JP2009112311A - 二本鎖ｒｎａ阻害を用いる遺伝子機能の評価 - Google Patents

Abstract

【課題】生物中にｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを産生できるＤＮＡを導入する方法の提供。
【解決手段】適当な転写因子がプロモーターまたはプロモーター類に結合した場合にＤＮＡ配列の二本鎖ＲＮＡへの転写が開始できるように該ＤＮＡ配列に対して配向した該プロモーターまたはプロモーター類を含む発現ベクターを含む適当な微生物を該生物に与えるか、または該生物に直接、該発現ベクターを与えることを特徴とする方法。使用される生物は、植物、動物、真菌類または酵母のいずれでもよいが、好ましくは線虫類、シー・エレガンスで、その野生型のいずれか、シー・エレガンスのｎｕｃ−１またはｐｈａ−ｔｓ突然変異体、またはこれらの突然変異の組み合わせであってよい。
【選択図】なし

Description

本発明は、二本鎖ＲＮＡ阻害（ｄｓＲＮＡｉ）を用いる遺伝子機能の評価または同定、細胞において特定の表現型を誘導する原因となるＤＮＡの同定方法および公知の遺伝子配列に機能を割り当てる方法に関する。

最近、Nature Vol 391, pp 806-811, Februaray 98に、細胞への二本鎖ＲＮＡの導入が細胞内の内因性遺伝子発現の強力かつ特異的な妨害をもたらし、この妨害が、アンチセンス技術で提案されているような、どちらかのＲＮＡ鎖を個々に提供するよりも、実質的により効率的であることが記載されている。この遺伝子活性の特異的減少は、線虫、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）のゲノムまたは体腔にＲＮＡを導入した場合も起こることが判明した。

Nature Vol 391, pp 806-811, Februaray 98

本発明者らは、この技術を利用し、例えば、ヒトゲノム・プロジェクトのような種々のプロジェクトで配列決定され、これから個々の機能を与えるべき遺伝子またはＤＮＡフラグメントに機能を割り当てる、また個々の表現型付与の原因となるＤＮＡを同定するために用いる新規な発明的方法を案出するために適用した。

したがって、本発明の第１の態様によれば、細胞における個々の表現型付与の原因となるＤＮＡの同定方法であって、ａ）該細胞のＤＮＡのｃＤＮＡまたはゲノム・ライブラリーを、適当なベクター中、プロモーター（類）に対し、該プロモーター（類）に適当な転写因子が結合すると、該ｃＤＮＡまたはＤＮＡの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡへの転写を開始できる配向で構築し、ｂ）該ライブラリーを該転写因子を含む１つ以上の該細胞に導入し、ｃ）該ライブラリーを含む該細胞の個々の表現型を同定・単離し、該表現型の付与の原因となるライブラリーから該ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを同定することを特徴とする方法を提供される。
本発明の好ましい具体例においては、以下の実施例でさらに詳細に記載するように、工程ｂ）の前に、例えば、遺伝子ファミリーを包含するような、該ライブラリーを階層的プールで組織化してもよい。

本発明のさらなる態様によれば、公知のＤＮＡ配列に機能を割り当てる方法であって、ａ）細胞における該ＤＮＡ配列のホモログ（類）を同定し、ｂ）該細胞から適当なＤＮＡホモログ（類）またはそのフラグメントを単離し、ｃ）該ホモログまたはそのフラグメントを、適当なベクター中、プロモーター（類）に対し、該プロモーター（類）に適当な転写因子が結合すると、該ホモログまたはそのフラグメントのｄｓＲＮＡへの転写を開始できる配向にクローニングし、ｄ）該ベクターを、該転写因子を含む工程ａ）からの該細胞に導入し、ｅ）野生型と比較して該細胞の表現型を同定することを特徴とする方法も提供される。

本発明の各態様において、塩基またはＤＮＡ配列は、上記した特性を有する単一のプロモーターに対して、センスおよびアンチセンス配向で提供されても、また、２つの同じプロモーターの間に提供されてもよい。両具体例において、ｄｓＲＮＡは、プロモーターが適当な転写因子と結合した後、プロモーターから開始された転写により提供される。
本発明における細胞は、生物から由来したものでも、生物に含まれるものでもよい。細胞が生物に含まれるものであるばあい、生物は該適当な転写因子を発現するように適応される。生物は、植物、動物、真菌類または酵母のいずれでもよいが、好ましくは線虫類、シー・エレガンスで、その野生型のいずれか、シー・エレガンスのｎｕｃ−１またはｐｈａ−ｔｓ突然変異体シー・エレガンスまたはこれらの突然変異の組み合わせであってよい。別の具体例において、ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーあるいはＤＮＡホモログまたはそのフラグメントは、有利には、細菌または酵母細胞のような微生物中にトランスフェクトまたは形質転換され、生物、好ましくは線虫シー・エレガンスに与えることができる。本発明のこの具体例において、微生物は適当な転写因子を発現するように適応させることができる。好ましくは、微生物は、イー・コリ（E. coli）である。
本発明の各態様において、ＤＮＡライブラリー、ＤＮＡホモログまたはＤＮＡフラグメントは、該転写因子をコードする塩基配列を含む適当なＤＮＡベクター中で構築できる。別法として、該転写因子はさらなるベクターによりコードされる。さらなる別法として、細胞または生物が該転写因子を発現できるか、発現に適応させることができる。好ましくは、本発明において用いるいずれものベクターは、例えば、ｓｕｐ−３５またはそのフラグメントをコードする塩基配列でよい選択マーカーを含む。該塩基配列は、プロモーターに対し、プロモーターに転写因子が結合するとＤＮＡの二本鎖ＲＮＡへの転写を開始するように配向している。図１０に、ベクターおよび、シー・エレガンスにおいて二本鎖ＰＮＡを産生させることの出来るＤＮＡ配列の配向を示す。すなわち、１つの具体例において、ＤＮＡはベクターの２つのプロモーターの間に位置し、プロモーターに適当な転写因子が結合すると、ｄｓＲＮＡを発現できる。別法として、ベクターは、プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で組織化されたＤＮＡ配列の２つのコピーを含み、そのマーカーは、ｐｈａ−１突然変異体シー・エレガンスに含まれると、選択できる。好ましくは、プロモーターはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターのいずれかで、転写因子が適当なポリメラーゼを含む。

好ましくは、選択マーカーは、該細胞中で、遺伝子の発現を阻害または防止できる塩基配列を含み、その遺伝子が公知の表現型付与の原因となるものである。この塩基配列は、該表現型を付与する遺伝子の一部の、または同じ配列でよく、その塩基配列それ自体が、プロモーター（類）に適当な転写因子が結合すると二本鎖ＲＮＡの転写を開始できるように、適当なプロモーター（類）に対して配向している。別法として、該塩基配列が、該表現型を付与する遺伝子の一部のまたは同じ配列でよく、その塩基配列がそのまま、該細胞のゲノムにおける相同的組換えにより、該適当な、またはさらなるベクターの組み込みを可能にし、該組み込み後、該塩基配列が該表現型を付与する遺伝子の発現を阻害できる。この具体例において、該塩基配列は、該ゲノムへの組み込み後、該核酸の翻訳を防止するのに十分な終止コドンを含む。
有利には、上記方法において、例えば、化合物に対する耐性または感受性を野生型と比較するような、所望の表現型のスクリーニングのために化合物を該細胞または生物に加えることができる。プロモーターは、好ましくは誘導的である。転写因子は、幾つかの具体例では、例えば、ファージプロモーターによって作動されるＴ７ ポリメラーゼのようなファージ誘導でよい。しかし、シー・エレガンスを利用する場合、例えば、ｌｅｔ８５８，ＳＥＲＣＡ、ＵＬ６、ｍｙｏ−２またはｍｙｏ−３のような虫特異性または組織特異性プロモーターも使用できる。好ましくは、イー・コリ株はＲＮＡアーゼＩＩＩであり、さらに好ましくは、ＲＮＡアーゼ陰性株である。

本発明のさらなる態様は、外来性転写因子を含み、導入遺伝子が、該転写因子の結合により発現されるＤＮＡフラグメントに操作可能に結合したプロモーターを含むトランスジェニック非ヒト生物の産生方法であって、ａ）外来転写因子をコードするＤＮＡを取り込んだ第１の構築物を含む第１のトランスジェニック生物および、該第１のトランスジェニック生物の転写因子が結合すると発現する所望のＤＮＡ配列に操作可能に結合した少なくとも１つのプロモーターを含む第２の構築物を含む第２のトランスジェニック生物を用意し、ｂ）該第１および第２のトランスジェニック生物を交差させ、該所望のＤＮＡ配列を発現する子孫を選択することを特徴とする方法を提供するものである。１つの具体例において、第１および第２の構築物を各微生物へ形質転換して第１および第２のトランスジェニック生物を産生し、後に各生物に攝食させる。好ましくは、該第２構築物は、該プロモーターに対して、該転写因子の結合により、該ＤＮＡのｄｓＲＮＡへの転写が開始できるような配向で該所望のＤＮＡを含む。この具体例において、該第２の構築物は、該転写因子のプロモーターへの結合により所望のＤＮＡ配列のｄｓＲＮＡへの転写を開始できる、該ＤＮＡ配列とフランキングな２つのプロモーターを含む。別法として、該ＤＮＡ配列は、プロモーターに転写因子が結合するとｄｓＲＮＡを産生するように該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される。これらの具体例の各々において、第１および／または第２構築物は、好ましくは、該転写因子の結合によりレポーターの転写を開始できるプロモーターに操作可能に結合したレポーター遺伝子を与えられてもよい。好ましくは、該レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼまたはβ‐ラクタマーゼのいずれかをコードする。

本発明はまた、当業者によく知られている、タンパク質−タンパク質相互反応を検出するChien et al (1991)によって最初に提案された酵母２ハイブリッドベクター実験で同定されたクローンを確認する方法も包含する。この本発明の方法は、２ハイブリッドベクター実験で同定されたタンパク質をコードするＤＮＡを含む構築物であって、該ＤＮＡが、適当な転写因子のプロモーターへの結合により該ＤＮＡのｄｓＲＮＡへの転写を開始できるプロモーターに対して配向している構築物を用意し、該転写因子を含む、細菌細胞のような細胞を該構築物で形質転換し、または該転写因子を含む生物を該構築物で形質転換し、ついで、野生型と比較して、該細胞または、シー・エレガンス等であってよい生物における表現型の変化を同定することを特徴とする。好ましくは、転写因子は、細胞または生物で誘導的である。再度、上記のごとく、該ＤＮＡ配列は、２つのプロモーターの間または単一のプロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される。好ましくは、該プロモーターはファージポリメラーゼプロモーターであり、該転写因子はＲＮＡポリメラーゼで、好ましくはＴ７ ポリメラーゼである。また、本発明の範囲には該細胞または生物を形質転換するために使用するベクターおよび該細胞または生物自体も包含する。

本発明のさらなる態様には、植物害虫の蔓延を軽減する方法であって、ａ）該害虫から、その生存、生長、増殖に臨界的なＤＮＡ配列を同定し、ｂ）工程ａ）からの配列またはそのフラグメントを適当なベクター中、プロモーターに対して、該プロモーターに適当な転写因子が結合すると、プロモーターが該ＤＮＡ配列のＲＮＡまたはｄｓＲＮＡへの転写を開始できるような配向にクローニングし、該ベクターを植物に導入することを特徴とする方法を提供する。
かくして、有利には、この本発明の方法は、植物害虫蔓延軽減のための特に選択的なメカニズムを提供し、植物害虫が植物を餌とするような、植物の寄生的蔓延のような場合には、その害虫がその植物を摂食すると、害虫は植物中で発現したｄｓＲＮＡを消化し、害虫の生長、生存、増殖または再生に臨界的な害虫内のＤＮＡの発現を阻害する。好ましい具体例のおいて、植物害虫は、チレンクルス・エスピー（Tylenchulus ssp.）、ロドホルス・エスピー（Radopholus ssp.）、ラジナフェレンクス・エスピー（Rhadinaphelenchus ssp.）、ヘテロデラ・エスピー（Heterodera ssp.）、ロチレンクルス・エスピー（Rotylenchulus ssp.）、プラチレンクルス・エスピー（Pratylenchus ssp.）、ベロノライムス・エスピー（Belonolaimus ssp.）、カンジャヌス・エスピー（Canjanus ssp.）、メロイドジン・エスピー（Meloidogyne ssp.）、グロボデラ・エスピー（Globodera ssp.）、ナコブス・エスピー（Nacobbus ssp.）、ジチレンクス・エスピー（Ditylenchus ssp.）、アフェレンコイデス・エスピー（Aphelenchoides ssp.）、ヒルシュメニエラ・エスピー（Hirschmenniella ssp.）、アンギナ・エスピー（Anguina ssp.）、ホプロライムス・エスピー（Hoplolaimus ssp.）、ヘリオチレンクス・エスピー（Heliotylenchus ssp.）、クリコネメラ・エスピー（Criconemella ssp.）、キシフィネマ・エスピー（Xiphinema ssp.）、ロンギドルス・エスピー（Longidorus ssp.）、トリコドルス・エスピー（Trichodorus ssp.）、パラトリコドルス、エスピー（Paratrichodorus ssp.）、アフェレンチス・エスピー（Aphelenchs ssp.）のいずれかとすることができる。本発明のこの態様のＤＮＡ配列またはそのフラグメントは、２つの根特異性プロモーターのような２つの組織特異性プロモーター間にクローンできる。

本発明のさらなる態様は、適当な転写因子がプロモーターに結合した場合に２つのプロモーターの間に位置するＤＮＡ配列の二本鎖ＲＮＡへの転写が開始できるように配向した２つの同じプロモーターを含む本発明の各方法においてライブラリーを構築するために使用するベクターに関する。例えば、ＤＮＡ配列は多クローニング部位を含むことができる。好ましくは、発現ベクターは選択マーカーをコードする塩基配列を含む。１つの具体例において、選択マーカーをコードする塩基配列は２つの同じプロモーターの間に位置させ、プロモーターへの転写因子の結合によりその間に位置する塩基配列のｄｓＲＮＡへの転写が開始されるようにする。好ましくは、選択マーカーは、ｐｈａ−１突然変異を有するシー・エレガンスへの導入用にｓｕｐ−３５をコードする塩基配列を含む。
好ましくは、転写因子は、対応するプロモーターまたはシー・エレガンス特異性プロモーターと結合するファージポリメラ−ゼ、より好ましくはＴ７ ポリメラ−ゼを含む。好ましくは、該同じプロモーターの間に多クローニング部位を含む。

本発明のさらなる態様において、本発明の方法において使用するための適当な転写因子発現用の発現ベクターを提供する。該ベクターは、適当な発現制御配列と操作可能に結合した該転写因子をコードする塩基配列を含む。好ましくは、該発現制御配列は、誘導的、構造的、一般的または組織特異的プロモーターまたはそれらの組み合わせを含む。好ましくは、転写因子はファージポリメラ−ゼを含み、好ましくは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６、ＲＮＡポリメラ−ゼである。
本発明のさらなる態様は、本発明のベクターによる細胞または生物の形質転換を同定するための選択システムを提供する。該システムは、本発明のベクターを含み、その選択マーカーが、該細胞または生物の、公知の表現型を付与する原因となる遺伝子の発現を阻害または防止することのできる塩基配列を含む。好ましくは、該塩基配列は、該公知の表現型を付与する遺伝子の一部または同じ配列に相当し、その塩基配列がそれ自体、プロモーターに適当な転写因子が結合すると、二本鎖ＲＮＡの転写を開始できる２つの同じプロモーターの間に位置する。別法として、該塩基配列は、該細胞または生物の公知の表現型を付与する遺伝子配列の一部または同じ配列を含み、該細胞または生物の染色体における相同的組換えにより該ベクターの組み込みを可能とし、組み込み後、該公知の表現型を付与する遺伝子配列の発現を阻害するものである。好ましくは、本発明のこの態様においては、該塩基配列が、ゲノムに組み込み後に該塩基配列の翻訳を防止するに十分な終止コドンを含む。好ましくは、該公知の遺伝子配列は、該ベクターをｐｈａ−１ ｅｔ１２３ｔｓ突然変異体シー・エレガンス虫に組み込み後、２５℃より高い温度における子孫の増殖の同定により選択できるｓｕｐ−３５遺伝子またはそのフラグメントを含む。

本発明のさらなる態様は、該ベクターをｐｈａ−１ ｅｔ１２３ｔｓ突然変異体シー・エレガンス虫に組み込み後、２５℃より高い温度における子孫の増殖の同定により選択できるｓｕｐ−３５遺伝子またはそのフラグメントを含む該公知の遺伝子配列を提供する。本発明のもう１つさらなる態様は、多細胞生物のＤＮＡ配列に機能を割り当てる方法であって、ａ）プロモーターから転写開始することのできる多細胞生物に、ｉ）該多細胞生物において転写をプロモートできる２つのプロモーターの間にクローンされた該ＤＮＡフラグメントを含む構築物を与え、ｂ）野生型と比較して、該多細胞生物の表現型を同定することを特徴とする方法を提供する。

本発明のプラスミドＰＧＮ１の塩基配列を示す。 本発明のプラスミドＰＧＮ１の塩基配列を示す。 本発明のプラスミドＰＧＮ１００の塩基配列を示す。 本発明のプラスミドＰＧＮ１００の塩基配列を示す。 本発明のプラスミドＰＧＮ１００の塩基配列を示す。 本発明の方法で使用するベクターおよび形質転換型を示す図である。 本発明で使用する発現ベクターを示す。 シー・エレガンスの形質転換に用いるＴ７ ポリメラ−ゼベクターを示す図である。 シー・エレガンスの形質転換に用いるＴ７ ポリメラ−ゼベクターを示す図である。 プラスミドＰＧＮ１を示す。 ｓｕｐ−３５ ｄｓＲＮＡをコードするｄｓＲＮＡ阻害用の促進ベクターを示す図である。 シー・エレガンスのゲノムに組み込むベクターを示す。 ＤＮＡ配列からｄｓＲＮＡの転写を開始するための適当なプロモーターに対するＤＮＡ配列の位置を示す。 プラスミドｐＧＮ１０８を示す。 プラスミドｐＧＮ１０５を示す。 プラスミドｐＧＮ４００を示す。 プラスミドｐＧＮ４０１を示す。 プラスミドｐＧＮ１１０を示す。 前向きおよび逆向きＴ７／Ｔ３／ＳＰ６プロモーターを有するプラスミドｐＡＳ２を示す。 前向きおよび逆向きＴ７／Ｔ３／ＳＰ６プロモーターを有するプラスミドｐＧＡＤ４２４を示す。 プラスミドｐＡＳ２−ｃｙｈ２−ＨＡ＋bothＴ７−ファイナルを示す。 プラスミドｐＧＡＤ４２４−without−ＦＵＬＬ−ＩＣＥ−ＢＯＴＨ−Ｔ７を示す。 （ａ）はプラスミドｐＧＮ２０５および（ｂ）はプラスミドｐＧＮ２０７を示す。

本発明は、添付の図面を参照して、純粋に例示として挙げた以下の実施例によりさらに明確に理解できる。
実施例Ａ：定序および階層的（ordered and hierarchical）プールされたｃＤＮＡライブラリーの構築およびその適用
ランダム定序およびプールされたライブラリー
ベクターは、２つのＴ７プロモーターを内蔵するイー・コリ・ベクターで、その間に多クローニング部位（ＭＣＳ）を有する。２つのプロモーターは、相互の方向に、かつＭＣＳの方向に配向している。Ｔ７ＲＮＡポリメラ−ゼの存在下、イー・コリ、シー・エレガンスまたは他の生物において発現され、該２つのＴ７プロモーターから始まり、ＲＮＡが産生される。これらが対向したセンスで配向しているので、Ｔ７ＲＮＡポリメラ−ゼの結合により、ＲＮＡの両方の鎖が、２つのプロモーターの間に挿入（クローン）されたＭＣＳから産生され、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成をもたらす。
シー・エレガンスｃＤＮＡライブラリーは、標準的な分子生物学技術を使用してＭＣＳから構築できる。このライブラリーをイー・コリに形質転換し、得られたイー・コリを培養して増殖させ、９６マルチウエル・プレートで保存する。この段階で、プラスミドＤＮＡを単離し、これらのイー・コリのコロニーに対応させて９６マルチウエル・プレートに保存することができる。約１００,０００コロニーを記録する。このようにして、ライブラリーは約５倍のシー・エレガンスの全発現されたｃＤＮＡバリエーションを内蔵し、これは低発現配列がライブラリーに存在する機会を与える。これは約１０４１個の９６ウエルプレートをもたらす。このプレートを必要により階層的にプールする。現在、コロニーのプールは１０〜１００の階級に整理されている。階層的プールが８または１２当たりの場合（９６ウエルプレートが８〜１２のグリッドを有しているので、これらの数値がより都合よい）、約８７のマルチウエルプレート、約８３５２のウエルとなる。階層的プールが９６ウエル当りの場合、すなわち１枚のプレート当たりの場合、約１１プレート、約１０４１ウエルとなる。階層的プールのいずれの段階においても、プラスミドＤＮＡを単離でき、少ないプレートを用いるので、労力も少なく、複雑性もなくなるが、１２当たりのプールの場合は該当しない。ＤＮＡのプールはオリジナルのＤＮＡを使用しても行うことができる。
以下の実験は、ＤＮＡおよびイー・コリ・ライブラリーの両方について、如何に階層的プールを行うべきかを記載する。

ＲＮＡｉ技術用の、シー・エレガンス・ゲノムの各遺伝子を内蔵する定序ライブラリー、その応用
ゲノム配列決定プロジェクトが終わりに近づき、この情報がＴ７ＲＮＡ阻害技術への応用に使用できる。シー・エレガンス・ゲノムの各遺伝子はＰＣＲ技術を用いてクローンできる。好ましくは、エクソンを最小長さ５００ｂｐでクローンする。エクソンが小さすぎる場合、ＰＣＲでより小さいフラグメントを単離するか、イントロンおよび隣接するエクソンの一部をＰＣＲ技術で単離し、遺伝子の翻訳領域の少なくとも一部をクローンする。このために、少なくとも１７０００ＰＣＲ反応を行うことが必要である。このＰＣＲ産物のコレクションを、記載したようにＴ７ベクターにクローンする（相互に対向して配向し、多クローニング部位をその間に有する２つのＴ７プロモーター）。各ＰＣＲ産物は独立してクローンするか、記載したｃＤＮＡライブラリーと同様に、ランダムライブラリーの形成に使用できる。各ＰＣＲ産物を独立してクローンする場合、得られた細菌およびプラスミドＤＮＡは種々の方法でプールできる。まず、Ｔ７ＲＮＡｉベクター中で独立してクローンしたＰＣＲ産物のコレクションはランダムライブラリーで記載したと同様にランダムにプールできる。このプールはまた、より合理的な方法で行うこともできる。例えば、シー・エレガンス・ゲノムの遺伝子はバイオインフォマティックな道具（in silico biology）を用いて分析できる。ゲノムの種々の遺伝子は遺伝子ファミリーに属し、またはゲノム中にホモログを有する。これらの遺伝子ファミリーのメンバーをプールするか、ホモログであるメンバーをプールする。このようにして約１７０００クローンの全メンバーを、より便利に使える量に減少させる。このライブラリーは、本発明の方法において表現型のスクリーニングに使用することができる。得られた表現型は、シー・エレガンスゲノムの遺伝子、遺伝子ファミリーまた遺伝子ホモログに機能的な記述を与える。ライブラリーは、ゲノムの各遺伝子の一部からなるので、この方法は完全ゲノムの機能−表現型用語での記載を可能とする。このために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を該虫に導入する必要がある。クローン単独または、ランダムにもしくは合理的にプールしたクローンの導入は記載するように幾つかの方法で行うことができる。

二本鎖ＲＮＡｉの発現用ベクターの例
Ｔ７プロモーターを含むいずれかのベクターを使用でき、これは多クローニング部位を含んでいる（これらは商業的に入手可能である）。共に適宜の末端を有する、Ｔ７プロモーターを含むプライマーと、逆相補鎖を有するプライマーを設計する。これのプライマーはハイブリダイズでき、よく設計されている場合は、選択したベクター中にクローンできる。Ｔ７プロモーターの最小配列は、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡである。Ｔ７発現ベクターの構築にはいずれのベクターも使用できるが、以下は、ｐＧＥＭ−３ｚｆ（−）ベクターを用いて如何にこれを行うかを示す例である。
ベクターｐＧＥＭ−３ｚｆ（＋）(PROMEGA)をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１で消化した。
プライマーｏＧＮ１およびｏＧＮ２を、最終濃度１μｇ／３０μｌで混合し、沸騰させ、ゆっくりと室温まで冷却した。
プライマーを、標準的連結方法でベクターに連結した。得られたベクターはｐＧＮ１であり（図１に示す）、相互に対向して配向する２つのＴ７プロモーターを含み、その間に多クローニング部位を内蔵している。ｏＧＮ１およびｏＧＮ２の配列は、
oGN1: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
oGN2: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC
である。

ライブラリー構築の例
ＲＮＡはＲＮＡｉに感受性の各生物から単離できる。一般に、単離したＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡにコピーし、ついで、適当なクローニングベクター中に調製する。幾つかの方法が存在し、PROMEGA、CLONTECH、BOEHRINGE MENNHEIM、BRL等を含む種々の会社から分子生物学キットを購入でき、以下のことが行える。
ＲＮＡの単離、
最終的にポリＡ ＲＮＡが単離できる（幾つかの技術およびキットが入手できる）、
ＡＭＶ逆転写、ランダム・ヘキサメリック・プライマーおよび／またはオリゴ（ｄＴ）プライマーによる第１鎖の合成、
ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラ−ゼＩによる第２鎖の合成、
Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼによる平滑末端、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるアダプターの付加、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼよる最終的処理、
ｃＤＮＡのベクターへのクローニング。
得られた連結混合物はｃＤＮＡライブラリーと考えることができる。この連結は、目的とするベクターに連結した全てのｃＤＮＡを含んでいる。ライブラリーを整理するために、連結をイー・コリ株に形質転換する必要がある。

イー・コリまたはＤＮＡライブラリーの適応
Ｔ７ＲＮＡ産生株：
標準的な株はＢＬ２１（ＤＥ３）：Ｆ−ｏｍｏＴ［ｌｏｎ］ｈｓｄｓ（ｒ−ｍ−；およびE. coli B株）λ（ＤＥ３）である。最終的に、ＢＬ２１（ＤＥ３）の変異体が使用できるが、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを使用する。
他のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラ−ゼ産生イー・コリも、入手できれば、構築する必要がある。これは、商業的に入手できるファージを用いて容易に形成でき、この場合は、λＣＥ６ベクター（PROMEGAより提供される）を用いる。ほとんど全てのイー・コリ株が、このファージでトランスフェクトでき、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラ−ゼを産生する。
ＲＮＡｓｅＩＩＩ突然変異体イー・コリ：
種々の株が原理的に入手でき、我々は、第１の実験に使用するため、ＡＢ３０１−１０５株：ｒｎａ−１９、ｓｕｃ−１１、ｂｉｏ−３、ｇｄｈＡ２、ｈｉｓ９５、ｒｎｃ−１０５、ｒｅｌＡ１、ｓｐｏＴ１、ｍｅｔＢ１（Kinder et al. 1973, Mol. Gen. Genet, 126:53）を選択した。しかし、他の株もより適当でありうる。この株をλＣＥ６で感染し、Ｔ７産生変異体を構築する。
野生型シー・エレガンス虫は細菌プールで生長できる。細菌はＴ７ＲＮＡポリメラ−ゼを発現している。これにより、シー・エレガンスの内臓に大量のｄｓＲＮＡをもたらし、該生物中に拡散し、発現の阻害をする。このライブラリーを幾つかの表現型のスクリーニングに用いることができる。この技術は、ある経路における適切な遺伝子を、公知のシー・エレガンス技術より、より迅速に検出できる利点を有する。さらに、興味ある表現型を見出したら、原因する遺伝子を容易にクローンすることができる。
階層的プールを使用することにより、プールの適切なクローンを第２のスクリーニングにおいて容易に見出すことができる。このクローンに挿入したＤＮＡを、ついで、配列決定できる。この実験は、１工程で遺伝的および生化学的データをもたらす。
野生型シー・エレガンスは、表現型、薬物耐性および薬物感受性をスクリーニングするために化合物と組み合わせることができる。シー・エレガンス株は、突然変異株でよく、増強された表現型、減少した表現型または新しい表現型についてスクリーニングされる。シー・エレガンス株は突然変異株でよく、ライブラリースクリーニングを化合物と組み合わせることができる。したがって、薬剤耐性、薬剤安定性、増強された表現型、減少した表現型または新しい表現型についてスクリーニングできる。イー・コリ株はＢＬ２１（ＤＥ３）のようなＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現株のいずれでもよいが、例えば、ＲＮＡｓｅＩＩＩ陰性のうような特別なイー・コリ株を使用することにより、二本鎖ＲＮＡの形成が促進されうる。ＲＮＡｓｅＩＩＩはｄｓＲＮＡの特異的なループを認識する。結局、ＲＮＡｓｅＩＩＩ以外のＲＮＡｓｅを欠失したイー・コリまたは１つ以上のＲＮＡｓｅを欠失したイー・コリを使用できる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ産生イー・コリ株に利用できる大部分の公知のイー・コリ株および構築物は、一般に、誘導的プロモーターを含む。このようにして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの産生、すなわち、ｄｓＲＮＡの産生が調節される。有利には、この特徴は生長の特定の段階でシー・エレガンス虫に「パルス」摂取させるために使用できる。これらの虫は非誘導イー・コリ株で生長する。虫が目的の段階に達したら、該細菌におけるＴ７ＲＮＡ産生が誘導される。これにより該動物のライフサイクルのいずれか点におけるいずれの遺伝子の機能も研究できる。

推定的目的ヒト遺伝子のホモログについてのライブラリーのスクリーニングおよびこれらの遺伝子の機能割り当て
ゲノムプロジェクト、差次的（differential）発現アレー、ハイブリダイゼーション研究等の種々のプロジェクトで数百の遺伝子が単離されている。記載されたｃＤＮＡライブラリーは迅速かつ効率的な方法でこれらの遺伝子の機能確認および／または割り当てする方法を提供できる。まず、全ての虫ホモログ、ホモログ類または遺伝子をバイオインフォマティックな道具（in silico biology）で同定する必要がある。ＰＣＲプライマーを開発し、ＰＣＲ技術を用いてｃＤＮＡフラグメントを単離する。ＰＣＲは階層的プールについて行なうことができる。適当なｃＤＮＡを有する陽性プールまたは細菌を内蔵する個々のウエルをシー・エレガンスに与え、表現型を記録する。
ＰＣＲはシー・エレガンスから単離したｃＤＮＡで行なうことができる。得られたＤＮＡは、Ｔ７ベクター中にクローンでき、該シー・エレガンス虫が与えられるｄｓＲＮＡ産生イー・コリに形質転換できる。どちらの方法がより迅速で、信頼性があるかにより、選択する必要がある。
遺伝子が遺伝子ファミリーに属している場合、虫に細菌の混合物を与える必要がありうる。これらの各々が遺伝子ファミリーのメンバーの一部を内蔵している。イー・コリ株、生長条件、化合物との組み合わせを、上記したごとく行なうことができる。
全てのシー・エレガンスの遺伝子が組織化され、構造的にクローンされている合理的なライブラリーを使用する場合、シー・エレガンス・ホモログ、そして結局、他のホモログ、オルトログ（orthologue）および遺伝子ファミリーのメンバーは、silico biologyを使用して容易にライブラリー中にさかのぼることができる。この工程にはＰＣＲは関与せず、虫が生長する細菌および／またはＤＮＡを単離する。

実施例
一連の実験の考え方は、構築したＲＮＡｉベクターおよびイー・コリ株をテストすることであった。
１）テストプラスミドの構築
ノックアウトまたはＲＮＡｉ実験に使用した場合に虫において明確な表現型を与えるｃＤＮＡのいずれかを使用できる。ｕｎｃ−２２がよい候補であることが知られているが、他の遺伝子も可能である。我々は、後の段階で使用できる感受性系を選択した。この系をｐｈａ−１バックグラウンド中、ｓｕｐ−３５でテストした。ｓｕｐ−３５のエクソン５をＰＣＲで単離し、Ｔ７プロモーターベクターｐＧＮ１にクローンした。調節ベクターをｐＧＮ２と称した。ｐｈａ−１（ｅ２１２３）突然変異体虫は２５℃より高い温度で子孫を産出できない。これは胚形成における発生の問題のためである。ｓｕｐ−３５がノックアウトまたはこの株で阻害されている場合、この温度で子孫は発育し得る。ｐｈａ−１突然変異虫およびｓｕｐ−３５ＲＮＡｉの組み合わせは種々の選択を確認するためのよい系である。

２）ｄｓＲＮＡを産生するイー・コリ株を用いるＲＮＡｉのテスト
ｐＧＮ２をイー・コリ株ＢＬ２１２（ＤＥ３）に導入し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをＩＰＴＧで誘導した。シー・エレガンス虫（ｐｈａ−１（ｅ２１２３））をこの細菌に接種し、２５℃の制限された温度で生長させた。この突然変異体は胎児突然変異体であり、この温度で何ら子孫は見られない。イー・コリ中のｄｓＲＮＡがｓｕｐ−３５遺伝子を効率的に阻害する場合、子孫が見られる。
ｐＧＮ２をイー・コリ株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）に導入し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをＩＰＴＧで誘導した。シー・エレガンス虫（ｐｈａ−１（ｅ２１２３））をこの細菌に接種し、２５℃の制限された温度で生長させた。この突然変異体は胎児突然変異体であり、この温度で何ら子孫は見られない。イー・コリ中のｄｓＲＮＡがｓｕｐ−３５遺伝子を効率的に阻害する場合、子孫が見られる。

３）よりよいｄｓＲＮＡ摂取のための虫株の改良
ｐｈａ−１シー・エレガンスを二本鎖ｓｕｐ−３５ＲＮＡを産生するイー・コリ株上で培養する前に、虫をＥＭＳ（メタンスルホン酸メチル）で突然変異誘発した。この突然変異誘発虫の子孫を細菌の上で培養した。虫をこの細菌で飼育し、より大量の子孫を得た。子孫は、ｄｓＤＮＡ摂取の向上をもたらす突然変異を有し、さらなる実験に使用できる。

ｄｓＲＮＡ産生ベクターのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ産生虫のゲノムへの安定な組み込み
以下の特徴を内蔵するイー・コリベクターを構築できる：相互に対抗する２つのＴ７プロモーターと、その間にクローンされた制限部位または多クローニング部位。さらに、このベクターは、シー・エレガンスｓｕｐ３５ゲノムＤＮＡを含むことができ、図８に示すごとく、種々の間隔で幾つかの終止コドンを含み、該ｓｕｐ３５ゲノムＤＮＡフラグメントから完全長のタンパク質が発現できないように操作することができる。いずれのｃＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントも２つのＴ７プロモーター間の多クローニング部位にクローンすることができる。このベクターを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するシー・エレガンス株に導入すると、２つのＴ７プロモーターの間にクローンされたｃＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントが転写され、クローンされたフラグメントからｄｓＲＮＡが生成する。
このベクターは、ｐｈａ−１（ｅ２１２３）突然変異体虫においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現に使用するために設計されている。Ｔ７ＲＮポリメラーゼの発現は構造的または調節され、全体的または組織特異的である。これらのｐｈａ−１（ｅ２１２３）虫は２５℃より高い温度で子孫を作れず、これは胚形成の発生の問題によるものである。この株において、ｓｕｐ−３５が阻害またはノックアウトされると、この温度で子孫が生長できる。
このベクターを虫に導入すると、相同的組換えによりベクターを組み込むことができる（キャンベル様組み込み）。低い頻度ではあるが、相同的組換えがシー・エレガンスで起こることが示されている（PlasterkおよびGroenen, EMBO J., 11:287-290, 1992）。ｓｕｐ３５遺伝子における相同的組換えは、２つの生じたｓｕｐ−３５遺伝子が終止コドンを内蔵しているので遺伝子のノックアウトをもたらす。得られた虫およびその子孫は、この組換えが卵で起これば、ゲノムに組み込まれたベクターのコピーを有する。これは、ｓｕｐ−３５がノックアウトされた虫だけが２５℃より高い温度で子孫を持てることから選択できる。さらにまた、得られた虫は、２つのプロモーターの間にクローンされたＤＮＡフラグメントから二本鎖ＲＮＡを安定に産生することができる。この虫は、遺伝子の機能の減少した、２つのＴ７プロモーターの間にフラグメントがクローンされた安定なトランスジェニク虫系統と考えることができる。
ＤＮＡは、注射、衝撃（ballistic）形質転換、ＤＮＡ溶液への浸漬、細菌での飼育を含む幾つかの技術によって虫にデリバリー（delivery）できる。形質転換効率を増大させる新しい他の方法を考えることができる。
標的シー・エレガンス株は、さらにｐｈａ−１（ｅ２１２３）突然変異以外の他の突然変異を有していてもよく、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ以外の遺伝子を発現してもよい。

実施例Ｂ：酵母２−ハイブリッド−ＲＮＡｉベクター
２つのＴ７プロモーターを内蔵する酵母２ハイブリッドベクターを構築できる。このベクターは酵母およびイー・コリの両方で複製するように設計できる。一般に、酵母２ハイブリッド系様のｃＤＮＡライブラリーは、Ｇａｌ４またはＬｅｘＡベクターで作成される。該ライブラリーは、これらの遺伝子の１つの活性化ドメインを有するベクター中で構築される。ベクターは依然として酵母ハイブリッド・スクリーニングで使用できるが、相互に対向した２つのＴ７プロモーターを含み、その間にクローニング部位を含む。プラスミド中の配列の順序は、「プラスミド主鎖、（ＧＡＬ４−Ｔ７）、ＭＣＳ、主鎖」である。このベクター中で構築されたシー・エレガンスｃＤＮＡライブラリーは、与えられたタンパク質と相互反応するタンパク質を単離する実験において標準的な酵母２ハイブリッドライブラリーとして使用できる。一端クローンを単離したら、プラスミドをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するイー・コリ株に導入でき、かくして、クローンしたフラグメントのｄｓＲＮＡを産生できる。このｄｓＲＮＡを産生する細菌を虫に与えることができ、表現型を記録できる。前の実施例と同様に、新たに単離した酵母２ハイブリッドクローンについてのこの確認操作は、ＰＣＲおよび／またはクローニング工程、ＲＮＡ実験および／またはノックアウト実験を要求する標準的な操作と比べて著しく短い。大抵の場合、単離したクローンをまず配列決定し、その配列に基づいて、さらに実験を続けるか否か決定する。本発明において、各単離されたクローンは、容易に適当なイー・コリに導入し、虫に与えることができる。ついで、表現型を分析して確認を行なう。
この操作を適用するため、公知の遺伝子を餌とし、新たに構築したライブラリーを標的として、酵母２ハイブリッドを行なう。餌のタンパク質と相互作用する標的中のクローンによってコードされるタンパク質は、Ｘ−ｇａｌでのＬａｃＺ染色で見られるようなレポーター分子を発現する陽性酵母クローンをもたらす。標的タンパク質をコードするプラスミドを酵母株から直接単離し、イー・コリに導入する。このイー・コリはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ産生イー・コリである。この場合、二本鎖ＲＮＡは、ベクターの多クローニング部位にクローンされたＤＮＡから産生される。このｄｓＲＮＡを上記した方法で虫に与えると、遺伝子は虫の中で阻害され、個々の表現型をもたらす。
この酵母２ハイブリッドベクターは、有利には、前記した実施例におけるように、定序および階層的にプールしたライブラリー構築のために使用できる。
酵母株も条件付きでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産生できる。酵母２ハイブリッド実験の後、Ｔ７ポリメラーゼの発現を誘導でき、酵母細胞中でｄｓＲＮＡの産生をもたらすことができる。その結果、酵母を虫に与えることができる。シー・エレガンス虫が酵母で飼育できることを示す証拠が入手できる。

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ産生株の構築およびその適応
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するシー・エレガンス株を構築できる。発現は全体的、構造的であるが、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーターあるいは一時的プロモーターまたはこれらの特徴または特徴の組み合わせを内蔵するプロモーターによって調節することもできる。ＤＮＡをこのシー・エレガンスに導入できる。これは注射、粒子の発射、エレクトロポーレーションまたは前記のような飼育によって行なうことができる。ＤＮＡが前記の実施例で記載したようなプラスミド、すなわち、クローンしたｃＤＮＡフラグメントまたはＰＣＲフラグメントを２つのフランキングＴ７プロモーターの間に内蔵するプラスミドである場合、このｃＤＮＡまたはＰＣＲフラグメントのｄｓＲＮＡを細胞または生物全体に形成させ、対応する遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす。導入したＤＮＡは、効率的な一時的ダウンレギュレーションを有することができる。導入したＤＮＡは染色体外アレイを形成でき、このアレイは、より接触的ノックアウトまたは機能表現型の減少をもたらし得る。プラスミドも、同じような接触ノックアウトまたは機能表現型の減少をもたらしうるが、安定に遺伝できる。

実施例ＡおよびＢで記載した２つのＴ７プロモーターの間にクローンされたシー・エレガンスのｃＤＮＡまたはｃＤＮＡの一部あるいはＥＳＴまたはＰＣＲフラグメントを内蔵するプラスミドＤＮＡを、標準的な技術でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ虫に導入する。表現型は標準的技術（注射、発射）で分析できる‐実施例Ａにおける定序およびプールしたライブラリーからのＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼ虫に導入できる。表現型を分析できる。階層的プールを用いて、元のクローンを容易に見出すことができる。
同じ操作を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する突然変異体虫を用いて行なうことができる。増強された、減少された、または新しい表現型をスクリーニングする。
この操作を用いて、化合物をスクリーニングできる。スクリーニングは野生型、突然変異体株を用いて増強された、または新しい表現型について行なうことができる。
新しい方法でＤＮＡを虫に導入できる。その１つは、イー・コリによるＤＮＡのデリバリーである。この場合、階層的にプールされたライブラリーを動物に与える。線虫の内臓におけるイー・コリＤＮＡの消化を防止するため、好ましくは、ｎｕｃ−１（ｅ１３９２）のようなＤＮＡｓｅ欠損シー・エレガンスを使用する。この操作は、他の技術の形質転換効率と独立しており、一般に、より迅速で手間がかからないので、最も好ましいものの１つである。

２）当該方法の推定されている増強
ベクターを、２つのＴ７プロモーターの間にクローンされたｓｕｐ−３５ｃＤＮＡまたはこのｃＤＮＡの一部を内臓するように設計する。ベクターの残部は、実施例ＡおよびＢに記載のとおりである。このベクターは、ｐｈａ−１ｔｓ突然変異体シー・エレガンスに導入することができる。この場合、温度選択システムが存在し、ＤＮＡを摂取し、二本鎖ｓｕｐ−３５ＲＮＡを発現した虫のみが制限された温度で生存できる。階層的にプールされたライブラリーが上記したいずれかの方法でデリバリーできる。
ベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現イー・コリに導入するライブラリーの構築に使用できる。この場合、我々は、ｓｕｐ−３５のｄｓＲＮＡが活性な虫のスクリーニングに加えて、Ａ）のような類似のスクリーニングを有している。
ｓｕｐ−３５のＤＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡを異なるプラスミドにデリバリーできる。ＤＮＡ飼育（実施例Ｃ）または実施例ＡおよびＢのｄｓＲＮＡ飼育の両方の飼育について、これは、２つのプラスミドが１つの細菌に存在できるか、虫が細菌の混合物で、そのうちの１つがｓｕｐ−３５構築物を内蔵している混合物で飼育できることを意味する。

Ｔ７ＲＮＡ産生シー・エレガンスの構築例
虫の中でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産生させるため、幾つかの可能性がある。Ｔ７ポリメラーゼは、誘導的プロモーター、構造的プロモーター、一般的（general）プロモーターまたは組織（細胞）特異性プロモーターｍまたはこれらの組み合わせの種々のプロモーターの下で発現できる。これらのプロモーターの例は、ヒートストック・プロモーターｈｓｐ−１６、内臓（ｇｕｔ）プロモーターｇｅｓ１、ｃｅｔ８５８からのプロモーターであり、ｄｐｙ７のプロモーターおよびプロモーター・エレメントＧＡＴＡ１も例示できる。この例では、ｐＰＤ４９．７８ベクター中で利用できるｈｓｐ−１６プロモーターの制御下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを、プライマーＧＮ３およびＧＮ４を用いてＰＣＲ産物として単離する。
我々のクローンしたいベクターがＦｉｒｅベクターｐＰＤ４９．７８であるので、得られたＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＮｃｏＩを用いて設計する。得られたベクターは図２に示すｐＧＮ１００である。ｏＧＮ３：CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC、ｏＧＮ４：ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG ｐＧＮ１００が包含される。
このベクターを、例えば、マイクロインジェクションのような標準的な技術を用いて虫に導入する。
以下の株を構築した。
野生型（ｐＧＮ１００）
ｎｕｃ−１（ｐＧＮ１００）
ｐｈａ−１（ｐＧＮ１００）
ｐｈａ−１；ｎｕｃ−１（ｐＧＮ１００）
これらの株の全てが、温度での誘導または重カドミウムまたは水銀の適用のような金属によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産生できる。温度誘導操作は、動物を３０〜３３℃に少なくとも１時間移すことであり、ついで常温（１５〜２５℃）に戻すことができる。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ産生野生型株は、虫におけるいずれのＲＮＡ産生にも使用できる。さらに詳しくは、記載したライブラリーからのプラスミドをこれらの虫に導入し、表現型を記録できる。
ｎｕｃ−１突然変異体虫は、虫を飼育する細菌を介してＤＮＡを導入するために使用できる。ｎｕｃ−１虫はＤＮＡを消化しないので、プラスミドＤＮＡは内臓壁を横切ることができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを産生する細胞に取り込まれると、ｄｓＲＮＡが産生され、遺伝子のＲＮＡ転写を阻害する。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを産生するｐｈａ−１突然変異体虫株は上記した操作を促進するために使用できる。ＤＮＡは、発射（shooting）、マイクロインジェクションまたは飼育により導入できる。さらに詳しくは、この株は、ｓｕｐ−３５および目的とする遺伝子からｄｓＲＮＡを産生するベクターとして使用でき、後者はＰＣＲ産物、ｃＤＮＡまたは上記したライブラリーとすることができる。

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを産生するｐｈａ−１；ｎｕｃ−１突然変異体は、ＤＮＡの細菌デリバリーに使用できる。ＤＮＡは、好ましくは、ｓｕｐ−３５および目的とする遺伝子両方からｄｓＲＮＡを産生できるプラスミドである。この虫株は、好ましくは、内臓においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産生する。好ましくは、デリバリーは、プラスミドを内蔵する細菌で虫を飼育することにより起こる。

ＲＮＡｉ技術の植物における適応
線虫類は、植物、特に農業で使用する植物に打撃を与える損傷の大きな部分の原因である。本発明のＲＮＡｉ操作は、これらの寄生線虫類のより長い攝食から植物を守るために使用できる。第１の工程において、線虫が生存または生長するために、あるいは攝食または増殖するために臨界的なＤＮＡフラグメントを寄生性植物線虫から単離する。発現が必須であるいずれもの遺伝子がこの目的に適している。
これらの遺伝子の一部、エクソンまたはｃＤＮＡをクローンする。このＤＮＡフラグメントは、組織特異的プロモーター、好ましくは、根特異的プロモーターの影響下、さらに好ましくは２つの根特異的プロモーターの間にクローンすることができる。根特異的プロモーターの制御下のクローン遺伝子のＤＮＡは、植物トランスジェニック技術を用いて目的とする植物に導入できる。各寄生線虫類について、別々のＤＮＡ片が必要とされ得、同様に、各植物の種族によって、別々のプロモーターが必要となる。
根は、根特異的プロモーターを利用する場合、導入されたＤＮＡ片からＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを産生する。線虫は根を攝食するので、該ＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡは該線虫により消費または摂取される。ＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡは線虫の細胞に入ることができ、標的ＤＮＡに対してその阻害作用を実行する。虫のクローンしたＤＮＡ片の性質により、線虫は、生存、攝食、増殖等ができなくなり、いずれの場合も、該動物は植物をもはや攝食できなくなり、かくして植物が保護される。

シー・エレガンス産生Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの構築
動物、さらに具体的には線虫類、よりさらに具体的にはシー・エレガンスにおけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたは他のＲＮＡポリメラーゼを産生させるため、幾つかの可能性を考えることができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは種々のプロモーターの下に発現できる。これらのプロモーターは、誘導的プロモーター、構造的プロモーター、一般的プロモーター、組織特異的プロモーターまたはこれらの組み合わせでよい。

シー・エレガンスにおけるＴ７ポリメラーゼ発現用の基本ベクターの構築
λ ＣＥ６（Novagen, Madison, USA）から、標準的操作（PCR, A practical A practical approach, 1993, Ed. J. McPherson, et al, IPL Press）により、プライマー、ｏＧＮ２６（ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG）およびｏＧＮ４６（CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC）を用い、Ｔ７ポリメラーゼをコードする配列をＰＣＲ増幅した。得られたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡフラグメントをＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＦｉｒｅベクターｐＰＤ９７．８２に挿入した。得られた構築物は、アミノ酸配列MTAPKKKRKVPVを有するＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームをコードする。この核局在化シグナル配列は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを細胞質から核へ転位させるために必要であり、核において、Ｔ７プロモーターと称するその特異的プロモーターと結合できる。Ｔ７ポリメラーゼ融合タンパク質配列のコード配列の上流は、幾つかのシー・エレガンス・プロモーターを挿入できる多クローニング部位（ＭＣＳ）によって先行されている最小プロモーター（ｍｙｏ−２）である。このプラスミド（図１１に示すｐＧＮ１０５）は、シー・エレガンスにおいてＴ７ポリメラーゼを発現できる基本的なＴ７ＲＮＡポリメラーゼプラスミドである。多クローニング部位にプロモーターがクローンされた、このプラスミドの誘導体は、多クローニング部位にクローンされたプロモーターにより発現が調節されるので、シー・エレガンスにおいてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導的、構造的、一般的および組織特異的発現を可能にする。
これらの例に限定するももではないば、以下のプロモーターが以下の組織における発現を誘導することが知られている。
ｌｅｔ−８５８（遍在発現）、ｍｙｏ−２（咽頭発現）、ｍｙｏ−３（体壁筋肉）、ｅｇｌ−１５（陰門筋肉）、ｕｎｃ−１１９（全ニューロン）

シー・エレガンス筋肉組織におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築
λ ＣＥ６から、プライマーｏＧＮ４３（GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC）およびｏＧＮ４４（CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG）を用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼコード配列をＰＣＲ増幅し、ＡｇｅＩ／ＳｐｅＩで消化し、ＡｇｅＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＧＫ１３ベクターに挿入した。（このベクターは、咽頭、陰門筋肉、尾および体壁筋肉で発現を起こさせる強力なＳＥＲＣＡプロモーターを含んでいる。）ＳａｃＩ／ＡｇｅＩ制限部位に２つのオーバーラップ・オリゴｏＧＮ４５（CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT）およびｏＧＮ４６（CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC）を挿入することにより、該Ｔ７ポリメラーゼコード配列の前にＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を挿入した。得られた構築物を図１０に示すごとくｐＧＮ１０８と命名した。このプラスミドをシー・エレガンスに導入すると、咽頭、陰門筋肉、尾および体壁筋肉におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現をもたらす。
ＳＥＲＣＡプロモーターの調節下のシー・エレガンスにおけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現および機能をテストするため、ＳＥＲＣＡプロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするｐＧＮ１０８をシー・エレガンスに注射した。テストベクターを共注射した。このテストベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下、ＧＦＰをコードする（図１３のｐＧＮ４０１）。プラスミドｐＧＮ４０１は、Ｔ７プロモーターを生成するＳａｃＩ／ＡｇｅＩ開裂ＦｉｒｅベクターｐＰＤ９７．８２に２つのオーバーラップ・オリゴｏＧＮ４１（CCCGGGATTAATACGACTCACTATA）およびｏＣＮ４２（CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT）を挿入することにより構築した。さらに、選択マーカーを共注射して形質転換体を選択した（ｒｏｌ６、ｐＲＦ４）。後者の選択ベクターｐＲＦ４は当業者によく知られている。トランスジェニックＦ１はｒｏｌ６表現型を示すので、容易に単離できた。これらのトランスジェニック・シー・エレガンスは全て、咽頭、陰門筋肉、尾および体壁筋肉でＧＦＰを発現した。このデータは、明らかに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがＳＥＲＣＡプロモーターの調節下で機能的に発現され、発現されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼがｐＧＮ４０１に存在するＴ７プロモーターに結合し、ＧＦＰ遺伝子の転写を開始し、ついで、機能的に発現し、ＳＥＲＣがＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導した筋肉組織に蛍光をもたらすことを示す。

シー・エレガンスにおけるＴ７ポリメラーゼの遍在発現用ベクターの構築
ＮＬＳ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合遺伝子をＸｍａＩ／Ｂｓｐ１２０１を有するｐＧＮ１０８から単離し、ＸｍａＩ／Ｂｓｐ１２０Ｉで消化したＦｉｒｅベクターｐＰＤ１０３．５にクローンした。これは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがｌｅｔ８５８プロモーターの調節下にクローンされているベクターをもたらす。この特異的プロモーターは全ての組織においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現することができる。得られたプラスミドをｐＧＮ１１０と命名した（図１４）。

Ｔ７プロモーターの制御下にＤＮＡフラグメント、遺伝子およびｃＤＮＡの発現に介在するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ用のベクターの構築
ＦｉｒｅベクターｐＰＤ９７．８２をＳＡｃＩ／ＡｇｅＩで消化し、ＳａｃＩ／ＡｇｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に２つのオーバーラップ・オリゴｐＧＮ４１（CCCGGGATTAATACGACTCACTATA）およびｏＧＮ４２（CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT）を挿入し、Ｔ７プロモーター部位を生じさせた。この構築物（ｐＧＮ４００、図１２）はＴ７プロモーターの調節下にＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の間にクローンされたＧＦＰオープンリーディングフレームを含む。いずれの遺伝子、ｃＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントも、ＡｇｅＩ／ＳａｃＩフラグメントとしてＧＦＰ遺伝子を欠失させ、ベクター中にＤＮＡフラグメントをクローンすることにより、このベクターにクローンできる。好ましくは、目的とするＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅で得、プライマーのＳａｃＩ／ＡｇｅＩ部位に挿入する。ＰＣＲ増幅後、得られたＤＮＡフラグメントを消化し、ｐＧＮ４００中のＧＦＰ遺伝子を、この増幅したＤＮＡフラグメントで置き換える。商業的に入手できるｐＧＥＭベクター類やｐBluescriptベクター類のような、Ｔ７プロモーターを含むいずれのベクターも、シー・エレガンスにおけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導発現のために使用できる。これは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するトランスジェニックシー・エレガンスにおけるＴ７プロモーターの調節下にＧＦＰを発現するｐＧＮ４０１ベクターによって明らかに示される。
ｐＧＮ４００の使用は、ベクターが、ＲＮＡの転写または安定性を促進するｕｎｃ−５４からの３’ＵＴＲフラグメントを含む利点を有する。

恒久的な、組織特異的「シウド（pseudo）ノックアウト」ＲＮＡｉシー・エレガンス系統の発生
現在、シー・エレガンスにおける遺伝子ノックアウトは、ランダム、大規模突然変異誘発およびＰＣＲベースｓｉｂ−選択によって得られる。この方法は、嵩張り、非常に時間がかかり、単調で退屈なものである。細胞への二本鎖ＲＮＡの導入が、内因性遺伝子発現の強力な、特異的妨害をもたらすことが記載されている。シー・エレガンスにおいて、虫の体腔へのＲＮＡ注射、虫を、ｄｓＲＮＡを含有する溶液に浸漬すること、または目的とする遺伝子に相当するｄｓＲＮＡを発現するイー・コリでのしいくにより、遺伝子発現をダウンレギュレーションできる。シー・エレガンス細胞は、それらの細胞外環境からｄｓＲＮＡを取り込むことができる。ｍＲＮＡが、このｄｓＲＮＡ介在遺伝子妨害の標的となることが報告されている（MontogemeryおよびFire, 1998）。また、標的ＲＮＡが、転写が起きる前に核中で分解されることも示唆されている。ＲＮＡｉ介在遺伝子発現の減少は次世代に継代されが、遺伝性は乏しく、その効果はさらなる子孫の誕生の間に急速に失われる。これは、多分、ｄｓＲＮＡプールの継続的減少による。我々は、ここに、恒久的な、遺伝するＲＮＡｉ表現型を有するシー・エレガンス系統の構築法を提案する。この方法は、虫プロモーターの制御下にセンスおよびアンチセンス配向に、または単一構築物からのｃＤＮＡの逆繰返しの転写により、標的遺伝子のｃＤＮＡフラグメントを含むプラスミドを導入することによるトランスジェニック・シー・エレガンス系統の発生を含む。別法として、ｄｓＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを発現するシー・エレガンス株における２つのＴ７プロモーターとフランキングなｃＤＮＡを内蔵するベクターから転写できる。結果は、遺伝する安定な「シウド・ノックアウト」表現型を有するトランスジェニック虫である。ｃＤＮＡまたはＴ７ポリメラーゼの発現は、一般的および構造的とすることができるが、組織特異的プロモーターの下でも調節できる。外部ｄｓＲＮＡｉ（注射、浸漬または飼育）によって誘導されるＲＮＡｉとは反対に、この方法は、遺伝子発現の条件付き、組織特異的阻害を得ることができる。

ＲＮＡ妨害によるｕｎｃ−２２発現の阻害は「ひきつり（twitching）」表現型をもたらす。
ｕｎｃ２２ｃＤＮＡ（エクソン２２）を、全ての組織でＲＮＡ配列を発現できるｌｅｔ８５８プロモーターを含むｐＰＤ１０３．０５（Ｆｉｒｅ ｎｒＬ２８６５）中にセンスおよびアンチセンス配向にクローンした。得られたプラスミドをｐＧＮ２０５（図１９ａ）ｏｙｏｂｉｐＧＮ２０７（図１９ｂ）と命名した。これらの構築物を選択マーカー（ｒｏｌ−６、ＧＦＰ）と共にシー・エレガンスに導入した。トランスジェニックＦ１個体（ｒｏｌ−６またはＧＦＰを発現）は「ひきつり」表現型を示し、ＲＮＡｉがトランスジェニックＤＮＡからのＲＮＡの内因性転写によって介在できることが示された。このＲＮＡｉ表現型は選択マーカーと共にさらなる子孫に共に分離した。これは、恒久的ＲＮＡｉ表現型を有するシー・エレガンス系統をもたらした。

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ系統の安定系統の発生およびデュアル・トランスジェニック虫の発生
外来性ＲＮＡポリメラーゼに基づくシー・エレガンスにおける発現系は２つのプラスミドを必要とする。１つは特異的なプロモーターの制御下でＲＮＡポリメラーゼをコードするものであり、他のプラスミドは、Ｔ７プロモーターの調節下で発現させるべきＤＮＡフラグメントをコードするものである。シウド安定ノックアウトと命名するセミ安定ＲＮＡｉの場合、ｄｓＲＮＡが産生できるように、目的とするＤＮＡを２つのＴ７プロモーターの間にクローンする。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現系は高発現系であることが知られており、これは、２つのトランスジェニック動物を生じさせる問題がある。シー・エレガンス線虫において発現させるべき遺伝子が毒性の場合、これは致死効果をもたらし、目的とする遺伝子の高度に調節された安定な発現無しにシー・エレガンスの構築をもたらす。目的とする遺伝子が生物の生存に必須の場合、この遺伝子からのＤＮＡフラグメントを用いるＲＮＡｉも、致死効果をもたらし、シウド安定ノックアルトは可能ではない。
この問題を克服するため、本発明者らは２トランスジェニック動物を含む系を設計した。第１の動物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼについてのトランスジェニックである。このＴ７ＲＮＡポリメラーゼは上記実施例で示した全ての細胞または特異的な細胞または組織で発現できる。第２のトランスジェニック動物は、目的とするＤＮＡフラグメントについてトランスジェニックである。これはＴ７プロモーターと連結する遺伝子またはｃＤＮＡとすることができ、あるいはＲＮＡｉを望む場合は、そのような遺伝子のＤＮＡフラグメントを２つのＴ７プロモーターの間にクローンできる。
両方のトランスジェニック動物は、生存能力があり、なんらの常軌を脱した表現型を示すものでもない。これは、第１のトランスジェニック生物で発現されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、たとえ比較的高いレベルで発現されても、当該生物にとって毒性でないからである。第２のトランスジェニック生物において、これらの生物がＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含まないので、目的とする遺伝子は発現されず、またはｄｓＲＮＡは産生されない。
２つのトランスジェニック動物をかけ合わせることにより、遺伝子または目的とするｃＤＮＡの発現あるいはＤＮＡフラグメントでのＲＮＡｉが得られる。これらの子孫はデュアル・トランスジェニックであり、目的とする遺伝子を発現するか、Ｍ句的のＤＮＡフラグメントのｄｓＲＮＡを発現する。そのようなかけ合わせで十分な雄を発生させるため、トランスジェニック動物の一方を、雄性世代を助長する表現型を有するシー・エレガンス突然変異体とすることができる。優先的には、そのような突然変異体を使用してＴ７ＲＮＡポリメラーゼ用のシー・エレガンス・トランスジェニックを作成し、一方、両性個体はＴ７プロモーターの調節下のＤＮＡフラグメントを内蔵する。
デュアル・トランスジェニック子孫を効率的に選択するため、第２トランス遺伝子を第２トランスジェニック動物に誘導する。このトランス遺伝子はＴ７プロモーターの調節下のレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子はＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β‐ガルマクトシダーゼ（galmactosidase）またはβ‐ラクタマーゼとすることができ、そのようなトランス遺伝子の例としてはベクターｐＧＮ４００およびｐＧＮ４０１が挙げられる。
シー・エレガンスにおけるトランス遺伝子の誘導的、組織特異的発現のため、我々は、組織特異的発現のできる別々のシー・エレガンス・プロモーターで制御されるＴ７ポリメラーゼ構築物を持つ雄性ストック（すなわち、ｈｉｍ−５）を作成できる。この雄はＴ７プロモーターの制御下、目的とする遺伝子を担持する両性個体と交差できる。
さらに、トランス遺伝子は動物のゲノムにも組み込める。該動物のゲノムへのプラスミドの安定な組み込みを生じさせる方法は記載されており（EpsteinおよびShakes編, Academic Press Mehtods in cell biology, Vol. 48, 1995）、動物の照射を含む。これは両方の動物に対して行なうことができるが、好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する動物をそのような処置に付す。これにより、種々のプロモーターの制御下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現するシー・エレガンス線虫のコレクションがもたらされ、そのような例は、ｍｙｏ−２（咽頭発現）、ｍｙｏ−３（体壁筋肉）、ｅｇｌ−１５（陰門筋肉）、ｕｎｃ−１９（全ニューロン）、ＳＥＲＣＡ（筋肉）、ｌｅｔ８５８（全細胞）、ｇｅｓ−１（内臓）である。

ＲＮＡｉＴ７プロモーター酵母２ハイブリッドベクターの構築
前向きおよび逆向きＴ７／Ｔ３および／またはＳＰ６を有するｐＧＡＤ４２４
多くの２ハイブリッド実験において、ｃＤＮＡライブラリーを、Ｎｃｏｌ部位（Clontech）のようなポリリンカーにおけるさらなる制限部位で操作されたプラスミドｐＧＡＤ４２４（図１６）にクローンする。このライブラリーは、酵母２ハイブリッド実験における結合タンパク質のスクリーニングを可能とする。我々は、酵母２ハイブリッドを行なう同じ可能性を有するが、２つのさらなるＴ７プロモーターを含む新しい酵母２ハイブリッドベクターを構築した。これはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ誘導シウド安定ノックアウトに使用できる。このために、我々は、Ｔ７−リンカー（以下のプライマーaattcttaatacgactcactatagggccおよびcatgggccctatagtgagtcgtattaagからなる）を用いてｐＧＡＤ４２４のＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌ部位に挿入した。得られたベクターをｐＧＡＤ４２４−without-ＦＵＬＬ−both−Ｔ７と命名した。終止コドンの削除に注意し、最大のポリリンカー適合性アミノ酸を使用した。我々は、ＢａｍＨ１およびＰｓｔ１を用いて同様な方法を逆Ｔ７（両プライマーgatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcaおよびgtaatacgactcactatagggagatctgtcgacgからなる）にも適用した。ＳａｌＩの損失をさけるため、我々はこの部位をプライマーに含めた。
ＳａｌＩ部位は、大部分のライブラリーがこの部位にクローンされ、アダプターが利用できるので重要である。これにより、存在するベクターに匹敵する新たに構築されたベクターを作成する。

前向きおよび逆向きＴ７／Ｔ３および／またはＳＰ６を有するｐＡＳ２
ｐＡＳ２（Clontech）を基にして類似の酵母２ハイブリッドベクターを構築した。部分ＥｃｏＲＶ消化により、我々はｃｙｈ２遺伝子の有意な部分を除去することができた。正しい構築物はを単離し、ＢａｌＩＩで制限部位を消化することにより、チェックした。この制限部位は除去すべきｐＡＳ２ｎｏＥｃｏＲＶフラグメントに存在する。これは、わずかに毒性で、生長の妨害に関与するｃｙｈ２遺伝子を除去する。この遺伝子はＲＮＡｉおよび酵母２ハイブリッド実験の実行に非必須的である。ＥｃｏＲＶフラグメントの除去の後、ＧＡＬ４ＤＢおよびＨＡ（エピトープ）をコードするＤＮＡ配列の間に位置するＥｃｏＲＩ制限部位はプラスミドにユニークとなり、Ｔ７プロモーター含有リンカーでのＨＡの置換に使用できる。これにより、全ての制限部位の持続性を保証し、フレームクローニングを可能とし、前のベクターとｐＧＡＤ４２４とを適合させる。我々は以下ののリンカー（プライマー：aattcttaatacgactcactatagggcaおよびtatgccctatagtgagtcgtattaag）を使用し、ＥｃｏｒＩおよびＮｄｅ１クローニング部位を使用した。我々は同じ方法を逆Ｔ７にも採用し、ＢａｍＨ１およびＰｓｔ１と共に（プライマー：gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca catgggccctatagtgagtcgtattaagおよびgtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg）を用いた。Ｓａｌ１の損失をさけるため、我々はこれをプライマーに含めた。得られたベクターをｐＡＳ２−ｃｙｈ２−ＨＡ＋bothＴ７finalと命名した。

ｐＧＡＤ４２４中のＴ７プロモーター（または別法としてＴ３またはＳＰ６プロモーター）により、タンパク質との相互反応からＲＮＡｉへ迅速に進めることができ、単離したＤＮＡフラグメントに機能を割り当てることができる。さらなる利点は、in vitro転写と結合したin vitro翻訳（ＧＡＬ４ＤＢまたはＧＡＬ４ＡＤと共にフレーム中にＡＴＧがある）による、実際のタンパク質‐タンパク質相互反応のin vitro制御（例、プル・ダウン・アッセイ）に使用できるラベルされたタンパク質の作成能力である。
作成されたプラスミドの配列およびＳＰ６およびＴ３ポリメラーゼは以下の配列表に示す。

Claims (37)

1. 生物中にｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを産生できるＤＮＡを導入する方法であって、適当な転写因子がプロモーターまたはプロモーター類に結合した場合にＤＮＡ配列の二本鎖ＲＮＡへの転写が開始できるように該ＤＮＡ配列に対して配向した該プロモーターまたはプロモーター類を含む発現ベクターを含む適当な微生物を該生物に与えるか、または該生物に直接、該発現ベクターを与えることを特徴とする方法。
2. 該発現ベクターが該ＤＮＡ配列にフランキングな２つの同じプロモーターを含む請求項１記載の方法。
3. 該発現ベクターが該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向した該ＤＮＡ配列を含む請求項１記載の方法。
4. 該発現ベクターがさらに、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、該プロモーター（類）に適当な転写因子が結合した場合にヌクレオチド配列の二本鎖ＲＮＡへの転写が起こるように該プロモーター（類）に対して配向している請求項４記載の方法。
6. 該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のｄｓＲＮＡへの転写が開始できるように、２つの同じプロモーターの間に提供される請求項５記載の方法。
7. 該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のｄｓＲＮＡへの転写が起こるように、該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される請求項５記載の方法。
8. 該選択マーカーが、ｐｈａ−１突然変異を有するシー・エレガンス中への導入のためのｓｕｐ−３５をコードするヌクレオチド配列を含む請求項４または５記載の方法。
9. 該微生物または生物を該転写因子の発現に適応させる請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 該微生物または生物のいずれかが請求項５〜８のいずれか１項記載の発現ベクターを含む請求項９記載の方法。
11. 該生物がシー・エレガンスであり、該微生物がイー・コリである請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 該イー・コリ株が、ＲＮＡアーゼＩＩＩ陰性株である請求項１１記載の方法。
13. 該生物が、シー・エレガンスｎｕｃ−１突然変異体である請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
14. 適当な転写因子がプロモーターまたはプロモーター類に結合した場合にＤＮＡ配列の二本鎖ＲＮＡへの転写が開始できるように該ＤＮＡ配列に対して配向した該プロモーターまたはプロモーター類を含む発現ベクター。
15. 該ＤＮＡ配列にフランキングな２つの同じプロモーターを含む請求項１４記載の発現ベクター。
16. 該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向した該ＤＮＡ配列を含む請求項１４記載の発現ベクター。
17. さらに、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む請求項１４〜１６のいずれか１項記載の発現ベクター。
18. 該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、該プロモーター（類）に適当な転写因子が結合した場合にヌクレオチド配列の二本鎖ＲＮＡへの転写が起こるように該プロモーター（類）に対して配向している請求項１７記載の発現ベクター。
19. 該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のｄｓＲＮＡへの転写が開始できるように、２つの同じプロモーターの間に提供される請求項１８記載の発現ベクター。
20. 該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のｄｓＲＮＡへの転写が起こるように、該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される請求項１８記載の発現ベクター。
21. 該選択マーカーが、ｐｈａ−１突然変異を有するシー・エレガンス中への導入のためのｓｕｐ−３５をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１７または１８記載の発現ベクター。
22. 配列番号１２または配列番号１３として示されるヌクレオチド配列を含むプラスミド。
23. 配列番号８または配列番号９として示されるヌクレオチド配列を含む酵母２ハイブリッドベクタープラスミド。
24. ｓｕｐ−３５遺伝子のエクソン５がクローンされている請求項２２記載のプラスミド。
25. ａ）相互に対抗する２つのＴ７プロモーター、
    ｂ）該２つのプロモーター間の制限部位または多クローニング部位、および
    ｃ）数個の終止コドンを含むことによって完全長ｓｕｐ３５タンパク質の発現を妨げるように操作された、シー・エレガンスｓｕｐ３５ゲノムＤＮＡ
    を含むプラスミド。
26. 請求項２２〜２５のいずれか１項記載のプラスミドで形質転換またはトランスフェクトされたか、または請求項１４〜２１のいずれか１項記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
27. 請求項２２〜２５のいずれか１項記載のプラスミドで形質転換またはトランスフェクトされたか、または請求項１４〜２１のいずれか１項記載の発現ベクターで形質転換された生物。
28. 微生物である請求項２７記載の生物。
29. 細菌または酵母細胞である請求項２８記載の微生物。
30. 線虫類の種である請求項２７記載の生物。
31. シー・エレガンスである請求項３０記載の生物。
32. 植物害虫の蔓延を軽減する方法であって、
    ａ）該害虫から、その生存、生長、増殖に臨界的なＤＮＡ配列を同定し、
    ｂ）工程ａ）からの配列またはそのフラグメントを適当なベクター中、プロモーター（類）に対して、該プロモーター（類）に適当な転写因子が結合すると、プロモーター(類）が該ＤＮＡ配列のＲＮＡまたはｄｓＲＮＡへの転写を開始できるような配向にクローニングし、
    ｃ）該ベクターを植物に導入することを特徴とする方法。
33. プロモーターに転写因子が結合すると、ＤＮＡのｄｓＲＮＡへの転写がもたらされるように２つのプロモーター間に該ＤＮＡ配列が提供される請求項３２記載の方法。
34. プロモーターに転写因子が結合すると、ＤＮＡのｄｓＲＮＡへの転写がもたらされるように該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で該ＤＮＡ配列が提供される請求項３３記載の方法。
35. 該害虫が線虫類である請求項３２記載の方法。
36. 該線虫類がチレンクルス・エスピー（Tylenchulus ssp.)、ロドホルス・エスピー（Radopholus ssp.）、ラジナフェレンクス・エスピー（Rhadinaphelenchus ssp.）、ヘテロデラ・エスピー（Heterodera ssp.）、ロチレンクルス・エスピー（Rotylenchulus ssp.）、プラチレンクルス・エスピー（Pratylenchus ssp.）、ベロノライムス・エスピー（Belonolaimus ssp.)、カンジャヌス・エスピー（Canjanus ssp.）、メロイドジン・エスピー（Meloidogyne ssp.）、グロボデラ・エスピー（Globodera ssp.）、ナコブス・エスピー（Nacobbus ssp.）、ジチレンクス・エスピー（Ditylenchus ssp.）、アフェレンコイデス・エスピー（Aphelenchoides ssp.）、ヒルシュメニエラ・エスピー（Hirschmenniella ssp.）、アンギナ・エスピー（Anguina ssp.）、ホプロライムス・エスピー（Hoplolaimus ssp.）、ヘリオチレンクス・エスピー（Heliotylenchus ssp.）、クリコネメラ・エスピー（Criconemella ssp.）、キシフィネマ・エスピー（Xiphinema ssp.）、ロンギドルス・エスピー（Longidorus ssp.)、トリコドルス・エスピー（Trichodorus ssp.)、パラトリコドルス、エスピー（Paratrichodorus ssp.)、アフェレンチス・エスピー（Aphelenchs ssp.)のいずれかを含む請求項３５記載の方法。
37. 該ＤＮＡ配列またはそのフラグメントが２つの組織特異的、好ましくは根特異的プロモーターの間にクローンされる請求項３３記載の方法。

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