JP6033218B2 - がんを治療するための試薬および方法 - Google Patents
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Description
本願は、2010年5月21日に出願された米国仮特許出願第61/347,104号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
1.発明の分野
本発明は、がんならびにがんを治療するための試薬および方法に関する。本発明は、概して、腫瘍細胞成長を阻害する試薬および方法に関し、前記試薬および方法を、それ自体で、ならびに従来の抗がん薬治療を補助する、または補完する実施形態において提供する。本発明は、具体的には、特に、短鎖干渉RNA(siRNA)の実施形態で腫瘍細胞成長を阻害する、一本鎖および二本鎖形式の単離リボ核酸オリゴヌクレオチドならびにその医薬組成物を提供する。細胞成長を阻害するために前記試薬を使用するための方法もまた提供される。
腫瘍細胞成長には、多数の遺伝子の発現、特に、その発現の調節不全が関与していることが公知である。調節不全を有するいくつかの遺伝子とは、発生の際には正常に発現されるが、腫瘍細胞では不適切に発現され、制御されない成長、侵襲性およびがんのその他の表現型的特徴の一因となる遺伝子である。
本発明は、腫瘍細胞成長を阻害するために、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するために、そうでなければ、単独または従来の抗がん剤とともに使用される改善されたがん治療のための方法を提供するために、EVI1発現または活性または両方を阻害するための試薬および方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
腫瘍細胞においてヒトEVIIの発現を低減できる、単離オリゴリボヌクレオチドおよびその薬学的に許容される塩であって、該単離オリゴリボヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド配列の連続部分である配列を有し、ここで、配列番号1の該ヌクレオチド配列の該連続部分が、ヌクレオチド246から266、ヌクレオチド969から1002、ヌクレオチド2900から2920またはヌクレオチド2984から3004である、単離オリゴリボヌクレオチドおよびその薬学的に許容される塩。
(項目2)
19〜21個のリボヌクレオチド残基を含む、一本鎖である項目1に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目3)
19〜21個のリボヌクレオチド残基を含む、二本鎖である単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目4)
配列番号1のヌクレオチド246から266によって同定される、項目1に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目5)
配列番号17から56によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目4に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目6)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号17および18、配列番号19および20、配列番号21および22、配列番号23および24、配列番号25および26、配列番号27および28、配列番号29および30、配列番号31および32、配列番号33および34、配列番号35および36、配列番号37および38、配列番号39および40、配列番号41および42、配列番号43および44、配列番号45および46、配列番号47および48、配列番号49および50、配列番号51および52、配列番号53および54、または配列番号55および56の組合せを含む、項目4に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのshRNA種もしくはsiRNA種。
(項目7)
配列番号1のヌクレオチド969から989またはヌクレオチド892から1002によって同定される、項目1に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目8)
配列番号57から120によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目7に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目9)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号57および58、配列番号59および60、配列番号61および62、配列番号63および64、配列番号65および66、配列番号67および68、配列番号69および70、配列番号71および72、配列番号73および74、配列番号75および76、配列番号77および78、配列番号79および80、配列番号81および82、配列番号83および84、配列番号85および86、配列番号87および88、配列番号89および90、配列番号91および92、配列番号93および94、配列番号95および96、配列番号97および98、配列番号99および100、配列番号101および102、配列番号103および104、配列番号105および106、配列番号107および108、配列番号109および110、配列番号111および112、配列番号113および114、配列番号115および116、配列番号117および118、または配列番号119および120の組合せを含む、項目8に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのshRNA種もしくはsiRNA種。
(項目10)
配列番号1のヌクレオチド2900から2920によって同定される、項目1に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目11)
配列番号121から160によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目10に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目12)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号121および122、配列番号123および124、配列番号125および126、配列番号127および128、配列番号129および130、配列番号131および132、配列番号133および134、配列番号135および136、配列番号137および138、配列番号139および140、配列番号141および142、配列番号143および144、配列番号145および146、配列番号147および148、配列番号149および150、配列番号151および152、配列番号153および154、配列番号155および156、配列番号157および158、または配列番号159および160の組合せを含む、項目11に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのshRNA種もしくはsiRNA種。
(項目13)
配列番号1のヌクレオチド2984から3004によって同定される、項目1に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目14)
配列番号161から200によって同定されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目13に記載の単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目15)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号161および162、配列番号163および164、配列番号165および166、配列番号167および168、配列番号169および170、配列番号171および172、配列番号173および174、配列番号175および176、配列番号177および178、配列番号179および180、配列番号181および182、配列番号183および184、配列番号185および186、配列番号187および188、配列番号189および190、配列番号191および192、配列番号193および194、配列番号195および196、配列番号197および198、または配列番号199および200の組合せを含む、項目14に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのshRNA種もしくはsiRNA種。
(項目16)
配列番号2、3、4、5または6によって同定されるヌクレオチド配列を含む単離オリゴリボヌクレオチド。
(項目17)
前記オリゴリボヌクレオチドが、配列番号7および8、配列番号9および10、配列番号11および12、配列番号13および14または配列番号15および16の組合せを含む、項目16に記載の二本鎖オリゴリボヌクレオチド、またはそのshRNA種もしくはsiRNA種。
(項目18)
項目1に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む医薬組成物。
(項目19)
項目16に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む医薬組成物。
(項目20)
腫瘍細胞を、有効量の項目1に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと接触させるステップを含む、腫瘍細胞成長を阻害する方法。
(項目21)
腫瘍細胞を、有効量の項目16に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと接触させるステップを含む、腫瘍細胞成長を阻害する方法。
(項目22)
腫瘍細胞を、有効量の項目18に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
(項目23)
腫瘍細胞を、有効量の項目19に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
(項目24)
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の悪性腫瘍、あるいは黒色腫または急性骨髄性白血病である、項目23に記載の方法。
(項目25)
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、項目18に記載の医薬組成物。
(項目26)
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、項目19に記載の医薬組成物。
(項目27)
腫瘍細胞を、有効量の項目25に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
(項目28)
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の悪性腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、項目27に記載の方法。
(項目29)
腫瘍細胞を、有効量の項目26に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法。
(項目30)
前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の悪性腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、項目29に記載の方法。
(項目31)
リポソーム中に被包された、項目18、19、25または26に記載の医薬組成物。
(項目32)
前記リポソームが、PEG化されている、項目31に記載の医薬組成物。
(項目33)
前記リポソームが、細胞ターゲッティング部分を含む、項目31に記載の医薬組成物。
(項目34)
前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、項目33に記載の医薬組成物。
(項目35)
ナノ粒子を含む、項目18、19、25または26に記載の医薬組成物。
(項目36)
前記ナノ粒子が、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマーまたはリン酸カルシウムポリマーまたはその組合せを含む、項目35に記載の医薬組成物。
(項目37)
前記ナノ粒子が、PEG化されている、項目35に記載の医薬組成物。
(項目38)
前記ナノ粒子が、細胞ターゲッティング部分を含む、項目35に記載の医薬組成物。
(項目39)
前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、項目38に記載の医薬組成物。
(項目40)
項目1から17のいずれかに記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
(項目41)
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、項目40に記載の医薬組成物。
オリゴヌクレオチド合成および酵素反応には、当業者に周知の従来技術を使用し、精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野でよく遂行されるように、または本明細書に記載されるように実施した。技術および手順は、概して、当技術分野で周知の従来の方法に従って、また本明細書を通じて列挙され、論じられた種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献に記載されるように実施した。例えば、任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら、2001年、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.参照のこと。特別の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分子生物学、遺伝子工学、分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される術後体系ならびにそれらの実験室手順および技術は、当技術分野で周知であり、日常的なものである。化学合成、化学分析および患者の治療には、標準技術が使用され得る。
本発明は、単離ポリヌクレオチド、特に、ヒトEVI1の一部をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書において、用語「単離ポリヌクレオチド」とは、ゲノム、cDNAまたは合成由来のポリヌクレオチドまたはその組合せを意味し、その供給源によって、「単離ポリヌクレオチド」は、(1)「単離ポリヌクレオチド」が天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合されず、(2)天然に連結していないポリヌクレオチドに連結され、または(3)長い配列の一部として天然に生じない。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイ:
PCRアッセイは、本明細書に記載されたsiRNA試薬の存在下でEVI1遺伝子発現の変化を検出するよう実施される。これらのアッセイのために、使用されるPCR反応条件は、60秒間95℃の融解温度;30秒間95℃、30秒間60℃および30秒間72℃で25〜30サイクルの熱サイクリングおよび60秒間72℃の伸長である。
本発明の好ましい実施形態では、EVI1阻害剤は、21bpの低分子干渉RNA(siRNA)である。EVI1発現をサイレンシングできる強力である可能性のあるsiRNAを同定するアルゴリズムを使用して、ヒトEVI1アイソフォームlb mRNAのコンピュータによる解析を実施した。siRNAが強力なEVI1下方制御因子を提供する、5種のコア標的配列が表1に示されている(配列番号2〜6)。これらの標的部位A(配列番号7〜8)、B(配列番号9〜10)、C(配列番号11〜12)、D(配列番号13〜14)およびE(配列番号15〜16)に対応するsiRNAが、表2に示されている。256コア(配列番号2)の周囲の着目された配列が表3に示されている(配列番号17〜56)。979コア(配列番号3)および992コア(配列番号4)の周囲の着目された配列が表4に示されている(配列番号57〜120)。2910コア(配列番号5)の周囲の着目された配列が表5に示されている(配列番号121〜160)。2994コア(配列番号6)の周囲の着目された配列が表6に示されている(配列番号161〜200)。
有効ながん治療薬である物質については、極めて低い濃度で頑強ながん死滅効果が必要であり、siRNAにとっては、細胞培養物中、ナノモル以下の濃度であると理解されよう。卵巣腫瘍細胞の成長を50%阻害したsiRNAの濃度(IC50)は、培養中の同数の腫瘍細胞に、種々の用量レベルのsiRNAのうち1種を添加した96時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。図6Aは、ES−2細胞についてのsiEVI1−979(配列番号9〜10)のIC50が、約2.5nMであり、siEVI1−2910(配列番号13〜14)のIC50が、約0.5nMであることを示す。TOV−112D細胞については、siEVI1−979(配列番号9〜10)のIC50は、約4nMであり、siEVI1−2910(配列番号13〜14)のIC50は、約0.8nMである。さらに同定するために、卵巣腫瘍細胞の成長を阻害する強力な配列、siEVI1−2910(配列番号121〜160)の最大10bp上流および10bp下流の配列を調製し、DharmaFECTトランスフェクション試薬を使用して、2.5nMの濃度で、ES−2およびTOV−112D卵巣腫瘍細胞に投与した。図7Aは、トランスフェクション対照に対するTOV−112D卵巣腫瘍細胞の成長阻害パーセントの結果を表す。siRNA配列(配列番号121〜124、127〜132、133〜136および137〜138)は、2.5nM以下の濃度で、TOV−112D卵巣腫瘍細胞の成長を阻害するとわかった。図7Bは、トランスフェクション対照に対するES−2卵巣腫瘍細胞の成長阻害パーセントの結果を表す。siRNA配列(配列番号121〜126、129〜130、133〜142、147〜148および151〜152)は、2.5nM以下の濃度でES−2卵巣腫瘍細胞の成長を阻害するとわかった。
EVI1の強力なsiRNA阻害剤は、腫瘍中への直接注射後に、マウスにおいて腫瘍の成長を低減させることができる。siRNAの効力を評価するために、300万個の卵巣転移性腫瘍細胞を雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を10日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された1nmolのsiRNAを各々含有する10マイクロリットルの最大5回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に2回、3週間注射する。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。強力なsiRNA種については、EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスにおける腫瘍は、スクランブルsiRNA配列を投薬されたものの平均して約10%の大きさの腫瘍を有すると思われる。これらの結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力の実証を提供する。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、例えば、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減すると思われる。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
本発明の試薬の有効な実施形態については、siRNAは、ナノモル以下の濃度での腫瘍中への直接注射後に、マウスにおいて腫瘍の成長を低減させる。siRNAの効力を評価するために、300万個の卵巣転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を21日間成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された100マイクロリットルの量の1nmol siRNAを、マウス尾静脈中に、週に2回、3週間注射する。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。強力なsiRNA種については、EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスから得た腫瘍は、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得たものの平均して約10%の大きさの腫瘍を有すると思われる。これらの結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力の実証を提供する。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、例えば、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減すると思われる。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
本明細書に示されるように、低分子干渉RNA(siRNA)は、EVI1発現をサイレンシングできる強力である可能性のあるsiRNAを同定するアルゴリズムを使用して実施されるヒトEVI1アイソフォームlb mRNAのコンピュータによる解析から提供される。siRNAが強力なEVI1下方制御因子を提供する、5種のコア標的配列が表1に示されている(配列番号2〜6)。これらの標的部位A(配列番号7〜8)、B(配列番号9〜10)、C(配列番号11〜12)、D(配列番号13〜14)およびE(配列番号15〜16)に対応するsiRNAが、表2に示されている。256コア(配列番号2)の周囲の着目された配列が表3に示されている(配列番号17〜56)。979コア(配列番号3)および992コア(配列番号4)の周囲の着目された配列が表4に示されている(配列番号57〜120)。2910コア(配列番号5)の周囲の着目された配列が表5に示されている(配列番号121〜160)。2994コア(配列番号6)の周囲の着目された配列が表6に示されている(配列番号161〜200)。
有効ながん治療薬である物質については、極めて低い濃度で頑強ながん死滅効果が必要であり、siRNAにとっては、細胞培養物中、ナノモル以下の濃度であると理解されよう。前立腺腫瘍細胞の成長を50%阻害したsiRNAの濃度(IC50)は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のsiRNAを添加した96時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。
表2中に示される5種のsiRNA二本鎖の各々を、50nMの濃度で乳房腫瘍細胞の培養物中に入れた。試験された乳房腫瘍細胞の特性が表11に示されている。手短には、5万〜10万個の腫瘍細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地中で18時間成長させた。2mlの総容量の培地中、1マイクロリットルのDharmaFECT試薬を使用して、合計200ピコモルの各siRNAを細胞に入れた。細胞をsiRNAとともに96時間インキュベートした。トリパンブルー排出後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって乳房腫瘍細胞の生存力を評価した。結果が表12に示されている。5種の配列の各々が、少なくとも1種の卵巣腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも40%低減させた(対照siRNA処理細胞と比較して)。
乳房腫瘍細胞の成長を50%阻害したsiRNAの濃度(IC50)は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のsiRNAを添加した96時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。
本発明の試薬の有効な実施形態については、siRNAは、ナノモル以下の濃度での腫瘍中への直接注射後に、マウスにおいて腫瘍の成長を低減させる。siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の前立腺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を10日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された1nmolのsiRNAを各々含有する10マイクロリットルの最大5回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に2回、3週間注射した。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスにおける腫瘍は、スクランブルsiRNA配列を投薬されたものの平均して約10%の大きさの腫瘍を有していた。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証する。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減した。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少した。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の前立腺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を21日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された100マイクロリットルの量の1nmol siRNAを、マウス尾静脈中に、週に2回、3週間注射した。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得たものの約10%の大きさであった。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。これらの腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロット分析によって明らかなように、70%超低減した。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少した。
表2中に示される5種のsiRNA二本鎖の各々を、50nMの濃度で肺腫瘍細胞の培養物中に入れる。試験された肺巣腫瘍細胞の特性が表13に示されている。手短には、5万〜10万個の腫瘍細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地中で18時間成長させた。2mlの総容量の培地中、1マイクロリットルのDharmaFECT試薬を使用して、合計200ピコモルの各siRNAを細胞に入れる。細胞をsiRNAとともに96時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって肺腫瘍細胞生存力を評価する。5種の配列の各々が、少なくとも1種の卵巣腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも40%低減させる(対照siRNA処理細胞と比較して)と思われる。
肺腫瘍細胞の成長を50%阻害したsiRNAの濃度(IC50)は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のsiRNAを添加した96時間後に細胞生存力を測定することによって決定する。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の肺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を10日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された1nmolのsiRNAを各々含有する10マイクロリットルの最大5回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に2回、3週間注射した。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスの約10%の大きさであった。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減した。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少した。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の肺転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を21日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された100マイクロリットルの量の1nmol siRNAを、マウス尾静脈中に、週に2回、3週間注射した。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得たものの約10%の大きさであった。これらの結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。これらの腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減した。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少した。
表2中に示される5種のsiRNA二本鎖の各々を、50nMの濃度で結腸腫瘍細胞の培養物中に入れる。試験された結腸腫瘍細胞の特性が表14に示されている。手短には、5万〜10万個の腫瘍細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地中で18時間成長させた。2mlの総容量の培地中、1マイクロリットルのDharmaFECT試薬を使用して、合計200ピコモルの各siRNAを細胞に入れる。細胞をsiRNAとともに96時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって結腸腫瘍細胞生存力を評価する。5種の配列の各々が、少なくとも1種の卵巣腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも40%低減させる(対照siRNA処理細胞と比較して)と思われる。
有効ながん治療薬である物質については、極めて低い濃度で頑強ながん死滅効果が必要であり、siRNAにとっては、細胞培養物中、ナノモル以下の濃度であると理解されよう。結腸腫瘍細胞の成長を50%阻害したsiRNAの濃度(IC50)は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のsiRNAを添加した96時間後に細胞生存力を測定することによって決定した。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の結腸転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を10日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された1nmolのsiRNAを各々含有する10マイクロリットルの最大5回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に2回、3週間注射する。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約10%の大きさであると思われる。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、例えば、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減すると思われる。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の結腸転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を21日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された100マイクロリットルの量の1nmol siRNAを、マウス尾静脈中に、週に2回、3週間注射する。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約10%の大きさであると思われる。これらの結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、例えば、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減すると思われる。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の乳房転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を10日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された1nmolのsiRNAを各々含有する10マイクロリットルの最大5回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に2回、3週間注射した。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約10%の大きさであった。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減した。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少した。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の乳房転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を21日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された100マイクロリットルの量の1nmol siRNAを、マウス尾静脈中に、週に2回、3週間注射した。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射した。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量した。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約10%の大きさであった。これらの結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証した。これらの腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減した。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少した。
表2中に示される5種のsiRNA二本鎖の各々を、50nMの濃度で黒色腫腫瘍細胞の培養物中に入れる。試験された黒色腫腫瘍細胞の特性が表15に示されている。手短には、5万〜10万個の腫瘍細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地中で18時間成長させた。2mlの総容量の培地中、1マイクロリットルのDharmaFECT試薬を使用して、合計200ピコモルの各siRNAを細胞に入れる。細胞をsiRNAとともに96時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって黒色腫腫瘍細胞生存力を評価する。5種の配列の各々が、少なくとも1種の黒色腫腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも40%低減させる(対照siRNA処理細胞と比較して)と思われる。
黒色腫腫瘍細胞の成長を50%阻害するsiRNAの濃度(IC50)は、培養中の同数の腫瘍細胞に、漸増用量のsiRNAを添加した96時間後に細胞生存力を測定することによって決定する。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の黒色腫転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに皮下に注射し、腫瘍を10日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された1nmolのsiRNAを各々含有する10マイクロリットルの最大5回の注射を、腫瘍のすぐ下に、週に2回、3週間注射する。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスにおける腫瘍は、平均して、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約10%の大きさであると思われる。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、例えば、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減すると思われる。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の黒色腫転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を21日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された100マイクロリットルの量の1nmol siRNAを、マウス尾静脈中に、週に2回、3週間注射する。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約10%の大きさであると思われる。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、例えば、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロット分析によって明らかなように、70%超低減すると思われる。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
siRNAの効力をさらに評価するために、300万個の黒色腫転移性腫瘍細胞を、雌のヌードマウスに腹腔内に注入し、腫瘍を21日間にわたって成長させた。リポソームナノ粒子中に被包された100マイクロリットルの量の1nmol siRNAを、マウス尾静脈中に、週に2回、3週間注射する。陰性対照としてスクランブルsiRNA配列を含有するナノ粒子を用いて、同様の腫瘍を有する等数のマウスに注射する。3週間の投薬の後に腫瘍を採取し、測定し、秤量する。EVI1をターゲッティングするsiRNAを投薬したマウスから得た腫瘍は、平均すると、スクランブルsiRNA配列を投薬されたマウスから得た腫瘍の約10%の大きさであると思われる。結果は、EVI1をターゲッティングするsiRNAの、抗がん療法としての有効性および効力を実証すると思われる。腫瘍におけるEVI1の全体の発現は、例えば、抗EVI1抗体を用いてプローブされた腫瘍ホモジネートのウエスタンブロットによって明らかなように、70%超低減すると思われる。EVI1 mRNAの発現はまた、EVI1エキソン14の300bp領域を増幅するプライマーを用いたEVI1遺伝子発現の定量的PCR分析によって明らかなように、数倍減少すると思われる。
表2中に示される5種のsiRNA二本鎖の各々を、50nMの濃度でHEL白血病細胞の培養物中に入れる。試験されたHEL白血病細胞の特性が表16に示されている。手短には、5万〜10万個のHEL細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに加え、表面に付着させ、10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI培地中で18時間成長させた。2mlの総容量の培地中、1マイクロリットルのDharmaFECT試薬を使用して、合計200ピコモルの各siRNAを細胞に入れる。細胞をsiRNAとともに96時間インキュベートする。トリパンブルー排出染色後に、血球算定器を用いて細胞を計数することによって白血病細胞生存力を評価する。5種の配列の各々が、少なくとも1種のHEL白血病腫瘍細胞株において生存細胞数を少なくとも40%低減させる(対照siRNA処理細胞と比較して)と思われる。
EVI1に感染した骨髄細胞を移植したC57BL/Ly5.2マウス(Buonamici、2004年)は、急性骨髄性白血病と同様の致死的骨髄異形成疾患を発生する。マウスを、ナノ粒子製剤中の抗EVI1 siRNAを用いて処理し、脾臓および骨髄におけるアポトーシスの程度ならびにTer119陽性骨髄細胞数を測定した。抗EVI1 siRNAを投与されているマウスは生存が延長し、Ter119細胞数が減少した。
Claims (22)
- 腫瘍細胞においてヒトEVI1の発現を低減できる、単離二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのshRNA種もしくはsiRNA種であって、該オリゴリボヌクレオチドが配列番号13および配列番号14の組合せを含む、単離二本鎖オリゴリボヌクレオチド、またはそのshRNA種もしくはsiRNA種。
- 前記オリゴリボヌクレオチドが、配列番号5のヌクレオチド配列を標的とする、請求項1に記載の単離二本鎖オリゴリボヌクレオチド、またはそのshRNA種もしくはsiRNA種。
- 請求項1〜2のいずれか1項に記載の単離オリゴリボヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとを含む医薬組成物。
- 有効量の請求項1〜2のいずれか1項に記載の単離オリゴリボヌクレオチドを含む、腫瘍細胞成長を阻害するための組成物。
- 化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- 有効量の請求項3または5に記載の医薬組成物を含む、腫瘍成長を阻害するための組成物。
- 前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、請求項4または6に記載の組成物。
- リポソーム中に被包された、請求項3または5に記載の医薬組成物。
- 前記リポソームが、PEG化されている、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記リポソームが、細胞ターゲッティング部分を含む、請求項8または9に記載の医薬組成物。
- 前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、請求項10に記載の医薬組成物。
- ナノ粒子中に被包された、請求項3または5に記載の医薬組成物。
- 前記ナノ粒子が、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマーまたはリン酸カルシウムポリマーまたはその組合せを含む、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記ナノ粒子が、PEG化されている、請求項12または13に記載の医薬組成物。
- 前記ナノ粒子が、細胞ターゲッティング部分を含む、請求項12、13または14に記載の医薬組成物。
- 前記細胞ターゲッティング部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、請求項15に記載の医薬組成物。
- 腫瘍細胞においてヒトEVI1遺伝子の発現を特異的に低減するための医薬組成物であって、該医薬組成物は、腫瘍細胞においてヒトEVI1の発現を低減できる、単離二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそのshRNA種もしくはsiRNA種を含み、ここで、該オリゴリボヌクレオチドが配列番号13および配列番号14の組合せを含み、該医薬組成物が、化学療法薬または化学療法剤と、薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントとをさらに含む、医薬組成物。
- 腫瘍成長を阻害するための、請求項3、5または8〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 有効量の請求項1〜2のいずれか1項に記載の単離オリゴリボヌクレオチドを含む、腫瘍細胞の死滅を誘発するための組成物。
- 有効量の請求項3または5に記載の医薬組成物を含む、腫瘍細胞の死滅を誘発するための組成物。
- 腫瘍細胞の死滅を誘発するための、請求項3、5および8〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記腫瘍が、肺、乳房、前立腺もしくは卵巣の組織または器官の腫瘍、あるいは黒色腫もしくは急性骨髄性白血病である、請求項19または20に記載の組成物あるいは請求項17、18または21に記載の医薬組成物。
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