ES2327334T3 - Metodo para mitigar la infestacion por plagas en plantas. - Google Patents

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Abstract

Un método para mitigar una infestación por plagas de plantas, comprendiendo dicho método a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que sea crítica para su supervivencia, desarrollo, proliferación, b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en una orientación respecto a un promotor o promotores, de modo que dicho promotor o promotores sea capaz de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores y c) introducir dicho vector en la planta en el que la plaga de plantas es una plaga de plantas que se alimenta de la planta.

Description

Método para mitigar la infestación por plagas en plantas.
La presente invención se refiere a la caracterización o identificación de la función de genes usando la inhibición por ARN bicatenario (ARNibc) y métodos de identificación del ADN responsable de la inducción de un fenotipo específico en una célula y un método de asignación de la función a secuencias de genes conocidas.
Se ha descrito recientemente en Nature Vol 391, págs. 806-811, Febrero 1998, que la introducción de ARN bicatenario en una célula da como resultado una interferencia potente y específica con la expresión de genes endógenos en la célula y siendo la interferencia sustancialmente más eficaz que proporcionar individualmente cualquier cadena de ARN como se propone en la tecnología antisentido. Se descubrió que esta reducción específica de la actividad del gen también sucedía en el helminto nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) cuando se introducía el ARN en el genoma o en la cavidad corporal del helminto.
Los presentes inventores han utilizado esta técnica y la han aplicado adicionalmente para encontrar nuevos e ingeniosos métodos de asignación de funciones a genes o fragmentos de ADN que se han secuenciado en diversos proyectos, tales como, por ejemplo, el proyecto genoma humano, y a los que todavía hay que dar una función particular, y para usar en la identificación del ADN responsable de conferir un fenotipo particular.
El documento US 4.970.168 describe plantas transgénicas que expresan proteínas de cubierta del Virus X de la Patata y del Virus Y de la Patata, volviéndolas por lo tanto resistentes a la infección por virus.
Se puede citar el documento WO 99/53050 bajo el Artículo 54 (3) EPC solamente en la medida en la que el tema se describe en la solicitud generadora de prioridad US 09/056.767 presentada el 8 de abril de 1998. No se puede citar en términos de etapa inventiva. El documento WO 99/53050 describe métodos para obtener organismos resistentes a virus por suministro de células del organismo con un primer y segundo ADN quimérico. El primer ADN quimérico incluye una secuencia de nucleótidos sentido que se corresponde con la secuencia de un genoma viral. El segundo ADN quimérico incluye la secuencia de nucleótidos antisentido correspondiente, de modo que pueda producirse ARN bicatenario cuando se transcriben las regiones de ADN.
El documento EP 0616035 describe organismos que incorporan al menos dos genes diferentes con "acción inhibidora de patógenos" para producir organismos resistentes.
Gast (Nucleic Acids Research, Vol. 17, Nº 23 (1989)) describe el uso de ARN polimerasa T7 para transcripción in vitro.
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para mitigar una infestación por plagas de plantas, comprendiendo dicho método
a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que es crítica para su supervivencia, desarrollo, proliferación,
b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en una orientación respecto a un promotor o promotores, de modo que dicho promotor o promotores sea capaz de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores y
c) introducir dicho vector en la planta
en el que la plaga de plantas es una plaga de plantas que se alimenta de la planta.
Un método de identificación del ADN responsable de conferir un fenotipo en una célula puede comprender a) construir una genoteca de ADNc o genómico del ADN de dicha célula en una orientación en relación con el promotor (o promotores) capaz de promover la transcripción de dicho ADNc o ADN en ARN bicatenario (bc) tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor (o promotores), b) introducir dicha genoteca en una o más de dichas células que comprenden dicho factor de transcripción y c) identificar y aislar un fenotipo deseado de dicha célula que comprende dicha genoteca e identificar el fragmento de ADN o ADNc de dicha genoteca responsable de conferir dicho fenotipo.
La genoteca puede organizarse en combinaciones jerárquicas como se describe con más detalle en los ejemplos proporcionados, antes de la etapa b) tal como para incluir, por ejemplo, familias de genes.
Un método de asignación de función a una secuencia de ADN conocida puede comprender
a) identificar un homólogo (u homólogos) de dicho ADN en una célula, b) aislar el ADN homólogo (u homólogos) pertinente o un fragmento del mismo de dicha célula, c) clonar dicho homólogo o fragmento en un vector apropiado en una orientación con relación a un promotor (o promotores) capaz de promover la transcripción de ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores, d) introducir dicho vector en dicha célula de la etapa a) que comprende dicho factor de transcripción, y e) identificar el fenotipo de dicha célula en comparación con el tipo silvestre.
En la invención, la secuencia de nucleótidos o de ADN puede proporcionarse tanto en una orientación con sentido como antisentido con relación a un solo promotor que tiene las propiedades definidas anteriormente, o como alternativa puede proporcionarse entre dos promotores idénticos. En ambas realizaciones el ARNbc se proporciona a partir de la transcripción iniciada a partir del promotor tras la unión de su factor de transcripción apropiado.
La célula de acuerdo con dicho método puede proceder de o estar contenida en un organismo. Cuando la célula está contenida en un organismo, el organismo puede adaptarse para expresar el factor de transcripción apropiado. El organismo puede ser cualquiera de una planta, animal, hongo o levadura pero preferiblemente puede ser el helminto nematodo C. elegans, que puede ser cualquiera de un tipo silvestre, un mutante nuc-1 o pha-ts de C. elegans o una combinación de dichas mutaciones. La genoteca de ADN o ADNc o el ADN homólogo o fragmento del mismo puede transfectarse o transformarse ventajosamente en un microorganismo, tal como una célula bacteriana o de levadura, que puede suministrarse al organismo, que es preferiblemente el helminto nematodo C. elegans. El microorganismo puede adaptarse para expresar el factor de transcripción apropiado. Preferiblemente, el microorganismo es
E. coli.
En cada uno de los métodos pertinentes, la genoteca de ADN, homólogo de ADN o fragmento de ADN puede construirse en un vector de ADN adecuado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicho factor de transcripción. Como alternativa, dicho factor de transcripción está codificado por un vector adicional. En una alternativa adicional más, la célula u organismo puede expresarse o adaptarse para expresar dicho factor de transcripción. Preferiblemente, cualquiera de los vectores usados en el método de acuerdo con la invención comprende un marcador de selección que puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica sup-35 o un fragmento del mismo. La secuencia de nucleótidos puede orientarse en relación con un promotor de manera que la unión de un factor de transcripción al promotor inicia la transcripción del ADN en ARN bicatenario. La Figura 10 ilustra los vectores y la orientación de la secuencia de ADN que permite la producción de ARN bicatenario en C. elegans. De esta manera, en una realización el ADN se localiza entre dos promotores en un vector capaz de expresar ARNbc después de la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores. Como alternativa, el vector comprende dos copias de la secuencia de ADN organizada en una orientación sentido y antisentido con relación al promotor y cuyo marcador es de selección cuando está contenido en un C. elegans mutante pha-1. Preferiblemente, los promotores son cualquiera de los promotores T7, T3 o SP6 y el factor de transcripción comprende la polimerasa apropiada.
Preferiblemente el marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos capaz de inhibir o impedir la expresión de un gen en dicha célula y siendo dicho gen responsable de conferir un fenotipo conocido. Esta secuencia de nucleótidos puede ser parte de o idéntica a dicho gen que confiere dicho fenotipo, y estando dicha propia secuencia de nucleótidos orientada en relación con un promotor (o promotores) adecuado capaz de iniciar la transcripción de ARN bicatenario tras la unión de un factor de trascripción apropiado a dicho promotor (o promotores). Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede ser una parte de o idéntica a dicha secuencia génica que confiere dicho fenotipo, y siendo dicha secuencia de nucleótidos tal que permite la integración de dicho vector adecuado o adicional por recombinación homóloga en el genoma de dicha célula y a continuación dicha integración de dicha secuencia de nucleótidos es capaz de inhibir la expresión de dicha secuencia génica que confiere dicho fenotipo. Dicha secuencia de nucleótidos comprende codones de terminación suficientes para impedir la traducción de dicha secuencia de nucleótidos después de su integración en dicho genoma.
En dicho método, ventajosamente, pueden añadirse compuestos a dicha célula u organismo con el propósito de exploración para fenotipos deseados, tales como por ejemplo, resistencia o sensibilidad al compuesto cuando se compara con el tipo silvestre. Los promotores son preferiblemente inducibles. El factor de transcripción puede proceder de fagos, tal como por ejemplo, una polimerasa T7 dirigida por un promotor de fago. Sin embargo, cuando se utiliza C. elegans puede usarse un promotor específico de helmintos o específico de tejido, tal como let858, SERCA, UL6, myo-2 o myo-3. Preferiblemente, la cepa de E. coli es una cepa ARNasa III, e incluso más preferiblemente, ARNasa negativa.
Un método de generación de un organismo transgénico no humano que comprende un factor de transcripción exógeno y un transgén que comprende un promotor unido operativamente a un fragmento de ADN que se expresa tras la unión de dicho factor de transcripción al mismo, puede comprender a) proporcionar un primer organismo transgénico que comprende una primera construcción que incorpora ADN que codifica un factor de transcripción exógeno y un segundo organismo transgénico que comprende una segunda construcción que incluye al menos un promotor unido operativamente a una secuencia de ADN deseada que se expresa tras la unión del factor de transcripción de dicho primer organismo transgénico al mismo b) cruzar dichos primer y segundo organismos transgénicos y seleccionar los descendientes que expresan dicha secuencia de ADN deseada. Dichos primer y segundo organismos transgénicos pueden generarse mediante la transformación de dichas primera y segunda construcciones en los microorganismos respectivos para el posterior suministro al organismo respectivo. Preferiblemente, dicha segunda construcción comprende dicha secuencia de ADN deseada en una orientación en relación con dicho promotor de manera que es capaz de iniciar la transcripción de dicho ADN en ARNbc tras la unión de dicho factor de transcripción al mismo. En este documento, dicha segunda construcción comprende dos promotores que flanquean dicha secuencia de ADN deseada, pudiendo dichos promotores iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARNbc tras la unión de dicho factor de transcripción a dichos promotores. Como alternativa, se proporciona dicha secuencia de ADN en una orientación sentido y antisentido en relación con dicho promotor para producir ARNbc tras la unión del factor de transcripción a los promotores. La primera y/o segunda construcciones pueden proporcionarse preferiblemente con un gen indicador unido operativamente a un promotor que es capaz de iniciar la transcripción de dicho indicador tras la unión de dicho factor de transcripción al mismo. Preferiblemente, el gen indicador codifica cualquiera de luciferasa, proteína verde fluorescente, \beta-galactosidasa o \beta-lactamasa.
Un método de validación de clones identificados en experimentos de vectores de doble híbrido en levadura, siendo dichos experimentos bien conocidos por los especialistas en la técnica y siendo dichos experimentos propuestos por primera vez por Chien et al. (1991) para detectar interacciones proteína-proteína, puede comprender proporcionar una construcción que incluye el ADN que codifica una proteína identificada en un experimento de vectores de doble híbrido, siendo su construcción tal que dicho ADN se proporciona en una orientación en relación con uno o más promotores capaz de promover la transcripción de dicho ADN en ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores, transformando una célula, tal como una célula bacteriana o, como alternativa, transformando un organismo que comprende dicho factor de transcripción con dichas construcciones e identificando un cambio fenotípico en dicha célula u organismo, que puede ser C. elegans o similar, comparado con el tipo silvestre. Preferiblemente, el factor de transcripción es inducible en la célula u organismo. Una vez más la secuencia de ADN puede localizarse entre dos promotores o tanto en una orientación sentido como antisentido en relación con un sólo promotor, como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, el promotor es un promotor de polimerasa de fago y dicho factor de transcripción es una ARN polimerasa, y preferiblemente polimerasas T7. Pueden usarse vectores para transformar dichas células u organismos y las propias células u organismos.
Como se ha mencionado anteriormente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método de mitigación de infestación por plaga de plantas, comprendiendo dicho método a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que es fundamental tanto para su supervivencia, desarrollo, proliferación o reproducción, b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en relación con uno o más promotores capaces de transcribir dicha secuencia en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores y c) introducir dicho vector en la planta.
Por lo tanto, ventajosamente, el método de acuerdo con la invención proporciona un mecanismo particularmente selectivo para mitigar una infestación por plaga, y en algunos casos la infestación parasitaria de plantas, de manera que cuando la plaga se introduce en la planta digerirá el ARNbc expresado en la planta inhibiendo de esta manera la expresión del ADN dentro de la plaga, que es fundamental para su desarrollo, supervivencia, proliferación o reproducción. En una realización preferida, la plaga puede ser cualquiera de Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmenniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchs ssp. La secuencia de ADN o fragmento de la misma de acuerdo con este aspecto de la invención puede clonarse entre dos promotores específicos de tejido, tales como dos promotores específicos de raíz.
El vector usado en cada uno de los métodos para la construcción de dicha genoteca, comprende dos promotores idénticos orientados de manera que son capaces de iniciar la transcripción de una secuencia de ADN localizada entre dichos promotores en ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores. La secuencia de ADN puede, por ejemplo, incluir un sitio de clonación múltiple. Preferiblemente, el vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador de selección. La secuencia de nucleótidos que codifica dicho marcador de selección puede localizarse entre dos promotores idénticos orientados de manera que son capaces de iniciar la transcripción del ADN localizado entre dichos promotores en ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores. Preferiblemente, el marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos que codifica sup-35, para la introducción en C. elegans que tiene una mutación pha-1.
Preferiblemente, el factor de transcripción comprende una polimerasa de fago que se une a su correspondiente promotor o un promotor específico de C. elegans e incluso más preferiblemente una polimerasa T7. Preferiblemente, el vector incluye un sito de clonación múltiple entre dichos promotores idénticos.
Un vector de expresión para expresar un factor de transcripción apropiado puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica dicho factor de transcripción unido operativamente a secuencias de control de la expresión adecuadas. Preferiblemente, las secuencias del control de la expresión incluyen promotores que son promotores inducibles, constitutivos, generales o específicos de tejido, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el factor de transcripción comprende una polimerasa de fago, y preferiblemente ARN polimerasa T7, T3 o SP6.
Un sistema de selección para identificar la transformación de una célula u organismo con un vector comprende un vector, como se describe en este documento, en el que dicho marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos capaz de inhibir o impedir la expresión de un gen en dicha célula u organismo, siendo dicho gen responsable de conferir un fenotipo conocido. Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos corresponde a una parte de o es idéntica a dicho gen que confiere dicho fenotipo conocido, y estando dicha propia secuencia de nucleótidos localizada entre dos promotores idénticos capaces de iniciar la transcripción de ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a los mismos.
De manera alternativa, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que es una parte de o idéntica a dicha secuencia génica que confiere un fenotipo conocido en dicha célula u organismo, y que es tal que tras la integración de dicho vector por recombinación homóloga en el cromosoma de dicha célula u organismo dicha secuencia inhibe la expresión de dicha secuencia génica que confiere dicho fenotipo conocido.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende codones de terminación suficientes para impedir la traducción de la secuencia de nucleótidos tras la integración en dicho cromosoma.
Preferiblemente, la secuencia génica conocida comprende un gen sup-35 o un fragmento del mismo que puede seleccionarse por identificación de descendientes que crecen a una temperatura superior a 25ºC tras la introducción en un helminto C. elegans mutante pha-1 et123ts.
Un método de asignación de función a una secuencia de ADN de un organismo multicelular comprende a) proporcionar i) una construcción que comprende dicho fragmento de ADN clonado entre dos promotores capaces de promover la transcripción en dicho organismo multicelular, en un organismo multicelular capaz de iniciar la transcripción a partir de dicho promotor; b) identificar el fenotipo de dicho organismo multicelular en comparación con el tipo silvestre.
La presente invención puede entenderse más claramente mediante los siguientes ejemplos que son puramente ejemplares con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 es una secuencia de nucleótidos del plásmido PGN1 de acuerdo con la presente invención.
La Figura 2 es una secuencia de nucleótidos del plásmido PGN100 de acuerdo con la presente invención.
La Figura 3 es una representación esquemática de los vectores usados y del régimen de transformación usado en los métodos descritos en este documento.
La Figura 4 es una ilustración de un vector de expresión usado de acuerdo con los métodos descritos en este documento.
La Figura 5 es una ilustración esquemática de los vectores de expresión de ARN polimerasa T7 usados para la transformación de C. elegans.
La Figura 6 es una ilustración del plásmido PGN1.
La Figura 7 es una representación esquemática de un vector mejorado para la inhibición por ARNbc que codifica el ARNbc de sup-35.
La Figura 8 es una ilustración de un vector para la integración en el genoma de C. elegans.
La Figura 9 es una ilustración de la posición de una secuencia (o secuencias) de ADN en relación con un promotor adecuado para iniciar la expresión de ARNbc a partir de la secuencia (o secuencias) de ADN.
La Figura 10 es una representación del plásmido pGN108.
La Figura 11 es una representación del plásmido pGN105.
La Figura 12 es una representación del plásmido pGN400.
La Figura 13 es una representación del plásmido pGN401.
La Figura 14 es una representación del plásmido pGN110.
La Figura 15 es una representación del plásmido pAS2 con promotores T7/T3/SP6 directos e inversos.
La Figura 16 es una representación del plásmido pGAD424 con promotores T7/T3/SP6 directos e inversos.
La Figura 17 es una representación del plásmido pAS2 -cyHA+, both T7-final.
La Figura 18 es una representación del plásmido pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7.
La Figura 19 (a) es una representación del plásmido pGN205 y (b) es una representación del plásmido pGN207.
Ejemplo A Construcción de una genoteca de ADNc ordenada y combinada jerárquicamente y aplicaciones de la misma Genoteca ordenada y combinada aleatoria
El vector es un vector de E. coli que contiene dos promotores T7, con un sitio de clonación múltiple (MCS) entre medias. Los dos promotores están orientados uno hacia el otro, y hacia el MCS. En presencia de ARN polimerasa T7, expresada en E. coli, C. elegans o cualquier otro organismo, se producirá ARN, comenzando a partir de los dos promotores T7. Como estos están orientados en sentido opuesto, se producirán ambas cadenas de ARN a partir del ADN insertado (clonado) en el MCS entre los dos promotores, dando como resultado la generación de ARN bicatenario (ARNbc) tras la unión de la ARN polimerasa T7 a los mismos.
En el MSC se construye una genoteca de ADNc de C. elegans usando técnicas de biología molecular convencionales. La genoteca se transforma dentro de E. coli, y las E. coli resultantes se cultivan y almacenan en placas multipocillo de 96. En esta fase, el ADN plásmido puede aislarse y almacenarse en placas multipocillo de 96 que se corresponden con los de las colonias de E. coli. Se puntúan aproximadamente 100.000 colonias. De este modo, la genoteca alojará aproximadamente 5 veces las variaciones totales de ADNc expresado de C. elegans, lo que proporciona la oportunidad de que las secuencias poco expresadas estén presentes en la genoteca. Esto dará como resultado aproximadamente 1041 placas de 96 pocillos. Las placas se combinan jerárquicamente según sea necesario. Por ahora la combinación de clones se dispone en un intervalo de 10 a 100. Si la combinación jerárquica es por 8 o 12 (son números más convenientes ya que las placas de 96 pocillos tienen una rejilla de 8 por 12), esto dará como resultado aproximadamente 87 placas multipocillo y aproximadamente 8352 pocillos. Si la combinación jerárquica es por 96 pocillos, que es una placa completa, dará como resultado aproximadamente 11 placas y aproximadamente 1041 pocillos. El ADN plásmido puede aislarse en cualquier fase de la combinación jerárquica, que sería menos complicado cuantas menos placas se usasen, pero daría como resultado una pérdida de complejidad aunque este no debería ser el caso en la combinación por 12. La combinación del ADN también puede llevarse a cabo con el ADN original.
Los siguientes experimentos describen cómo debe realizarse la combinación jerárquica, tanto para el ADN como para la genoteca de E. coli.
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Una genoteca ordenada para la tecnología de ARNi que contiene todos los genes del genoma de C. elegans, con aplicaciones de la misma
Como el proyecto de secuenciación del genoma está llegando a su fin, puede usarse esta información en la aplicación de la tecnología de inhibición por ARN de T7. Todos los genes del genoma de C. elegans pueden clonarse usando la tecnología de PCR. Se clonarán, con preferencia, los exones con una longitud mínima de 500 pb. Si los exones son demasiado pequeños, los fragmentos más pequeños se aislarán con PCR, o incluso partes de intrones y exones vecinos se aislarán con la tecnología de PCR de manera que se clone al menos una parte suficiente de la región traducida del gen. Para esto, es necesario realizar al menos 17000 reacciones de PCR. Esta colección de productos de PCR se clonará en un vector T7 como se ha descrito (dos promotores T7 orientados uno hacia el otro con un sitio de clonación múltiple entre medias). Cada producto PCR se clona independientemente, o puede usarse para generar una genoteca aleatoria, análoga a la genoteca de ADNc descrita. Si cada producto PCR se clona individualmente, la bacteria resultante y el ADN plásmido pueden combinarse de diversas maneras. En primer lugar, esta colección de productos PCR clonados individualmente en el vector de ARNi T7 puede combinarse aleatoriamente, como se ha descrito en la genoteca aleatoria. Esta combinación también puede hacerse de una manera más racional. Por ejemplo, pueden analizarse los genes del genoma de C. elegans usando herramientas bioinformáticas (biología in silico). Diversos genes del genoma pertenecerán a una familia de genes, o tendrán homólogos en el genoma. Estos miembros de la familia de genes se combinarán, o se combinarán los miembros que sean homólogos. De esta manera el número total de aproximadamente 1700 clones se reduce a una cantidad más manejable. Esta genoteca puede usarse para explorar fenotipos en los métodos que se describen en este documento. El fenotipo resultante proporciona una descripción funcional para el gen o familia de genes u homólogos de genes del genoma de C. elegans. Como la genoteca consta de una parte de todos los genes en el genoma, este método permite la descripción del genoma completo en términos fenotípico-funcionales. Para esto es necesario introducir el ARN bicatenario (ARNbc) en el helminto. Esta introducción de clones solos o clones combinados, siendo una combinación aleatoria o combinación racional, puede conseguirse de varias formas como se describe.
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Ejemplo de un vector para la expresión de ARNi bicatenario
Puede usarse cualquier vector que contenga un promotor T7, y que contenga un sitio de clonación múltiple (hay muchos disponibles en el mercado). Se diseñan cebadores que contienen el promotor T7 y un cebador con la cadena complementaria inversa, ambos con los extremos apropiados. Estos cebadores pueden hibridarse, y si están bien diseñados, clonarse en el vector de elección. La secuencia mínima para un promotor T7 es TAATACGACTCACTATAGGGCGA. Aunque puede usarse cualquier vector para la construcción de un vector de expresión T7, a continuación hay un ejemplo de cómo conseguir esto con el vector pGEM-3zf(-).
- Se digirió el vector pGEM-3zf(+) (PROMEGA) con HindIII y SalI
- Se mezclaron juntos los cebadores oGN1 y oGN2 a una concentración final de 1 \mug/30 \mul llevados a ebullición y enfriados lentamente a temperatura ambiente.
- El cebador se ligó en el vector usando procedimientos de ligamiento convencionales. El vector resultante es pGN1 (se muestra en la Figura 1) y contiene dos promotores T7 orientados uno hacia el otro, y contiene un sitio de clonación múltiple entre medias.
Las secuencias de oGN1 y oGN2 son:
-
oGN1: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
-
oGN2: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC
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Ejemplo de la construcción de una genoteca
Puede aislarse ARN de todo organismo que sea sensible a ARNi. En general, el ARN aislado se copia después en ADNc bicatenario y posteriormente se prepara en vectores adecuados para la clonación. Existen varios procedimientos y pueden adquirirse kits de biología molecular de diversas firmas incluyendo promega, clontech, boehringer Mannheim, BRL, etc. que permiten:
- aislamiento de ARN,
- finalmente, puede aislarse ARN poliA (disponibles varias técnicas y kits)
- sintetizar la primera cadena con transcriptasa inversa de AMV, cebadores hexaméricos aleatorios y/o cebador oligo (dT)
- sintetizar la segunda cadena con ARNasa H, ADN Polimerasa I,
- nivelar los extremos con ADN Polimerasa T4
- adición de un adaptador con ADN ligasa T4
- finalmente, tratamiento con polinucleótido quinasa T4
- clonación del ADNc en el vector.
Puede considerarse la mezcla de ligamiento resultante como la genoteca de ADNc. El ligamiento contiene todo el ADNc del procedimiento ligado en el vector de interés.
Para ordenar la genoteca, el ligamiento debe transformarse en cepas de E. coli. 
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Aplicación de esta E. coli o genoteca de ADN Cepa de producción de ARN T7
- BL21 (DE3) es una cepa patrón: F-ompT[Ion]hsds(r-m-; y cepa B de E. coli) \lambda (DE3). Finalmente pueden usarse variantes de BL21 (DE3), aunque se usa BL21 (DE3)pLysS.
- es necesario construir cualquier otra cepa de E. coli que produzca la ARN polimerasa T7, que puede estar disponible. Esto puede generarse fácilmente usando un fago que esté disponible en el mercado, en este caso, se usa el vector \lambdaCE6 (proporcionado por Promega). Con este fago pueden transfectarse casi todas las cepas de E. coli y producirá ARN polimerasa T7.
- un mutante ARNasa III de E. coli:
En principio están disponibles diversas cepas, se elige usar en un primer experimento la cepa AB301-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relA1, spoT1, metB1. (Kinder et al. 1973 Mol Gen. Genet 126: 53), pero pueden adaptarse mejor otras cepas. Esta cepa se infecta con \lambdaCE6 y de esta manera se construirá una variante que produzca T7. Pueden crecer helmintos C. elegans de tipo silvestre sobre las combinaciones de bacterias. La bacteria está expresando la ARN polimerasa T7. Esto da como resultado grandes cantidades de ARNbc en el intestino del C. elegans, que se difundirán en el organismo y darán como resultado la inhibición de la expresión. Esta genoteca puede usarse ahora para la exploración de varios fenotipos. Esta técnica tiene la ventaja de que es mucho más rápida para detectar genes pertinentes en determinadas rutas que la tecnología de C. elegans conocida. Además, si se encuentra un fenotipo interesante, el gen responsable puede clonarse fácilmente. Usando la combinación jerárquica se puede encontrar fácilmente en una segunda exploración el clon pertinente de la combinación. El ADN insertado de este clon puede secuenciarse después.
Este experimento da como resultado datos genéticos y bioquímicos en una etapa.
Las cepas de C. elegans de tipo silvestre pueden combinarse con compuestos para explorar para determinar el fenotipo, resistencia a fármacos y/o sensibilidad a fármacos. La cepa de C. elegans puede ser una cepa mutante, explorando para un fenotipo aumentado, un fenotipo reducido o un nuevo fenotipo. La cepa de C. elegans puede ser una cepa mutante, y la exploración de genoteca puede combinarse con compuestos. Por tanto puede explorarse para resistencia a fármacos, sensibilidad a fármacos, un fenotipo aumentado, un fenotipo reducido o un nuevo fenotipo. La cepa de E. coli puede ser cualquier cepa que exprese ARN polimerasa T7, como BL21 (DE3), por ejemplo, pero la formación del ARN bicatenario puede potenciarse usando una cepa de E. coli especial que sea ARNasaIII negativa. La ARNasaIII reconoce bucles específicos en el ARNbc. Finalmente, puede usarse una cepa de E. coli que tenga delecionadas otras ARNasas distintas de ARNasaIII o puede usarse una E. coli que tenga delecionada una o más ARNasas. La expresión de la ARN polimerasa T7 en la mayoría de las cepas y construcciones de E. coli conocidas que están disponibles para generar cepas de E. coli que producen ARN polimerasa T7, comprenden generalmente un promotor inducible. De esta manera la producción de ARN polimerasa T7 está regulada, y por tanto la producción de ARNbc. Ventajosamente, puede usarse esta característica para "estimular" el suministro a los helmintos C. elegans en fases específicas del desarrollo. Los helmintos se desarrollan sobre las cepas de E. coli no inducidas. Cuando el helminto ha alcanzado la fase de interés, se induce la producción de ARN T7 en la bacteria. Esto permite el estudio de la función de cualquier gen en cualquier punto del ciclo biológico del animal.
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Exploración de la genoteca para homólogos de genes humanos supuestamente interesantes y asignación de función a estos genes
Se han aislado cientos de genes en diversos proyectos, siendo proyectos genómicos, matrices de expresión diferencial, estudios de hibridación, etc. La genoteca de ADNc descrita puede proporcionar un modo para validar o asignar la función a estos genes de una manera más rápida y eficaz. En primer lugar es necesario identificar el homólogo u homólogos o los genes del helminto mediante herramientas informáticas (biología in silico). Se desarrollan cebadores de PCR y el fragmento de ADNc se aísla usando tecnología de PCR. Puede realizarse PCR sobre las combinaciones jerárquicas. Los pocillos de combinación o individuales positivos que contienen la bacteria que tiene el ADNc apropiado se suministra a C. elegans y se puntúa el fenotipo.
Puede realizarse PCR sobre ADNc aislado de C. elegans. El ADN resultante puede clonarse en el vector T7 y transformarse en la E. coli que produce ARNbc de la que se alimentan después los helmintos C. elegans. Dependiendo del modo más rápido y más fiable es necesario hacer una elección.
Si el gen pertenece a una familia de genes, puede ser necesario suministrar al helminto una mezcla de bacterias. Conteniendo cada una de ellas una parte del miembro de la familia de genes. Pueden realizarse cepas de E. coli, condiciones de cultivo, combinaciones con compuestos, como las descritas anteriormente.
Si se usa la genoteca racional, en la que todos los genes de C. elegans se clonan de manera organizada y estructurada, puede rastrearse fácilmente el homólogo de C. elegans y finalmente los otros homólogos, ortólogos y miembros de la familia de genes en la genoteca usando biología in silico. En esta etapa no está implicada una PCR y puede aislarse la bacteria y/o el ADN sobre el que crecerá el helminto.
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Ejemplos
La idea de la serie de experimentos era ensayar tanto el vector de ARNi como las diversas cepas de E. coli que se construyeron.
1) Construcción de un plásmido de ensayo
Puede usarse cualquier ADNc que proporcione un fenotipo claro en el helminto cuando se anula o usado en un experimento de ARNi. Se sabe que unc-22 es un buen candidato, pero son posibles otros genes. Se optó por un sistema sensible que puede usarse en una fase posterior. El sistema se ensayó con sup-35 en un fondo pha-1. Mediante PCR se aisló el exón 5 del sup-35 y se clonó en el vector de promotor T7 pGN1. El vector resultante se denominó pGN2. Los helmintos mutantes pha-1 (e2123) no pueden producir descendientes a temperaturas superiores de 25ºC. Esto es debido a un problema del desarrollo en la embriogénesis. Cuando sup-35 está anulado, o inhibido en esta cepa, los descendientes pueden crecer a esta temperatura. La combinación de helmintos mutantes pha-1 y ARNi de sup-35 es un buen sistema para validar las diversas opciones.
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2) Ensayo del ARNi usando una cepa de E. coli que produce ARNbc
- Se introdujo pGN2 en la cepa de E. coli BL21(DE3) y se indujo la ARN polimerasa T7 con IPTG. Los helmintos C. elegans (pha-1 (e2123)) se inocularon sobre esta bacteria, y se desarrollaron a la temperatura limitada de 25ºC. Como este mutante es un mutante embrionario a esta temperatura, no se observará descendencia. Si el gen sup-35 se inhibe de manera eficaz mediante el ARNbc presente en E. coli, se observará descendencia.
- Se introdujo pGN2 en la cepa de E. coli AB301-105 (DE3) y se indujo la ARN polimerasa T7 con IPTG. Los helmintos C. elegans (pha-1 (e2123)) se inocularon sobre esta bacteria, y se cultivaron a la temperatura limitada de 25ºC. Como este mutante es un mutante embrionario a esta temperatura, no se observará descendencia. Si el gen sup-35 se inhibe de manera eficaz mediante el ARNbc presente en E. coli, se observará descendencia.
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3) Mejora de la cepa de helminto para una mejor captación de ARNbc
Antes de desarrollar en placas C. elegans pha-1 sobre la cepa E. coli que produce el ARN bicatenario de sup-35. Se modificó por mutagénesis con EMS (etílico del ácido metanosulfónico) el helminto. La descendencia de este helminto mutado se desarrolló después en placas sobre la bacteria. El helminto que se alimenta de esta bacteria produce mayor descendencia que tiene una mutación que da como resultado una mejora de la captación de ARNbc y puede usarse para experimentos adicionales.
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Integración estable del vector que produce ARNbc en el genoma del helminto que produce ARN polimerasa T7
Puede construirse un vector de E. coli que contiene las siguientes características; dos promotores T7 dirigidos uno hacia el otro, con un sitio de restricción o un sitio de clonación múltiple entre medias. Además, el vector puede contener el ADN genómico de sup35 de C. elegans, modificado por ingeniería genética de manera que contiene varios codones de terminación a diversos intervalos, para que no pueda expresarse ninguna proteína de longitud completa a partir del fragmento de ADN genómico de sup35 como se ilustra en la Figura 8. Cualquier ADNc o fragmento de ADNc puede clonarse en el sitio de clonación múltiple entre los dos promotores T7. Cuando este vector se introduce en una cepa de C. elegans que expresa ARN polimerasa T7, el ADNc o fragmento de ADNc clonado entre los dos promotores T7 se transcribirá, generando ARNbc a partir del fragmento clonado.
El vector está diseñado para usarse en helmintos mutantes pha-1 (e2123) que expresan ARN polimerasa T7. La expresión de la ARN polimerasa T7 puede ser constitutiva o regulada, general o específica de tejido. Estos helmintos pha-1 (e2123) no pueden producir descendencia a temperaturas superiores a 25ºC, debido a un problema del desarrollo en la embriogénesis. Cuando se inhibe o se anula sup-35 en esta cepa, la descendencia puede crecer a esta temperatura.
Cuando el vector se introduce en el helminto, el vector puede integrase mediante recombinación homóloga (integración de tipo Campbell). Se ha demostrado que la recombinación homóloga se produce en C. elegans, aunque a bajas frecuencias (Plasterk y Groenen, EMBO J. 11: 287-290, 1992). La recombinación homóloga en el gen sup-35 dará como resultado una anulación del gen ya que los dos genes sup-35 resultantes alojarán los codones de terminación. Si se produce esta recombinación en los huevos, el helminto resultante y su descendencia tendrán una copia del vector integrado en el genoma. Esto puede seleccionarse ya que únicamente los helmintos cuyo sup-35 se haya anulado tendrán descendencia a temperaturas superiores a 25ºC. Además, el helminto resultante producirá de manera estable ARN bicatenario a partir del fragmento de ADN clonado entre los dos promotores T7. Este helminto puede considerarse ahora como una cepa estable de helminto transgénico con una reducción de la función del gen, del que se ha clonado un fragmento entre los dos promotores T7.
Se puede proporcionar ADN al helminto mediante varias técnicas incluyendo inyección, transformación biolística, impregnación en la solución de ADN, alimentación con bacterias. Pueden considerarse métodos nuevos y otros que aumenten las eficacias de transformación.
La cepa diana de C. elegans puede tener además otras mutaciones distintas de la mutación pha-1 (e2123) y puede expresar otros genes distintos de ARN polimerasa T7.
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Ejemplo B Vector de ARNi de doble híbrido en levadura
Puede construirse un vector de doble híbrido en levadura que aloje los dos promotores T7. Los vectores pueden diseñarse para replicarse tanto en levaduras como en E. coli. En general se preparan genotecas de ADNc para el sistema de doble híbrido en levadura en los vectores Ga14 o LexA. La genoteca se construye en vectores que tienen el dominio de activación de uno de estos genes. Puede construirse un vector que aún pueda funcionar en la exploración de doble híbrido en levadura pero que además contenga dos promotores T7 orientados uno hacia el otro con un sitio de clonación en el mismo entre medias. El orden de la secuencia en el plásmido será por tanto "estructura del plásmido, (GAL4-T7), MCS, T7, estructura". Puede usarse una genoteca de ADNc de C. elegans construida en este vector como una genoteca de doble híbrido en levadura patrón en un experimento para aislar proteínas que interaccionen con una proteína dada. Una vez aislado un clon, puede introducirse el plásmido en una cepa de E. coli que exprese la ARN polimerasa T7 y, por lo tanto, producirá ARNbc a partir del fragmento clonado. La bacteria que produce esta ARNbc puede suministrarse al helminto y pueden puntuarse los fenotipos. Como en el ejemplo anterior, este procedimiento de validación para un clon de doble híbrido en levadura recién aislado es notablemente más corto que el procedimiento convencional, que requiere etapas de clonación y/o PCR, experimentos de ARN y/o experimentos de anulación. En la mayoría de los casos los clones aislados se secuencian primero, y en base a la secuencia, se toma una decisión para continuar con experimentos adicionales. Cada clon aislado puede introducirse fácilmente en la E. coli apropiada y suministrarse al helminto. Después se realiza la validación mediante el análisis del fenotipo.
Para aplicar este procedimiento se realizó un doble híbrido en levadura usando un gen conocido como cebo y la genoteca recién construida como diana. Las proteínas codificadas por los clones en la diana que interaccionan con la proteína cebo, darán como resultado clones de levadura positivos que expresan la molécula indicadora de modo que puede observarse mediante tinción de LacZ con X-gal. El plásmido que codifica la proteína diana se aísla directamente a partir de la cepa de levadura y se introduce en E. coli. La E. coli es E. coli productora de ARN polimerasa T7. En este caso, se produce un ARN bicatenario a partir del ADN clonado en el sitio de clonación múltiple del vector. Cuando este ARNbc se suministra al helminto usando los métodos descritos anteriormente, el gen se ha inhibido en el helminto, dando como resultado un fenotipo particular.
- Este vector de doble híbrido en levadura puede usarse ventajosamente para construir una genoteca ordenada y combinada jerárquicamente como se ha descrito en el ejemplo anterior.
- También puede construirse una cepa de levadura que produce de forma condicionada ARN polimerasa T7. Después de los experimentos de doble híbrido en levadura, podría inducirse la expresión de la polimerasa T7, dando como resultado la producción de ARNbc en la célula de la levadura. Por consiguiente, la levadura podría suministrarse al helminto. Se dispone de pruebas que demuestran que los helmintos de C. elegans pueden alimentarse de levaduras.
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Construcción de una cepa productora de ARN polimerasa T7 y aplicaciones de la misma
Puede construirse una cepa de C. elegans que exprese ARN polimerasa T7. La expresión puede ser general y constitutiva, pero también podría estar regulada bajo un promotor específico de tejido, un promotor inducible, o un promotor temporal o un promotor que incluya una de estas características o una combinación de características. Puede introducirse ADN en esta cepa de C. elegans. Esto se hace por inyección, por bombardeo con partículas, por electroporación o como se ha mencionado anteriormente por alimentación. Si el ADN es un plásmido como se ha descrito en los ejemplos anteriores, es decir un plásmido que aloja un fragmento de ADNc clonado o un fragmento de PCR entre dos promotores T7 flanqueantes, entonces el ARNbc de este ADNc o fragmento de PCR se forma en la célula u organismo completo dando como resultado la regulación negativa del gen correspondiente. El ADN introducido puede tener una regulación negativa transitoria eficaz. El ADN introducido puede formar una matriz extracromosómica, pudiendo dicha matriz dar como resultado una anulación o reducción más catalítica de fenotipo funcional. El plásmido también podría integrarse en el genoma del organismo, dando como resultado la misma anulación o reducción catalítica de fenotipo funcional, pero transmitiéndose de forma estable.
- Mediante técnicas convencionales puede introducirse en el helminto con ARN polimerasa T7 un ADN plasmídico que aloja un ADNc o una parte de un ADNc o una EST o un fragmento de PCR de C. elegans clonado entre dos promotores T7 como se ha descrito en los ejemplos A) y B). Pueden analizarse los fenotipos. ADN de una genoteca ordenada y combinada como en el ejemplo A) puede introducirse en el helminto con ARN polimerasa T7, mediante técnicas convencionales (inyección, bombardeo). Pueden analizarse los fenotipos. Con la combinación jerárquica, el clon original puede encontrarse fácilmente.
- Puede realizarse el mismo procedimiento con un helminto mutante que expresa la ARN polimerasa T7. Explorando para fenotipos aumentados, reducidos o nuevos.
- Puede usarse el procedimiento para permitir la exploración de compuestos. Explorar con cualquier cepa de tipo silvestre o una cepa mutante para fenotipos aumentados o nuevos.
- El ADN podría introducirse en el helminto mediante nuevos métodos. Siendo uno de ellos el suministro de ADN mediante E. coli. En este caso la genoteca combinada jerárquicamente se suministra al animal. Para impedir la digestión del ADN de E. coli en el intestino del nematodo, se usará preferentemente un C. elegans deficiente en ADNasa, tal como nuc-1 (e1392). Este procedimiento sería uno de los más interesantes ya que sería independiente de las eficacias de transformación de otras técnicas, y generalmente más rápido y menos laborioso.
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2) Supuestas mejoras del método
- Se diseña un vector para que contenga el ADNc de sup-35 o una parte de este ADNc, clonado entre dos promotores T7. El resto del vector es como se ha descrito en los ejemplos A) y B). Este vector puede introducirse en un C. elegans mutante pha-1ts. En este caso existe un sistema de selección por temperatura y únicamente aquellos helmintos que hayan captado el ADN y expresen el ARN bicatenario de sup-35 sobrevivirán a temperaturas limitadas. La genoteca combinada jerárquicamente puede suministrarse mediante cualquier método descrito anteriormente.
- El vector puede usarse para construir una genoteca que se introduce en una E. coli que expresa ARN polimerasa T7. En este caso se tiene una exploración análoga a la de la parte A) con una exploración adicional para helmintos en los que sea activo el ARNbc de sup-35.
- El ADN y/o ARNbc de sup-35 podría suministrarse en un plásmido diferente. Para el suministro, tanto suministro de ADN (Ejemplo C) como suministro de ARNbc, Ejemplos A) y B), esto significa que los dos plásmidos podrían estar presentes en una bacteria, o que al helminto se le suministra una mezcla de bacterias, conteniendo una de ellas la construcción de sup-35.
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Ejemplo de la construcción de un C. elegans productor de ARN T7
Para producir ARN polimerasa T7 en el helminto, son posibles varias posibilidades. La polimerasa T7 puede expresarse bajo diversos promotores, siendo promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores generales y promotores específicos (de célula) de tejido, o combinaciones de los mismos. Los ejemplos de estos promotores son el promotor de choque térmico hsp-16, el promotor intestinal ges 1, el promotor de cet858, pero también el promotor de dpy7 y el elemento promotor GATA1. En este ejemplo la ARN polimerasa T7 se expresa bajo el control del promotor hsp-16 que está disponible en el vector pPD49.78. La ARN polimerasa T7 se aísla como un producto de PCR usando los cebadores GN3 y GN4.
El producto de PCR resultante se digiere con NheI y NcoI, al igual que el vector en el que se quiere clonar, siendo el vector Fire pPD49.78. El vector resultante es pGN100 ilustrado en la Figura 2. Se incluyen oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC y oGN4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG de pGN100.
El vector se introduce en el helminto usando técnicas convencionales, tales como, por ejemplo, microinyección.
Después se construyeron las siguientes cepas:
-
Tipo silvestre (pGN100)
-
nuc-1 (e1392) (pGN100)
-
pha-1 (e2123) (pGN100)
-
pha-1; nuc-1 (pGN100)
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Todas estas cepas son capaces de producir ARN polimerasa T7 cuando se inducen por temperatura o de manera alternativa mediante metales tal como aplicación de cadmio o mercurio pesado. El procedimiento para inducción por temperatura es cambiar al animal a una temperatura de 30-33ºC durante al menos una hora, después el animal puede cambiarse de nuevo a temperaturas convencionales (15-25ºC).
La cepa de tipo silvestre que produce ARN polimerasa T7 puede usarse para la producción de cualquier ARN en el helminto. Más específicamente, los plásmidos de las genotecas descritas pueden introducirse en estos helmintos y pueden puntuarse los fenotipos.
El helminto mutante nuc-1 se usará para introducir el ADN a través de la bacteria de la que se alimenta el helminto. Como el helminto nuc-1 no digiere el ADN, el ADN plasmídico puede atravesar la pared intestinal. Si se capta por las células que producen la ARN polimerasa T7, se producirá ARNbc, inhibiendo de esta manera el gen a partir del que se transcribió el ARN.
Puede usarse la cepa mutante pha-1 que producía ARN polimerasa T7 para mejorar los procedimientos que se han descrito anteriormente. Puede introducirse ADN mediante bombardeo, microinyección o alimentación. Más específicamente, puede usarse esta cepa para los vectores que producen ARNbc a partir de sup-35 y a partir del gen de interés, pudiendo ser este último un producto de PCR, un ADNc o una genoteca como se ha descrito.
Para el suministro bacteriano del ADN puede usarse el mutante pha-1; nuc-1 que produce ARN polimerasa T7. Preferentemente el ADN será el plásmido que produce ARNbc tanto a partir de sup-35 como del gen de interés. Preferentemente la cepa de helminto producirá la ARN polimerasa T7 en el intestino. Preferentemente, el suministro se producirá por alimentación del helminto sobre la bacteria que aloja el plásmido.
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Aplicación de la tecnología ARNi en plantas
Los nematodos son responsables de una gran parte del daño inflingido en plantas y, más particularmente, en plantas usadas en la industria agrícola. Pueden aplicarse a plantas los procedimientos de ARNi de acuerdo con la invención para impedir que estos nematodos parasitarios se sigan alimentando. En una primera etapa, se aísla del nematodo parasitario de plantas un fragmento de ADN que es fundamental para la supervivencia o desarrollo de los animales, o para alimentarse o proliferar. Cualquier gen cuya expresión sea esencial es adecuado para este propósito.
Se clona una parte de este gen, un exón o ADNc. Este fragmento de ADN puede clonarse bajo la influencia de un promotor específico de tejido, preferiblemente un promotor específico de raíz, incluso más preferiblemente entre dos promotores específicos de raíz. Usando tecnología transgénica de plantas, puede introducirse en la planta de interés el ADN del gen clonado bajo el control del promotor específico de raíz. Para cada nematodo parásito, puede ser necesario un trozo diferente de ADN y, así mismo, será necesario un promotor diferente para cada estirpe de planta.
La raíz producirá ARN o ARNbc a partir del trozo de ADN introducido cuando se utiliza un promotor específico de raíz. Como el nematodo se alimenta de la planta, el nematodo consumirá o ingerirá el ARN y/o ARNbc. El ARN y/o ARNbc pueden introducirse en las células del nematodo y realizar su acción inhibidora sobre el ADN diana. Dependiendo de la naturaleza del trozo de ADN del helminto clonado, el nematodo no será capaz de sobrevivir, alimentarse, proliferar, etc. en ningún caso, impidiendo que el animal se siga alimentando de la planta, y protegiendo de esta manera la planta.
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Construcción de un C. elegans productor de ARN polimerasa T7
Para producir una ARN polimerasa T7 u otras ARN polimerasas en animales, y más particularmente en nematodos y más particularmente en C. elegans, pueden considerarse varias posibilidades. La ARN polimerasa T7 puede expresarse bajo diversos promotores. Estos promotores pueden ser promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores generales, promotores específicos de tejido, o combinaciones de estos.
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Ejemplo 1 Construcción de un vector básico para la expresión de polimerasa T7 en C. elegans
A partir de \lambda CE6 (Novagen, Madison, Estados Unidos) se amplificó por PCR la secuencia codificante de la polimerasa T7 usando los cebadores oGN26 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) y oGN46 (CTCACCGG
TAATGAACACGATTAACATCGC), usando procedimientos convencionales (PCR, A practical approach, 1993, Ed. J. McPherson, et al, IRL Press). El fragmento de ADN resultante que codifica la ARN polimerasa T7 se digirió con AgeI y EcoRI y se insertó en el vector Fire pPD97.82 digerido con AgeI y EcoRI. La construcción resultante codifica una fase de lectura abierta de la ARN polimerasa T7 en fusión con la señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40 con la secuencia de aminoácidos MTAPKKKRKVPV. Esta secuencia señal de localización nuclear es necesaria para translocar la ARN polimerasa T7 del citoplasma al núcleo, donde es capaz de unirse a sus promotores específicos, denominados promotores de T7. Cadena arriba de la secuencia codificante de la proteína de fusión de polimerasa T7 hay un promotor mínimo (myo-2) precedido por un sitio de clonación múltiple (MCS) en el que pueden insertarse varios promotores de C. elegans. Este plásmido (pGN105 que se muestra en la Figura 11) es un plásmido de ARN polimerasa T7 básico que permite la expresión de la polimerasa T7 en C. elegans. Los derivados de este plásmido en los que se clonan promotores en el sitio de clonación múltiple permiten la expresión inducible, constitutiva, general y específica de tejido de la ARN polimerasa T7 en C. elegans, ya que la expresión estará regulada por el promotor clonado en el sitio de clonación múltiple.
Aunque no se limita a estos ejemplos, se sabe que los siguientes promotores inducen la expresión en los siguientes tejidos.
let-858 (expresión ubicua), myo-2 (expresión en faringe), myo-3 (músculos de la pared corporal), egl-15 (músculos vulvares), unc-119 (pan-neuronal).
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Ejemplo 2 Construcción de un vector para la expresión de ARN polimerasa T7 en el tejido muscular de C. elegans
La secuencia codificante de la ARN polimerasa T7 se amplificó por PCR a partir de \lambda CE6 usando los cebadores oGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) y oGN44 (CACTCAGTGGGCCCTTACG
CGAACGCGAAGTCCG) digeridos con AgeI/SpeI e insertados en el vector pGK13 digerido con AgeI/SpeI. (Este vector contiene el promotor fuerte SERCA que dirige la expresión en la faringe, el músculo vulvar, músculo de la cola y de la pared corporal). Se insertó una señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40 en frente de la secuencia codificante de la polimerasa T7 por inserción de dos oligonucleótidos solapantes oGN45 (CCG
GATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) y oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) en los sitios de restricción SacI/AgeI. La construcción resultante se denominó pGN108, como se muestra en la Figura 10. La introducción de este plásmido en C. elegans da como resultado la expresión de la ARN polimerasa T7 en la faringe, músculo vulvar, músculos de la cola y de la pared corporal.
Para ensayar la expresión y la funcionalidad de la ARN polimerasa T7 en C. elegans bajo la regulación del promotor SERCA, se inyectó pGN108, que codifica la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor SERCA, en C. elegans. Se coinyectó un vector de ensayo. Este vector de ensayo codifica GFP bajo el control de un promotor T7 (pGN401 en la Figura 13). Se construyó el plásmido pGN401 insertando dos oligonucleótidos solapantes oGN41 (CCCGG
GATTAATACGACTCACTATA) y oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) en el vector Fire pPD97.82 abierto con SacI/AgeI, generando un promotor T7. Además se coinyectó un marcador de selección para seleccionar los transformantes (rol6, pRF4). El último vector de selección pRF4 es bien conocido para el especialista en la técnica. La F1 transgénica podía aislarse fácilmente ya que muestran el fenotipo rol 6. Estos C. elegans transgénicos expresaban todos GFP en la faringe, el músculo vulvar, el músculo de la cola y de la pared corporal. Estos datos muestran claramente que la ARN polimerasa T7 se expresa funcionalmente bajo la regulación del promotor SERCA, y que la ARN polimerasa T7 expresada se une al promotor T7 presente en pGN401 e inicia la transcripción del gen GFP, que después se expresa funcionalmente, dando como resultado fluorescencia en los tejidos musculares donde SERCA está induciendo la expresión de la ARN polimerasa T7.
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Ejemplo 3 Construcción de un vector para la expresión ubicua de polimerasa T7 en C. elegans
El gen de fusión de NLS-ARN polimerasa T7 se aisló a partir de pGN108 con XmaI/Bsp1201 y se clonó en el vector Fire pPD103.05 digerido con XmaI/Bsp1201. Esto da como resultado un vector en el que la ARN polimerasa T7 se clona bajo la regulación del promotor let858. Este promotor específico permite la expresión de ARN polimerasa T7 en todos los tejidos. El plásmido resultante se denominó pGN110 (Figura 14).
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Ejemplo 4 Construcción de un vector para la expresión mediada por ARN polimerasa T7 de fragmentos de ADN, genes y ADNc bajo el control de un promotor T7
Se digirió el vector Fire pPD97.82 con SacI/AgeI y se generó una secuencia de promotor T7 por inserción de dos oligonucleótidos solapantes oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) y oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCG
TATTAATCCCGGGAGCT) en los sitios de endonucleasas de restricción SacI/Age. Esta construcción (pGN400 Figura 12) contiene una fase de lectura abierta de GFP clonada entre los sitios de endonucleasas de restricción SacI y EcoRI bajo la regulación del promotor T7. En este vector puede clonarse cualquier gen, ADNc o fragmento de ADN por deleción del gen de GFP como un fragmento AgeI/SacI y clonando el fragmento de ADN de interés dentro del vector. Preferentemente el fragmento de ADN de interés puede obtenerse por amplificación por PCR, insertando los sitios SacI/AgeI en los cebadores. El fragmento de ADN resultante después de la amplificación por PCR el digerido y el gen de GFP en pGN400 se reemplaza por el fragmento de ADN amplificado. Todos los vectores que contengan un promotor T7 pueden usarse para el propósito de la expresión inducida por ARN polimerasa T7 en C. elegans, tales como los vectores pGEM y los vectores pBluescript disponibles en el mercado. Esto se demuestra claramente por el vector pGN401 que expresa GFP bajo la regulación del promotor T7 en un C. elegans transgénico que expresa ARN polimerasa T7.
El uso de pGN400 tiene la ventaja de que el vector incluye un fragmento 3' UTR de unc-54 que potencia la transcripción o la estabilidad del ARN.
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Generación de líneas permanentes de C. elegans con ARNi "pseudo knock-out" específico de tejido
En la actualidad, se obtienen C. elegans con genes anulados (knock out) después de mutagénesis aleatoria a gran escala y selección sib (selección de individuos morfológicamente iguales y genéticamente diferentes) basada en PCR. Este método es engorroso, consume mucho tiempo y es tedioso. Se ha descrito que introduciendo ARN bicatenario en una célula da como resultado una interferencia potente y específica de la expresión de genes endógenos. En C. elegans la expresión génica puede regularse negativamente inyectando ARN en la cavidad corporal del helminto, impregnando el helminto en una solución que contiene ARNbc o suministrándole E. coli que expresa el ARNbc correspondiente al gen de interés. Las células de C. elegans tienen la capacidad de captar ARNbc de su medio extracelular. Se ha descrito que el ARNm es la diana de esta interferencia genética mediada por ARNbc (Montgomery y Fire 1998). También se ha sugerido que el ARN diana se degrada en el núcleo antes de que pueda ocurrir la traducción. Aunque la reducción mediada por ARNi de la expresión génica puede pasarse a las siguientes generaciones, la heredabilidad es escasa y el efecto se pierde rápidamente en descendientes posteriores. Esto es probablemente debido a una disminución continua de la combinación de ARNbc. Se propone en este documento un método para construir líneas de C. elegans con un fenotipo ARNi permanente heredable. El método incluye la generación de líneas de C. elegans transgénicas introduciendo plásmidos que contienen fragmentos de ADNc del gen diana en orientación sentido y antisentido bajo el control de un promotor de helminto o mediante la transcripción de una repetición invertida del ADNc a partir de una sola construcción. Como alternativa, puede transcribirse ARNbc de un vector que aloja un ADNc flanqueado por dos promotores T7 en una cepa de C. elegans que expresa polimerasa T7. El resultado es un 3helminto transgénico con un fenotipo "pseudo-knock-out" estable heredable. La expresión del ADNc o de la polimerasa T7 puede ser general y constitutiva pero también podría regularse bajo un promotor específico de tejido. Al contrario que el ARNi inducido por ARNibc externo (inyectado, impregnado o suministrado) este método permitiría obtener la inhibición condicional específica de tejido de la expresión de genes.
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La inhibición de la expresión de unc-22 por interferencia con ARN da como resultado un fenotipo "inestable"
Se clonó ADNc de unc 22 (exón 22) en orientación sentido y antisentido en pPD103.05 (A. Fire Nº L2865) que contenía el promotor let 858 que es capaz de expresar secuencias de ARN en todos los tejidos. Los plásmidos resultantes se denominaron pGN205 (Figura 19a) y pGN207 (Figura 19b). Estas construcciones se introdujeron en C. elegans junto con un marcador de selección (rol-6; GFP). Los individuos transgénicos de la F1 (que expresan rol-6 o GFP) mostraron un fenotipo "inestable" indicando que el ARNi podría estar mediado por la transcripción endógena de ARN a partir de ADN transgénico. El fenotipo ARNi cosegregaba con el marcador de selección en descendientes posteriores. Esto dio como resultado la generación de líneas de C. elegans con fenotipo ARNi permanente.
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Generación de líneas estables con líneas de ARN polimerasa T7 y generación de helmintos dobles transgénicos
Un sistema de expresión en C. elegans basado en una ARN polimerasa exógena demanda dos plásmidos. Uno está codificado por la ARN polimerasa bajo el control de un promotor específico, mientras que el otro plásmido codifica el fragmento de ADN a expresar, bajo la regulación del promotor T7. En el caso de ARNi semiestable, también denominados knock out pseudoestables, el ADN de interés se clona entre dos promotores T7 para que pueda producirse ARNbc.
Como se sabe que el sistema de expresión de ARN polimerasa T7 es un sistema de alta expresión esto dará como resultado problemas para generar animales doblemente transgénicos. Si el gen a expresar en el nematodo C. elegans es tóxico, esto dará como resultado efectos letales y, por lo tanto, la construcción de un C. elegans sin expresión estable altamente regulada del gen de interés. Si el gen de interés es esencial para la supervivencia del organismo, el ARNi con un fragmento de ADN de este gen también dará como resultado efectos letales, de manera que no son posibles knock out pseudoestables.
Para solucionar este problema los presentes inventores han diseñado un sistema que consiste en dos animales transgénicos. El primer animal es transgénico para la ARN polimerasa T7. Esta ARN polimerasa T7 puede expresarse en todas las células o en células o tejidos específicos como se ha demostrado en ejemplos anteriores. El segundo animal transgénico es transgénico para el fragmento de ADN de interés. Este puede ser un gen o ADNc unido a un promotor T7, o si se quiere realizar ARNi, un fragmento de ADN de dicho gen clonado entre dos promotores T7.
Ambos animales transgénicos son viables y no muestran fenotipo anormal. Esto es porque la ARN polimerasa T7 expresada en el primer organismo transgénico no es tóxica para el organismo, incluso si se expresa a niveles relativamente altos. En el segundo organismo transgénico, el gen de interés no se expresa o el ARNbc no se produce ya que estos animales transgénicos no contienen la ARN polimerasa T7.
La expresión del gen o ADNc de interés o ARNi con un fragmento de ADN puede obtenerse ahora por apareamiento de los dos animales transgénicos. La descendencia de estos es doblemente transgénica y expresan el gen de interés o expresan ARNbc o el fragmento de ADN de interés. Para generar suficientes machos en dicho apareamiento, uno de los animales transgénicos machos puede ser un mutante de C. elegans con un fenotipo que favorezca la generación de machos. Un Ejemplo de dicho mutante es him-5. Preferentemente, dicho mutante se usará para generar un C. elegans transgénico para ARN polimerasa T7, mientras que el hermafrodita contiene el fragmento de ADN bajo la regulación del promotor T7.
Para seleccionar de manera eficaz la descendencia doble transgénica puede introducirse un segundo transgén en el segundo animal transgénico. Este transgén contiene un gen indicador bajo la regulación del promotor T7. El gen indicador puede ser GFP, luciferasa, beta-galactosidasa o beta-lactamasa, siendo un ejemplo de dicho transgén los vectores pGN400 y pGN401.
Para obtener la expresión inducible específica de tejido de un transgén en C. elegans se puede generar una reserva de machos (es decir, him-5) que lleven la construcción de polimerasa T7 bajo el control de diferentes promotores de C. elegans que permiten la expresión específica de tejido como tal. Estos machos pueden cruzarse con hermafroditas que lleven el gen de interés bajo el control del promotor T7.
Además, los transgenes pueden integrarse en el genoma del animal. Se han descrito métodos para generar la integración estable de un plásmido en el genoma del animal (Methods in cell biology, Vol. 48, 1995, ed. por Epstein y Shakes, Academic Press) e implica la radiación del animal.
Esto puede hacerse para ambos animales, pero preferentemente, los animales que expresan la ARN polimerasa T7 se someten a dicho tratamiento. Esto da como resultado una colección de nematodos C. elegans que expresan de forma estable la ARN polimerasa T7 bajo el control de diversos promotores, siendo ejemplos de dichos promotores el myo-2 (expresión en faringe), myo-3 (músculos de la pared corporal), egl-15 (músculos vulvares), unc-119 (pan-neuronal), SERCA (músculos), let858 (todas las células), ges-1 (intestino).
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Construcción de vectores de doble híbrido en levadura del promotor T7 de ARNi pGAD424 con T7/T3 y/o Sp6 directo e indirecto
En la mayoría de los experimentos de doble híbrido se clona una genoteca de ADNc en el plásmido pGAD424 (Figura 16) que se ha modificado por ingeniería genética con sitios de restricción adicionales en el polienlazador tal como un sitio NcoI (Clontech). Esta genoteca permite la exploración de proteínas de unión en un experimento de doble híbrido en levadura. Se construyó un nuevo vector de doble híbrido en levadura con las mismas posibilidades para realizar doble híbrido en levadura, pero que contienen dos promotores T7 adicionales, de manera que el vector puede usarse para knock out pseudo estables inducidos por ARN polimerasa T7. Para esto se insertó un T7 directo usando un enlazador de T7 (que consiste en los siguientes cebadores aattcttaatacgactcactatagggcc y catgggccctatagtgagtattaag) en el sitio EcoRI-NcoI de pGAD424. El vector resultante se denominó pGAD424-without-FULL-ICE-both-T7. Se tuvo cuidado de eliminar los codones de terminación y usar aminoácidos de máxima compatibilidad con el polienlazador. Se adoptó la misma estrategia para el T7 inverso (que consistía en ambos cebadores gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcg
tattactgca y gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) con BamHI y PstI. Para evitar la pérdida de SalI, se incluyó este sitio en el cebador.
El sitio SalI es importante ya que la mayoría de las genotecas se clonan en este sitio, se dispone de adaptadores. Esto hace al vector recién construido compatible con vectores existentes.
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pAS2 con T7/T3 y/o Sp6 directo e inverso
Se construyó un vector de doble híbrido en levadura análogo basado en pAS2 (Clontech). Mediante digestión parcial con EcoRV se fue capaz de eliminar una parte significativa del gen cyh2. La construcción correcta puede aislarse y revisarse mediante una digestión de restricción con BgIII. Este sitio de restricción está presente en el fragmento EcoRV de PAS2 a eliminar. Esto elimina el gen cyh2 que es un gen ligeramente tóxico y que está implicado en el retraso del crecimiento. Este gen no es esencial para la realización del ARNi y los experimentos de doble híbrido en levadura. Después de la eliminación del fragmento EcoRV, el sitio de restricción EcoRI que se localiza entre la secuencia de ADN que codifica GAL4BD y HA (epítopo) se vuelve única para el plásmido, y puede usarse para sustituir HA con un enlazador que contiene el promotor T7. Esto asegura la persistencia de todos los sitios de restricción, permitiendo tanto la clonación en fase de lectura como la compatibilidad con vectores previos y pGAD424. Se usaron los siguientes enlazadores (cebadores: aattcttaatacgactcactatagggca y tatgccctatagtgagtcgtat
taag) usando sitios de clonación EcorI y NdeI. Se adoptó la misma estrategia para el T7 inverso (cebadores: gatccgtc
gacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatagtgagtcgtattaag y gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) con BamHI y PstI. Para evitar la pérdida de SalI se incluyó en el cebador. El vector resultante se denominó pAS1-cyh2-HA+both
T7-final.
Tener el promotor T7 (o de manera alternativa el promotor T3 o SP6) en pGAD424 permite ir rápidamente de la proteína que interacciona al ARNi y asignar una función al fragmento de ADN aislado. Una ventaja adicional es la capacidad de generar mediante transcripción in vitro acoplada a traducción in vitro (hay un ATG en fase de lectura con GAL4DB o GAL4AD) una proteína marcada que puede usarse para controles in vitro (por ejemplo ensayos de inmunoprecipitación) de la interacción proteína-proteína real.
Las secuencias de los plásmidos producidos y la polimerasa SP6 y T3 se identifican en la Lista de Secuencias proporcionada a continuación:
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 1
ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6
Número de acceso Swissprot P06221
Secuencia de proteína:
1 
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SECUENCIA ID Nº: 2
ARN polimerasa dependiente de ADN de T3
Número de acceso Swissprot P07659
Secuencia de proteína:
2 
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 3
pGN108
Secuencia de ácido nucleico:
3
4 
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 4
pGN105
Secuencia de ácido nucleico:
5
SECUENCIA ID Nº: 5
pGN400
Secuencia de ácido nucleico:
7 
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 6
pGN401
Secuencia de ácido nucleico:
8 
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 7
pGN110
Secuencia de ácido nucleico:
9
10
SECUENCIA ID Nº: 8
pAS2-cyh2-HA+bothT7-final
Secuencia de ácido nucleico:
12
13 
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 9
pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7
Secuencia de ácido nucleico:
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14
15 
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 10
pGN205
Secuencia de ácido nucleico:
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16
17 
\newpage
SECUENCIA ID Nº: 11
pGN207
Secuencia de ácido nucleico:
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18
19

Claims (7)

1. Un método para mitigar una infestación por plagas de plantas, comprendiendo dicho método
a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que sea crítica para su supervivencia, desarrollo, proliferación,
b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en una orientación respecto a un promotor o promotores, de modo que dicho promotor o promotores sea capaz de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores y
c) introducir dicho vector en la planta
en el que la plaga de plantas es una plaga de plantas que se alimenta de la planta.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN se proporciona entre dos promotores, de modo que la unión del factor de transcripción a los promotores da como resultado la transcripción del ADN en ARNbc.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia de ADN se proporciona en una orientación sentido y antisentido respecto a dicho promotor, de modo que la unión del factor de transcripción al promotor da como resultado la transcripción del ADN en ARNbc.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha plaga es un helminto nematodo.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho nematodo comprende cualquiera de Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmenniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchs ssp.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma se clona entre dos tejidos, preferiblemente promotores específicos de raíz.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para mitigar una infestación parasitaria de plantas.
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Families Citing this family (253)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
HU230353B1 (hu) 1998-03-20 2016-02-29 Benitec Australia Ltd A génexpresszió szabályozása
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
EP1147204A1 (en) * 1999-01-28 2001-10-24 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
BR0009884A (pt) * 1999-04-21 2002-01-08 American Home Prod Processos e composições para a inibição da função das sequências de polinucleotìdeos
US6924109B2 (en) * 1999-07-30 2005-08-02 Agy Therapeutics, Inc. High-throughput transcriptome and functional validation analysis
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
GB9930691D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2002094185A2 (en) 2001-05-18 2002-11-28 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
AU2001245793A1 (en) 2000-03-16 2001-09-24 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
ES2336887T5 (es) 2000-03-30 2019-03-06 Whitehead Inst Biomedical Res Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN
GB2362383B (en) * 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
US7083947B2 (en) 2000-05-19 2006-08-01 Devgen Nv Assay techniques using nematode worms
GB0012233D0 (en) * 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Vector constructs
GB0012229D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Lipid uptake assays
WO2001096584A2 (en) * 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
WO2002044321A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
IL157087A0 (en) * 2001-01-25 2004-02-08 Virxsys Corp A method for identifying a function of a gene sequence
EP1354035B1 (en) 2001-01-26 2016-08-24 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
US20020132257A1 (en) 2001-01-31 2002-09-19 Tony Giordano Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
CA2434881A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-15 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Method for identifying functional nucleic acids
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003070887A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2003070884A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1412371B1 (en) 2001-07-12 2016-02-24 University of Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
DE60236095D1 (de) 2001-08-31 2010-06-02 Riken Wako PFLANZENSYSTEM ZUR UMFASSENDEN GENFUNKTIONSANALYSE UNTER VERWENDUNG EINER VOLLÄNGEN-cDNA
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
US20030150017A1 (en) * 2001-11-07 2003-08-07 Mesa Jose Ramon Botella Method for facilitating pathogen resistance
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
EP1572902B1 (en) * 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
DE60337040D1 (de) 2002-02-01 2011-06-16 Life Technologies Corp Oligonukleotid-Zusammensetzungen mit verbesserter Wirksamkeit
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
AU2003219833A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070966A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
AU2003213057A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Incoporated Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
AU2003228667A1 (en) * 2002-04-22 2003-12-19 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
WO2003095652A2 (de) * 2002-05-08 2003-11-20 Xantos Biomedicine Ag EXPRESSIONSKONSTRUKTE ZUR HERSTELLUNG VON DOPPELSTRANG (ds) RNA UND DEREN ANWENDUNG
AU2003239706A1 (en) * 2002-05-23 2003-12-12 Devgen Nv Method for determining the influence of a compound on cholesterol transport
CN1662652B (zh) * 2002-06-21 2011-05-25 北京诺赛基因组研究中心有限公司 随机化的dna文库和双链rna文库,其用途及生产方法
AU2003247951A1 (en) * 2002-07-10 2004-01-23 Kansas State University Research Foundation Compositions and methods for controlling parasitic nematodes
US7655790B2 (en) 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
DK3222724T3 (en) 2002-08-05 2018-12-03 Silence Therapeutics Gmbh ADDITIONALLY UNKNOWN FORMS OF INTERFERRING RNA MOLECULES
US8729036B2 (en) 2002-08-07 2014-05-20 University Of Massachusetts Compositions for RNA interference and methods of use thereof
CA2497892A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-18 Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided T Rinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Compositions and methods for tissue specific or inducible inhibition of gene expression
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1613723B1 (en) 2002-11-27 2013-05-15 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods for sequence variation detection and discovery
EP1597361A2 (en) * 2002-12-23 2005-11-23 Devgen NV Kinase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases and nucleotide sequences encoding such kinase sequences
EP1622572B1 (en) 2003-04-30 2017-12-20 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
IL155783A (en) 2003-05-05 2010-11-30 Technion Res & Dev Foundation Multicellular systems of multi-potential embryonic human stem cells and cancer cells and their use
US7619068B2 (en) 2003-05-09 2009-11-17 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
AU2005212433B2 (en) 2003-05-23 2010-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sINA)
US20070092910A1 (en) * 2003-06-17 2007-04-26 Devgen Nv Alcohol dehydrogenase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases
US9394565B2 (en) 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
US20060272049A1 (en) * 2003-11-17 2006-11-30 Waterhouse Peter M Insect resistance using inhibition of gene expression
JP4682152B2 (ja) 2003-12-31 2011-05-11 ザ・ペン・ステート・リサーチ・ファンデーション 卵巣がんの化学療法に対する抵抗性を予測および克服するための方法ならびに結腸がんの発生を予測するための方法
WO2005078848A2 (en) 2004-02-11 2005-08-25 University Of Tennessee Research Foundation Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase dnazymes
US7622301B2 (en) * 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
CN101233240A (zh) 2004-03-26 2008-07-30 斯昆诺有限公司 与质量分析结合的甲基化特异性扩增产物的碱基特异性切割
ES2411965T3 (es) 2004-04-02 2013-07-09 The Regents Of The University Of California Métodos y composiciones para tratar y prevenir enfermedad asociada con integrina alfa V beta 5
PL1818405T3 (pl) 2004-04-09 2015-11-30 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby do zwalczania inwazji szkodników u roślin
AU2005238034A1 (en) 2004-04-23 2005-11-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of hairless protein mRNA
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
DE602005026811D1 (de) 2004-06-22 2011-04-21 Univ Illinois Verfahren zur inhibierung von tumorzellwachstum mit foxm1 sirns
US7968762B2 (en) 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
EP1782321A4 (en) 2004-07-23 2009-11-04 Univ North Carolina METHOD AND MATERIALS FOR DETERMINING PAIN SENSITIVITY AND PREDICTING AND TREATING SUFFERING INTERFERENCE
CA2577036A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Genesense Technologies Inc. Small interfering rna molecules against ribonucleotide reductase and uses thereof
CA2940718C (en) 2004-09-24 2019-06-18 J.R. Simplot Company Gene silencing
US20060247197A1 (en) 2004-10-04 2006-11-02 Van De Craen Marc Method for down-regulating gene expression in fungi
MX2007004310A (es) * 2004-10-13 2007-06-18 Univ Georgia Res Found Plantas transgenicas resistentes a nematodos.
EP1807522B1 (en) 2004-10-21 2013-11-20 Venganza Inc. Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants
WO2006045591A2 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Devgen N.V. Method and constructs for delivering double stranded rna to pest organisms
PL1807520T3 (pl) 2004-10-25 2013-01-31 Devgen Nv Konstrukty do RNA
DK1841793T3 (da) 2005-01-07 2010-07-19 Diadexus Inc Ovr110-antistofsammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
US8519225B2 (en) 2006-02-10 2013-08-27 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
TWI335352B (en) 2005-03-31 2011-01-01 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
JP2008540571A (ja) 2005-05-12 2008-11-20 ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション Ｐｉｎ１の遮断は活性化した免疫細胞によるサイトカイン産生を防ぐ
CA2610644A1 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Devgen Nv Rnai for control of insects and arachnids
WO2007011702A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of egfr inhibitors to prevent or treat obesity
ATE548459T1 (de) 2005-09-16 2012-03-15 Monsanto Technology Llc Verfahren zur genetischen kontrolle von insektenbefall bei pflanzen und zusammensetzungen
ATE533358T1 (de) 2005-09-16 2011-12-15 Devgen Nv Verfahren zum kontrollieren von schädlingen mittels rnai
PT2295584E (pt) 2005-09-16 2015-09-22 Devgen Nv Métodos com base em plantas transgénicas para infestações em plantas utilizando arn de interferência
EP1931789B1 (en) 2005-09-20 2016-05-04 BASF Plant Science GmbH Methods for controlling gene expression using ta-siran
US9286469B2 (en) * 2005-12-16 2016-03-15 Cisco Technology, Inc. Methods and apparatus providing computer and network security utilizing probabilistic signature generation
BRPI0706368A2 (pt) 2006-01-06 2011-03-22 Univ Georgia composição, vetor, método para fornecer resistência ao cisto nematódeo a uma planta, proteìna de fusão, método para inibir atividade biológica, ácido nucléico isolado
EP2348115A3 (en) 2006-01-12 2012-01-18 deVGen N.V. Transgenic plant-based methods for plant pests using RNAi
EP2347759B1 (en) 2006-01-12 2017-10-18 deVGen N.V. Methods for controlling pests using RNAi
US8906876B2 (en) 2006-01-12 2014-12-09 Devgen Nv Methods for controlling pests using RNAi
US20080022423A1 (en) * 2006-02-03 2008-01-24 Monsanto Technology Llc IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI
EP1984511A2 (en) * 2006-02-13 2008-10-29 Monsanto Technology LLP Selecting and stabilizing dsrna constructs
US20100068172A1 (en) * 2006-03-16 2010-03-18 Devgen N.V. Nematode Control
US8968702B2 (en) 2006-03-30 2015-03-03 Duke University Inhibition of HIF-1 activation for anti-tumor and anti-inflammatory responses
PL216037B1 (pl) * 2006-06-09 2014-02-28 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu
AU2007314477B2 (en) 2006-07-11 2012-03-29 Rutgers, The State University Of New Jersey MG53 compositions and methods of use
US20100105610A1 (en) 2006-07-28 2010-04-29 Children's Memorial Hospital Methods of Inhibiting Tumor Cell Aggressiveness Using the Microenvironment of Human Embryonic Stem Cells
EP2962697A1 (en) 2006-11-27 2016-01-06 diaDexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
CN101195821A (zh) * 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
US20100129358A1 (en) 2006-12-22 2010-05-27 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
AU2008207735B2 (en) 2007-01-26 2013-10-03 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
US20080184391A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Kuppuswamy Subramaniam Pathogen resistant transgenic plants, associated nucleic acids and techniques involving the same
CN101646769A (zh) 2007-02-20 2010-02-10 孟山都技术公司 无脊椎动物微rna
US8796442B2 (en) 2007-03-21 2014-08-05 Brookhaven Science Associates, Llc. Combined hairpin-antisense compositions and methods for modulating expression
EP2377952A1 (en) 2007-04-26 2011-10-19 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for diagnosing and treating astrocytomas
WO2008137115A1 (en) 2007-05-03 2008-11-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
EP2171078B1 (en) 2007-06-29 2016-08-10 Boston Biomedical, Inc. Enabling the use of long dsrna for gene targeting in mammalian and other selected animal cells
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2009012263A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
CA2695455C (en) 2007-08-14 2019-01-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved gene silencing methods
KR101142209B1 (ko) 2007-09-22 2012-05-04 재단법인서울대학교산학협력재단 섭취 ＲＮＡｉ를 이용한 꼬마선충에서 두 유전자의동시발현 억제방법
US7968525B1 (en) 2007-12-03 2011-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control
EP2283133A2 (en) 2008-04-04 2011-02-16 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of epas1 inhibitors
US8901373B2 (en) 2008-04-10 2014-12-02 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for root knot nematode control
GB0807018D0 (en) 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
WO2010054221A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 The Johns Hopkins University Treatment of chronic inflammatory respiratory disorders
EP2352847B1 (en) 2008-11-10 2014-01-08 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Gene signature for predicting prognosis of patients with solid tumors
DK2379722T3 (da) 2008-12-16 2017-01-02 C-Lecta Gmbh Ekspressionsvektor
EP2379076B1 (en) 2008-12-23 2014-11-12 The Trustees of Columbia University in the City of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
WO2010074783A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
JP2012520683A (ja) 2009-03-19 2012-09-10 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
JP2012520686A (ja) 2009-03-19 2012-09-10 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたシグナル伝達性転写因子６（ＳＴＡＴ６）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
US20120016010A1 (en) 2009-03-19 2012-01-19 Merck Sharp & Dohme Corp RNA Interference Mediated Inhibition of BTB and CNC Homology 1, Basic Leucine Zipper Transcription Factor 1 (BACH1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US20120029054A1 (en) 2009-03-19 2012-02-02 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of GATA Binding Protein 3 (GATA3) Gene Expression Using Short Intefering Nucleic Acid (siNA)
JP2012521765A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
EP2411019A2 (en) 2009-03-27 2012-02-01 Merck Sharp&Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 1 (STAT1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2010111464A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF APOPTOSIS SIGNAL-REGULATING KINASE 1 (ASK1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20120004281A1 (en) 2009-03-27 2012-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp RNA Interference Mediated Inhibition of the Nerve Growth Factor Beta Chain (NGFB) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
WO2010111490A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF THE THYMIC STROMAL LYMPHOPOIETIN (TSLP) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20100257634A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Venganza Inc. Bioassay for gene silencing constructs
US8283332B2 (en) 2009-04-17 2012-10-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PFKFB4 inhibitors and methods of using the same
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
WO2011008823A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated non-covalent delivery of active agents across the blood brain barrier
BR112012001463A2 (pt) 2009-07-24 2016-03-15 Univ California métodos e composições para tratar e prevenir doença associada à integrina alfavbeta5
BR112012004462B1 (pt) 2009-08-28 2024-02-27 Corteva Agriscience Llc Polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método para controlar uma praga de plantas do tipo coleoptera e método para obtenção de uma planta
WO2011071916A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 The Johns Hopkins University Sr-bi as a predictor of human female infertility and responsiveness to treatment
EP3434773A3 (en) 2009-12-09 2019-04-17 Nitto Denko Corporation Modulation of hsp47 expression
US10640457B2 (en) 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
EP2509590B1 (en) 2009-12-10 2019-10-30 The Trustees of Columbia University in the City of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
EP3000885B1 (en) 2009-12-18 2018-07-25 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat hsf1-related diseases
US20110200582A1 (en) 2009-12-23 2011-08-18 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
DK2529033T3 (en) 2010-01-26 2017-08-07 Nat Jewish Health PROCEDURES FOR PREVENTING THE RISK OF, DIAGNOSTICATION AND PROJECTING OF LUNG DISEASES
WO2011098449A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Novartis Ag Methods and compounds for muscle growth
WO2011146938A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 NanoOncology, Inc. Reagents and methods for treating cancer
GB201009601D0 (en) 2010-06-08 2010-07-21 Devgen Private Ltd Method for down-grading gene expression in fungi
US9168297B2 (en) 2010-06-23 2015-10-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (NRG-1)
CN107090456B (zh) 2010-08-02 2022-01-18 瑟纳治疗公司 使用短干扰核酸的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1基因表达的抑制
HUE044815T2 (hu) 2010-08-17 2019-11-28 Sirna Therapeutics Inc Hepatitisz B vírus (HBV) génexpressziójának RNS-interferencia közvetített gátlása, rövid interferáló nukleinsav (SINS) alkalmazásával
EP3372684B1 (en) 2010-08-24 2020-10-07 Sirna Therapeutics, Inc. Single-stranded rnai agents containing an internal, non-nucleic acid spacer
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
EP2627349B1 (en) 2010-10-15 2016-02-03 The Trustees of Columbia University in the City of New York Obesity-related genes and their proteins and uses thereof
WO2012058210A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA)
AU2011323508B2 (en) 2010-11-01 2017-04-27 Peptimed, Inc. Compositions of a peptide targeting system for treating cancer
US9198911B2 (en) 2010-11-02 2015-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
DK2635299T3 (da) 2010-11-02 2019-10-21 Univ Columbia Fremgangsmåder til behandling af hårtabsforstyrrelser
US9150926B2 (en) 2010-12-06 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483
CN103298939A (zh) 2010-12-06 2013-09-11 夸克医药公司 包含位置修饰的双链寡核苷酸化合物
ES2820863T3 (es) 2010-12-22 2021-04-22 Univ Columbia Moduladores de histona acetiltransferasa y usos de los mismos
CA2828002A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
WO2013033657A2 (en) 2011-09-02 2013-03-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York CaMKII, IP3R, CALCINEURIN, P38 AND MK2/3 INHIBITORS TO TREAT METABOLIC DISTURBANCES OF OBESITY
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
PL2766393T3 (pl) 2011-10-14 2018-11-30 F.Hoffmann-La Roche Ag PRZECIWCIAŁA PRZECIW HtrA1 I SPOSOBY ZASTOSOWANIA
DK2768958T3 (da) 2011-10-18 2019-09-16 Dicerna Pharmaceuticals Inc Kationiske aminlipider og anvendelser deraf
AU2012332517B9 (en) 2011-11-03 2017-08-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
JP6212107B2 (ja) 2012-03-29 2017-10-11 ザ トラスティース オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 脱毛障害を処置するための方法
CN104395474A (zh) 2012-04-20 2015-03-04 富优基尼以色列股份有限公司 青铜蝽防治剂
WO2013163085A2 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Futuragene Israel Ltd. Glycaspis brimblecombei control agents
EP3919620A1 (en) 2012-05-02 2021-12-08 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
DK2877494T3 (da) 2012-07-23 2020-09-21 La Jolla Inst Allergy & Immunology PTPRS og proteoglycaner i autoimmun sygdom
CN104903449A (zh) 2012-10-03 2015-09-09 富优基尼以色列股份有限公司 瘿蜂防治剂
CA2886120A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 St. Jude Children's Research Hospital Therapies based on control of regulatory t cell stability and function via a neuropilin-1:semaphorin axis
US9920316B2 (en) 2013-03-14 2018-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
AU2014236947A1 (en) 2013-03-15 2015-09-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
AU2014284396A1 (en) 2013-07-03 2016-02-04 City Of Hope Anticancer combinations
WO2015054451A1 (en) 2013-10-09 2015-04-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Detection of hepatitis delta virus (hdv) for the diagnosis and treatment of sjögren's syndrome and lymphoma
US10004814B2 (en) 2013-11-11 2018-06-26 Sirna Therapeutics, Inc. Systemic delivery of myostatin short interfering nucleic acids (siNA) conjugated to a lipophilic moiety
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
US10174111B2 (en) 2013-12-27 2019-01-08 National University Corporation Kochi University Therapeutic drug for malignant tumors
CN106794141B (zh) 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
WO2016059187A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Universite De Strasbourg Method of capturing and identifying novel rnas
AU2015346281B2 (en) 2014-11-12 2021-12-02 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
EP3237452A4 (en) 2014-12-23 2018-12-05 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fusion proteins and methods thereof
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
WO2016145008A2 (en) 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Mirna for treatment of breast cancer
US10781446B2 (en) 2015-03-09 2020-09-22 University Of Kentucky Research Foundation RNA nanoparticle for treatment of gastric cancer
CN107531740B (zh) 2015-03-09 2021-03-19 肯塔基大学研究基金会 用于脑肿瘤治疗的rna纳米颗粒
US11279768B1 (en) 2015-04-03 2022-03-22 Precision Biologics, Inc. Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof
WO2016168784A2 (en) 2015-04-17 2016-10-20 University Of Kentucky Research Foundation Rna nanoparticles and method of use thereof
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
JP6980534B2 (ja) 2015-06-25 2021-12-15 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 造血幹細胞の増大、富化、および維持に関する方法および組成物
US10072065B2 (en) 2015-08-24 2018-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of immunoglobulins across the blood-brain barrier
AU2016321298A1 (en) 2015-09-09 2018-03-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of ER-MAM localized APP-C99 and methods of treating Alzheimer's Disease
US11285142B2 (en) 2015-09-29 2022-03-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for identifying and treating dystonia disorders
WO2017075212A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
US10358647B2 (en) 2015-12-13 2019-07-23 Nitto Denko Corporation siRNA structures for high activity and reduced off target
EP3423568A4 (en) 2016-03-04 2019-11-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. METHOD AND COMPOSITIONS FOR EX-VIVO REPRODUCTION OF VERY SMALL EMBRYONAL STEM CELLS (VSELS)
DK3429603T3 (da) 2016-03-15 2022-03-14 Childrens Medical Center Fremgangsmåder og sammensætninger vedrørende ekspansion af hæmatopoietiske stamceller
US10883108B2 (en) 2016-03-31 2021-01-05 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent
EP3516062A1 (en) 2016-09-21 2019-07-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Myostatin irna compositions and methods of use thereof
CN107858405B (zh) * 2017-10-12 2021-09-24 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法
WO2019199673A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 President And Fellows Of Harvard College Modulating nuclear receptors and methods of using same
CN109266677B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法
CN109183158B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法
EP3853250A4 (en) 2018-09-19 2022-06-08 La Jolla Institute for Immunology PTPRS AND PROTEOGLYCANS IN RHEUMATOID ARTHRITIS
US11708575B2 (en) 2018-11-16 2023-07-25 Nitto Denko Corporation RNA interference delivery formulation and methods for malignant tumors
WO2020141608A1 (ja) * 2019-01-04 2020-07-09 国立大学法人京都大学 潰瘍性大腸炎及び原発性硬化性胆管炎の検査方法
CN110229839B (zh) * 2019-06-04 2021-06-08 中国农业大学 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法
CN110746497A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 维塔恩(广州)医药有限公司 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
CN110804088A (zh) * 2019-11-18 2020-02-18 维塔恩(广州)医药有限公司 巨细胞病毒相关抗原短肽及其应用
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
JOP20220152A1 (ar) 2019-12-18 2023-01-30 Novartis Ag مشتقات 3-(5- ميثوكسي -1- أوكسو أيزو إندولين -2- يل) بيبريدين -2، 6- دايون واستخداماتها
JP2023506842A (ja) 2019-12-18 2023-02-20 ノバルティス アーゲー 異常ヘモグロビン症の治療用組成物及び方法
AU2021205929A1 (en) 2020-01-08 2022-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
US20210222128A1 (en) 2020-01-22 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Inducible tissue constructs and uses thereof
US11642407B2 (en) 2020-02-28 2023-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Identification of variable influenza residues and uses thereof
CN113638055B (zh) * 2020-05-22 2023-07-07 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种制备双链rna测序文库的方法
WO2022147481A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma Inc. Combination therapy of an oncolytic virus delivering a foreign antigen and an engineered immune cell expressing a chimeric receptor targeting the foreign antigen
WO2022269518A2 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2023012165A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Universite De Montpellier Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22
CN113533007B (zh) * 2021-08-06 2023-11-24 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 一种抗体染色标记装置及其方法
WO2024059618A2 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
WO2024059824A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589801A (en) * 1897-09-07 woltereck
EP1213348A2 (en) 1985-03-21 2002-06-12 Johnston, Stephen, Ph.D. Parasite-derived resistance
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
NZ219472A (en) 1986-03-28 1990-08-28 Calgene Inc Regulation of phenotype in plant cells using dsdna constructs
US5017488A (en) * 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
US4970168A (en) * 1989-01-27 1990-11-13 Monsanto Company Virus-resistant plants
JPH04507083A (ja) * 1989-05-19 1992-12-10 ヘム・リサーチ・インコーポレーテッド 規定された構造の短い治療用ｄｓＲＮＡ
HUT57265A (en) 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5837848A (en) * 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
JPH05505727A (ja) * 1990-03-30 1993-08-26 プレジデント、アンド、フェローズ、オブ、ハーバード、カレッジ トランスジェニック動物においてトランス遺伝子の発現をコントロールするバイナリー遺伝子系
US5831011A (en) * 1990-07-27 1998-11-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins
US5459252A (en) * 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
WO1993019188A1 (en) 1992-03-20 1993-09-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Fungus-responsive chimaeric gene
DE4234131C2 (de) * 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
CA2088379A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 University Of British Columbia Biological systems incorporating stress-inducible genes and reporter constructs for environmental biomonitoring and toxicology
IL104830A (en) * 1993-02-23 2001-01-28 Yissum Res Dev Co A chimeric plasmid containing a non-structural gene for the protease of the potato virus and its various uses
DE4317845A1 (de) * 1993-05-28 1994-12-01 Bayer Ag Desoxyribonukleinsäuren
JPH10504448A (ja) * 1994-06-15 1998-05-06 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 腫瘍抑制遺伝子を同定する方法
US5691140A (en) * 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
GB9510944D0 (en) * 1995-05-31 1995-07-26 Bogaert Thierry Assays and processes for the identification of compounds which control cell behaviour,the compounds identified and their use in the control of cell behaviour
DK0832207T3 (da) * 1995-06-02 2000-11-06 M & E Biotech As Fremgangsmåde til identifikation af biologisk aktive peptider og nukleinsyrer
US5679551A (en) * 1995-10-31 1997-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Unique double-stranded RNAS associated with the Trichomonas vaginalis virus
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
WO1998006750A2 (en) * 1996-08-09 1998-02-19 Keygene N.V. Resistance against nematodes and/or aphids
JP2001503972A (ja) * 1996-09-18 2001-03-27 ユング，クリスチャン 線虫抵抗性遺伝子
AU4470697A (en) 1996-10-03 1998-04-24 Hajime Kato Method for hydrocarbon steam reforming
WO1998027152A1 (en) 1996-12-18 1998-06-25 Exxon Chemical Patents Inc. Compatibilized polymer blends formed using a multifunctional agent
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP3214177A3 (en) * 1998-04-08 2017-11-22 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) * 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-09-02 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
ATE548459T1 (de) 2005-09-16 2012-03-15 Monsanto Technology Llc Verfahren zur genetischen kontrolle von insektenbefall bei pflanzen und zusammensetzungen

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Publication number Publication date
EP1484415B1 (en) 2009-06-10
CN1900319A (zh) 2007-01-24
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ATE419383T1 (de) 2009-01-15
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KR20010074639A (ko) 2001-08-04
GB2362885A (en) 2001-12-05
US20040133943A1 (en) 2004-07-08
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RU2240349C2 (ru) 2004-11-20
PT1197567E (pt) 2009-04-09
DE1093526T1 (de) 2001-10-11
EP2045336A3 (en) 2009-06-10
MXPA00012955A (es) 2002-04-10
EP2374901A1 (en) 2011-10-12
CZ304897B6 (cs) 2015-01-07
EP2045336A2 (en) 2009-04-08
GB0206600D0 (en) 2002-05-01
IS2816B (is) 2012-11-15
DK1197567T3 (da) 2009-05-04
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EP1484415A2 (en) 2004-12-08
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AU769223B2 (en) 2004-01-22
DE69940219D1 (de) 2009-02-12
JP5847776B2 (ja) 2016-01-27
BR9911802A (pt) 2002-01-22
US20030061626A1 (en) 2003-03-27
IS5802A (is) 2001-01-02
HUP0103571A3 (en) 2006-01-30
DK1484415T3 (da) 2009-10-12
ZA200007653B (en) 2002-09-19
US8114980B2 (en) 2012-02-14
GB2349885A (en) 2000-11-15
DE29924298U1 (de) 2002-09-12
PL216779B1 (pl) 2014-05-30
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DK1197567T4 (en) 2015-12-07
AU4907999A (en) 2000-01-24
GB2370275B (en) 2002-11-27
CZ303494B6 (cs) 2012-10-24
HUP0103571A2 (hu) 2002-01-28
KR20070041607A (ko) 2007-04-18
MX234065B (es) 2006-02-01
IL140467A (en) 2007-07-04
GB2349885B (en) 2003-01-29
IL181727A (en) 2015-08-31
DE69940984D1 (de) 2009-07-23
CA2789083A1 (en) 2000-01-13
NO20010019L (no) 2001-03-05
US20040187170A1 (en) 2004-09-23
ES2320527T5 (es) 2015-11-16
CA2332619C (en) 2012-12-11
CZ200114A3 (en) 2001-06-13
IL140467A0 (en) 2002-02-10
HK1029142A1 (en) 2001-03-23
JP2014058514A (ja) 2014-04-03
WO2000001846A3 (en) 2000-06-15
CA2332619A1 (en) 2000-01-13
CY1109324T1 (el) 2014-07-02
PL201425B1 (pl) 2009-04-30

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