WO1998012335A1 - Nematodenresistenzgen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Familien der Solanaceaen, Chenopodiaceaen und/oder Brassicaceaen induziert. Insbesondere umfaßt diese Nukleinsäure eine translatierte Region, die zu mindestens 60 % zu der Sequenz des Hslpro-1-Gen aus Beta procumbens homolog ist. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Sequenz einens cDNA-Klons und eines genomischen Klons dieser Nukleinsäure. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, der z.B. ein künstliches Hefechromosom (yeast artificial chromosome) 'YAC' sein kann, der die Nukleinsäure für eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen enthält. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen sowie eine transgene Pflanze, die die Nukleinsäure oder den Vektor enthält. Ferner betrifft die Erfindung das durch die Nukleinsäure kodierte Protein, einen die Nukleinsäure und/oder den Vektor enthaltenden Testkit und ein Verfahren einer transgenen Pflanze sowie ein Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen. Schließlich betrifft die Erfindung den Promotor der Nukleinsäure, seine Verwendung und einen Primer für die PCR.

Description

Nematoden resistenzgen

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die in Pflanzen, vorzugsweise der Familien der Solanaceen und/oder C enopodiaceen und/oder der Brassicaceen, besonders bevorzugt der Gattung Beta und/oder Brassica und/oder Solarrum, eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die DNA-Sequenz eines cDNA-Klons und eines genomischen Klons dieser Nukleinsäure. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, der z.B. ein künstliches Hefechromosom (yeast artificial chromosome) "YAC" sein kann, der die Nukleinsäure für eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen enthält. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen sowie eine transgene Pflanze, die die Nukleinsäure oder den Vektor enthält.

Ferner betrifft die Erfindung das durch die Nukleinsäure kodierte Protein, einen die Nukleinsäure und/oder den Vektor enthaltenden Testkit und ein Verfahren einer transgenen Pflanze sowie ein Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen.

Schließlich betrifft die Erfindung den Promotor des Resistenzgens.

Es ist bekannt, daß Pflanzen von verschiedenen Erregern und Parasitenarten befallen werden. Es ist ebenfalls bekannt, daß Kulturpflanzen meist anfälliger sind für einen Parasitenbefall als ihre wildwachsenden Verwandten. Häufig trifft man Pflanzenparasiten aus der Familie der Nematoden an, mit einer Flüssigkeits-erfüllten, von einem Hautmuskelschlauch umschlossenen Pseudocylo hülle. Nematoden sind wichtige Pa- rasiten, die in den Ernten überall auf der Welt einen Schaden von ca. 150 Millionen DM pro Jahr verursachen. Besonders schädlich sind Nematoden der Gattungen Meloidogyne, Hetero- dera und Globodera, die sich permanent in den Wurzeln der befallenen Pflanze festsetzen, nachdem sie bestimmte Ernährungsstrukturen induziert haben. Der Nematode Heterodera schachtii hat ein breites Wirtsspektrum, das viele Arten verschiedener Pflanzenfamilien umfaßt, z.B. die Chenopo- diaceae und Brassicaceae.

Der Lebenszyklus von Nematoden ist in vier larvale Stadien untergliedert (J1-J4) . Die Wurzeln werden von J2 Juvenilsta- dien infiziert, die zum Zentralzylinder wandern, wo sie die Entwicklung von Syncytien induzieren. Diese extensiven Nahrungsstrukturen resultieren aus einem teilweisen Zellwandabbau zwischen den Zellen des Xylem-Parenchyms. Der Nematode beendet seinen Lebenszyklus zum Erwachsenen nach drei Abschnitten. Die weiblichen Nematoden schwellen an und zerstören schließlich den Wurzelcortex, während sie sich immer noch aus den Syncytien ernähren. Die männlichen Stadien ernähren sich nach Beendigung des dritten Stadiums nicht mehr und bewegen sich, wenn sie erwachsen sind, auf die weiblichen Stadien zu, von denen sie durch Sexpheromone angezogen werden. Die reifen weiblichen Stadien sind mit Eiern angefüllt. Nach ihrem Tod formen sie eine Zyste, in der die in- fektösen Larven (J2) in der Erde für bis zu 10 Jahre überleben können.

Es wird angenommen, daß Nematodenresistenzgene eine inkompatible Reaktion zwischen dem Wirt und dem Parasiten auslösen, die auf zellulärem Niveau bereits beschrieben wurden. Die Wurzeln von Pflanzen, die dieses bzw. diese Gen(e) tragen, werden von J2-Juvenilstadien zwar befallen, aber die meisten der Nematoden sterben im späten J2-Stadium aufgrund des Abbaus des initiierten Syncytiums. In seltenen Fällen können sich weibliche Stadien entwickeln, die jedoch ein durchsichtiges Aussehen zeigen und ihr Wachstum einstellen. Auf diese Weise können die Nematoden ihren Lebenszyklus nicht vollenden.

Da der Einsatz von Nematiziden aufgrund umweltpolitischer Überlegungen nur begrenzt möglich ist, ist es besonders wünschenswert, diese Resistenzgene auch in Kulturpflanzen zu verwirklichen.

Insbesondere Kulturrüben der Gattung Beta (z.B. Zuckerrübe, Futterrübe, Mangold, Rote-Bete) sind hochanfällig gegen den Rübenzystennematoden Heterodera schachtii. Es wird bereits seit langem daran gearbeitet, Resistenzen gegen Heterodera schachtii und andere phytopathogene Nematoden (z.B. Globo- dera) in Pflanzen, insbesondere Kulturpflanzen, zu erzeugen, da diesen entsprechende Resistenzgene fehlen. Einzige Quellen für eine Resistenz sind die Wildart Beta procumbens und ihre nahen Verwandten B. webbiana und B. patellaris.

Gene für die Resistenz gegen verschiedene Nematodenarten werden in unterschiedlichen Nutzpflanzenarten züchterisch genutzt (z.B. Kartoffel, Tomate, Weizen, Ölrettich) . Es wurde auch ein Resistenzgen aus der Wildart Beta procumbens mittels Artkreuzung in die Zuckerrübe überführt. Daraus konnten resistente Zuckerrüben selektiert werden, die jedoch den Nachteil aufwiesen, daß sie durch mangelnde Qualitätsund Leistungseigenschaften charakterisiert waren. Die resi- stenten Zuckerrübenlinien, die aus der Artkreuzung mit Beta procumbens hervorgingen, verfügen über wechselnd große Translokationen aus den Wildrüben der Sektion Procumbentes. Ihre geringe Leistungsfähigkeit und verminderte Qualität liegt vermutlich darin begründet, daß sich neben dem Resistenzgen noch weitere leistungs indernde Gene aus den Wildarten in diesen Zuckerrübenlinien befinden. Auch ist die Transmission der Resistenzeigenschaft auf nachfolgende Generationen unvollständig. Auf rein Züchterischem Wege lassen sich diese Nachteile nicht beseitigen, da eine Züchtung durch Kreuzung kaum spezifische Eigenschaften selektieren kann, ohne daß auch andere - unter Umständen nachteilige - Eigenschaften mitübertragen werden.

Weiterhin wurden zahlreiche Versuche unternommen, um künstliche Nematodenresistenz in Pflanzen durch eine Kombination von "Selbstmordgenen" mit Syncytien-spezifischen Promotoren zu induzieren. Bislang konnten daraus jedoch keine resisten- ten Pflanzen gezüchtet werden.

Es ist außerdem bisher noch nicht gelungen, ein natürliches Resistenzgen molekular zu identifizieren und für die Erzeugung einer Resistenz in Kulturpflanzen zu nutzen.

Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure bereitzustellen, die eine Resistenz gegen Nematoden in Pflanzen vermittelt. Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die diesem Gen zugrunde liegende DNA-Sequenz bereitzustellen.

Ferner war es eine weitere Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, die Verwendung eines solchen Gens zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden zu ermöglichen.

Es war außerdem eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, eine transgene Pflanze anzugeben, die eine solche Resistenz vermittelnde Nukleinsäure enthält, sowie Zellen, Samen oder Pflanzenteile, die diese Nukleinsäure enthalten.

Schließlich war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vektoren anzugeben, in die das Gen zur Resistenzvermittlung gegen Nematoden in Pflanzen wirksam eingebaut werden kann und darin enthalten ist.

Es war weiterhin eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, das von der Nukleinsäure kodierte Protein und einen Testkit, der die Nukleinsäure enthält, anzugeben.

Schließlich war es eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze und ein Verfahren zum Erzeugen einer Resistenz gegen Nematoden anzugeben.

Es war auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, den Promotor anzugeben, der die Expression des oben angegebenen Resistenzgens kontrolliert.

Diese Aufgaben werden durch die in den Ansprüchen angegebenen Gegenstände der Erfindung gelöst.

Figur 1 zeigt eine Northern-Analyse von Gesamt-RNA aus Blättern und Wurzeln. Die Gesamt-RNA wurde aus Blättern und Wurzeln von sechs Wochen alten Pflanzen isoliert, die entweder (1) infiziert oder (2) nicht infiziert waren. Die Vollängen- cDNA 1832 wurde als Sonde verwendet. 20 μg Gesamt-RNA wurden in 1,3 %iger Agarose aufgetrennt und auf Nylonmembranen transferiert. Der Filter wurde über Nacht mit der radioaktiv markierten Sonde bei 60 °C hybridisiert und anschließend für 2 x 30 min bei 60°C in 0,2 x SSC gewaschen.

Gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure, die in Pflanzen, vorzugsweise aus der Familie der Solanaceaen und/oder Chenopodiaceaen und/oder Brassi- caceaen, besonders bevorzugt der Gattung Beta und/oder Bras- sica und/oder Solanu eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert, bereitgestellt. Die Bereitstellung eines sol- chen Gens erlaubt es, Kulturpflanzen zu züchten, die eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden aufweisen. Derartig resistente Kulturpflanzen sind selbstverständlich ihren nicht resistenten Verwandten weit überlegen, da sie nicht von Nematoden befallen werden können und daher weniger kranheits- anfällig sind. Durch die Bereitstellung der Nukleinsäure, die die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen trägt, ist es weiterhin möglich, resistente Pflanzen zu erhalten, die dennoch eine gleichhohe Qualität und Leistungsfähigkeit wie andere, nicht resistente Kulturpflanzen aufweisen. Dies ist darauf zurückzuführen, daß eine einzelne Nukleinsäure, nämlich die Nukleinsäure für die Resistenz gegen sedentäre Nematoden, in die Pflanzen übertragen wird, während bei konventionellen Züchtungsverfahren neben den gewünschten Genen auch andere DNA-Sequenzen übertragen werden, die unter Umständen für unerwünschte Eigenschaften kodieren.

Besonders bevorzugt umfaßt die Nukleinsäure, die die Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert, einen transla- tierten Bereich, der zu der Sequenz des Hsl^pro~ -Gens aus Beta procumbens mindestens 60 % homolog ist. Hierzu zählen unter anderem die homologen Gene aus Beta webbiana und Beta patellaris. Das HSl^pro~ -Gen aus Beta procumbens trägt eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen. Eine 60%- ige Homologie mit der oben aufgeführten DNA-Sequenz ist bereits ausreichend, um die gewünschte Eigenschaft der Resistenz gegen sedentäre Nematoden in einer Pflanze zu induzieren, die diese Nukleinsäure trägt. Erfindungsge äße Gene sind ebenfalls erhältlich durch Absuchen von Genbanken mit der Sequenz 1832, wobei die Hybridisierungsbedingungen wie folgt gewählt werden können:

Hybridisierungstemperatur 50°C, vorzugsweise 60°C, und Waschen der Filter in 0,5 x SSC, vorzugsweise in 0,2 x SSC für beispielsweise 30 Minuten. Besonders bevorzugt ist die Nukleinsäure, die eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen induziert, die folgende DNA-Sequenz umfaßt:

ATGAGAAGGT

GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT

TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA

GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA

TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT

CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA

TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT

TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG

AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG

ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA

AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG

TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT

GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA

ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG

AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA

GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT

TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGG AG CGGCCTCGAT

TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGA

Diese Sequenz soll im folgenden als Nr. 1832 bezeichnet werden.

Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind Nukleinsäuren, die ein Protein kodieren, das die gleiche Nematodenresistenz verleiht, wie das durch obige Nukleinsäure Nr. 1832 kodierte Genprodukt, wobei vorzugsweise alle diese Genprodukte die gleiche Aminosäuresequenz umfassen.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure eine cDNA.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure, die die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen induziert, eine genomische DNA, die die folgende DNA-Sequenz umfaßt:

TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCT TCTTTCTTGG TGCTTAATTT TTTGACACTA ATCCGATTCT TAGCATTAAG TTGAAGCACA CTCTTGATAA ACTATGTTAC TATGTATCAT TGTCAATATG CTAAGAATTT GTCTTGACCT CATCGCTATG TATAAGCATC TAATACTTTC CTAAACTAGT AAAAACAAAT ATTCCATCCG TCCCATAATA TGAGTCCCCT TTCTATTTTA GGAGTCAAAA TTTTAAAATT TTTGACCAAA TATTCTTATT ACTATATATA AAAACATATT CATGTGGGAT CTTGTTAGAT TCGTCTTAAT ATGTATTTTC ATAATATCAA CTTTTTATAT TTTTTTACTA ATACGAAATT GAAGATATAC AATGTCTTAA AGACTATGCA AAAGTAAGCA GAACCTATAT TTTGGGACGG AGGGAGTAAT AAGTAATATT GATTGACGCA TAATTTGTAT ATAAATATTT CAAATTGATA CTACTTTAAA TAATATAGTT AATGCTTATA AATAAGCCTA AAGACTGTGA ATAGCAAGAT CGTTAAAAAT AAAATTTGAA AATATTTGAT ATGGATAATG AAATTGGAAA TGGCATGCTT AGCTTCTCGG GAATCTTATA CCGCTACATC TATAATAAAA ATTCCTCATA AAATTTTGCC CATTTTAACA CACGAAATTC GTCCTTTTAC GCGAGCCCTT TCCACACGTC TTTAAAATTT AAAAACCTCG TCTTTACTCT CCCCACCTAT ATATATACAC GTCCCCCCTT CTCTACTTCC CATCTCACAT ACACATACCC AATCCACAAA CTTCCATCTT ATCCAACTTT CTCTCACCTA TCTCCTTCTT CAATTTTCAA AACTCAAAAG AAAATGGTAG ATTTCGATTG CAAAACAAAA ATGGTACAAT CAACACCAAA CCTCACAAAA AAATCTCCAA AAATCACAAC CAAACGCACA ATATCAACAC CATTAATTTC ACCAGTACCA GTAATTTCCG GCGAATTATC TCCGGCGTCG GAATCATCCT GTTCAGCTTA CGAATCGTAT CTCAAATTAC CGGAGCTCCG TCAACTATGG AGTTCAAAAG AATTCCCCGG TTGGGATAAC GAACCGATAA TCAAACCGGC TTTGCAAGCA TTAGAGATAA CATTCCGGTT CATCTCACTC GTTTTATCCG ACGCTAGACC GTACATAAAC CGGCGAGAAT GGAACCGGAA ATTAGAGTCG TTAGCGAGAG ATCAAGTCCG AAACTCATCT CAGTTCTCTG CGGAAGACGA TGAGACACGT GGATCAGCTC CGAATCGTTG ATCTGACGTC ATCGTATGGT GAGGTGATGT CACAAACAGA AGTTCAGCGG AGGTATGGAA GCTTGCGAAT GGAGAACATG ATACTACCGT GGTCTGTCGT AGTAGCGAAT TTAGTCTCCT TCCGAGGTTA GCCACGTGGC AGAAGTCGGA GGAGATTGCT TCTAGAATCT TCTACGCGGT TGAATCTGCT ATGAGAAGGT GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGAT GGTTTCGAAG TTAGTTTTGG ATTGAGTTTG GTTTGATCTG ACTCGGCTGA GTAATGGGCG GCGATAGGGA GGTTATGGAG AACGTGGGGC GGAAAGTGGG TGGCCTTGTT AGTGAGACGT GCAAACTTTG GTTACTATTA CATGTGATAT ACTTATATTT AGTGGGAATA TTGCTTTGGT GTATATAGAT AAATTTTTGA ATTAATTGTT ACACTTGTAT TAGTAAATTC TGTATCATGA TGATTATAAC ATGAATTTTT TGTTGTGACT TTAAATGAGA TTTATGCTCC TTAATCCTTA TTTCACTGAT ATTATTTTTT TGTAGTCTGA GTATAAGTGC GGAGTTTAAT CAAGCAAGAG AAAATAATAG AAGGTGATTG CATACTTGGA TTGGAGATCA ATATCTAAAA GATGGTTATG AAACTATTGT GAATAACGGA GTACATGTCC AACACCACAC ACGTATGACT GTGTACCTCT AATTTACAAA GAGATTTACA AAATCTAGAT GAGTTTTGAT ATGATCGACA TTGTCTCTAA ATGGGAGATA AGAATTAAAT CGTGAGGCTC TTTGCGGCTA G7TCTTCCGA ATAAAATAAG AAACAATGGT TTACTCTAAT TCA7TTTTCC AATTGGCAAA GTGGCACAAG CTTCAATAA? T7GGCTCTTC ACAATTGAGT ATAAAAGAAT GGGTTAATTA C?CCGG?CTT TGAATAAAAT TAATCCTATT TAATTGTTTT TGAAATATTC TTAAAAATA? CGTTGTCTAA TACTTTCTTT AGTTGGGACC CGGTTCTGAA CC7ACTTAAA TTAATGGGCT CAATGGCCGC CTAATTTCCT CTTGTTATTT TTAGCCTTTT TTTTCCTTTT TTTCC CTTTA AAATAACTAT TTGTTCTCTT GAATATCTTA AAATACGTGT CTATC77CTT TAGTTGGACC GTCTGAACTA TTATTATGCT ATGCACTATT CCTTTGTATT TACCTTTTTC TTTTTCCTTT AAATACTATT GTTCTCATTT CAATTATATT CTATTTTTGT TAAAAAACGG TCTTAATTTT TACAACAGTA AAATTATTGA TTTTCCTTCT ATATTAAAAT TTGAAAGTGA ATGTATTTCG AAATTTAGGT ATATGAATAT TTATATTGTT CGATTAATGA TGATAAAAGG ATTTTACTCA TTAACCTAAA CCATTTCTAG ATAAGATAAG AGGAACTTCC ACCTAGTTAA CATGTCTCAC TTTCCTAGTA GACGAATCTA AATTGCGTTG CTGGATTTAG AACTTTGGTC AAGATAATGG CAAAACTTTC AAGCACCCGT AGATGCATTT TCC7CGACAT TTCTCATACA GCACTAAACG TTTCAACTTC CTCTTTTATT TTCTTGAAAT TTTTTGTGGC AATGAGAAAC GTTCGAAGTT GATCTTTGCG TTTCGACGAT TTGAAATAAG AAAATGCGTA TTGTCGGCAA CTGATTGTAG TAGTTGC7GT TATTATAATG ATAGTCTTTT ATATAGAATT CATTTAATTC TAATTCATTT GAATCCAGTT AAGTTGAGTT TAGTTTAGTC AGCCTAAAAG AACAAAGTAA GTCATGGAAT GGAATGAAGA TGTAATCAAA TAGAGGAGGG GCTGATAACA ATAATTATTA CTTATGTTGC GTGTTCAATT CAGTAATGAA AAAAATAAGG TTGAATTAGG AGGGTAATAC AATTATTACC GGTGATGTGA TAAAACTAAT GTTTAAGGGT TTAAGTTACT CTAAACCCTC AATTAAACAT AGTCTAACAA AAAATTCTCA TAATCTAAAT CAAACACGTA CTTATACAAT CCTCTACATG AATCCGTTTC TAACTCTAAA GGAAGATCGA TACTTATTAG AATCCGTTTC CAACCCTAAA AATGACTGAT CAAAGGTTCA TGGATTTTGG AAGGGAAAGA CGAATGCGAG GGCAGTGTAC AGGATAATGT GCATGAGATG GCAAGGGTCA TGCTAGTTAG AGCAAAATAT A7ATGACTTA ATTCAAAAAC TACCTACTAT TTCAAATTAA TAGACTTTAT TGGAGTCATG AAGTGTACTG TTTGGTACAC CCCACATTAC TCATGCACTA CACCTAATTT GTCACAGCAT TCAGCTGCCC TTGTTTTGCA GTCTTTGGAG CTGGCGTGCC TCTTGTTGCT GGTTAGTCGG CGCTTGGTCT GTTGTG? ?GT GACCCTCTGT iTirp mrp r rp ppr mrπ TTTTAAAATG GTCGCTGATT ACTAT7CTGT GTATT7CATT TTGTACTCCC TCGTATCCAA TTATATGCTA CACTTTTTTT GCGGACTCCA AAACGTTTTT TTTTT7TGTC CGAGAGATAG AGAGGAAAAG CCCATGTTGT TAGGAGAGAG 7TCGGGAGAA GGAAAAGCCA AATAAAGAAG TAATAACATC TAAATAAGAA AATTCCTTTG ATGGAAAGTG TAGCGACTAA AAAACGAAGG ACAATATGTA GTTTTCATAT GCCTTTACCT TTGCAATCTC CTTTTTTATT GTTTACCCAT ACTGGATTAG GTTGGATTTA TCAACACAAA ATGAGTTGGA CTATATCACT ACATTACTGT GGTCCTGTGG ATACATCAAC AAAAAAAATG AGTTGGACCA TATCAATGTG TTAGCGTGGA TTATGTACAC ATTGGACTGG AGTTGAAGCA AATATAATCT GAAAAGGGCG ATGGGTTAGG TCATGAGGTA TTTAGAATAA GACTTTGATC AAGCCCAAAT CCACCCGCAA AGAATTATAC CCTTTATTTT CAAGGCACCA TCACTGCATA AAATAATCTG AAATGCCACA AAAGATTAAC GTCCAATATG CTCACAGCCA AAAATCAATC CATTATTGTT TGGTAAGAAA AGGTAATAGG CTAGATCAAT TTGCTGCCAA TTGCCAGGCC TGTGGGCCTG TCACCTGTGG GTAATTTAAT ATG7CTCAAA TGGGTCGGCC TGTTAAGTAC ACCAACATGA ACTTAAAGCT T An Positionen mit (?) kann sich A, G, C oder T befinden oder das Nukleotid ist nicht vorhanden. Der Translationsstart ist unterstrichen. Die fettgedruckten Buchstaben stellen den cDNA-Anteil dar. In dem beigefügten Sequenzprotokoll entspricht (?) dem Buchstaben N.

Diese Sequenz soll im folgenden als Nr. 1832.1 bezeichnet werden. Die ursprüngliche Sequenz von 5407 Nukleotiden, wie in Figur 2 angegeben, enthielt Sequenzierfehler, die sich jedoch nicht auf den proteinkodierenden Bereich auswirken.

Schließlich umfaßt die vorliegende Erfindung die Sequenz gemäß dem Seq.Id.No3. (auch als 1832A1 bezeichnet).

Umfaßt ist auch eine Nukleinsäure, die erhältlich ist durch Absuchen einer DNA-Bank mit einer wie oben beschriebenen DNA-Sequenz und die für eine Nematodenresistenz kodiert, wie für Klon 1832 nachgewiesen.

Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure aus einer Wildart der Sektion Procumbentes der Gattung Beta.

Besonders bevorzugt löst die Nukleinsäure, wie oben beschrieben, eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden der Gattungen Meloidogyne. Heterodera und/oder Globodera aus. Ganz besonders bevorzugt ist die Induktion einer Resistenz gegen Heterodera schachtii in Pflanzen. Besonders bevorzugt wird die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Art Beta vulcraris induziert.

Bei der Einschleusung eines derartigen Gens in die zu verändernden Pflanzen wird in aller Regel lediglich die Eigenschaft Nematodenresistenz beeinflußt. Es sind keine pleio- tropen Geneffekte zu erwarten. Damit bleibt die Leistungsfähigkeit des Zuchtmaterials unberührt. Die transgenen Pflanzen, die das o.g. Gen exprimieren, zeigen eine inkompatible Reaktion gegenüber Zystennematoden. Damit können sie für die Züchtung resistenter Sorten eingesetzt werden. Da es sich um eine natürliche Resistenz-Nukleinsäure aus Wildarten der Sektion Procumbentes der Gattung Beta handelt, werden keine Akzeptanzprobleme hinsichtlich gentechnisch veränderter Pflanzen erwartet. Nematodenresistente Sorten, die das oben genannte Gen besitzen, können zu einer Erhöhung des Anteils von Wirtskulturen in der Fruchtfolge führen. Im Falle der Zuckerrübe bedeutet das theoretisch, daß eine Kultur mit hohem Deckungsbeitrag in verstärktem Maß angebaut werden kann. Ferner ist die HSl^pro~ -Sequenz nicht nur in Pflanzen der Gattung Beta aktiv, sondern sie vermag auch eine Nematodenresistenz in Pflanzen anderer Gattungen, wie beispielsweise in Arabidopsis thaliana. zu erzeugen.

Ob eine aufgefundene Sequenz das Potential besitzt, einer Pflanze Nematodenresistenz zu verleihen, läßt sich anhand üblicher Teste überprüfen, wie sie beispielsweise im folgenden noch näher erläutert werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor, besonders bevorzugt ein künstliches Hefechromosom, zur Verfügung gestellt (yeast artificial chromosome, YAC) , das eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen vermittelt und die Nukleinsäure, wie oben beschrieben, enthält.

Das YAC kann z.B. folgende DNA-Sequenz enthalten:

1. (Nr. 1832)

2. (Nr. 1832.1)

Eine 60%-ige Homologie zu der in den YACs enthaltenen Nukleinsäuren genügt zur Induktion einer Resistenz in den Pflanzen. Bevorzugte YACs sind die folgenden: TABELLE 1

YAC Größe in Spezifität klonierte Sequenzen der YAC-Enden kBp links rechts

YAC42D12 50 643 — +

YAC112G9 60 643 + +

YAC120E7 150 643 + +

YAC31G11 70 D13 + +

YAC80G3 200 YAC31L — +

YAC116C5 50 YAC31R — —

YAC114H8 120 YAC104L — —

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Resistenz gegen Nematoden der Gattungen Meloidogyne, Heterodera und/oder Globodera in Pflanzen induziert. Besonders bevorzugt richtet sich die Resistenz gegen Heterodera schachtii.

Vorzugsweise wird die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Art Beta vulgaris induziert.

Weiterhin richtet sich die Erfindung auf die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors, wie oben beschrieben, zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen.

Die Erfindung ist außerdem auf eine transgene Pflanze gerichtet, die die Nukleinsäure oder den Vektor, wie oben beschrieben, enthält.

Das Gen kann durch Transformation mit Standardmethoden entweder unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle des internen Promotors, der stromaufwärts der translatierten Sequenz liegt, in Pflanzen zur Ex- pression gebracht werden. Dadurch wird eine inkompatible Reaktion mit den sedentären Nematoden, insbesondere dem Zy- stenne atoden Heterodera schachtii, hervorgeru en.

Die stromaufwärts gelegene, ca. 1500 Nukleotide umfassende Promotorregion des Gens kann zur wurzelspezifischen Expression beliebiger Gene in beliebigen Pflanzen verwendet werden. Umfaßt sind Promotoren, die sich von der 5' nicht translat- ierten Region des HSl^{p o_} -Gens ableiten und die gleiche Promotoraktivität zeigen wie der HSl^pro~ -Genpromotor.

Ein bevorzugter Promotor befindet sich innerhalb des Xbal- Fragments zwischen Nukleotidposition 1 und 1521 in der Sequenz 1832.1. Weiterhin bevorzugt sind Promotoren, die sich von dem genannten Promotor durch z.B. Insertionen, Deletio- nen, Substitutionen und/oder Inversionen ableiten und die gleiche Promotoraktivität beibehalten oder sogar stärkere Promotoraktivität zeigen. Das Vorhandensein von Promotoraktivität läßt sich mit den üblichen Verfahren bestimmen, wie beispielsweise im folgenden anhand der Beispiele erläutert.

Als erfindungsgemäß werden Derivate des oben genannten 1832- Promotors angesehen, die mindestens 10 % von dessen Promotorstärke aufweisen.

So wird der 1832-Promotor beispielsweise in Arabidopsis tha- liana aktiviert mit dem Ergebnis, daß die Sequenz 1832 unter der Kontrolle des genannten Promotors in diesem Wirt eine Resistenz gegen Heterodera schachtii hervorruft.

In einer bevorzugten Ausführungsform gehört die transgene Pflanze der Gattung Beta oder der Gattung Brassica an. Besonders bevorzugt gehört die transgene Pflanze der Art Beta vulqaris an. Die Erfindung ist auch auf Zellen, Samen oder Pflanzenteile gerichtet, die die Nukleinsäure oder den Vektor, wie oben beschrieben, enthalten.

Ferner ist die Erfindung auf das von der Nukleinsäure kodierte Protein gerichtet, sowie auf Derivate davon mit den gleichen resistenzverleihenden Eigenschaften.

Die erfindungsgemäßen Proteine sind erhältlich durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Wirt wie Bakterien, Hefen, Säuger- und Pflanzenzellen.

Die Erfindung betrifft außerdem einen Testkit, der eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie oben beschrieben, oder ein Protein, wie oben beschrieben, enthält. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure, wie oben beschreiben, in eine Pflanzenzelle eingebracht wird und eine Pflanze aus der Pflanzenzelle regeneriert wird.

Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Nukleinsäure, wie oben beschrieben, in eine nematodensensitive Pflanze eingebracht wird.

Die Erfindung betrifft außerdem einen Promotor, der die Expression der oben beschriebenen Nukleinsäure mit steuert und der dadurch gekennzeichnet ist, daß er wurzelspezifisch aktiv ist.

Der 5 '-flankierende Bereich des Gens, ein ca. 1,5 kb Xbal- Fragment, enthält typische Elemente eukaryotischer Promotoren, wie z.B. die TATA-Box. Der Promotor ist offensichtlich wurzelspezifisch, weil nach Northern-Analyse mit Blatt- und Wurzel-RNA lediglich ein Signal mit Wurzel-RNA gefunden wurde. Dies bestätigen auch Experimente mit transgenen Kartoffeln, die mit einem Fusionsprodukt aus dem 1832-Promotor und dem GUS-Gen transformiert worden sind. Dort zeigten die Wurzeln eine eindeutige Farbreaktion, die auf eine Aktivität des 1832-Promotors schließen ließ.

Damit kann der 1521 Nukleotide umfassende 5 '-Bereich des 1832-Gens und Derivate davon mit entsprechender Promotoraktivität für die Expression beliebiger Gene, insbesondere in Wurzelgeweben, unterschiedlicher Pflanzen genutzt werden. Geeignete Derivate sind solche, die mindestens 10 % der Promotoraktivität der 1832.1-Sequenz aufweisen. Anwendungsbeispiele sind die Expressionen von Genen für Resistenz gegen Nematoden sowie Resistenz gegen weitere wurzelbürtige Schaderreger, sowie Expression von Genen, die an der Saccharose- Translokation beteiligt sind und allgemein von Genen, die an der Saccharose- oder Inulinspeicherung beteiligt sind. Derivate des erfindungsgemäßen Promotors sind Sequenzen, die sich von dem Promotor des 1832-Gens z.B. durch Deletionen, Insertionen, Basenaustausche usw. ableiten, wobei die Promo- toreigenschaften des 1832-Genpromotors beibehalten werden.

Schließlich betrifft die Erfindung einen Primer für die PCR, erhältlich aus der Sequenz Nr. 1832.1.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen im einzelnen beschrieben, wobei diese Beispiele den Umfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.

Beispiel 1

Klonierung des HSl^E£g--Gens

Für die Klonierung des HSl^pro -Gens wurden eng miteinander verbundene Marker identifiziert. Ein B. procumbens-spezi- fischer Satellit (pRK643) wurde von einer der Fragment- Additionslinien kloniert. Eine Southern-Analyse zeigte, daß alle getesteten, resistenten Linien diesen Satelliten tru- gen, was andeutete, daß er in der Region des Genoms der Wildart B. procumbens verteilt ist, in der das Gen lokalisiert ist. Dieser Marker erwies sich als hilfreich bei der Identifizierung der Translokationslinie mit dem kleinsten Segment der Wildrübe unter einer Mehrzahl chromosomaler Mutanten. Diese Linie wurde für die positionale Klonierung des Gens ausgewählt. Der Marker pRK643 kosegregierte perfekt mit der Resistenz in einer segregierenden F2-Population von 241 Individuen. Unter Verwendung dieses Satelliten arkers als Sonde wurden 3 Klone aus einer YAC-Bibliothek der Line A906001 extrahiert, die die HSl^pro~ -Genregion umfaßten.

Beispiel 2

Identifizierung der transkribierten Sequenzen der YACs

Um die transkribierten Sequenzen der YACs zu identifizieren, wurde eine cDNA-Bibliothek aus den Wurzeln von mit Nematoden infizierten A906001-Pflanzen erstellt und mit den drei YACs gescreent, was zu der Isolierung von drei cDNA-Klonen, nämlich den Nummern 1832, 1845 und 1859 führt. Der Klon 1845 zeigte eine Kreuzhybridisierung mit Zuckerrüben-DNA, während der Klon 1859 multiple Bandenmuster mit der DNA von sowohl anfälligen als auch resistenten Rüben ergab. Die weiterführende Arbeit konzentrierte sich auf die cDNA 1832, da:

1. Diese cDNA ein Einzelkopiesignal mit DNA der resistenten Linien ergab, während kein Signal mit DNA von der anfälligen Zuckerrübe sichtbar war, was die Annahme zuläßt, daß dieses Gen in kultivierten Rüben nicht vorhanden ist. Alle monoso- men Additionslinien, die das HSl^pro~ -Gen trugen, ergaben ein Signal mit dieser Sonde.

2. Es zeigte eine vollständige Cosegregation mit der Resistenzeigenschaft in den segregierenden F2-Populationen. 3. Ein ca. 1,6 kb-Transkript war nur in Wurzeln von resistenten Pflanzen vorhanden, wie durch Northern-Analyse gezeigt wurde. Ein deutlich stärkeres Hybridisierungssignal wurde im Vergleich zu nichtinfizierten Wurzeln mit RNA von Wurzeln gefunden, die mit Heterodera schachtii infiziert waren.

4. Die Sequenzanalyse des vorhergesagten Polypeptids zeigte Motive, die typisch sind für in letzter Zeit klonierte Resistenzgenprodukte .

Unter Zusammenfassung dieser Resultate repräsentierte der Klon 1832 ein wildrübenspezifisches Gen, das nur in Wurzeln exprimiert wird und nach Nematodeninfektion stimuliert wird.

Beispiel 3

Genetische Komplementierunqsanalyse

Für die genetische Komplementierungsanalyse wurden Haarwurzelkulturen durch Induktion mit Agrobacterium rhizogenes erhalten und verwendet. Die Haarwurzelkulturen der Zuckerrübe erwiesen sich als geeignetes Substrat für Wurzelpathogene. Die kompatible Reaktion der anfälligen wie auch die inkompatible Reaktion der resistenten Wurzeln auf Zystenne atoden wird in Haarwurzelkulturen der Zuckerrübe aufrecht erhalten. Eine anfällige Zuckerrübenlinie (Nr. 93161p) wurde mit der 1450 Basenpaar (bp) cDNA 1832 unter Verwendung eines A. rhi- zogenes-ver ittelten Gentransfers transformiert. Die gentechnische Veränderung der Transformanden wurde durch GUS- Assay und DNA-Blot-Analyse bestätigt. Nach Inokulierung mit J2-Juvenilen wurden sechs unabhängig voneinander transformierte Wurzeln gefunden, die das 1832-Gen exprimierten und dieselbe inkompatible Reaktion wie die resistente Linie A906001 zeigten, während sich Nematoden regelmäßig auf den anfälligen Kontrollen entwickelten und auf den Haarwurzeln, die das Gen nicht enthielten. Anfälligkeit konnte nach Transformation von einer resistenten Wurzelkultur mit einem Gegensinnkonstrukt der cDNA 1832 wiederhergestellt werden.

Diese experimentellen Daten belegen, daß die Resistenz in Haarwurzeln aus der Linie 93161p von der Expression des 1832 Gens abhängt. Das isolierte Gen wird als HSl^pro -Gen bezeichnet, da es die Nematodenresistenz auf die anfällige Zuckerrübenlinie derartig überträgt, daß sie vollständig mit der Resistenz in der Linie A906001 übereinstimmt.

Beispiel 4

Sequenzierung der cDNA

Die Sequenzierung der gesamten cDNA und des korrespondierenden genomischen Klons zeigte einen offenen Leserahmen ohne Introns von 846 bp, die ein vorhergesagtes Genprodukt von 282 Aminosäuren kodierten, was mit den von den RNA-Blots erhaltenen Daten übereinstimmt.

Beispiel 5

Strukturanalyse der Aminosäuresequenz

Die Aminosäuresequenz des vorhergesagten Polypeptids kann in vier verschiedene Subdo änen unterteilt werden. Ein vermutliches Signalpeptid (Domäne A) kann am N-Terminus definiert werden, der vermutlich die Aufgabe hat, das Protein zur Cytoplasmamembran zu leiten. Eine leucinreiche Region (Domäne C) , die in imperfekten, leucinreichen, sich wiederholenden Einheiten angeordnet ist, zeigt sich deutlich am N- Terminus des HSl^pro~ -Polypeptids. Die sich wiederholenden leucinreichen Einheiten (LRR) sind Teil der Protein-Protein- Interaktion und wurden in vorher klonierten Resistenzgenen aus Pflanzen gefunden, z.B. dem RPS2-Gen von A. thaliana. Ihre Funktion variiert von mutativen Erkennungsstellen in Rezeptor-ähnlichen Molekülen, die extrazellulär lokalisiert sind, zu katalytischen Domänen von Enzymen, die im Cytoplas- ma aktiv sind. Ähnlich anderen LRRs, die in Pflanzenresi- stenzgenen identifiziert wurden, sind die LRRs des HSl^pro~ - Polypeptids wenig konserviert im Vergleich zu der Konsensussequenz der LRR-Konsensus-Superfamilie. Die LRRs des HSl^pro~ -Polypeptids sind gekennzeichnet durch ein 20aa- Konsensusmotiv (xLxxaxxaxLxxLxxaxxxL; L = Leucin oder Iso- leucin, a = aliphatiεches oder aromatisches aa, x = jedes aa) . Die Leucin- und aliphatischen Reste an den Positionen 2, 5 und 16 sind in derselben Position lokalisiert wie im Konsensus der LRR-Superfamilie. Das hochkonservierte Aspara- gin an Position C ist mit einem Leucin/Isoleucin substituiert. Dieses Asparagin fällt ebenso in die Konsensus-LRRs des RPS2-Polypeptids. Die hydrophobe Domäne von 17aa des HSl^pro~ -Gens (Domäne F) zeigt ein Transmembransegment an. Die C-terminale Domäne enthält aa mit positiv geladenen Resten und eine putative N-Glycosylierungsstelle.

Das Elicitor-Rezeptor odell der pflanzenpathogenen Interaktion deutet an, daß die Produkte der Resistenzgene als spezifische Rezeptoren für pathogene Auslöser gemäß der Genfür-Gen-Hypothese wirken. Die Sequenzanalyse von HSl^pro~ deutet an, daß es in einer Gen-für-Gen-Resistenz als Teil einer Kaskade von Abwehrreaktionen involviert ist. Das vorhergesagte Polypeptid besteht aus imperfekten LRRs, die am N-Terminus lokalisiert sind mit einem zusätzlichen Signal- peptid, einer putativen Transmembran-übergreifenden Domäne und einem positiv geladenen C-Terminus, und paßt so in die zweite Gruppe von Pflanzenresistenzgenen.

Ähnliche Proteinstrukturen zwischen HSl^pro_ und dem Resistenzgen Cf-9 aus der Tomate konnten vorhergesagt werden, obwohl keine signifikante Sequenzhomologie festgestellt wurde. Als mögliche Art der Resistenzreaktion können die ex- tracytoplasmatischen LRRs als rezeptorerkennende putative Auslöser wirken. Von Nematoden ist es bekannt, daß sie Sekrete produzieren, die mit membrangebundenen Pflanzenrezeptoren interagieren können. Der positiv geladene C-Terminus interagiert möglicherweise mit den cytoplasmatischen Bestandteilen für die Signalübertragung. Alternativ als Protein, das im Cytoplasma lokalisiert ist, kann es als Rezeptor für Auslöser wirken, die in die Zelle über den Mundstachel des Nematoden injiziert wurde.

Durch die Klonierung des ersten Pflanzengenes, das in die Nematodenresistenz involviert ist, sollte es besser möglich sein, den Prozeß der wirtsspezifischen Abwehr gegen Nematoden zu verstehen. Außerdem bietet die Isolierung des HSl^pro_

-Gens die Möglichkeit, eine Resistenz auf Wirtspezies mit landwirtschaftlicher Bedeutung zu übertragen, in denen keine allele Form des Gens vorhanden ist.

Beispiel 6

Identifizierung und Charakterisierung des HSl^pro~ -Promotors

Aus einer Lamda-DASHII-Bank wurde mit einem PCR-Fragment aus dem 5' -Bereich des HSl^pro~ -Gens ein ca. 1 , 5 kb Xbal-Frag ent isoliert, das dem 5 ' -flankierenden Bereich des Gens und der Sequenz mit der Nummer 1832.1 entspricht. Die isolierte Promotorsequenz enthält die typischen Elemente eukaryotischer Promotoren, wie die TATA-Box mit der Sequenz TACATAAA in der Position -23 vor dem Transkriptionsstart bzw. dem 5' -Ende der cDNA.

Der identifizierte Promotor ist wurzelspezifisch, da in Northern-Blots ein Signal mit der Probe aus dem 5 '-Bereich des 1832-Gens nur in Wurzelgewebe gefunden wird. Weiterhin zeigen Konstrukte enthaltend den erfindungsgemäßen Promotor und ein GUS-Reportergen ausschließlich eine Farbreaktion in Wurzeln transformierter Kartoffeln bzw. Tabak.

Darüber hinaus ist der Promotor durch Nematoden induzierbar. Dies zeigt ein Vergleich der transkriptionellen Aktivität von mit H. schachtii infizierten und nicht infizierten Zuk- kerrübenwurzeln. Dies läßt darauf schließen, daß der erfindungsgemäße Promotor Transkriptionsfaktoren bindet, die von Nematoden stammen oder die infolge der Infektion gebildet werden.

Die genannten Versuche demonstrieren die Wurzelspezifität des HSl^pro_1-Promotors.

Beispiel 7

Expression der Seguenz 1832 in Arabidopsis

Die cDNA 1832 wurde mit dem GUS-Intron-Gen (Vancanneyt et al. (1990) MGG, S. 245) fusioniert und unter die Kontrolle des 35S-Promotors gebracht. Das Konstrukt wurde unter Zuhilfenahme des Vektors pAM194 (unten beschrieben) nach Standardverfahren mittels Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis thaliana eingebracht. Nach drei Selbstungsgenerationen wurden Linien erhalten, die eine vollständige Resistenz gegen Heterodera schachtii aufweisen, d.h. es wurden keinerlei Zysten oder entwickelte Weibchen beobachtet. Der Resistenztest erfolgte mit infektiösen Larven in einer Petrischale. Ferner wurde die GUS-Aktivität bestimmt.

Beispiel 8

Gewebespezifische Regulation des 1832-Promotors

Für die Studien wurde das Xbal-Restriktionsfragment . Xbal- Stellen an Position 1 und 1521 der 1832.1-Sequenz) mit dem GUS-Intron-Gen fusioniert und mittels dem Vektor pBIN19 und Agrobacterium tumefaciens/Agrobacerium rhizogenes-Kotrans- formation in die Wurzel von Zuckerrüben und Kartoffeln eingeführt. Bei der Zuckerrübe wurde beobachtet, daß in einer "Hairy-Root-Kultur" die GUS-Aktivität lediglich in dem Syn- zytium nachweisbar war. In nicht-infizierten Wurzeln oder in Bereichen, in denen sich keine Nematoden befanden, war eine entsprechende GUS-Aktivität nicht sichtbar. Dies zeigt, daß der eingesetzte Promotor ein "Pathogen-Responsive"-Element bzw. Elemente besitzt, das bzw. die nach Ne atodenbefall verstärkt aktiviert wird bzw. werden. Somit ermöglicht der 1832-Promotor die gewebespezifische Expression beliebiger Gene in Wirtspflanzen, wie beispielsweise der Zuckerrübe.

Beispiel 9

Expression von cDNA 1832 in Brassica

Es wurden Rapskotyledonen mit einem Konstrukt, enthaltend die Sequenz 1832, wie oben in Beispiel 7 beschrieben, transformiert. Die Anzucht der Kotyledonen erfolgte auf MS-Nähr- medium, wobei die Selektion auf MS-Nährmedium unter Zusatz von Carbenicillin erfolgte. Die Untersuchung der Transformanden zeigte positive Ergebnisse sowohl im GUS-Test wie auch in der PCR-Analyse.

Beispiel 10

Identifizierung einer Variante von Klon 1832.1, im folgenden 1832A1 genannt

Es wurde eine Variante zu Klon 1832 identifiziert, die ein offenes Leseraster umfaßt, bei dem das Startkodon mit dem ATG der Position 924 der 1832.1-Sequenz entspricht. Das Stopkodon entspricht der Position 2397 in der Sequenz 1832.1. Die Variante 1832A1 enthält weitere geringfügige Unterschiede im Vergleich zu der Sequenz 1832.1, wie sich aus dem Sequenzvergleich ergibt. Bemerkenswerterweise führen sämtliche Sequenzen, d.h. 1832.1, 1832 und 1832A1 nach Expression in Wirtszellen zur Resistenz gegenüber Nematodenbe- fall. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann man davon ausgehen, daß die kürzere der Sequenzen, nämlich 1832, sämtliche Elemente kodiert, die dem kodierten Protein die Fähigkeit verleihen, eine Resistenz gegen Nematoden hervorzurufen. Figur 3 zeigt schematisch die Kodierungskapazität der 3 Klone 1832.1, 1832 und 1832A1 relativ zueinander. Sämtlichen Klonen ist der Abschnitt 1832 gemeinsam.

Beispiel 11

Herstellen des Expressionsvektors pAM194

Der hergestellte binäre Vektor pAM194 verbindet die Eigenschaften eines Klonierungsvektors und eines Pflanzentransformationsvektors (Ti-Plasmids) . Die Eignung als Transformationsvektor wurde zusammen mit Agrobacterium tumefaciens als auch in Kombination mit Agrobacterium rhizogenes für Ko- transformationsexperimente geprüft. Der Vektor ist ein Derivat von pBI121 (Jefferson et al. 1987) (Clontech Laboratories) ; das Grundgerüst für pBI121 stellt pBIN19 (Bevan et al. 1984) bereit.

pAM194 umfaßt folgende Elemente:

- das Fragment außerhalb der Randsequenzen (LB; RB) enthält NPTII, als einen Selektions arker;

- die linken und rechten Randsequenzen (LB; RB) ;

- das NPTII-Gen aus Tn5 für die Selektion in Pflanzen; - das GUS-Gen aus E. coli mit der ST-LSl-Intronsequenz (Vancanneyt et al. 1990);

- die 35S-Promotor-Terminator-Kassette mit singulären Restriktionsspaltstellen zum Zwecke der Klonierung

Herstellung:

Das Plasmid pBI121 wurde mit Hindlll/SstI gespalten. Das gespaltene HindIII/SstI-35S-GUS-Fragment wurde ersetzt durch ein subkloniertes 35S-GUS-Intron-Fragment . Die EcoRI- Restriktionsspaltstelle wurde zerstört, indem mit EcoRI gespalten wurde und die überstehenden Enden mit "Klenow- Frag ent" von E. coli-Poly erase I aufgefüllt wurden; anschließend wurde erneut ligiert unter Herstellung von pBIN- GUSINT. Eine 35S-Promotor-35S-Terminator-Kassette mit einer einzigen EcoRI-Klonierunqsstelle aus dem Plasmid pRT104 (Töpfer et al. 1987) wurde in die Hindlll-Stelle von pBIN- GUS-INT kloniert, wobei dies zu pAM194 führte. Die oben angegebenen Literaturstellen lauten wie folgt:

- Bevan M. 1984: Binary Agrobacterium vectors for plant transformation; Nucleic Acids Research Band 12, Nr. 22, 8711.

- Jefferson R.A. , Kavanaugh T.A. , Bevan M.W. 1987. EMBO Journal Band 6: 3901.

- Töpfer R. , Matzeit V., Gronenborn B. , Schell J., Steinbiss H.H. 1987; A set of plant expression vectors for trans- criptional and translational fusions. Nucleic Acids Research Band 15, Nr. 14: 5890.

- Vancanneyt G. , Schmidt R. , O'Connor-Sanches A. , Willmitzer L. , Rocha-Sosa M. 1990. Construction of an intron-contai- ning marker gene. Molecular General Genetics, 245-250.

Die Konstruktion des Plas ids ist schematisch in Figur 4 wiedergegeben . Beispiel 12

Transformation von Zuckerrübe

Zur Transformation wurde Agrobacterium tumefaciens , Stamm EHA101 (Hood E.E. et al. 1986, J. Bacteriology 168, S. 1291- 1301) , verwendet, der mit dem Plasmid LD10/1832-13 (Figur 5a bis d) oder mit dem Vektor LD10, einem Plasmid, dem die 1832-cDNA fehlte, nach dem Friertauverfahren (Holters et al. 1978) transformiert worden war.

Zur Transformation der Zuckerrübe wurden sterile Zuckerrübensamen des Typs "Elite 0-272" zur Keimung gebracht auf einem Medium, enthaltend 2,0 g/1 Sucrose und 4,0 g/1 Agarose . Die Sämlinge wurden gekappt und die Kotylidonen wurden sorgfältig entnommen und als Explantate verwendet. Der Agrobace- rium tumefaciens-Stamm EHA101 mit dem Plasmid LD10/ 1832-13 , oder die Kontrolle mit Plasmid LDIO (Figur 5c) wurde auf LB- Mediu (Maniatis et al. 1982), ergänzt mit 50 mg/1 Kanamy- cin, 75 mg/1 Spectinomycin, 150 mg/1 Streptomycin und 50 mg/1 Acetosyringon auf einem Drehschüttler (340 U/min) bei 27°C bis zu einer OD von ungefähr 1,0 (bei 660 nm) kultiviert. Die Bakteriensuspension wurde dann mit LB auf OD 0,1 verdünnt und zur Inokulation mit den Explantaten, die für 2 bis 4 Tage bei 22°C kokultiviert wurden, verwendet.

Die Selektion auf transgene Schößlinge erfolgte nach einer Modifikation des Mannoseselektionssystems. Dabei wurde auf transgene Zuckerrübenschößlinge hin selektiert. Nach der Co- kultivierung wurden die Explantate auf Selektionsmedium, bestehend aus MS-Medium (Murashige & Skoog 1962) , ergänzt mit

0,05 mg/1 α-Naphthylessigsäure, 0,25 mg/1 6-Benzyladenin, 500 mg/1 Carbenicillin, 20 g/1 Sucrose und D-Mannose überführt, wobei die Konzentration der D-Mannose schrittweise während der Selektion erhöht wurde, wobei mit einer Konzentration von 1,25 g/1 für die ersten zwei Subkulturperioden begonnen wurde, dann wurde auf 5,0 g/1 für die nächsten 2 Subkulturperioden gesteigert, und schließlich wurde die Konzentration auf 10 g/1 Mannose für die letzte Periode erhöht. Jede Subkulturperiode dauerte 3 Wochen. Die Mannose- resistenten Schößlinge wurden weiter auf MS-Medium, dem 0,25 mg/1 6-Benzyladenin zugesetzt waren, kultiviert, und das Ausbilden der Wurzeln erfolgte im wesentlichen gemäß Miedema (1982) .

Die Analyse der Mannose-resistenten Schößlinge wurde dann wie folgt durchgeführt. Zum Sicherstellen, daß die Mannose- resistenten Schößlinge, die die Selektion überstanden, transgener Natur waren, wurden sämtliche Schößlinge auf PMI- Aktivität untersucht. Die nicht-transgenen Zuckerrübenschößlinge zeigen keine PMI-Aktivität (Phosphomannosei.somerase) . Es wurden Extrakte aus 2-3 Blattspitzen von einer Größe von ca. 3 mm hergestellt und dem gekoppelten PMI-Enzymassay , modifiziert nach Feramisco et al. (1973) und Gill et al. (1986) , unterzogen. Ungefähr 80-90 % der Schößlinge zeigten eine signifikante PMI-Aktivität. Die restlichen 10-20 % wurden verworfen.

Zum Durchführen des Nematodentests wurden die Schößlinge mit PMI-Aktivät und guter Wurzelentwicklung (4-6 Wochen alt) von den Agarplatten abgenommen, und die Wurzeln wurden sorgfältig in Leitungswasser gewaschen. In eine 4 x 2 x 12 cm Sandsäule, die auf den Seiten in Plastik eingehüllt war, wurde ein Loch eingeführt und die Schößlinge wurden darin eingepflanzt. Der Sand wurde vorsichtig um die Wurzeln gegeben und sorgfältig gewässert, und die Pflanzen in der Sandsäule wurden unter ein Kunststoffzeit für 10 Tage bei 25°C überführt. Das Zelt wurde nach und nach während dieser Dauer entfernt, um die Pflanzen abzuhärten. Diese Pflanzen wurden mit Nematoden unter Verwendung einer Spritze inokuliert, indem jeweils 200 juvenile Nematoden (J2) möglichst nahe an der einzelnen Pflanze in den Sand eingebracht wurden. 3 Wochen nach der Inokulation entwickelten sich die weiblichen Zysten, und sie wurden quantitativ bestimmt unter Verwendung eines Stereomikroskops. Die gesamte Wurzel einer jeden Pflanze wurde untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden mit der nicht-transgenen, anfälligen Linie Cl, der transgenen Kontrollinie CLD10, der nicht-transgenen anfälligen Kontrolle, die aus Samen entwickelt wurden (C2) , und den transgenen Pflanzen, die das Konstrukt LD10/1832-13 enthalten (T1-T9) .

Pf lanze Anzahl der durchschn itt l iche I D-Nummer

Pf lanzen Anzahl an Zysten/Pf lanze

Kontrol le Ci 4 9 lab 535

Kontrol le C2 9 9 , 3 Samenpf lanzen

Kontr . CLD10 2 9 , 5 T9600130 l 2 14 1458D τ₂ 2 9 , 5 1468A τ₃ 2 4 143614J τ 4 4 , 3 14479K τ₅ 2 2 , 5 144710L τ₆ 3 5 , 3 14054D τ₇ 4 6 , 75 142611H τ₈ 5 5 14052B τ₉ 4 7 , 5 14053C

9 unabhängige transgene Linien mit dem Konstrukt LDIO/ 1832- 13 wurden in diesem Test analysiert. 2 (Ti und T ) haben ungefähr die gleiche Anzahl an Zysten entwickelt wie die Kontrollen C_{l f} C und CLD10. 3 der transgenen Pflanzen (T₃, T₄ und T₈) zeigen eine Zystenentwicklung von ungefähr der Hälfte der Kontrollen, wobei dies anzeigt, daß das Gen in diesen Pflanzen bis zu einem gewissen Grade aktiv ist. Eine der transgenen Linien, T₅, zeigt eine Zystenentwicklung, die den zuvor berichteten Ergebnissen (Cai et al. 1997) entspricht. Die T₅-Linie entwickelte nur durchschnittlich 2,5 Zysten pro Pflanze, wobei dies deutlich niedriger ist als die Anzahl an Zysten, die im Mittel von ungefähr 10 Pflanzen für die verschiedenen Kontrollen beobachtet wird. Dies zeigt deutlich, daß das 1832-Gen in den Wurzeln einer Zuckerrübenlinie, die kommerziell von Interesse ist, aktiv ist.

Die oben erwähnten Literaturstellen lauten wie folgt:

- Cai D., Kleine M. , Kifle S. , Harloff H.-J., Sandal N.N., Marcker K.A. , Klein-Lankhorst R.M. , Salentijn E.M.J., Lange W. , Stieke a W.J., Wyss U, Grundler M.W. und Jung C. (1997) Science 275, 832-834.

- Fera isco R. , Tilley B.E., Conn W.R., Gracy R.W., Noltmann E.A. (1973) Biochem. Biophys. Res. Comm. 55: 636-641

- Gill J.F., Deretic V., Chakrabarty A.M. (1986) J. Bacteri- Ol. 167: 611-615

- Holters et al. (1978) Mol. Gen. Genet . 163: 181-187

- Maniatis T. , Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laborato- ry, New York, USA

- Miedema P. (1982) Euphytica 31: 635-643

- Murashige T. , Skoog F. (1962) Plant Physiol. 15: 473-497

Beispiel 13

Herstellen des Plas ids LD10/1832-13

In Figur 5a-d ist die Herstellung des genannten Plasmids dargestellt. Das Xbal-Fragment von Nukleotidposition 1521- 2904 aus der SEQ ID Nr. 1 wurde mit Klenow-Enzym zu glatten Enden aufgefüllt. Dieses Fragment wurde dann in die mit glatten Enden versehene BamHI-Stelle des Plasmids pPS48 eingefügt. Dieses neue Plasmid, pPS48/BamHI-15 genannt, wurde dann mit Hindlll gespalten. Das HindiII-Fragment von Basen- paar 0-2403 wurde in die Hindlll-Stelle des Plasmids pLDIO eingeführt, wobei Plasmid LD10/1832-13 erhalten wurde.

Beispiel 14

Transformation von Brassica napus mit der Sequenz 1832 zur Erzeugung von Nematodenresistenz und Resistenztest

Als Transformationsvektor wurde das Ti-Plasmid pAM194 , enthaltend das Gen für die Nematodenresistenz (Sequenz 1832) verwendet. Der Vektor ist im einzelnen näher in Beispiel 11 beschrieben.

Als Bakterienstamm wurde Stamm C58C1 ATHV Rif verwendet, der sich vom Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101 ableitet, welcher das Helferplasmid pEHAlOl ohne Kana ycinresistenz trägt.

Der Stamm AMT entspricht dem oben genannten Stamm C58C1 ATHV Rif, der das Plasmid pAM194-1832 enthält.

Die Anzucht der Bakterien für die Transformation erfolgte für die AMT-Kultur auf LB-Agar mit 50 mg/1 Kanamycin und 100 mg/1 Rifampicin und wurde bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt. Zwei Tage vor der beabsichtigten Transformation werden 30 ml LB-Nährmedium mit der entsprechenden Bakterienkultur angeimpft. Zur Bakterienselektion enthält das Flüssigmedium, wie auch der LB-Agar, 50 mg/1 Kanamycin und 100 mg/1 Rifampicin. Die Bakterien wurden 24 im Dunkeln bei 28°C auf einem Schüttler bei 190 up inkubiert. Am zweiten Tag impft man 30 ml LB-Medium ohne Antibiotika mit 20 μl der oben genannten, nach 24 Stunden erhaltenen Bakterienkultur an und inkubiert für weitere 24 Stunden bei gleichen Bedingungen.

Zur Anzucht von Sommerraps in vitro (Brassica napus ssp. oleifera cv. Sommerraps) wird das Saatgut in sterilen Erlen- meyer-Kolben mit NaOCl (3 % aktives Chlor) für 10 Minuten sterilisiert und anschließend 3 x mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen werden dann auf MS-N-Medium mit B5-Mikroelementen und Vitaminen ausgelegt. In einem Container mit 50 ml Nährmedium werden 10 Körner ausgelegt. Die Körner werden bei ca. 2000 Lux und einem Tag-/Nacht-Rhythmus von 16 h/8 h für 4 Tage inkubiert. Die Anzuchttemperatur beträgt 25°C.

Zur Transformation mit A. tumefaciens (Kotyledonentransformation) werden von vier Tage alten Keimlingen die Kotyledonen mit einem Skalpell kurz über dem Meristem abgetrennt. Dazu faßt man beide Kotyledonen mit einer Pinzette und trennt sie gleichzeitig mit einem geraden Schnitt ab. Sofort nach dem Abtrennen taucht man die Petiole der Kotyledone für 10 sec in die unverdünnte Bakteriensuspension (Übernachtkultur) . Dann werden die Kotyledonen zurück auf das Anzuchtmedium gesteckt. Die Cokultur von 48h wird bei 25°C und Dämmerlicht durchgeführt. Nach Beendigung der Cokultur werden die Kotyledonen in Container mit 50 ml MSM-Medium, das 750 mg/1 Carbenicillin zur Bakterienabtötung enthält, gesetzt und 7 Tage bei bei 25°C und 2000 Lux bei 16 h Tag kultiviert. Nach 7 Tagen auf MSM mit 750 mg/1 Carbenicillin werden die Kotyledonen auf das gleiche Nährmedium umgesetzt, das zu Beginn zusätzlich 20 mg/1 Kanamycin zur Sproßselektion enthält. Bei späteren Passagen ist die Kanamycin-Konzen- tration auf 25 mg/1 erhöht worden. Nicht-transgener Kallus wird turnusmäßig entfernt. Die abgetrennten Sprosse werden zur weiteren Selektion bzw. zum Nachweis der Transgenität auf B5-Medium mit 50 mg/1 Kanamycin und 400 mg/1 Betabactyl gesetzt. Das mitübertragene GUS-Gen erlaubt eine weitere Identifikation transgener Sprosse zum frühestmöglichen Zeitpunkt. Die Bewurzelung der transgenen Sprosse findet auf B5- Nähr edium ohne Hormone statt. Zum molekularbiologischen Nachweis der Genübertragung wird ein GUS-Test als histochemischer Nachweis auf ß-Glucuroni- dase-Aktivität durchgeführt. Das Enzym spaltet Indol von einem künstlichen Substrat ab, so daß sich GUS-positive Blattstücke blau färben. Der Testablauf ist gemäß Jefferson R.A. (1987) : Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fu- sion System. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405.

Ein weiterer molekularbiologischer Nachweis der Genübertragung ist der NPTII-ELISA-Test , bei dem die Bildung des Enzyms Neomycin-Phosphotransferase, welches der transgenen Pflanze Kanamycin-Resistenz vermittelt, qualitativ und quantitativ nachgewiesen wird. Der Test wurde mit dem NPTII- ELISA-kit (Kat. Nr. 5307-630101) der Firma CP Instruments Co., Ltd. durchgeführt.

Um ständig ausreichende Larvenmengen für die Inokulation bei Resistenztests mit Heterodera schachtii zur Verfügung zu haben, wurden die Nematoden an den Wirtspflanzen Senf (Sorte "Albatross" Petersen-Saatzucht) sowie Rüben vermehrt. Die Samen werden in 3 %iger Ca (0C1) 2-Lösung für 10 min und anschließend 3-4 x mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Anschließend trocknen die Samen auf sterilem Filterpapier und werden dann auf Wasseragar mit 8 % Agar-Agar aufgelegt. Nach 3-4 Tagen auf diesem Agar bei 25°C in Dunkelheit werden die jungen Keimlinge auf 0,2 konzentriertes Knoop-Medium umgesetzt. Die Wurzeln sollten dabei etwa 3-4 cm Länge aufweisen. Verwendet werden Petrischalen mit 15 cm Durchmesser und Nocken, in die zwei Keimlinge gegenüber plaziert werden. Nach 14 Tagen Wachstum im Dunkeln bei 25°C erfolgt die Inokulation mit 1000 Nematodenlarven im L2-Stadium. Nach etwa 4 Wochen bei 25°C in Dunkelheit haben sich reife Zysten gebildet, die nun gesammelt werden können. Bei der Zystenernte werden mit einer Federstahlpinzette ca. 200 Zysten in ein kleines Sieb, Maschenweite 50-200 μm, gesammelt, welches in einem Glastrichter gefüllt mit Zinkchloridlösung (3 mM) steht. Am Trichterauslauf ist ein Silikonschlauch befestigt, wicher mit einer Stahlschlauchklemme abgeklemmt ist. Diese Anordnung steht in einem hohen 250 ml Becherglas, welches mit einer Alufolie abgedeckt wird.

Nach 3 Tagen bei 25°C im Wärmeschrank haben sich die geschlüpften Larven vor der Stahlklemme im Silikonschlauch gesammelt und können durch kurzes Öffnen der Klemme in ein Sieb mit 15 μm Maschenweite geerntet werden, wobei der Trichter mit einer Pinzette gehalten wird. Die Larven werden nun 3 x mit sterilem Wasser gespült und anschließend mit einer Pasteurpipette in ein steriles Blockschälchen überführt. Nach etwa 3 min Wartezeit, in der die Larven zu Boden sinken, wird die überschüssige Flüssigkeit weitestgehend abgesaugt und durch 0,5 %ige Gelrite-Lösung ersetzt, die eine homogene Verteilung der Larven gewährleistet. Nach sorgfältigem Durchmischen wird die Konzentration der Larven mittels Stereomikroskop überprüft, wobei die Larven in einem 10 μl Tropfen gezählt werden.

Zur Durchführung der in vitro-Tests wurden die Wurzeln von den Sprossen der transgenen Ausgangsklone abgetrennt und auf 4 B5-Medium mit 300 mg/1 Betabactyl und 8 g/1 Daishin-Agar aufgelegt. Jede Inokulation eines transgenen Ausgangsklons wird mit je 5 Wurzeln durchgeführt. Als anfällige Kontrolle wird Ölrettich verwendet, dessen Wurzeln wie oben beschrieben erhalten worden sind. Pro Schale werden etwa 100 L2- Larven von Heterodera schachtii auf die Wurzeln getropft, die wie oben beschrieben erhalten worden sind. Zur Inokulation wird eine Multipette mit 0,5 ml Combitip verwendet. Die mit Parafilm versiegelten Schalen inkubieren bei 25°C im Dunkeln. Die erste Zählung der gebildeten Zysten erfolgt nach 14 Tagen, die zweite und letzte Zählung nach 20 Tagen, wenn die Zysten bereits schwach gebräunt sind und sich so besser von den weißen Wurzeln abheben.

Bei der Durchführung der in situ-Tests werden zunächst je 5 Sprosse pro transgenem Ausgangsklon in das Gewächshaus überführt. Die Sprosse sollten sich dazu bereits etwas gestreckt haben und einige wenige Wurzeln besitzen. Sie werden in Aussaaterde pikiert, in der sie 1,5 Wochen verbleiben, um mehr Wurzelmasse zu entwickeln. Überdies gibt ihnen das die Möglichkeit, sich an die Gewächshausgbedingungen zu aklimati- sieren. Nach 1,5 Wochen werden die Pflanzen in Quarzsand mit einem Kordurchmesser von 0,1-0,5 cm pikiert, der zuvor mit Nährlösung nach Steiner angefeuchtet worden ist. Die Inokulation wird in diesem Sand durchgeführt, da das Ausschlämmen und Auszählen der Zysten durch Humusteilchen und Schmutzpartikel stark erschwert wird. Der Sand befindet sich in Röhrchen, die in einer Kiste aufgestellt werden. Da die Randbereiche einer Kiste den Pflanzen mehr Licht und damit bessere Wachstumsbedingungen geben, werden die Testpflanzen von anderen Pflanzen umgeben, so daß jede Testpflanze einen Nachbarn hat. Eine Woche nach dem zweiten Pikiertermin erfolgt die Inokulation mit (600) frisch geschlüpften H. schachtii-Larven , L2-Stadium. Die Auswertung erfolgt nach ca. 6 Wochen, wenn die Zysten braun geworden sind und leicht von den Wurzeln abgespült werden können. Die Zysten werden durch Abspülen mit einem scharfen Wasserstrahl durch ein Küchensieb von den Pflanzenwurzeln abgetrennt, in einem 100 μm Sieb aufgefangen und durch Zentrifugation vom Sand getrennt. Das erhaltene Gemisch aus Zysten, feinen Wurzeln und Wasser wird filtriert und die Zysten dann unter dem Biokular bei 10-facher Vergrößerung ausgezählt.

Die Transgenität der Pflanzen wurde durch PCR-Analysen sowie NPTII-ELISA- und GUS-Tests gezeigt. Die Tabelle zeigt die Ergebnisse aus dem in vivo-Resi- stenztest mit der nicht-transgenen anfälligen Sorte T₀ und den transgenen Pflanzen T₇ bis T₁₅ mit dem Gen 1832.

10 unabhängige, transgene Linien mit dem Gen 1832 wurden in diesem Test ausgewertet. 6 Linien (T₈, T₉, T₁₀, T_1X T₁₃ und T₁ ) hatten eine vergleichbare Anzahl von Zysten wie die anfällige Linie; 3 Linien (T₇, Tai und T₁₅ hatten im Vergleich zur Kontrolle eine Reduktion der Zysten von 27% und 1 Linie (^τ _ll) eine Reduktion der Zysten von 47 %. Dies zeigt, daß das Gen in den Pflanzen aktiv ist und bei Brassica napus eine deutliche Reduktion des Zystenbefalls zu erzielen ist.

Beispiel 15

Kartoffeln der Sorte Bintje wurden mit dem Plasmid pAM194 mit dem Insert 1832 unter der Kontrolle des 35S-Promotors mit A. rhizogenes transformiert. 40 unabhängige Hairy-Root- Kulturen wurden mit je 250 Globodera pallida-Larven inokuliert. Nach 56 Tagen wurde die Nematodenentwicklung untersucht. 35 Kulturen zeigten eine normale Nematodenentwicklung mit durchschnittlich 40 reifen Weibchen/Petrischale. An 5 Wurzelkulturen war die Entwicklung von Weibchen gestört. Dort wurden nur je 10 reife Weibchen gefunden. Dies zeigt, daß die Sequenz 1832 in Kartoffeln deren Resistenz gegen Ne- matodenbefall verbessern kann. SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Prof. Dr. Christian Jung

(B) STRASSE: Zum Amt 15

(C) ORT: Daenischenhagen

(E) LAND: DEUTSCHLAND

(F) POSTLEITZAHL: 24229

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Nematodenresistenzgen (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5401 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris

(B) STAMM: A906001

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(A) BIBLIOTHEK: lambda DASHII

(B) CLON(E) : 1832.1

(viii) POSITION IM GENOM:

(C) EINHEITEN: 5401

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCT 60

TCTTTCTTGG TGCTTAATTT TTTGACACTA ATCCGATTCT TAGCATTAAG TTGAAGCACA 120

CTCTTGATAA ACTATGTTAC TATGTATCAT TGTCAATATG CTAAGAATTT GTCTTGACCT 180

CATCGCTATG TATAAGCATC TAATACTTTC CTAAACTAGT AAAAACAAAT ATTCCATCCG 240

TCCCATAATA TGAGTCCCCT TTCTATTTTA GGAGTCAAAA TTTTAAAATT TTTGACCAAA 300

TATTCTTATT ACTATATATA AAAACATATT CATGTGGGAT CTTGTTAGAT TCGTCTTAAT 360

ERSATZBLAH(REGEL26) ATGTATTTTC ATAATATCAA CTTTTTATAT TTTTTTACTA ATACGAAATT GAAGATATAC 420

AATGTCTTAA AGACTATGCA AAAGTAAGCA GAACCTATAT TTTGGGACGG AGGGAGTAAT 480

AAGTAATATT GATTGACGCA TAATTTGTAT ATAAATATTT CAAATTGATA CTACTTTAAA 540

TAATATAGTT AATGCTTATA AATAAGCCTA AAGACTGTGA ATAGCAAGAT CGTTAAAAAT 600

AAAATTTGAA AATATTTGAT ATGGATAATG AAATTGGAAA TGGCATGCTT AGCTTCTCGG 660

GAATCTTATA CCGCTACATC TATAATAAAA ATTCCTCATA AAATTTTGCC CATTTTAACA 720

CACGAAATTC GTCCTTTTAC GCGAGCCCTT TCCACACGTC TTTAAAATTT AAAAACCTCG 780

TCTTTACTCT CCCCACCTAT ATATATACAC GTCCCCCCTT CTCTACTTCC CATCTCACAT 840

ACACATACCC AATCCACAAA CTTCCATCTT ATCCAACTTT CTCTCACCTA TCTCCTTCTT 900

CAATTTTCAA AACTCAAAAG AAAATGGTAG ATTTCGATTG CAAAACAAAA ATGGTACAAT 960

CAACACCAAA CCTCACAAAA AAATCTCCAA AAATCACAAC CAAACGCACA ATATCAACAC 1020

CATTAATTTC ACCAGTACCA GTAATTTCCG GCGAATTATC TCCGGCGTCG GAATCATCCT 1080

GTTCAGCTTA CGAATCGTAT CTCAAATTAC CGGAGCTCCG TCAACTATGG AGTTCAAAAG 1140

AATTCCCCGG TTGGGATAAC GAACCGATAA TCAAACCGGC TTTGCAAGCA TTAGAGATAA 1200

CATTCCGGTT CATCTCACTC GTTTTATCCG ACGCTAGACC GTACATAAAC CGGCGAGAAT 1260

GGAACCGGAA ATTAGAGTCG TTAGCGAGAG ATCAAGTCCG AAACTCATCT CAGTTCTCTG 1320

CGGAAGACGA TGAGACACGT GGATCAGCTC CGAATCGTTG ATCTGACGTC ATCGTATGGT 1380

GAGGTGATGT CACAAACAGA AGTTCAGCGG AGGTATGGAA GCTTGCGAAT GGAGAACATG 1440

ATACTACCGT GGTCTGTCGT AGTAGCGAAT TTAGTCTCCT TCCGAGGTTA GCCACGTGGC 1500

AGAAGTCGGA GGAGATTGCT TCTAGAATCT TCTACGCGGT TGAATCTGCT ATGAGAAGGT 1560

GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT TTAGATTACG 1620

ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG GATTATATTC 1680

AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT 1740

CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG 1800

CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT 1860

TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG AGGATGAAAA 1920

CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG GTAACAAAAT 1980

TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG 2040

GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA 2100

AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA 2160 ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG AATTTTGCTG 2220

TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA GAACCTACTT 2280

ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG 2340

CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGAT 2400

GGTTTCGAAG TTAGTTTTGG ATTGAGTTTG GTTTGATCTG ACTCGGCTGA GTAATGGGCG 2460

GCGATAGGGA GGTTATGGAG AACGTGGGGC GGAAAGTGGG TGGCCTTGTT AGTGAGACGT 2520

GCAAACTTTG GTTACTATTA CATGTGATAT ACTTATATTT AGTGGGAATA TTGCTTTGGT 2580

GTATATAGAT AAATTTTTGA ATTAATTGTT ACACTTGTAT TAGTAAATTC TGTATCATGA 2640

TGATTATAAC ATGAATTTTT TGTTGTGACT TTAAATGAGA TTTATGCTCC TTAATCCTTA 2700

TTTCACTGAT ATTATTTTTT TGTAGTCTGA GTATAAGTGC GGAGTTTAAT CAAGCAAGAG 2760

AAAATAATAG AAGGTGATTG CATACTTGGA TTGGAGATCA ATATCTAAAA GATGGTTATG 2820

AAACTATTGT GAATAACGGA GTACATGTCC AACACCACAC ACGTATGACT GTGTACCTCT 2880

AATTTACAAA GAGATTTACA AAATCTAGAT GAGTTTTGAT ATGATCGACA TTGTCTCTAA 2940

ATGGGAGATA AGAATTAAAT CGTGAGGCTC TTTGCGGCTA GNTCTTCCGA ATAAAATAAG 3000

AAACAATGGT TTACTCTAAT TCANTTTTCC AATTGGCAAA GTGGCACAAG CTTCAATAAN 3060

TNGGCTCTTC ACAATTGAGT ATAAAAGAAT GGGTTAATTA CNCCGGNCTT TGAATAAAAT 3120

TAATCCTATT TAATTGTTTT TGAAATATTC TTAAAAATAN CGTTGTCTAA TACTTTCTTT 3180

AGTTGGGACC CGGTTCTGAA CCNACTTAAA TTAATGGGCT CAATGGCCGC CTAATTTCCT 3240

CTTGTTATTT TTAGCCTTTT TTTTCCTTTT TTTCCCTTTA AAATAACTAT TTGTTCTCTT 3300

GAATATCTTA AAATACGTGT CTATCNNCTT TAGTTGGACC GTCTGAACTA TTATTATGCT 3360

ATGCACTATT CCTTTGTATT TACCTTTTTC TTTTTCCTTT AAATACTATT GTTCTCATTT 3420

CAATTATATT CTATTTTTGT TAAAAAACGG TCTTAATTTT TACAACAGTA AAATTATTGA 3480

TTTTCCTTCT ATATTAAAAT TTGAAAGTGA ATGTATTTCG AAATTTAGGT ATATGAATAT 3540

TTATATTGTT CGATTAATGA TGATAAAAGG ATTTTACTCA TTAACCTAAA CCATTTCTAG 3600

ATAAGATAAG AGGAACTTCC ACCTAGTTAA CATGTCTCAC TTTCCTAGTA GACGAATCTA 3660

AATTGCGTTG CTGGATTTAG AACTTTGGTC AAGATAATGG CAAAACTTTC AAGCACCCGT 3720

AGATGCATTT TCCNCGACAT TTCTCATACA GCACTAAACG TTTCAACTTC CTCTTTTATT 3780

TTCTTGAAAT TTTTTGTGGC AATGAGAAAC GTTCGAAGTT GATCTTTGCG TTTCGACGAT 3840

TTGAAATAAG AAAATGCGTA TTGTCGGCAA CTGATTGTAG TAGTTGCNGT TATTATAATG 3900

ATAGTCTTTT ATATAGAATT CATTTAATTC TAATTCATTT GAATCCAGTT AAGTTGAGTT 3960 TAGTTTAGTC AGCCTAAAAG AACAAAGTAA GTCATGGAAT GGAATGAAGA TGTAATCAAA 4020

TAGAGGAGGG GCTGATAACA ATAATTATTA CTTATGTTGC GTGTTCAATT CAGTAATGAA 4080

AAAAATAAGG TTGAATTAGG AGGGTAATAC AATTATTACC GGTGATGTGA TAAAACTAAT 4140

GTTTAAGGGT TTAAGTTACT CTAAACCCTC AATTAAACAT AGTCTAACAA AAAATTCTCA 4200

TAATCTAAAT CAAACACGTA CTTATACAAT CCTCTACATG AATCCGTTTC TAACTCTAAA 4260

GGAAGATCGA TACTTATTAG AATCCGTTTC CAACCCTAAA AATGACTGAT CAAAGGTTCA 4320

TGGATTTTGG AAGGGAAAGA CGAATGCGAG GGCAGTGTAC AGGATAATGT GCATGAGATG 4380

GCAAGGGTCA TGCTAGTTAG AGCAAAATAT ANATGACTTA ATTCAAAAAC TACCTACTAT 4440

TTCAAATTAA TAGACTTTAT TGGAGTCATG AAGTGTACTG TTTGGTACAC CCCACATTAC 4500

TCATGCACTA CACCTAATTT GTCACAGCAT TCAGCTGCCC TTGTTTTGCA GTCTTTGGAG 4560

CTGGCGTGCC TCTTGTTGCT GGTTAGTCGG CGCTTGGTCT GTTGTGNNGT GACCCTCTGT 4620

TTTTTTTTTT TTTTAAAATG GTCGCTGATT ACTATNCTGT GTATTNCATT TTGTACTCCC 4680

TCGTATCCAA TTATATGCTA CACTTTTTTT GCGGACTCCA AAACGTTTTT TTTTTNTGTC 4740

CGAGAGATAG AGAGGAAAAG CCCATGTTGT TAGGAGAGAG NTCGGGAGAA GGAAAAGCCA 4800

AATAAAGAAG TAATAACATC TAAATAAGAA AATTCCTTTG ATGGAAAGTG TAGCGACTAA 4860

AAAACGAAGG ACAATATGTA GTTTTCATAT GCCTTTACCT TTGCAATCTC CTTTTTTATT 4920

GTTTACCCAT ACTGGATTAG GTTGGATTTA TCAACACAAA ATGAGTTGGA CTATATCACT 4980

ACATTACTGT GGTCCTGTGG ATACATCAAC AAAAAAAATG AGTTGGACCA TATCAATGTG 5040

TTAGCGTGGA TTATGTACAC ATTGGACTGG AGTTGAAGCA AATATAATCT GAAAAGGGCG 5100

ATGGGTTAGG TCATGAGGTA TTTAGAATAA GACTTTGATC AAGCCCAAAT CCACCCGCAA 5160

AGAATTATAC CCTTTATTTT CAAGGCACCA TCACTGCATA AAATAATCTG AAATGCCACA 5220

AAAGATTAAC GTCCAATATG CTCACAGCCA AAAATCAATC CATTATTGTT TGGTAAGAAA 5280

AGGTAATAGG CTAGATCAAT TTGCTGCCAA TTGCCAGGCC TGTGGGCCTG TCACCTGTGG 5340

GTAATTTAAT ATGNCTCAAA TGGGTCGGCC TGTTAAGTAC ACCAACATGA ACTTAAAGCT 5400

T 5401 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 849 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (viii) POSITION IM GENOM:

(C) EINHEITEN: 849bp

( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2:

ATGAGAAGGT GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT 60

TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG 120

GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG 180

TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG 240

TTTACCAAAG CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA 300

ATCGAGAATT TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG 360

AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG 420

GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG 480

GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA 540

AGATACGAGA AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG 600

TTTTTCTTTA ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG 660

AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA 720

GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG 780

CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG 840

AAACAATGA 84 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3:

( i ) SEQUENZKENNZEICHE :

(A) LÄNGE: 1774 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

(Vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris

(B) STAMM: B883

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(A) BIBLIOTHEK: lambdaZAPII

(B) CLON(E) : extl832-16c

(viii) POSITION IM GENOM:

(C) EINHEITEN: 1774 (xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 3 :

CCACAAACTT CCATCTTATC CAACTTTCTC TCACCTATCT CCTTCTTCAA TTTTCAAAAC 60

TCAAAAGAAA ATGGTAGATT TCGATTGCAA AACAAAAATG GTACAATCAA CACCAAACCT 120

CACAAAAAAA TCTCCAAAAA TCACAACCAA ACGCACAATA TCAACACCAT TAATTTCACC 180

AGTACCAGTA ATTTCCGGCG AATTATCTCC GGCGTCTGAA TCATCCTGTT CAGCTTACGA 240

ATCGTATCTC AAATTACCGG AGCTCCGTCA ACTATGGAGT TCAAAAGAAT TCCCCGGTTG 300

GGATAACGAA CCGATAATCA AACCGGCTTT GCAAGCATTA GAGATAACAT TCCGGTTCAT 360

CTCACTCGTT TTATCCGACG CTAGACCGTA CATAAACCGG CGAGAATGGA ACCGGAAATT 420

AGAGTCGTTA GCGAGAGATC AAGTCGAACT CATCTCAGTT CTCTGCGAAG ACGATGAGAC 480

ACGTGGATCA GCTCCGATCG TTGATCTGAC GTCATCGTAT GGTGAGGTGA TGTCACAAAC 540

AGGAAGTTCA GCGGAGGTAT GGAAGCTTGC GAATGGAGAA CATGATACTA CCGTGGTCTG 600

TCGTAGTAGC GAATTTAGTC TCCTTCCGAG GTTAGCCACG TGGCAGAAGT CGGAGGAGAT 660

TGCTTCTAGA ATCTTCTACG CGGTTGAATC TGCTATGAGA AGGTGTGGGT ATAGTTTGGG 720

CCTTGGTGAG CCCAATTTGG ACGGAAAGCC CAATTTAGAT TACGACGCCG TTTGTCGTCC 780

TTCTGAGCTT CACGCGCTTA AAAAGGGCGC GTTGGATTAT ATTCAGAATT CGGAAAATCA 840

GATATTGTTT ACAATTCATC AGATTTTCGA GTCGTGGATT TTTTCCTCGA AAAAATTGTT 900

GGATCGAATA AGTGAGAGGA TCAGTAAAGA AGAGTTTACC AAAGCAGCAG ATGATTGTTG 960

GATACTGGAG AAAATATGGA AGTTATTGGA GGAAATCGAG AATTTACATT TATTAATGGA 1020

TCCTGACGAT TTCCTGCATC TGAAGACGCA ACTGAGGATG AAAACAGTGG CGGATTCTGA 1080

AACTTTTTGT TTTCGATCAA AAGGACTGAT CGAGGTAACA AAATTAAGCA AGGATCTACG 1140

GCACAAGGTG CCGAAGATCC TTGGTGTAGA GGTGGACCCT ATGGGAGGAC CGGTGATACA 1200

AGAGTCGGCA ATGGAGTTGT ACCGAGAAAA AAGAAGATAC GAGAAGATAC ATCTGTTACA 1260

AGCGTTTCAA GGGGTGGAAT CCGCTGTTAA AGGGTTTTTC TTTAATTATA AACAGTTGTT 1320

GGTGATCATG ATGGGTAGTT TGGAAGCGAA AGCGAATTTT GCTGTGATTG GTGGTTCTAC 1380

TGAGTCTTCG GATTTGTTGG CTCAGTTGTT TTTAGAACCT ACTTATTATC CGAGTTTGGA 1440

TGGTGCCAAG ACTTTTATTG GTGATTGTTG GGAGCATGAT CAGGCTGTTG GTAGCGGCCT 1500

CGATTGTCGT CATCATCGGA AGAATCGGAC TGCGAAACAA TGATGGTTTC GAAGTTAGTT 1560

TTGGATTGAG TTTGGTTTGA TCTGACTCGG CTGAGTAATG GGCGGCGATA GGGAGGTTAT 1620

GGAGAACGTG GGGCGGAAAG TGGGTGGCCT TGTTAGTGAG ACGTGCAAAC TTTGGTTACT 1680

ATTACATGTG ATATACTTAT ATTTAGTGGG AATATTGCTT TGTGTATATA GATAAATTTT 1740

ERSΛTZBLATT (REGEL 26) TGAATTAATT GTTACACTTG TATTAGTAAA TTCT 1774 ( 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4 :

( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :

(A) LÄNGE : 1705 Basenpaare

(B) ART : Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris

(B) STAMM: B883

(vii ) UNMITTELBARE HERKUNFT :

(A) BIBLIOTHEK : lambdaZAPII

(B ) CLON (E) : Bvl832 -6b

(viii) POSITION IM GENOM:

( C) EINHEITEN : 1705

(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 4 : ACAAACCACA AAATTACATC TTATCCAATT TTCTCTCTCC TACTATTTAT CTCTCTTCAT 60 CTTCAAATTC AAAACTCAAA ATTTCCAAAA AACATATCAG AAATTCAAAA AAATGGTTGA 120 TTTCGATTGC AAAACAAAAA TGGTTCAATC AACACCAAAT CTCACAAAAA AAAACCCCAA 180 AACGCATCAC TTCAACGCCG GTAATTTCAC CGGTACCGGT AATCGCCGGT GAATTATCAC 240 CGGCATCGGA ATCTTCATGT TTAGCATACG AATCATATCT CCGGTTACCG GAGCTCCGAG 300 AATTATGGAG TTCAAAAGAA TTTCCAGGGT GGAAAAACGA GTCAATAATT AAACCGGCTT 360 TACAAGCTTT AGAAATAACT TTCCGGTTTA TTTCAATTAT TTTATCCGAC GCTAGACCGT 420 ACGTGAACCG GCGTGAATGG AATCGTCGAT TGGAGTCGTT AACTCGAGAT CAAGTCGAGT 480 TAATCTCGAT ATTATGTGAA GATGATGAAA CATCTGGTTC TGCTCCCATA ATGGATCTGA 540 CATCATCTTT CGGTGAAGTG ATGTCACAAA CTGGAAGTTT TACAACAGAA GTATGGAAAC 600 ATGAAACTAC TTCGGTAGTA TGTCGTAGTA GTGAATTTAG TCTACTTCCT AGACTTGCCA 660 CGTGGCATAA ATCAGATGAG ATTTCTTCTA GAATATTCTA CGCGGTTGAG AGCGCGATGA 720 AGAGGTGTCC ATATAGTTTG GGCTTAGGTG AGCCCAATTT AGATGGAAAG CCCAATTTGG 780 ATTACGACGT CGTTTGTCGT CCTACTGAAA TCCACGCGCT TAAAAAAGGC GCGTTGGATT 840 ATATTCAAAA TCCGGAAAAC CAGATTTTAT TCACAATTCA TCAGATTTTC GAGTCGTGGG 900 TTTTTTGCGC GAAACAATTG TTGATTCGTG TAGGAGAGAG AATCAACAAA GAAGAATTCA 960 ACAAAGTTGC AGATGATTGT TGGGTTTTAA CAAGAATCTG GAACATTCTA GAAGAAATCG 1020

AGAATTTACA TTTATTAATG GATCCAGATG ATTTTCTACA TTTGAAAACT CAATTACGGA 1080

TGAAAACGAC GTCGGATTCT GAAACATTTT GTTTCAGATC AAGAGGTTTA ATTGAAATTA 1140

CAAAATTAAG TAAAGATTTA CGTCACAAAG TTCCAGAAAT TCTAGCCGTT GAAGTGGACC 1200

CCATGGGTGG ACCAGTAATA CAAGAATCAG CAATGGAGTT ATATAGAGAG AAGAGAAAGT 1260

TCGAGAAGAT TCATGTTTTG CAAGCATTTC AAGGTGTTGA ATCTGCTGTG AAAGGTTTTT 1320

TTTATAATTA TAAACAATTG TTGGTGATTA TGATGGGAAG TTTAGAAGCT AAGGCTAATT 1380

TTGCTGTAAT TGGTGGTGGT TCTGAATCGT CTGATTTATT GGCTCAGATC TTTCTAGAAC 1440

CTACTTATTA TCCTAGCTTA GATGGTGCCA AGACTTTTAT TGGTGATTTT TGGGATCATG 1500

ATCAGACGGT TGTGAGTGGG TGTGATAGGA AAAATCGGGT TGCGAAAAAT TGATCATTGA 1560

TAAAAGGGCG AAAGTATACT TGGCCGTCCT CCTTAACCAA GTCTGGTTTC GCTCCTGGGT 1620

GATGGTGGTG GTGTCGTTGG TGAGACGTGG GTTACTTTGA TTACTTGTTA CAATGTGATG 1680

ATATATTTAG TGGAATACTA TTGCT 1705 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1490 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana

(B) STAMM: Columbia

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(A) BIBLIOTHEK: lambdaPRL-2

(B) CLON(E) : 61cllt7

(viii) POSITION IM GENOM:

(C) EINHEITEN: 1490

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

ACAAACACAA ACACACACAC CAAAAAAAAC ACAGACCTTA AAAAAATAAA AATGGTTGAT 60

ATGGATTGGA AGAGGAAGAT GGTATCATCA GATTTACCAA ACTCACCTAA GCTTTCTTCA 120

AAGCTTCACG TAACTATTCC ATCACCGTTC AAAATCGTCC CTGTTTCATC TCCGATCTCA 180

TGTTCAGCAC CTGCTCTTTG CTCTGCTTAC GAGCTTTACC TTCGTCTCCC TGAGCTAAGA 240

AAGCTCTGGT CATCTCGTGA TTTTCCTCAA TGGACATCAG AGCCGATTCT CAAACCAGCT 300 CTTCAAGCTT TGGAGATCAG TTTCAGATTA GTTTTCGCCG TTTGTTCTGA TACTAGACCG 360

TACATCAACC ACCGTGAATG GAACCGGAGG CTAGATTCTC TCATCACGAA GCAGATCCAG 420

CTTGTAGCAG CGATCTGCGA AGATGAAGAA GAAGAAGGTA TATCAGCGGA GGCTCCGGTC 480

GGCGGTGGAC GGAGTTCGTT GAGTTTGTTA CCGCAGCTAG CTACGTGGAG GAGATCAGAG 540

GCTTTGGGGA AGAAGATCTT ATATACGATC GATAACGAGA TGAGTCGGTG TAAGTACACG 600

CTCGGACTCG GTGAACAAAA CATCGCCGGA AAACCAAATC TCCGGTACGA TGCGATTTGC 660

CGACCAAACG AGATCTATAG CCTCAAGGAT AATCCATACG CAGATCATAT CGATAATCAC 720

GAGAATCAAA CTCTCTATAT CATTCACCAG ATCCTCGAAT CGTGGATCTA CGCATCTGGA 780

AATCTTCTGA ATCGAATCGT CTCAAGTATC GAAGAAGAGA AATTCGGAAA AGCTTCAAAC 840

GATGTTTACT TGCTGGAGAA GATCTGGAAA ATTTTAGCGG AGATTGAAGA TCTTCATATG 900

TTGATGGATC CGGAAGATTT TTTGAAATTG AAGAAACAGT TACAGATCAA ATCGACGGGT 960

AAAAACGATG CGTTTTGTTT CAGATCTAAA GGATTAGTGG AGATGATGAA GATGTCGAAA 1020

GATCTGAGAC AGAAAGTACC GGCGGTCTTG GCGGTTGAGG TAGATCCAAC CGGAGGACCA 1080

AGATTACAAG AGGCGGCGAT GAAGCTTTAC GCGAGGAAGA CAGAGTGCGA TAAGATTCAT 1140

TTGCTTCAGG GGATGCAAGC GGTGGAAGCG GCGGCGAAGA GTTTCTTCTT TGGGTATAGG 1200

CAGTTAGTGG CGGCTATGAT GGGAAGTGCG GAGATGAACG CGACGGCGAG TCAAGAGTCG 1260

TGTGACTCAC TGAGTCAGAT ATTTATGGAG CCGACGTATT TCCCGAGCCT TGACGCGGCA 1320

AAGACGTTTC TGGGAGAGTT TTGGAGTCAT TTGGGATGAT TAAATTTTAA TTTCTGCTGG 1380

TATAATTATT TAATATAAAT TTAAATTGGT GGTTTGGTTT AATTTAGTTT GTAAGATAGT 1440

GAAATTTTTG GAACATTTGA CGATCCATAT TTGAATACAA ATTCATTTTT 1490

Claims

Patentansprüche

1. Nukleinsäure, die in Pflanzen, vorzugsweise der Familien der Solanaceaen und/oder Chenopodiaceaen und/oder der Brassicaceaen, besonders bevorzugt der Gattung Beta und/oder Brassica und/oder Solanum, eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert.

2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine translatierte Sequenz umfaßt, die zu der proteinkodierenden Sequenz des Hsl^pr°^~ -Gens aus

B. procumbens zu mindestens 60 % homolog ist.

3. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das HSl^pro~ -Gen die folgende Sequenz umfaßt:

ATGAGAAGGT

GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT

TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA

GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA

TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT

CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA

TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT

TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG

AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG

ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA

AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG

TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT

GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA

ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG

AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA

GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT

TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT

TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGA

Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA, vorzugsweise eine cDNA, ist. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß sie eine genomische DNA ist, die die folgende Sequenz umfaßt:

TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCT TCTTTCTTGG TGCTTAATTT TTTGACACTA ATCCGATTCT TAGCATTAAG TTGAAGCACA CTCTTGATAA ACTATGTTAC TATGTATCAT TGTCAATATG CTAAGAATTT GTCTTGACCT CATCGCTATG TATAAGCATC TAATACTTTC CTAAACTAGT AAAAACAAAT ATTCCATCCG TCCCATAATA TGAGTCCCCT TTCTATTTTA GGAGTCAAAA TTTTAAAATT TTTGACCAAA TATTCTTATT ACTATATATA AAAACATATT CATGTGGGAT CTTGTTAGAT TCGTCTTAAT ATGTATTTTC ATAATATCAA CTTTTTATAT TTTTTTACTA ATACGAAATT GAAGATATAC AATGTCTTAA AGACTATGCA AAAGTAAGCA GAACCTATAT TTTGGGACGG AGGGAGTAAT AAGTAATATT GATTGACGCA TAATTTGTAT ATAAATATTT CAAATTGATA CTACTTTAAA TAATATAGTT AATGCTTATA AATAAGCCTA AAGACTGTGA ATAGCAAGAT CGTTAAAAAT AAAATTTGAA AATATTTGAT ATGGATAATG AAATTGGAAA TGGCATGCTT AGCTTCTCGG GAATCTTATA CCGCTACATC TATAATAAAA ATTCCTCATA AAATTTTGCC CATTTTAACA CACGAAATTC GTCCTTTTAC GCGAGCCCTT TCCACACGTC TTTAAAATTT AAAAACCTCG TCTTTACTCT CCCCACCTAT ATATATACAC GTCCCCCCTT CTCTACTTCC CATCTCACAT ACACATACCC AATCCACAAA CTTCCATCTT ATCCAACTTT CTCTCACCTA TCTCCTTCTT CAATTTTCAA AACTCAAAAG AAAATGGTAG ATTTCGATTG CAAAACAAAA ATGGTACAAT CAACACCAAA CCTCACAAAA AAATCTCCAA AAATCACAAC CAAACGCACA ATATCAACAC CATTAATTTC ACCAGTACCA GTAATTTCCG GCGAATTATC TCCGGCGTCG GAATCATCCT GTTCAGCTTA CGAATCGTAT CTCAAATTAC CGGAGCTCCG TCAACTATGG AGTTCAAAAG AATTCCCCGG TTGGGATAAC GAACCGATAA TCAAACCGGC TTTGCAAGCA TTAGAGATAA CATTCCGGTT CATCTCACTC GTTTTATCCG ACGCTAGACC GTACATAAAC CGGCGAGAAT GGAACCGGAA ATTAGAGTCG TTAGCGAGAG ATCAAGTCCβ AAACTCATCT CAGTTCTCTG CGGAAGACGA TGAGACACGT GGATCAGCTC CGAATCGTTG ATCTGACGTC ATCGTATGGT GAGGTGATGT CACAAACAGA AGTTCAGCGG AGGTATGGAA GCTTGCGAAT GGAGAACATG ATACTACCGT GGTCTGTCGT AGTAGCGAAT TTAGTCTCCT TCCGAGGTTA GCCACGTGGC AGAAGTCGGA GGAGATTGCT TCTAGAATCT TCTACGCGGT TGAATCTGCT ATGAGAAGGT GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGAT

GGTTTCGAAG TTAGTTTTGG ATTGAGTTTG GTTTGATCTG ACTCGGCTβA

GTAATGGGCG GCGATAGGGA GGTTATGGAG AACGTGGGGC GGAAAGTGGG

TGGCCTTGTT AGTGAGACGT GCAAACTTTG GTTACTATTA CATGTGATAT

ACTTATATTT AGTGGGAATA TTGCTTTGGT GTATATAGAT AAATTTTTGA

ATTAATTGTT ACACTTGTAT TAGTAAATTC TGTATCATGA TGATTATAAC

ATGAATTTTT TGTTGTGACT TTAAATGAGA TTTATGCTCC TTAATCCTTA

TTTCACTGAT ATTATTTTTT TGTAGTCTGA GTATAAGTGC GGAGTTTAAT

CAAGCAAGAG AAAATAATAG AAGGTGATTG CATACTTGGA TTGGAGATCA

ATATCTAAAA GATGGTTATG AAACTATTGT GAATAACGGA GTACATGTCC

AACACCACAC ACGTATGACT GTGTACCTCT AATTTACAAA GAGATTTACA

AAATCTAGAT GAGTTTTGAT ATGATCGACA TTGTCTCTAA ATGGGAGATA

AGAATTAAAT CGTGAGGCTC TTTGCGGCTA G7TCTTCCGA ATAAAATAAG

AAACAATGGT TTACTCTAAT TCA?TTTTCC AATTGGCAAA GTGGCACAAG

CTTCAATAA? T7GGCTCTTC ACAATTGAGT ATAAAAGAAT GGGTTAATTA

C?CCGG?CTT TGAATAAAAT TAATCCTATT TAATTGTTTT TGAAATATTC

TTAAAAATA? CGTTGTCTAA TACTTTCTTT AGTTGGGACC CGGTTCTGAA

CC7ACTTAAA TTAATGGGCT CAATGGCCGC CTAATTTCCT CTTGTTATTT

TTAGCCTTTT TTTTCCTTTT TTTCCCTTTA AAATAACTAT TTGTTCTCTT

GAATATCTTA AAATACGTGT CTATC??CTT TAGTTGGACC GTCTGAACTA

TTATTATGCT ATGCACTATT CCTTTGTATT TACCTTTTTC TTTTTCCTTT

AAATACTATT GTTCTCATTT CAATTATATT CTATTTTTGT TAAAAAACGG

TCTTAATTTT TACAACAGTA AAATTATTGA TTTTCCTTCT ATATTAAAAT

TTGAAAGTGA ATGTATTTCG AAATTTAGGT ATATGAATAT TTATATTGTT

CGATTAATGA TGATAAAAGG ATTTTACTCA TTAACCTAAA CCATTTCTAG

ATAAGATAAG AGGAACTTCC ACCTAGTTAA CATGTCTCAC TTTCCTAGTA

GACGAATCTA AATTGCGTTG CTGGATTTAG AACTTTGGTC AAGATAATGG

CAAAACTTTC AAGCACCCGT AGATGCATTT TCC7CGACAT TTCTCATACA

GCACTAAACG TTTCAACTTC CTCTTTTATT TTCTTGAAAT TTTTTGTGGC

AATGAGAAAC GTTCGAAGTT GATCTTTGCG TTTCGACGAT TTGAAATAAG

AAAATGCGTA TTGTCGGCAA CTGATTGTAG TAGTTGC7GT TATTATAATG

ATAGTCTTTT ATATAGAATT CATTTAATTC TAATTCATTT GAATCCAGTT

AAGTTGAGTT TAGTTTAGTC AGCCTAAAAG AACAAAGTAA GTCATGGAAT

GGAATGAAGA TGTAATCAAA TAGAGGAGGG GCTGATAACA ATAATTATTA

CTTATGTTGC GTGTTCAATT CAGTAATGAA AAAAATAAGG TTGAATTAGG

AGGGTAATAC AATTATTACC GGTGATGTGA TAAAACTAAT GTTTAAGGGT

TTAAGTTACT CTAAACCCTC AATTAAACAT AGTCTAACAA AAAATTCTCA

TAATCTAAAT CAAACACGTA CTTATACAAT CCTCTACATG AATCCGTTTC

TAACTCTAAA GGAAGATCGA TACTTATTAG AATCCGTTTC CAACCCTAAA

AATGACTGAT CAAAGGTTCA TGGATTTTGG AAGGGAAAGA CGAATGCGAG

GGCAGTGTAC AGGATAATGT GCATGAGATG GCAAGGGTCA TGCTAGTTAG

AGCAAAATAT A7ATGACTTA ATTCAAAAAC TACCTACTAT TTCAAATTAA

TAGACTTTAT TGGAGTCATG AAGTGTACTG TTTGGTACAC CCCACATTAC

TCATGCACTA CACCTAATTT GTCACAGCAT TCAGCTGCCC TTGTTTTGCA

GTCTTTGGAG CTGGCGTGCC TCTTGTTGCT GGTTAGTCGG CGCTTGGTCT

GTTGTG??GT GACCCTCTGT π rπ.τv ιI"|"|*T"|"|' TTTTAAAATG GTCGCTGATT

ACTAT7CTGT GTATT7CATT TTGTACTCCC TCGTATCCAA TTATATGCTA

CACTTTTTTT GCGGACTCCA AAACGTTTTT TTTTT7TGTC CGAGAGATAG

AGAGGAAAAG CCCATGTTGT TAGGAGAGAG 7TCGGGAGAA GGAAAAGCCA

AATAAAGAAG TAATAACATC TAAATAAGAA AATTCCTTTG ATGGAAAGTG

TAGCGACTAA AAAACGAAGG ACAATATGTA GTTTTCATAT GCCTTTACCT

TTGCAATCTC CTTTTTTATT GTTTACCCAT ACTGGATTAG GTTGGATTTA

TCAACACAAA ATGAGTTGGA CTATATCACT ACATTACTGT GGTCCTGTGG ATACATCAAC AAAAAAAATG AGTTGGACCA TATCAATGTG TTAGCGTGGA

TTATGTACAC ATTGGACTGG AGTTGAAGCA AATATAATCT GAAAAGGGCG

ATGGGTTAGG TCATGAGGTA TTTAGAATAA GACTTTGATC AAGCCCAAAT

CCACCCGCAA AGAATTATAC CCTTTATTTT CAAGGCACCA TCACTGCATA

AAATAATCTG AAATGCCACA AAAGATTAAC GTCCAATATG CTCACAGCCA

AAAATCAATC CATTATTGTT TGGTAAGAAA AGGTAATAGG CTAGATCAAT

TTGCTGCCAA TTGCCAGGCC TGTGGGCCTG TCACCTGTGG GTAATTTAAT

ATG7CTCAAA TGGGTCGGCC TGTTAAGTAC ACCAACATGA ACTTAAAGCT T

6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich ist durch Absuchen einer DNA-Bank mit einer DNA-Sequenz wie in Anspruch 3 und/oder 5 angegeben.

7. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie einer Wildart der Sektion Procumbentes der Gattung Beta entstammt .

8. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden der Gattungen Meloido- qyne. Heterodera und/oder Globodera induziert.

9. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Resistenz gegen Heterodera schachtii induziert.

10. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Art Beta vulgaris induziert.

11. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

12. Vektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er ein YAC-Vektor ist.

13. Verwendung einer Nukleinsäure und/oder eines Vektors gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen.

14. Transgene Pflanze, enthaltend eine Nukleinsäure und/oder einen Vektor gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche.

15. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Gattung Beta oder der Gattung Brassica angehört.

16. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie Beta vulgaris angehört.

17. Zelle, Samen oder Pflanzenteile, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 11 oder 12.

18. Protein, kodiert durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

19. Protein, erhältlich durch Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem geeigneten Wirt, wobei das Protein eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen hervorrufen kann.

20. Testkit, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 11 oder 12 und/oder ein Protein nach Anspruch 18 oder 19.

21. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in eine Pflanzenzelle eingebracht wird und eine Pflanze aus der Pflanzenzelle regeneriert wird.

22. Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in eine nematodensen- sitive Pflanze eingebracht wird.

23. Wurzelspezifischer Promotor, erhältlich durch Absuchen einer Genbank mit der Sequenz, wie in Anspruch 5 angegeben, und Derivate davon mit gleicher Promotoraktivität.

24. Promotor nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression des HSl^pro~ -Gens kontrolliert.

25. Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß er auf dem ca. 1,5 kb Xbal-Fragment der Sequenz 1832.1 gelegen ist, welches sich 5' vom Startkodon in Position 1551 befindet, sowie davon abgeleitete Derivate.

26. Promotor nach einem der Ansprüche 23-25, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Resistenz gegen Heterodera schachtii in Arabidopsis induzieren kann.

27. Verwendung des Promotors gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26 für die Expression von Genen.

28. Verwendung der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder des Promotors nach einem der Ansprüche 23 bis 26 zur Herstellung nematodenresistenter Pflanzen.

29. Primer für die PCR, erhältlich aus der Sequenz Nr. 1832.1.