KR20010042848A

KR20010042848A - 인슐린유사 성장인자 ⅱ의 안티센스 올리고뉴클레오타이드서열 및 이를 이용한 세포성장 조절방법

Info

Publication number: KR20010042848A
Application number: KR1020007011617A
Authority: KR
Inventors: 라이트짐에이.; 영아이핑에이치.; 리윤에스.
Original assignee: 진센스 테크놀로지즈 인코포레이티드
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2001-05-25
Also published as: EP1073729A2; CA2326824A1; WO1999055854A3; WO1999055855A3; US6417169B1; AU3402299A; BR9909809A; AU747639B2; IL138976A0; WO1999055855A2; IL138977A0; EP1073728A2; AU747639C; JP2002512792A; US20020187954A1; NZ508354A; JP2002512793A; AU3402199A; CN1298444A; CN1298445A

Abstract

본 발명은 포유류 내에서 종양세포의 성장을 조절하는 IGF-Ⅱ 유전자에 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 사용하여 포유류의 종양세포의 성장을 억제하는 방법 및 제약학적으로 수용가능한 부형제와 유효량의 본 발명의 화합물을 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

인슐린유사 성장인자 Ⅱ의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열 및 이를 이용한 세포성장 조절방법 {INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR Ⅱ ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES AND METHODS OF USING SAME TO MODULATE CELL GROWTH}

＜110＞ GENESENSE TECHNOLOGIES INC.

＜120＞ INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR II ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES

AND METHODS OF USING SAME TO MODULATE CELL GROWTH

＜130＞ IPP000384CA

＜150＞ US 60/082,791

＜151＞ 1998-04-23

＜160＞ 37

＜170＞ KOPATIN 1.5

＜210＞ 1

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ human

＜400＞ 1

ggctcgctgg ggcaggagga 20

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gctggtgggc agagcgcggg 20

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ttggtgtcta cagctcagca 20

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cagcgaggca gcgggcggcg 20

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tcgggcgaag cggggatggg 20

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cgggcctcgg gagggggaca 20

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gaccgcgggc gcccagctcg 20

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acgtcgaggg gccgggggag 20

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cgggagaaag agcgggggcc 20

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cgagagggcg ggcgtgaggg 20

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cagcgagagg cgggcaggcg 20

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cgggctgtct tcgggctggg 20

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gcgacggggc agagcggggg 20

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cgctgccgcc cacctccctg 20

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ttggtgtctg gaagccggcg 20

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ttccccattg ggattcccat 20

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gtccaccagc tccccgccgc 20

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cgatgccacg gctgcgacgg 20

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acgcaggagg gcaggcaggc 20

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gcgagcacgt gaccccggcg 20

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cgtgggcggg gtcttgggtg 20

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tgtttcgggg aggcggggca 20

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gcggtacgag cgacgtgccc 20

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caaatgccgc cggccgcaca 20

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cgcatcagtg cacggccccc 20

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gtgcggaagg cggccaccct 20

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cagggtgctg aggggcgggc 20

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gctccggggc ccaagcaacc 20

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ccctaggcgc cgcggtggtg 20

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tggcatggac gacccccggg 20

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gggccgcaag gtggaccgag 20

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taccgcccca gtgagaccct 20

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tgacgtttgg cctccctgaa 20

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cccaaaattt gggcattgtt cccgctcgcc ggccacccac tgcagcttcc ccaaccccgc 60

gcacagcggg cactggtttc gggcctctct gtctcctacg aagtccccag agcaactcgg 120

atttgggaaa tttctctcta gcgttgccca aacacacttg ggtcggccgc gcgccctcag 180

gacgtggaca gggagggctt ccccgtgtcc aggaaagcga ccgggcattg cccccagtct 240

cccccaaatt tgggcattgt ccccgggtct tccaacggac tgggcgttgc tcccggacac 300

tgaggactgg ccccggggtc tcgctcacct tcagcagcgt ccaccgcctg ccacagagcg 360

ttcgatcgct cgctgcctga gctcctggtg cgcccgcgga cgcagcctcc agcttcgcg 419

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gttcgcctgc tctccggcgg agctgcgtga ggcccggccg gccccggccc cccccttccg 60

gccgcccccg cctcctggcc cacgcctgcc cgcgctctgc ccaccagcgc ctccatcggg 120

caaggcggcc ccgcgtcgac gccgcccgct gcctcgctgc tgactcccgt cccgggcgcc 180

gtccgcgggg tcgcgctccg ccgggcctgc ggattccccg ccgcctcctc ttcatctacc 240

tcaactcccc ccatccccgc ttcgcccgag gaggcggttc cccccgcagg cagtccggct 300

cgcaggccgc cggcgttgtc accccccccg cgctccccct ccagccctcc ccccggcgcg 360

cagcctcggg ccgctcccct ttccgcgctg cgtcccggag cggccccggt gccgccaccg 420

cctgtccccc tcccgaggcc cgggctcgcg acggcagagg gctccgtcgg cccaaaccga 480

gctgggcgcc cgcggtccgg gtgcagcctc cactccgccc cccagtcacc gcctcccccg 540

gcccctcgac gtggcgccct tccctccgct tctctgtgct ccccgcgccc ctcttggcgt 600

ctggccccgg cccccgctct ttctcccgca accttccctt cgctccctcc cgtccccccc 660

agctcctagc ctccgactcc ctccccccct cacgcccgcc ctctcgcctt cgccgaacca 720

aagtggatta attacacgct ttctgtttct ctccgtgctg ttctctcccg ctgtgcgcct 780

gcccgcctct cgctgtcctc tctccccctc gccctctctt cggccccccc ctttcacgtt 840

cactctgtct ctcccactat ctctgccccc ctctatcctt gatacaacag ctgacctcat 900

ttcccgatac cttttccccc ccgaaaagta caacatctgg cccgccccag cccgaagaca 960

gcccgtcctc cctggacaat cagacgaatt ctcccccccc ccccaaaaaa aagccatccc 1020

cccgctctgc cccgtcgcac attcggcccc cgcgactcgg ccagagcggc gctggcagag 1080

gagtgtccgg caggagggcc aacgcccgct gttcggtttg cgacacgcag cagggaggtg 1140

ggcggcagcg tcgccggctt ccag 1164

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gcaaactgga tattagcttc tcctgtgaaa gagacttcca gcttcctcct cctcctcttc 60

ctcctcctcc tcctgcccca gcgagccttc tgctgagctg tag 103

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acaccaatgg gaatcccaat ggggaagtcg atgctggtgc ttctcacctt cttggccttc 60

gcctcgtgct gcattgctgc ttaccgcccc agtgagaccc tgtgcggcgg ggagctggtg 120

gacaccctcc agttcgtctg tggggaccgc ggcttctact tcagcaggcc cgcaagccgt 180

gtgagccgtc gcagccgtgg catcgttgag gagtgctgtt tccgcagctg tgacctggcc 240

ctcctggaga cgtactgtgc tacccccgcc aagtccgaga gggacgtgtc gacccctccg 300

accgtgcttc cggacaactt ccccagatac cccgtgggca agttcttcca atatgacacc 360

tggaagcagt ccacccagcg cctgcgcagg ggcctgcctg ccctcctgcg tgcccgccgg 420

ggtcacgtgc tcgccaagga gctcgaggcg ttcagggagg ccaaacgtca ccgtcccctg 480

attgctctac ccacccaaga ccccgcccac gggggcgccc ccccagagat ggccagcaat 540

cggaagtgag caaaactgcc gcaagtctgc agcccggcgc caccatcctg cagcctcctc 600

ctgaccacgg acgtttccat caggttccat cccgaaaatc tctcggttcc acgtccccct 660

ggggcttctc ctgacccagt ccccgtgccc cgcctccccg aaacaggcta ctctcctcgg 720

ccccctccat cgggctgagg aagcacagca gcatcttcaa acatgtacaa aatcgattgg 780

ctttaaacac ccttcacata ccctcccccc aaattatccc caattatccc cacacataaa 840

aaatcaaaac attaaactaa cccccttccc ccccccccac aacaaccctc ttaaaactaa 900

ttggcttttt agaaacaccc cacaaaagct cagaaattgg ctttaaaaaa aacaaccacc 960

aaaaaaaatc aattggctaa aaaaaaaaag tattaaaaac gaattggctg agaaacaatt 1020

ggcaaaataa aggaatttgg cactccccac ccccctcttt ctcttctccc ttggactttg 1080

agtcaaattg gcctggactt gagtccctga accagcaaag agaaaagaag ggccccagaa 1140

atcacaggtg ggcacgtcgc tcgtaccgcc atctcccttc tcacgggaat tttcagggta 1200

aactggccat ccgaaaatag caacaaccca gactggctcc tcactccctt ttccatcact 1260

aaaaatcaca gagcagtcag agggacccag taagaccaaa ggaggggagg acagagcatg 1320

aaaaccaaaa tccatgcaaa tgaaatgtaa ttggcacgac cctcaccccc aaatcttaca 1380

tctcaattcc catcctaaaa agcactcata ctttatgcat ccccgcagct acacacacac 1440

aacacacagc acacgcatga acacagcaca cacacgagca cagcacacac acgagcatac 1500

agcacacaca caaacgcaca gcacacacag cacacagatg agcacacagc acacacacaa 1560

acgcacagca cacacacgca cacacatgca cacacagcac acaaacgcac ggcacacaca 1620

cgcacacaca gtgcacacac agcacacacg caaacgcaca cgcacacaca aacgcacagc 1680

acacacgcac acacagcaca cacacgagca cacagcacac aaacgcacag cacacgcaca 1740

cacatgcaca cacagcacac tagcacacag cacacacaca aagacacagc acacacatgc 1800

acacacagca cacacacgcg aacacagcac acacgaacac agcacacaca gcacacacac 1860

aaacacagca cacacatgca cacagcacat gcacacacag cacacacatg aacacagcac 1920

acagcacaca catgcacaca gcacacacgc atgcacagca cacatgaaca cagcacacac 1980

aaacacacag cacacacatg cacacacagc acacacactc atgcgcagca catacatgaa 2040

cacagctcac agcacacaaa cacgcagcac acacgttgca cacgcaagca cccacctgca 2100

cacacacatg cgcacacaca cgcacacccc cacaaaatta gatgaaaaca ataagcatat 2160

ctaagcaact acgatatctg tatggatcag gccaaagtcc cgctaagatt ctccaatgtt 2220

ttcatggtct gagcccccct cctgttccca tctccactgc ccctcggccc tgtctgtgcc 2280

ctgcctctca gaggaggggg ctcagatggt gcggcctgag tgtgcggccg gcggcatttg 2340

ggatacaccc gtaggtgggc ggggtgtgtc ccaggcctaa ttccatcttt ccaccatgac 2400

agagatgccc ttgtgaggct ggcctccttg gcgcctgtcc ccacggcccc cgcagcgtga 2460

gccacgatgc tccccatacc ccacccattc ccgatacacc ttacttactg tgtgttggcc 2520

cagccagagt gaggaaggag tttggccaca ttggagatgg ccggtagctg agcagacatg 2580

cccccacgag tagcctgact ccctggtgtg ctcctggaag gaagatcttg gggacccccc 2640

caccggagca cacctaggga tcatctttgc ccgtctcctg gggacccccc aagaaatgtg 2700

gagtcctcgg gggccgtgca ctgatgcggg gagtgtggga agtctggcgg ttggaggggt 2760

gggtgggggg cagtgggggc tgggcggggg gagttctggg gtaggaagtg gtcccgggag 2820

attttggatg gaaaagtcag gaggattgac agcagacttg cagaattaca tagagaaatt 2880

aggaaccccc aaatttcatg tcaattgatc tattccccct ctttgtttct tggggcattt 2940

ttcctttttt tttttttttt gttttttttt tacccctcct tagctttatg cgctcagaaa 3000

ccaaattaaa cccccccccc atgtaacagg ggggcagtga caaaagcaag aacgcacgaa 3060

gccagcctgg agaccaccac gtcctgcccc ccgccattta tcgccctgat tggattttgt 3120

ttttcatctg tccctgttgc ttgggttgag ttgagggtgg agcctcctgg ggggcatggc 3180

catgagcccc cttggagaag tcagagggga gtggagaagg catgtccggc ctggcttctg 3240

gggacagtgg ctggtcccca gaagtcctga gggcggaggg gggggttggg cagggtctcc 3300

tcaggtgtca ggagggtgct cggaggccac aggagggggc tcctggctgg cctgaggctg 3360

gccggagggg aaggggctag caggtgtgta aacagagggt tccatcagct ggggcagggt 3420

ggccgccttc cgcacacttg aggaaccctc ccctctccct cggtgacatc ttgcccgccc 3480

ctcagcaccc tgccttgtct ccaggaggtc cgaagctctg tgggacctct tgggggcaag 3540

gtggggtgag gccggggagt agggaggtca ggcgggtctg agcccacaga gcaggagagc 3600

tgccaggtct gcccatcgac caggttgctt gggccccgga gcccacgggt ctggtgatgc 3660

catagcagcc accaccgcgg cgcctagggc tgcggcaggg actcggcctc tgggaggttt 3720

acctcgcccc cacttgtgcc cccagctcag cccccctgca cgcagcccga ctagcagtct 3780

agaggcctga ggcttctggg tcctggtgac ggggctggca tgaccccggg ggtcgtccat 3840

gccagtccgc ctcagtcgca gagggtccct cggcaagcgc cctgtgagtg ggccattcgg 3900

aacattggac agaagcccaa agagccaaat tgtcacaatt gtggaaccca cattggcctg 3960

agatccaaaa cgcttcgagg caccccaaat tacctgccca ttcgtcagga cacccaccca 4020

cccagtgtta tattctgcct cgccggagtg ggtgttcccg ggctgcctgt ctgacctccg 4080

tgcctagtcg tggctctcca tcttgtctcc tccccgtgtc cccaatgtct tcagtggggg 4140

gccccctctt gggtcccctc ctctgccatc acctgaagac ccccacgcca aacactgaat 4200

gtcacctgtg cctgccgcct cggtccacct tgcggcccgt gtttgactca actcagctcc 4260

tttaacgcta atatttccgg caaaatccca tgcttgggtt ttgtctttaa ccttgtaacg 4320

cttgcaatcc caataaagca ttaaaagtca 4350

인슐린-유사 성장 인자 Ⅱ(IGF-Ⅱ)는 67개의 아미노산 폴리펩타이드 성장 인자로, 인간 배아조직을 발생시키는 데 광범위하게 발현되고, 다양한 조직의 성장 및 분화와 관련된다. 출생 후, 발현은 거의 모든 인간 조직에서 점진적으로 소멸한다. 성인에서 약 100 ng/㎖의 혈청 농도가 주로 간에서 생산된다. IGF-Ⅱ 수용체(탄수화물 대사, 악성 세포의 운동성 및/또는 종양-유도된 맥관형성과 관련됨) 또는 IGF-Ⅰ수용체(신호 전달경로 및 전이와 관련됨)중 어떤 것과 결합하였는지에 따라 IGF-Ⅱ의 생물학적 기능이 조절된다.

다수의 종양에서 다양한 대사에 의해 종양 진행 및 전이에 IGF-Ⅱ가 관련되는 것으로 알려져 있다((1,2)에서 연구됨). IGF-Ⅱ와 관련된 종양은 횡문근육종(rhabdomyosaroma), Wilms' 종양, 신경아세포종과 같은 소아기 종양을 포함한다. 이들 종양은 IGF-Ⅱ의 과잉 발현을 나타내는 것으로, 파라크린(paracrine) 또는 오토크린(autocrine) 루프의 존재를 알려주는 것으로, 이 루프를 봉쇄하면 종양의 성장 또는 전이가 저해된다. 골육종, 유방암, 간아세포종, 생식세포 종양, 간세포암, 부신피질암, 폐종양, 횡문근육종, 뇌종양 및 결장암을 포함하는 여러 가지 종양에서 IGF-Ⅱ는 다양한 정도로 종양의 성장 및 전이에 기여한다. 또한, 종양형성에서 IGF-Ⅱ의 직접적인 역할은 유전자 변형 마우스 및 인간에서 이것을 과잉발현시킨 세포주에서 밝혀졌다(3-5).

인간 IGF-Ⅱ 유전자는 인슐린 유전자 바로 하류에 있는 크로모좀 11p15에 위치하며 30kb(6의 연구; 도 1 참조)의 길이를 가진다. 이것은 엑손 7, 8, 및 일부 9가 전구체 단백질을 코딩하는 9개의 엑손으로 이루어져 있다. 엑손 1, 4, 5, 및 6에는 각각 특정 프로모터인 P1, P2, P3, 및 P4가 선행하고 있다. 프로모터 P1은 성인의 간에서만 활성이나, P2-4는 대부분 태아의 조직에서 활성이다. P2, 3, 및 4로부터 소량의 전사체(태아의 전사체)를 발현하는 성인 조직은 소수만이 있다. 4가지의 주요한 mRNA종(태아 전사체 6Kb, 4.8-5 Kb 및 2.2 Kb 및 성인 전사체 5.3Kb)이 차별적 스프라이싱(differential splicing)에 의해 독특한 프로모터로부터 생산되는 것으로 확인되었다. 여러 가지 원발성 암 및 세포주에서 관찰되는 IGF-Ⅱ의 과잉발현은 발현이 주로 P3 및 P4로 유도되는 mRNA의 재활성화(간에서) 또는 과잉발현으로 초래되는 것이다. 이들 태아의 전사체는 P1(엑손 1, 2, 및 3을 포함하는 5' UTR)으로 부터 유도된 성인 전사체에 없는 독특한 5' 미해독 부위(엑손 4 또는 5 또는 6을 포함하는 5'UTR)를 포함한다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드(AS-ODNs)는 mRNA를 표적하기 위해 서열-특이적 혼성화에 의한 표적 특이적 방식으로 유전자 발현을 저해하기 위해 광범위하게 사용되고 있다. 다수의 여러 가지 연구에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 중제된 암유전자의 억제가 암 종양발생을 지배하는 생화학적 대사를 설명하는 데 극히 유용(7)할 뿐 아니라 인간의 암의 치료를 위한 신규한 치료용 화합물(8,9)로도 상당히 기대되고 있다는 것이 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중제된 암유전자의 억제에서 밝혀지고 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드를 기본으로 한 치료에는 상대적으로 적은 독성이 발휘된다(10).

소수의 연구(11, 15-17)에서는 인간 또는 생쥐의 성인 IGF-Ⅱ 전사에 대해 표적되는 특정 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 실험실에서 종양 세포 증식을 효과적으로 방해한다는 것을 밝혀냈다. 한 연구(15)에서는, 인간의 성인 전사체의 번역 개시자리를 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 IGF-Ⅱ 생산을 억제하여 인간의 간세포 암 세포주, HuH-7 및 HepG2의 성장을 저해하였다고 결론을 내렸다. 인간의 경부암 세포주를 이용한 다른 연구(16, 17)에서는, IGF-Ⅱ의 단백질 코딩영역을 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표피 성장인자(EGF)-유도된 유사분열 작용을 저해하는 것을 밝혀냈다.

따라서, 높은 특이성과 적은 독성을 가지며, IGF-Ⅱ의 발현 및 생산을 저해하는 데 작용하는 IGF-Ⅱ에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 동정하는 것이 바람직할 것이다.

본 발명은 포유류의 인슐린유사 성장 인자 Ⅱ(IGF Ⅱ) 유전자에 상보적이며, 포유류에서 종양 세포성장을 조절하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유류에서 종양 세포의 성장을 저해하는 데 상기 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 제약학적으로 수용가능한 부형제 및 유효량의 본 발명의 화합물을 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

인용문헌

하기의 간행물, 특허 출원서, 및 특허는 본 출원서에 인용된다:

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41. Felgner et al.,미합중국 특허 No. 5,580,859

상기 모든 간행물, 특허출원서 및 특허는 본 명세서에서 이들의 전문이 참조문헌으로 인용되며 각각의 개별적인 간행물, 특허출원서 또는 특허는 특정하게 그리고 개별적으로 참조문헌으로 표시되어 있다.

도 1은 택일적으로 전사되고 스플라이싱된 mRNA와 인간 IGF-Ⅱ 유전자의 지도이다.

번호가 매겨진 박스(1-9)는 IGF-Ⅱ 유전자의 엑손을 가리킨다. 4개의 프로모터(P1-P4)가 화살표로 표시되어 있다. 다양한 IGF-Ⅱ mRNA 종은 해당하는 크기에 따라 도면의 하부에 도시되어 있다. 검은 색 박스는 IGF-Ⅱ 전구체 단백질의 코딩 영역을 나타낸다.

도 2A-D는 지적된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 투여에 의한 여러 가지 세포종의 콜로니 형성능의 저해율을 나타내는 그래프이다. 도 2A는 인간 횡문근육종 세포주 RD의 저해율을 도시하고; 도 2B는 인간 전립선암 세포주 PC-3의 저해율을 도시하고; 도 2C는 인간 췌장암 세포주 AsPC-1의 저해율을 도시하고; 도 2D는 인간 신경아세포종 세포주 SK-N-AS의 저해율을 도시한다.

도 3은 GTI4006 [SEQ ID NO:6] 또는 GTI4011 [SEQ ID NO: 11]의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 투여한 후, 인간 신경아세포종 세포주 SK-N-AS 또는 횡문근육종 세포주(RD)로부터 얻은 RNA의 노던 블롯의 자동방사사진이다.

도 4는 상이한 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드로 처리한 후 인간 신경아세포종 세포에서 IGF-Ⅱ 발현의 웨스턴 블롯의 사진이다.

도 5는 상이한 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드로 처리한 후 인간 횡문근육종 세포에서 IGF-Ⅱ 발현의 웨스턴 블롯의 사진이다.

도 6A는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하거나 또는 무처리(대조군)한 생쥐에서 인간 신경아세포종 세포(SK-N-AS)의 주사후 종양의 크기의 그래프이다.

도 6B는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하거나 또는 무처리(대조군)한 생쥐에서 인간 신경아세포종 세포(SK-N-AS)의 주사 20일후 종양의 질량의 그래프이다.

도 7A는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하거나 또는 무처리(대조군)한 생쥐에서 인간 Wilm's 종양 세포(G401)의 주사후 종양의 크기의 그래프이다.

도 7B는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하거나 또는 무처리(대조군)한 생쥐에서 인간 Wilm's 세포(G401)의 주사 20일후 종양의 질량의 그래프이다.

도 8은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 GTI4006 [SEQ ID NO: 6]으로 치료한 후 인간 신경아세포종(SK-N-AS) 종양에서 IGF-Ⅱ mRNA 수치의 노던 블롯의 자동방사 사진이다.

도 9는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 치료한 후 인간 신경아세포종(SK-N-AS) 종양에서 IGF-Ⅱ 단백질 수치의 웨스턴 블롯의 사진이다. 아래의 밴드는 로드된 총 단백질을 나타내기 위해 인디아 잉크로 착색된 겔의 사진이다.

도 10은 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 세포주를 처리한 후 인간 흑색종 세포주(C8161)에 의해 생쥐당 폐 전이의 평균 개수를 나타내는 그래프이다.

도 11은 인간 IGF-Ⅱ 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 일부이다. 도 11A는 엑손 4의 서열[SEQ ID NO: 34]이고, 도 11B는 엑손 5의 서열[SEQ ID NO: 35]이고, 도 11C는 엑손 6의 서열[SEQ ID NO: 36]이고, 도 11D는 엑손 7-9의 서열[SEQ ID NO:37]이다.

본 발명은 포유류에서 IGF-Ⅱ 유전자의 발현 및 IGF-Ⅱ의 생산을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포유류에서 종양성장 및 전이를 저해하도록 사용하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 조성물 중 하나에서, 본 발명은 포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 약 3 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제 내성이 있는 것으로 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 가질 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적이지 않은 부가적인 뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 표 1에 나타난 SEQ ID NO: 1 내지 15로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 표 2에 나타난 SEQ ID NO: 17-31로 이루어지는 군으로부터 선택된 포유류 성인의 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명의 다른 조성물에서, 본 발명은 포유류의 태아의 IGF-Ⅱ mRNA의 5' 미해독 부위에 상보적인 서열을 포함하는 약 3 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 조성물에서, 본 발명은 표 2의 SEQ ID NO: 17-31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 조성물에서, 본 발명은 포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 약 3 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 제약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 표 1의 SEQ ID NO: 1 내지 15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 조성물에서, 본 발명은 표 2의 SEQ ID NO: 17 내지 31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로부터 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 제약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 방법 중 하나에서, 본 발명은 포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 약 3개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에게 종양의 성장이 저해되는 조건하에서 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 종양성장 저해방법에 관한 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 1의 SEQ ID NO: 1 내지 15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 표 2의 SEQ ID NO: 17 내지 31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 포유류 성인의 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 약 20개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에게 종양의 성장이 저해되는 조건하에서 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 종양성장 저해방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 방법에서, 본 발명은 포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 약 3개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전이된 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에게 종양의 전이가 저해되는 조건하에서 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 종양전이 저해방법에 관한 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학요법제와 함께 투여할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 1의 SEQ ID NO: 1 내지 15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 표 2의 SEQ ID NO: 17 내지 31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 포유류 성인의 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 약 20개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전이된 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에게 종양의 전이가 저해되는 조건하에서 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 종양전이 저해방법에 관한 것이다.

본 발명은 포유류의 IGF-Ⅱ에 상보적이고, 포유류에서 종양 세포성장을 조절하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 다양한 인간의 원발성 암 및 세포주에서 관찰된 IGF-Ⅱ의 과잉발현은 태아의 mRNA 종의 재활성화(간에서) 또는 과잉발현(다른 기관에서)에 기인하는 것 같다. 따라서, 5'UTR에서 태아의 전사체를 특이적으로 표적하고 성인 전사체를 손상시키지 않도록 설정되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종양 세포를 표적하기 위해 매우 특이적일 것이다.

특정한 이론 또는 대사로 한정되어 있지 않지만, 이들 안티센스 화합물은 종양세포의 오토크린(autocrine) 성장을 억제하여 가능하면 세포자멸을 유도할 뿐 아니라 종양 세포 운동성 및/또는 내피세포 이동 및 맥관형성의 유도와 같은 IGF-Ⅱ의 오토크린/파라크린(paracrine) 작용을 저해함으로써 항종양 활성을 발휘할 것이다라고 알려져 있다.

정 의

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다음의 용어는 다음과 같은 의미를 가진다.

"안티센스 올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 본 명세서에서 사용된 바와 같이 원하는 mRNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 IGF-Ⅱ 발현을 저해하기 위하여 표적물로서 효과적으로 작용하는 포유류의 IGF-Ⅱ mRNA의 일부분에 상보적인 것이다. 바람직하게, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 IGF-Ⅱ 태아의 전사체의 5' 미해독 부위에 상보적인 것이다. 더욱 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 도 11 A-C에 설정된 엑손 4, 5, 또는 6의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 것이다.

어떠한 이론 또는 대사로 한정되지 않지만, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활성은 올리고뉴클레오타이드와 표적의 핵산(예를 들면, 유전자 영역, 유전자 또는 그의 mRNA 전사체)이 결합하여, 하이브리드 형성 정지 또는 RNase H에 의한 표적 RNA의 파괴에 의해(RNA에 혼성되는 경우 RNase H를 활성화하는 능력) 표적물의 작용을 파괴한다는 것이 알려져 있다.

"올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 천연적으로 발생하는 염기, 당, 및 당간(골격) 결합으로 이루어지는 뉴클레오타이드 모노머 또는 뉴클레오사이드 모노머의 올리고머 또는 폴리머를 의미하는 것이다. 이 용어는 또한 유사한 작용을 하는 비천연적으로 발생하는 모노머 또는 이의 일부를 포함하는 변형되거나 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 상기 변형되거나 치환된 올리고머는 세포 유입이 촉진되거나 뉴클레아제의 존재시 안정성이 증가되는 것과 같은 특성 때문에 천연적으로 발생하는 형태보다 바람직할 수도 있다. 상기 용어는 또한 2개 이상의 화학적으로 독특한 영역을 포함하는 키메릭 올리고뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예를 들면 키메릭 올리고뉴클레오타이드는 유익한 특성(예를 들면 증가된 뉴클레아제 내성, 증가된 세포내 유입)을 부여하는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 부분 을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 2 이상의 올리고뉴클레오타이드를 서로 결합시켜 키메릭 올리고뉴클레오타이드를 형성할 수도 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우라실을 포함하는 천연적으로 발생하는 염기 모노머 또는 합성 염기 모노머를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 기타 알킬 아데닌, 5- 할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자 우라실, 6-아자 시토신, 및 6-아자 티민, 슈도 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티올 알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 기타 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티올알킬 구아닌, 8-하이드록실 구아닌 및 기타 8-치환된 구아닌, 기타 아자 및 데아자 우라실, 티미딘, 시토신 또는 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실, 및 5-트리플루오로 시토신과 같은 변형된 염기를 포함할 수도 있다. 또한, 메틸, 에틸, 프로필기와 같은 기타 화학기를 올리고뉴클레오타이드의 당, 염기, 또는 골격 성분을 포함하는 다양한 부분에 부착시키는 것을 포함한 변형도 가능하다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트 골격, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당간 결합 또는 단쇄 이종원소 또는 헤테로사이클릭 당간 결합에 변형된 인 산소 이종원소를 포함할 수도 있다. 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 및 모르폴리노 올리고머를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 4개 내지 6개의 3'-말단 뉴클레오타이드 사이를 연결하는 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 결합은 모든 뉴클레오타이드를 연결할 수 있다. 포스포로티오에이트 결합은 R_P엔안티오머와 S_P엔안티오머가 혼합되어 있거나 또는 입체 규칙적이거나, 또는 R_P형 또는 S_P형 중 하나로 실제적으로 입체 규칙적일 수도 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당 유사체(mimetic)를 포함 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기 및/또는 당을 가진 2'-O-치환된 리보뉴클레오타이드와 같은 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "2'-O-치환된"이라는 용어는 펜토스기의 2' 자리가 1-6개의 포화 또는 불포화 탄소원자를 함유하는 -O- 저급 알킬기 또는 2 내지 6개의 탄소원자를 가지는 -O-아릴기 또는 알릴기로 치환된다는 것을 의미한다. 상기알킬기, 아릴기, 또는 알릴기는 치환되지 않거나 또는 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕시(carbalkoxy), 또는 아미노기로 치환될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에서 2'-O-알킬화된 4개 또는 5개의 리보뉴클레오타이드 및/또는 3' 말단에서 2'-O-알릴화된 4개 또는 5개의 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 구조가 근본적으로 변경되는 뉴클레오타이드 아날로그를 포함할 수도 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드 아날로그의 예로는 DNA(또는 RNA)에서 데옥시리보스(또는 리보스) 포스페이트 골격이 펩타이드에서 발견되는 것과 유사한 폴리아미드 골격으로 치환된 펩타이드 핵산(PNA)이 있다(Nielsen et al.²⁹; Good and Nielsen³⁰; 고 Buchardt, et al.³¹, 미합중국 특허 제5,766,855호; 고 Buchardt, et al.³², 미합중국 특허 제 5,719,262호). PNA 아날로그는 효소에 의한 변성에 내성이 있는 것으로 알려졌고 실험실 내에서와 생체 내에서 수명이 연장된다. 또한, PNA 가닥과 DNA 가닥 사이의 전하 반발력이 부족하기 때문에 천연 발생의 핵산 분자보다 PNAs는 상보적인 DNA 서열과 더욱 강하게 결합한다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 폴리머 골격, 고리골격, 또는 비고리 골격을 포함하는 다른 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면 뉴클레오타이드는 모르폴린의 골격 구조를 포함할 수도 있다(미합중국 특허 제5,034,506호(33)).

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 DNA와 RNA 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉽지 않도록 변형되거나 또는 DNA 또는 RNA 뉴클레아제로부터 올리고뉴클레오타이드를 자체적으로 보호하는 운반 비히클에 위치시키는 경우, "뉴클레아제 내성"이 생긴다. 뉴클레아제 내성 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르 및 모르폴리노 올리고머를 포함한다. 뉴클레아제 내성을 부여하는 적합한 운반 비히클은 예를 들면 리포좀을 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오타이드의 약물동태학적 특성을 개선시키기 위한 기, 올리고뉴클레오타이드의 약물동태학적 특성을 개선시키기 위한 기와 같은 기를 포함할 수도 있다.

이중쇄 형태, 헤어핀 형태, 및 호모올리고머/서열 반복의 가능성은 작고, IGF-Ⅱ 유전자 서열에 대한 결합 가능성이 큰 IGF-Ⅱ 유전자에 상보적인 서열로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 특성은 컴퓨터 모델링 프로그램 OLIGO Primer Analysis Software, Version 5.0(National Biosciences, Inc., Plymouth, MN)을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 다섯 가지의 파라미터를 정량 분석한다.

또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열이 2개 이상의 포유류종 사이의 IGF-Ⅱ 유전자에 보존수준이 높은 서열을 기준으로 선택될 수 있다. 이들 특성은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 데이터베이스를 사용하는 University of Wisconsin Computer 그룹 (GCG) 소프트웨어(Deverreux J. 등(35))의 BLASTN 프로그램(Altschl, et al.(34))을 이용하여 측정될 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 치환, 삽입, 및 결실과 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게 서열의 10% 미만이 돌연변이를 가지는 것이 바람직할 것이다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 적어도 약 3개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그를 포함하고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 5개의 뉴클레오타이드를, 더욱 바람직하게는 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 100개 미만의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 50개 미만의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그이고, 더욱 바람직한 것은 약 35개 미만의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그이다.

바람직하게, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 태아의 IGF-Ⅱ 전사체의 5' 미해독 부위에 상보적이다. "태아의 IGF-Ⅱ 전사체의 미해독 부위(untranslated region of the fetal IGF-Ⅱ transcript)"이라는 용어는 주요 IGF-Ⅱ 전사체를 형성하기 위해 태아의 세포에서 전사되고, 성인의 IGF-Ⅱ 전사체의 일부(성인 세포에서 주요 전사체)는 형성하지 않는 IGF-Ⅱ 유전자의 일부를 의미한다. 바람직하게 "태아의 IGF-Ⅱ 전사체의 미해독 부위"는 IGF-Ⅱ 유전자의 엑손 4, 5, 및 6이다. 더욱 바람직하게는 "태아의 IGF-Ⅱ 전사체의 미해독 부위"는 실질적으로 도 11A-C에 설정된 엑손 4, 5, 및 6의 서열이다.

바람직하게, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 1 및 2(이하)에 설정된 서열을 포함한다.

[표 1]

인간 IGF-Ⅱ 태아의 mRNA를 표적하도록 설정된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열

이중쇄 형태, 헤어핀 형태 및 호모올리고머/서열 반복의 가능성은 작고, IGF-Ⅱ mRNA 서열에 대한 결합가능성이 큰 GC 클램프(clamp)를 포함하는, 인간 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 서열로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하였다. 또한, 인간과 생쥐에서 자주 발견되는 기타 반복 서열에 대한 그릇된 프라이밍(priming)을 제거하였다. 이들 특성은 컴퓨터 모델링 프로그램인 OLIGO™Primer Analysis Software, Version 5.0(National Biosciences, Inc., Plymouth, MD)을 사용하여 측정하였다.

[표 2]

인간 IGF-Ⅱ mRNA의 모든 영역에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드

이중쇄 형태, 헤어핀 형태, 및 호모올리고머/서열 반복의 가능성은 적으면서 IGF-Ⅱ mRNA 서열에 대한 결합 가능성은 큰 GC 클램프를 포함하는, 인간 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 서열로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하였다. 또한, 인간과 생쥐에서 자주 발견되는 기타 반복서열에 대한 그릇된 프라이밍을 제거하였다. 이들 특성은 컴퓨터 모델링 프로그램인 OLIGO™Primer Analysis Software, Version 5.0(National Biosciences, Inc., Plymouth, MD)을 사용하여 측정하였다.

표 1 및 2에서 "Tm"은 열역학적으로 가장 근사한 값으로 산출된 올리고뉴클레오타이드 이중쇄의 용융 온도이다. 이 온도에서 핵산 분자의 50%가 이중쇄 상태로 남아 있고 나머지 50%가 변성된다. "ΔG"는 올리고뉴클레오타이드의 자유에너지이고 올리고뉴클레오타이드 이중쇄의 안정성에 대한 측정값이다.

"알킬"이라는 용어는 바람직하게 1 내지 20개의 탄소원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소원자를 가지는 1가의 알킬기를 의미한다. 이 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, n-헥실 등과 같은 기를 예로 들 수 있다.

"아릴"이라는 용어는 단일 고리(예를 들면 페닐) 또는 다중 축합(융합된) 고리(예를 들면 나프틸 또는 안트릴)를 가지는 6 내지 14개의 탄소원자의 불포화 방향족 카르보사이클릭기를 의미한다. 바람직한 아릴은 페닐, 나프틸 등을 포함한다.

"할로" 또는 "할로겐"이라는 용어는 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도를 의미하고, 플루오로 또는 클루오로 중 하나가 바람직하다.

하나 이상의 치환기를 포함하는 상기 기의 일부에 대해서 상기 기들은 입체적으로 구현될 수 없거나 및/또는 손쉽게 합성될 수 없는 치환 또는 치환 패턴을 포함하지 않을 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 화합물은 이들 화합물의 치환으로 생기는 모든 입체화학적 이성체를 포함한다.

"제약학적으로 수용할 수 있는"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 물질은 세포, 세포 배양물, 조직, 또는 기관과 같은 생물계와 친화될 수 있는 것이다.

"제약학적으로 수용가능한 염"이라는 용어는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 생물학적 효능 및 특성을 가지고, 바람직하지 못한 생물학적 특성 또는 기타의 특성을 갖지 않는 염을 의미한다. 많은 경우에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 아미노 및/또는 카르복시기 또는 이와 유사한 기의 존재에 의해 산성 및/또는 염기성 염을 형성할 수 있다.

제약학적으로 수용가능한 염기의 부가염은 무기염기 및 유기염기로 제조될 수 있다. 무기염기로부터 유도된 염은 예시적으로 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘 염을 포함한다. 유기염기에서 유도된 염은 알킬 아민, 디알킬 아민, 트리알킬 아민, 치환된 알킬 아민, 디(치환된 알킬) 아민, 트리(치환된 알킬) 아민, 알케닐 아민, 디알케닐 아민, 트리알케닐 아민, 치환된 알케닐 아민, 디(치환된 알케닐) 아민, 트리(치환된 알케닐) 아민, 사이클로알킬 아민, 디(사이클로알킬)아민, 트리(사이클로알킬) 아민, 치환된 사이클로알킬 아민, 이치환된 사이클로알킬 아민, 삼치환된 사이클로알킬 아민, 사이클로알케닐 아민, 디(사이클로알케닐)아민, 트리(사이클로알케닐) 아민, 치환된 사이클로알케닐 아민, 이치환된 사이클로알케닐 아민, 삼치환된 사이클로알케닐 아민, 아릴 아민, 디아릴 아민, 트리아릴 아민, 헤테로아릴 아민, 디헤테로아릴 아민, 트리헤테로아릴 아민, 헤테로사이클릭 아민, 디헤테로사이클릭 아민, 트리헤테로사이클릭 아민, 혼합된 디- 및 트리-아민과 같은 1급, 2급, 및 3급 아민의 염을 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 상기 아민에 적어도 2개의 치환기가 상이하고, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 2 또는 3개의 치환기가 아민기의 질소화 함께 헤테로사이클릭 또는 헤테로아릴기를 형성하는 경우 아민도 포함한다.

적합한 아민의 예로는 이소프로필 아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리(이소-프로필)아민, 트리(n-프로필)아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트리메트아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로캐인, 하이드라브아민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코스아민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, 모르폴린, N-에틸피페리딘 등을 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 카르복시산 유도체, 예를 들면 카르복스아미드, 저급 알킬 카르복스아미드, 디알킬 카르복스아미드 등을 포함하는 카르복시산 아미드는 본 발명의 실시에 유용할 것이다.

제약학적으로 수용가능한 산 부가염은 무기산 및 유기산으로부터 제조될 수 있다. 무기산에서 유도된 염은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기산에서 유도된 염은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루빈산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레인산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 계피산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔-술폰산, 살리사이클산 등을 포함한다.

"IGF-Ⅱ 유전자" 또는 "인슐린유사 성장인자 Ⅱ"라는 용어는 IGF-Ⅰ 또는 IGF-Ⅱ 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 의미한다. 바람직하게 IGF-Ⅱ 유전자는 도 11A-D에 설정된 엑손 4, 5, 6, 또는 7-9의 서열과 대체로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 가진 하나 이상의 영역을 포함한다.

"상보적인"이라는 용어는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열이 표적 서열, 즉 IGF-Ⅱ 유전자(또는 mRNA)와 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 생리적 조건하에서, 예를 들면 Watson Crick 염기쌍 짝짓기(올리고뉴클레오타이드와 단일 가닥 핵산사이의 상호작용)에 의해 또는 Hoogsteen 염기쌍 짝짓기(올리고뉴클레오타이드와 이중 가닥 핵산 사이의 상호작용)에 의해 또는 올리고뉴클레오타이드가 RNA에 연결되는 경우, 유사매듭(pseudoknot)의 형성을 유발하도록 하는 기타 수단에 의해 바람직하게 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 핵산에 결합된다. 생리학적 조건하에서 Watson-Crick 또는 Hoogsteen 염기쌍 짝짓기에 의한 결합은 핵산 서열의 작용의 간섭을 관찰하여 실질적으로 측정된다.

바람직하게 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 표적서열에 대하여 몇몇 염기의 갭 또는 부정합(mismatch)만이 허락되는 적어도 약 75%가 표적서열과 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%가 동일하고, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 표적 서열과 동일하다. 동일성은 예를 들면 University of Wisconsin Computer Group (GCG) 소프트웨어의 BLASTN 프로그램에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 적어도 45℃, 바람직하게 적어도 약 50℃, 그리고 가장 바람직하게 적어도 약 55℃에서 IGF-Ⅱ mRNA에 혼성되어, 본 명세서에서 기재된 OLIGO Primer Analysis Software, version 5.0 프로그램에 의해 측정된다.

"성장의 저해"라는 용어는 적어도 한가지 유형의 종양 세포의 성장을 바람직하게 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 50%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 75% 감소하거나 저해한다는 것을 의미한다. 종양의 성장의 저해는 누드 마우스에서 종양의 크기를 측정하거나 실험실내에서 콜로니 형성에 대한 종양세포의 무능력을 측정하여 결정할 수 있다.

"전이의 저해"라는 용어는 전이성 종양의 수를 바람직하게 적어도 10%, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 50% 감소하거나 저해한다는 것을 의미한다. 이것은 실시예 및 종래에 공지된 다른 방법에 설정된 방법에 의해 결정된다.

"IGF-Ⅱ의 발현의 저해"라는 용어는 올리고뉴클레오타이드를 세포에 투여한 경우 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 세포에 의해 생산된 IGF-Ⅱ mRNA의 수준 또는 IGF-Ⅱ 단백질의 수준을 감소시킨다는 것을 의미한다.

"포유류" 또는 "포유류의"라는 용어는 인간, 양, 소, 말, 백조, 개, 고양이 및 생쥐 등을 포함하는 모든 포유류를 의미하나, 바람직하게는 인간을 의미한다.

"종양을 가진 것으로 의심되는 포유류"라는 용어는 증식성 이상 또는 종양을 가지고 있을 수 있는 포유류, 증식성 이상 또는 종양을 가진 것으로 진단된 포유류, 또는 증식성 이상 또는 종양으로 이전에 진단된 적이 있고 종양이 수술에 의해 제거되었으나 포유류에 종양 세포가 조금 잔류하는 것이 의심되는 포유류를 의미한다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제조

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종래의 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면 올리고뉴클레오타이드는 고상 합성법, 특히 캐나다의 Mississauga 소재의 Applied Biosystems Canada Inc.사에서 시판하는 장치와 같은 시제품을 사용하여 제조될 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 본 기술분야에서 공지된 방법으로 천연적으로 발생하는 IGF-Ⅱ 유전자의 효소 소화에 의해 제조될 수도 있다.

올리고뉴클레오타이드는 Uhlmann 등(21)과 Agrawal 등(22)에 의해 개시된 수동 또는 자동 합성기를 실행할 수 있는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포에이트 화학과 같은 본 기술분야에 공지된 방법으로 제조될 수도 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드의 분리 및 정제

원하는 경우에는 여과, 추출, 결정화, 칼럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피, 후(厚)막 크로마토그래피, 저압 또는 고압 제조용 액체 크로마토그래피, 또는 이들을 조합한 방법과 같은 적합한 분리법 또는 정제법을 사용하여 본 명세서에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 효과적으로 분리 및 정제할 수 있다. 물론, 이 밖의 다른 동등한 분리법 및 정제법이 사용될 수도 있다.

안티센스 올리고뉴크레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 제작할 수 있다.

당업자는 안티센스 올리고뉴크레오타이드 서열이 바람직하게 전사되는데 필요한 모든 발현성분을 함유하는 벡터를 제작할 수 있다. 따라서, 본 발명은 안티센스 올리고뉴크레오타이드를 코딩하는 서열에 효과적으로 결합된 전사조절 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 적합한 전사 및 번역요소는 박테리아, 균류, 바이러스, 포유류, 또는 곤충의 유전자와 같은 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 적합한 요소의 선택은 선택되는 숙주세포에 따라 좌우된다.

리포터 유전자를 벡터에 포함시킬 수 있다. 적합한 리포터 유전자는 β-갈락토시다제(예를 들면, lacZ), 클로람페니콜, 아세틸-트랜스퍼라제, 개똥벌레 루시퍼라제, 또는 면역글로불린 또는 이들의 부위를 포함한다. 안티센스 올리고뉴크레오타이드의 전사는 리포터 유전자의 발현을 모니터링하여 관찰할 수 있다.

벡터는 본 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 하나를 사용하여 세포 또는 조직에 주입할 수 있다. 이러한 방법들은 Sambrook et al.²⁴; Ausubel et al.²⁵; Chang et al.³⁶; Vega et al.³⁷; 및 Vectors; A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses³⁸에 기재되어 있으며, 예를 들면 재조합 바이러스 벡터의 안정된 또는 순간적(transient) 트랜스펙션, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 및 감염이 있다.

감염에 의한 핵산 주입은 여러 가지 장점을 제공하는데, 조직의 유형에 대하여 높은 효능 및 특이성이 얻어질 수 있다. 통상적으로, 바이러스는 특정한 유형의 세포에 특이적으로 감염되어 증식한다. 따라서, 생체내 특정한 유형의 세포 또는 조직 또는 세포의 혼합 배지 내에 벡터를 주입하는 데는 바이러스의 특이성이 사용될 수 있다. 또한, 바이러스 벡터를 특정한 리셉터 또는 리간드를 가지도록 변형시킴으로써 리셉터 매개 작용을 통한 표적 특이성을 변화시킬 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 mRNA를 절단하는 리보자임일 수 있다. 리보자임은 본 발명의 올리고뉴크레오타이드 서열과 상동한 서열 및 mRNA 절단에 필요한 촉매중심을 가지는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상동 리보자임 서열은 IGF-Ⅱ mRNA를 파괴하는 것으로 선택할 수 있다. 본 발명에 사용되는 리보자임의 유형은 본 기술분야에 공지된 유형으로부터 선택할 수 있다. 몇몇 리보자임은 담배의 링스폿(ringspot) 바이러스의 위성 RNA(sTRSV)의 네거티브 가닥으로부터 유래되는 헤어핀 리보자임, 인트론 Ⅰ그룹, RNase P, 간염 델타 바이러스 리보자임, 및 해머해드 리보자임을 포함하는 구조군으로 동정되었다(Sullivan 1994, U.S. Patent No. 5,225,347³⁹). 해머해드(hammerhead) 및 헤어핀 리보자임 모티브는 유전자 치료를 위한 mRNA의 트랜스 절단에 가장 보편적으로 사용된다(Sullivan 1994). 본 발명의 용도로는 헤어핀 리보자임이 바람직하다. 일반적으로, 리보자임은 30개 내지 100개의 뉴클레오타이드에 해당하는 길이를 갖는다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 불용화될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드를 적합한 담체에 결합시킬 수 있다. 적합한 담체의 예로는 다음과 같은 것들이 있다: 아가로스, 셀룰로오스, 덱스트란, 세파덱스, 세파로스, 카르복시메틸 셀룰로오스 폴리스티렌, 여과지, 이온-교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리 비드, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레인산 코폴리머, 아미노산 코폴리머, 에틸렌-말레인산 코폴리머, 나일론, 실크 등. 담체의 형태는 예를 들면 튜브, 테스트 플레이트, 비드 디스크, 구형 등일 수 있다.

불용화 올리고뉴클레오타이드는 공지된 화학적 방법 또는 물리적 방법, 예를 들면 시아노겐 브로마이드 커플링법을 사용하여 적합한 불용성 담체와 물질을 반응시켜 제조할 수 있다.

약제의 제조

제약학 분야에서 적용되는 경우, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 제약학적 조성물의 형태로 투여한다. 이러한 화합물은 경구, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 및 비강내 경로를 포함하는 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 주사용 및 경구용 조성물로 효과적이다. 이러한 조성물은 제약분야에 공지된 방법에 의하여 제조되며 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다. 제약학적 조성물은 예를 들면 정맥내 투여된다. 제약학적 조성물은 치료하고자 하는 종양에 직접 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제에 결합된 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물 제조에서, 활성 성분은 일반적으로 부형제와 혼합되거나 부형제로 희석시켜 캡슐, 사시에낭(sachet), 페이퍼, 또는 기타 용기형태의 담체 내에 봉합된다. 부형제가 희석제로서 제공되는 경우, 활성 성분을 위한 운반체, 담체 또는 매질로 작용하며, 고체, 반고체, 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서, 제약학적 조성물은 정제, 환약, 분말, 구중정, 사시에낭, 카시에낭(cachet), 엘리시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸(고체 또는 액체 매질), 예를 들면 10 중량% 이하의 활성 화합물을 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌약, 살균 주사액, 및 살균포장 분말 형태일 수 있다.

제제의 제조 시에, 활성 화합물은 다른 성분과 혼합하기 전에 분쇄하여 적합한 크기의 입자로 만들어야 하는 경우도 있다. 활성 화합물이 실질적으로 불용성인 경우에는 보통 200 메쉬 이하의 입자 크기로 분쇄한다. 활성 화합물이 실질적으로 수용성인 경우에는 제제 내에서 실질적으로 균일한 분포를 하도록 예를 들면 약 40 메쉬의 크기로 분쇄하는 것이 일반적이다.

적합한 부형제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 트래거컨트, 겔라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 살균수, 시럽, 및 메틸 셀룰로오스가 있다. 제제는 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 에멀젼화제 및 현탁제; 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트와 같은 보존제; 감미제; 및 향미제와 같은 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 투여후, 공지된 방법에 의하여 활성 성분이 신속 또는 지속적으로 방출되거나 방출이 지연되도록 조제될 수 있다.

상기 조성물은 단위 용량 형태로 조제하는 것이 바람직하며, 각 단위 용량당 약 1% 내지 95%, 일반적으로는 약 5% 내지 약 90%의 활성성분을 함유하는 것이 바람직하다. "단위 용량 형태"란 사람 또는 기타 포유류의 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하는 것으로서, 각 단위당 적합한 약제 부형제와 혼합된 바람직한 치료효과를 발휘하도록 산출된 유효량의 활성성분이 함유된다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이며, 일반적으로는 제약학적 유효량으로 투여된다. 유효량이란 투여 시에 증상을 완화시키는 함량으로서, 종양세포의 성장을 억제할 수 있는 함량이 바람직하다. 유효량은 체중의 단위 kg당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg이 바람직하다. 그러나, 실제 투여되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 함량은 치료 조건, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물, 환자 개인의 연령, 체중, 및 반응성, 병의 경중을 포함하는 관련 상황을 고려하여 의사에 의해서 결정될 것이다. 치료 과정은 수일에서 수개월 또는 병이 완화될 때까지 지속될 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다른 공지된 치료와 함께 투여할 수도 있다. 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여하는 경우에는 올리고뉴클레오타이드는 다른 치료제와 동시에 또는 후속하여 투여할 수도 있다. 후속하여 투여하는 경우, 담당 의사는 다른 치료제와 함께 하는 올리고뉴클레오타이드의 적합한 투여 순서를 결정할 수 있을 것이다.

정제와 같은 고형 조성물을 제조하는 경우에는 주요 활성 성분/안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제약학적 부형제와 혼합하여 본 발명의 화합물의 균질 혼합물을 함유하는 고형 예비조제 조성물을 제조한다. 이러한 예비조제 조성물이 균질하다는 것은 활성성분이 조성물 전반에 걸쳐 균일하게 분산되어 조성물이 정제, 환약, 및 캡슐과 같이 균일하게 효과적인 단위 용량의 형태로 쉽게 분할될 수 있음을 의미하는 것이다.

본 발명의 정제 또는 환약은 코팅되거나 다른 방법으로 혼합되어 약효의 지속 효과를 제공하는 용량의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 정제 또는 환약은 내부 성분 및 외부 성분을 포함할 수 있으며, 이때 외부 성분은 내부 성분을 둘러싸는 형태가 된다. 장층(entric layer)을 사용해 두 성분을 분리하면, 위장에서 분해되는 것을 방지하고 내부 성분이 손상되지 않은 상태로 십이지장으로 들어가게 하거나 방출을 지연시킬 수 있다. 이러한 장층 또는 코팅제로는 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 물질의 예로는 다양한 폴리머 산 및 폴리머 산과 셀락, 세틸 알콜, 및 셀룰로오스 아세테이트의 혼합물이 있다.

본 발명의 경구 투여 또는 주사용 조성물에 혼합될 수 있는 액체 형태로는 엘리시르 및 유사한 약제 운반체 외에도 수용액, 적합하게 가미된 시럽, 수계 또는 오일 현탁액, 및 옥수수유, 목화씨유, 참기름, 코코넛유, 또는 땅콩유와 같은 식용 오일을 함유하는 향미 에멀젼이 있다.

흡입 또는 취입용 조성물은 제약학적으로 수용가능한 형태의 용액 및 현탁액, 수계용매 또는 유기용매, 또는 이들의 혼합물, 및 분말을 포함한다. 액상 또는 고형 조성물은 상기에 기재된 제약학적으로 수용가능한 적합한 부형제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 국부 작용 또는 전신 작용을 위하여 경구 또는 비강내 호흡경로를 통해 투여되는 것이 바람직하다. 제약학적으로 수용가능한 용매 형태의 조성물은 불활성 기체를 사용하여 분무할 수 있다. 분무 용액은 분무기로부터 직접 흡입될 수 있고, 분무 장치를 안면 마스크 텐트 또는 간헐적으로 양압을 주입하는 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액, 또는 분말 조성물은 알맞은 방식으로 제제를 운반하는 장치로부터 경구 또는 비강내 경로를 통해 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제약학적 조성물은 집합 형태에서 수용액 내에 존재하는 마이셀, 불용성 단일층, 액정 또는 라멜라층에 존재하는 지질과 같은 양쪽통과성 제제와 함께 기타 제약학적으로 수용가능한 캐리어에 첨가하여 올리고뉴클레오타이드 혼합된 리포좀의 형태일 수도 있다. 리포좀으로 적합한 지질로는 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 황화물, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 특히 유용한 지질 담체는 리포펙틴이다. 상기 리포좀 제제의 제조는 본 기술 분야에서 공지된 기술수준 내에 있는 것으로 예를 들면 국제 특허 공보 제WO97/21808호(28)에 개시되어 있다. 제약학적 조성물은 사이클로덱스트린 및 올리고뉴클레오타이드의 세포내 운반을 향상시키거나 폴리머의 분비를 지연하는 화합물을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 바람직한 제제는 경피투여 장치("패치")를 사용한다. 이러한 경피 패치를 사용하면 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 소정의 함량으로 연속 또는 불연속 주입할 수 있다. 약제의 운반을 위한 경피 패치의 제조 방법 및 용도는 본 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본 명세서에 인용된 미국특허 제5,023,252호⁴⁰를 참조할 수 있다. 이러한 패치는 약제의 운반을 연속적 또는 맥동성으로 또는 요구에 따라 운반하는 형태로 제작될 수 있다.

또 다른 바람직한 전달 방법으로는 피부층을 통하여 무처리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 "신탄(shotgun)" 전달법이 있다. "무처리된(naked)" 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 전달법은 본 기술분야에 널리 공지된 것으로서, 본 명세서에 참고로 인용된 Felgnet 등의 미국특허 제5,580,859호⁴¹를 참조할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 "신탄" 전달하기 전에 지질 담체 내에 포장할 수도 있다.

하기 제형 실시예는 본 발명의 대표적인 제약학적 조성물을 설명하기 위한 것이다.

제형 실시예 1

다음의 성분을 함유하는 경질 젤라틴 캡슐을 제조하였다:

성 분 함 량(mg/캡슐)

활성성분 30.0

전분 305.0

마그네슘 스테아레이트 5.0

상기 활성성분을 혼합하여 340 mg의 경질 젤라틴 캡슐에 충전하였다.

제형 실시예 2

다음의 성분을 사용하여 정제를 제조하였다:

성 분 함 량(mg/정제)

활성성분 25.0

미세결정성 셀룰로오스 200.0

콜로이드질 이산화규소 10.0

전분 5.0

상기 성분들을 혼합하여 압착하고 각각 240 mg 중량의 정제를 제조하였다.

제형 실시예 3

다음의 성분을 함유하는 건조 분말 흡입제를 제조하였다:

성 분 중 량 %

활성성분 5

락토오스 95

상기 활성성분을 락토오스와 혼합하고, 그 혼합물을 건조 분말 흡입기에 첨가하였다.

제형 실시예 4

각각 30 mg의 활성성분을 함유하는 다음과 같은 정제를 제조하였다:

성 분 함 량(mg/정제)

활성성분 30.0 ㎎

전분 45.0 ㎎

미세결정성 셀룰로오스 35.0 ㎎

폴리비닐피롤리돈

(10% 살균수의 수용액) 4.0 ㎎

소듐 카르복시메틸 전분 4.5 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.5 ㎎

탈크 1.0 ㎎

전 체 120 mg

활성성분, 전분, 및 셀룰로오스를 No. 20 메쉬 U.S. 시브를 통과시켜 고르게 혼합하였다. 얻어진 분말에 폴리비닐피롤리돈 용액을 혼합한 뒤, 16 메쉬 U.S. 시브를 통과시켰다. 이렇게 제조된 입자를 50 내지 60℃에서 건조시킨 다음, 16 메쉬 U.S. 시브를 통과시켰다. 소듐 카르복시메틸 전분, 마그네슘 스테아레이트, 및 탈크를 No. 30 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 상기 입자에 첨가하여 혼합한 뒤, 정제 장치 상에서 압착하여 각각 120 mg 중량의 정제를 제조하였다.

제형 실시예 5

각각 40 mg의 약제를 함유하는 다음과 같은 캡슐을 제조하였다:

성 분 함 량(mg/캡슐)

활성성분 40.0 mg

전분 109.0 mg

마그네슘 스테아레이트 1.0 mg

전 체 150.0 mg

활성성분, 전분, 및 마그네슘 스테아레이트를 혼합하고 No. 20 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 150 mg 중량의 경질 젤라틴 캡슐에 충전하였다.

제형 실시예 6

각각 25 mg의 활성성분을 함유하는 다음과 같은 좌약을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 25 mg

포화 지방산 글리세라이드 2,000 mg

활성성분을 No. 20 메쉬 U.S. 시브로 통과시킨 다음, 필요한 최소량의 열을 사용하여 미리 용융시킨 포화 지방산 글리세라이드에 현탁시켰다. 얻어진 혼합물을 2.0 g 용량의 좌약 주형에 넣고 냉각하였다.

제형 실시예 7

5.0 ㎖의 용량당 각각 50 mg의 약제를 함유하는 다음과 같은 현탁액을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 50.0 mg

크산탄검 4.0 mg

소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(11%)

미세결정성 셀룰로오스(89%) 50.0 mg

설탕 1.75 mg

소듐 벤조에이트 10.0 mg

향료 및 염료 q.v.

정제수 5.0 ㎖

활성 성분, 설탕, 및 크산틴 고무를 혼합하여 No. 10 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 미리 만들어둔 미세결정성 셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 수용액과 혼합하였다. 소듐 벤조에이트, 향료, 및 착색제를 약간의 물로 희석시키고 교반하면서 첨가하였다. 그런 다음, 충분한 량의 물을 첨가하여 원하는 부피로 만들었다.

제형 실시예 8

성 분 함 량(mg/캡슐)

활성성분 15.0 mg

전분 407.0 mg

마그네슘 스테아레이트 3.0 mg

전체 425.0 mg

활성 성분, 전분, 및 마그네슘 스테아레이트를 혼합하여, No. 20 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 425.0 mg 함량의 경질 젤라틴 캡슐에 충전하였다.

제형 실시예 9

다음과 같이 제형을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 5.0 mg

옥수수유 1.0 ㎖

제형 실시예 10

다음과 같이 국부용도의 제형을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 1 - 10 g

에멀젼화 왁스 30 g

액상 파라핀 20 g

백색 연질 파라핀 100 g으로 채움

백색의 연질 파라핀을 가열하여 용융시켰다. 액상 파라핀 및 에멀젼화 왁스를 혼합하고 교반하여 용해시켰다. 활성성분을 첨가하고 분산될 때까지 교반을 계속하였다. 그런 다음, 혼합물을 냉각시켜 고체상태로 만들었다.

본 발명의 용도로 적합한 다른 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences(23)에서 찾아볼 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제약학적 조성물은 적합한 용기로 포장된 필수 물질을 제공하는 편리한 키트로 포장될 수 있다.

질병, 이상증 및 종양 성장과 관련된 증상을 치료하는데 치료학적 제제의 형태의 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 유용하다. 상기 방법에서는, IGF-Ⅱ의 태아의 전사체 발현을 저해하는 치료학적 유효량이 세포에 투여된다. 상기 세포는 세포 배양물의 일부, 조직 배양물의 일부 또는 인간과 같은 포유류의 전신의 일부가 될 수도 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임은 종양세포의 성장을 조절한다. 따라서, 본 발명은 종양 또는 종양세포를 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는 포유류내 종양세포의 성장을 방해 또는 억제하는 방법을 제공한다.

"접촉"이란 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 등을 세포 현탁액 또는 조직 샘플에 첨가하거나 올리고뉴크레오타이드를 직접 또는 간접적으로 동물의 세포 또는 조직에 투여하는 것을 의미한다.

상기 방법은 다음과 같은 다양한 암 또는 종양 형태를 포함하는 증식성 이상에 사용될 수 있다: 백혈병, 림프종(Hondgkins and non-Hondgkins), 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 저산소성 종양, 경구, 인후, 후두, 및 허파의 낙설성(squamous) 세포 암종, 경부암 및 방광암과 같은 비뇨기 암, 조혈성 암, 결장암, 유방암, 췌장암, 신장암, 뇌암, 피부암, 간암, 머리 및 목 부분의 암, 및 신경계 암뿐 아니라 유두종과 같은 양성 장애. 기타 증식성 이상으로는 건선, 동맥경화증 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 내약성 종양의 치료에도 사용될 수 있다. 내약성 종양의 예로는 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 메토트렉세이트 또는 히드록시우레아와 같은 화학요법제에 대하여 내성을 가지는 종양 및 콜히친(colchicine), 빈블라스틴(vinblastine), 및 독소루비신(doxorubicin)과 같은 다양한 항암제에 대한 내성을 부여하는 것으로 알려진 P-글리코단백질이 높은 수준으로 발현되는 종양; 또는 Dreeley 등(28)에 의하여 보고된 다중-약제 내성 단백질을 발현시키는 종양이 있다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 공지된 항암 화합물 또는 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제는 종양의 성장을 억제할 수 있는 화합물들이다. 이러한 제제로는 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 메토트렉세이트, 및 히드록시우레아가 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 화학요법제의 함량은 유효량, 즉 종양의 성장을 억제하기에 충분한 함량, 또는 유효량 이하로 할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 C8161 흑색종 세포와 같은 전이성 종양의 성장을 저해한다는 것이 알려져 있다. 본 발명의 실시예에서 제공되는 포유류의 전이성 종양성장 감소방법은, 포유류의 태아 IGF-Ⅱ mRNA의 5' 미해독 부위에 상보적인 서열을 포함하는 약 3 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함한다. 서열은 표 1에 나타난 올리고뉴클레오타이드의 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시예에서 제공된 포유류에서 전이성 종양성장 감소방법은, 표 2에 나타난 SEQ ID NO: 17-31을 포함하는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함한다.

상기 올리고뉴클레오타이드는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 투여할 수 있다. 서열은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 세포 내에서 발현되는 카세트 또는 구조체와 결합될 수 있다. 상기 구조체는 올리고뉴클레오타이드를 세포 내에서 전사시킬 수 있는 적합한 전사조절 부분을 함유한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 서열에 유효하게 결합된 전사조절 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 벡터로 형질변환된 적합한 진핵세포 또는 원핵세포로부터 선택되는 숙주세포를 제공한다.

적합한 벡터는 공지된 것으로서, 상기 서열을 바람직하게 전사시키는데 필요한 모든 종류의 발현성분을 함유하는 것이 바람직하다. 플라스미드 또는 박테리오파지 벡터로 사용될 수 있기 때문에 파지미드(phagemide)가 유용한 벡터의 특정 예가 된다. 벡터의 예로는 박테리오파지와 같은 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스, DNA 바이러스, 리포좀, 및 기타 재조합 벡터가 있다. 상기 벡터는 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에 사용되는 요소를 함유할 수도 있다. 당업자는 숙주 시스템이 특정한 벡터와 상용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

상기 벡터는 재조합 바이러스 벡터의 안정된 또는 순간적 트랜스펙션, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 및 인펙션을 통해 세포로 주입될 수 있다.

벡터의 안전성을 강화하고 치료효과를 높이기 위하여 추가의 요소가 벡터에 첨가될 수 있다. 이러한 요소의 예로는 재조합 바이러스로 감염된 세포에 대하여 음성적으로 선택하는데 사용될 수 있는 마커를 포함한다. 이러한 음성적 선택 마커의 예로는 항바이러스 강시클로비어(gancyclovir)에 대한 특이성을 제공하는 TK 유전자가 있다. 특정한 유형의 세포 발현을 제한하는 요소가 포함될 수도 있다. 이러한 요소의 예로는 원하는 유형의 세포에 대하여 특이적인 프로모터 및 조절요소를 포함한다.

생체내 주입용으로 유용한 벡터의 다른 예로는 레트로바이러스 벡터가 있으며, 상기 바이러스는 측면(lateral) 감염 및 표적 특이성과 같은 장점을 제공한다. 측면 감염은 단일 감염된 세포가 이웃 세포에 감염되는 많은 자손 비리온(virion)을 생산하는 과정이며, 결과적으로 넓은 영역이 신속하게 감염될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 벡터는 표적화되는 세포 유형에 따라 선택할 수 있다. 예를 들면, 유방암 세포를 치료하고자하는 경우에는 상피세포에 대하여 특이적인 벡터가 사용될 수 있으며, 마찬가지로 조혈계 세포를 치료하고자 하는 경우에는, 혈액 세포에 대하여 특이적인 바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

유용성

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포유류 세포 내에서의 IGF-Ⅱ 유전자의 발현을 저해하는데 사용하면 이들 세포의 성장을 억제할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 포유류 세포 내에서 IGF-Ⅱ mRNA의 존재를 검출하기 위한 혼성화 프로브로 사용할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 이러한 용도로 사용되는 경우에는, 적합한 검출 그룹(예를 들면, 방사성 동위원소, 리간드, 기타 바이오틴과 같은 특이적 결합쌍 멤버)으로 올리고뉴클레오타이드를 표지할 수 있다. 마지막으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 분자량 마커로 사용될 수도 있다.

본 발명의 특징 및 장점은 하기 실시예를 통해 보다 상세히 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 청구의 범위를 어떠한 의미로도 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예에서, 모든 온도는 섭씨 온도(달리 지정하지 않는 경우)이고, 모든 분율은 중량%(달리 지정하지 않는 경우)이다.

이하의 실시예에서, 모든 약어는 하기의 의미를 갖는다. 약어가 정의되지 않는 경우에는 일반적으로 받아들여지는 의미를 갖는다.

AS = 안티센스

cDNA = 상보적인 데옥시리보핵산

ODN = 올리고데옥시뉴클레오타이드

μM = 마이크로몰

mM = 밀리몰

M = 몰

㎖ = 밀리리터

㎕ = 마이크로리터

mg = 밀리그램

㎍ = 마이크로그램

PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

rpm = 단위 시간당 회전수

ΔG = 자유에너지, 올리고뉴클레오타이드 이중쇄의 안정도 측정값

kcal = 킬로칼로리

FBS = 소의 태아 혈청

DTT = 디티오트리에톨

SDS = 소듐 도데실 설페이트

PBS = 포스페이트 완충 식염수

PMSF = 페닐메틸술포닐 플루오라이드

GAPDH = 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제

IgG = 면역글로블린 G

kDa = 킬로달톤

PCR = 폴리머라제 연쇄 반응

Tris-HCl = 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-염산

TRIzol = 총 RNA 분리시약

ECL = 웨스턴 블롯 검출 시약

IGF-Ⅰ = 인슐린유사 성장 인자 Ⅰ

IGF-Ⅱ = 인슐린유사 성장인자 Ⅱ

UTR = 미해독 부위

분자생물학적에서의 표준 방법:

특정하여 설명하지 않은 본 기술분야에 공지된 분자생물학적 표준 방법은 Sambrook et al.²⁴; Ausubel et al.²⁵; 및 Perbal²⁶에 따르는 것이 일반적이다.

올리고뉴클레오타이드

이중쇄 형태, 헤어핀 형태, 및 호모올리고머/서열 반복의 가능성은 가능한 한 작고, IGF-Ⅱ mRNA 서열에 결합할 수 있는 가능성이 큰 IGF-Ⅱ mRNA에 상보적인 서열로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하였다. 또한, 사람 및 생쥐에게서 자주 나타나는 기타 반복서열에 대한 그릇된 프라이밍을 제거하였다. 이러한 특성은 컴퓨터 모델링 프로그램 OLIGO™ Primer Analysis Software, Version 5.0(International Bioscience, Inc. Plymouth MN)을 사용하여 측정하였다. 이 분석을 참조하여 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 설계되고, 본 기술분야에서 잘 공지된 방법으로 제조되었다.

세포주

배아의 횡문근육종(RD), 신경아세포종(SK-N-AS), Wilms' 종양(G401), 흑색종(C8161), 인간 전립선 선암종(PC-3), 전이성 췌장 선암종(AsPC-1)을 포함하는 5종류의 상이한 인간 암 세포주를 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 구입하였다. 세포주는 10%의 소의 태아 혈청(FBS)이 보충된 α-MEN 배양액(Gibco BRL, Gaithersburg, ND)에 보관하였다.

실시예 1

IGF-Ⅱ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한

암세포주의 성장 억제

상기에 기재된 방법(Choy et al.¹⁸)을 사용하여 여러 가지 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 암세포주의 콜로니 형성 능력을 측정하였다. 특히, 종양 세포의 현탁액을 분취하여 대략 1×10⁴밀도로 60 ㎜의 조직배양 디시에 첨가하고 37℃에서 10%의 FBS가 보충된 α-MEM 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 5 ㎖의 PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고, 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)의 존재 하에서 4시간 동안 0.2 μM의 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다. PBS로 세포를 한차례 세척하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제거하고 37℃, 성장배지(10%의 FBS가 보충된 α-MEM 배지)에서 7일 내지 10일 동안 세포를 배양하였다. 메틸렌 블루를 사용하여 콜로니를 염색하고 상기에 기재된 바와 같이(Choy et al.¹⁸및 Huang and Wright²⁰) 콜로니를 직접 계측하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 존재하지 않는 배지에서 배양된 콜로니 수와 비교하여 억제율(%)을 계산하였다. 모든 실험은 4번씩 반복하였다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 종양 세포주의 콜로니 형성 능력을 억제하는 효과를 나타내었다. 도 2A는 횡문근육종(RD)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이고; 도 2B는 인간 전립선암 세포주(PC-3)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이며; 도 2C는 인간 췌장암 세포주(AsPC-1)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이며; 도 2D는 인간 섬유아세포종 세포주(SK-N-AS)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이다.

실시예 2

IGF-Ⅱ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리후

mRNA의 수준 감소

인간 섬유아세포종 세포(SK-N-AS) 또는 횡문근육종 세포(RD)를 융합(70 내지 80%)될 때까지 동시 배양하여 IGF-Ⅱ에 상보적인 0.2 μM의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL) 및 Opti-MEM(Gibco-BRL)의 존재 하에서 4시간 동안 배양하였다. PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고 10%의 FBS가 보충된 α-MEM(Gibco-BRL) 배지에서 16시간 동안 배양하였다. TRIzol 시료(Gibco BRL, Gaithersburg MD) 내에서 전체 RNA를 제조하여 Hurta 및 Wright(27)에 기재된 바에 약간의 수정을 가하여 노던 블롯으로 분석하였다. 전방향 프라이머(5'-TAC CGC CCC AGT GAG ACC CT-3')[SEQ ID NO: 32], 역방향 프라이머(5'-TGA CGT TTG GCC TCC CTG AA-3')[SEQ ID NO: 33] 및 인간 직장결장 선암종 5'-스트레치 플러스 cDNA 라이브러리(미합중국 캘리포니아주의 Palo Alto 소재의 Clonetech)를 템플레이트(template)으로 사용하여 합성된³²P-표지된 389 bp PCR 단편과 블롯을 혼성화시켰다. 인간 IGF-Ⅱ mRNA를 ∼6kb 뉴클레오타이드 전사체(Werner et al⁶)로 발현시켰다. 동일한 RNA의 로딩은 혼성화하기 전에 블롯의 메틸렌 블루 염색으로 설명하였다.

도 3은 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 대조군 세포에 비하여 IGF-Ⅱ mRNA의 수준을 적어도 50% 가량 감소시켰음을 보여준다.

실시예 3

IGF-Ⅱ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리후

IGF-Ⅱ단백질 수준의 감소

인간 섬유아세포종 세포(SK-N-AS) 또는 횡문근육종 세포(RD)를 융합(70 내지 80%)될 때까지 배양하여 IGF-Ⅱ에 상보적인 0.2 μM의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL) 및 Opti-MEM(Gibco-BRL)의 존재 하에서 4시간 동안 배양하였다. PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고 10%의 FBS가 보충된 α-MEM(Gibco-BRL) 배지에서 20시간 동안 배양하였다. 2X 샘플 로딩 완충용액(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.2 M DTT, 4% SDS, 20% 글리세롤, 및 0.015% 브로모페놀 블루) 내에서 완전한 세포의 단백질 추출물을 제조하기 전에 처리 및 배양을 한번 이상 반복하였다.

웨스턴 블롯 분석은 상기에 기재된 방법(Choy et al.(18) 및 Fan et al.(19))을 약간 변형시킨 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. 항-IGF-Ⅱ 항체(1 내지 2 ㎍/㎖)(Research DiagNOtic Inc., Flanders NJ.)를 사용하여 IGF-Ⅱ의 발현을 검출한 뒤, 1:7,000으로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항염소 IgG(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 검출하였다. ECL(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의하여 대략 7.5 kDa의 단백질이 가시화되었다.

도 4는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리한 후 인간 섬유아세포종 세포에서 IGF-Ⅱ 단백질의 감소를 도시한다.

도 5는 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리한 후 인간 횡문근육종 세포에서 IGF-Ⅱ 단백질의 감소를 도시한다.

실시예 4

IGF-Ⅱ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 정맥내 처리에 의한 생쥐내 인간 종양세포의 성장 억제

Charles River Laboratories(Montreal, Canada)로부터 CD-1 무흉선 누드 마우스를 구입하였다. 6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 SK-N-AS 인간 신경아세포종 세포주(통상, 100 ㎕의 PBS 내에 3×10⁶세포)를 주입하였다. 각 실험군에는 5마리의 생쥐가 배정하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 6일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 식염수를 주입하였다. 통상적으로, 그후 14일 동안 치료를 계속하였다.

도 6A는 CD-1 누드 마우스 내에서의 인간 섬유아세포종 종양 성장에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과를 나타낸 것이다. 14일에 걸쳐 평균 이틀 간격으로 캘리퍼를 사용하여 측정한 종양의 크기 감소로 항종양 활성을 측정하였다. 도면상의 각각의 점은 실험군당 5마리의 생쥐로부터 측정한 종양의 평균 크기를 나타낸 것이다. 공분산을 이용하여 각각의 치료군내에서 시간에 따른 생쥐의 회귀곡선을 비교 분석하였다. 이 같은 분석을 통해 기울기가 동일하거나, 기울기가 같은 경우 절편이 동일하다는 가설이 유도되었다. 모든 분석에는 SAS(Statistical Analysis System) 버젼 6.12가 사용되었다. 식염수 대조군과 비교하여도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 투여로 0.0001 이하의 p값으로 종양의 성장을 억제하였다.

치료의 마지막(일반적으로, 마지막 치료 후 24시간 뒤)에 동물을 죽여 종양의 중량을 측정하였다. 도 6B는 종양의 평균 중량을 나타낸 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종양의 성장을 억제하는데 상당히 효과적인 것으로 나타났다. 편차를 원-웨이(one-way) 분석하여 치료군의 평균을 비교하였다. 대략 전체군이 효과가 현저하다면 최소 제곱평균(the least square means)을 사용한 프리오리(priori) 다중 비교를 사용하여 현저한 차이가 있는 쌍의 치료군을 발견하였다. 종양의 중량을 비교한 경우에도, 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 식염수 대조군에 비하여 통계학적으로 유의적인 저해 효과를 나타냈다.

실시예 5

IGF-Ⅱ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 정맥내 처리에 의한

생쥐내 인간 종양세포의 성장 억제

Charles River Laboratories(Montreal Canada)로부터 CD-1 무흉선 누드 마우스를 구입하였다. 6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 G4이 인간 Wilm's 종양세포(통상, 100 ㎕의 PBS 내에 3×10⁶세포)를 주입하였다. 각 실험군에는 5마리의 생쥐가 배정하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 8일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 식염수를 주입하였다. 통상적으로, 그후 18일 동안 치료를 계속하였다.

도 7A는 CD-1 누드 마우스 내에서의 인간 Wilms 종양 성장에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과를 나타낸 것이다. 18일에 걸쳐 평균 이틀 간격으로 캘리퍼를 사용하여 측정한 종양의 크기 감소로 항종양 활성을 측정하였다. 도면상의 각각의 점은 실험 그룹당 5마리의 생쥐로부터 측정한 종양의 평균 크기를 나타낸 것이다. 공분산을 이용하여 각각의 치료군내에서 시간에 따른 생쥐의 회귀 곡선을 비교 분석하였다. 이 같은 분석을 통해 기울기가 동일하거나, 기울기가 같은 경우 절편이 동일하다는 가설이 유도되었다. 모든 분석에는 SAS(Statistical Analysis System) 버젼 6.12가 사용되었다. 식염수 대조군과 비교하여도 6a에 도시된 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 0.0002 이하의 p값으로 종양의 성장을 억제하였다.

치료의 마지막(일반적으로, 마지막 치료 후 24시간 뒤)에 동물을 죽여 종양의 중량을 측정하였다. 도 7B는 종양의 평균 중량을 나타낸 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종양의 성장을 억제하는데 상당히 효과적인 것으로 나타났다. 편차를 원-웨이(one-way) 분석하여 치료군의 평균을 비교하였다. 대략 전체군이 효과가 현저하다면 최소 제곱평균(the least square means)을 사용한 프리오리 다중 비교를 사용하여 현저한 차이가 있는 쌍의 치료군을 발견하였다. 종양의 중량을 비교한 경우에도, 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 식염수 대조군에 비하여 통계학적으로 유의적인 억제 효과가 나타냈다.

실시예 6

IGF-Ⅱ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 정맥내 처리에 의한 생쥐내 인간 종양세포에서 IGF-Ⅱ mRNA 수준의 감소

Charles River Laboratories(Montreal Canada)로부터 CD-1 무흉선 누드 마우스를 구입하였다. 6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 SK-N-AS 인간 신경아세포종 세포(통상, 100 ㎕의 PBS 내에 3×10⁶세포)를 주입하였다. 각 실험군에는 5마리의 생쥐가 배정하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 6일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 식염수를 주입하였다. 생쥐는 7회 주사한 후 희생시켜 동일한 크기의 동양 분획을 절취하여 TRIzol 시약(GIBCO BRL)에 즉시 수집하고 빠르게 균질화하여 mRNA 제제를 제조하였다.

상기에 기재된 방법(Hurta and Wright(27))을 약간 변형시킨 노던 블롯 분석법을 이용하여 IGF-Ⅱ mRNA 수준에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 작용효과를 측정하였다. 전방향 프라이머(5'-TAC CGC CCC AGT GAG ACC CT-3')[SEQ ID NO: 32], 후방향 프라이머(5'-TGA CGT TTG GCC TCC CTG AA-3')[SEQ ID NO: 33], 및 인간 대장결장 선암종 5'-스트레치 플러스 cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 블롯과³²P-표지된 330 bp PCR 단편을 혼성화 시켰다. 인간 IGF-Ⅱ mRNA는 ∼6 kb의 뉴클레오타이드 전사체로 발현되었으며(Werner et al.⁶), 이전에 설명된 바(Hurta and Wright(27))에서와 같이 이의 수준은 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GADPH) mRNA와 비교하였다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드 GTI4006 [SEQ ID NO: 6]으로 처리된 종양에서 IGF-Ⅱ mRNA의 수준이 감소되었다는 것이 도 8에 나타나 있다.

실시예 7

IGF-Ⅱ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 정맥내 처리에 의한 생쥐내 인간 종양세포에서 IGF-Ⅱ 단백질 수준의 감소

Charles River Laboratories(Montreal Canada)로부터 CD-1 무흉선 누드 마우스를 구입하였다. 6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암컷 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 SK-N-AS 인간 신경아세포종 세포(통상, 100 ㎕의 PBS 내에 3×10⁶세포)를 주입하였다. 각 실험군에는 5마리의 생쥐가 배정하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 6일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 식염수를 주입하였다. 7회의 주입후 생쥐를 희생하고 절취된 동일한 크기의 종양 분획을 RIPA 추출 완출용액(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM 레이펩틴)에 즉시 수집하여 빠르게 균질화하여 단백질 제제를 제조하였다.

상기에 기재된 방법(Choy et al.(18) 및 Fan et al.(19))을 약간 변형시킨 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 IGF-Ⅱ 단백질 수준에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 작용효과를 측정하였다. 15% SDS-PAGE 겔상에서 단백질 추출물(10 내지 20 ㎍)을 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 다음, 인디아 잉크로 염색하여 가시화하였다. 항-IGF-Ⅱ 항체(1 내지 2 ㎍/㎖)(미합중국 뉴저지주의 Flanders 소재의 Research Diagnostic Inc.사 제품)를 사용하여 IGF-Ⅱ의 발현을 검출한 뒤, 1:7,000으로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항염소 IgG(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 검출하였다. ELC(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의하여 대략 7.5 kDa의 단백질이 가시화되었다.

종양세포에서 추출된 단백질의 웨스턴 블롯이 도 9에 도시되어 있다. 실험된 각 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종양에서 IGF-Ⅱ 단백질의 수준을 감소시켰다. 인디아 잉크로 염색된 블롯의 일부가 각 라인에 동량 로딩을 설명하기 위해 아래에 표시되어 있다.

실시예 8

안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 실험적인 전이의 저해

이전에 설명된 바(Fan et al., 1996¹⁹)와 같이 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 C8161 인간 흑색종 세포의 실험적 전이를 평가하였다. 세포의 현탁액을 분취하여 대략 2×10⁶밀도로 100 ㎜의 조직배양 디시에 첨가하고 37℃에서 10%의 FBS가 보충된 α-MEM 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 10 ㎖의 PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고, 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL)의 존재 하에서 4시간 동안 0.2 μM의 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다. PBS로 세포를 한차례 세척하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제거하고 세포에 트립신 첨가(trypsinized)하였다. 이후 원심분리하여 세포를 수집하고 6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암컷 누드 마우스의 꼬리 정맥에 PBS 0.1 ㎖에 현탁시킨 1×10⁵세포를 주입하였다. 개별 마우스로부터 폐를 적출하고 피크릭산(picric acid) 염색용액(75% 피크릭산, 20% 포름알데히드, 5% 빙초산)으로 염색한 후 폐종양의 개수의 평가는 5주 후에 실시되었다.

다양한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 종양 세포를 처리한 후 암컷 누드 마우스에서 폐종양의 개수가 감소되었다는 것이 도 10에 도시되어 있다.

Claims

포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA의 5' 미해독 부위에 상보적인 서열을 포함하는, 약 3 내지 약 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,

하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,

IGF-Ⅱ mRNA에 상보적이지 않은 부가적인 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,

서열이 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1-15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
표 2에 기재된 서열 SEQ ID NO: 17-31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 약 20개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제5항에 있어서,

하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제5항에 있어서,

IGF-Ⅱ mRNA에 상보적이지 않은 부가적인 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
포유류 태아의 IGF-ⅡmRNA의 5' 미해독 부위에 상보적인 약 3개 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
표 2에 기재된 SEQ ID NO: 17-31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 약 20개 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA의 5' 미해독 부위에 상보적인 서열을 포함하는, 약 3 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 제약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
제10항에 있어서,

서열이 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1-15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제약학적 조성물.
표 2에 기재된 SEQ ID NO: 17-31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 20개 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 제약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
종양의 성장이 억제되는 조건하에서 포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA의 5' 미해독 부위에 상보적인 서열을 포함하는, 약 3개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 종양성장 억제방법.
제13항에 있어서,

포유류에 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양성장 억제방법.
제13항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 표 1에 기재된 SEQ ID NO: 1-15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양성장 억제 방법.
제13항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 뉴클레아제 내성인 종양성장 억제 방법.
종양의 성장이 억제되는 조건하에서 표 2에 기재된 SEQ ID NO: 17-31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 약 20개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 종양성장 억제방법.
제17항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 뉴클레아제 내성인 종양성장 억제 방법.
제17항에 있어서,

포유류에 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양성장 억제 방법.
종양의 전이가 억제되는 조건하에서 포유류 태아의 IGF-Ⅱ mRNA의 5' 미해독부위에 상보적인 서열을 포함하는, 약 3개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전이성 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에 투여하여 포유류의 종양전이 억제방법.
제20항에 있어서,

포유류에 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양전이 억제방법.
제20항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 뉴클레아제 내성인 종양전이 억제방법.
제20항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 표 1에 기재된 SEQ ID NO:1-15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양전이 억제방법.
종양의 전이가 억제되는 조건하에서 표 2에 기재된 SEQ ID NO: 17-31로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 약 20개 내지 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전이성 종양을 가진 것으로 의심되는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 종양전이 억제방법.
제24항에 있어서,

포유류에 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양전이 억제방법.
제25항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 뉴클레아제 내성인 종양전이 억제방법.