gen erzeugenden Mikroorganismen gereinigt. Die in dieser Weise gereinigte DNA wird mit SacII und BamHI digeriert und die Deletion erfolgt durch intermittierende ExoIII-Exzisionsreaktion unter Verwendung des Erase-a-Base-Systems (Promega, USA). Die deletierte DNA wird durch T&sub4;- DNA-Ligase verknüpft, worauf sich eine Transformation mit kompetenten XL1- Blue-Zellen anschließt, welche mit einer CaCl&sub2;-Lösung hergestellt worden sind. Zur Bestimmung der DNA-Sequenz wird die über die Molekülgröße fraktionierte Deletions-Mutante verwendet.
  • Nach der Einzelstrangbildung durch die Alkali-Denaturierungsmethode wird die vollständige DNA-Sequenz des PAP-Genoms mit Hiffe der SEQUENASE VERSION 2.0 (United States Biochemical, USA) unter Verwendung eines Primers, wie T&sub7; Promotor-Primer oder eines Universalen Reversions-Primers, bestimmt. Wie in der Fig. 1 dargestellt ist, umfaßt das PAP-Genom 1195 Basenpaare eines offenen Leserasters; wobei die cDNA-Insertion des PAP 313 Aminosäurereste codiert, von denen 22 Reste als Signalpeptid wirken. Das Polyadenylierungssignal (AATAAA), welches in der mRNA der meisten Pflanzen und Tiere ubiquitär auftritt, scheint 17 Basenpaare oberhalb der Polyadenylierungsstelle angeordnet zu sein. Die in Ribosom-inaktivierenden Proteinen vorherrschende Aminosäuresequenz (RIP: Abrin A , Luffin-a, MAP, Ricin A., Trichosanthin und S06) findet sich auch indem PAP-Gen (Ile-Gln-Met-Val-Ser-Glu-Ala-Arg-Phe-Lys-Tyr-Ile), welche als die aktive Stelle von RIP mit Enzymaktivität bestimmt wurde.
  • Es wurde wie folgt eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt zur Lokalisierung des PAP-Gens in Phytolacca americana: Die gesamte DNA wurde aus Phytolacca americana isoliert, mit HindIII und EcoRI digeriert und die daraus gebildeten Fragmente wurden elektrophoretisch auf 0,8% (Vol./Gew.) Agarosegel getrennt. Die DNA wird auf Hybond-N+ übertragen und unter Verwendung eines 0,52 kb EcoRI-Fragments der PAP-cDNA-Insertion als Sonde unterworfen. In diesem Zusammenhang ist zu sagen, daß die Sonde durch mit Hilfe eines Nick-Translationkits (Promega, USA) bereitet wurde und mit α-³²P-dATP markiert wurde.
  • Die Northern-Blot-Analyse wurde wie folgt durchgeführt: Aus Phytolacca americana isolierte Poly(A)-mRNA wird auf 1 % (Vol./Gew.) Agarosegel, welches 10 % (Vol./Vol.) Formaldehyd enthält, einer Elektrophorese unterworfen. Die in dieser Weise fraktionierte RNA wird auf Hybond-N+ übertragen und einer Hybridisierung unterworfen unter Verwendung des 0,52 kb EcoRI-Fragments. das auch bei der oben angesprochenen Southern-Blot-Analyse eingesetzt worden ist.
    • Beispiel 2: Manipulierung der 5'- und 3'-Stellen des PAP-Genoms
  • Zur Translation des PAP-Gens unter Verwendung des CaMV 35S Promotors sollte die 5'-Stelle des PAP-Genoms wie folgt bezüglich der translationalen Insertionsstelle (ATG) deletiert werden: Das PAP-Gen wird mit SacII und BamHI einer doppelten Restriktion unterzogen und dann während 10 Sekunden bei 30ºC einer Behandlung mit ExoIII unterworfen. Durch eine S&sub1;-Nucleasebehandlung wird eine deletierte DNA mit 30 Bp gebildet und mit T&sub4; DNA-Ligase an den BamHI-Linker verknüpft. Das in dieser Weise erhaltene DNA-Fragment wird mit kompetentem XL1-BLUE transformiert und sequenziert zur Selektion der gebildeten Kolonie und zur genauen Lokalisierung der Terminatorsequenz. Die deletierte DNA wird selektiert und für die weitere Untersuchung verwendet. Zur Verknüpfung der 3'- Stelle des PAP-Gens mit dem Nopalinesynthase-Terminator ("Nos Terminator") wird das Gen mit HindIII digeriert, mit den Klenowschen Fragment behandelt und dann mit dem BamHI-Linker verknüpft, woran sich die Selektion des interessierenden Gens anschließt.
    • Beispiel 3: Manipulierung des binären Vektors pBI121 und Herstellung des Expressionsvektors pJRM 100
  • Zum Klonen des 1,0 kb BamHI-Fragments des PAP-Genoms mit dem binären Vektor pBI121 (Clonetech, Lot. #6019-2) wird die SstI-Restriktionsstelle in der Nähe des Nos-Terminators wie folgt durch die BamHI-Restriktionsstelle substituiert: Man behandelt pBI121 mit SstI und erhält die interessierende DNA nach der Behandlung mit dem Klenowschen Fragment und der Ligation an den BamHI-Linker. Das 1,0 kb BamHI-Fragment des PAP-Gens wird auf Agarosegel fraktioniert und durch unidirektionale Elektroelution isoliert. In ähnlicher Weise wird pJRM 100 bereitet durch Verknüpfen von 11,06 kb BamHI-Fragmenten von pBI121 miteinander mit Hilfe der T&sub4;-DNA-Ligase. Das in diese Weise erhaltene pJRM 100 wird mit CaCl&sub2;-kompetentem XL1-BLUE, welches mit CaCl&sub2; behandelt worden ist, transformiert. pBI121, die das 1,0 kb BamHI-Fragment enthalten, werden in analoger Weise selektioniert und isoliert.
  • Die Beispiele 2 und 3 werden durch das in der Fig. 2 dargestellte Schema verdeutlicht. Die Fig. 3 verdeutlicht das Agarosegel-Elektrophoresemuster des mit HindIII und XhoI digerierten pJRM 100 (Spur 1: λDNA mit HindIII digeriert).
    • Beispiel 4: Transformation von Pflanzenzellen mit dem Agrobacterium- Mediator
  • Man wendet eine Gefrier-Auftau-Methode an zur Transformierung von Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 mit dem in Beispiel 3 hergestellten pJRM 100, wobei die Expression des PAP-Gens unter Einwirkung des CaMV-Promotors gesteuert wird. Zur Selektion des mit pJRM 100 transformierten Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 wird die Plasmid-DNA mittels der Quick-Screening-Methode aus dem Agrobakterium isoliert (siehe: B.G. Stanton et al., Plant Molecular Biology Manual (1988), Kluwer, Academic Publishers) und mit BamHI digeriert. Das mit pJRM 100 transformierte Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 wurde am 7. August 1992 unter der Hinterlegungsnummer KCTC 0052BP bei der Korean Collection for Type Culture (KCTC) hinterlegt und wird in der vorliegenden Erfindung beansprucht.
  • Erfindungsgemäß werden als Wirtsorganismen die wie folgt behandelten Tabakpflanzen Nicotiana tabacurn NC2326 und Nicotiana tabacum xanthi eingesetzt: Tabaksamen werden während 5 Minuten mit 70 %-igem (Vol./Vol.) Ethanol und dann während 20 Minuten mit einem 50 %-igen (Vol./Vol.) Bleichmittel behandelt, anschließend 3-mal mit destilliertem Wasser gewaschen und auf einem basischen MS-Medium inkubiert. Anschließend werden die während 1 Monats in einem Inkubator gezogenen Blätter auf die geeignete Größe zerschnitten und als Material für die Transformation verwendet. Mit pJRM 100 (KCTC 0052BP) transformiertes Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, ein Mediator für die Pflanzenzellentransformation, wird in einem Schüttelinkubator während 18 Stunden bei 28ºC und 200 min&supmin;¹ inkubiert. Nach der Züchtung der Zellen werden die Zellen geerntet, mit einem MS-Medium mit einer Konzentration von 1 bis 2 x 10³ Zellen/ml emulgiert und für die Transformation der Tabakpflanzen verwendet.
  • Die Transformation der Tabakblattfragmente mit Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, welches pJRM 100 enthält, erfolgt durch Inkontaktbringen der Materialien während 30 Minuten, worauf man die Transformationsprodukte auf einem festen MS-Medium, welches 1,0 mg/l BAP (Benzylaminopurin) und 0,1 mg/l NAA (α-Naphthalinessigsäure) enthält, im Dunkeln während 48 Stunden bei 26ºC inkubiert. Anschließend erfolgt eine Inkubation auf einem selektiven MS-Medium, welches 1,0 mg/l BAP, 100 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Carbenicillin enthält, um die Schößlingsbildung zu induzieren. Die Inkubation erfolgt bei 26ºC und 300 Lux, wobei die Tageslichtdauer intermittierend in 16-stündigem Zyklus eingehalten wird. Die in diese Weise induzierten Schößlinge werden weiter während mehrerer Generationen inkubiert, d.h. es wird unter den gleichen Bedingungen wie bei der Blattfragmentinkubierung alle 2 Wochen von Generation zu Generation eine Sämlingsbildung verursacht.
  • Die auf dem selektiven MS-Medium erzeugte transgene Tabakpflanze wird einer Wurzelbildung unterworfen durch Inkubieren auf einem basischen MS-Medium, welches 100 mg/l Canamycin und 250 mg/l Carbenicillin enthält, wonach die in dieser Weise induzierte Tabakpflanze in Töpfe überführt wird und für die spätere Verwendung adaptiert wird. Die Fig. 4 verdeutlicht die Ergebnisse, wobei die Fig. 4(A), 4(B) und 4(C) Fotografien darstellen, welche die Schößlingsbildung nach der Infektion, die Wurzelbildung bzw. die Topfadaptation wiedergeben.
    • Beispiel 5: Bestimmung der PAP-Expression in transgenem Tabak
  • Zur Bestimmung der PAP-Expression in transgenem Tabak wird eine Immunodiffusionsuntersuchung unter Verwendung von Anti-PAP-Antikörpern durchgeführt. Nachdem Petrischalen mit 1 % (Vol./Gew.) Agar beschichtet worden sind, wird eine Mischung aus 0,8 % (Vol./Gew.) Agar und 5 mg/ml Anti-PAP-Antikörper in die Petrischalen gegossen und verfestigt. Dann werden Poren für die Probenbeschickung auf der festen Agarplatte erzeugt. Das gesamte Protein wird aus transgenem Tabak isoliert und die daraus isolierten Proben werden auf die in der oben beschriebenen Weise bereitete Agarplatte aufgebracht. Die Agarplatte wird während 48 Stunden diffundiert, mit einer Farbstofflösung gefärbt, mit einer Entfärbungslösung entfärbt und es wird der gebildete Niederschlag untersucht. Die Fig. 5 verdeutlicht die Ergebnisse, wobei C für das Gesamtprotein von Phytolacca arnericana L., B für das Gesamtprotein von nicht-transformiertem Tabak und die anderen für das aus transformiertem Tabak isolierte Gesamtprotein stehen.
    • Beispiel 6: Southern-Blot-Analyse von transgenem Tabak
  • Zur Bestimmung der richtigen Einfügung des PAP-Gens in das Tabakgen wird eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt. Die gesamte DNA wird aus transgenem Tabak isoliert, mit BamHI digeriert und auf einem 0,8 %-igen (Vol./Gew.) Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen. Die DNA wird auf Hybond-N+ (Amersham, U.K.) überführt und es wird eine Hybridisierung durchgeführt unter Verwendung des in Beispiel 3 eingesetzten 1,0 kb BamHI-Fragments als Sonde. In diesem Zusammenhang ist festzuhalten, daß die Sonde mit Hilfe des Nick-Translation-Kits (Promega, USA) hergestellt worden ist und mit α-³²P dATP markiert worden ist. Die Fig. 6 verdeutlicht die Ergebnisse: Die Spur 1 betrifft die mit BamHI digerierte DNA aus nicht-transformiertem Tabak; die Spuren 2, 3 und 4 die mit BamHI digerierte DNA von transformiertem Tabak; die Spur 5 steht für mit BamHI behandeltem pJRM 100, wobei die gleiche Bande wie in den Spuren 2, 3 und 4 bestimmt wurden.
    • Beispiel 7: Northern-Blot-Analyse von transgenem Tabak
  • Zur Bestimmung des Transkriptionsausmaßes in dem transgenen Tabak wird die gesamte RNA aus dem transgenen Tabak isoliert, auf 1 %-igem (Vol./Gew.) Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen, auf Hybond-N+ überführt und einer Hybridisierung unterworfen unter Verwendung des in Beispiel 3 eingesetzten 1,0 kb BamHI-Fragments als Sonde. Die Fig. 7 verdeutlicht die Ergebnisse, wobei bei der nicht-transformierten Kontrolle (A) keine Bande festzustellen ist, während bei dem transformierten Tabak eine Bande zu beobachten ist.
    • Beispiel 8: Lokale Läsions-Untersuchung von transgenem Tabak
  • Gefriergetrocknetes TMV-infiziertes Gewebe (ATCC PV226), welches von der ATCC erhalten worden ist, wird zerkleinert, in einer Phosphatpufferlösung gelöst und zentrifugiert. Die in dieser Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit wird für die Viren-Inokulation formuliert und in dem 4- bis 6-blättrigen Stadium an die Testpflanzen verabreicht. Nach der Inokulierung wird die lokale Läsions-Untersuchung während 7 Tagenin einer Wachstumskammer durchgeführt. Die Fig. 8 verdeutlicht die erhaltenen Ergebnisse, wobei sich bei dem transformierten Tabak (A) eine Plaque bildet, während bei dem nicht-transformierten Tabak keine Plaque zu beobachten ist.
  • Wie oben erläutert und verdeutlicht, schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer ein antivirales Protein bildenden transgenen Pflanze durch Transformation mit einem rekombinanten Vektor für die Expression des antiviralen Proteins, welches ein PAP-Gen enthält, welches aus der cDNA-Bibliothek von Phytolacca americana isoliert worden ist, und einen Vektor für die Fremdproteinexpression. Erfindungsgemäß können daraus auch virusresistente Pflanzen und damit gebildete antivirale Mittel erzeugt werden.

Claims (7)

1. Rekombinante DNA pJRM 100 (KCTC 0052BP), welche ein antivirales Proteingen in einer Pflanzenzelle exprimiert.
2. Rekombinante DNA pJRM 100 nach Anspruch 1, worin das antivirale Protein PAP (Phytolacca Antiviral Protein) ist.
3. Rekombinante DNA pJRM 100 nach Anspruch 1, worin die Pflanze Tabak ist.
4. Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 transformiert mit der rekombinanten DNA pJRM 100 nach Anspruch 1.
5. Verfahren zur Herstellung eines antiviralen Proteins, welches darin besteht, eine mit der rekombinanten DNA von Anspruch 1 transformierte Pflanzenzelle zu inkubieren.
6. Verfahren nach Anspruch 5. worin das antivirale Protein PAP (Phytolacca Antiviral Protein) ist.
7. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit Virusresistenz, welches den Schritt der Transfektion mit Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 nach Anspruch 4 umfaßt, welcher mit der rekombinanten DNA nach Anspruch 1 transformiert worden ist.
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