PL216779B1 - Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu - Google Patents

Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu

Info

Publication number
PL216779B1
PL216779B1 PL390495A PL39049599A PL216779B1 PL 216779 B1 PL216779 B1 PL 216779B1 PL 390495 A PL390495 A PL 390495A PL 39049599 A PL39049599 A PL 39049599A PL 216779 B1 PL216779 B1 PL 216779B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
promoter
promoters
vector
transcription factor
Prior art date
Application number
PL390495A
Other languages
English (en)
Inventor
Geert Plaetinck
Christ Platteeu
Katherine Mortier
Thierry Bogaert
Original Assignee
Devgen Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26313977&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL216779(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB9814536.0A external-priority patent/GB9814536D0/en
Application filed by Devgen Nv filed Critical Devgen Nv
Publication of PL216779B1 publication Critical patent/PL216779B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu niebędącego człowiekiem.
Ostatnio opisano w Nature, tom 391, str. 806-811, luty 98, że wprowadzanie dwuniciowego RNA do komórki powoduje silną i specyficzną ingerencję w ekspresję endogennych genów w komórce, która to ingerencja jest istotnie bardziej wydajna niż dostarczanie pojedynczych nici RNA, jak to się proponuje w technice antysensu. Ta specyficzna redukcja aktywności genu została także stwierdzona u nicienia Caenorhabditis elegans (C. elegans), gdy RNA wprowadzano do genomu lub jamy ciała robaka.
Twórcy wynalazku zastosowali tą technikę i użyli jej także do opracowania nowych sposobów przypisywania funkcji genom lub fragmentom DNA, które zostały zsekwencjonowane w różnych projektach, takich jak przykładowo, projekt poznania ludzkiego genomu i którym nie przypisano dotychczas określonej funkcji oraz do zastosowania w identyfikowaniu DNA odpowiedzialnego za nadawanie określonego fenotypu.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu niebędącego człowiekiem, polegający na tym, że karmi się ten organizm odpowiednim mikroorganizmem zawierającym dowolny spośród następujących wektorów ekspresyjnych od (a) do (h):
(a) wektor ekspresyjny zawierający promotor lub promotory w takiej orientacji wobec sekwencji DNA, że pozwalają one na inicjację transkrypcji sekwencji DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do promotora lub promotorów;
(b) wektor ekspresyjny określony w (a) zawierający dwa identyczne promotory flankujące sekwencję DNA;
(c) wektor ekspresyjny określony w (a) zawierający sekwencję DNA w orientacji sensownej i antysensownej względem promotora;
(d) wektor ekspresyjny określony w (a), (b) lub (c), który zawiera dodatkowo sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny;
(e) wektor ekspresyjny określony w (d), w którym sekwencja nukleotydowa kodująca marker selekcyjny jest zorientowana względem promotora lub promotorów w taki sposób, że transkrypcja sekwencji nukleotydowej do dwuniciowego RNA następuje po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do promotora lub promotorów;
(f) wektor ekspresyjny określony w (e), w którym sekwencja nukleotydowa kodująca marker selekcyjny jest umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotorów;
(g) wektor ekspresyjny określony w (e), w którym sekwencja nukleotydowa kodująca marker selekcyjny jest umieszczona w orientacji sensownej i antysensownej względem promotora, w taki sposób, że następuje transkrypcja sekwencji nukleotydowej do dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotora;
(h) wektor ekspresyjny określony w (d) lub (e), w którym marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sup-35, do wprowadzania do C. elegans posiadającego mutację pha-1, albo karmienia tego organizmu bezpośrednio dowolnym wektorem ekspresyjnym od (a) do (h).
Korzystnie stosuje się mikroorganizm lub organizm dostosowany do ekspresji czynnika transkrypcyjnego.
Korzystniej stosuje się mikroorganizm albo organizm obejmujący dowolny spośród wektorów ekspresyjnych od (a) do (h) jak zdefiniowano powyżej, lub dowolny spośród następujących wektorów ekspresyjnych od (i) do (k):
(i) wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą odpowiedni czynnik transkrypcyjny do stosowania w sposobie określonym w tu powyżej, operacyjnie związany z odpowiednimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję;
(j) wektor ekspresyjny określony w (i), w którym sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują promotory, które są indukowalne, konstytutywne, ogólne lub tkankowo-specyficzne, lub ich kombinację;
(k) wektor ekspresyjny określony w (i) albo (j), w którym czynnik transkrypcyjny obejmuje polimerazę fagową, a zwłaszcza polimerazę RNA T7.
PL 216 779 B1
Korzystnie jako organizm stosuje się C. elegans.
Korzystnie jako mikroorganizm stosuje się E. coli.
Korzystniej jako szczep E. coli stosuje się szczep ujemny pod względem Rnazy III.
Korzystnie jako organizm stosuje się mutanta nuc-1 C. elegans.
Jeżeli korzystnie stosuje się mikroorganizm lub organizm dostosowany do ekspresji czynnika transkrypcyjnego, to korzystniej jako czynnik transkrypcyjny stosuje się polimerazę RNA T7.
Opisano tutaj także sposób identyfikowania DNA odpowiedzialnego za nadawanie pewnego fenotypu w komórce, który obejmuje: a) konstruowanie biblioteki cDNA lub genomowej z DNA tej komórki w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego cDNA lub DNA do dwuniciowego (ds) RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, b) wprowadzanie wspomnianej biblioteki do jednej lub więcej komórek zawierających wspomniany czynnik transkrypcyjny, oraz c) identyfikowanie i izolowanie danego fenotypu wspomnianej komórki zawierającej wspomnianą bibliotekę i identyfikowanie fragmentu DNA lub cDNA ze wspomnianej biblioteki odpowiedzialnego za nadawanie danego fenotypu.
Biblioteka może być zorganizowana w zbiory hierarchiczne, co opisano szczegółowo w opisanych przykładach, przed etapem b), tak aby obejmowała, przykładowo rodziny genów.
Opisano tutaj również sposób przypisywania funkcji znanej sekwencji DNA, który obejmuje: a) identyfikowanie homologu lub homologów wspomnianej sekwencji DNA w komórce, b) izolowanie odnośnego homologu lub homologów DNA lub jego fragmentu z komórki, c) klonowanie wspomnianego homologu lub jego fragmentu do odpowiedniego wektora w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego cDNA lub DNA do dwuniciowego (ds) RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, d) wprowadzanie wspomnianego wektora do wspomnianej komórki z etapu a) zawierającej wspomniany czynnik transkrypcyjny, oraz e) identyfikowanie fenotypu wspomnianej komórki w porównaniu z typem dzikim.
Sekwencja nukleotydowa lub DNA mogą być dostarczana w orientacji sensownej i antysensownej wobec pojedynczego promotora, którego cechy zdefiniowano powyżej, lub alternatywnie mogą być umieszczane pomiędzy dwoma identycznymi promotorami. dsRNA dostarczany jest w wyniku transkrypcji inicjowanej przez promotor po związaniu z odpowiednim czynnikiem transkrypcyjnym.
Komórka taka może pochodzić z organizmu lub może być zawarta w organizmie. Gdy komórka zawarta jest w organizmie, organizm może być przystosowany do ekspresji odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Organizmem może być dowolna roślina, zwierzę, grzyb lub drożdże, a dogodnie jest to nicień C. elegans, który może być typu dzikiego, może być mutantem C. elegans nuc-1 lub pha-ts, lub kombinacją tych mutacji. Biblioteka DNA lub cDNA lub homologu DNA lub jego fragmentu, może być, dogodnie, transfekowana lub transformowana do mikroorganizmu, takiego jak komórka bakteryjna lub drożdżowa, która może stanowić pokarm dla organizmu, którym jest dogodnie nicień C. elegans. Mikroorganizm może być przystosowany do ekspresji odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Korzystnie mikroorganizmem jest E. coli.
Biblioteka DNA, homologu DNA lub fragmentu DNA może być skonstruowana w odpowiednim wektorze, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą wspomniany czynnik transkrypcyjny. Alternatywnie, wspomniany czynnik transkrypcyjny może być kodowany przez dodatkowy wektor. Ewentualnie komórka lub organizm może ekspresjonować lub może być przystosowana do ekspresji wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Zalecane jest stosowanie w sposobie według wynalazku dowolnego wektora zawierającego marker selekcyjny, którym może być przykładowo sekwencja nukleotydowa kodująca sup-35 lub jej fragment. Sekwencja nukleotydowa może być zorientowana względem promotora w taki sposób, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego do promotora inicjuje transkrypcję DNA w dwuniciowy RNA. Figura 10 prezentuje wektory i orientację sekwencji DNA, która umożliwia produkcję dwuniciowego RNA w C. elegans. DNA może być umieszczony pomiędzy dwoma promotorami w wektorze zdolnym do ekspresji dsRNA poprzez wiązanie odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Alternatywnie, wektor zawiera dwie kopie sekwencji DNA zorganizowane w sensownej i antysensownej orientacji względem promotora i którego marker może być selekcjonowany gdy znajduje się w mutancie pha-1 C. elegans. Zalecane promotory stanowią dowolny z promotorów T7, T3 lub SP6 a czynnik transkrypcyjny odpowiednią polimerazę.
Zalecany marker selekcyjny obejmuje sekwencję nukleotydową zdolną do inhibicji lub zapobiegania ekspresji genu we wspomnianej komórce, przy czym gen ten jest odpowiedzialny za nadawanie
PL 216 779 B1 znanego fenotypu. Ta sekwencja nukleotydowa może być częścią wspomnianego genu lub może być identyczna ze wspomnianym genem nadającym wspomniany fenotyp, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest w orientacji wobec odpowiedniego promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub wspomnianych promotorów. Alternatywnie ta sekwencja nukleotydowa może być częścią lub może być identyczna ze wspomnianą sekwencją genu nadającą wspomniany fenotyp, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest taka, że pozwala na integrację wspomnianego odpowiedniego lub dodatkowego wektora poprzez rekombinację homologiczną z genomem wspomnianej komórki i po wspomnianej integracji wspomniana sekwencja nukleotydowa jest zdolna do inhibicji ekspresji wspomnianej sekwencji genu nadającej wspomniany fenotyp. Taka sekwencja nukleotydowa zawiera kodony stopu wystarczające do zapobiegania translacji wspomnianej sekwencji nukleotydowej po jej integracji ze wspomnianym genomem.
Dogodnie w sposobie tym mogą być dodawane do wspomnianej komórki lub organizmu związki w celu poszukiwania pożądanych fenotypów, takich jak przykładowo, oporność na antybiotyki lub wrażliwość na związek w porównaniu z typem dzikim. Zalecane promotory są indukowalne. Czynnik transkrypcyjny może w pewnych realizacjach być pochodzenia fagowego, tak jak przykładowo, polimeraza T7 kontrolowana przez promotor fagowy. Jednakże, gdy stosowany jest C. elegans mogą zostać użyte promotory specyficzne dla robaków lub szczególnej tkanki, takie jak przykładowo, let858, SERCA, UL6, myo-2 lub myo-3. Dogodnie, szczep E. coli jest negatywny względem RNazy III, a dogodniej jest to szczep negatywny pod względem RNazy.
Opisano tutaj również sposób wytwarzania transgenicznego organizmu niebędącego człowiekiem, obejmującego egzogenny czynnik transkrypcyjny i transgen zawierający promotor operacyjnie związany z fragmentem DNA, ekspresjonowany po przyłączeniu do niego tego czynnika transkrypcyjnego, który to sposób obejmuje: a) dostarczanie pierwszego organizmu transgenicznego zawierającego pierwszy konstrukt zawierający DNA kodujący egzogenny czynnik transkrypcyjny i drugiego organizmu transgenicznego zawierającego drugi konstrukt zawierający przynajmniej jeden promotor operacyjnie związany z pożądaną sekwencją DNA, która jest ekspresjonowana po przyłączeniu do niego czynnika transkrypcyjnego z pierwszego organizmu transgenicznego, b) krzyżowanie wspomnianego pierwszego i drugiego organizmu transgenicznego i selekcjonowanie potomstwa ekspresjonującego wspomnianą pożądaną sekwencję DNA. Pierwszy i drugi organizm transgeniczny może być wytworzony poprzez transformowanie wspomnianego pierwszego i drugiego konstruktu do odpowiednich mikroorganizmów służących następnie do karmienia odpowiedniego organizmu. Dogodnie wspomniany drugi konstrukt zawiera pożądaną sekwencję DNA w orientacji wobec wspomnianego promotora pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego DNA do dsRNA po związaniu do niego wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Wspomniany drugi konstrukt dogodnie zawiera dwa promotory flankujące wspomnianą pożądaną sekwencję DNA, które to promotory mogą inicjować transkrypcję wspomnianej sekwencji DNA do dsRNA po związaniu wspomnianego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Alternatywnie wspomniana sekwencja DNA jest dostarczana w orientacji sensownej lub antysensownej wobec wspomnianego promotora w celu uzyskiwania produkcji dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotora.
Pierwszy i/lub drugi konstrukt mogą być dogodnie wyposażone w gen reporterowy operacyjnie związany z promotorem, który jest zdolny do inicjacji transkrypcji wspomnianego reportera po związaniu do niego wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Dogodnie wspomniany gen reporterowy zawiera dowolną spośród sekwencji kodujących lucyferazę, białko zielonej fluorescencji, β galaktozydazę lub β-laktamazę.
Opisano tutaj także sposób oceny klonów zidentyfikowanych w eksperymencie z dwuhybrydowym wektorem drożdżowym, które to eksperymenty są dobrze znane fachowcom i które to eksperymenty zostały po raz pierwszy zaproponowane przez Chien i wsp. (1991) w celu wykrywania oddziaływań białko-białko. Sposób ten obejmuje dostarczanie konstruktu zawierającego DNA kodujący białko zidentyfikowane w eksperymencie z dwuhybrydowym wektorem drożdżowym, przy czym konstrukt ten jest taki, że wspomniany DNA jest w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, transformowanie komórki, takiej jak komórka bakteryjna lub alternatywnie transformowanie organizmu zawierającego wspomniany czynnik transkrypcyjny wspomnianym konstruktem, i identyfikowanie zmian fenotypowych we wspomnianej komórce lub organizmie, którym może być C. elegans lub podobny, w porównaniu z typem
PL 216 779 B1 dzikim. Dogodnie, czynnik transkrypcyjny jest indukowalny w komórce lub organizmie. Ponownie, sekwencja DNA może być umieszczana pomiędzy dwoma promotorami lub może być w orientacji sensownej, jak i antysensownej wobec pojedynczego promotora, jak opisano poprzednio. Dogodnie, promotor jest promotorem fagowej polimerazy a wspomniany czynnik transkrypcyjny jest polimerazą RNA, zwłaszcza polimerazą RNA T7. Ujawniono tutaj również wektory stosowane do transformowania wspomnianych komórek lub organizmów i komórki lub organizmy jako takie.
Opisano tu również sposób łagodzenia ataku szkodników roślinnych, który obejmuje: a) identyfikowanie sekwencji DNA ze wspomnianego nicienia, która jest kluczowa dla jego przetrwania, wzrostu, rozmnażania, b) klonowanie wspomnianej sekwencji z etapu a) lub jej fragmentu do odpowiedniego wektora w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, oraz c) wprowadzanie wspomnianego wektora do rośliny.
Zatem, taki sposób według wynalazku dostarcza szczególnego mechanizmu selekcyjnego do łagodzenia ataku szkodników, a w pewnych przypadkach ataku pasożytów roślinnych, w którym szkodniki żerujące na roślinie zjadają ekspresjonowane w roślinie dsRNA i w ten sposób roślina inhibituje u szkodnika ekspresję DNA, który jest kluczowy dla jego wzrostu, przetrwania, rozmnażania lub reprodukcji. Nicieniem może być dowolny spośród Tylenchulus ssp. Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmaniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Parartichodorus ssp., Aphelenchs ssp. Sekwencja DNA lub jej fragment zgodnie z tym aspektem wynalazku może być wklonowana pomiędzy dwa tkankowo-specyficzne promotory, takie jak promotory specyficzne dla korzeni.
Wektor ekspresyjny stosowany w dowolnym opisanym tu sposobie do konstruowania wspomnianej biblioteki może zawierać dwa identyczne promotory w orientacji wobec wspomnianej sekwencji DNA pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Sekwencja DNA może, przykładowo, obejmować miejsce wielokrotnego klonowania. Zalecany wektor ekspresyjny zawiera dodatkowo sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny. Wspomniana sekwencja nukleotydową kodująca wspomniany marker selekcyjny może być umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotorów. Zalecany marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sup-35, do wprowadzania do C. elegans posiadającego mutację pha-1.
Dogodnie, czynnik transkrypcyjny zawiera polimerazę fagową wiążącą się z odpowiednim promotorem lub promotorem specyficznym dla C. elegans, dogodniej polimerazę RNA T7. Dogodnie, wektor zawiera miejsce wielokrotnego klonowania pomiędzy wspomnianymi identycznymi promotorami.
Opisano również wektor ekspresyjny do ekspresji odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do stosowania w sposobie według wynalazku, który to wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą wspomniany czynnik transkrypcyjny operacyjnie związany z odpowiednimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję. Dogodnie, sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują promotory które są indukowalne, konstytutywne, ogólne lub tkankowo-specyficzne, lub ich kombinacje. Dogodnie czynnik transkrypcyjny obejmuje polimerazę fagową, a zwłaszcza polimerazę RNA T7, T3 lub SP6.
Opisano tu również system selekcyjny do identyfikowania transformacji komórki lub organizmu wektorem tutaj opisanym, który to system zawiera wektor tutaj opisany, w którym marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową zdolną do inhibicji lub zapobiegania ekspresji genu we wspomnianej komórce lub organizmie, który to gen jest odpowiedzialny za nadawanie znanego fenotypu. Zalecana wspomniana sekwencja nukleotydowa odpowiada części wspomnianego genu lub jest identyczna ze wspomnianym genem nadającym wspomniany znany fenotyp, i która to sekwencja nukleotydowa jest umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dwuniciowego RNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Alternatywnie, sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową, która jest częścią lub jest identyczna z sekwencją wspomnianego genu, który nadaje znany fenotyp wspomnianej komórce lub organizmowi, i która to sekwencja nukleotydowa pozwala na integrację wspomnianego wektora poprzez rekombinację homologiczną z chromosomem wspomnianej komórki lub organizmu i po wspomnianej integracji wspomniana sekwencja nukleotydowa jest zdolna do inhibicji ekspre6
PL 216 779 B1 sji wspomnianej sekwencji genu nadającej wspomniany znany fenotyp. Zalecana sekwencja nukleotydowa zawiera kodony stopu wystarczające do zapobiegania translacji sekwencji nukleotydowej po jej integracji ze wspomnianym genomem.
Dogodnie sekwencja znanego genu zawiera gen sup-35 lub jego fragment, który może być selekcjonowany poprzez identyfikowanie potomstwa wzrastającego w temperaturze powyżej 25°C po wprowadzeniu do genomu mutanta pha-1 et123ts robaka C. elegans.
Opisano tu również sekwencję znanego genu obejmującą gen sup-35 lub jego fragment, który może być selekcjonowany poprzez identyfikowanie potomstwa wzrastającego w temperaturze powyżej 25°C po wprowadzeniu wspomnianego wektora do genomu mutanta pha-1 et123ts robaka C. elegans.
Opisano tutaj także sposób przypisywania funkcji sekwencji DNA z organizmu wielokomórkowego, który to sposób obejmuje a) dostarczanie (i) konstruktu zawierającego fragment DNA sklonowany pomiędzy dwoma promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji w tym organizmie wielokomórkowym z tego promotora;
b) identyfikowanie fenotypu wspomnianego organizmu wielokomórkowego w porównaniu z typem dzikim.
Niniejszy wynalazek może stać się łatwiej zrozumiały w świetle poniższych przykładów, które są jedynie przykładami odnoszącymi się do załączonych figur, na których:
Figura 1 jest sekwencją nukleotydową plazmidu PGN1 tutaj opisanego.
Figura 2 jest sekwencją nukleotydową plazmidu PGN100 tutaj opisanego.
Figura 3 przedstawia schematycznie zastosowane wektory i drogę transformacji wykorzystaną w sposobach tutaj opisanych.
Figura 4 przedstawia wektor ekspresyjny zastosowany zgodnie z wynalazkiem.
Figura 5 przedstawia schemat wektorów ekspresyjnych polimerazy RNA T7 zastosowanych do transformacji C. elegans.
Figura 6 przedstawia plazmid PGN1.
Figura 7 przedstawia diagram prezentujący wzmocniony wektor do inhibicji dsRNA kodujący dsRNA sup-35.
Figura 8 przedstawia wektor do integracji z genomem C. elegans.
Figura 9 przedstawia pozycję sekwencji DNA względem odpowiedniego promotora inicjującego ekspresję dsRNA z sekwencji DNA.
Figura 10 przedstawia plazmid pGN108.
Figura 11 przedstawia plazmid pGN105.
Figura 12 przedstawia plazmid pGN400.
Figura 13 przedstawia plazmid pGN401.
Figura 14 przedstawia plazmid pGN110.
Figura 15 przedstawia plazmid pAS2 z promotorami T7/T3/SP6, zgodnym i odwrotnym.
Figura 16 przedstawia plazmid pGAD424 z promotorami T7/T3/SP6, zgodnym i odwrotnym.
Figura 17 przedstawia plazmid pAS2-cyh2-HA+, obydwa T7-końce.
Figura 18 przedstawia plasmid pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7.
Figura 19 (a) przedstawia plazmid pGN205, a (b) przedstawia plazmid pGN207.
P r z y k ł a d A: Konstruowanie uporządkowanej i hierarchicznie pogrupowanej biblioteki cDNA i jej zastosowania.
Losowo uporządkowana i pogrupowana biblioteka:
Wektorem jest wektor E. coli posiadający dwa promotory T7, z miejscem wielokrotnego klonowania (MCS) pomiędzy nimi. Obydwa promotory są skierowane do siebie, i do MCS. W obecności polimerazy RNA T7, ekspresjonowanej w E. coli, C. elegans lub dowolnym innym organizmie, produkowane będzie RNA, startując z promotorów T7. Ze względu na to, że są one ukierunkowane w przeciwnych kierunkach (sensach), obydwie nici RNA będą produkowane z DNA wbudowanego (sklonowanego) w MCS pomiędzy dwoma promotorami, co powoduje wytworzenie dwuniciowego RNA (dsRNA) po związaniu do niego polimerazy RNA T7.
Biblioteka cDNA C. elegans jest konstruowana w MSC za pomocą typowych technik biologii molekularnej. Biblioteka transformowana jest do E. coli, a uzyskane E. coli namnażane w hodowlach i przechowywane w 96-studzienkowych płytkach. Na tym etapie, DNA plazmidowy może być izolowany i przechowywany na 96-studzienkowych płytkach odpowiadającym koloniom E. coli. Zebranych jest około 100000 kolonii. Dzięki temu biblioteka odpowiada w przybliżeniu 5-krotnej całkowitej ekspresji
PL 216 779 B1 różnorodności cDNA z C. elegans, co daje możliwość obecności w bibliotece słabo ekspresjonowanych sekwencji. Uzyskuje się w wyniku tego około 1041 96-studzienkowych płytek. Gdy jest to konieczne, płytki grupowane są hierarchicznie. W celu pogrupowania klonów dzielone są one w zakresach od 10 do 100. Gdy grupowanie hierarchiczne następuje co 8 lub co 12 (liczby te są najbardziej odpowiednie, ponieważ płytki 96-studzienkowe posiadają 8 na 12 rzędów), daje to około 87 płytek kilku-studzienkowych i około 8352 studzienek. Gdy grupowanie hierarchiczne następuje co 96 studzienek, co odpowiada pełnej płytce, daje to około 11 płytek i około 1041 studzienek. W dowolnym etapie grupowania hierarchicznego, plazmidowy DNA może być izolowany, co jest tym mniej pracochłonne, im mniej płytek jest zastosowanych, lecz może zaowocować utratą kompleksowości, pomimo, że nie powinno to nastąpić przy grupowaniu co 12. Grupowanie DNA może być także prowadzone z oryginalnym DNA.
Eksperymenty poniżej opisują jak powinno być przeprowadzone hierarchiczne grupowanie, zarówno w przypadku biblioteki E. coli, jak i DNA.
Uporządkowana biblioteka do techniki RNAi, z każdym genem z genomu C. elegans, wraz z jej zastosowaniami.
Jako że projekt sekwencjonowania genomu ma się ku końcowi, informacje te mogą być zastosowane do stosowania techniki inhibicji RNA T7. Każdy gen z genomu C. elegans może być sklonowany za pomocą PCR. Dogodnie, klonowane są egzony o minimalnej długości 500 pz. Jeśli egzon jest zbyt mały, mniejsze fragmenty będą izolowane za pomocą PCR, lub nawet części intronów i sąsiednich egzonów będą izolowane techniką PCR, dzięki czemu przynajmniej wystarczająca część regionu genu ulegającego translacji będzie sklonowana. W tym celu należy przeprowadzić przynajmniej 17000 reakcji PCR. Taka kolekcja produktów PCR zostanie sklonowana w wektorze T7 zgodnie z opisem (dwa promotory T7 ukierunkowane do siebie z miejscem wielokrotnego klonowania pomiędzy nimi). Każdy produkt PCR jest klonowany niezależnie, lub może być stosowany do generowania losowej biblioteki, analogicznie do opisanej biblioteki cDNA. Gdy każdy produkt PCR jest klonowany niezależnie, uzyskiwane bakterie i plazmidowy DNA mogą być grupowane różnymi sposobami. Po pierwsze, kolekcja niezależnie sklonowanych produktów PCR w wektorze RNA T7 i może być grupowana losowo, jak to opisano dla biblioteki losowej. Grupowanie można także prowadzić w bardziej racjonalny sposób. Przykładowo, geny z genomu C. elegans mogą być analizowane narzędziami bioinformatycznymi (biologia in silico). Różne geny z genomu mogą należeć do rodziny genów, lub posiadać homologi w genomie. Można zatem grupować członków rodziny genów, lub grupować członków będących homologami. W ten sposób całkowita liczba około 17000 klonów jest zredukowana do bardziej użytecznej ilości. Biblioteka ta może być zastosowana do poszukiwania fenotypów. Uzyskany fenotyp dostarcza funkcjonalnego opisu genu lub rodziny genów lub homologów genu z genomu C. elegans. Jako że biblioteka stanowi część wszystkich genów z genomu, sposób ten umożliwia opisanie pełnego genomu cechami funkcjonalno-fenotypowymi. W tym celu konieczne jest wprowadzenie dwuniciowego RNA (dsRNA) do robaków. Takie wprowadzenie pojedynczych klonów, lub klonów pogrupowanych, pogrupowanych losowo lub racjonalnie może być przeprowadzone kilkoma opisanymi metodami.
P r z y k ł a d wektora do ekspresji dwuniciowego RNAi
Dowolny wektor zawierający promotor T7 może zostać wykorzystany, zwłaszcza zawierający miejsce wielokrotnego klonowania (wiele z nich jest dostępnych komercyjnie). Zaprojektowano startery zawierające promotor T7 i starter z odwrotną nicią komplementarną, obydwa z odpowiednimi końcami. Startery te mogą hybrydyzować, i gdy są dobrze zaprojektowane, być wklonowane do wybranego wektora. Minimalną sekwencją promotora T7 jest TAATACGACTCACTATAGGGCGA. Pomimo tego, że do konstruowania wektora ekspresyjnego T7 może być zastosowany dowolny wektor, poniżej podano przykład wykorzystujący w tym celu wektor pGEM-3zf(-).
- Wektor pGEM-3zf(+) (PROMEGA) trawiono HindIII i SalI.
- Startery oGN1 i oGN2 mieszano wspólnie w ostatecznym stężeniu 1 μg/30 μ|, gotowano i schładzano powoli do temperatury pokojowej.
Starter ligowano do wektora stosując standardową procedurę ligacyjną. Uzyskano tak wektor pGN1 (pokazany na Figurze 1), który zawiera dwa promotory T7 skierowane do siebie, otaczające leżące pomiędzy nimi miejsce wielokrotnego klonowania.
PL 216 779 B1
Sekwencje oGN1 i oGN2 są następujące:
- oGN1: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
- oGN1: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC
P r z y k ł a d konstruowania biblioteki
RNA może być izolowany z każdego, wrażliwego względem RNAi organizmu. Ogólnie, wyizolowany RNA jest następnie kopiowany w postaci dwuniciowego cDNA, a następnie, umieszczany w odpowiednich wektorach do klonowania. Istnieje kilka procedur oraz zestawów, produkowanych przez różne firmy, włączając Promega, Clontech, Boehringer Mannheim, BRL, itp., stosowanych w biologii molekularnej i pozwalających na:
- izolację RNA,
- ewentualnie możliwość wyizolowania RNA polyA (dostępnych jest kilka technik oraz zestawów),
- syntezę pierwszej nici za pomocą odwrotnej transkryptazy AMV, losowych heksamerowych starterów i/lub starterów oligonukleotydowych (dT),
- syntezę drugiej nici za pomocą RNAzy H, Polimerazy DNA I,
- przygotowanie tępych końców za pomocą Polimerazy DNA T4,
- dodatek adaptera za pomocą ligazy DNA T4,
- ewentualną obróbkę za pomocą kinazy polinukleotydowej T4,
- klonowanie cDNA do wektora.
Otrzymana mieszanina ligacyjna może być rozumiana jako biblioteka cDNA. Ligacja obejmuje wszystkie cDNA stosowane w procedurze ligacji do odpowiedniego wektora. W celu uporządkowania biblioteki, wymagane jest transformowanie produktu ligacji do szczepów E. coli.
Zastosowanie tych szczepów E. coli lub biblioteki DNA
Szczep produkujący RNA T7:
- Standardowym szczepem jest BL21 (DE3): F-ompT[lon]hsds(r-m-; oraz szczep E. coli B) λ (DE3). Ewentualnie mogą być zastosowane warianty BL21, mimo zastosowania BL21(DE3) pLys.
- Powinien być skonstruowany jakikolwiek inny, dostępny szczep E. coli, produkujący polimerazę RNA T7. Można to wykonać w prosty sposób, stosując handlowo dostępny preparat faga, w tym wypadku wykorzystano, wektor λCΕ6 (dostarczany przez Promega). Prawie każdy szczep E. coli może być transfekowany za pomocą tego faga i będzie produkował polimerazę RNA T7.
- Mutant RNAzy III E. coli:
Z pośród rożnych, dostępnych początkowo szczepów, do zastosowania w pierwszym eksperymencie wybrano szczep AB301-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relA1, spoT1, metB1. (Kinder i wsp., 1973, Mol.Gen.Genet 126:53), ale inne szczepy mogą lepiej nadawać się do tego celu. Szczep ten zainfekowano λCΕ6, co pozwoliło na uzyskanie wariantu produkującego polimerazę RNA T7.
Dziki typ robaków C. elegans może być hodowany na podłożu bakteryjnym. Bakterie ekspresjonują polimerazę RNA T7. Powoduje to powstanie dużych ilości dwuniciowego RNA w jelicie C. elegans, który dyfunduje następnie w organizmie i wywołuje inhibicję ekspresji. Biblioteka ta może być wykorzystana do skriningu kilku fenotypów. Technika ta jest zalecana ze względu na większą szybkość wykrycia istotnych genów, biorących udział w pewnych ścieżkach, niż znana, stosowana w badaniach C. elegans, technologia. Ponadto, w przypadku znalezienia interesującego fenotypu, umożliwia ona łatwe sklonowanie odpowiedzialnego genu.
Zastosowanie hierarchicznie uporządkowanej metody pozwala na łatwe wykrycie w drugim skriningu istotnego dla eksperymentu klonu z całego zbioru. DNA, jaki uległ insercji w tym klonie może być następnie sekwencjonowany. Eksperyment ten dostarcza w jednym etapie dane genetyczne i biochemiczne.
Dziki typ szczepów C. elegans może być stosowany w połączeniu ze związkami służącymi do skriningu fenotypu, oporności na leki i/lub wrażliwości na leki. Szczep C. elegans może być szczepem zmutowanym, o wzmocnionym fenotypie, zredukowanym fenotypie, lub nowym fenotypie. Szczep C. elegans może być szczepem zmutowanym a w skriningu biblioteki wykorzystywane są różne związki. Dlatego też, skrining może być wykonany pod kątem oporności na leki, wrażliwości na leki, wzmocnionego fenotypu, zredukowanego fenotypu, lub nowego fenotypu. Szczep E. coli może być jakimkolwiek ekspresjonującym polimerazę RNA T7 szczepem, jak na przykład, BL21(DE3), ale tworzenie dwuniciowego RNA może być wzmocnione dzięki użyciu specjalnego szczepu E. coli, negatywnego pod względem RNAzy III. RNaza III rozpoznaje specyficzne pętle w dwuniciowym RNA.
PL 216 779 B1
Ostatecznie, możliwe jest zastosowanie szczepu E. coli, w którym nastąpiła delecja RNAz, innych niż RNaza III lub szczepu E. coli charakteryzującego się delecją jednej lub więcej RNAz. W większości znanych szczepów E. coli i konstruktów, zdolnych do generowania szczepów E. coli produkujących polimerazę RNA T7, ekspresja polimerazy RNA T7, ogólnie obejmuje indukowany promotor. Tym sposobem regulowana jest produkcja polimerazy RNA T7, zatem też, produkcja dwuniciowego RNA. Dogodnie, właściwość ta może być wykorzystana do pulsowego karmienia robaków C. elegans podczas specyficznych etapów ich wzrostu. Robaki hodowane są na nieindukowanych szczepach E. coli. W momencie gdy osiągają odpowiednie stadium, indukuje się w bakteriach produkcję RNA T7. Pozwala to na badanie działania jakiegokolwiek genu, w jakimkolwiek punkcie cyklu życiowego zwierzęcia.
Skrining biblioteki pod kątem homologii z przypuszczalnie genami będącymi przedmiotem zainteresowania ludzkimi i przypisywanie funkcji tym genom.
Podczas realizacji różnorodnych projektów, będących projektami genomowymi, ekspresjonowania różnicującego, analiz hybrydyzacyjnych itp., wyizolowano setki genów. Opisana biblioteka cDNA może dostarczać sposób na ocenę i /lub przypisanie funkcji tym genom w szybki i skuteczny sposób. Przede wszystkim, homologi z robaka lub homologi czy geny powinny być zidentyfikowane metodami bioinformatycznymi (biologia in silico). Przygotowywane są startery PCR oraz wyizolowane fragmenty cDNA przy użyciu technologii PCR. Reakcja PCR może być wykonana na hierarchicznie uporządkowanym zbiorze. Pozytywne zbiory lub pojedyncze studzienki zawierające bakterie posiadające odpowiedni cDNA są dostarczane jako karma dla C. elegans i odczytywany jest fenotyp.
PCR może być wykonany na cDNA wyizolowanym z C. elegans. Otrzymany DNA może być klonowany do wektora T7 i transformowany w produkujących dwuniciowy RNA E. coli, które następnie podawane są z karmą robakom C. elegans. Odpowiednią metodę należy wybrać zależnie od jej szybkości i wiarygodności.
W przypadku jeżeli gen należy do rodziny genów, może zaistnieć potrzeba karmienia robaków mieszaniną bakterii. Każda z nich obejmuje część członków rodziny genów. Szczepy E. coli, warunki wzrostu, stosowanie dodatkowych związków można opracować zgodnie z opisem powyżej.
Zastosowanie odpowiedniej biblioteki, w której wszystkie geny C. elegans są wklonowane w zorganizowany i określony sposób pozwala na łatwe wykrycie w tej bibliotece, za pomocą metod biologii in silico, homologów C. elegans i możliwie innych homologów, ortologów i członków rodziny genowej. Etap ten nie obejmuje PCR i umożliwia izolację obecnych podczas wzrostu robaków bakterii i/lub DNA.
P r z y k ł a d y
Założenie serii eksperymentów miało na celu przetestowanie zarówno wektora RNAi, jak i różnych, skonstruowanych szczepów E. coli.
1) Konstrukcja testowego plazmidu
W eksperymencie tym można zastosować jakikolwiek cDNA wywołujący wyraźny fenotyp robaków, w przypadku inaktywacji genu lub użyty w eksperymencie RNAi. Wiadomo, że odpowiednim kandydatem jest unc-22, ale możliwe jest zastosowanie innych genów. Wykorzystano system wrażliwości, możliwy do wykorzystania na etapie późnego stadium. System testowano za pomocą sup-35 i tła pha-1. Egzon 5 pochodzący z sup-35 wyizolowano za pomocą PCR i wklonowano do wektora pGN1 z promotorem T7. Tak otrzymany wektor oznaczono jako pGN2. Mutanty robaków pha-1 (e2123) nie są zdolne do wydania potomstwa w temperaturach wyższych niż 25°C. Wynika to z zakłóceń rozwojowych na etapie embriogenezy. W przypadku gdy sup-35 ulega inaktywacji lub inhibicji w takim szczepie, potomstwo może rosnąć w tej temperaturze. Połączone zastosowanie mutantów robaków pha-1 oraz sup-35 RNAi jest dobrym systemem do oceny różnych opcji.
2) Testowanie RNAi za pomocą szczepu E. coli, produkującego dwuniciowy RNA
- pGN2 został wprowadzony do szczepu E. coli BL21(DE3), a następnie za pomocą IPTG indukowano polimerazę RNA T7. Robaki C. elegans (pha-1 (e2123)) inokulowano do tych bakterii i hodowano w restrykcyjnej temperaturze 25°C. Ponieważ w takiej temperaturze hodowane są mutanty embrionowe, nie obserwuje się podczas takiej hodowli pojawiania się potomstwa. Natomiast w sytuacji skutecznej inhibicji genu sup-35 przez dwuniciowy RNA obecny w E. coli, zaobserwuje się obecność potomstwa.
- pGN2 został wprowadzony do szczepu E. coli AB301-105 (DE3), a następnie za pomocą IPTG indukowano polimerazę RNA T7. Robaki C. elegans (pha-1 (e2123)) inokulowano do tych bakterii i hodowano w restrykcyjnej temperaturze 25°C. Ponieważ w takiej temperaturze hodowane są mu10
PL 216 779 B1 tanty embrionowe, nie obserwuje się podczas takiej hodowli pojawiania się potomstwa. Natomiast w sytuacji skutecznej inhibicji genu sup-35 przez dwuniciowy RNA obecny w E. coli, zaobserwuje się obecność potomstwa.
3) Udoskonalenie szczepu robaków w celu lepszego pobierania dwuniciowego RNA
Przed rozpoczęciem hodowli C. elegans pha-1 na płytkach, w obecności szczepu E. coli, produkującego dwuniciowy RNA sup-35, robaki poddano mutagenezie za pomocą EMS (metanosulfonian etylu). Potomstwo tak zmutowanych robaków umieszczano na płytkach z bakteriami. Robaki wzrastające na tych bakteriach dawały większe ilości potomstwa, cechującego się mutacją, co powodowało zwiększone pobieranie dwuniciowego RNA i pozwalało na zastosowanie w kolejnych eksperymentach.
Stabilne włączenie wektora odpowiedzialnego za produkcję dwuniciowego RNA do genomu robaków produkujących polimerazę RNA T7.
Wektor E. coli skonstruowano tak, by posiadał następujące właściwości: dwa promotory T7, skierowane ku sobie i pomiędzy tymi dwoma promotorami miejsce restrykcyjne lub miejsce wielokrotnego klonowania. Ponadto, wektor może zawierać genomowy DNA C. elegans sup-35, skonstruowany tak, by zawierał kilka kodonów stop w różnych obszarach tak, by nie było ekspresji pełnej długości białka z fragmentu genomowego DNA sup35, jak przedstawiono na Figurze 8. W miejscu wielokrotnego klonowania, pomiędzy dwoma promotorami T7, może być klonowany jakikolwiek cDNA lub fragment cDNA. Gdy taki wektor wprowadzany jest do szczepu C. elegans ekspresjonującego polimerazę RNA T7, to cDNA lub fragment cDNA wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7, ulega transkrypcji, generując z wklonowanego fragmentu dwuniciowy RNA.
Wektor zaprojektowany jest do zastosowania w przypadku mutantów pha-1 (e2123) robaków ekspresjonujących polimerazę RNA T7. Ekspresja polimerazy RNA T7 może mieć charakter konstytutywny lub podlegać regulacji, zachodzić ogólnie lub tkankowo-specyficznie. Robaki pha-1 (e2123) nie mogą wytwarzać potomstwa w temperaturze wyższej niż 25°C, co wynika z zakłóceń rozwojowych podczas embriogenezy. Natomiast, w przypadku gdy, sup-35 ulega inhibicji lub inaktywacji w tym szczepie, możliwy jest wzrost potomstwa w tej temperaturze.
Po wprowadzeniu do robaków wektora, może on ulec integracji w wyniku homologicznej rekombinacji (integracja typu Campbell). Wykazano, że taka homologiczna rekombinacja zachodzi u C. elegans, jednak z niską częstotliwością (Plasterk i Groenen, EMBO J. 11:287-290, 1992). Homologiczna rekombinacja w obrębie genu sup-35 daje w wyniku jego inaktywację, jako że dwa otrzymane geny sup-35 zawierają kodony stop. W rezultacie, robak i jego potomstwo, jeżeli taka rekombinacja zaszła w jajeczkach, posiada, zintegrowaną w swoim genomie kopię wektora. Dzięki temu może być przeprowadzona na podstawie posiadania potomstwa w temperaturze wyższej niż 25°C selekcja robaków z inaktywowanym sup-35. Ponadto, taki robak trwale produkuje dwuniciowy RNA, pochodzący z fragmentu DNA wklonowanego uprzednio pomiędzy dwoma promotorami T7. Tak scharakteryzowany typ robaka można uważać za trwale transgeniczny szczep organizmu o zredukowanej funkcji genu, z którego fragment został wcześniej wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7.
DNA może być dostarczany do organizmu robaków za pomocą kilku technik, włączając iniekcję, transformację balistyczną, moczenie w roztworze DNA, dodatek do karmy bakterii. Można rozważyć nowe i inne metody zwiększające wydajność transformacji.
Docelowy szczep C. elegans może, dodatkowo, zawierać inne mutacje, niż mutację pha-1 (e2123) i ekspresjonować inne geny, niż polimerazę RNA T7.
P r z y k ł a d B: Drożdżowy wektor dwuhybrydowy RNAi
Drożdżowy wektor dwuhybrydowy skonstruowany został tak, by zawierał dwa promotory T7. Wektory takie zaprojektowano tak, by ulegały replikacji, zarówno w drożdżach, jak i w E. coli. Ogólnie, biblioteki cDNA w przypadku drożdżowego systemu dwuhybrydowego konstruowane są w wektorach Ga14 lub LexA. Biblioteka konstruowana jest w wektorach posiadających domenę aktywacyjną jednego z tych genów. Wektor można skonstruować w taki sposób, aby wciąż przeprowadzać skrining, ale żeby również zawierał on te dwa promotory T7, zorientowane ku sobie i obejmował miejsce klonowania pomiędzy nimi. Ułożenie sekwencji w plazmidzie będzie zatem miało postać: szkielet plazmidu, (GAL4-T7), MCS, T7, szkielet. Biblioteka cDNA C. elegans skonstruowana w takim wektorze może być zastosowana jako standardowa drożdżowa, dwuhybrydowa biblioteka w eksperymencie izolacji białek oddziałujących z danym białkiem. Po wyizolowaniu klonu, plazmid może być wprowadzany do szczepu E. coli ekspresjonującego polimerazę RNA T7, w wyniku czego uzyska się produkcję dwuniciowego RNA, pochodzącego od wklonowanego fragmentu. Bakterie produkujące taki dwuniciowy
PL 216 779 B1
RNA mogą być włączone do pokarmu robaków i można oceniać fenotypy. Jak w poprzednim przykładzie, taka procedura oceny dla nowo wyizolowanego drożdżowego dwuhybrydowego klonu jest znacznie krótsza niż standardowa procedura, wymagająca PCR i/lub etapów klonowania, eksperymentów z wykorzystaniem RNA i/lub eksperymentów inaktywujących gen. W większości przypadków, wyizolowane klony są na początku sekwencjonowane, a na podstawie sekwencji podejmowana jest decyzja czy eksperyment powinien być dalej kontynuowany. Każdy wyizolowany klon może być łatwo wprowadzony do odpowiedniego szczepu E. coli i dostarczony robakom. Ocenę przeprowadza się następnie przez analizę fenotypową.
W celu zastosowania tej procedury przygotowano drożdżową podwójną hybrydę, wykorzystując znany gen jako przynętę oraz nowo skonstruowaną bibliotekę jako cel. Docelowe białka kodowane przez klony oddziałujące z białkiem - przynętą dały w rezultacie pozytywne klony drożdżowe, ekspresjonujące cząsteczkę reporterową, tak jak obserwowane to jest w przypadku LacZ oznaczanego za pomocą X-gal. Plazmid kodujący docelowe białko jest izolowany bezpośrednio ze szczepu drożdży i wprowadzany do E. coli. Szczep E. coli jest szczepem produkującym polimerazę RNA T7. W tym przypadku, dwuniciowy RNA produkowany jest z DNA wklonowanego w miejscu wielokrotnego klonowania wektora. Po wprowadzeniu takiego dwuniciowego RNA, wraz z karmą do organizmu robaków, za pomocą opisanych uprzednio metod, gen ulega inhibicji u tych organizmów, co skutkuje określonym fenotypem.
- Taki drożdżowy dwuhybrydowy wektor może być dogodnie zastosowany do konstruowania uporządkowanej i hierarchicznie pogrupowanej biblioteki, jak opisano w poprzednim przykładzie.
- Możliwe jest skonstruowanie szczepu drożdży warunkowo produkującego polimerazę RNA T7. W wyniku zastosowania w eksperymentach drożdżowych podwójnych hybryd, można uzyskać indukcję ekspresji polimerazy T7, co wywołuje w rezultacie produkcję dwuniciowego RNA w komórkach drożdżowych. Konsekwentnie, drożdże mogą być dostarczane w pokarmie robakom. Wykazano, że robaki C. elegans mogą otrzymywać w karmie drożdże.
Konstrukcja szczepu produkującego polimerazę RNA T7 i jego zastosowania
Możliwe jest skonstruowanie szczepu C. elegans, tak by produkował on polimerazę RNA T7. Ekspresja może mieć charakter konstytutywny i ogólny, ale możliwe jest też uzyskanie jej regulacji pod tkankowo-specyficznym promotorem, promotorem ulegającym indukcji, lub promotorem czasowym lub promotorem posiadającym jedną z tych właściwości lub też ich kombinację. Do tak przygotowanego szczepu C. elegans może być wprowadzany DNA. Wprowadzenie DNA uzyskuje się w wyniku iniekcji, czy wstrzeliwania cząsteczek, dzięki zastosowaniu elektroporacji, lub, jak wcześniej wspomniano, poprzez dostarczenie wraz z karmą. W przypadku, gdy DNA ma postać plazmidu, jak opisano w poprzednich przykładach, np. jest plazmidem zawierającym wklonowany fragment cDNA lub fragment otrzymany w wyniku PCR, pomiędzy dwoma flankującymi promotorami T7, w komórkach lub w całym organizmie powstaje dwuniciowy RNA, pochodzący od tego cDNA lub fragmentu PCR, co wywołuje inhibicję odpowiedniego genu. Tak wprowadzony DNA może wydajnie pośredniczyć w przejściowej inhibicji. Wprowadzony DNA może tworzyć struktury pozachromosomalne, które mogą powodować w rezultacie więcej katalitycznych inaktywacji lub redukcji funkcji fenotypowych. Plazmid może również ulec integracji z genomem organizmu, powodując takie katalityczne inaktywacje lub redukcję funkcji fenotypowych, ale w postaci utrwalonej i stabilnie przenoszonej.
- W wyniku zastosowania standardowych metod możliwe jest wprowadzenie do organizmu robaka produkującego polimerazę RNA T7, plazmidu DNA, zawierającego cDNA lub część cDNA lub EST, lub fragment PCR pochodzący z C. elegans, wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7, jak opisano w Przykładach A) oraz B). Możliwa jest analiza fenotypów - DNA, pochodzący z uporządkowanej biblioteki, jak w Przykładzie A) może być wprowadzony do organizmu robaków, produkujących polimerazę RNA T7, w wyniku zastosowania standardowych technik (iniekcja, wstrzeliwanie). Możliwa jest analiza fenotypów. Wyjściowy klon może być łatwo odnaleziony przy użyciu metody hierarchicznego uporządkowania.
- Taka sama procedura może być zastosowana w przypadku mutantów robaków ekspresjonujących polimerazę RNA T7. Możliwy jest skrining dla wzmocnionego, zredukowanego lub nowego fenotypu.
- Procedura może być zastosowana w celu przeprowadzenia skriningu związków. Skrining, zarówno dla dzikiego szczepu, jak i dla zmutowanego możliwy jest dla wzmocnionego lub nowego fenotypu.
PL 216 779 B1
- DNA może być wprowadzony do organizmu robaków w wyniku zastosowania nowych metod. Jedną z nich jest dostarczenie DNA poprzez E. coli. W tym przypadku, hierarchicznie uporządkowana biblioteka jest dostarczana jako karma zwierzęciu. W celu zapobiegnięcia trawieniu DNA E. coli w jelicie nicienia, dogodnie stosuje się C. elegans z niedoborem DNAzy, taki jak nuc-1 (e1392). Procedura ta jest jedną z najbardziej interesujących ze względu na brak zależności od wydajności transformacji, jaka występuje w przypadku innych technik, i ogólnie, pozwala na szybsze i mniej pracochłonne wykonanie eksperymentu.
2) Przypuszczalne wzmocnienie metody
- wektor projektowany jest tak, by zawierał cDNA sup-35 lub część tego cDNA, wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7. Pozostała część wektora jest taka jak opisano w Przykładzie A) i B). Taki wektor może być wprowadzony do mutanta pha-1ts C. elegans. W tym przypadku stosuje się system selekcji oparty na temperaturze, wskazujący robaki, które posiadają zdolność przeżycia w restrykcyjnej temperaturze dzięki uprzedniemu pobraniu DNA i ekspresji dwuniciowego RNA sup-35. Możliwe jest otrzymanie hierarchicznej uporządkowanej biblioteki poprzez zastosowanie jakiejkolwiek metody opisanej powyżej.
- do konstrukcji biblioteki wprowadzonej do ekspresjonującej polimerazę RNA T7 E. coli może być zastosowany wektor. W tym przypadku możliwy jest analogiczny skrining, jak w części A), wraz z dodatkowym skriningiem robaków, u których aktywny jest dwuniciowy RNA sup-35.
- DNA i/lub dwuniciowy RNA sup-35 mogą być dostarczone za pomocą odrębnych plazmidów. W przypadku karmienia, zarówno DNA dostarczanym z karmą (Przykład C), jak i dwuniciowym RNA dostarczanym z karmą Przykład A) i B), możliwe jest dostarczenie dwóch plazmidów, obecnych w jednej bakterii, lub dostarczenie z karmą mieszaniny bakterii, z których jedna zawiera konstrukt sup-35.
P r z y k ł a d konstrukcji C. elegans produkującego RNA T7
W celu uzyskania produkcji polimerazy RNA T7 w organizmie robaka, dostępnych jest kilka możliwości. Polimeraza T7 może być ekspresjonowana pod kontrolą różnych promotorów, promotorów ulegających indukcji, promotorów konstytutywnych, ogólnych i tkankowo- (komórkowo) specyficznych, lub promotorów będących kombinacją wyżej wymienionych. Przykładami takich promotorów są promotor szoku cieplnego hsp-16, promotor jelitowy ges1, promotor pochodzący z cet858, jak również promotor z dpy7 oraz element promotorowy GATA1. W powyższym przykładzie polimeraza RNA T7 ekspresjonowana jest pod kontrolą promotora hspl6, dostępnego w wektorze pPD49.78. Polimeraza RNA T7 izolowana jest jako produkt PCR z użyciem starterów GN3 oraz GN4.
Otrzymany w wyniku reakcji PCR produkt trawiony jest za pomocą enzymów NheI oraz NcoI, jak wektor, który ma być użyty do klonowania, wektor Fire pPD49.78. Otrzymany wektor jest wektorem pGN100, przedstawionym na Figurze 2 i obejmuje oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC, oGN4 : ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG.
Wektor wprowadzany jest do organizmu robaka za pomocą standardowych technik, na przykład mikroiniekcji.
W kolejnym etapie konstruowane są następujące szczepy:
- Dziki typ (pGN100)
- nuc-1 (e1392) (pGN100)
- pha-1 (e2123) (pGN100)
- pha-1; nuc-1 (pGN100)
Wszystkie wymienione szczepy są zdolne do produkcji polimerazy RNA T7 pod wpływem indukcji temperaturowej lub, alternatywnie, w wyniku indukcji uzyskanej dzięki obecności metali, takich jak zastosowanie metali ciężkich, jak kadm lub rtęć. Procedura indukcji za pomocą temperatury polega na podwyższeniu temperatury dla zwierzęcia do 30-33°C przez przynajmniej godzinę, a następnie powrót do standardowej temperatury (15-25°C).
W celu uzyskania produkcji jakiegokolwiek RNA w organizmie robaka może być zastosowany dziki typ szczepu produkującego polimerazę RNA T7. Bardziej specyficznie, do organizmów robaków mogą być wprowadzone plazmidy pochodzące z opisanych bibliotek, a następnie może być przeprowadzana ocena fenotypowa.
Mutant nuc-1 robaka może być wykorzystany w eksperymencie wprowadzenia DNA przez bakterie, poprzez dostarczanie bakterii z pokarmem. Ze względu na to, że mutant nuc-1 nie posiada zdolności trawienia DNA, plazmidowy DNA może przejść poprzez ściany jelita. Jeżeli jest on pobrany przez komórki produkujące polimerazę RNA T7, możliwa jest produkcja dwuniciowego RNA i przez to inhibicja genu, z którego ten RNA uległ transkrypcji.
PL 216 779 B1
Szczep mutanta pha-1, produkujący polimerazę RNA T7 może być zastosowany do wzmocnienia procedury, jak opisano powyżej. DNA może być wprowadzony w wyniku wstrze|iwania, mikroiniekcji lub karmienia. Bardziej specyficznie, szczep ten może być wykorzystany dla wektorów produkujących dwuniciowy RNA pochodzący z sup-35 i z będącego przedmiotem zainteresowania genu, którym może być produkt PCR, cDNA lub biblioteka, zgodnie z tym, jak opisano powyżej.
Mutant pha-1; nuc-1 produkujący polimerazę RNA T7 może być wykorzystany w eksperymencie opartym na bakteryjnym dostarczeniu DNA. DNA dogodnie jest plazmidem, produkującym dwuniciowy RNA pochodzący z zarówno sup-35, jak i genu będącego przedmiotem zainteresowania. Mutant ten będzie preferencyjnie produkował polimerazę RNA T7 w jelicie. Dostarczenie będzie preferencyjnie zachodziło dzięki wzrostowi robaka w obecności bakterii posiadających plazmid.
Zastosowanie techno|ogii RNAi u roślin
Nicienie powodują znaczną część szkód występujących u roślin, w szczególności dotyczy to roślin uprawnych. Zgodnie z wyna|azkiem, procedury RNAi mogą być zastosowane w przypadku roślin w celu uniemożliwienia dłuższego żerowania pasożytniczych nicieni. W pierwszym etapie, izolowany jest z pasożytującego na roślinie nicienia krytyczny dla przeżycia lub wzrostu, bądź też dla odżywiania |ub pro|iferacji fragment DNA. Odpowiedni do tego celu jest jakikolwiek gen, którego ekspresja jest ważna do przeżycia.
Następnie poddaje się klonowaniu część, egzon lub cDNA tego genu. Taki fragment DNA może być wklonowany pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora, korzystnie, promotora specyficznego d|a korzenia, a nawet korzystniej, pomiędzy dwoma, specyficznymi dla korzenia promotorami. DNA wklonowanego genu pod kontrolą promotora specyficznego dla korzenia wprowadza się do doce|owej rośliny za pomocą technologii transgenicznych roślin. Możliwe jest uzyskanie dla każdego pasożytniczego nicienia odmiennych fragmentów DNA i podobnie dla każdej odmiany roślinnej istnieje potrzeba zastosowania różnego promotora.
W ten sposób, w przypadku wykorzystania specyficznego d|a korzenia promotora, korzeń będzie produkował RNA |ub dwuniciowy RNA pochodzący z wprowadzonego fragmentu DNA. Ze wzg|ędu na to, że nicienie odżywiają się na roślinach, RNA i/|ub dwuniciowy RNA będzie spożywany lub przyjmowany przez nicienie. Umożliwia to dostarczenie RNA i/|ub dwuniciowego RNA do komórek nicieni, a następnie jego inhibujące działanie względem docelowego DNA. W zależności od charakteru wklonowanego fragmentu DNA, nicienie są niezdolne do przeżycia, odżywiania się, proliferacji, itd., w każdym przypadku uniemożliwia to dalsze żerowanie zwierzęcia na roślinie i przez to zapewnia tej roślinie ochronę.
Konstrukcja C. elegans produkującego polimerazę RNA T7
Istnieje kilka możliwości uzyskania produkcji polimerazy RNA T7, |ub innych po|imeraz RNA, u zwierząt, a szczególnie, u nicieni, zwłaszcza w przypadku C. elegans. Po|imeraza RNA T7 może ulegać ekspresji pod kontrolą różnych promotorów. Promotory te mogą mieć charakter indukowany lub konstytutywny, ogólny, bądź tkankowo-specyficzny, lub też być kombinacją wyżej wymienionych promotorów.
P r z y k ł a d 1:
Konstrukcja podstawowego wektora służącego do ekspresji polimerazy T7 u C. elegans
Dzięki zastosowaniu PCR dokonano, zgodnie z standardowymi procedurami, amp|ifikacji sekwencji kodującej polimerazę T7 z λ CE6 (Novagen, Medison, USA), przy czym w reakcji tej wykorzystano następujące startery: oGN2 6(ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) oraz oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) (PCR, A practica| approach, 1993, Ed. J.McPherson i wsp., IRL Press). Otrzymany fragment DNA, kodujący polimerazę RNA T7 trawiono enzymami AgeI oraz Eco RI, a następnie wstawiano do wektora Fire pPD97.82, trawionego AgeI i Eco RI. Tak otrzymany konstrukt kodował otwartą ramkę odczytu dla polimerazy RNA T7, w połączeniu z białkiem sygnałowym lokalizacji jądrowej dużego antygenu T SV40 (NLS) o sekwencji aminokwasowej MTAPKKKRKVPV. Taka sekwencja sygnałowa lokalizacji jądrowej konieczna jest do translokacji polimerazy RNA T7 z cytoplazmy do jądra, gdzie możliwe jest wiązanie ze specyficznymi dla niej promotorami, określonymi jako promotory T7. Powyżej sekwencji kodującej białko fuzyjne polimerazy T7 znajduje się minimalny promotor (myo-2), poprzedzony przez miejsce wie|okrotnego k|onowania (MSC), w którym możliwe jest wstawienie kilku promotorów C. elegans. P|azmid ten (pGN105, przedstawiony na Figurze 11) jest podstawowym p|azmidem po|imerazy RNA T7 umożliwiającym ekspresję polimerazy T7 u C. elegans. Pochodne tego plazmidu zawierają wklonowane w miejscu wie|okrotnego k|onowania promotory, zapewniające indukowaną, konstytutywną, ogólną lub też tkankowo-specyficzną
PL 216 779 B1 ekspresję polimerazy RNA T7 u C. elegans, ponieważ ekspresja ta podlega kontroli i regulacji, zależnie od wklonowanego, w miejscu wielokrotnego klonowania, promotora.
Znana jest indukcja ekspresji wymienionych promotorów w następujących tkankach: let-858 (ogólna ekspresja), myo-2 (ekspresja w gardzieli), myo-3 (mięśnie ciała), egl-15 (mięśnie sromowe), unc-119 (pan-neurony), ale te promotory nie stanowią ograniczenia.
P r z y k ł a d 2:
Konstrukcja wektora do ekspresji polimerazy RNA T7 w tkance mięśniowej C. elegans
Dzięki zastosowaniu PCR dokonano amplifikacji sekwencji kodującej polimerazę T7 z λCE6 (Novagen, Medison, USA), przy czym w reakcji tej wykorzystano następujące startery: oGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) oraz oGN44 (CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG). Następnie trawiono za pomocą enzymów Agel/Spel i wstawiano do wektora pGK13, trawionego Agel/Spel. (Wektor ten zawierał silny promotor SERCA, kierujący ekspresją w gardzieli, mięśniach sromowych, mięśniach ogona i ciała). Sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) dużego antygenu T SV40 wstawiono z przodu sekwencji kodującej polimerazę T7 poprzez wstawienie w miejscach restrykcyjnych Sacl/Agel dwóch, zachodzących oligonukleotydów oGN45 (CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) oraz OGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC). Otrzymany konstrukt, przedstawiony na Figurze 10, nazwano pGN108. Wprowadzenie tego plazmidu do C. elegans wywoływało ekspresję polimerazy RNA T7 w mięśniach gardła i sromu oraz mięśniach ogona i ciała.
W celu sprawdzenia ekspresji i działania polimerazy RNA T7, pod kontrolą i regulacją promotora SERCA u C. elegans, wstrzykiwano do jego organizmu pGN108, kodujący polimerazę RNA T7, pod kontrolą promotora SERCA. Jednocześnie wstrzykiwano testowy wektor, kodujący GFP, pod kontrolą promotora T7 (pGN401 na Figurze 13). Plazmid pGN401 skonstruowano poprzez wstawienie w miejscu Sacl/Agel otwartego wektora FIRE pPD97.82 dwóch zachodzących oligonukleotydów oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) oraz oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT), tworząc promotor T7. Ponadto, wraz z plazmidami, wstrzyknięto marker selekcyjny, pozwalający na określenie stopnia transformacji (rol6, pRF4). Specjalistom w dziedzinie dobrze znany jest ten ostatni wektor selekcyjny pRF4. Transgeniczne F1 mogą być łatwo uzyskane ze względu na pojawiający się fenotyp rol6. Tak uzyskane transgeniczne C. elegans, wszystkie, ekspresjonują GFP w gardzieli, mięśniach sromowych, mięśniach ogona i ciała. Zatem dane te jasno wskazują na to, że polimeraza RNA T7 jest funkcjonalnie ekspresjonowana pod kontrolą promotora SERCA. Tak ekspresjonowana polimeraza RNA T7 wiąże się z promotorem T7, obecnym w pGN401 i inicjuje transkrypcję genu GFP, który jest następnie funkcjonalnie ekspresjonowany, co wywołuje pojawienie się fluorescencji w tkankach mięśni, w których promotor SERCA indukuje ekspresję polimerazy RNA T7.
P r z y k ł a d 3:
Konstrukcja wektora niespecyficznej ekspresji polimerazy T7 u C. elegans
Z pGN108 izolowano gen fuzyjny NLS-polimerazy RNA T7 za pomocą Xmal/Bsp1201 i klonowano do wektora Fire pPD103.05, trawionego XmaI/Bsp1201. W rezultacie otrzymano wektor, w którym polimeraza RNA T7 znajduje się pod kontrolą promotora let858. Ten specyficzny promotor umożliwia ekspresję polimerazy RNA T7 we wszystkich tkankach. Tak otrzymany plazmid nazwano pGN110 (Figura 14).
P r z y k ł a d 4:
Konstrukcja wektora do ekspresji fragmentów DNA, genów i cDNA, zależnej od polimerazy RNA T7 pod kontrolą promotora T7
Wektor Fire pPD97.82 trawiono za pomocą Sacl/Agel i, poprzez wstawienie w miejscach restrykcyjnych Sacl/Agel dwóch zachodzących oligonukleotydów oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) oraz oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) generowano sekwencję promotora T7. Konstrukt ten (pGN400, Figura 12) zawierał otwartą ramkę odczytu GFP, wklonowaną pomiędzy miejscami restrykcyjnymi endonukleaz SacI i EcoRI pod kontrolą promotora T7. Do takiego wektora, w wyniku dokonania delecji genu GFP w postaci fragmentu Agel/SacI i wklonowaniu do wektora fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania, może być wklonowany jakikolwiek gen, cDNA lub fragment DNA. Dogodnie, fragment DNA będący przedmiotem zainteresowania można uzyskać za pomocą reakcji amplifikacji PCR, poprzez wstawienie miejsca Sacl/Afel w startery. Tak otrzymany po amplifikacji PCR fragment DNA jest trawiony i gen GFP w pGN400 zastępowany amplifikowanym fragmentem DNA.
PL 216 779 B1
W celu uzyskania indukowanej ekspresji polimerazy RNA T7 u C. elegans możliwe jest użycie jakiegokolwiek wektora zawierającego promotor T7, takiego jak handlowo dostępne wektory pGEM i pBluescript. Wykazano to jasno na przykładzie wektora pGN401, ekspresjonującego GFP pod kontrolą promotora T7 u transgenicznych C. elegans, ekspres jonujących polimerazę RNA T7.
Zastosowanie pGN400 ma zaletę związaną z tym, że wektor ten zawiera fragment 3'UTR, pochodzący z unc-54, powodujący wzmocnienie transkrypcji lub stabilności RNA.
Wytwarzanie trwałych, tkankowo-specyficznych pseudoinaktywacji RNAi linii C. elegans
Inaktywacja genu u C. elegans uzyskiwana jest obecnie w wyniku losowych, przeprowadzanych na dużą skalę mutagenez i opartej na PCR sib-selekcji. Metoda ta jest niewygodna, czasochłonna oraz mało interesująca. Wykazano, że wprowadzenie dwuniciowego RNA do komórki wywołuje silne i specyficzne oddziaływanie na ekspresję endogennych genów. W przypadku C. elegans można uzyskać zahamowanie ekspresji genu poprzez wstrzyknięcie RNA do jamy ciała robaka, moczenie robaka w roztworze zawierającym dwuniciowy RNA lub karmienie bakteriami E. coli, ekspres-sjonującymi odpowiadający badanemu genowi, dwuniciowy RNA. Komórki C. elegans posiadają zdolność pobierania dwuniciowego RNA z ich zewnątrzkomórkowego środowiska. Stwierdzono, że mRNA jest celem genetycznych oddziaływań, w których pośredniczy taki dwuniciowy RNA (Montgomery i Fire, 1998). Sugerowano również, że degradacja docelowego RNA ma miejsce w jądrze, przed możliwą translacją. Mimo że mediowana poprzez RNAi redukcja ekspresji genu może zostać przekazana następnym pokoleniom, dziedziczność jest słaba i efekt ten jest szybko tracony u kolejnego potomstwa. Zjawisko to wywołane jest prawdopodobnie w wyniku stałego obniżania ilości dwuniciowego RNA. W niniejszym eksperymencie zaproponowano metodę stworzenia linii C. elegans o stałym, dziedzicznym fenotypie RNAi. Metoda ta obejmuje wytwarzanie transgenicznych linii C. elegans poprzez wprowadzenie plazmidów zawierających fragmenty cDNA docelowego genu w sensownej i antysensownej orientacji, pod kontrolą promotora pochodzącego z tych robaków lub też, poprzez transkrypcję cDNA o odwrotnie powtórzonej sekwencji z pojedynczego konstruktu. Alternatywnie, możliwe jest uzyskanie transkrypcji dwuniciowego RNA z wektora zawierającego cDNA, flankowanego przez dwa promotory T7 w ekspresjonującym polimerazę T7 szczepie C. elegans. W wyniku tego otrzymuje się transgeniczny organizm o dziedzicznie stabilnym pseudo inaktywowanym fenotypie. Ekspresja cDNA lub polimerazy T7 może mieć charakter ogólny i konstytutywny, ale też może podlegać regulacji pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora. W przeciwieństwie do RNAi indukowanego poprzez pochodzący z zewnątrz dwuniciowy RNAi (wstrzykiwany, wchłaniany poprzez moczenie lub podawany jako pożywienie), metoda ta umożliwia uzyskanie warunkowej, tkankowo-specyficznej inhibicji ekspresji genu.
Inhibicja ekspresji unc-22 poprzez zakłócenia RNA wywołujące pojawienie się kurczącego się fenotypu.
cDNA unc-22 (egzon22) wklonowano w sensownej i antysensownej orientacji w pPD103.05. (A.Fire nr L2865), zawierającym zdolny do ekspresji sekwencji RNA we wszystkich tkankach, promotor let 858. Otrzymane plazmidy nazwano pGN205 (Figura 19a) oraz pGN207 (Figura 19b). Konstrukty te wprowadzono do C. elegans wraz z markerem selekcyjnym (rol6; GFP). Transgeniczne osobniki F1 (ekspresjonujące rol-β lub GFP) wykazywały kurczący się fenotyp, wskazując, że RNAi mogłaby być zależna od endogennej transkrypcji RNA z transgenicznego DNA. Fenotyp RNAi przenoszony był wraz z markerem selekcyjnym do kolejnego potomstwa. W ten sposób otrzymano linie C. elegans o stałym fenotypie RNAi.
Produkcja stabilnych linii polimerazy RNA T7 oraz podwójnie transgenicznych robaków
System ekspresji u C. elegans oparty na egzogennej polimerazie RNA wymaga obecności dwóch plazmidów. Jeden z plazmidów powinien kodować polimerazę RNA pod kontrolą specyficznego promotora, podczas gdy drugi, mający ulec ekspresji fragment DNA, pod kontrolą promotora T7. W przypadku częściowo stabilnego RNAi zaprojektowano również pseudo-stabilne inaktywacje genu i DNA będący przedmiotem zainteresowania klonowano pomiędzy dwoma promotorami T7, wywołując tym produkcję dwuniciowego RNA.
Ze względu na to, że system ekspresji polimerazy RNA T7 jest systemem wysokiej ekspresji wywołuje to problemy związane z otrzymaniem podwójnie transgenicznych zwierząt. Jeżeli mający ulec ekspresji w nicieniu C. elegans gen jest toksyczny, powoduje to efekt letalny i wskutek tego w konstrukcie C. elegans brak silnie regulowanej, stabilnej ekspresji interesującego genu. Jeżeli będący przedmiotem zainteresowania gen jest istotny dla przeżycia organizmu, RNAi wraz z fragmentem DNA z tego genu wywołuje również letalny efekt, tak więc nie są możliwe pseudo-stabilne inaktywacje genu. W celu ominięcia tego problemu opracowano zgodnie z wynalazkiem system obejmujący dwa
PL 216 779 B1 transgeniczne zwierzęta. Pierwsze jest transgeniczne ze względu na polimerazę RNA T7, która może ulegać ekspresji we wszystkich komórkach lub specyficznych komórkach, bądź też w tkankach, jak wykazano w poprzednich przykładach. Drugie zwierzę jest transgeniczne ze względu na będący przedmiotem zainteresowania fragment DNA. Gen ten, lub cDNA, związany jest z promotorem T7 lub, w celu uzyskania RNAi, fragment DNA takiego genu wklonowany jest pomiędzy dwa promotory T7.
Oba transgeniczne zwierzęta są żywotne i nie wykazują jakiejkolwiek nieprawidłowości fenotypowej. Uzyskano ten efekt dzięki temu, że w przypadku pierwszego transgenicznego organizmu, ekspresjonowana polimeraza RNA T7 nie jest toksyczna, nawet jeśli poziom ekspresji jest wysoki. W przypadku drugiego transgenicznego organizmu, gen będący przedmiotem zainteresowania nie ulega ekspresji lub też nie jest produkowany dwuniciowy RNA, ze względu na to, że zwierzęta te nie posiadają polimerazy RNA T7.
Ekspresję genu lub cDNA będącego przedmiotem zainteresowania, czy też RNAi z fragmentem DNA można obecnie uzyskać poprzez skrzyżowanie dwóch transgenicznych zwierząt. Tak uzyskane potomstwo jest podwójnie transgeniczne i ekspresjonuje gen będący przedmiotem zainteresowania lub też ekspresjonuje dwuniciowy RNA fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.
W celu uzyskania odpowiedniej liczby osobników męskich w wyniku takiej krzyżówki, jeden z takich transgenicznych osobników może być mutantem C. elegans o fenotypie sprzyjającym powstawaniu potomstwa męskiego. Przykładem takiego mutanta jest him-5. Preferencyjnie taki mutant umożliwi otrzymanie transgenicznych pod względem polimerazy RNA T7 C. elegans, gdzie hermafrodyty zawierają fragment DNA pod kontrolą promotora T7.
W celu dokonania skutecznej selekcji podwójnie transgenicznego potomstwa możliwe jest wprowadzenie transgenu do drugiego transgenicznego zwierzęcia. Taki transgen powinien zawierać gen reporterowy pod kontrolą promotora T7. Genem reporterowym może być GFP, lucyferaza, beta-galaktozydaza lub beta-laktamaza. Przykładem takiego transgenu są wektory pGN400 oraz pGN401.
W celu uzyskania indukowanej, tkankowo-specyficznej ekspresji transgenu C. elegans wykorzystuje się stado osobników męskich (np. him-5) posiadających konstrukt polimerazy T7 pod kontrolą różnych promotorów C. elegans, umożliwiających tkankowo-specyficzną ekspresję. Osobniki takie krzyżuje się z hermafrodytami, przenoszącymi gen będący przedmiotem zainteresowania pod kontrolą promotora T7.
Ponadto, wprowadzane geny mogą ulec integracji z genomem zwierzęcia. Metody pozwalające na trwałą integrację plazmidu z genomem zwierzęcia zostały opisane (Methods in cell biology, Vol.48, 1995, ed. Epstein i Shakes, academic press) i obejmują napromieniowanie zwierzęcia. Metody te mogą być zastosowane względem obu zwierząt, lecz zalecane jest poddać takim działaniom zwierzęta ekspresjonujące polimerazę T7. Pozwala to otrzymać kolekcję nicieni C. elegans trwale ekspresjonujących polimerazę RNA T7 pod kontrolą różnych promotorów. Przykładami takich promotorów są myo-2 (ekspresja w gardzieli), myo-3 (mięśnie ciała), egl-15 (mięśnie sromowe), unc-119 (pan-neurony), SERCA (mięśnie), let858 (wszystkie komórki), ges-1 (jelito).
Konstrukcja drożdżowych wektorów dwuhybrydowych RNAi z promotorem T7 pGAD424 posiadający zgodny i odwrotny T7/T3 oraz/lub Sp6
Większość eksperymentów związanych z systemem podwójnohybrydowym opiera się na wklonowaniu biblioteki cDNA do plazmidu pGAD424 (Figura 16), zaprojektowanego tak, by zawierał dodatkowe miejsca restrykcyjne w obrębie sekwencji poliłącznikowej, takiej jak miejsce NcoI (Clontech). Biblioteka ta umożliwia skrining białek wiążących w eksperymentach wykorzystujących podwójne drożdżowe hybrydy. Skonstruowano nowy drożdżowy, dwuhybrydowy wektor o takich samych możliwościach drożdżowego systemu dwuhybrydowego, ale zawierający dodatkowo dwa promotory T7, pozwalające na wykorzystanie polimerazy RNA T7 do indukowanych, pseudo stabilnych inaktywacji genów. W tym celu wstawiono zgodny T7, stosując sekwencję łącznikową T7 (składającą się z następujących starterów: aattcttaatacgactcactatagggcc oraz catgggccctatagtgagtcgtattaag), w miejscu EcoRI-Ncol wektora pGAD424. Otrzymany w ten sposób wektor oznaczono jako pGAD424-without-FULL-ICE-both-T7. Zwrócono uwagę na wyeliminowanie kodonów stop oraz zastosowanie sekwencji poliłącznikowej o maksymalnie zgodnych aminokwasach. Taką samą strategię obrano w przypadku odwrotnego T7 (składającego się z obu starterów: gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca oraz gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg), za pomocą BamHI oraz PstI. W celu uniknięcia utraty miejsca SalI, włączono to miejsce w sekwencję startera.
PL 216 779 B1
Miejsce SalI jest istotne ze względu na to, że większość bibliotek klonowanych jest w tym miejscu, a sekwencje adaptacyjne są dostępne. Czyni to nowo skonstruowany wektor zgodnym z istniejącymi wektorami.
pAS2 zawierający zgodny i odwrotny T7/T3 i/lub Sp6
W oparciu o pAS2 (Clontech) skonstruowano analogiczny drożdżowy, dwuhybrydowy wektor. Częściowe trawienie za pomocą EcoRV spowodowało usunięcie znacznej części genu cyh2. Prawidłowy konstrukt można wyizolować i sprawdzić poprzez trawienie restrykcyjne BglII. To miejsce restrykcyjne występuje we fragmencie EcoRV PAS2, do eliminacji. Wyklucza to słabo toksyczny gen cyh2, uczestniczący w procesie opóźniania wzrostu. Gen ten nie jest istotny do przeprowadzan ia RNAi oraz eksperymentów związanych z drożdżowymi podwójnymi hybrydami. Po usunięciu fragmentu EcoRV, miejsce restrykcyjne EcoRI, zlokalizowane pomiędzy sekwencjami DNA kodującymi GAL4DB oraz HA (epitop), pozostaje jedynym w plazmidzie i może być wykorzystane do podstawienia HA promotorem T7, zawierającym sekwencję łącznikową. Zapewnia to utrzymanie wszystkich miejsc klonowania, pozwalając obu na klonowanie w ramce i zgodność z poprzednimi wektorami oraz pGAD424. Zastosowano, wykorzystując miejsca klonowania EcoRI oraz Ndel, następującą sekwencję łącznikową (startery: aattcttaatacgactcactatagggca oraz tatgccctatagtgagtcgtattaag). Taką samą strategię obrano w przypadku odwrotnego T7 (startery: gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatagtgagtcgtattaag oraz gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg), stosując BamHI oraz PstI. W celu uniknięcia utraty SalI miejsce to zostało włączone do sekwencji startera. Tak otrzymany wektor nazwano pAS2-cyh2-HA+both T7-final.
Obecność promotora T7 (lub alternatywnie, T3, lub promotora SP6) w pGAD424 pozwala na szybkie przejście z oddziaływania białkiem do RNAi i przypisanie funkcji wyizolowanemu fragmentowi DNA. Dodatkową zaletą jest możliwość uzyskania in vitro transkrypcji, połączonej z translacją in vitro (Obecność w ramce ATG zarówno GAL4DB, jak i GAL4AD) znakowanego białka, które może być wykorzystane jako kontrola in vitro (np. testy grupujące podzbiory) oddziaływań typu białko-białko.
Sekwencje otrzymanych plazmidów oraz polimerazy T3 i SP6 określono w wykazie sekwencji, przedstawionym poniżej:
PL 216 779 B1
Zależna od DNA polimeraza RNA SP 6 Nr dostępu swissprot P06221 Sekwencja białka:
Nr Id. Sekw.
raqdlhaiqlq leeemfnggi rrfeadqqrq iaagsesdta wnrrllseli apmaegiqay keeyegkkgr apralaflqc venevaayit mkwmdmlnt datląaiams vaeriedqvr
121 fskleghaak yfekvkkslk asrtksyrha hnvawaeks vaekdadfdr weawpketql
1Θ1 qigttlleil egsvfyngep vfmramrtyg gktiyylqts esvgqwisaf kehvaqlspa
241 yapcvipprp wrtpfnggfh tekvasrirl vkgnrehvrk ltqkqropkvy kainalqntq
301 wqinkdvlav ieevirldlg ygvps£kpli dkenkpanpv pvefqhlrgr elkemlspeq
361 wqqfinwkge carlytaetk rgsksaawr mvgqarkysa fesiyfvyam dsrsrvyvqs
421 stlspqsndl gkallrfteg rpvngvealk wfcinganlw gwdkktfdvr vsnvldeefq
481 dmcrdiaadp ltftqwakad apyefławcf eyaqyldlvd egradefrth lpvhqdgscs
541 giqhysamlr devgakavnl kpsdapqdiy gavaqwikk nalymdadda ttftsgsvtl
601 sgtelramas awdsigitrs ltkkpvmtlp ygstrltcre śvidyivdle ekeaqkavae
661 grtankvhpf eddrqdyltp gaaynymtal iwpsisewk apivamkjnir qlarfaakrn
721 eglmytlptg fileqkimat emlrvrtclra gdikmslqve tdivdeaamm gaaapnfvhg
781 hdashliltv celvdkgvts iavihdsfgt hadntltlr? ałkgqmvamy idgnalqkll
841 eehevrwmvd tgievpeqge fdlneimdse yvfa
Zależna od DNA polimeraza RNA T 3
Nr Id. Sekw. 2
Nr dostępu swissprot P07659 Sekwencja biała:
mniieniekn dfseielaai pfntladhyg salakeąlal ehesyelger rflkmlerqa kageiadnaa akpllatllp klttrivewl eeyaskkgrk psayaplqll kpeasafitl
121 kvilasltst nmttiqaaag ralgkaiedea rfgrirdlea khfkkhveeq lnkrhgqvyk
181 kafmqvvead migrgllgge awsswdkett mhvgirliem liestglvel qrhnagnags
241 dhealqlaqe yvdvlakrag alagispmfą pcwppkpwv aitgggywan grrplalvrt
301 hskkglmrye dvyrapevyka vnlaqntawk inkkvlavvn eivnwkncpv adipslerqe
361 lppkpddidt neaalkewkk aaagiyrldk arvsrrisle fmleqankfa skkaiwfpyn
421 mdwrgrvyav pmfnpągndm tkglltlakg kpigeegfyw lkihgancag vdkvpfperi
481 a£iekhvddi lacakdpinn twwaeqdspf cflafcfeya gvthhglsyn cslplafdgs
541 csgiqhfsam lrdevggrav nllpsetvqd iygivaqkvn eilkqdaing tpnemitvtd
601 kdtgeisekl klgtstlaqq wlaygvtrsv tkrsvmtlay gskefgfrqq vlddtiqpai
661 dsgkglmftą pnąaagymak liwdavsvtv vaaveamnwl ksaakllaae vkdkktkeil
721 rhrcavhwtt pdgfpvwqey rkpląkrldm iflgqfrlqp tintlkdsgi dahkqesgia
781 pnfvhsqdgs hlrmtwyah ekygiesfal ihdsfgtipa dagklfkavr etmvityenn
841 dvladfysqf adqlhetqld kmpplpkkgn lnlgdilksd fafa
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw, 3 pGNIOS:
gttgicgtaaagagalgnffiattttacrttacaccgggtcctctctctetgccagcacagcttagtgnggctgtgtgcKgggctcctgccaccggcgg «icatęttcttcttcttcttctetccigcictcgenaicacttcttcattcancttattccttncatcatcaaactagcatttcttactttatttamttKcaatttKa attttcagataaaaccaaactacttgggRacagccgteaacagatccccgggaRggccaaaggacccaaaggtatgtncgaatgaiactaacataa calagaacaRncaggaggacccRgcRggaggguccggatgactgctccaaagaagaagcglaagctcatgaacacganaacaKgciaagaa cgacttctctgacatcgaactggctgctaicccgttcaacactctggctgaccattasggtgagcgmagctcgcgaacagttggcccngagcatgag tcnacgagatgggtgaagcacgcnccgcaagatgttigagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggauacgcigccgccaagcctctcatcact accclackcctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccRccagttcetgcaag aaatcaagęcggaagccgttgcgtacaieaccattaagaccactciggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgtKaggctgtagcaagcgc aatcggtcgggceangaggacgaggctegcttcggtcgutccgtgaccRgaagctaagcactKaagaaaaacgttgaggaacaacicaacaag cgcgtagggcacgtctżcaagaaagcarttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttegtggca taaggaagaeteuncatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggtttgenacaccgccaaaatgctggcgugtagg tcaagactctgagactatcgaactegcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgigcaggtgcgctggctggcatctciccgatgnccaaccttg cgUgttcctectaagccgtggactggcaructggiggtggcttttgggciaacggKgtcgtcctctggcgctggtgcgtacttacagiaagaaagc aclgatgcgclacgaagacgmacaigcctgaggigtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcg gtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcangtceggtcgaggacatcccigcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgac atgaatcetgaggctcwaccgcgtggaaacgtgetgecgctgetgtgtaccgcaegacaaggctcgcaagtctcgecgiateagcengagttcatg cttgagcaagccaauagtttgciaaęcataaggćeawtggttcccttacaacatggactggcgcggttcgtgtttacgctgtgtcaatgtteaacccgc aaggtaacgautgaecaaaggacgtcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatcczcggtgcaaacig tgcgggtgicgataaggtTtcgmcctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacattatggcngcgctaagtctccaciggagaacac ttggtgggctgagcaagattctcegtWtgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacageaccacggcctgagetataacigciecetKcgc tggcgmgacgggtcttgciciggcaiccagcaettctccgcgatgctccgagatgaggtaggiggicgegeggttaacrtgcrtcctagtgaaaccgt tcaggacatetacgggangngetaagaaagtcaacgagattetgeaagcagaegcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgai gagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgtiactcgcagtgtgactaagc gttcagteaigaegctggctiacgggtccaaagagttcggcttecgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctangattccggcaagggtc igatgtteactcagccgaaicaggctgctggataeatggctaagctgatngggaatccgigagcgtgacggtggtagctgcggttgaageaisgaac tggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgRgcgctgtgcattgggtaactcct gatggtttccctgtgtggcaggaaiacaagaagceuttcagacgcgcngaacctgatgticctcggTcagrtccgctlacagcciaccattaacacca acaaagatagcgagangatgeacacaaacaggagtctggtatcgetcctaacRIgtacacagccaagacggtagccaccncgtaagactgtagtg tgggcacacgagaagtacggaatcgaaKttttgcactgancacgactcettcggtaccattccggctgacgctgcgaacetgRcaaagcagtgcgc gaaactatggngacaeatatgagtcRglgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagc acrtccggctaaaggtaacttgaaceiecgtgacatcnagagtcggacncgcgncgcguagggcccaetagtcggccgtaegggcccmcgtn cgcgcgmcggtgatgacggtgaaaaccKtgacacatgcagcicccggagacggtaacagcttgtciglaagcggalgccgggagcagacaagc ccgtcagggcgcgtcagcgggtgRggcgggtgKggggciggenaaetaTgcggcatcagagcagattguctgagagtgcaccatatgcggtgt gaaaUccgcaeagargcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccttaagggcetegtgatacgretatRrtataggRaatgteatgataataat ggRteRagacgtcaggtggcaenttcggggaaatgtgcgcggaicccctarttgtttatttRcuaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaai aaccetgateaatgcncaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatnccgtgtcgccctUttcccttftttgcggcattKgccnccignn tgctcacccagaaacgciggtgaaagtaaaagatgetgaagatcagRgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggiaagatc cngagagttttcgcccegaagaacgrtnccaatgatgagcacttuaaagttctgctatgtggcgcgguttitcccgtattgacgccgggcaagagca actcggtcgcegcatacacuttctcagaatgacttggngagtactcaccagtcacagaaaagcaicttacggatggcatgacagtaagagaattatg cagtgctgccataaccatgagtgataacacigeggccaacnacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagciaaccgcttttttgcacaacatgg gggatcatguactcgccngatcgngggaaceggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaecaegaigcctgtagcaatggcaa caacgngcgcaaactattaactggcgaaciacttactctagcncccggcaacaanaatagactggatggaggcggataaagngcaggaccaenc tgcgelcggecctlccggetggctggtttattgcIgataaatctggagccggtgagcgtgggKtcgcggtatcangcagcactggggccagatgg:
aagccctcccgtatcgtagnatracacgacggggagtcaggcaactatggaigaacgaaatagaeagatcgctgagaUggtgcctcaętganaa gcanggtaactgteagaccaagtttacKaiautacmagattgatnaaaacttcatttttaamaaaaggatctaggtgaagatccttmgataatMca tgaccaaaatcccnaacgtgagttRcgRCCactgagcgtcagaccccgugaaaagaUaiaggatcncrtgagatcetttttttctgegegtaatctg ctgctlgcaaacaaaaaaaccaccgctaceagcggtggtttgtttgccggatcaagBgctaccaactcmnecgaaggtaactggcttcagcag3gc gcagataccaaatactgtccnctagtgtagcegtagttaggecaccacticaagaactctgtagcaccgcciacatacctcgctctgcuatcctgRat cagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttacegggttggactcaagacgalagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg gttcgtgcacacageccagcttggagcgaacgaectacaccgaactgagatacctacagcgigagcaRgagaaagcgccacgittcccgaaggg agaaaggcggacaggtatceggtaagcggcagggteggaacaggagagcgcacgagggagcRecagggggaaacgcctggtatcRtatagtc cigtegggtrtegecaccictgacngagcgicgatttttgtgBfgetcgtcaggggggeggajcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttflac ggRcctggccmtgctggccttngcKaeatgttctttcclgegttateceetgattctgtggataaccgtatuccgcctRgagtgagctgataccgctc gcegcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaogcggaagagcgcccaatacgcaaaeegcctctccccgcgcgRggccg attcanaalgcagciggcacgacaggmeccgactggaaagcgggeagtgagcgcaacgcaattaitgtgagttagctcacteanaggcacccca ggctRacactRatgcnccggctcgtatgngtgtggaaRgtgagcggataacaatRcacacaggaaacagctatgaccaiganacgccaagclgt aagtttaaacatgatcRactaactaaętanctcatttaaanttcagagctiaaaaatggctgaaalcactcacaacgatggaiacgciaacaacttggaa atgaaataagcttgcatgcctgcagagcaaaaaaatactgcttnccttgcaaaattcggtgcttKTtcaaagagaaacrcRgaagtcggęgęgagcat
PL 216 779 B1 ttccttctłtgacttctctctnccgccaaaaagcctagcattrttattgataatttganacacacactcagagttcttcgacatgataaagtgtttcattggcac tcgcccttacagucatgaeaagggcggattatutcgatcgatattgaagacaaactccaaatgtgtgctcattttggagccccgtgtggggcagctg ctctcaatatattactagggagacgaggagggggaccttatcgaacgtcgcatgagccattctttcRctttatgcactctcttcactctctcacacattaat cgatteatagactcccatattccttgatgaaggtgtgggtttnagctttttttcccgatttgtaaaaggaagaggctgacgatgttaggaaaaagagaacg gagccgaaaaaacatccgtagtaagtcnccttnaagccgacacntttagacagcattcgccgctagtttigaagtttaaattttaaaaaaiaaaaattag tncaattnttttaattacuaauggcaaaagttttncaagaactctagaaaaactagcttaanutgggtactagaaaaattcttgnttaaatttaatattu tcttaagatgtaattacgagaagcttttttgaaaattctcaattaaaagaatngccgatttagaat&aaagtcttcagaaatgagtaaaagctcaaattaga agtngtnttaaaggaaaaacacgaaaaaagaacactatttatcttttcctccccgcgtaaaattagttgttgtgataatagtgatccgctgtctatttgcact cggctcttcacaccgtgcncctctcacttgacccaacaggaaaaaaaaacatcacgtctgagacggtgaangccttatcaagagcgtcgtctctttca cccagtaacaaaaaaaatnggntctttactttatatttatgtaggtcacaaaaaaaaagtgaigcagttttgtgggtcggttgtctccacaccacctccgc ctccagcagcacacaatcaicttcgtgtgttctcgacgattccngtatgccgcggtcgtgaatgcaccacaitcgacgcgcaactacacaccacactc actttcggtggtanactacacgtcatcgttgttcgtagtctcccgctctttcgtccccactcactcctcattanccccttggtgtattgattttttttaaatggw caccactcctgacgtttctaccttcngtTttccgtccatttagattnatctggaaatRTtnaaaanttaggccagagagttctagttcttgttcuaaagtcta ggteagacatacanncuttTctcatcaaaaaaaaagttgataaagaaaactggttattcagaaagagtgtgtctegt!gaaattgattcaaaaaaaaan cccacccctcgcttgtnctcaaaaiaigagatcaacggattttttccrtctcgattcaattnttgctgcgctctgtctgccaaagtgtgtgtgtccgagcaaa agatgagagaatnacaaacagaaatgaaaaaaagnggccaaataatgaagtttutccgagattgatgggaaagatattaatgttctnacggmgga ggggagagagagatagattttcgcatcaaactccgccttnacatgtcttttagaatctaaaatogatttttctcatcatttttaatagaaaatcgagaaana cagtaatttcgcaattttcttgccaaaaatacacgaaatttgtgggtctcgccacgatctcggtcttagtggttcatttggtttaaaagtttataaaatttcaaa ttctagtgtttaatnccgcataattggacctaaaatgggtttttgtcateattttcaacaagaaatcgtgaaaatcctgttgtttcgcaattncttncaaaaata cacgaaatatatggtaantcccgaaatattgagggtctcgccacgatttcagtcacagtggccaggatttatcacgaaaaaagttcgcctagtctcacat ttccggaaaaccgaatctaaatiagrnmgtcatcattttgaacaaaaaatcgagacatccciitagtttcgcaattttcgłcgcnnctctccaaaaatga cagtctagaattaaaattcgctggaactgggaccatgatatcttttctccccgtttttcatmattttnartacactggattgactaaaggtcaccaccaccg ccagtgtgtgccatatcaeacacacacacacacacaatgtcgagattttatgtgttaiccctgettgatttcgttccgttgictctctctctctattcatcKttg agccgagaagclccagagaatggagcacacaggatcccggcgcgcgatgtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagaiatca gggaagaicgtctgatttctcctcggatgccacętcatctctcgagtttctccgcctgttacłccctgccgaaccigatatttccc
PL 216 779 B1 pGNIOS Nr Id. Sekw, 4 aagcttgcatgcctgcaggcctlggtcgacictagacacmuagctacetagalacatggatalccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggcicgeegaaaaaKaaagnaiMcęaggctcgcgcatcceaccgagcggngacnctctccaccacttttcattttaacęcicggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtalgtticgaatgatactaacataacaragaacatntcaggaggacccngcttggagggiaccgagctcagaa aaaatgactgctccaaagaagaagcgtaagguccggua(gaaeacgaRaacatcgciaagaacgacnctctgacatcgaactggcigctatccc gttcaacactctggctgaccattacggigagcgtttagctcgegaacagnggcccttgagcatgagtctttcgagatgggtgaagcacgcticcgcaa gatgragagcgtcaacnaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctcrcatcactaccctactccctaagatgattgcacgęawaa cgactggmgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcecgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgiagcgtacatca ccattaagaccactctggcngccaaccagtgctgacaatacaaccgncaggctgtagcaagcgcaatcgglcgggccaBgaggacgaggctcg cncggicgtalccgtgaccttgaagciaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaacicaacaagcgcgugggcacgiciacaagaaagcama
[gcaagttgtcgaggctgacalgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtctlcgtggcalaaggaagacKLttcatgtaggaglacgct gcategagatgctcattgagttaaccggaatggttagęnacaccgccaaaatgctggcgiagiaggtcaagactctgagactatcgaacKgcacer gaaUcgctgaggctatcgcaacccgtgcagglgcgctggctggcatctetccgalgnccaaccttgcgBgttcctcetaagccgtggactggcatt actggtggtggctattgggciaacggtcgtcgteetMggcgctggigcgtictcacagiaagaaagcactgatgcgctacgaagacgffiacałgcct gaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaascaccgcaiggaaaatcaacaagaaagicctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcat igrccgglcgaggacatccitgcgangagcgtgaagaacłcccgatgaaaccggaagacatcgaeatgaatccłgaggetctcaccgcgtggaaa cgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacagggctcgcaagtctcgccgutcagccttgagttcatgcngagcaagccaataagittgctaaccat aaggceatctggttcccnacaacaiggactggcgcggtcgtgtnacgccgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgctt acgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggtiactactggclgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctg agcgcaicaagttcangaggaaaaccacgagaacalcatggcttgcgctaagtctceactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgncl gcnccngcgnetgctngagtacgctggggtacagcaccacggectgagctataactgcWCcRcegatggsgtttgaegggicttgctciggcaif:
cagcaetTctccgcgalgcKcgagatgaggtaggtggtcgęgcggnaactlgcttcctaglgagaccgncaggacatctacgggangRgcuag aaagtcaacgaganctaeaagcagacgcaatcaaCgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacaciggtgaaalctctgagaaa gtcaagctgggcactaaggcactggciggtcaatggctggctcacggtgttactcgcagtgtgactaagcgtlcagtcatgacgctggcttacgggtc caaagagttcggcnccgicaacaagigctggaagataeeancagccagctanganceggcaagggtccgatgttcactcagccgaaicaggcig clggatacaiggctaagctgamgggaaictgtgagcgtgacggiggtagctgcggngaagtaatgsactggcnaagtctgclgctaagcigctgg ctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttcccigtgiggcaggaataca agaagcciattcagacgcgcttgaaccrgatgttcctcggtcagłtccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgaigcacaca aacaggagtctggtatcgctcctaactngtacacagccaagacggtagccaccttcguagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcga aicctttgcactgancacgaciccncggiaccattccggctgacgclgcgaaccigttcaaagcagtgcgcgaaactatggtigacaaalaigagtcft gtgargtaciggctgatnciacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacct ccgtgacatcttagagtcggacncgcgnegcgtaagaanccaactgagcgccggtcgctaccattaccaaengietggtgtcaaaaataataggg gcegctguatcagagtaagtnaaactgagnctacuaciaacgagtaaatttaaatmcagcatctcgcgcccgigcctctgacttctaagiccaan actcncaacatccctacatgcKttKtccctgtgctcccacccccumttgttanatcaaaaaaacttcttcKaatttctttgttnttagcttcttttaaglca cctctaacaatgaaaagigtagattcaaaaatagaattaatlcgtaataaaaagtcgaaaaaaattglgctccctccccccattaataataanctatccca aaaKtacacaatgnctgtgtaeacRcnaigmtttrtacttctgauaatttttntgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaa(acctlatcaiatgtt acgntcagtttatgiccgcaatttrtarncRcgcacgtcigggcctctcargacgtcaaatcatgetcatcgigaaaaagttttggagtatttttggaattnt caatcaagtgaaagtnatgaaanaatntcctgcttttgctttngggggtncccctattgmgtcaagagntegaggacggcgtttncngctaaaatca caagtangatgagcacgatgcaagaaagaicggaagaaggtttgggntgaggctcagtggaaggtgagtagaagngataatttgaaagtggagia gtglctatggggmtlgccttaaaigacagaatacattcccaalataccaaacataactgtttcctaclaglcggccgtacgggcccttlcgtctcgcgcg tttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacalgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggalgccgggageagaeaagccegKa gggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggettaactargcggcatcagagcagangtactgsgagtgcaccalatgcggtgtgaaaw ccgcacagargcgtaaggagaaaataecgcaEcaggeggccnaagggccicgtgaiacgcctattttiataggnaatgKaigataaiaatggTttctt agacgKaggtggcac8ncggggaaatgtgcgeggaacccctatttgtttatttttctaaatacancaaaiaigtatccg«catgagacaataaccci gaTaaatgcticaataatattgaaaaaggaagogtatgagtattcaacamccgtgKgcccttatfcccttttttgcggcattngccttęctgtttttgctca eccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgeacgagigggnacatcgaactggatctcaacagcgguagalccttgag agttttcgęccegaagaacgOTccaatgatgagcactTttaaagttctgctatgtggcgcggiattaKCCgtangacgccgggcaagagcaactcg glcgccgcaracac»ncEagaatgacnggngagiactcaccaglcacagaaaagcaictiacggaiggcatgacagtaagagaanatgcagtg ctgccataaccatgaglgataacactgcggccaacttacrtclgacaaagaKggaggaccgaaggagctaaccgcrnntgcacaacalggggga!
catgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgaeaccacgatgcctgTagcaatggcaacaacg ngcgcaaactattaaętggegaactacttactctagcncccggcaaeaanaatagaciggarggaggcggaiaaagttgcaggaccacttctgcgct cggcccKccggctggctggtttatlgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtaieatlgcagcactggggccagaiggtaagccc
KregtatcgtagnatciaeaegacggggaglcaggcaactatggatgaacgaaatagaęagaKgctgagauggtgcclcactgattaagcattg gtaactgtcagaccaagtttacKaiaiatactttagattgatttaaaactKanrttaamaaaaggatctaggigaagatcctttttgataaictcatgacca aaatcccrtaacgtgagtntcgtticactgagcgtcagaccccgiagaaaagalcaaaggatctttttgagatccnmnctgcgcgiaatctgctgctt gcaaacaaaaaaaccaccgclaccagcggtggtngtngccggatcaagagciaccaactcntttccgaaggtaactggcRcagcagagcgcaga taccaaaiactgtcctutagigragccgugttaggccaccacttcaagaactctglagcaccgcetacataceicgctctgctaaKcignaMagtg gctgctgccagtggcgataaglcgrgtcnaccgggnggactcaagaegatagttaccggaiaaggcgcagcggicgggctgaacggggggncg tgcacacagcccagcnggagegaacgacctacaccgaactgagatacciacagcgigagcattgagaaagcgccacgcncccgaagggagaa agscggacaggtatccggiaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtaicntatagtcctgtc gggtttcgccacctctgacngagcgtcgamngtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaiaaegccagcaaegcggcctttnacggnc etggcettttgctggccrtttgctcacatgttctttcctgegRatcccctganctgtggataaccgtattaccgccntgagtgagctgaUccgcttgccg cagccgaacgaccgigcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgeaaaccgcctctccccgcgcgttggccgatica ttaatgcagctggcacgacaggtncccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaatuatgtgagRagctcacieattaggcaccecaggcfl tacacltiatgctKcggctcgtaigttgtgtggaattgtgagcggalaacaamcaeacaggaaacagctatgaccatgartacgccaagctgtaagttl aaacatgaicttactaactaaeianetcalttaaattncagagcnaaaaatggctgaaatcaclcacaacgatggataegctaacaacnggaaatgaa at .....
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw. 5 pGN400:
aagcttgcatgcctgcaggccnggtcgactctagacacttncagctaccłagaucatggaiatccccgcctccca8iccacccacccagggaaaaa gaagggctcgccgaaaaatcaaagttatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggttgacrtctctccaccacmtcatntaacccteggggucg ggattggccaaaggacccaaaggiatgtncgaatgatactaacataacatagaacanttcaggaggacccttgcttggagggtaccgagctcccgg gattaatacgacicactataccggtagaaaaaaigagtaaaggagaagaactntcactggagttgtcccaa«cRgttgaattagalggtgatgnaatg ggcacaaaTrnctgicagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccRaaarttatttgcaciactggaaaactacctgttccatgg gtaagtttaaacatatatatactaacuaccctgatuntaaattttcagccaacacttgicactactttctgtiatggigttcaacgcttctcgagatacccag atcatatgaaacggcatgactttticaagagigccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatt!ttcaaagatgacgggaactacaagacac gtaagtnaaacagrtcggtactaactaaccatacatattiaaattttcaggtgctgaagtcaagtttgaaggigatacccttgttaatagaatcgagttaaa aggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactauactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaat ggaaicaaagRgtaagtnaaacatgattttaciaactaactaatctgamaaattttcagaacrtcaaaanagacacaacattgaagatggaagcgttca actagcagaccanatcaacaaaaiacłccaattggcgatggcectgtccttttaccagacaaccatiacetgtccacacaatctgccctttcgaaagatc ccaacgaaaagagagaccacaiggtccncttgagtttgtaacagctgctggganacacatggcatggatgaactatacaaatagcattcgtagaattc caactgagcgccggtcgctaecanaccaacttgtctggtgtcaaaaataataggggccgcigtcatcagagtaagtttaaactgagttctactaactoa cgagiaatatttaaattttcagcatctcgcgcccgtgcctotgacttctaagtccaattaętcitcaacatccctacatgctctttctccctgtgctcccaccc cctatttngttattatcaaaaaaacRcttcttaatncmgttttttagęttcttttaagtcacctctaacaatgaaattgtgtagattcaaaaat^aanaatlcg taataaaaagtcgaaaaaaattgtgctccctccccccatuataataattctatcccaaaaUŁacacaatgttctgtgtacacttcttatgttttttttacttctg ataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaataccttatcatatgttacgtttcagrttatgaccgcaatttttatttcttcgcacgtctgggc ctclcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaaaagtrttggagtatttttggaantncaatcaagtgaaagtttatgaaattaattttcctgcttngctttttg ggggtttcccctaRgttigtcaagagtttcgaggacggcgtttttengctaaaatcacaagtattgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaagg
RTgggRtgaggctcagtggaaggtgagtogaagRgataantgaaagtggagtagtgtcutggggmttgccRaaatgacagaatacancccaat ataccaaacataactgntcctactagteggccgtacgggccctRcgictcgcgcgRtcggtgatgacggtgaaaaccictgacacatgcigctcecg gagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgRggcgggtgicggggctggctta actatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggc ctiaagggcctcgtgatocgcctatRnataggttaatgtcatgaUataaiggtRcttagacgtcaggtggcacttRcggggaaaigtgcgcggaacc cctarttgtRaRtttetaaalacancaaatatgtatęcgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataalaRgaaaaaggaagagtatgagtan caacatRccgtgtcgcccRattcccnRUgcggcartttgccticctgKtngętcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagalgctgaagatcagtt gggtgcacgagtgggRacatcgaactggatctcaacagcggUagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacnttaaa gttcłgctatgtggcgeggtaRarcccgurtgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggngagtaetcac cagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacnctga caacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcRRRgcacaacatgggggatcatgtaactcgccngatcgRgggaaccggagctgaaigaagc cataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactartaactggcgaactactiactctagcttcccggc aacaattaatagactggatggaggcggataaagngcaggaccacRctgcgctcggcccttccggctggctggtRattgctgataaatctggagccg gtgagcgtgggtctcgcggtatcaRgcagcictggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactai ggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcaRggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactnagaRgaRtaaa acttcaRRtaaRiaaaaggatcuggtgaagatcctttrtgataatctcaJgaccaaaatcccRaacgtgagRRcgnccacłgagcgtcagaccccg ugaaaagatcaaaggatcncngagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccgg atcaagagctaccaactcntRecgaaggiaaciggcRcagcagagcgcagataccaaatactgtccRctagtgtagccgtagnaggccaccacn caagaactctgtagcaccgcetacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcglgtcRaccgggttggactcs agacgatagRaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggncgtgcacacagcccagcnggagcgaacgacctacaccgaactga gaiacctacagcgtgagcangagaaagcgccacgCRcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggag agcgcacgagggagcnccagggggaaacgcctggtatcRtaugtcctgtcgggRtcgccacctctgacRgagcgtegamngtgatgctcgtc aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccRRtacggttcctggccRttgctggcctRtgctcacatgRcrncctgcgtiatccc ctgattctgtggaiaaccgtattaccgcctRgagtgagctgataccgctcgccgeagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaag cggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgaRcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggc agtgagcgcaacgcaattaatgtgagRagctcactcattaggcaccccaggcRtacacRtatgcttccggctcgtatgttgtgtggaangtgagcgg ataacaaRicacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagtnaaacatgatcRactaactaactattctcatnaaanttcagagcn aaaaatggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaacRggaaatgaaat
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw. 6 pGN401 galcccggcgcgcgatgicgicgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatcagggaagatcgtctgatrtctcctcggatgccacct catctcicgagtttctccgcctgtuctcccigccgaaccigatatttcccgttgicgtaaagagatgtttttattttactttacaccgggtcctctctctctgcc agcacagctcagtgttggctgtgtgcicgggctecTgccaccggcggccrcaicncncncncttctctcctgctctcgcttatcacttcTtcattcattctt anccttttcatcatcaaactagcatncttactnattiatttttncaattttcaattncagataaaaccaaactacttgggttacagccgtcaacagatccccg ggatiggccaaaggacccaaaggutgmcgaatgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgcttggagggtaccggtagaaaaa atgagtaaaggagaagaacrnicactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattnctgtcagtggagagggtga aggigatgcaacatacggaaaacnacccnaaacnatttgcactactggaaaactacctgttccatggglaagtttaaacatalaUtactaactaaccct gattantaaattttcagccaacacngtcactactttctgttatggtgtteaatgcttctcgagatacccagatcatatgaaacggcatgactnncaagagt gccatgcccgaaggnatgiacaggaaagaactatatttttcaaagatgaęgggaactacaagacacgtaagtttaaacagtteggtactaactaacca<
acatatnaaattttcaggtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgamtaaagaagaiggaaacattcn ggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagngtaagtttaaacnggacnac taactaacgganatatttaaatnrcagaacttcaaaattagacacaacangaagatggaagcgttcaactagcagaccattttcaacaaaatactcc3a nggegatggccctgtcemuccagacaaccattaccłgtccacacaatctgcectttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttct tgagtttgtaacagctgctggganacacatggcatggatgaactataeaaatageattcgtagaattccaactgagcgccggtcgctaccatiaccaac ttgłctggtgtcaaaaataauggggccgc!gtcatcagagtaagtnaaactgagttctactaacuacgagtaautttaaatmcagcatctcgcgccc gtgcetctgacticiaagtecaanacicRcaacatccctacatgetctttctccctgtgctcecacccectattmgttattaicaaaaaaacttcttcnaatt tctttgtrttttagcttcttttaagtcacctctaacaalgaaangtgtagattcaaaaaiagaaitaattcgtaataaaaagtcgaaaaaaanglgctccctcc ccccattaataataattcutcccaaaatctacacaatgttctgtgtacactlctutgttttmtacttctgalaaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccg cacacaaaataccrtaicataigttacgtttcagtttatgaccgcaatmtamcncgcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcatgcKatcgtgaaa aagttnggagtattmggaatmtcaatcaagtgaaagtttatgaaattaattttcctgctttEgctTmgggggtttcccctatigtttgtcaagagtttcgag gacggcgtttttcttgcttaaatcacaagtattgatgagcacgatgcaagaaagaicggaagaaggntgggtttg&ggctcagtggaaggtgagtag aagngataatttgaaagtggagtagtgictatggggrrtttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaaealaactgtncctactagicggcę gtacgggcccggtacccagctTOgncectttagtgagggtlaangcgcgcnggcguatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgnatccgct cacaanccacacaacatacgagceggaagcauaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacatiaangcgttgcgctcactgc ccgctnccagtcgggaaacctgtcgtgecagcłgeanaatgaaKggceaacgcgcggggagaggeggtttgcgtattgggcgctenccgcttcc tcgctcactgactcgctgcgctcggtegRcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaaUcggtłatccacagaateaggggata acgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgiaaaaaggccgcgttgciggcgtttttccauggctccgcccccęi gacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaaccegacaggactauaagataccaggcgttKcccctggaagctccctcgtg cgctctcctgttccgaccctgccgettaccggatacctgtccgcctttcteccttcgggaagcgiggcgctnctcatagctcacgctgtaggtatctcag ttcggtgtaggtcgncgctccaagcigggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgetgcgecttatccggttacutcgtcttgagtccaa cccggiaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagncttgaagig gtggcctaactacggciacaciagaaggacagtarttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagcicttgatccgg caaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtrtgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctngatcnnctacg gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgnaagggattttgglcatgagattttcaaaaaggatcncacciagatccttttaaattaaaaatgaag ttnaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacnggJctgacagttaccaitgcrtaatcagigaggcacctatctcagcgaic!gtclanicgncatccat agngcctgactccccgttgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatąggceccagtgcTgcaatgataccgcgagacccacgctcaccg gctccagatttatcagcaaiaaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtciattaangngc cgggaagctagagtaagtagnegccagtteatagtttgcgcaacgngttgccartgctacaggcaKgtggTgtcacgctcgtcgttiggtatggcttc attcagctccggttcccaacgaieaaggcgagnacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggnagctccncggtcctccgatcgngtcagaagi aagnggccgcagcgttatcacccatggnatggcagcactgcaiaattctcnactgtcatgccatccguagatgcttttctgtgactggtgagucicaa eeaagicattctgagaatagtgiaigcggcgaccgBgttgctcttgcccggcgtcaatacgggataalaccgcgccacatagcagaacfflaaaagtg ctcatcattggaaaacgttcticggggcgaaaactctcaaggatctuccgctgttgagatccagttcgatguacccactcgtgcacccaactgatcttc agcatcttttactttcaccagcgttKtgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaata ctcatactcnccmncaatattaRgaagcatttaKagggttattgtctcaigagcggatacatatrtgaatgtatnagaaaaataaacaaataggggnc cgcgcacatnccccgaaaagrgccacctaaattgtaagcgttaatattttgnaaaattcgcgttaaamtigctaaBtcagctcattttttaaccaataggc cgaaatcggcaaaatccc«auaaicaaaagaatagaccgagatagggttgagtgngttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtgga ctccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaeeatcaccciaatcaagttKnggggtcgaggtgccgiaaa gcactaaatcggaaccetaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaa aggagcgggcgctagggcgclggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtc ccaticgccattcaggctgcgcaactgngggaagggcgatcggłgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgigctgcaag gęgattaagttgggtaacgccagggrrrtcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattg gagciccaccgcggtggcggccgctctagaactagtg
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw. 7 pGNtlO:
gatcctccaaaatcgtcttccgcictgaaaaacgaaagtggaccmgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaattgagctRttgggtcgaaaa aaatgtRnagaatgetgagaacacgttaaacacgaagatcataRtanttgagacccggatgctctgaaaatgtctgacatagatttaaaaaagcatat ataiatttttcanttcaacgtgaaagttttgtgcaactttatagaatctcetanggeacattgtttniatttaactgaggcagntflgaacaccttmgaaacn tgaatctctRgaagtatactgttgaaaagactgacttgagcgncgaaatgccagaagaaaactatantgaalclcgcgctaaangagaaaigcaacc gcgctccactggacaattggaaaaammatKggaggcgacaaeggtannegaaatigattttctgtgtttmcteainntataaattettcrttgattt atcgttcgtttgtgagaaatnaangtattcaaaettttttatagtaagataccggtggtaccgitagGCgtacgaacccgggattggccaaaggaccca aaggtatgtncgaatgalacuacataacatagaacaimcaggaggacccttgcttggagggtaccggatgactgeiecaaagaagaagegtaagc icaigaacacgattaacatcgcuagaacgactlctctgacaicgaactggctgctatcccgttcaacacicEggctgaccanacggtgagcgttugci cgcgaacagRggcccRgagcatgagtettacgagaigggtgaagcacgcRccgcaagaigtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcgga taacgctgccgccaagcctcicatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggHigaggaagigaaagctaagcgcggcaag egcccgacagcCRccagttcctgcaagaaateaagccggaagccgiagcgtacatcaccattaagaceactctggcRgcctaaccagtgelgaca aucaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcRcggtcgtatcegtgaccttgaagctaagcacttcaa gaaaaacgngaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagngicgaggctgacatgcictctaagggtcia ctcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactciancatgtaggagucgctgcaicgagatgctcaUgagtcaaccggaatggttag cRacaccgccaaaatgcTggcgtagiaggtcaagactcfgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcg ctggclggcatctctccgatgttccaacengćgtagRccKetaagccgtggactggcatiactggtggiggctangggctaacggtcglcgtcctct ggcgctggtgcgtactcacag[aagaaagcactgatgegctacgaagacgRtacatg(ctgaggtgtacaaagcgatttacaRgcgcaaaaca« gcatggaaaatcaacaagaaagtccttgcggicgccaacgtaatcaccaagtggaagcatigrccggtcgaggacitccctgcgangagcgtgaa gaacteecgatgaaaccggaagacalcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgiggaaacgtgcJgccgctgctgigtaccgcaagacaaggctc gcaagtctcgccgtateagccngagticatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccattaggccatciggncectucaacatggactggegeg gttcgtgRiacgctgtgtcaatgncaacccgcaaggiaacgatargaccaaaggacgicKacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaagg
RacuctggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggRtcgRtccigagcgcatcaagRcattgaggaaaaccaegagaacat catggcttgcgctaagtctccactggagaacacRggtgggcigagcaagattctccgttetgettccRgcgttctgctflgagtacgeiggggtaeage accacggcctgagctataactgcKttttccgctggegRtgacgggtcRgctctggcaiccageacnetccgcgatgcWcgagatgaggtaggtg gtcgegcggnaacttgcncctagtgaaaccgttcaggacasetacgggaftgngCtaagaaagteaacgagaRctgeaageagacgcaatcaatg ggaccgataacgaagugttaccgtgaccgatgagaacaciggtgaaatctctgagaaagleaagctgggcactaaggcactggclgglcaatggci ggcnaeggtgKactcgcagigtgactaagcgtteagtcatgacgctggcnacgggiccaaagagttcggcRccgtcaacaagigctggaagatac caRcagecagctangaRccggcaagggtctgatgRcactcagccgaatcaggctgctggatacalggctaagcigaRtgggaaiccgtgagcgi gacKitgg&gctgcggngaagcaatgaactggcRaagtetgetgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttc gcaagcgRgcgctgtgcaRggguactccigatggtRccctgigtggcaggaatacaagaagcctaRcagacgcgcRgaaccigatgncctcgg tcagRccgcttacagcctaccanaacaccaacaaagatagegagangatgcacacaaacaggagictggtatcgctcctaactRgtacacagcca agacggug«aeettegtaagacigiagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactga«eacgactccRcggtaccaRccggc tgacgctgcgaacctgneaaagcagtgcgcgaaactatggngacacatatgagtcRgtgatgiaciggctgaRtctacgaccagRcgctgaccag
Rgcacgagtc(caanggacaaaatgęcagcaeRccggctaaaggtaacRgaaccKcgtgacatcttagagicggacRcgcgRcgcgtaaggg ccctcgtegagtcggtcaeaalcacctgaaacttcaaaggcagccagigaggaacgtgaagaagaagaaaaagagtcatctgaaeaggRigann
CRtctggreaaaaagaigaaattaRganttcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtcrgcaagtcgRcacagtcgcccagagaaicgc gggaagtgagccaagaggtatgnRtcaaaaatcaataactgatcataaRRtaRgntggtgaaRtaagaaaaiaataticgaaaancctctgaattat caagaRgcagtatiaantcgagaaaaattgagatancatagagctattgtaaatnicttgatflcagactgaaaeRcggaaaBtcaagagaaaaccaa agaaaaggatgacggggaigaicagcctggcacaecgaacagctatagaagccgggaaacrtcaccagctccaaaaaggtccaaggagaccag gRigicaaaagcRcctgcgattaancttatttcaaRtncagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggncgttcaagatctcceagaaggtcnca gcacgttcc<xgtcacgatclcctagacggcgccgagaaagaagcteagaaagaaagcaatecgaagagceagcaccgc[accagagaaaaaga agaaagagcegctggatattcucgaacaagaaccggaggageatataRccacccgccaaacRcgacnaigcaacaacagaRagtgatazgca aagtgaacagtatc3gagaatgaaitgggaaagaatgaagaaaaagaRcaeggaRggt!aacagagtcaacgcgaagaatcngRcaaangtca gagaacncncaagagaatgłgattcgKcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaattaatRaaRRTcaggggacRctctgccgtg acaRancaagctcaggcRicicaccagganctctaacgtctatgcagcntggcggcsgttatcaactcgaaanccctcatgtcggtgaacttcnctc cgtcgtctgaRgtacagRcaaaagaagrtKcgtagaaatgacagaggcgicacggtgaacgtgateaaartcatcgcacatttgattaatcaacaag ngctcacgaagttcRgcgctggaaatcatgaRclgatgcngaagaaccaactgatgancagRgaagicgccattgsgttcctgaaagagtgigga gcaaagcttctggagaRgetccagcagctcnaacagtgtctaegaccgtcttcgtgcaattctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcactggaic gacgiatrcagtatatgattgagBCtgcaatgcagattcgaaaggacaaaRtgcggtaaggtagaatataiaaaiagtttattagaaaaaaa!aaatiag aaiaaniaaartcciactagccaatcaggcgacMRttgcgcatagttctattattgaaaaamggagaaRtctcatattctcgctcggaaateiggaatt cgacgagaEcttctggcnctgtgcagcigeatcgcRtgtgetecemcłcgcttgrcnctgtgiacaccaagaaccRgttgagttcalcaaetgaatct gtgactggcRgngctcactggatgcactagacgacigattctcgagaaatcagattgagttgcganagggtgacctagaaaRgggaataataegaa cnRgaaaat3EtcaggagganaaaaaaanaRctcgacaaicctacaaaniacRangcaccatgttgctecaacantncanaaaagna3tg3aaa aargtagaaaatcggaaaRggcaatRtcagaccanR!aagcattncaaaaaaaaaRgcagctgaaataaatgicanttcagataaaicgagcgaR ncigRgicigacaciagRRtagtmaaaaaatgnggaagaacatggtgcaataggiaaRtcatagaamccatgignRRncaaRa3Ccaanatc caaatcnceaaactcacanttgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagRRataagacgagcatctcigatatcacigaaaanaatRRaalca aaacngaaiatcaacuaacccacRanaactncKgatcnctgtcgttcggtacgatgacggtgaagaagecaang)agtagttgaRtggncaag[
PL 216 779 B1 ccittcggtgttgtacgtcagtgtccigcaatgciatttagnataacttaggcctaagancaaltlaaigaagtganaaatttgttctctgaacctcttaaga
Igatcttttggattagaaacataiaagacaggntacclatctattaaaaaacagalcaaaatagatacgaceaaatcggataaiccatgcctacctggca!
ciaggaacgtgncttagaagantcttacgraatcgtatgaagaaataacaatttgaKgnggccageaaaaatagggttnaagtgggatagtgtnttii tagetaaccggaaaattttatagnmttttgciagaaaccactgaaaaceccctaattgtttacattttttggagcagcttctggtcttTttgagcaataaaai
Kgataaaacagaamaagtguaattgficacafttagtttclattrtatcaaattngngcuaaaaacattcgaagctgcictaaaaaaaigeattaaaaa aggggttttcagtggttttlcaeanaaaaaagctaamtaacuaaaatecatcatatttccaacntgTcacaacaataaflatgctggtcaaaatgtgncg aaaaaatgtmtttttttaatmutaatniaaaatagttttctttcgctgggacacaacantttgggcgfaaattttcagttcaaameeanttticaaccat aatcaiaaagctacgtctgatcietctegcaettaeetgcgcctgattcgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagttg!
ggtagtggacgttcafcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtMcactttccgtactattgagagaggggagaetgaagatggcaattgaggaca gtgtcttcgacgeaegcatgcaiccataagcataateeaggagggaiggagagaaaaarcttgtttctaagcccctwctttgiaatacitacacatatct aataecgaagaatggc!aattgaatggacgicagctgttgcigtagttgcciaggcatcatcgatgaaataaeigaaagaaagaattaaalaattattgc aggcgtatccggcggKangaagacnggacttgattgaggaggaggatcagatcalccatacacttaattlggaggatgcggngatccggaaaalg ggcttagtaagtgactgaccacicgcggggggcattaatnaafaaattgaattccatttcagatgtgncaaactagatccagaattcgaaaagaacga ggaggnutgaggagaiccgtaaggaaatcattggaaacgwgatatttcggatgaggalgglggcgacgagnggatgalgaagaagagggtagt gatgtggaagaggctccgiagaagactacagagattangataaiactgatcagaattgacigctttcagaaggtattcatttlgagttttgggccggcaa atctgtaagrtgccggttgecgaaaatttgctgaattigccggaaaaaaaaan«ggaatttatttaaaaactKttgtaaaaattaaattaaattlgcaacR itcagagaagtctacctgacaaigcaaicatttnggacMccaagaagctgctcacaaattgcigaaaatgaagatttcagacagcatgcaggttagc gatgttgcaaagaaaaanticgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaantaaaaaaaaact£egnntttcttrnttt«tacgagaaaaaccaaaaaa atgtatttttgccaaattctaaaaiaefatccccgaaatmcaatattttctctttcagaacgaactctgcgcgatgcttgKgattgttglgctcaacagcgta cctacgagcgattctacggaatgclcaKgaacgtRclgccgacttcgcctcgaataccagcaatacttfgaaaagctctgccaggacacgtattccac gattcaccgaattgacateacaaaactgcggaatnggctcgecttattgctcatttgcKtcgacggatgctattgaclggaagattnggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacticnctggcagaatctataRaaatatatafttaatgaacngtggaggcgatgggaatggttaaacncattcgagag nactgatccglgagtncctagagagagttgttttcgtattcaaitttcccUtTncagaactttggcrcangctttgtiggattatteccacgaaciaatccg aacagcgcacganncgatcaacncncacaatgattggangggtggtttgacgRggaacHcgtgaatggctggcaaagggtctcaagaagaaga agggaaigclggatcagttgaaggccgaatcaagctcagattcatcgtcgtcttcggattegtcagactcgtctgatWRcggattcigacgattcatcc gnctcgtcttcagaRcetcatcncncagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaigaacagfgaagBgagnccaaaaagaag gaaaaagagaatattggtegacgggatcgiggagacaagagagttgaacgtcatcgtgatcaaagigtggagaacaaggacaaggatcgtcgacg icgccagganctgacgaaaaicgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagategicgtcgtcaagactcggatgatgagg atcggaaaggKgtgaacgKgggaagaticaggggaaagacglcgcggagatcgggatcgacglgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg igaagaicgcegtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgKaigactctgatgatgatcgtaaaactcglcgggaUgaagt gaagagcgaggaggacgtcg!cgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgrtgaattttcaaattttaaatactgaatamgtltttt«cctait atttatttanclcrttgtgtttttittcngcrttciaaaaaattaaticaatccaaateuaacatgagcggttttttttctctttccgtcteccaattegtattccgct cctctcatctgaacacaatgigcaagtnatttatcttcicgctttcatncattaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacacacaaaaggaig atggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaaaagaaaacataaaaaiataugaggaggaa ggaaflactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgalgagaangtcctcgcttggeaaaigcgaatccgiaiggagaggcacgtnggcga aggcaaatgttcggtatggagaKtgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctctmacaaaanttccgittttcgcttgaaattacggtgccaggwt cgacacgtcttccaatttncaaartcaiaagagcctttaBtgggctgtagttgcttarrtetcgttfitgaaaatttttettccgrtiaatcgaaarngatgtattt tatttatgattttcaataaatltcaaagaaaetggtgaaaactcggaaaaRgtgaactacagtaatccaatcctUaaggcgcacacctrnaaatgtccgc cccaalacgaiatTtRttaagancgctagageggecgccaccgcggtggagciccaattcgccctatagtgagtcgtaRacaattcactggccglcgt tttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacitaatcgccrtgcagcacatccecccRcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgaregcccncecaacagngcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgMCtgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgfggtggrtacgc gcagcgtgaccgclacacttgccagcgecetagcgcccgctcetttcgctttcncccncctttctcgccacgttcgccggctnccccgtcaagcfcia aaKgggggcKcctftagggnccgantagtgctttacggcaccKgiccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccaKgcccl gatagacggtttncgcccttigacguggagKcacgttcntaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatetcggtclattctnt gattotaagggattttgccgatticggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaiatnaacgcgaaltttaacaaaauttaacgmaciamca ggtggcacrttfcggggaiatgigcgcggaacccctatttgtttaKtttctaaataeaHcaaatatgtalccgctcaigagacaataacectgataaatgc ncaataatettgaaaaaggaagagiatgagiattcaacantccgsgtcgcccttatlcccttttttgcggcatltigccticctgtrtngcTcacccagaaac getggtgiaagtaaaagatgctgaagatcagngggtgcacgiglgggttacatcgaactggaKteaacagcggtaigatccttgagagttttcgcc ecgaagaaegttttceaatgatgagcactmaaagttctgctalgJggcgcggtanatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggrcgccgcat acaciattctcagaatgacttggtigagiacicaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcacgacagtaagagaattatgeagtgctgccataag catgagtgataacactgcggccaacnacnelgacaacgatcggaggaccgaaggagclaaccgclttttncacaacatgggggafcaigtaactcg ccngatcgttgggaaccggagctgaafgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact attaactggcgaacUctacKiagcneccggcaacaanaatagactggatggaggeggataaagngcaggaccacnctgcgctcggseettcc ggctggctggtnangctgataaatciggagccggtgagegtgggtclcgegguteangcageactggggccagatggtaagceetceegatcgl agnaictacacgacgggcagicaggcaactatggatgaaegaaatagacagatcgctgagataggtgccteactgattaag£attggUactgtcag accaagcnacicaiatatacmasattganlaaaacncatmtaamaaaaggaiciagglgaagatcctttttgataatctcaigaccaaaauccttaa cgigagitttcgticeacigagcgttagaceccgUgaaaagalcaaaggatcncBgagatcctttttttctgcgeglMtclgclgcngcaaacaaaa aaaccaMgciaccagcggtggmgmgccggattaagagcuccaacKtttttecgaagguactggeKagcagagcgcagauccaaatóet gtccttcagtgtagccgtagttaggccaccacticaagaactctgiagcaccgcciacłiacctcgctctgctaatccignaccagtggctgctgccag iggcgaiaagKgtgtcttacegggttggacKMgaegatagtiaecggBtaaggcgcagcggtegggetgaacggggggtwgtgeacBcagce eagcttggagegaacgacclacaccgaacigagaUcctacagegtgageangagaaagcgecacgcttcccgaagggagaaaggcggacagg talccggaagcggcagggteggaacaggagagcgcacgagggagcnceaggggggaaegcctggutctttaugtcctgtcgggttfcgccat «ctgacngagcgtcgantRgtgatgctcgtciggggggccgagcettiggaaaaacgccagcaacgcggecttttucggttcctggeetMgct ggccttttgctcacatgncmcttgegtlatcccctgattctgtggaiaaccgtattaecgcctttgagtgigctgBtaccgctcgccgcageegaaega
CcgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaMgectctcccegcgcgnggccgattcattaaigcagctg gcacgacaggmMCgaciggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattaggcaccccaggctttacacntaigct tccggctcctatgRgtgtggaattgtgagcggataacaatncacacaggaaacagcUtgaccatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaa agggaacaaaagctgggggg
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw, 8 pAS2-cyh2-HA+bothT7-ruial gatcegicgacagatciccctatagtgagtcgunacigcagccaagclaatlecgggcgazmettatgatttargattRtanittaaataagiiataaaaaaa ataagtgiatacaaannaaagtgactcnaggnnaaaacgaaaancngtttngagtiactctncctguggteaggttgcntcicagguiagcatgaggt cgctcnatTgaceaeaeettlaccggcaigcaagcnggcgtaitcatggtcaugetgtnccigtgtgaaattgttatccgctcacaanecaeacaacatac gagceggaageataaagtguaagcctggggtgcctaatgigtgaggiaactcacanaattgegngcgcieaclgcccgcmccagKgggaaacctgt cgtgccagctgganaaigaatcggccaacgcgcggggagaggcggKtgcgtattgggcgctcnccgcncclcgctczcTgactcgcigcgcicggtcg ncggctgcggcgageggtttcageTcactcaaaggcggtaaacggttaiccacagaatcaggggataaegcaggaaagaacatgtgagcaaaaggcc agciaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgngclggcgtttnccataggctccgcccccctgacgagcateacaaaaatcgacgcicaagtcagag gtggcgiaacccgaciggicuiaaagataecaggcgtttccccctggaagctccctcgtgCiCicKctgttccgiccctgccgcmccggauceigtc cgcctttctcecncgggaagcgtggcgctRctcalagctcacgctgUggtatctcagncggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtglgcacgaac cccccgttcagceegaccgetgcgccttatccggaictitcgtcngigrccaacccggtiagicacgicRaicgccictggeagcagccaetggtaaca ggattagcagagcgiggtatguggcggtgctacagagncitgaagtggtggcctaactacggtiacactagaaggacagtatnggtatctgcgctctgct gaagccBgttaccncggaaaaagagttggiagctcRgatecggcaaieaaaeciccgctggtageggtggtttnttgtttgeaigeigełgitucgcge agaaaaaaaggaictcaagaagaiccittgatcmtcUcgggstctgacgctcagtggaacgaaaacIMcgttaagggattttggtiitgaginaieaaa aaggatcncaeeugziccnnaaanaaaaaigaignttaaatcaatctaaagtalitatgagtaaacttggtctgacigniecaatgcnaatcagtgaggc aectateteagcgatctgtctarnegneaiecatagttgcctgłctccćcgtcgtgtagaiaaetacgatacgggagggctlaccatctggccccagtgcigc latgatacegcgagacccacgctcaccggctccagatitaKagcaatłaaccagccagccggaBgggccgagcgcagaagiggtcctgcaactttatce gcctccatccagietattaattgttgccgggaagętagagtaagUgttcgecagttaatagtttgcgeaaegtlgttgeeattgctacaggcatcgtggtgKa cgctegtegmggtatggeneaneageieeggttcccaacgatcaaggcgagnaeatgatcecccatgttgtgcaaaaaagcggttagctcettcggtnt ccgatcgttgtcagaaglaagRggGegcagigttatcactcatggnaiggcagcactgcataattcccnaclglcatgccaiccgttagaigcnttctgtgac tggtgagtactcaaccaagtcancigagaatagtgtatgcggcgac:gagttgctcrtgcccggcgtcaataegggataataccgcgccacatageagaac ntiaaagigetcaicanggaaiacgnciteggggcgaaaaetcteaaggatcnacegctgttgagatEcagttcgatglaacccactcgtgcacccaactg alclteageatcttnaetncaceagcgRtetgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacBcggaaatgttgaat acicaEactcttccrttncaatanangaagcatnatcagggningtctcatgagcggatacatatttgaatgtamagiiaaataaaeaaaaggggnccgc
Sc»catneccegaaiagigeca«lgaacgiegcitctgtgctttitntgttgaaciaaiatgcaaegcgag*gegetaeimtc>aacaaagaaictga gctgcatttttacagaicagaaatgcaacgcgaaagcgcuttttaccaacgaagaatctgtgcttcamttguaaicnaaatgcaacgcgagigcgctaa tttnciaaciaagaatclgagctgcamfiacigiacagaaatgcaacgcgagagcgctanttaccaacaaigaatcuucttcttmtgttciacaasaatg eatcccgagBgegctaRtnctaaeaaageatetugaRactmtnctccittgtgcgctclatsaigcagtetetigaiaaetttngeacigtaggtccgnaag gttagaagaaggctactttggtgtctattnctcnccataaaaaaagcctgactccactteccgcgtttactgattactagcgiageigcgggtgcattttntaag ataiaggcaiccccganatattciauccgitpggattgcgcatactttgtgaacagiaagtgltagcgngatgancncanggicagaaaanatgaacg gntcttctatRlgtctctatataciacitataggaiitgtttacatttKgtattgttttcgancaMcuigaaiignettaetaeiantttttgtciaaagagtaatac tagagataaacitaaaiaitgtagJggtegagtKagatgcaagncaaggagcgaaaggtggitgggtaggttaatagggatalagcacagagaialata gcaaagagatacttttgagcaatgtttgtggaagcggtattcgc3BtattnagtBgc:cgttacagtccggtgcgtttttggttttngaaagtgcgtencagagc gettnggttneaaaagcgctctgaagRcctatactttctagagaataggaaeticggaataggaacttcaaagcgtttccgaaaacgagegenccgaaaat gcaacgcgagctgcgeacatacagctcicigtteacgtcgcacctautctgcgtgttgectgtatatatatatacaigagaagaacggcatagtgcgtgrcat gcttaaatgcgtacnaiatgegieumatgiaggMgaaiggBgtctagtacctcctgtgaiattatcecittccatgcggggtatcgtaigcnccncagca ciacccmagctgttetataigetgceaciceteiangganigteteawcncaatgetaKarnecnigatanggiteaianaagaaaeeinanatcBtga cataacctatauaaiiggcgtatcacgiggecctttcgtctcgcgegttlcggigaigacggtgaaaacctetgieacatgcagcteccggigacggua cagcngtctgtaagcggaigccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcggglgitggcgggtgtcggggctggctuactaigeggeaicig agcagattgtaetgigagtgeaeeatłgateiaegacattactautatataauiaggaagcattuatagacagcateguatatatgtguctngcagttatg acgccagatggcagtagtggaagalanetRatigaaaaaugcngtcaccttacgtacaalcngaiecggagcttncGtttngccganaagaaRaattcg gtegiaaaiagaaaaggagagggccaagagggagggcanggtgacattgageacgtgagtaucgtgattaagcacaeaaaggcagcttggagutg tctgttatiaameaeaggtagttctggteciHggtgaaagtRgeggettgcigagcacagiggccgeagaatgtgetctagattccgatgctgacttgctg ggtattatatgtgtgeccaatagaaagigaacaattgacccggttattgciaggiaaatncaapcttguaaagcaUlaaiiaiagneaggcaeiccgaa atactiggttggcgtgtncgtiatcaacctaaggaggaigttttggctctgglcaaigattacggcattgatatcgtccaaetgcatggigatgagtcgtggca agaataceaagagnccKggtttgccagnanaaiagactcgtamccaaaagacigcaacaiactictcagtgcagctlcacagaaacctcancgtnan cccttgntganeagiBgcaggtgggacaggtgaacttnggattggBactcgamctgartgggttggaaggcaagagagcccegaaagcttaeatmat gttagctggiggaetgaegeeagaaaatgnggtgatgcgcttaganaaatggcgnatiggtgttgatgtaagcggiggtgtggagacaaatggtgtaaaa gactctaacaaaatagcaaatttcgtcaaaBatgcuagaaataggttinietgagtagutRatttiagiangtttgtgcaengccgatetatgcggtgtgaa ataccgcacigitgcgiaaggagaaaataccgeaieiggaaangtaiacgttaitattHgttaaaatKgegttaaatttttgttaaatcagctcainntaacc aalaggccgBaaieggeaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagaiagggttgagtgttgttccagttlggaacaagagtecactuuaagaacgt ggictccaacgtcaaagggcgaaaaaccgKlaKagggcgatggcccactaepgaaccatcaccctaatcaagttitngggglcgaggtgccgtaaag cacaaaicggaaccctaaagggagcccccgatttagagc«gacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggiagggaagłaagcgaaagg3g cgggcgctagggcgclggcaigtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaceacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgicgcgceancg ccattcaggctgcgcaactgngggaagggcgatcggtgcgggccicttcgctattacgceagaggcgaaagggggatgtgetgcaaggcgatuagn gggtaacgceagggRttcccagtciCgiegngtaaaacgacggccagtcgtccaagctncgcgagctcgigatcccgagctttgiaaanaaagccttc gagcgtcccaaaaccttctcaagcaaggttttcigtatastgttacatgcgticacgegietgtacigaaaaaiaagaaaaarttgaaataUaetaacgnctt aatactaacataactaiaaaaaaataaaiagggacciagaettcaggngtctaactccncctntcggttagageggatgtggggggagggcgigaatga» gcgtgacalaactaattacatgaUtccttitgttgtnccgggtgtacaltatggaencetetIttcIggeaaeeaaacccaacatagggattcctataBtaecrt cgttggtctccctaicatgtaggtggcggaggggagatatacaatagaacsgauccagacaagacataatgggctaaicaagactacaccaatucactg ccteattgaiggtggtacaiaacgaaęlaataKgtagccctagacttgatagccateaKłiategaagtttcactaccctttttccattigccatctattgaagta ataauggegeaigcaacttcttttcnntttttcttttctctctcccccgttgttgtetcaceatalcegcaatgacaaaaaiaatgatggiagacactaaaggaaa aaattaacgacaaagacageaccaacagaigtcgttgnccagagctgitgaggggtatctttgaacactcgaaaMttttcertecttcattcacgeaeacU ctctctaatgagcaacggtatacggcettccttccagttaettgaatRgaiataaiaaaagtttgccgctttgctatcaagtauaatagacMgeałttittaatc ttttgtttectcgicattgttciegttcecmcttccttgtttctttttetgeacaatatncaagelalaccaigcaiacaatcaaetccaagcttgaagcaagccicci gaaagMgaagctactg1cttctatcgaaeaagcatgegatantgccgachaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgegccaaglgtetga
BgaacaactgggagtgtcgctactcKccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcaeatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaica gctatttcUctgamncctcgagaagaccttgaeatgattłtgaaaatggaRMnacaggitataaaagcattgttaacaggattatngtacaigataatgig aataaagatgccgtcacagataganggcncagtggagaclgatatgccictaacattgagacagcangaataagigegaeatcateatcggaagagagt agtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgceggaattcttaatacgactcactatagggcatatggccatggaggccccggg
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw, 9 pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7 gatccgtcgacagatctccctaiagtgagtcgtanactgcagagatctatgaalcglagatactgaaaaaccccgcaagrtcacitcaactgtgcatcgtgca ccitctcaatRcRtaintatacatcgttngccRcnnatglaactatacicctetaagtttcaatenggccatglaacctctgalctaTagaattttttaaatgacta gaattaatgcccatctrttnnggacctaaancttcatgaaaataiatiacgagggcttancagaagętttggacttcttcgccagaggtttggtcaigiaccia tcaaggttgicggęttgKtaęcttgccagaaatttacgaaaagatggaaaaggglcaaaKgttggtagataagttgttgacacnclaaataagcgaarticn atgatttatgatttttaRattaaataagnauaaaaaaauagtgtaucaaartRaaagigactcRaggtntaaaacgaaaaRcttgncttgaguacicnKC tgtaggtcaggRgctttctcaggtaiagcatgiggtcgctcKangaccacacctctaccggsatgcecgaaattcccctacceiaigaacatanccafflgt aantcgtgtcgRtctattatgaatttcaRtaiaaagtttalgtacaaataicataaaaaaagagaatcRtnaagcaagganncttaacRcRcggcgacagca tcaccgactKggtggtactgttggaaccacctaaatcaccagttctgalacctgcatccaaaacctttttaaclgcatcttcaaiggccttaccttttKaggcaa gttcaatgacaafttcaacatcattgcagcagacaagataglggcgatagggtcaaccnattctttggcaaatctggagcagaaccgtggcatggttcguca aaccaaatgcggtgRcRgictggcaaagaggccaaggacgcagaiggcaacaaacccaaggaaectgggataacggaggctlcatcggagatgatatc accaaacatgRgctggtgartataataccatnaggtgggttgggttcttaaciaggatcatggcggcagaatcaatcaattgatgngaacctlcaatgugga aiitcgttcttgatggtncciccacagtttitctccataatcttgBagaggccaaaacattagetRalccaaggaccaaaiaggeaatgglggctcatgttgtag ggMatgaaagcggccancngigattctngcacRctggaacgglgtaRgncactatccęaagcgacaccatcaccatcgKRęcRtcwttaccaaagS aaatacctcccaetaattctctgacaacaacgaagttagtaccRtagcaaattgtggchgittggagataagictaaaagagagtcggatgcaaagttacat gglctBagnggcgtacaangaagncmacggaRtttagtaaaccRgttaaggtctaacactacctgtaecccatnaggaceacccacagcacctaacaa aacggcatcaaecttcttggaggcttccagcgcctcatctggaagtgggacacclgtagcatcgitagcageaccaMaattaaatgattttcgaaatcgaac
RgacaRggaacgaacatcagaaatagcRtaagaaccRaatggcRcggMgtganwttgaccaacgtggteacctggcaaaacgacgaicncttaggg gcagacaRagaatggtatatccttgaaatatatatatataRgctgaaatgtaaaaggtaagaaaagttagaaagtaagacgangctaaccacciattggaaa aaacaataggtccnaaataaiaRgtcaacRcaagtangtgatgciagcaRtagtcatgaicgcRctctattctatalgaaaagccggRccggccictcac ctnccttmctcceaaRntcagttgaaaaaggtatatgcgtcaggcgacctctgaaattaacaaaaaatttccagicatcgaaRtganctgtgcgatagcgi:
CwtgtgtgRMcgRaigRgaggaaaaaaataatggRgctaagagaRcgaacicngcatattacgatacctgagtaRcccacagRggggaKicgactc tagcugaggatcaaRcgtaatcatggtcatagctgRtcctgtgtgaaaRgtratccgctcacaaRccacacaacataegagecggaagcataaagtgtaa agcctggggtgcctaacgagtgaggtaactcacaRaattgegttgcgeKactgcccgctRccagtcgggaaacctgtcgtgccagctggatUatgaaic ggccaacgcgcggggagaggcggmgcgtaRgggcgctcnccgcnccKgcKactgactcgctgcgcteggtcgRcggclgcggagagcggiaic agctcactcaaaggcggtaatocggRBKcacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgia aaaaggccgegRgctggcgnRtccasaggctccgccceccigacgagcawacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact ataaagaiaccaggcgRtccccctggaagctęcctcgtgcgetcteetgRecgaccctgccgcRaccggaiacctgttcgretttctcccacgggaagcg iggcgcntcteaUgcKacgciguggtatctcagRcggtgtaggtcgncgctccaagctgggcSgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaMgctg cgccttatEcggtaactatcgtcitgagtccaacccggtaagacacgacttategMactggcagcagccaciggtaacaggaRagcagagcgaggtalgi aggcggtgctacagagttcngaagiggtggcctaactacggctacactagaaggacaglatltggtatctgcgctctgctgaagMagRaccncggaaaa agagRggiagctcitgatccggcaaacaaaccacegciggUgcggtggRttttigtngcaagcagcagaHacgcgcagaaaaaaaggatcKaagaa ga!ccragatcttnctacggggtetgacgc!caglggaacgaaaacicacgttaagggaiRtggtcatgaganatcaaaaaggaicttcaectagatccttti aaanaaaaatgaagmtaaaKaataaaagtatatatgagtaaacRggtctgacagtlaęcaatgcRaatcagtgaggcacctatcKagcgaicigtctan icgncarccatagRgcctgaitccccgtcgigtagataactacgatacgggagggcitaccatctggccccagtgcigcaatgataccgcgigacccacg ctcaccggclccagatnarcagcaaiaaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactnaiecgcctccatccagtctattaatlgt igccgggaagctagaguagiagncgccagttaaugntgcgcaacgngRgccaRgitacaggcatcgtggtgtcacgcKgtcgRtgguiggctua ttcagctccggncccaacgaicaaggcgagttacatgatccKcaigHgtgeaaaaaageggnageiecttcggtcctecgatcgttgLcagaagtaagn ggcegeagtgnatcacwaiggttatggcagcactgcataattctcnactgteatgacatccgtaagatgcnRctgtgactggtgagtacKaaccaagtcat tetgagaatagtgtatgcggcgaccgagRgcKRgcccggcgtcaataegggaaaUMgcgecaeatagcagaactttaaaagtgcicatcattggaaa acgRcncggggcgaaaacKtcaaggaKnaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcglgcaceeaactgaMRcagcaicttttacRtcacc agcgRtclgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaatoagggcgaeacggaaatgttgaataeKatactcttccRRtcaatatt attgaagcaRtatcagggRaRgtctealgagcggatacaBRtgaatgtatttagaaaaataaacaaaCaggggrtecgcgcacatnccccgaaaagigcc acctgacgtctaagaaaccattanatcitgacattaacetataaaaataggcgtatcacgaggccctRcgtctegcgcgtttcgglgatgacggtgaaaaMt ctgacacatgcagctcccggagacggicacagCttgtctgtaagcggalgccgggagcigacaagcKglcagggcgcgwagcgggtgttggcgggt gięggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccataacgęaRtaagcataaacacgcactatgccgttcttctcatglaiat autatacaggęaacacgcagatauggigcgacgtgaacagigagctgtatgtgcgcagcttgcgRgcaRRcggaagcgcKgnttcggaaacgctR gaagnccURccgaagnccURCtctagciagaaagtataggaacRcagagcgctRtgaaaaccaaaagcgctclgaagacgcacRtcaaaaaaeca aaaacgcaccggactgtaacgagciacwaaataRgcgaataccgcRccacaaacangctcaaaagutctcRlgctautatctctgigctalatccctaia taacctacccatccacctttcgcKcngaicttgcatctaaacregacctctacaRRttatgtttatctctagtattactctttagacaaaaaaaitgtagtaagaac tartcatagagtgaaicgaaaacaatacgaaaatgtaaacaRtcciatacglagta!atagagacaaaatagaagaaaccgRcataatntc!gaccaatgaa gaatcaicaacgctatcactnctgneacaaagatgcgcaatccacaicggtatagaatataateggggatgcctttatcttgaaaasatgcacccgcagctt cgctagtaatcagtaaacgcgggaagtgęagKBggctttttttalggaagagaaaatagicaccaaagugccRcncuaecRaacggaccSacagtgc aaaaagttttcaagagacigcattatagaącgcacaaaggagaaaaaaagtaatttaagatgcmgtUgaaaaatagcgctcKgggatgcattKtgtaga acauaaaagaagtatagatKtttgtiggraaaatagcgctctcgcgngcaRtctgRcigtaaaaaigcagctcagancntgtngaaaaatttgcgctciCg tgngcatnngRRacaaaaatgaageacagaRcttcgttggtaaaatagcgcRlcgegngcaRielgncigiaaiaaigcagclcagattcRtgtRgBi aaaRagcgctctcgegRgcatttRgttctacaaiatgaageaęagatgetttgRgeRgcitgciaettctttteRRtttttcttnctclcticcccgRgttgtet cactalatccgeaatgacaaaaiiaatgBlggaagacactaaaggaaaaaattaacgacaasgacagcaccaacagatgtegngttccagagctgatg» ggggtatcncgaacacacgaaactnttccttccRcattcacgcacactoctetctaatgagcaacggttticggeettecttccagracttgaitttgaaatia aaaaagtttgecgctRgttatcMgttBaatagacclgcaaRanaatcRflgtoeeicgtcattgBCKgttccetnencettgRtctttttcigMciatatn caagcutaccaagcatacaatcaaciccaagcRtgcaaagatggataaagcggaattaatttccgagcclccaaaaaagaagagaaaggi£gaattgE;
taccgccgccaaRttaatcaaagtgggaataHgctgatagctesngttcRcactttcactaacagagcaacggtccgaaecKiHicaicieaaacaaa
RctcaagcgetttcacaaceaattgcctcclctaacgttcatgataacRcaigaataatgaaattacggctagtaaaattgatgitggttataafleaaaaecsc tgtcacciggnggacggaccaaactgcgtataacgcgtnggaatcactacagggatgtttaitaccactacaitggatgatgtatataactatciancgatga tgaagatacccciccaaacccaiaaaaagagatcgaaRctuatacgacteaclittgggwcatgiacgaagaatccBgttcaRcttatgtacctatgclg agaaicgtgccaataagaagccaatacRccRagatgatgcaataaatattaaaataaaacaaaaeagaaggctg
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw. 10 pGN20J:
ccggtggUCcgggcccccccicgaggtegacggUKgaiaagctncgrcangaaaagaaggataagaatggacgatgggaagaagctcKgtt gnccaggagateagaaaacageaaetgttcciaatcnaaggagggagaagaatarcaattcagaatttcigctcgtaacaaggctggaactggaga tccnctgatccnctgatcgtgtigngcgaagccaagaaaccttgciccaagaattcatcgtgaagaKtRc:gatacaactgtcaaggtcggagccac tctcaagttcangneatattgatggtgagccagcaęeagatgtaacatggteattcaatggiaaaggaaKggagBgagcaaggctcaaattgaaaa tgagccatacatitcgagatttgcntgccaaaggcaettegtaagcaaagtggaaaztataeeateactgcaaccaacattaatggaaetgieagtgtc actatcaataicaaggtaaaaagcaagccaacgaaaccaaagggaccaaEcgaggtaactgatgtcttcgaagatcgtgcaacteRgactggaaac caccagaggatgacggaggagagccaattgagttetatgaaattgaaaagatgaacaceaaggacggaatctgggttccatgtggicgiagtggag atacccacncacagEcgattcaetcaacaagggagatcattacaagttccgtgtcaaggctgtcaacagcgaaggacettctgatccattggaaactg aaaccgataKttggcaaaaatccantgatcgtccagatagaccaggtcgtccagagccaactgattgggattctgatcatgttgatctcaagtgggat ccactagnctagaagcgetgctaagggggccctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaaga agaaaaagigtcatctgaacaggtngattttctttctggtcaaaaagatgaaanattgattncagecagatactcccaaaactagcagcgagaagtct gcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcgggaagtgagccaagaggtatgtttncaaaaatcaataactgateataanntattgtttggtgaattt aagaaaataatancgaaaattccictgaattatcaagangcagutUatttcgagaaaaattgagatattcatagagctattgtaaattncttgantcag actgaaacncggaaaatcaagagaaaatcaaagaaaaggatgacggggatgatcagectggcacaccgaacagctatagaagccgggaaaettc accagctccaaaaaggtccaaggagaccaggtttgtcaaaagcłtcetgcgattaattctcattteaatttticagagaatcagagtctcctgaaaaatcc ecggttcgttcaagautcccagaaggtcncagcacgttccccgtcacgatctcclagacggcgccgagaaagaagctcagaaagiaagcaatccg aagBgecagcaccgetaccagagaaaaagaagasigagccgctggatattctacgaacaagaaccggaggagcatatattceacccgceaaactt cgacttatgcaaeaacagattaglgataagcaaagtgaacagutcagagaatgaattgggaaagaatgaagaaaaagattcacggattggtiaacag agKaacgcgaagaatcngncaaattgtcagagaacttcttcaagagaalgtgattcgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaat taatttaantTtcaggggacttctctgęcgtgacattattcaagclcaggctttctcacCBggattctctaaegTctatgcagctitggcggcagttatcaac tegaaaRccctcatgtcggtgaacttcttctccgtcgtctgattgtacagttcaaaagaagtttccgtagaaatgacagaggcgtcacgglgaacgtgat caaattcatcgcacatttgattaatcaacaagttgctcacgaagttcttgcgctggaaatcatgattctgatgctlgaagaaccaactgaigatttagnga agkgccangcgttcctgaaagagtgtggagcaaagcttctggagattgctccagCBgcicttaacagtgtctaegacegtcttcglgcaattctcatg gaaactgaaagatcggaaaatgcaccggatcgacgtattcagtatatgaRgagactgcaatgcBgacicgaaaggacaaatngcggtaaggtagaa tautaaatagtnanagaaaaaaataaattagaataatnaaattcctactagccaatcaggcgaęctttttgcgcatagttciattattgaaaaatttggag aatttctcaURctcgctcggaaatctggaaRcgacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgctngtgctccctttctcgcttgtcttctgtgtaca ccaagaaccngRgagttcatcaactgaatctgtgactggcttgttgctcactggatgcacugacgactgattctcgagaaatcagangagngcgan agggtgacctagaaattgggaaiaatacgaaettttgBaaatattóaggaggattaaaaaaattattctcgacaetcctacaaatttacttattgeaeeatgs tgctecaaeatttttcattaaaagnaatgaaaaaatgtagaaaatcggaaattggcaatineagaccatttttaagcattttcaaaaaaaaattgcagctga aataaatgteatmeagataaatcgigegatntctgtigtctgacactagtttttagttttaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaatttcatag aatttccatgtgRtmttcsattaaeeaattatccaaatcttccaaactcacattttgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagtmataagacgagc atMctgatatcactgaaaanaarnnaalcaaaacttgaatatcaaetaaacccacttattaacttKtcgaiccctgKgncggacgatgacggtgaa gaagccaattgtagtagngatnggncaaglcctttcggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctattugttataacttaggeetaagancaatttaatg aagiganaaatngttctctgaacctenaagatgatcttttggattagaaacautaagacaggtttacctatctatiaaaaaacagatcaaaalagatacg accaaatcggataatccatgccucctggcatctaggaacgtgttcttagaagatttc(Ucg(aatcgtatgaagaaataacaatRgatcgnggccag caaaaatagggmaag(gggaagtgtttttaRagctaaccggaaaattnatagntnRtigcaagaaaecactgaaaaccccctaattgtatacattn
ETggagcagcnctggtctttngagcaataaaattcgataaaacagaamaagtgtaaangttcacamagmcratraattaaattttgttgctcaaaaa cattcgaagctgetctaaaaaaaigcanaaaaaaggggttttcagtggtttttcacattaaaaaBgctaatffiaactaaaaatccatcatatttccaactttg tcacaaeaataaaatgciggicaaaatgigttcgaaaaaatgtttttttttttaatłcttataatttaaaaatagttttctttcgctgggacacalacatKttgggc gtaaattneagtteaaantttaitnucaaccattałcataaagctacgtctgawtetetcgcacnacctgcgcctgattcgaaagaacaieegtagc caaaagaacaagaagaacaagcacgtagngtggtagtggacgttcaicacgcaatactgaccaaiggtcgtggggtctcactnccgtactangaga gaggggagacigaagatggcaattgaggacagtgtcttcgacgcacgcatgcatccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcttgttt ctaagcccctcccRtgUaucaucacitatctaataccgaagaatggctaangaatggacgtcagctgngctgtagRgccaaggcatcatcgatg aaataactgaaagaaagaanaaataaRaRgcaggcgtaiccggcgg(cangaagacnggacRgaRgaggaggaggatcagatcatccataca cnaamggaggatgcggngatccggaaaatgggcttagUaglgactgaccacacgcggggggcanaaRtaataaaRgaattccatncagaigc gncaaactagatccagaancgaaaagaacgaggaggttUtgaggagatccgtaaggaaatcaRggaaacgccgatatttcggatgaggatggtg gcgaegagttggatgatgaagaagagggtaglgatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaangactgcR rcagaaggttttcaRRgagnRgggccggcaaatctglaagttgccggRgccgaaaaRtgctgaantgccggaaaaaaaaaRccggaatttattta aaaacntRgtaaaaanaaaRaaatngcaaciRtcagagaagtctacctgacaatgcaakatctRggactaccaagaagctgctcacaaangctg aaaatgaagattccagacagcaigcaggtcagcgatgRgcaaagaaaaattRcgaccaaaaaaaccaaccaaicataaaatnaaaaaaaaactcc gtttttRcRttRRtaEacgagaaaaaccaaaaaałlgtattmgccaaanctaaaatactalccccgaaactncaataCR4ctctttcagaacgaactctg cgcgatgcngtcgaflgRgtgcicaacagcgtaccUcgagcgaRctacggaatgctcatcgaacgtnctgccgacRcgcctcgaataccagcaa actngaaaagctctgccaggasa£giattccaegancaccgaaRgacatcacaaaacigcggaamggctcgccRaRgcteatttgctctcgacg gatgctaRgaciggaagaRRggccgatatgaaaatgaccgaagaggaeaeaacttcTtctggcagaatetatanaaaUtataRtaatgaacRgtg gaggcgatgggaaiggRaaacRcancgagagttacigatccgtgagtttcctagagagagRgRttcgtancaatRtccctattRcagaactttggct cangctttgttggaRaRcecacgaaetaateegaaeagcgcacgattttcgatcaacRcttcacaatgattggattgggtggtttgacgRggaacnc glgaatggctggeaaagggtctcaagaagaagaagggaatgetggateagngaaggcegaatcaagcicagaRcatcgtegicncggancgtca gactcgtctgaRcRcggaRctgacgancatccgactcgtcncagattcctcatcHencagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaa
PL 216 779 B1
8aa8aaca8łgaagagagttccaaaaagaaggaaaaagagaauttggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaa gtglggagaacaaggacaaggatcgtcgacgtcgccaggattctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaa agałcgtcgtcgtcaagaclcggatgatgaggatcggaaBggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagaegtcgcggagatcgggatcgac gtgatcgaaacaaggatcaggaggaicaccgtgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgecgtcgtcatgactctg »tgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagtgaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcg«gaatm caaattttaaatactgaatattigtttttntcctattatttantattctctttgtgttttttttcttgctttctaaaaaattaattcaatccaaatctaaacatgagcggtt ttttttctctttccgtctcccaattcgtanccgctcctctcatctgaacacaatgtgcaagtttatttatcttctcgctttcaTttcattaggacgtggggggaatt ggtggaagggggaaacacacaaaaggatgatggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaa aagaaaacBtaaaaatatatagaggBggaaggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaatiaggcgaacgatgagaattgtcctcgcnggcaaatg cgaatccgtatggagaggcacgtnggcgaaggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctcttOaeaaaatrtt ccgattttcgcttgaaattacggtgccaggtctcgacacgtcttccaatttttcaaattcaaaagagccttuatgggctgtagflgctaatnctcgtttttga aaatttttcttccgtttaatcgaaatttgatgtannattUtgattttcaataaatttcaaagaaactgglgaaaactcggaaaattgtgaic&cagtaatcca atccttaaaggcgcacaccttttaaatgtccgęcccaatacgatatttttttaagattcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccct atagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggegttacccaacttaatcgcettgcagcacatccccc cttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcg gcgcattaagcgcggcgggtgrggtggaacgcgcłgcgtgaccgctacacngccagcgccctagcgcccgctcctttcgetttcttcccttcctttct cgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctcectttagggticcgatttagtgctttacggcacctegaccccaaaaaacttgat tagggtgatggttcacgtagtgggccatcgecctgatagacggKtttcgccctttgacgttggagtccacgttctnaatagiggactcngttccaaact ggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatnaacaaaaatttaa cgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaanteaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgmattRtetaaatacattcaaaUt gtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaattatactga&aaaggaagagtatgagttttcaacatttccgtgtcgeccttattcccttttttg cggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgga tctcaacagcggtaagatcctjgagagttttcgccccgaagaacgttnccaatgatgagcacttttaaagttctgctalgtggcgcggtanatcccgtatt gacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctoagaatgacttggxtgagta«caccagtcacagaaaagcatcttacggatggcat gacagtaagagaattatgcagtgctgccataagcatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaacc gcttnntcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataceaaacgacgagcgtgacaccacgat gcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaaetacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggau aagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcag cactggggccagatggtaagcectccegtatcgtagttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaaagacagatcgctgagat aggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttnaatttaaaaggatcuggtgaa gatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagnttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagBtcaaaggaicttcttgagaicc tttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccageggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaaetctttttccgaaggt aactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgttgccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacct cgctctgctaatcctgtuccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggauaggcgcagc ggtcgggctgaacggggggticgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagaucctacagcgtgagcattgagaaag cgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtoggaacaggagagcgcacgagggagcticcagggggg aacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacetctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgteaggggggccgagectatggaaaaacg ccagcaacgcggccttttucggttcctggccttngctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggaUaecgtaitaccgcct ttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagigagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgc clctccccgcgcgrtggccgattcanaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagna cctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaamcacacaggaaacagctatg accatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagt ggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaattgagctttttgggtcgaaaaaaatgtttttagaatgctgagaacacgttaaacacgaag atcatatttatttigagacccggatgctctgaaaatgtclgacatagatttaaaaaagcatatatatatttttcattttcaacgtgaaagttttgtgcaactttsta gaatctcctattggcacattgttttratttaactgaggcagntngaacacctttttgaaactttgaatctctngaagtatactgtcgaaaagactgacRga gcgttcgaaatgccagaagaaaacutaittgaBtctcgcgctaaangagaaatgcaaccgcgciccactggacaattggaaaaaaaaRUttęgga ggcgacaacggtattttcgaaartgattttctgtglattttctcattttttataaattcttctngatttatcgttcgrttgtgagaaatnaangtancaaacmm ataguagata
PL 216 779 B1
Nr Id. Sekw. 11 pGN207;
ccggiggtaccgctagccgtacgaacccgggnctagaacugtggalcccacttgagaKaaeaigateagaatcccaatcagRggctctggacga cctggictatctggacgatcaaalggattmagccaaaatatcggtttcagtttccaatggatcaguggtccttcgctgttgacagccngacacggaa eRgtaatgatcttccttgttgagtgaatcgaclgtgaagtgggtaKtecactacgtecacatggaacecagattccgKcttggtgneitcttncaatR catagaactcaattggctctcclccgtcatcctetggiggt«ccagieaagagngcacgaicncgaagacateagtuccicgattggtccetnggttt cgRggcRgcnniaccngaURgaagigacactgtcagttccaaaatgRggngcagtgatggtttattRecactttgctłacgaagtgccRtggca aagcaaatctcgagatgta(ggctcartttcaatttgagccngctctctccgattccttttceattgaatgaccatgnacatctggtgctggctcaccatca atatgaaeaatgaaengagagłggttccgaccRgacagRgUttagaaagatctKacgaigaaRcttggagcaaggtttcRggcttcgcaacaac acgatcagaaggatcagaaggatctecagttccagcengnaegagcagaaattctgaaRgataticnctccctccttaagatttggaacagttgcigt tttctgatctcetggaacaacgagagcRcttcccatcgtccattcttatccncttncaatgacgiaagettategataccgtcgacctcgagggggggc cctcgtcgagtcggteacaaKacctgaaactccaaaggcagęeagtgaggaacgigaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggtttgattttct ttctggteaaaaagatgaaattattgattttcagccagatactcceaaaactagcagcgagaagtctgeaagtcgttcacagtcgc«sgagaatcgcg ggaagtgagccaagagguigmncaaaaatcaaiaacigatcataatmtattgmggtgaainaagaaaaaaancgaaaattc«ctgaattatc aagattgcagtattaatttcgagaaaaattgagatattcatagagcttttglaaattttcttgattteagactgaaacttcggaaaateaagagaaaatcaaa gaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttcaccagctccaaaaaggtccaaggagaccaggl
RgtcaaaagcttccłgcganaanctcatttcaaRtttcagagaaicagagtctcctgaaaaatGCCcggttcgitcaagatctcccagaaggicttcag eacgaceccgtcacgałcKcagacggcgccgagaaagaagcKagaaagBaagcaattcgaagagceagcaccgcaceagegaaaaagaa gaaagagccgctggauncaegaacaagaaetggaggagcaaattccacccgccaaaenegacnatgcaacaacagataglgataagcaa agtgaacagatcagagaa(gaangggaaagaatgaagaaaaagattcacgganggttaacagagtcaacgcgaagaatcRgttcaaangtcag agaacttctteaagagaatgtgattcgttcaaagigagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaartaattaatt«teaggEgacttctctgccg1gac atuttciagcteaggcRKttaeeaggattctcaacgtctatgcagcmggcggeagttateaaetcgaaattccctcatgKggtgaacttcttctcc gtcgKtgatigUcagttcaaaagaagtttecgtagaaatgaeagaggegtcacggtgaacgtgatcaaattcatcgcaeatttganaatcaaeaagtT gctcacgaagttcttgegetggaaateatgattctgaJgcttgaagaaceaacigatgattcagttgaagtcgccattgcgttectgaaagaglgtggag eaaagcttetggagattgctecagcagcIcKaacagtgtcucgaccgtcttcgigcaattcteaiggaaictgaaagatcggaaaatgcactggatcg aegatteaguutgaitgagactgeaatgcagattcgaaaggac3aatTtgcggaaggugaauaiaaategttattagaaaaaaaaaaitaga aaatttaaaflęcucagccaattaggcgacctttttgcgcaagRcatangaaaaatttggagaatttctcauncKgcteggaaatctggaaRC gacgagatcttctggcRctgtgcagetgcategcRtgtgctccctttctcgcRgtcnetglgacaeeaagaaccRgRgigRcaicaactgaaletgt gactggcRgRgctcactggatgcaettgacgactgaflctcgagaaateagangagHgcgaRagggtgacctagaaaRgggaataaiaegaact (ttgaaaaaticaggaggataaaMaaRaRctcgacaatccUeaaattucnaRgcaccatgttgctccaacatttRcaRaaaagRaatgaaaaa atgUgaaa3łcggaaanggcaanRCBgaccaRnaagcaRttcaaaaaaaaangcagctgMauaatgtcattncagaUaategagcgattR cigRgKtgacactagttttttgttRaaaaaatgRggaagaacatggtgcaaUggtaatRcalagaaRtccatgtgttRRRcaattaaeeaanatcc aaatcnccaaacicacattngcggagetgggcutcaagaatctgctgcagttflatiagacgagcatctctgatatcacigaaaaflaantflaatcaa aacttgaaaieaacaaaceeacRataacnt«ęgatcRctgtcgttcggUegaigacggigaagaagecaaRgagUgRgatnggncaagtc ctRcggtgRgoegteagtgtcctgcaaigctatRagHaUacRaggecUagattcaanuatgaagtgaflaaatngRctctgaaecteRaagat gitcRttggaRagaaacaUUagacaggntaccttKtaRaaaaaacagatcaaaatagaacgaeeaaatcggaualccatgccUcctggcat caggaacgtgttctagaagitR«ucgUatcgatgaagaaataacaatttgatcgKggcc3geaaaaaUgggtnuagtgggaugigtRflai
UgcaaccggsaaaRttaagRRnntgcaagaaaccactgaaaacccccaanguucaRttnggagcagcRctgg<cRiRgagcaaaaaa( ttgauaaacagaatRaagigaaangncacatttagCrtcUflttatcaaattngRgcttaaaaacanigaagctgctcaaaaaaatgeattaaaaa aggggtRtcagtggntncacaRaaaaaageuaRttaactaaaaatccatcaamccaaetngteaeaacaaaaaatgctggtcaaaatgtgtteg aawałtgtRmtRHaaRRtaaatRaaiiaagttttctncgctgggacacaiaeaRtagggcgaaittRcagRcaaa«tocaRRtacaaccat aaKaaaagcUcgtctgBKtctcttgcacttaectgcgcctgaRegaaagaacaaccgtagccaaaagaacaag3agaacaagcacgtagngt ggtagtggacgRcateacgeaataetgaccaatggtcgtggggtctcacRKcgtactattgagagaggggagactgaagatggcaangaggaca gtgtcRegaeg«cgeatgeaKcauageaaat«aggagggatggagagaaaaatcRgtacUagcecctcccRigaaucaacacaatM aauccgaagaatggctaaflgsatggacgtcagctgttgctgUgttgccaBggcatcatcgaigaaaaactgaaagaaagaaRaaaUanaRgc aggcgtatecggeggtcangaagicRggacngaRgaggaggaggatcagatcatccaUcattaatttggiggiigcggRgatccggaaaatg ggcRagaagtgactgaccacacgcggggggeataattuaaaaRgaittccaRtcagatgtgttcaaacUgaKcagaattcgaaaagaacga ggaggnutgaggagatcsgaaggaaatcaRggaaacgccgataRtcggatgaggatggtggcgacgagRggaigatgaagaagagggag!
gatgiggaagaggciccgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaangaetgctneagaagguneanngagnngggccggcaa atttgtoagRgecggRgecgaaaamgetgaatngccggaaaaaaa3aRccggaatnattaaaaactttttgttaaaattaaanaaantgGaacR ncagagaagtctacctgacaatgcaatcatctRggactaccaagaagctgcteacaaaRgctgaaaatgaaganccagacagcatgcaggtcagc gatgngeaaagaaaaattRcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaaMccgRntRctIttRjnatacgagaaaaaccaaaaaa aigtanffigccaaaRctaaaauctaKcccgaaatttlcaalattncKtttcagaacgaacwtgcgcgatgcttgtcgaRgRgtgcKaacagcgta cetóegagcganetacggaaigctcategaacgtttctgccgaencgcctegaataecagcaatacmgaaaagcKigccaggaeaegtanccac gaRcacegaangacateacaaaactgcggaantggctcgeeRattgctcatttgGtetógacggiigctaRgactggaagattRggcegatatgaa aatgaccgaagaggacaeaaeRcnctggcagaatctataRaaatatatantaatgaacRgtggaggcgatgggaaiggRaaacncaRcgagag lUctgaKcgtgagtttcctagagagagngnttcgtaRcaatntccciaRttcagaacrtiggctciRgetttgttggaRattcecacgaactaaiwg aacagcgcaegaiRtegau:aicncncacaatganggattgggtggtngacgRggaacRcgigaaiggctggcaaagggtcKaagaagaagB agggaatgctggatcagngaaggccgaatcaagcłcagaRcatcgtcgtcRcggaRcgtcagactcgtctgancttcggaRctgacgattcatcc gactcgteRcagaRcctcaicRcncagaaicagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagtteeaaaaagaag
PL 216 779 B1 gaaaaagagaatartggicgacgggalęgtggagacaagagagctgaaegtcatcgtgatcaaagtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacg tcgccaggattctgaegaaaatcgicggccagaaegaggagaigaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagactcggatgitgagg atcggaaaggtcgtgaacgccgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgigaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtegteatgactctgatgatgatcguaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgRgaatntcaaattttaaatactgaautngttttttttcctatt atttatttattctctttgtgtmnttcngctttctaaaaaaRaaUcaatccaaatctaaacatgagcggttttttKctctttccgtctcccaaRCgtaitccgc( cctcicaKtgaacacaatgtgcaagtttantatcttctcgctttcatttcattaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacaeacaaaaggaig atggaaatgaaataaggacaeacaautgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaaaagaaaacataaaaatatatagaggiggaa ggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaattgtcctcgcttggcaaatgcgaaiccgtatggagaggcacgtttggcga aggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttta3gttgaaatttggtgttgetcttttacaaaattttecgattttcgcttgaaattacggtgceaggtct cgacacgtcttccaatttttcaaancaaaagagccttlaatgggctgtagttgctaatttctcgtttttgaaaatttttcttccgtnaatcgaaatttgatgtattt tatnatgattttcaataaatttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgigaactacagtaatccaatccttaaaggcgcacaccttttaaatgtccgc cccaatacgaiatttttnaagattcgctagagcggccgccaccgcggłggagctccaattcgccctatagtgagtcgtanacaancactggccgtegt tttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccccttcgccagcTggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgugcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggtttcgc gcagcgtgaccgctacacngccagcgccctagcgcccgctccrttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctticcccgtcaagctcta aatcgggggctaccittagggttcegatnagtgcntacggcacctcgaccccaaaaaaettgattagggigatggttcacgtagtgggccatcgccct gatagacggttracgccctttgacgttggagtccacgtlctttaatagtggactcttgttccaaactggaBcaacactcaaccctatctcggtctaRctttt gatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatatttacgtttacaatttca ggtggcacttncggggaaatgigcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgc ttcaataatattgaaaaaggaagagtttgagUttcaacamccglgtcgcccttattcccttmtgcggcattttgccncctgtttttgctcacccagaaac gctggtgaaagtaaaagatgclgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatetcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcc ccgaagaacgttttccaatgaigageacttttaaagttctgctotgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat acactattctcagaatgacnggngagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgetgccaiaag catgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaBggagctaaccgctttttttcacaacatgggggatcatgtaactcg ccttgatcgttgggaaccggagcigaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgiagcaatggcaacaacgttgcgcaaact attaactggcgaactacnacteugcncccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttcc ggctggctggtnangctgataaatciggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcatlgcagcBCtggggccagatggtaagccctcccgtatcgt agttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagategctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcag accaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaamaaaaggarctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaa cgtgagltttcgttccactgagcgicagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttnctgcgcgiaatctgctgcngcaaacaaaa aaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatoaagagctaccaactcttttrccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatact giccttctagtgtagccgugttflgg«aceaettcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgrtaccagtggctgctgccag tggcgataagtcgigtcttaccgggttggactcaagacgaUgttaceggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggrtcgtgcacacagcc eagcttggagegaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacagg tatccggtaagcggcagggteggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcetggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccac ctctgacttgagcgtcgatnngtgatgctcgtcaggggggccgagcciatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctrttgct ggccttttgctcacatgncntcctgcgtutcccctgattctgtggataaccgtattacegccmgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacga ccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgrtggccgattcattaatgcagctg gcacgacaggtncccgactggaaagcgggcBgtgagcgcaacgcaanaatgtgagttacctcactcanaggcaccccaggctttacacttutgci tccggctcct8tgngtgtggaangtgagcggatoacaantcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaaRaaccctcactaa agggaacaaaagctgggggggaicctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagtggaccrttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatga aattgagctttttgggtcgaaaaaaatgtttttagaatgctgagaacacgnaaacacgaagatcatatttattttgagacccggatgctctgaaaatgtctg acatagatttaaaaaagcafataaumttcattttcaacgtgaaagttttgtgcaacrttaugaatctcctattggcaeattgttttttatnaactgaggcag tttngaacaccttntgaaactttgaatcictttgaagtatactgtcgaaaagactgacttgagcgttcgaaatgccagaagaaaactatatngaatctcgc gctaaattgagaaatgcaaccgcgctecaetggacaanggaaaaaaaatnattcggaggcgacaacggtatmcgaaattgattttctgigtattrtct catmttataaattcttctttgamatcgttcgtttgtgagaaattuattgtattcaaacrntttatagtaagata

Claims (8)

1. Sposób wprowadzania dsRNA |ub DNA zdo|nego do produkcji dsRNA do organizmu niebędącego człowiekiem, znamienny tym, że karmi się ten organizm odpowiednim mikroorganizmem zawierającym dowolny spośród następujących wektorów ekspresyjnych od (a) do (h):
(a) wektor ekspresyjny zawierający promotor lub promotory w takiej orientacji wobec sekwencji DNA, że pozwalają one na inicjację transkrypcji sekwencji DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do promotora lub promotorów;
(b) wektor ekspresyjny określony w (a) zawierający dwa identyczne promotory flankujące sekwencję DNA;
(c) wektor ekspresyjny określony w (a) zawierający sekwencję DNA w orientacji sensownej i antysensownej względem promotora;
(d) wektor ekspresyjny określony w (a), (b) lub (c), który zawiera dodatkowo sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny;
(e) wektor ekspresyjny określony w (d), w którym sekwencja nuk|eotydowa kodująca marker selekcyjny jest zorientowana względem promotora lub promotorów w taki sposób, że transkrypcja sekwencji nuk|eotydowej do dwuniciowego RNA następuje po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do promotora lub promotorów;
(f) wektor ekspresyjny określony w (e), w którym sekwencja nuk|eotydowa kodująca marker se|ekcyjny jest umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotorów;
(g) wektor ekspresyjny określony w (e), w którym sekwencja nuk|eotydowa kodująca marker se|ekcyjny jest umieszczona w orientacji sensownej i antysensownej względem promotora, w taki sposób, że następuje transkrypcja sekwencji nukleotydowej do dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotora;
(h) wektor ekspresyjny określony w (d) |ub (e), w którym marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sup-35, do wprowadzania do C. elegans posiadającego mutację pha-1, a|bo karmienia tego organizmu bezpośrednio dowolnym wektorem ekspresyjnym od (a) do (h).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm lub organizm dostosowany do ekspresji czynnika transkrypcyjnego.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm albo organizm obejmujący dowolny spośród wektorów ekspresyjnych od (a) do (h) jak zdefiniowano w zastrz. 1, |ub dowolny spośród następujących wektorów ekspresyjnych od (i) do (k) :
(i) wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą odpowiedni czynnik transkrypcyjny do stosowania w sposobie określonym w jednym z poprzednich zastrz., operacyjnie związany z odpowiednimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję;
(j) wektor ekspresyjny określony w (i), w którym sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują promotory, które są indukowalne, konstytutywne, ogólne lub tkankowo-specyficzne, lub ich kombinację;
(k) wektor ekspresyjny określony w (i) a|bo (j), w którym czynnik transkrypcyjny obejmuje polimerazę fagową, a zwłaszcza polimerazę RNA T7.
4. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że jako organizm stosuje się C. elegans.
5. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że jako mikroorganizm stosuje się E. coli.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako szczep E. coli stosuje się szczep ujemny pod względem Rnazy III.
7. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że jako organizm stosuje się mutanta nuc-1 C. elegans.
8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako czynnik transkrypcyjny stosuje się polimerazę RNA T7.
PL390495A 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu PL216779B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9814536.0A GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-07-03 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GBGB9827152.1A GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1998-12-09 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL216779B1 true PL216779B1 (pl) 2014-05-30

Family

ID=26313977

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL390495A PL216779B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu
PL384205A PL213379B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym
PL347978A PL201425B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384205A PL213379B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym
PL347978A PL201425B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia

Country Status (27)

Country Link
US (3) US20030061626A1 (pl)
EP (5) EP1484415B1 (pl)
JP (3) JP4353639B2 (pl)
KR (4) KR20070041607A (pl)
CN (3) CN1198938C (pl)
AT (2) ATE433500T1 (pl)
AU (1) AU769223B2 (pl)
BR (1) BR9911802A (pl)
CA (2) CA2789083C (pl)
CY (2) CY1108920T1 (pl)
CZ (2) CZ303494B6 (pl)
DE (5) DE69940984D1 (pl)
DK (2) DK1484415T3 (pl)
ES (2) ES2320527T5 (pl)
GB (4) GB9827152D0 (pl)
HU (1) HU230602B1 (pl)
IL (3) IL140467A0 (pl)
IN (2) IN2001DE00006A (pl)
IS (1) IS2816B (pl)
MX (1) MX234065B (pl)
NO (1) NO327729B1 (pl)
NZ (1) NZ509182A (pl)
PL (3) PL216779B1 (pl)
PT (2) PT1197567E (pl)
RU (1) RU2240349C2 (pl)
WO (1) WO2000001846A2 (pl)
ZA (1) ZA200007653B (pl)

Families Citing this family (257)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CZ295108B6 (cs) * 1998-03-20 2005-05-18 Benitec Australia Ltd Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
CA2361201A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
BR0009884A (pt) * 1999-04-21 2002-01-08 American Home Prod Processos e composições para a inibição da função das sequências de polinucleotìdeos
US6924109B2 (en) * 1999-07-30 2005-08-02 Agy Therapeutics, Inc. High-throughput transcriptome and functional validation analysis
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
GB9930691D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
AU2001245793A1 (en) 2000-03-16 2001-09-24 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
EP1309726B2 (en) 2000-03-30 2018-10-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
GB2362383B (en) * 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
GB0012233D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Vector constructs
GB0012229D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Lipid uptake assays
US7083947B2 (en) 2000-05-19 2006-08-01 Devgen Nv Assay techniques using nematode worms
WO2001096584A2 (en) * 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
US20040259247A1 (en) 2000-12-01 2004-12-23 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
IL157087A0 (en) * 2001-01-25 2004-02-08 Virxsys Corp A method for identifying a function of a gene sequence
NZ526507A (en) 2001-01-26 2005-07-29 Commw Scient Ind Res Org Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
US20020132257A1 (en) 2001-01-31 2002-09-19 Tony Giordano Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
AU2002249170B2 (en) * 2001-02-02 2007-02-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V Method for identifying functional nucleic acids
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US7517864B2 (en) 2001-05-18 2009-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP2415486B1 (en) 2001-05-18 2017-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003070972A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003102131A2 (en) * 2002-04-22 2003-12-11 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
WO2003070884A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
JP4210737B2 (ja) 2001-07-12 2009-01-21 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 遺伝子サイレンシングを仲介する低分子干渉リボ核酸のインビボにおける製造方法
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
WO2003018808A1 (en) 2001-08-31 2003-03-06 Riken PLANT SYSTEM FOR COMPREHENSIVE GENE FUNCTION ANALYSIS WITH THE USE OF FULL-LENGTH cDNA
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
US20030150017A1 (en) * 2001-11-07 2003-08-07 Mesa Jose Ramon Botella Method for facilitating pathogen resistance
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
EP1572902B1 (en) * 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
JP4527984B2 (ja) 2002-02-01 2010-08-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 増強された効力を有するオリゴヌクレオチド組成物
EP1465910A4 (en) * 2002-02-20 2005-03-16 Sirna Therapeutics Inc INHIBITION OF GENE EXPRESSION OF CHECKPOINT KINASE-1 (CHK-1) IMPROVED BY RNA INTERFERENCE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS
EP1472265A4 (en) * 2002-02-20 2005-06-15 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE MEDIA INHIBITION OF THE EXPRESSION OF THE POLYCOMB GROUP EZH2 PROTEIN GENE USING A SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070966A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
AU2003207708A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
WO2003095652A2 (de) * 2002-05-08 2003-11-20 Xantos Biomedicine Ag EXPRESSIONSKONSTRUKTE ZUR HERSTELLUNG VON DOPPELSTRANG (ds) RNA UND DEREN ANWENDUNG
WO2003100094A2 (en) * 2002-05-23 2003-12-04 Devgen Nv Method for determining the influence of a compound on cholesterol transport
JP2005529624A (ja) * 2002-06-21 2005-10-06 シノゲノマックス カンパニー リミテッド ランダムｄｎａライブラリーと二本鎖ｒｎａライブラリー、その用途および生産方法
BR0312580A (pt) * 2002-07-10 2006-10-10 Univ Kansas State composições e métodos para controlar nematódeos parasitas
US7655790B2 (en) 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
PT1527176E (pt) 2002-08-05 2007-04-30 Atugen Ag Novas formas de muléculas de arn de interferência
AU2003261449A1 (en) 2002-08-07 2004-02-25 Compositions for rna interference and methods of use thereof
AU2003264727A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-29 Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Compositions and methods for tissue specific or inducible inhibition of gene expression
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2507189C (en) 2002-11-27 2018-06-12 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
EP1597361A2 (en) * 2002-12-23 2005-11-23 Devgen NV Kinase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases and nucleotide sequences encoding such kinase sequences
EP3222294A1 (en) 2003-04-30 2017-09-27 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
IL155783A (en) 2003-05-05 2010-11-30 Technion Res & Dev Foundation Multicellular systems of multi-potential embryonic human stem cells and cancer cells and their use
DK1633784T3 (da) 2003-05-09 2011-10-24 Diadexus Inc OVR110 antistofsammensætninger og -anvendelsesfremgangsmåder
JP2006527593A (ja) * 2003-06-17 2006-12-07 デヴゲン エヌブイ 代謝性疾患の予防及び／又は治療のための化合物を開発するために有用なアルコールデヒドロゲナーゼ配列
US9394565B2 (en) 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
ATE526407T1 (de) * 2003-11-17 2011-10-15 Commw Scient Ind Res Org Insektenresistenz durch inhibierung von genexpression
ES2394799T3 (es) 2003-12-31 2013-02-05 The Penn State Research Foundation Métodos para predecir y superar la resistencia a quimioterapia en cáncer de ovario
JP2007523649A (ja) 2004-02-10 2007-08-23 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）を用い、ＲＮＡ干渉を介した遺伝子発現の阻害
US20060019914A1 (en) 2004-02-11 2006-01-26 University Of Tennessee Research Foundation Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase DNAzymes
US7622301B2 (en) * 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
EP1727911B1 (en) 2004-03-26 2013-01-23 Sequenom, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
EP2394662B1 (en) 2004-04-02 2018-03-21 The Regents of The University of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alpha v beta 5 integrin
AU2005244258B2 (en) 2004-04-09 2010-07-01 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
AU2005238034A1 (en) 2004-04-23 2005-11-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of hairless protein mRNA
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
DE602005026811D1 (de) 2004-06-22 2011-04-21 Univ Illinois Verfahren zur inhibierung von tumorzellwachstum mit foxm1 sirns
US7968762B2 (en) 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
EP1782321A4 (en) 2004-07-23 2009-11-04 Univ North Carolina METHOD AND MATERIALS FOR DETERMINING PAIN SENSITIVITY AND PREDICTING AND TREATING SUFFERING INTERFERENCE
US20080255065A1 (en) 2004-08-18 2008-10-16 Genesense Technologies, Inc. Small Interfering Rna Molecules Against Ribonucleotide Reductase and Uses Thereof
PT1799028E (pt) 2004-09-24 2015-05-11 Simplot Co J R Silenciamento genético
US20060247197A1 (en) 2004-10-04 2006-11-02 Van De Craen Marc Method for down-regulating gene expression in fungi
MX2007004310A (es) 2004-10-13 2007-06-18 Univ Georgia Res Found Plantas transgenicas resistentes a nematodos.
CN101107362A (zh) 2004-10-21 2008-01-16 文甘扎公司 用于赋予对植物病害生物和植物病原体抗性的方法和材料
WO2006045591A2 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Devgen N.V. Method and constructs for delivering double stranded rna to pest organisms
CA2582550C (en) 2004-10-25 2019-06-25 Devgen Nv Rna constructs
DK1841793T3 (da) 2005-01-07 2010-07-19 Diadexus Inc Ovr110-antistofsammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
WO2006124699A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Blockade of pin1 prevents cytokine production by activated immune cells
US8759306B2 (en) 2005-05-31 2014-06-24 Devgen N.V. RNAi for the control of insects and arachnids
WO2007011702A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of egfr inhibitors to prevent or treat obesity
BRPI0615791B1 (pt) 2005-09-16 2018-04-03 Devgen Nv Rna de fita dupla isolado compreendendo fitas complementares aneladas, método de controle de infestação de peste e uso de uma ração artificial compreendendo a sequência de ribonucleotídeo de fita dupla para tratar infestação de plantas por insetos
AR055169A1 (es) 2005-09-16 2007-08-08 Monsanto Technology Llc Metodos para el control genetico de infestaciones de insectos en plantas y composiciones para los mismos
PT2270181E (pt) 2005-09-16 2016-01-26 Devgen Nv Arncd como agente de controlo de insetos
CA2620387C (en) 2005-09-20 2018-09-18 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-sirna
US9286469B2 (en) * 2005-12-16 2016-03-15 Cisco Technology, Inc. Methods and apparatus providing computer and network security utilizing probabilistic signature generation
EP1974041A2 (en) * 2006-01-06 2008-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cyst nematode resistant transgenic plants
CA2633576A1 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Devgen N.V. Dsrna as insect control agent
EP2374462A3 (en) 2006-01-12 2011-12-14 deVGen N.V. Methods for controlling pests using RNAi
US8906876B2 (en) 2006-01-12 2014-12-09 Devgen Nv Methods for controlling pests using RNAi
US20080022423A1 (en) * 2006-02-03 2008-01-24 Monsanto Technology Llc IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI
BRPI0707626A2 (pt) 2006-02-10 2011-05-10 Monsanto Technology Llc identificaÇço e uso de genes alvos para o controle de nematàides parasitas de plantas
CN101384721A (zh) 2006-02-13 2009-03-11 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
US20100068172A1 (en) * 2006-03-16 2010-03-18 Devgen N.V. Nematode Control
US8968702B2 (en) 2006-03-30 2015-03-03 Duke University Inhibition of HIF-1 activation for anti-tumor and anti-inflammatory responses
PL216037B1 (pl) * 2006-06-09 2014-02-28 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu
EP2471809B1 (en) 2006-07-11 2015-09-02 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Proteins, nucleic acids encoding the same and associated methods of use
JP5693004B2 (ja) 2006-07-28 2015-04-01 チルドレンズ メモリアル ホスピタル ヒト胚性幹細胞の微小環境を使用して腫瘍細胞の悪性度を抑制する方法
CA2670696A1 (en) 2006-11-27 2008-06-05 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
CN101195821A (zh) * 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
WO2008094370A2 (en) 2006-12-22 2008-08-07 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
AU2008207735B2 (en) 2007-01-26 2013-10-03 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
US20080184391A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Kuppuswamy Subramaniam Pathogen resistant transgenic plants, associated nucleic acids and techniques involving the same
AU2008218813B2 (en) * 2007-02-20 2014-04-17 Monsanto Technology, Llc Invertebrate microRNAs
PL2129680T3 (pl) 2007-03-21 2015-10-30 Brookhaven Science Ass Llc Łączone kompozycje cząsteczek antysensownych o strukturze spinki do włosów oraz sposoby modulacji ekspresji
EP2152903A2 (en) 2007-04-26 2010-02-17 Ludwig Institute for Cancer Research, Ltd. Methods for diagnosing and treating astrocytomas
WO2008137115A1 (en) 2007-05-03 2008-11-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
WO2009006450A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Boston Biomedical, Inc. Bacteria-mediated gene modulation via microrna machinery
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2009012263A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
WO2009021288A1 (en) 2007-08-14 2009-02-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved gene silencing methods
KR101142209B1 (ko) 2007-09-22 2012-05-04 재단법인서울대학교산학협력재단 섭취 ＲＮＡｉ를 이용한 꼬마선충에서 두 유전자의동시발현 억제방법
US7968525B1 (en) 2007-12-03 2011-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control
AU2009232355A1 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of EPAS1 inhibitors
BRPI0911173A2 (pt) 2008-04-10 2020-05-12 Monsanto Technolgoy Llc Método e composições para o controle de nematódeos das galhas
GB0807018D0 (en) 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
EP2727996A1 (en) 2008-11-06 2014-05-07 The Johns-Hopkins University Treatment of chronic inflammatory respiratory disorders with NP1 inhibitors
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
DK2379722T3 (da) 2008-12-16 2017-01-02 C-Lecta Gmbh Ekspressionsvektor
JP2012513464A (ja) 2008-12-23 2012-06-14 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク ホスホジエステラーゼ阻害剤及びその使用
WO2010074783A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
JP2012520685A (ja) 2009-03-19 2012-09-10 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
JP2012520686A (ja) 2009-03-19 2012-09-10 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたシグナル伝達性転写因子６（ＳＴＡＴ６）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
WO2010107952A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR (CTGF) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
CA2755773A1 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Rna interference mediated inhibition of btb and cnc homology 1, basic leucine zipper transcription factor 1 (bach 1) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
JP2012521764A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
JP2012521763A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたシグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
KR20110138223A (ko) 2009-03-27 2011-12-26 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 짧은 간섭 핵산 (ｓｉＮＡ)을 사용한 세포간 부착 분자 1 (ＩＣＡＭ-1) 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제
WO2010111464A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF APOPTOSIS SIGNAL-REGULATING KINASE 1 (ASK1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20120004281A1 (en) 2009-03-27 2012-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp RNA Interference Mediated Inhibition of the Nerve Growth Factor Beta Chain (NGFB) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US20100257634A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Venganza Inc. Bioassay for gene silencing constructs
US8283332B2 (en) 2009-04-17 2012-10-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PFKFB4 inhibitors and methods of using the same
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
EP3000481A3 (en) 2009-07-14 2016-05-11 Mayo Foundation for Medical Education and Research Peptide-mediated non-covalent delivery of active agent agents across the blood brain barrier
US10087252B2 (en) 2009-07-24 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with αvβ5 integrin
BR122018067960B8 (pt) 2009-08-28 2022-12-06 Du Pont Polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método para controlar uma praga de plantas do tipo coleoptera e método para obtenção de uma planta
WO2011071916A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 The Johns Hopkins University Sr-bi as a predictor of human female infertility and responsiveness to treatment
DK2509991T3 (en) 2009-12-09 2015-12-21 Nitto Denko Corp MODULATION OF HSP47 EXPRESSION
WO2011072243A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
US10640457B2 (en) 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
AU2010332881B2 (en) 2009-12-18 2015-01-22 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat HSF1-related diseases
SG10201407996PA (en) 2009-12-23 2015-01-29 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
WO2011094345A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 National Jewish Health Methods and compositions for risk prediction, diagnosis, prognosis, and treatment of pulmonary disorders
AU2011214465A1 (en) 2010-02-10 2012-08-30 Novartis Ag Methods and compounds for muscle growth
JP6033218B2 (ja) 2010-05-21 2016-11-30 ペプティメド， インコーポレイテッド がんを治療するための試薬および方法
GB201009601D0 (en) 2010-06-08 2010-07-21 Devgen Private Ltd Method for down-grading gene expression in fungi
WO2011163466A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (nrg-1)
CN107090456B (zh) 2010-08-02 2022-01-18 瑟纳治疗公司 使用短干扰核酸的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1基因表达的抑制
LT2606134T (lt) 2010-08-17 2019-07-25 Sirna Therapeutics, Inc. Hepatito b viruso (hbv) geno raiškos slopinimas, tarpininkaujant rnr interferencijai naudojant mažą interferuojančią nukleorūgštį (sina)
JP6106085B2 (ja) 2010-08-24 2017-03-29 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 内部非核酸スペーサーを含む一本鎖ＲＮＡｉ剤
US9233997B2 (en) 2010-08-26 2016-01-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of prolyl hydroxylase domain 2 (PHD2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
BR112013009196A2 (pt) 2010-10-15 2020-08-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York usos de polipeptídeo para redução da aquisição de ácido graxo e da ingestão de alimento, bem como para promoção de saciedade relacionados à obesidade
ES2663009T3 (es) 2010-10-29 2018-04-10 Sirna Therapeutics, Inc. Inhibición de la expresión génica mediada por interferencia por ARN utilizando ácidos nucleicos de interferencia cortos (ANic)
BR112013010911A2 (pt) 2010-11-01 2017-05-02 Peptimed Inc composições de um sistema à base de peptídeo para direcionamento para céllas específicas
HRP20191548T1 (hr) 2010-11-02 2020-02-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Postupci liječenja poremećaja gubitka kose
US9198911B2 (en) 2010-11-02 2015-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
US9150926B2 (en) 2010-12-06 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483
EP2649181B1 (en) 2010-12-06 2016-04-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
EP2654428B1 (en) 2010-12-22 2018-02-14 The Trustees of Columbia University in the City of New York Histone acetyltransferase modulators and usese thereof
KR101937498B1 (ko) 2011-03-03 2019-04-10 쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드 폐 질환 및 손상을 치료하기 위한 조성물 및 방법
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
EP3072555B1 (en) 2011-09-02 2020-03-25 The Trustees of Columbia University in the City of New York Mk2/3 inhibitors to treat metabolic disturbances of obesity
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
CA2850032C (en) 2011-10-14 2022-06-07 Genentech, Inc. Anti-htra1 antibodies and methods of use
WO2013059496A1 (en) 2011-10-18 2013-04-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Amine cationic lipids and uses thereof
AU2012332517B9 (en) 2011-11-03 2017-08-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
EP3459565A1 (en) 2012-03-29 2019-03-27 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for treating hair loss disorders
UY34752A (es) 2012-04-20 2013-11-29 Futuragene Israel Ltd Agentes para el control de la chinche del eucalipto
BR112014026363A2 (pt) 2012-04-23 2017-06-27 Futuragene Israel Ltd molécula de ácido ribonucleico, dsrna, vetor, célula hospedeira, tecido vegetal, ácido nucleico isolado, método de produção de planta resistente a pragas e método de inibição de infestação de pragas
EP3358013B1 (en) 2012-05-02 2020-06-24 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
US20150175979A1 (en) 2012-07-23 2015-06-25 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ptprs and proteoglycans in autoimmune disease
UY35064A (es) 2012-10-03 2014-04-30 Futuragene Israel Ltd Agentes para el control de la avispa de las agallas
WO2014058915A2 (en) 2012-10-08 2014-04-17 St. Jude Children's Research Hospital Therapies based on control of regulatory t cell stability and function via a neuropilin-1:semaphorin axis
US9920316B2 (en) 2013-03-14 2018-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP2968551B1 (en) 2013-03-15 2021-05-05 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fusion proteins and methods thereof
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
BR112015033053A2 (pt) 2013-07-03 2018-03-20 Hope City método de tratamento de câncer em um sujeito, método de estimulação do sistema imune em um sujeito, método de aumentar a distribuição de um agente anticâncer a uma célula tumoral, composição, e kit
US10584387B2 (en) 2013-10-09 2020-03-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Detection of hepatitis delta virus (HDV) for the diagnosis and treatment of Sjögren's syndrome and lymphoma
EP3068407A1 (en) 2013-11-11 2016-09-21 Sirna Therapeutics, Inc. Systemic delivery of myostatin short interfering nucleic acids (sina) conjugated to a lipophilic moiety
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
WO2015098113A1 (ja) 2013-12-27 2015-07-02 独立行政法人医薬基盤研究所 悪性腫瘍の治療薬
CN106794141B (zh) 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
WO2016059187A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Universite De Strasbourg Method of capturing and identifying novel rnas
WO2016077624A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
EP3778644A3 (en) 2014-12-23 2021-06-02 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fgfr-tacc fusion proteins and methods thereof
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
WO2016145003A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Rna nanoparticle for treatment of gastric cancer
WO2016145008A2 (en) 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Mirna for treatment of breast cancer
CN107531740B (zh) 2015-03-09 2021-03-19 肯塔基大学研究基金会 用于脑肿瘤治疗的rna纳米颗粒
US11279768B1 (en) 2015-04-03 2022-03-22 Precision Biologics, Inc. Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof
WO2016168784A2 (en) 2015-04-17 2016-10-20 University Of Kentucky Research Foundation Rna nanoparticles and method of use thereof
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
US10669528B2 (en) 2015-06-25 2020-06-02 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
US10072065B2 (en) 2015-08-24 2018-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of immunoglobulins across the blood-brain barrier
EP3702470A3 (en) 2015-09-09 2020-10-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
WO2017059118A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 Duke University Compositions and methods for identifying and treating dystonia disorders
RU2750285C2 (ru) 2015-10-30 2021-06-25 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ НtrА1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
BR112018008344A2 (pt) 2015-12-13 2018-10-30 Nitto Denko Corp molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica, vetor ou célula, método para prevenir, tratar ou melhorar uma doença, e, uso de uma composição
WO2017152073A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and compositions for ex vivo expansion of very small embryonic-like stem cells (vsels)
EP4049665B1 (en) 2016-03-15 2025-03-12 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
US10883108B2 (en) 2016-03-31 2021-01-05 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent
WO2018057575A1 (en) 2016-09-21 2018-03-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Myostatin irna compositions and methods of use thereof
CN107858405B (zh) * 2017-10-12 2021-09-24 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法
US20210162007A1 (en) 2018-04-09 2021-06-03 President And Fellows Of Harvard College Modulating nuclear receptors and methods of using same
CN109183158B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法
CN109266677B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法
JP2022501388A (ja) 2018-09-19 2022-01-06 ラホヤ インスティチュート フォー イミュノロジー 関節リウマチにおけるｐｔｐｒｓ及びプロテオグリカン
PT3880212T (pt) 2018-11-16 2024-02-08 Nitto Denko Corp Formulação e métodos de administração de rna de interferência para tumores malignos
US20220091135A1 (en) * 2019-01-04 2022-03-24 Kyoto University Test method for ulcerative colitis and primary sclerosing cholangitis
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
CN110229839B (zh) * 2019-06-04 2021-06-08 中国农业大学 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法
CN110746497A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 维塔恩(广州)医药有限公司 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
CN110804088A (zh) * 2019-11-18 2020-02-18 维塔恩(广州)医药有限公司 巨细胞病毒相关抗原短肽及其应用
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
WO2021123920A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
AU2020410514A1 (en) 2019-12-18 2022-06-30 Novartis Ag 3-(5-methoxy-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US12344665B2 (en) 2020-01-08 2025-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva by administration of an anti-activin a antibody
WO2021150300A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Massachusetts Institute Of Technology Inducible tissue constructs and uses thereof
WO2021173965A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Identification of variable influenza residues and uses thereof
CN111560651B (zh) * 2020-05-22 2021-09-07 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种制备双链rna测序文库的方法
TW202241479A (zh) 2020-12-30 2022-11-01 美商安迅生物製藥公司 遞送外來抗原之溶瘤病毒及表現靶向外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞之組合療法
US20250127809A1 (en) 2021-06-23 2025-04-24 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP4381069A1 (en) 2021-08-02 2024-06-12 Universite De Montpellier Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22
CN113533007B (zh) * 2021-08-06 2023-11-24 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 一种抗体染色标记装置及其方法
EP4416292A2 (en) 2021-10-14 2024-08-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems
AU2023343318A1 (en) 2022-09-13 2025-04-10 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
AU2023342285A1 (en) 2022-09-16 2025-03-27 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations
US12257304B2 (en) 2023-03-03 2025-03-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting PSMA and CA9
WO2025199338A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting slc34a2 and tmprss4 and methods of use thereof

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589801A (en) * 1897-09-07 woltereck
ATE202139T1 (de) 1985-03-21 2001-06-15 Johnston Stephen Ph D Von parasit gewonnener widerstand
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5017488A (en) * 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
US4970168A (en) * 1989-01-27 1990-11-13 Monsanto Company Virus-resistant plants
JPH04507083A (ja) * 1989-05-19 1992-12-10 ヘム・リサーチ・インコーポレーテッド 規定された構造の短い治療用ｄｓＲＮＡ
HUT57265A (en) 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5837848A (en) * 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
WO1991015111A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 President And Fellows Of Harvard College A binary genetic system to control expression of a transgene in a transgenic animal
US5831011A (en) * 1990-07-27 1998-11-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins
US5459252A (en) * 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5859332A (en) 1992-03-20 1999-01-12 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Fungus-responsive chimaeric gene
DE4234131C2 (de) * 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
CA2088379A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 University Of British Columbia Biological systems incorporating stress-inducible genes and reporter constructs for environmental biomonitoring and toxicology
IL104830A (en) * 1993-02-23 2001-01-28 Yissum Res Dev Co A chimeric plasmid containing a non-structural gene for the protease of the potato virus and its various uses
DE4317845A1 (de) 1993-05-28 1994-12-01 Bayer Ag Desoxyribonukleinsäuren
US5482845A (en) * 1993-09-24 1996-01-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for construction of normalized cDNA libraries
WO1995034680A1 (en) * 1994-06-15 1995-12-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to identify tumor suppressor genes
US5691140A (en) * 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
GB9510944D0 (en) * 1995-05-31 1995-07-26 Bogaert Thierry Assays and processes for the identification of compounds which control cell behaviour,the compounds identified and their use in the control of cell behaviour
DE69610310T2 (de) * 1995-06-02 2001-03-15 M&E Biotech A/S, Horsholm Verfahren zur identifikation von biologisch aktiven peptiden und nukleinsäuren
US5679551A (en) * 1995-10-31 1997-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Unique double-stranded RNAS associated with the Trichomonas vaginalis virus
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
CA2262411C (en) * 1996-08-09 2012-01-10 Keygene N.V. Resistance against nematodes and/or aphids
CZ88199A3 (cs) * 1996-09-18 1999-08-11 Christian Jung Gen indukující odolnost proti nematodům (hlísticím)
AU4470697A (en) 1996-10-03 1998-04-24 Hajime Kato Method for hydrocarbon steam reforming
CA2271120A1 (en) 1996-12-18 1998-06-25 Anthony Jay Dias Compatibilized polymer blends formed using a multifunctional agent
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
DE69943389D1 (de) * 1998-04-08 2011-06-09 Commw Scient Ind Res Org Verfahren und mittel zum erhalt von veränderten phänotypen
AR020078A1 (es) * 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-09-02 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
AR055169A1 (es) 2005-09-16 2007-08-08 Monsanto Technology Llc Metodos para el control genetico de infestaciones de insectos en plantas y composiciones para los mismos

Also Published As

Publication number Publication date
EP2045336A3 (en) 2009-06-10
GB9827152D0 (en) 1999-02-03
IS5802A (is) 2001-01-02
EP1197567B1 (en) 2008-12-31
CN1198938C (zh) 2005-04-27
CN1657620A (zh) 2005-08-24
AU769223B2 (en) 2004-01-22
HUP0103571A3 (en) 2006-01-30
PL213379B1 (pl) 2013-02-28
CZ303494B6 (cs) 2012-10-24
EP1484415A2 (en) 2004-12-08
MXPA00012955A (es) 2002-04-10
US20040187170A1 (en) 2004-09-23
NO20010019D0 (no) 2001-01-02
US20030061626A1 (en) 2003-03-27
DK1484415T3 (da) 2009-10-12
CY1109324T1 (el) 2014-07-02
HK1029142A1 (en) 2001-03-23
DK1197567T3 (da) 2009-05-04
JP2014058514A (ja) 2014-04-03
NZ509182A (en) 2004-01-30
ES2320527T5 (es) 2015-11-16
US20040133943A1 (en) 2004-07-08
HU230602B1 (hu) 2017-02-28
GB2370275B (en) 2002-11-27
BR9911802A (pt) 2002-01-22
DE69940984D1 (de) 2009-07-23
DE69940219D1 (de) 2009-02-12
IN2006DE03568A (pl) 2007-08-31
ES2320527T3 (es) 2009-05-25
IL140467A0 (en) 2002-02-10
ATE433500T1 (de) 2009-06-15
CN1900319A (zh) 2007-01-24
IL181727A0 (en) 2007-07-04
KR20040066200A (ko) 2004-07-23
EP1484415A3 (en) 2008-02-13
GB2362885A (en) 2001-12-05
EP2045336A2 (en) 2009-04-08
WO2000001846A2 (en) 2000-01-13
CA2789083A1 (en) 2000-01-13
DE29924298U1 (de) 2002-09-12
PL347978A1 (en) 2002-05-06
AU4907999A (en) 2000-01-24
HUP0103571A2 (hu) 2002-01-28
EP1197567A3 (en) 2003-01-02
EP1093526A2 (en) 2001-04-25
KR20070041607A (ko) 2007-04-18
EP1197567A2 (en) 2002-04-17
DE29924299U1 (de) 2002-09-12
NO20010019L (no) 2001-03-05
IL181727A (en) 2015-08-31
IN2001DE00006A (pl) 2007-02-09
WO2000001846A3 (en) 2000-06-15
JP4353639B2 (ja) 2009-10-28
IL140467A (en) 2007-07-04
EP1484415B1 (en) 2009-06-10
JP2002519072A (ja) 2002-07-02
CY1108920T1 (el) 2014-07-02
GB2349885B (en) 2003-01-29
GB0118514D0 (en) 2001-09-19
ES2327334T3 (es) 2009-10-28
CA2332619A1 (en) 2000-01-13
RU2240349C2 (ru) 2004-11-20
DE1093526T1 (de) 2001-10-11
US8114980B2 (en) 2012-02-14
KR20060071438A (ko) 2006-06-26
ATE419383T1 (de) 2009-01-15
KR100563295B1 (ko) 2006-03-27
EP2374901A1 (en) 2011-10-12
CN1323354A (zh) 2001-11-21
GB0020485D0 (en) 2000-10-11
GB2362885B (en) 2002-07-31
ZA200007653B (en) 2002-09-19
GB2370275A (en) 2002-06-26
EP1197567B2 (en) 2015-10-07
CA2332619C (en) 2012-12-11
PT1484415E (pt) 2009-07-27
IS2816B (is) 2012-11-15
CA2789083C (en) 2016-03-15
MX234065B (es) 2006-02-01
PT1197567E (pt) 2009-04-09
KR20010074639A (ko) 2001-08-04
PL201425B1 (pl) 2009-04-30
CZ200114A3 (en) 2001-06-13
CZ304897B6 (cs) 2015-01-07
GB0206600D0 (en) 2002-05-01
JP5847776B2 (ja) 2016-01-27
GB2349885A (en) 2000-11-15
NO327729B1 (no) 2009-09-14
JP2009112311A (ja) 2009-05-28
DK1197567T4 (en) 2015-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL216779B1 (pl) Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu
Ryder et al. Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila
JP2024038096A (ja) ＶＩ－Ｅ型及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム並びにそれらの使用
Johnson et al. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome
US7005423B1 (en) Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition
WO1998020031A1 (en) Method for producing tagged genes, transcripts and proteins
AU2004200852B2 (en) Characterisation of gene function using double stranded RNA inhibition
Hongbao Brookdale University Hospital and Medical Center, Brooklyn, New York 11212, USA ma8080@ gmail. com
Geurts Sleeping Beauty transposon system-based applications for mouse germline mutagenesis