KR20230104880A - 올리고뉴클레오티드의 신경교세포로의 선택적 전달 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 발현 및/또는 단백질의 수준의 선택적 감소를 위한 올리고뉴클레오티드 및 그러한 올리고뉴클레오티드를 신경교세포로 전달하는 관련된 방법에 관한 것이다.
Description
신경계는 뉴런과 신경교세포로 구성된다. 뉴런은 주로 화학적 및 전기적 신호를 생성하고 전파하는 기능을 한다. 신경교세포는 뉴런 기능 및 신호전달을 조절하는 기능을 하여 뉴런 특성 및 기능을 형성하고 조절한다. 중추신경계 (CNS)에서, 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 및 미세교세포를 포함한다. 말초신경계에서, 주요 신경교세포는 슈반 세포, 장의 신경교세포, 및 위성세포를 포함한다.
신경교세포는 다양한 질환 과정에 관여한다. 몇 가지 신경퇴행성 질환은 결함이 있는 신경교세포 기능으로 인해 발생할 수 있다. 예를 들어, 성상세포 기능장애는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅턴병, 및 파킨슨병과 관련될 수 있다. 신경 세포의 축삭에 보호막을 형성하는 기능을 하는 희소돌기교세포는 신경아교종, 정신분열증, 양극성 장애 및 백질이영양증과 관련될 수 있다. 미세교세포는 뇌의 면역 기능에 역할을 하며, 알츠하이머병, 자폐증 및 정신분열증을 촉진할 수 있는 염증 반응을 유발한다. 슈반 세포의 기능장애는 귈랑 바레 증후군, 샤르코마리투드병, 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증과 관련이 있다.
신경교세포 기능장애와 관련된 일부 질환은 특정 유전자 산물의 발현과 관련이 있다. 예를 들어, 알렉산더병은 미엘린초의 파괴를 특징으로 하는 백질이영양증의 한 형태이며, 성상세포에서 발현되는 중간 필라멘트 단백질인 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP)에 대한 유전자의 상염색체 기능 획득 돌연변이로 인해 발생한다. GFAP의 과발현 및 축적은 정상적인 중간 섬유의 형성을 손상시킬 수 있는 로젠탈 섬유로 알려진 비정상적인 단백질 침착을 초래한다.
신경교세포에서 비정상적인 유전자 산물의 발현과 관련된 또 다른 질환은 ALS이다. ALS는 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 (SOD1)을 인코딩하는 유전자의 돌연변이와 관련이 있다. ALS의 마우스 모델에서, 돌연변이 SOD1 (mSOD1)의 운동 뉴런에서의 선택적 발현만으로는 완전한 ALS 증상을 유발하기에 충분하지 않다 (문헌 [Pramatarova 등, J NEUROSCI. 2001, 21(10):3369-74] 참조). 그러나 운동 뉴런에서 mSOD1의 선택적 고갈은 발병 및 생존에 영향을 미치지만 질환 진행에는 영향을 미치지 않으며, 이는 퇴행에 영향을 미치는 주변 신경교세포의 관여를 암시한다.
신경교세포의 기능장애와 관련된 수많은 질환 및 장애의 관점에서, 신경교세포 기능과 관련된 질환 또는 장애에 관련된 유전자 산물의 발현을 조절함으로써 신경교세포를 선택적으로 표적화하기 위한 치료적 접근법이 바람직하다.
본 개시내용은 간섭 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 포유동물 신경계에 투여하면 뉴런 세포에서 발현되는 mRNA의 발현의 감소와 비교하여 신경교세포에서 발현되는 mRNA의 수준이 선택적으로 감소한다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드 상의 GalNAc 표적화 모이어티의 존재 유무에 관계 없이 신경교세포에서 선택적 흡수 및/또는 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 감소가 달성될 수 있음을 제공한다.
따라서, 일 측면에서, 본 개시내용은 간섭 올리고뉴클레오티드를 신경교세포에 선택적으로 전달하는 방법을 제공하며, 특히 선택도는 뉴런 세포보다 신경교세포에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 간섭 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 전달하는 방법은 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖는 간섭 올리고뉴클레오티드와 신경교세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 신경교세포에서 발현되는 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준을 선택적으로 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준을 선택적으로 감소시키는 방법은 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드와 신경교세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 RNA의 엑손에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 RNA의 5'-비번역 영역에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 RNA의 3'-비번역 영역에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 RNA의 대립유전자 특이적 서열, 예컨대 다형성 서열에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12 내지 60개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드인 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA의 상보성 영역은 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스를 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고 표적 RNA의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 15 내지 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 27개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드인 듀플렉스를 형성한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드인 듀플렉스를 형성한다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 별개의 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 단일 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 듀플렉스를 형성할 때, 길이가 최대 2개의 뉴클레오티드인 3'-오버행을 갖는다. 바람직하게는, 안티센스 가닥은 길이가 최대 2개의 뉴클레오티드인 3'-오버행을 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 영역 S1-L-S2을 포함하는 스템-루프 서열을 추가로 포함하고, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, L은, S1 및 S2가 듀플렉스를 형성할 때, S1과 S2 사이에서 형성되는 루프이고, 상기 스템-루프 서열은 센스 가닥의 3'-말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, 루프 L은 펜타루프, 테트라루프 또는 트리루프이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드 또는 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 스템-루프 서열의 루프 L 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 모이어티는 GalNAc 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 모이어티를 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 5'-말단 포스페이트, 뉴클레오티드 염기, 가역적 변형 및 상기 논의된 바와 같이 하나 이상의 표적화 모이어티의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드로 표적화하기 위한 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 장의 신경교세포 또는 이들의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 대상체의 중추신경계에 존재한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 대상체의 말초신경계에 존재한다. 일부 실시양태에서, 표적화를 위한 신경교세포는 중추신경계의 특정 영역, 예를 들어 전두엽 피질, 선조체, 체감각 피질, 해마, 시상하부, 소뇌, 뇌간 및/또는 척수에 존재한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 경추 척수, 흉추 척수 또는 요추 척수와 같은 척수의 특정 영역에 존재한다.
일부 실시양태에서, 신경교세포로의 전달에 대한 선택도 또는 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 감소에 대한 선택도는 뉴런 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소는 뉴런 세포에 비해 신경교세포의 경우 적어도 1.5배 이상이다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소는 뉴런 세포에 비해 신경교세포의 경우 2 이상; 2.5 이상; 3 이상; 3.5 이상; 4 이상; 4.5 이상; 또는 5 이상이다.
일부 실시양태에서, 간섭 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달 또는 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 감소 방법은 신경교세포의 기능장애, 예컨대 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 및/또는 장의 신경교세포의 기능장애와 관련된 장애 또는 병태를 치료하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소는 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 척수강내, 뇌실내, 사이질 (interstitial), 설하, 정맥내 또는 비강내 투여함으로써 이루어진다.
본원에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 특정 실시양태를 예시하고, 서면 설명과 함께 본원에 개시된 조성물 및 방법의 특정 측면의 비제한적인 예를 제공하는 역할을 한다.
도 1은 GFAP 및 TUBB3 mRNA를 표적으로 하는 siRNA의 구조를 도시한다. 테트라루프 서열 GAAA는 GalNAc 모이어티로 변형되었다.
도 2a 및 2b는 마우스의 CNS 전체에 걸친 세포 유형 특이적 Tubb3 및 Gfap mRNA 발현을 도시한다.
도 3은 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 및 3 mg/kg 단일 피하 투여의 용량에서 GalXC-GFAP 30일 스크린 용량 반응, HDI 2일 후 피하 투여 4일 후 수확을 도시한다.
도 4는 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 및 3 mg/kg 단일 피하 투여의 용량에서 GalXC-TUBB3 30일 스크린 용량 반응, HDI 2일 후 피하 투여 4일 후 수확을 도시한다.
도 5는 전두엽 피질에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 6은 선조체에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 7은 체감각 피질에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 8은 해마에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 9는 시상하부에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 10은 소뇌에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 11은 뇌간에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 12는 경추 척수, 흉추 척수 및 요추 척수에서 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 13은 요추척수에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 또는 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시하고, 여기서 siRNA는 GalNAc 잔기로 변형되거나 변형되지 않는다.
도 1은 GFAP 및 TUBB3 mRNA를 표적으로 하는 siRNA의 구조를 도시한다. 테트라루프 서열 GAAA는 GalNAc 모이어티로 변형되었다.
도 2a 및 2b는 마우스의 CNS 전체에 걸친 세포 유형 특이적 Tubb3 및 Gfap mRNA 발현을 도시한다.
도 3은 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 및 3 mg/kg 단일 피하 투여의 용량에서 GalXC-GFAP 30일 스크린 용량 반응, HDI 2일 후 피하 투여 4일 후 수확을 도시한다.
도 4는 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 및 3 mg/kg 단일 피하 투여의 용량에서 GalXC-TUBB3 30일 스크린 용량 반응, HDI 2일 후 피하 투여 4일 후 수확을 도시한다.
도 5는 전두엽 피질에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 6은 선조체에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 7은 체감각 피질에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 8은 해마에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 9는 시상하부에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 10은 소뇌에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 11은 뇌간에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 및 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 12는 경추 척수, 흉추 척수 및 요추 척수에서 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시한다.
도 13은 요추척수에서 성상세포 특이적 Gfap mRNA 침묵 또는 뉴런 특이적 Tubb3 mRNA 침묵의 GalXC siRNA 약리학을 도시하고, 여기서 siRNA는 GalNAc 잔기로 변형되거나 변형되지 않는다.
본 개시내용은 간섭 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 위한 조성물 및 조성물의 용도, 및 대상체의 신경계에서 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소를 포함하는, 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 감소에 관한 것이다. 본 개시내용은 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드를 사용하는 다른 뉴런 세포와 비교하여 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 전달 및 선택적 감소의 예상치 못한 발견을 제시한다. 따라서, 다음은 올리고뉴클레오티드 조성물 및 올리고뉴클레오티드의 신경교세포로의 선택적 전달 및 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩되는 단백질의 수준의 선택적 감소를 위한, 예컨대 신경교세포 기능장애와 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 올리고뉴클레오티드의 용도의 상세한 설명을 제공한다.
도면을 포함하는 전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며 본 개시를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 조직적인 목적만을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
I. 정의
본 개시내용과 관련하여, 본원의 설명에 사용된 기술 및 과학 용어는 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 따라서, 다음 용어는 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다.
대략적으로 : 본원에서 사용되는 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 관심대상의 하나 이상의 값에 적용될 때 언급된 기준 값에 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대락적으로" 또는 "약"은 달리 언급하지 않는 한 또는 문맥에서 달리 명백하지 않은 한, 상기 언급된 기준 값의 어느 한 쪽 방향에서 (초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).
투여하는: 본원에서 사용되는 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 (예를 들어, 대상체의 병태를 치료하는 데) 약제학적으로 유용한 방식으로 대상체에 물질 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 제공하는 것을 의미한다.
상보적: 본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 뉴클레오티드가 서로 염기쌍을 형성하도록 허용하는 뉴클레오티드 (예를 들어, 맞은편 핵산 단일 핵산 가닥의 맞은편 영역 상의 2개의 뉴클레오티드) 사이의 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 맞은편 핵산의 피리미딘 뉴클레오티드에 상보적인 하나의 핵산의 퓨린 뉴클레오티드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보적 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 방식으로 또는 안정적인 듀플렉스의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 핵산은 본원에 기술된 바와 같이 상보성 영역을 형성하기 위해 서로에게 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
데옥시리보뉴클레오티드 : 본원에서 사용되는 용어 "데옥시리보뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드와 비교하여 오탄당의 2' 위치에서 수소를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 당, 포스페이트기 또는 염기의 변형 또는 치환을 포함하는 2' 위치 이외에 원자의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드 : 본원에서 사용되는 용어 "이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 실질적으로 듀플렉스 형태인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보적 염기쌍은 공유적으로 별개의 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보적 염기쌍은 공유 결합된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보적 염기쌍은 함께 염기쌍을 이루는 뉴클레오티드의 상보적 역평행 서열을 제공하기 위해 (예를 들어, 헤어핀을 통해) 접힌 단일 핵산 가닥으로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 서로 완전히 듀플렉스되는 2개의 공유적으로 별개의 핵산 가닥을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 일단 또는 양단에 오버행을 갖는 부분적으로 듀플렉스되는 2개의 공유적으로 별개의 핵산 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드의 역평행 서열을 포함하므로, 따라서 내부 미스매치 또는 말단 미스매치를 포함할 수 있는 하나 이상의 미스매치를 가질 수 있다.
듀플렉스: 본원에서 사용되는 용어 "듀플렉스"는 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 관련하여, 뉴클레오티드의 2개의 역평행 서열의 상보적 염기 쌍형성을 통해 형성된 구조를 지칭한다.
부형제: 본원에서 사용되는 용어 "부형제"는 예를 들어 원하는 점조도 또는 안정화 효과를 제공하거나 또는 그에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비-치료제를 지칭한다.
신경교세포: 본원에서 사용되는 "신경교세포" 및 "신경교질세포"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 지지 또는 영양을 제공하거나 항상성을 유지하기 위해 작용하는 신경계의 비-뉴런 전구체 및/또는 완전히 분화된 세포를 지칭한다. 신경교세포의 예는 특히 상의 세포, 희소돌기교세포, 성상세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 및 장의 신경교세포를 포함한다. 신경교세포는 또한 신경 발사 속도, 뇌 가소성 및 면역 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다.
루프: 본원에서 사용되는 용어 "루프"는 적절한 혼성화 조건하에서 (예를 들어, 인산염 완충액, 세포 내) 쌍을 이루지 않은 영역이 측면에 있는 2개의 역평행 영역이 혼성화하여 듀플렉스 ("스템"으로 지칭됨)를 형성하도록 서로 충분히 상보적인 핵산의 2개의 역평행 영역이 측면에 있는 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 쌍을 이루지 않은 영역을 지칭한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결: 본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오티드간 연결"은 포스포디에스테르 결합을 포함하는 참조 뉴클레오티드간 연결과 비교하여 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드간 연결을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 연결이다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결이 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특정을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 열 안정성, 분해에 대한 저항성, 뉴클레아제 저항성, 용해도, 생체이용률, 생물 활성, 감소된 면역원성 등을 개선할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드 : 본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드, 아데닌 데옥시리보뉴클레오티드, 구아닌 데옥시리보뉴클레오티드, 시토신 데옥시리보뉴클레오티드 및 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 상응하는 참조 뉴클레오티드와 비교하여 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 그의 당, 핵염기 및/또는 포스페이트 기에서 하나 이상의 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 상응하는 참조 뉴클레오티드에 접합된 하나 이상의 화학적 모이어티를 갖는다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드가 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 열 안정성, 분해에 대한 저항성, 뉴클레아제 저항성, 용해도, 생체이용률, 생물활성, 감소된 면역원성 등을 개선할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 리보스 고리의 2' 위치에서 2'-O-메틸 또는 2'-F 치환을 포함한다.
닉킹된(Nicked) 테트라루프 구조: "닉킹된 테트라루프 구조"는 별개의 센스 (패신저) 및 안티센스 (가이드) 가닥의 존재를 특징으로 하는 RNAi 올리고뉴클레오티드의 구조를 지칭하며, 여기서 센스 가닥은 2개의 가닥이 듀플렉스를 형성하도록 안티센스 가닥에 대한 상보성 영역을 가지며, 상기 가닥 중 적어도 하나, 일반적으로 센스 가닥은 듀플렉스로부터 연장되며, 연장부는 테트라루프에 인접한 스템 영역을 형성하는 2개의 자가-상보적 서열 및 테트라루프를 함유하고, 테트라루프는 적어도 하나의 가닥의 자가-상보적 서열에 의해 형성된 인접한 스템 영역을 안정화시키도록 구성된다.
뉴런 세포: "뉴런 세포"는 일반적으로 신경계의 구조적 및 기능적 유닛을 지칭하며, 중추 및 말초신경계에 존재한다. 뉴런 세포는 화학적 및/또는 전기적 신호를 수신하고 전송하는 신경계의 전도 세포로 기능한다. 뉴런 세포의 세 가지 일반적인 범주에는 감각 뉴런, 운동 뉴런 및 중간뉴런이 포함된다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포는, 예로서 그리고 제한 없이, 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE 또는 감마-에놀라제); 뉴런 핵 (NeuN 또는 Fox3); 미세소관-관련 단백질 2 (MAP-2); 튜불린 베타 III (TUBB3); 더블코르틴 (DCX); 및 c-fos를 포함하는 특정 뉴런 특이적 마커의 발현에 의해 비-뉴런 신경교세포와 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포에 대한 임상 마커는 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT) 및 티로신 하이드록실라제를 포함한다. 중추신경계 또는 말초신경계의 영역에 특이적인 다른 뉴런 세포 마커, 예를 들어 칼빈딘-D28K, 칼레티닌, 및 신경필라멘트 단백질 (NFP)이 또한 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 : 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 짧은 핵산, 예를 들어 길이가 100개 미만의 뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 예를 들어, 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 듀플렉스 영역을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 비제한적인 예의 세트로서, 올리고뉴클레오티드는 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 다이서 (dicer) 기질 간섭 RNA (dsiRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 siRNA, 또는 단일-가닥 siRNA일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 RNAi 올리고뉴클레오티드이다.
오버행: 본원에서 사용되는 용어 "오버행"은 하나의 가닥 또는 영역이 듀플렉스를 형성하는 상보적 가닥의 말단을 넘어 연장되는 하나의 가닥 또는 영역으로부터 생성된 말단 비-염기 쌍 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 듀플렉스 영역으로부터 연장되는 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥에 대한 3' 또는 5' 오버행이다.
포스페이트 유사체: 본원에서 사용되는 용어 "포스페이트 유사체"는 포스페이트 기의 정전기적 및/또는 입체적 특성을 모방하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 종종 효소 제거에 민감한 5'-포스페이트 대신에 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 실시양태에서, 5' 포스페이트 유사체는 포스파타제-저항성 연결을 함유한다. 포스페이트 유사체의 예는 5' 메틸렌포스포네이트 (5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트 (5'-VP)와 같은 5' 포스포네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 당의 4'-탄소 위치에서 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 4'-포스페이트 유사체의 예는 옥시메틸 기의 산소 원자가 당 모이어티 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 또는 그의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다 (예를 들어, 국제 특허 공보 WO/2018/045317호 참조, 포스페이트 유사체에 관한 이의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 대한 다른 변형이 개발되었다 (예를 들어, 국제 특허 공보 WO2011133871호; 미국 특허 번호 제8,927,513호; 및 문헌 [Prakash 등, Nucleic Acids Res., 2015, 43(6):2993-3011] 참조, 포스페이트 유사체에 관한 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함됨).
감소된 발현: 본원에서 사용되는 용어 "감소된 발현" 또는 이의 유전자의 등가물은 유전자에 의해 인코딩된 단백질 또는 RNA 전사체의 양의 감소 및/또는 적절한 참조 세포 또는 대상체와 비교하여 세포 또는 대상체에서 유전자의 활성 양의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 표적 mRNA 서열에 상보적인 안티센스를 갖는 것)로 세포를 처리하는 행동은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 세포와 비교하여 RNA 전사체, 단백질 및/또는 효소 활성 (예를 들어, 표적 유전자에 의해 인코딩됨)의 양을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 본원에서 사용되는 "감소하는 발현"은 유전자 (예를 들어, 표적 유전자)의 발현을 감소시키는 행동을 지칭한다.
상보성 영역: 본원에서 사용되는 용어 "상보성 영역"은 적절한 혼성화 조건하에서, 예를 들어 인산염 완충액, 세포 등에서 뉴클레오티드의 두 서열 사이의 혼성화를 허용하기 위해 뉴클레오티드의 역평행 서열 (예를 들어, mRNA 내의 표적 뉴클레오티드 서열)에 충분히 상보적인 핵산 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드)의 서열을 지칭한다. 상보성 영역은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, mRNA 또는 이의 일부 내에 존재하는 표적 뉴클레오티드 서열)에 완전히 상보적일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 상보성 영역은 mRNA의 상응하는 서열에 대한 어떠한 미스매치 또는 갭 없이 상보적인 뉴클레오티드의 연속 서열을 갖는다. 대안적으로, 상보성 영역은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, mRNA 또는 이의 일부에 존재하는 뉴클레오티드 서열)에 부분적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 부분적으로 상보적인 상보성 영역은 mRNA에서 상응하는 서열에 상보적이지만, 상보성 영역이 mRNA 적절한 혼성화 조건하에서 mRNA와 혼성화할 수 있는 상태로 유지된다면 mRNA의 상응하는 서열과 비교하여 하나 이상의 미스매치 또는 갭 (예를 들어, 1, 2, 3개 이상의 미스매치 또는 갭)을 함유하는 뉴클레오티드의 연속 서열을 갖는다.
리보뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 용어 "리보뉴클레오티드"는 오탄당으로서 리보스를 갖는 뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 2' 위치에서 하이드록실 기를 함유한다. 변형된 리보뉴클레오티드는 리보스, 포스페이트 기 또는 염기에서의 변형 또는 치환을 포함하는 2' 위치가 아닌 원자의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 리보뉴클레오티드이다.
RNAi 올리고뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 용어 "RNAi 올리고뉴클레오티드"는 (a) 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 일부가 표적 mRNA의 절단에 아르고너트 2 (Ago 2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는, 센스 가닥 (패신저) 및 안티센스 가닥 (가이드)을 갖는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 (b) 안티센스 가닥 (또는 안티센스 가닥의 일부)가 표적 mRNA의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
선택적 감소: 본원에서 사용되는 유전자 발현의 "선택적 감소" 또는 "이의 등가물은 유전자에 의해 인코딩된 단백질 또는 RNA 전사체의 양의 우선적 감소 및/또는 적절한 참조 세포 또는 대상체와 비교하여 관심 세포의 유전자의 활성 양의 감소를 지칭하며, 여기서 관심 세포의 유전자와 참조 세포 또는 대상체의 비교 유전자는 동일한 유전자이거나 다른 유전자이다. 일부 실시양태에서, 관심 세포에서 유전자의 발현은 관심 세포에 특이적이며 참조 세포에서 비교 유전자의 발현은 참조 세포에 특이적이다.
가닥: 본원에서 사용되는 용어 "가닥"은 뉴클레오티드간 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르 연결, 포스포로티오에이트 연결)을 통해 함께 연결된 뉴클레오티드의 단일 연속 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가닥은 2개의 자유 말단, 예를 들어, 5'-말단 및 3'-말단을 갖는다.
대상체: 본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 마우스, 토끼 및 인간을 포함한 임의의 포유동물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 인간이 아닌 영장류이다. 용어 "개인" 또는 "환자"는 "대상체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
합성: 본원에서 사용되는 용어 "합성"은 (예를 들어, 기계 (예를 들어, 고체 상태 핵산 합성기)를 사용하여) 인위적으로 합성되거나 그렇지 않으면 일반적으로 분자를 생산하는 천연 공급원 (예를 들어, 세포 또는 유기체)으로부터 유도되지 않는 핵산 또는 다른 분자를 지칭한다.
표적화 리간드: 본원에서 사용되는 용어 "표적화 리간드"는 관심 조직 또는 세포의 동족 분자 (예를 들어, 수용체)에 선택적으로 결합하고 관심 조직 및 또는 세포에 다른 물질을 표적화할 목적으로 다른 물질에 접합 가능한 분자 (예를 들어, 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 특정 관심 조직 및 세포에 올리고뉴클레오티드를 표적화할 목적으로 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 세표 표면 수용체에 선택적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 접합될 때 표적화 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 수용체에 대한 선택적 결합을 통한 특정 세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달 및 올리고뉴클레오티드, 표적화 리간드 및 수용체를 포함하는 복합체의 세포에 의한 엔도솜 내재화를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오티드가 세포내 표적화 리간드로부터 방출되도록 세포 내재화 후에 또는 도중에 절단되는 링커를 통해 올리고뉴클레오티드에 접합된다.
테트라루프: 본원에서 사용되는 용어 "테트라루프"는 뉴클레오티드의 측면 서열의 혼성화에 의해 형성된 인접한 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 루프를 지칭한다. 안정성의 증가는 뉴클레오티드의 무작위로 선택된 서열로 이루어진 유사한 길이의 루프 세트로부터 평균적으로 예상되는 인접한 스템 듀플렉스의 Tm 보다 높은 인접한 스템 듀플렉스의 용융 온도 (Tm)의 증가로 감지할 수 있다. 예를 들어, 테트라루프는 10 mM NaHPO4 에서 길이가 적어도 2개의 염기쌍인 듀플렉스를 포함하는 헤어핀으로 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 용융 온도를 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 스태킹 상호작용에 의한 인접한 스템 듀플렉스에서 염기쌍을 안정화시킬 수 있다. 또한, 테트라루프 내의 뉴클레오티드 사이의 상호작용은 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성, 스태킹 상호작용, 수소 결합 및 접촉 상호작용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (문헌 [Cheong 등, Nature, 1990, 346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science, 1991, 253(5016):191-4]). 일부 실시양태에서, 테트라루프는 3 내지 6개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되며, 전형적으로 4 내지 5개의 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 테트라루프는 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 (예를 들어, 표적화 모이어티에 접합되거나 접합되지 않을 수 있는) 3개, 4개, 5개 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오티드로 구성된다. 임의의 뉴클레오티드가 테트라루프에 사용될 수 있고, 이러한 뉴클레오티드에 대한 표준 IUPAC-IUB 기호는 문헌 [Cornish-Bowden, Nucleic Acids Res. 1985, 13:3021-3030]에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문자 "N"은 임의의 염기가 그 위치에 있을 수 있음을 의미하기 위해 사용될 수 있고, 문자 "R"은 A (아데닌) 또는 G (구아닌)가 그 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있고, "B"는 C (시토신), G (구아닌), 또는 T (티민)가 그 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 테트라루프의 예는 테트라루프의 UNCG 패밀리 (예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리 (예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프 (문헌 [Woese 등, Proc Natl Acad Sci. USA., 1990, 87(21):8467-71; Antao 등, Nucleic Acids Res., 1991, 19(21):5901-5])를 포함한다. DNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리 (예를 들어, d(GTTA)), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리, 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리 (예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. 예를 들어 문헌 [Nakano 등, Biochemistry, 2002, 41(48):14281-292; Shinji 등, Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, 2000, 78(2):731]을 참조하며, 이는 이들의 관련 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 닉킹된 테트라루프 구조 내에 함유된다.
치료하다, 치료 또는 치료하는: 본원에서 사용되는 용어 "치료하다" "치료" 또는 "치료하는"은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, 다음을 포함한다: (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 저지하는 것; 및 (c) 질환의 완화, 예를 들어 질환의 퇴행 유발, 예를 들어 질환의 증상을 완전히 또는 부분적으로 제거하는 것.
II. 신경교세포에서 RNA 및/또는 단백질 발현의 선택적 전달 및 감소를 위한 올리고뉴클레오티드
본 개시내용은 간섭 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달 또는 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 단백질의 수준의 선택적 감소, 특히 대상체의 신경계의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 논의한 바와 같이, GalNAc 잔기로 변형된 간섭 RNA (RNAi)를 신경계에 투여하면 뉴런 세포에서 특이적으로 발현되는 표적 mRNA의 수준의 감소와 비교하여 신경교세포에서 특이적으로 발현되는 표적 mRNA의 수준이 놀라울 정도로 선택적으로 감소한다는 것이 본원에 나타나있다. 일부 경우에, 신경교세포에서 발현되는 mRNA의 감소에 대한 선택도는 뉴런 세포에서 발현되는 mRNA의 발현 감소 (예를 들어, 약 40% 감소)에 비해 거의 2배 (예를 들어, 80% 초과 감소)이다. 올리고뉴클레오티드 상의 GalNAc 리간드가 간에서의 선택적 흡수를 위해 그것을 표적화하는 것으로 알려져 있지만, 본 출원에서의 결과는 그러한 변형된 올리고뉴클레오티드가 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준의 감소에 비해 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 간 아시알로당단백질 수용체에 대한 GalNAc의 공지된 특이성 및 GalNAc 변형된 올리고뉴클레오티드의 대조적인 선택적 활성은 신경교세포에서의 선택적 흡수 및/또는 신경교세포에서 발현되는 RNA의 수준의 선택적 감소가 GalNAc 리간드의 존재 없이 달성될 수 있음을 보여준다.
a. 올리고뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달 방법 또는 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 방법은 신경교세포에서 발현되는 RNA 및/또는 단백질의 수준을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드와 신경교세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 적어도 15개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 적어도 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 19 내지 23개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12 내지 60개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12 내지 58개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스를 형성할 수 있고, 안티센스 가닥은 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 서열에 대한 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 의해 형성된 듀플렉스는 제1 듀플렉스 (D1)로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 15 내지 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 19 내지 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 12 내지 36개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 17 내지 36개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 19 내지 23개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 최대 50개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 최대 40개, 최대 30개, 최대 27개, 최대 25개, 최대 21개, 또는 최대 19개의 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 12 내지 36개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 17 내지 36개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 29개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 27개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 21 내지 27개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 21 내지 23개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 의해 형성되고 제1 듀플렉스 또는 D1으로도 지칭되는 듀플렉스는 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 12 내지 30개, 12 내지 27개, 15 내지 25개, 21 내지 26개, 18 내지 30개, 또는 19 내지 30개의 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스의 길이는 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 또는 적어도 25개의 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스의 길이는 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 의해 형성된 듀플렉스는 12-21개의 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 13 내지 20개, 14 내지 20개, 15 내지 20개, 16 내지 20개, 17 내지 20개, 18 내지 20개, 또는 19 내지 20개의 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 길이가 12 내지 23개, 12 내지 22개, 12 내지 21개, 12 내지 20개, 12 내지 19개, 12 내지 18, 12 내지 17개, 12 내지 16개, 12 내지 15개, 12 내지 14개, 또는 12 내지 13개의 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 영역은 길이가 적어도 19개의 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 길이가 20개의 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스는 길이가 21개의 염기쌍이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이에 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역은 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 또는 적어도 25개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역은 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역은 길이가 12 내지 30개, 12 내지 27개, 12 내지 22개, 15 내지 25개, 15 내지 23, 21 내지 26개, 20 내지 23개, 18 내지 30개 또는 19 내지 30개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이에 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개)의 미스매치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은, 적절한 혼성화 조건하에서 듀플렉스를 형성하는 능력을 유지한다면, 최대 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개 등의 미스매치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 하나 이상의 미스매치가 존재하는 경우, 이들은 올리고뉴클레오티드가 적절한 혼성화 조건하에서 듀플렉스를 형성하는 능력을 유지한다면 연속적으로 위치하거나 (예를 들어, 2개, 3개 이상 연속으로), 상보성 영역 전체에 산재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 듀플렉스 (D1)는 하나 이상의 미스매치를 함유한다.
일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현된 표적 RNA에 대한 안티센스 서열의 상보성 영역은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현된 표적 RNA에 대한 안티센스 서열의 상보성 영역은 길이가 적어도 15개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현된 표적 RNA에 대한 안티센스 서열의 상보성 영역은 길이가 적어도 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 서열의 상보성 영역은 길이가 적어도 21개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 길이가 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 또는 적어도 21개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 길이가 12 내지 30개 (예를 들어, 12 내지 30개, 12 내지 22개, 15 내지 25개, 17 내지 21개, 18 내지 27개, 19 내지 27개, 또는 15 내지 30개) 범위의 뉴클레오티드인 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 뉴클레오티드인 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 상의 서열에 완전히 상보적인 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상의) 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상의) 올리고뉴클레오티드의 상보성 영역은 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드 범위 (예를 들어, 12 내지 25개, 12 내지 20개, 12 내지 18개, 12 내지 16개, 12 내지 14개, 14 내지 20, 14 내지 18개, 14 내지 16개, 16 내지 20개, 16 내지 18개, 또는 18 내지 30개)에 있는 표적 RNA 서열의 연속 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 상의) 올리고뉴클레오티드의 상보성 영역은 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 연속 뉴클레오티드인 표적 RNA 서열의 연속 뉴클레오티드 서열에 상보적이다.
일부 실시양태에서, 표적 RNA 서열에 대한 상보성 영역은 표적 RNA의 상응하는 서열과 비교하여 하나 이상의 미스매치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 대한 상보성 영역은 적절한 혼성화 조건하에서 표적 RNA 서열과 상보적인 염기쌍을 형성하는 능력을 유지한다면 최대 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개 등의 미스매치를 가질 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 상의 상보성 영역은 적절한 혼성화 조건하에서 표적 RNA 서열과 상보적인 염기쌍을 형성하는 능력을 유지한다면 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하 또는 5개 이하의 미스매치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역에 하나 이상의 미스매치가 있는 경우, 이들은 올리고뉴클레오티드가 적절한 혼성화 조건하에서 표적 RNA 서열과 상보적인 염기쌍을 형성하는 능력을 유지한다면 연속적으로 위치하거나 (예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상 연속으로), 상보성 영역 전체에 산재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 다형성 서열을 갖는 유전자의 대립유전자로부터 발현된 RNA 사이의 구별을 증진시키거나 표적 RNA의 발현을 감소시키는 활성을 증진시키기 위해 표적 RNA의 서열과 뉴클레오티드 미스매치를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 서열 또는 구조를 추가로 포함하고, 상기 스템 루프 서열 또는 구조는 서열 영역 S1-L-S2을 포함하고, 여기서 S1은 S2와 상보적이고 제2 듀플렉스 (D2)를 형성할 수 있고, L은 S1과 S2가 제2 듀플렉스 (D2)를 형성할 때 형성된 루프이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 5'-말단에서 스템 루프 서열 또는 헤어핀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3' 말단에서 스템-루프 서열을 포함한다. 바람직하게는, 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 3'-말단에서 스템 루프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 듀플렉스 D2는 다양한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 듀플렉스/D2는 1 내지 6개의 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 듀플렉스/D2는 2 내지 6개, 3 내지 6개, 4 내지 6개, 5 내지 6개, 1 내지 5개, 2 내지 5개, 3 내지 5개, 또는 4 내지 5개의 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 듀플렉스/D2는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, S1 서열은 표적 RNA의 서열 및 표적 RNA의 S2 서열 안티센스 서열을 포함하고, 여기서 S1 및 S2는 듀플렉스를 형성한다. 일부 실시양태에서, S1 및 S2 서열은 표적 RNA 서열과 무관한 인공 서열이다. 일부 실시양태에서, 제2 듀플렉스는 완전히 상보적이다. 일부 실시양태에서, 제2 듀플렉스는 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, S1 및 S2의 서열은 루프 L의 형성을 안정화시키기 위해 선택된다. 예시적인 S1 서열은 GCAGCC 및 그의 상응하는 S2 서열 GGCUGC이다.
일부 실시양태에서, 스템-루프 서열에서 루프 L은 길이가 최대 30개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프 L은 길이가 최대 10개, 15개, 20개 또는 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 루프 L은 길이가 3 내지 6개의 뉴클레오티드, 3 내지 6개의 뉴클레오티드, 3 내지 5개의 뉴클레오티드, 또는 3 내지 4개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, L은 본원에 기술된 바와 같은 테트라루프, 펜타루프, 또는 트리루프이다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 길이가 4개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, L의 서열은 S1 및 S2가 제2 듀플렉스를 형성할 때 루프 구조를 안정화시키기 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, L은 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물로 구성된다. 일부 실시양태에서, L의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 변형된다. 하기에서 추가로 기술되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, L은 UNCG, GAAA, CUUG, d(GNNA), d(GNRA) d(GNAB), d(CNNG) 및 d(TNCG)로 제시된 서열이고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, N은 U, A, C, G중 어느 하나이고, R은 G 또는 A이다. 일부 실시양태에서, L은 GAAA로 제시된 서열이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 오버행 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 오버행 뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 1개 이상의 뉴클레오티드인 3'-오버행을 포함한다. 일부 실시양태에서, 길이가 1개 이상의 뉴클레오티드인 3'-오버행은 안티센스 가닥, 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥 및 센스 가닥 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 1개 이상의 뉴클레오티드인 5'-오버행 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 길이가 하나 이상의 뉴클레오티드인 5'-오버행은 안티센스 가닥, 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥 및 센스 가닥 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 3'-말단에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 3'-말단에서 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-말단에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-말단에서 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 1개 이상의 뉴클레오티드의 5'-오버행 (예를 들어, 5' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 오버행) 및 길이가 1개 이상의 뉴클레오티드의 3' 오버행 (예를 들어, 3' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 오버행)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 1개 또는 2개의 뉴클레오티드인 3'-오버행 서열을 포함하고, 여기서 3'-오버행 서열은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 모두에 존재한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 23개의 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 21개의 뉴클레오티드의 센스 가닥을 가지며, 여기서 센스 가닥의 3'-말단 및 가이드 안티센스 가닥의 5'-말단은 블런트 말단 (blunt end)을 형성하고, 안티센스 가닥은 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 22개의 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 20개의 뉴클레오티드의 센스 가닥을 가지며, 여기서 센스 가닥의 3'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단은 블런트 말단을 형성하고, 안티센스 가닥은 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행을 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 비대칭 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 3'-말단에서 36개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 센스 가닥 및 2개의 뉴클레오티드 3'-오버행이 있는 22개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 안티센스 가닥이 있는 비대칭 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 3'-말단에서 37개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 센스 가닥 및 2-뉴클레오티드 오버행이 있는 23개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 안티센스 가닥이 있는 비대칭 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 별개의 올리고뉴클레오티드이다. 즉, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 공유적으로 연결되어 있지 않다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중 가닥 형태일 때 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이에 갭 또는 닉(nick)을 함유하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 구조 S1-L-S2를 갖는 스템-루프 서열을 추가로 포함하며, 여기서 닉 또는 갭은 센스 가닥의 S2 영역에 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 단일 올리고뉴클레오티드를 형성하도록 공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 영역 S1-L-S2를 갖는 스템-루프 서열을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 센스 가닥에 공유적으로 연결되며, 예를 들어, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드간 연결에 의해 센스 가닥의 S2 영역에 연결된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 및/또는 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오티드의 저항성을 증가시키고, 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나 생체내 안정성을 증진시키기 위한 수단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 포스파타제 및/또는 뉴클레아제에 대한 센스 가닥의 저항성을 증가시키고, 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나 생체내 안정성을 증진시키기 위한 수단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 포스파타제 및/또는 뉴클레아제에 대한 안티센스 가닥의 저항성을 증가시키고, 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나 생체내 안정성을 증진시키기 위한 수단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 둘 모두는 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나 생체내 안정성을 증진시키는 포스파타제 및/또는 뉴클레아제를 위한 수단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드가 스템-루프 서열을 포함하는 경우, 스템-루프 서열은 포스파타제 및/또는 뉴클레아제에 대한 저항성을 증가시키고, 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나 생체내 안정성을 증진시키기 위한 수단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스파타제 및/또는 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오티드의 저항성을 증가시키고, 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나 생체내 안정성을 증진시키기 위한 수단은 본원에 추가로 기술되는 바와 같이 특히 당 잔기, 5'-말단 포스페이트, 뉴클레오시드간 연결, 및 핵염기에 대한 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 변형된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 변형된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부 (예를 들어, 90% 이상) 또는 모든 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 적어도 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 적 센스 가닥의 적어도 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 적어도 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 적어도 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트는 예를 들어 포스파타제 또는 다른 효소의 작용을 제한하기 위해 포스포로티오에이트 또는 4'-포스포네이트 유사체와 같은 포스페이트 유사체로 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5'-말단 포스페이트는 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 4'-포스포네이트 유사체와 같은 포스페이트 유사체로 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5'-말단 포스페이트는 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 4'-포스포네이트 유사체와 같은 포스페이트 유사체로 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5'-뉴클레오티드의 당의 4'-탄소는 포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트, 비닐포스포네이트, 또는 말로니포스포네이트이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 추가로 기술된 바와 같이 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 한정된 영역 또는 패턴으로 올리고뉴클레오티드 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 센스 가닥의 5'-말단에서 1 내지 4개의 뉴클레오티드 내에, 및/또는 센스 가닥의 3'-말단에서 1 내지 4개의 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 안티센스 가닥의 5'-말단에서 1 내지 4개의 뉴클레오티드 내에, 및/또는 안티센스 가닥의 3'-말단에서 1 내지 4개의 뉴클레오티드 내에 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 (5'-말단에서)의 위치 1 및 2에서 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 포스포로티오에이트이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5'-말단에서)의 위치 1 및 2 및 위치 2 및 3 및 선택적으로 위치 3 및 4에서 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 포스포로티오에이트이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3'-말단에서 마지막 2개, 바람직하게는 마지막 3개의 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 포스포로티오에이트이다. 예를 들어, 길이가 22개의 뉴클레오티드인 안티센스 가닥의 경우, 위치 20 및 21 및 위치 21 및 22에서 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 포스포로티오에이트를 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형, 예를 들어 2'-변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸로 변형된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 3'-말단 뉴클레오티드는 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸로 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 적어도 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸로 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 적어도 3'-말단 뉴클레오티드는 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸로 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 적어도 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸로 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 적어도 3'-말단 뉴클레오티드는 2'-플루오로 또는 2'-0-메틸로 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 당 모이어티의 2' 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 당 모이어티의 2' 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 당 모이어티의 2' 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 당 모이어티의 2' 변형을 갖는다. 2'-O-메틸 대신에 당 모이어티의 다른 2'- 변형은 하기에 더 자세히 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 50% 미만 내지 약 10%는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 50% 미만 내지 약 10%는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 50% 미만 내지 약 10%는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 전술한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 바람직하게는 2-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 길이가 19 내지 21개의 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 위치 7 내지 11에서 하나 이상의 뉴클레오티드 내지 4개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 9, 10, 11에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 9, 10, 11에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 전술한 실시양태에서, 센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 바람직하게는 2-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 21 내지 23개의 뉴클레오티드이고 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 14, 및 16, 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 2, 5, 6, 14 및 16에서 하나 이상의 뉴클레오티드, 최대 6, 최대 5, 최대 4 또는 최대 3개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 뉴클레오티드 위치 5 또는 14에서, 또는 뉴클레오티드 위치 5 및 14 둘 모두에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 뉴클레오티드 위치 2, 5 및 14에서 뉴클레오티드를 갖고, 선택적으로 뉴클레오티드 위치 1, 3, 6, 7, 10, 및 16에서 최대 3개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 전술한 실시양태에서, 안티센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 바람직하게는 2-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 가닥을 포함하고, 스템-루프 서열 S1-L-S2를 추가로 포함하고, 여기서 L은 테트라루프 또는 트리루프이다. 일부 실시양태에서, S1 및 S2 영역의 모든 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 바람직하게는 2-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, L 서열의 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-O-메틸로의 당 모이어티의 변형을 가지며, L의 나머지 뉴클레오티드는 하기에 추가로 기술된 바와 같은 표적화 리간드를 갖는다. 일부 실시양태에서, L 서열의 모든 뉴클레오티드는 표적화 리간드, 예를 들어, GalNAc를 갖는다.
일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소를 위한 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 하나 이상의 표적화 리간드 또는 모이어티로 변형된다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 RNA 및/또는 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소를 위한 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드 또는 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 모이어티는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질의 일부 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편) 또는 지질로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 모이어티는 하나 이상의 GalNAc 잔기 또는 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 별개의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 뉴클레오티드는 각각 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 2 내지 4개의 뉴클레오티드는 별개의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 2 내지 4개의 뉴클레오티드에 접합된다 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개의 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합됨). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 스템-루프 서열을 포함할 수 있고, 스템 루프의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오티드는 표적화 리간드에 개별적으로 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 GalNAc에 접합되지 않는다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 초과의 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2개, 3개, 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되고, 전형적으로 3개 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc, 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 각각 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 테트라루프의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 뉴클레오티드는 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 테트라루프의 2 내지 4개의 뉴클레오티드는 각각 GalNAc에 접합된다. 일부 실시양태에서, 트리루프의 1 내지 3개의 뉴클레오티드는 각각 별개의 GalNAc에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 2 내지 4개의 뉴클레오티드에 접합된다 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개의 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합됨). 일부 실시양태에서, GalNAc 모이어티는 센스 가닥의 뉴클레오티드에 접합된다. 예시적인 실시양태에서, 4개의 GalNAc 모이어티는 각각의 GalNAc 모이어티가 하나의 뉴클레오티드에 접합된 센스 가닥의 테트라루프에서 뉴클레오티드에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 하기에 묘사된 바와 같이, [ademG-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-구아디닌-GalNAc으로 지칭되는 구아디닌 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNAc를 포함한다:
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기에 묘사된 바와 같이, [ademA-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-아데닌-GalNAc으로 지칭되는 아데닌 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNAc를 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 GAAA (Z = 링커, X = 헤테로원자) 스템-루프 서열을 5'에서 3'으로 포함하는 루프에 대한 예시적인 변형이 하기에 도시되어 있다. 화학식에서, 
는 올리고뉴클레오티드 가닥에 대한 부착 지점을 설명하는 데 사용된다:
식 중:
Z는 치환 또는 비치환 알킬렌, 치환 또는 비치환 알케닐렌, 치환 또는 비치환 알키닐렌, 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로알케닐렌, 치환 또는 비치환 헤테로알키닐렌, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 결합, 클릭 화학 핸들 또는 1 내지 20개의 포괄적이고 연속적이며 공유 결합된 원자 길이의 링커를 나타내고; 그리고 X는 O, S, 또는 N이다.
일부 실시양태에서, Z는 아세탈 링커이다. 일부 실시양태에서, X는 O이다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 상의 루프 L의 -AAA- 서열은 하기 구조를 포함한다:
일부 실시양태에서, 루프 L은 GAAA로 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, GAAA 서열에서 각각의 A는 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, GAAA 서열에서 G는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, GAAA 서열에서 G는 2'-OH를 포함한다. 일부 실시양태에서, GAAA 서열에서 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, GAAA 서열에서 각각의 A는 2'-OH를 포함하고, GAAA 서열에서 G는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, GAAA 서열에서 각각의 A는 2'-O-메톡시에틸 변형을 포함하고, GAAA 서열에서 G는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, GAAA 서열에서 각각의 A는 2'- 아뎀 변형을 포함하고, GAAA 서열에서 G는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 간섭 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달 또는 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 위한 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예는 하기 구조를 갖는다 (센스 가닥에서 안티센스 가닥까지 5'→3'으로 도시):
여기서 각각의 원은 뉴클레오티드간 연결을 통해 연결된 뉴클레오티드를 나타내고, 예시된 구조에서 테트라루프로 도시된 루프 (L)는 GalNAc 잔기 (다이아몬드 모양으로 표시됨)에 접합된 뉴클레오티드를 갖는다. 센스 가닥의 번호는 센스 가닥의 5'-말단에서 시작하는 반면, 안티센스 가닥의 번호는 닉 지점 (nick site) 다음의 뉴클레오티드 잔기에서 시작한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 연속 올리고뉴클레오티드 이고 (즉, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 닉 또는 갭이 존재하지 않음), 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 예시된 구조에 도시된 바와 같이 닉 또는 갭이 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 존재할 때 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 센스 가닥의 3' 말단과 안티센스 가닥의 5' 말단 사이에 블런트 말단을 갖는 듀플렉스를 형성하는 경우 별개의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 길이가 각각 17 내지 36개의 뉴클레오티드 범위인 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 그들의 센스 가닥의 3' 연장부 내의 테트라루프, 및 안티센스 가닥의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 일부 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행은 GG이다. 일반적으로, 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 2개의 말단 GG 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두는 표적 RNA 서열에 상보적이거나 상보적이지 않다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 각각 20 내지 23개의 뉴클레오티드 범위인 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' 오버행은 길이가 1 또는 2개의 뉴클레오티드인 센스, 안티센스 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두에 제공된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 23개의 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 21개의 뉴클레오티드의 센스 가닥을 가지며, 여기서 센스 가닥의 3'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단은 블런트 말단을 형성하고, 여기서 가이드 가닥은 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 22개의 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 20개의 뉴클레오티드의 센스 가닥을 가지며, 여기서 센스 가닥의 3'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단은 블런트 말단을 형성하고, 여기서 안티센스 가닥은 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행을 갖는다. 일부 실시양태에서, 3' 오버행은 길이가 9개의 뉴클레오티드인 안티센스 가닥 상에 제공된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 22개의 뉴클레오티드의 안티센스 (가이드) 가닥 및 29개의 뉴클레오티드의 패신저 가닥 (패신저 가닥)을 가질 수 있으며, 여기서 센스 (패신저) 가닥은 그의 말단 3' 말단에서 테트라루프 구조를 형성하고, 안티센스 (가이드) 가닥은 9개의 뉴클레오티드 3' 오버행 (본원에서 "N-9"로 지칭됨)을 갖는다.
예시된 구조의 올리고뉴클레오티드는 본원에서 상세히 설명되는 바와 같이, 센스 가닥, 안티센스 가닥, S1 및 S2 영역, 루프 (L), 및 뉴클레오티드 오버행의 길이의 변화 및 선택적인 표적화 모이어티, 닉 지점의 위치, 뉴클레오티드 오버행의 위치, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 (센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 포함)에 대한 변형 유형 및 정도, 및 센스 가닥 및 안티센스 가닥 및 S1 및 S2 영역의 상보성 정도의 변화 및 변형 및 이를 가질 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 기술된 각각의 실시양태, 변화 및 변형 및 이러한 실시양태, 변화 및 변형의 임의의 조합은 상기 기술된 예시적인 올리고뉴클레오티드 구조에 적용된다.
b. 신경교세포 표적 RNA 서열
다양한 실시양태에서, 안티센스 가닥은 신경교세포에서 발현되는 관심 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 관심 RNA는 관심 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 대상체의 중추신경계 또는 말초신경계에 존재한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포에서 발현되는 RNA에 대한 상보성 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 표적 RNA는 신경교세포의 기능장애와 관련된 질환 또는 장에와 관련된 상응하는 인코딩된 단백질이다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA 및/또는 관련된 질환 또는 장애는 예로서 다음의 발현을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 알렉산더병 (AxD)에 대한 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP ) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001131019.3; NM_001242376.2; NM_001363846.1; 및 NM_002055.5); 이염성 백질이영양증에 대한 프로사포신 (PSAP) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001042465.3; NM_001042466.3; 및 NM_002778.4); 샤르코마리투드병에 대한 말초 미엘린 단백질 22 (PMP22 ) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000304.4; NM_001281455.1; NM_001281456.2; NM_001330143.2; 및 NM_153321.3); 성인 발병 백질이영양증에 대한 라민 B1 단백질 (LMNB1) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001198557.2; 및 NM_005573.4); 알츠하이머병에 대한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000484.4; NM_001136016.3; NM_001136129.3; NM_001136130.3; 및 NM_001136131.2), 및 미세소관-관련 단백질 tau (MAPT) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001123066.3; NM_001123067.3; NM_001203251.2; NM_001203252.1; 및 NM_005910.5); 헌팅턴병에 대한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 (SOD1) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열 NM_000454.4), 9번 염색체 개방 판독 프레임 72 (C9orf72) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001256054.2; NM_018325.5; 및 NM_145005.6), 및 헌팅턴 (HTT ) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_002111.8); 파킨슨병에 대한 α-시누클레인 (SNCA 또는 ASYN) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000345.4; NM_001146054.2; NM_001146055.2; 및 NM_007308.2) 및 다르다린/류신-풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_198578.4); 간질에 대한 아데노신 키나아제 (ADK) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001123.3; NM_001202449.1; NM_001202450.1; 및 NM_001369123.1; NM_001369124.1); 뇌졸증에 대한 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000594.4), 및 미토겐-활성화 단백질 키나아제 7 (ERK5 / MAPK7) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_002749.4; NM_139032.3; NM_139033.2; 및 NM_139034.3); 외상성 뇌 손상 및 축삭 손상에 대한 종양 괴사 알파 인자 (TNFα) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000594.4) 및 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP ) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001131019.3; NM_001242376.2; NM_001363846.1; 및 NM_002055.5); 자폐증에 대한 IL-1 수용체 유형 2 (IL- 1R2) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열; NM_001261419.2; NM_004633.4; 및 NM_173343.1); 다발성 경화증에 대한 인테그린 서브유닛 알파 4 ( CD49d ) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000885.6; 및 NM_001316312.1); 교모세포종 및 신경교세포 암에 대해 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF -1) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000618.5; NM_001111283.3; NM_001111284.2; 및 NM_001111285.3), 표피 성장 인자 (EGF) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001178130.3; NM_001178131.3; NM_001357021.2; 및 NM_001963.6), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000660.7), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001025366.3; NM_001025367.3; NM_001025368.3; NM_001025369.3; 및 NM_001025370.3); 근위축성 측삭 경화증 (ALS)에 대한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 (SOD1) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열 NM_000454.4), C9orf72 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001256054.2; NM_018325.5; 및 NM_145005.6), 및 TAR-DNA-결합 단백질 (TDP -43) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_007375.3); 신경염증에 대한 종양 괴사 인자 알파 (TNFα 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000594.4), 및 분화 클러스터 38 (CD38) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001775.4); 척수소뇌성 운동실조증(1,3,5,7 등)에 대한 아탁신 2 (ATXN2) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001310121.1; NM_001310123.1; 및 NM_002973.4), 아탁신 3 (ATXN3) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001127696.2; NM_001127697.2; NM_001164774.2; NM_001164776.2; 및 NM_001164777.2 ), 및 아탁신 7 (ATXN7) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000333.3; NM_001128149.3; 및 NM_001177387.1); 진행성 핵상 마비에 대한 미세소관-관련 단백질 tau (TAU/MAPT) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001123066.3; NM_001123067.3; NM_001203251.2; NM_001203252.1; 및 NM_005910.5); 원발성 노화 타우병증 (PART)/신경원섬유엉킴 우세 노인성 치매에 대한 TAU/MAPT 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001123066.3; NM_001123067.3; NM_001203251.2; NM_001203252.1; 및 NM_005910.5); 전측두엽 치매 및 17번 염색체에 연결된 파킨슨병 (FTDP-17)에 대한 TAU/MAPT 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001123066.3; NM_001123067.3; NM_001203251.2; NM_001203252.1; 및 NM_005910.5); 및 말초 신경 탈수초화에 대한 조기 성장 반응 단백질 2 (EGR2) 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_000399.5; NM_001136177.3; NM_001136178.1; NM_001136179.3; 및 NM_001321037.2).
일부 실시양태에서, 표적 RNA는 가공된 형태의 RNA이다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA는 가공되지 않은 형태의 RNA이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 mRNA의 5'-비번역 영역에 대한 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 mRNA의 코딩 영역에 대한 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 mRNA의 엑손에 대한 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 mRNA의 3'-비번역 영역에 대한 상보성 영역을 갖는다. 일반적으로, 안티센스 가닥으로 표적화하기 위한 mRNA의 5'-비번역 영역, 3'-비번역 영역 및 엑손의 위치 및 서열은 상기 개시된 각각의 NCBI 참조 mRNA 서열에 대한 NCBI 데이터 베이스에 제공된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 서열이 표적 RNA의 발현을 감소시키거나 조절하는 RNA의 스플라이스 접합부에서 또는 그 부근의 서열에 대한 상보성 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 돌연변이된 형태의 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 신경교세포에서의 과발현이 질환 또는 장애와 관련된 유전자는 발현 감소를 위해 표적화 된다. 일부 실시양태에서, 이들은 예로서 GFAP, PMP22, LMNB1, APP, MAPT, SOD1, C9orf72, ATXN2, NG2, C9ORF72, ATXN3, ATXN7, HTT, SNCA / ASYN, ADK, TNFα, CD49d, TDP -43, 및 TAU/MAPT을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 표적 mRNA 서열에서 돌연변이를 함유하는 서열에 완전히 상보적이며 돌연변이를 함유하는 RNA의 발현을 감소시키는데 효과적이다 (예를 들어, 문헌 [Scholefield 등, PLOS One, 2009, 4(9):e7232] 참조). 일부 실시양태에서, 표적 mRNA는 돌연변이를 갖는 대립유전자와 같은 RNA의 대립유전자 특이적 서열이다 (예를 들어, 문헌 [Bongianino 등, Circulation Research, 2017, 121(5):525-536] 참조). 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 질환 관련 돌연변이와 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 표적으로 한다.
올리고뉴클레오티드 특성, 변화 및 변형에 대한 추거 설명은 하기 섹션에 설명되어 있다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하기에 기술된 각 실시양태, 변화 및 변형 및 이러한 실시양태, 변화 및 변형의 임의의 조합을 포함한다.
c. 올리고뉴클레오티드 구조, 변화 및 변형
i. 안티센스 가닥
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 "가이드 가닥"으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 가닥이 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)와 맞물려 아르고너트 단백질에 결합하거나 하나 이상의 유사한 인자와 맞물리거나 결합할 수 있고 표적 유전자의 직접적인 침묵을 유발할 수 있는 경우, 안티센스 가닥은 가이드 가닥으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서 가이드 가닥과 상보적인 센스 가닥은 "패신저 가닥"으로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 최대 50개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 최대 50개, 최대 45개, 최대 40개, 최대 35개, 최대 30개, 최대 27개, 최대 25개, 최대 21개, 최대 19개, 최대 17개, 또는 최대 12개의 뉴클레오티드)인 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 19개, 적어도 21개, 적어도 25개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 35개, 또는 적어도 38개의 뉴클레오티드)인 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 길이가 12 내지 50개, 12 내지 40개, 또는 12 내지 30개 (예를 들어, 12 내지 50, 12 내지 40개, 12 내지 38개, 12 내지 36개, 12 내지 32개, 12 내지 30개, 12 내지 28개, 12 내지 22개, 12 내지 23개, 15 내지 21개, 15 내지 27개, 17 내지 21개, 17 내지 25개, 19 내지 27개, 또는 19 내지 30개)의 뉴클레오티드 범위이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 안티센스 가닥은 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 또는 50개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 23개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 22개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오티드, 길이가 22개의 뉴클레오티드, 길이가 21개의 뉴클레오티드, 길이가 20개의 뉴클레오티드, 또는 길이가 19개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 20 내지 22개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 20 내지 21개의 뉴클레오티드 또는 길이가 21 내지 22개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 20개의 뉴클레오티드, 길이가 21개의 뉴클레오티드, 또는 길이가 22개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 제공되는 바와 같은 비대칭 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 (즉, 3'-오버행)에서 임의의 길이의 단일-가닥 뉴클레오티드를 갖는 안티센스 가닥을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 2개의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 0개, 1개, 2개, 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 2개의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 3개의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 4개의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 5개의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 6개의 단일-가닥 뉴클레오티드를 포함한다.
ii. 센스 가닥
본원에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는 일부 실시양태에서 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 최대 40개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 최대 40개, 최대 35개, 최대 30개, 최대 27개, 최대 25개, 최대 21개, 최대 19개, 최대 17개, 또는 최대 12개의 뉴클레오티드)인 센스 가닥 (또는 패신저 가닥)을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 19개, 적어도 21개, 적어도 25개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 32개, 적어도 34개, 적어도 36개, 또는 적어도 38개의 뉴클레오티드)인 센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12 내지 40개 (예를 들어, 12 내지 40개, 12 내지 36개, 12 내지 32개, 12 내지 28개, 15 내지 40개, 15 내지 36개, 15 내지 32개, 15 내지 28개, 17 내지 21개, 17 내지 25개, 17 내지 36개, 19 내지 27개, 19 내지 30개, 20 내지 40, 22 내지 40개, 25 내지 40개, 또는 32 내지 40개)의 뉴클레오티드 범위의 센스 가닥을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12개의 뉴클레오티드, 길이가 13개의 뉴클레오티드, 길이가 14개의 뉴클레오티드, 길이가 15개의 뉴클레오티드, 길이가 16개의 뉴클레오티드, 길이가 17개의 뉴클레오티드, 길이가 18개의 뉴클레오티드, 길이가 19개의 뉴클레오티드, 길이가 20개의 뉴클레오티드, 길이가 21개의 뉴클레오티드, 길이가 22개의 뉴클레오티드, 길이가 23개의 뉴클레오티드, 길이가 24개의 뉴클레오티드, 길이가 25개의 뉴클레오티드, 길이가 26개의 뉴클레오티드, 길이가 27개의 뉴클레오티드, 길이가 28개의 뉴클레오티드, 길이가 29개의 뉴클레오티드, 길이가 30개의 뉴클레오티드, 길이가 31개의 뉴클레오티드, 길이가 32개의 뉴클레오티드, 길이가 33개의 뉴클레오티드, 길이가 34개의 뉴클레오티드, 길이가 35개의 뉴클레오티드, 길이가 36개의 뉴클레오티드, 길이가 37개의 뉴클레오티드, 길이가 38개의 뉴클레오티드, 길이가 39개의 뉴클레오티드, 또는 길이가 40개의 뉴클레오티드인 센스 가닥을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 3'-말단에서 영역 S1-L-S2를 갖는 스템-루프 서열 (또는 구조)을 추가로 포함하며, 여기서 S1 영역은 S2 영역과 상보적이고, 제2 듀플렉스 (D2) 또는 스템을 형성할 수 있고, L은 S1과 S2가 D2 (스템)을 형성할 때 형성된 루프이다. 일부 실시양태에서, S1과 S2 사이에 형성된 D2 또는 스템은 길이가 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개)의 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, D2 또는 스템은 길이가 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 또는 14개의 뉴클레오티드인 듀플렉스이다. 일부 실시양태에서, S1 영역과 S2 영역 사이에 형성된 D2는 길이가 1-6개의 염기쌍 (예를 들어, 길이가 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 2 내지 6개, 3 내지 6개, 4 내지 6개, 또는 5 내지 6개의 염기쌍) 범위이다.
일부 실시양태에서, S1과 S2 사이에 형성된 루프 L는 길이가 최대 10개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 루프 L은 S1 및 S2 영역을 연결하는 테트라루프, 펜타루프 또는 트리루프 (triL)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프, 펜타루프 또는 트리루프는 센스 가닥의 3' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 테트라루프, 펜타루프 또는 트리루프는 센스 가닥보다는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있다.
일부 실시양태에서, 트리루프, 펜타루프 또는 테트라루프와 같은 L 내의 임의의 수의 뉴클레오티드는 표적화 리간드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트리루프는 리간드에 접합된 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리루프는 리간드에 접합된 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리루프는 리간드에 접합된 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리루프는 리간드에 접합된 1 내지 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리루프는 리간드에 접합된 1 내지 2개의 뉴클레오티드 또는 리간드에 접합된 2 내지 3개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 테트라루프는 리간드에 접합된 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 리간드에 접합된 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 리간드에 접합된 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 리간드에 접합된 4개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 리간드에 접합된 1 내지 4개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 리간드에 접합된 1 내지 3개의 뉴클레오티드, 1 내지 2개의 뉴클레오티드, 2 내지 4개의 뉴클레오티드, 또는 3 내지 4개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 테트라루프 또는 트리루프는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. RNA 테트라루프의 비제한적인 예는 테트라루프의 UNCG 패밀리 (예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리 (예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. DNA 테트라루프의 비제한적인 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리 (예를 들어, d(GTTA)), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리, 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리 (예를 들어, d(TTCG))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
iii. 듀플렉스 길이
일부 실시양태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 21개)의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 12 내지 30개, 12 내지 27개, 12 내지 22개, 15 내지 25개, 18 내지 22개, 18 내지 25개, 18 내지 27개, 18 내지 30개, 19 내지 30개 또는 21 내지 30개의 뉴클레오티드) 범위이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있지 않다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이의 듀플렉스는 센스 또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이의 듀플렉스는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두의 전체 길이에 걸쳐 있다.
iii. 올리고뉴클레오티드 말단
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 3'-오버행은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 5' 말단과 비교하여 열역학적으로 덜 안정된 하나의 5'-말단을 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 3'-말단에서 블런트 말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단에서 오버행을 포함하는 비대칭 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 상의 3' 오버행은 길이가 1 내지 8개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 뉴클레오티드)이다.
전형적으로, RNAi에 대한 올리고뉴클레오티드는 안티센스 (가이드) 가닥의 3'-말단 상에 2개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 그러나 다른 오버행이 가능하다. 일부 실시양태에서, 오버행은 1 내지 6개의 뉴클레오티드, 선택적으로 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개, 3 내지 6개, 3 내지 5개, 3 내지 4개, 4 내지 6개, 4 내지 5개, 5 내지 6개의 뉴클레오티드, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 3'-오버행이다. 그러나 일부 실시양태에서, 오버행은 1 내지 6개의 뉴클레오티드, 선택적으로 1 내지 5개, 1 내지 4개의, 1 내지 3개. 1 내지 2개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개, 3 내지 6개, 3 내지 5개. 3 내지 4개, 4 내지 6개, 4 내지 5개, 5 내지 6개의 뉴클레오티드, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 뉴클레오티드의 길이를 포함하는 5'-오버행이다.
일부 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단의 하나 이상 (예를 들어, 2개, 3개, 4개)의 말단 뉴클레오티드는 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 1 또는 2개의 말단 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 마지막 뉴클레오티드는 변형되며, 예를 들어 2'-변형, 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 마지막 1개 또는 2개의 말단 뉴클레오티드는 표적에 대해 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 마지막 1개 또는 2개의 뉴클레오티드는 표적에 대해 상보적이지 않다. 일부 실시양태에서, 센스 또는 안티센스 가닥의 5'-말단 및/또는 3'-말단은 반전된 캡 (inverted cap) 뉴클레오티드를 갖는다.
iv. 미스매치
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 올리고뉴클레오티드는 센스 및 안티센스 가닥 사이에 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개)의 미스매치를 갖는다. 센스 및 안티센스 가닥 사이에 하나 이상의 미스캐치가 있는 경우, 이들은 연속적으로 (예를 들어, 2개, 3개 이상 연속으로) 위치하거나, 상보성 영역 전체에 산재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 3'-말단은 하나 이상의 미스매치를 함유한다. 일부 실시양태에서, 2개의 미스매치는 센스 가닥의 3'-말단에 통합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥의 3'-말단에서 세그먼트의 염기 미스매치 또는 불안정화는 아마도 다이서에 의한 프로세싱을 용이하게 함으로써 RNAi에서 합성 듀플렉스의 효능을 개선하였다.
v. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 표적 RNA의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 이러한 구조는 단일-가닥 RNAi 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. (예를 들어, 문헌 [Matsui 등, Molecular Therapy, 2016, 24(5), 946-955] 참조). 일부 실시양태에서, 단일 가닥 RNAi는 표적 RNA에 대한 안정성 및 유효성을 증진시키도록 변형된다.
그러나 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 기록될 때, 특정 핵산의 표적 세그먼트의 역 상보를 포함하고 세포에서 또는 (예를 들어 믹스머 (mixmer)로서) 표적 RNA의 RNaseH 매개 절단을 유도하고 세포에서 표적 RNA의 번역을 억제하기 위해 적합하게 변형되는 (예를 들어, 갭머 (gapmer)로서), 핵염기 서열을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 변형에 관한 그 개시내용 (예를 들어, 핵염기 (피리미딘, 퓨린)의 길이, 당 모이어티, 및 핵염기의 헤테로고리 부분의 변경)이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 제9,567,587호에 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 적합한 방식으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 분자는 특정 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Bennett 등, Pharmacology of Antisense Drugs, ANNUAL REVIEW OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY, 7:81-105] 참조).
iv.
올리고뉴클레오티드 변형
올리고뉴클레오티드는 특이성, 안정성, 전달, 생체이용률, 뉴클레아제 분해로부터의 저항성, 면역원성, 염기 쌍 특성, RNA 분포 및 세포 흡수 및 치료 또는 연구 용도와 관련된 기타 특징을 개선하거나 제어하기 위해 다양한 방식으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bramsen 등, Nucleic Acids Res., 2009, 37:2867-2881; Bramsen and Kjems, Frontiers in Genetics, 2012, 3:1-22] 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 적합한 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 하기에서 추가로 기술되는 바와 같이 그의 염기 (또는 핵염기), 당 (예를 들어, 리보스, 데옥시리보스) 또는 포스페이트 기에서 변형을 갖는다.
올리고뉴클레오티드의 변형 수 및 이러한 뉴클레오티드 변형의 위치는 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 지질 나노입자 (LNP) 또는 유사한 담체에 접합되거나 포함함으로써 생체내에서 전달될 수 있다. 그러나 올리고뉴클레오티드가 LNP 또는 유사한 담체에 의해 보호되지 않는 경우, 적어도 일부의 뉴클레오티드가 변형되는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 임의의 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 중 절반 이상이 변형된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 중 절반 미만이 변형된다. 전형적으로, 네이키드 전달의 경우, 모든 당은 2'-위치에서 변형된다. 이러한 변형은 가역적이거나 비가역적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 원하는 특성 (예를 들어, 효소 분해로부터의 보호, 생체내 투여 후 원하는 세포를 표적화하는 능력 및/또는 열역학적 안정성)을 야기하기에 충분한 수 및 유형의 변형된 뉴클레오티드를 갖는다.
a. 당 변형
일부 실시양태에서, 변형된 당 (본원에서 당 유사체로도 지칭됨)은 예를 들어, 하나 이상의 변형이 당의 2', 3', 4' 및/또는 5' 탄소 위치에서 발생하는 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 당은 또한 잠금 핵산 ("LNA" 또는 "이환식") (예를 들어, 문헌 [Koshkin 등, Tetrahedron, 1998, 54:3607-3630] 참조), 비잠금 핵산 ("UNA" 또는 "비환식") (예를 들어, 문헌 [Snead 등, Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2013, 2:e103] 참조), 및 가교 핵산 ("BNA") (예를 들어, 문헌 [Imanishi and Obika, The Royal Society of Chemistry, Chem. Commun., 2002, 1653-1659] 참조)에 존재하는 것과 같은 비천연 대체 탄소 구조를 포함할 수 있다. Koshkin 등, Snead 등, 및 Imanishi 및 Obika는 당 변형에 관한 그들의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다. 당 변형은 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오티드의 저항성을 증가시키고/시키거나 혼성화 효율을 증진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 당의 뉴클레오티드 변형은 2'-변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형은 특히 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 또는 2'-O-메톡시에틸이다. 일부 실시양태에서, 당의 변형은 당 고리의 변형을 포함하며, 이는 당 고리의 하나 이상의 탄소의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 당의 변형은 당의 1'-탄소 또는 4'-탄소에 연결된 당의 2'-산소, 또는 에틸렌 또는 메틸렌 브릿지를 통해 1'-탄소 또는 4'-탄소에 연결된 2'-산소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-탄소 대 3'-탄소 결합이 결여된 비환식 당을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 예를 들어 당의 4' 위치에서 티올 기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드는 당 모이어티에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개 이상)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥은 당 모이어티에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개 이상)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 당 모이어티에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 이상)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드 (즉, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두)는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 상의 당 모이어티의 변형은 2'-변형 (예를 들어, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 상의 당 모이어티의 변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸로의 2'-변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 50% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만 내지 약 10%, 약 12%, 약 14%, 약 18% 또는 약 20%는 2'-F 기로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 50% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만 내지 약 10%, 약 12%, 약 14%, 약 18% 또는 약 20%는 2'-F 기로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 길이가 19 내지 21개의 뉴클레오티드인 센스 가닥은 2'-F 기로의 당 모이어티의 변형을 갖는 최대 5개, 바람직하게는 최대 4개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 길이가 21 내지 23개의 뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 2'-F 기로의 당 모이어티의 변형을 갖는 최대 6개, 바람직하게는 최대 5개, 더 바람직하게는 최대 3개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 길이가 19 내지 21개의 뉴클레오티드인 센스 가닥 및 길이가 21 내지 23개의 뉴클레오티드인 안티센스 가닥을 갖는 올리고뉴클레오티드는 2'-F로의 당 모이어티의 변형을 갖는 최대 총 4 내지 12개, 5 내지 11개 또는 6 내지 10개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 또는 이들의 조합, 바람직하게는 2'-O-메틸로 당 모이어티에서 변형된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 정의된 위치에서 뉴클레오티드의 정의된 위치에서 뉴클레오티드의 당 잔기에 대한 변형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 경우, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 7, 8, 9, 10 및 11에서 하나 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 위치 9, 10 및 11에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 7, 8, 9, 10 및 11에서 2'-F로의 당 모이어티의 변형을 갖는 2개, 3개, 4개 또는 모든 뉴클레오티드를 갖는다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 2'-F 기로 변형된 당 모이어티를 갖는 최대 5개, 바람직하게는 최대 4개의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥이 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는 전술한 실시양태 각각의 경우, 센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 또는 이들의 조합, 바람직하게는 2'-O-메틸로의 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 7, 8, 9, 10, 및 11에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖고, 센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 또는 이들의 조합, 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 19 내지 21개의 뉴클레오티드인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 8, 9, 10 및 11, 또는 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 9, 10 및 11에서 2'-F로의 당 모이어티의 변형을 갖는 뉴클레오티드를 가지며, 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸로 당 잔기의 변형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 14 및 16, 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 2, 3, 5, 6, 7, 10 및 14 중 하나 이상에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 뉴클레오티드 위치 5 또는 14에서 2'-F로의 당 모이어티의 변형을 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 5 및 14에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 5에서 뉴클레오티드를 갖고, 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 6, 7, 10, 14 및 16에서 최대 5개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 14에서 2'-F 변형을 갖고, 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 6, 7, 10, 14 및 16에서 최대 5개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 5 및 14에서 뉴클레오티드를 갖고, 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 6, 7, 10 및 16에서 최대 4개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 2, 5 및 14에서 뉴클레오티드를 갖고, 선택적으로 뉴클레오티드 위치 1, 3, 7 및 10에서 최대 3개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 위치 2, 5 및 14 각각에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1, 2, 5 및 14 각각에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 위치 1, 2, 3, 5, 7 및 14 각각의 위치에서 당 모이어티는 2'-F로 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥의 위치 1, 2, 3, 5, 10 및 14 각각의 위치에서 당 모이어티는 2'-F로 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥의 위치 2, 3, 5, 7, 10 및 14 각각의 위치에서 당 모이어티는 2'-F로 변형된다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 길이가 21 내지 23개의 뉴클레오티드인 안티센스 가닥은 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 최대 5개, 더 바람직하게는 최대 3개의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥이 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는 전술한 실시양태 각각의 경우, 안티센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA) 또는 이들의 조합, 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 14 및 16, 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 2, 3, 5, 6, 7, 10 및 14 중 하나 이상에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 가지며, 안티센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 또는 이들의 조합, 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 2, 5 및 14에서 뉴클레오티드를 갖고, 선택적으로 뉴클레오티드 위치 1, 3, 6, 7 및 10에서 최대 3개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로의 당 모이어티의 변형을 갖고, 상기 안티센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-메틸로의 당 모이어티의 변형을 갖는다.
일부 실시양태에서, S1-L-S2의 스템-루프 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 경우, 스템 및/또는 루프는 하나 이상의 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형은 표적화 리간드로의 변형을 배제한다. 일부 실시양태에서, 변형은 2'-O-프로파질, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸 (EA), 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸] (2'-O-NMA), 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산 (2'-FANA), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티의 변형은 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 또는 2'-O-메톡시에틸이다. 일부 실시양태에서, S1의 하나 이상의 뉴클레오티드 내지 모든 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, S2의 하나 이상의 뉴클레오티드 내지 모든 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, S1 및 S2의 모든 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형, 바람직하게는 2'-O-메틸로의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 루프 L의 하나 이상의 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 루프 서열의 5' 뉴클레오티드는 당 모이어티의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 테트라루프, 펜타루프 또는 트리루프의 경우, 루프 서열의 5' 뉴클레오티드는 2' 위치에서 당 모이어티의 변형, 바람직하게는 2'-O-메틸로의 변형을 가지며, 루프의 나머지 뉴클레오티드는 표적화 리간드로 변형된다.
b. 5' 말단 포스페이트
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트 기는 아르고너트 2와의 상호작용을 증진시킨다. 그러나 5'-포스페이트 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 또는 다른 효소를 통한 분해에 민감할 수 있으며, 이는 생체내 올리고뉴클레오티드 생체이용률을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이러한 분해에 저항성이 있는 5' 포스페이트의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트, 비닐포스포네이트, 또는 말로닐포스포네이트일 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 가닥의 5' 말단은 천연 5'-포스페이트 기 ("포스페이트 모방체")의 정전기적 및 입체적 특성을 모방하는 화학적 모이어티에 부착된다 (예를 들어, 문헌 Prakash 등, Nucleic Acids Res., 2015, 43(6): 2993-3011) 참조, 포스페이트 유사체에 관한 이의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 5' 말단에 부착될 수 있는 많은 포스페이트 모방체가 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제8,927,513호 참조, 포스페이트 유사체에 관한 이의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 대한 다른 변형은 예를 들어, 국제 특허 공보 WO 2011/133871호에 개시되어 있으며, 포스페이트 유사체에 관한 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, 하이드록실 기는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 부착된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 당의 4'-탄소 위치에서 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 예를 들어, 2017년 9월 1일에 출원된 국체 특허 공보 PCT/US2017/049909호, 2016년 9월 2일에 출원된 4′-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same라는 제목의 미국 가출원 번호 제62/383,207호, 및 4'-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same라는 제목의 2016년 9월 12일에 출원된 제62/393,401호를 참조하며, 포스페이트 유사체에 관한 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸 기의 산소 원자가 당 모이어티 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 또는 이의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 다른 실시양태에서, 4'-포스페이트 유사체는 티오메틸 기의 황 원자 또는 아미노메틸 기의 질소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이다. 특정 실시양태에서, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트이다. 일부 실시양태에서, 옥시메틸포스포네이트는 식 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2으로 표시되며, 식 중 R은 H, CH3, 알킬 기, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si (CH3)3, 또는 보호기로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 CH2CH3이다. 보다 전형적으로, R은 H, CH3, 또는 CH2CH3으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 5'-말단 변형은 센스 가닥에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-말단 변형은 안티센스 가닥에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 부착된 포스페이트 유사체는 메톡시 포스포네이트 (MOP)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 부착된 포스페이트 유사체는 5' 모노-메틸 보호된 MOP이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체를 포함하는 다음의 우리딘 뉴클레오티드는 예를 들어 안티센스 (가이드) 가닥의 첫 번째 위치에서 사용될 수 있다:
변형된 뉴클레오티드는 [Me포스포네이트-4O-mU] 또는 5'-메톡시, 포스포네이트-4'옥시- 2'-O-메틸우리딘으로 지칭된다.
c. 변형된 뉴클레오시드간 연결
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 변형 또는 치환은 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 5개)의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 1 내지 10개 (예를 들어, 1 내지 10개, 2 내지 8개, 4 내지 6개, 3 내지 10개, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개 또는 1 내지 2개)의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티온알킬포스포트리에스테르 연결, 포스포르아미다이트 연결, 포스포네이트 연결 또는 보라노포스페이트 연결일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드간 연결은 하기 구조의 4-O-메틸렌 포스포네이트 연결이다:
여기서 R1은 H 또는 C1-C4 알킬 기다. 일부 실시양태에서, R1은 메틸이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 위치 1 및 2 (즉, 5'-말단 영역에서), 안티센스 가닥의 위치 1 및 2, 안티센스 가닥의 위치 2 및 3, 안티센스 가닥의 위치 3 및 4 (즉, 5'-말단 영역에서), 안티센스 가닥의 위치 20 및 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21 및 22 (즉, 3'-말단 영역) 중 하나 이상에서 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 위치 1 및 2, 안티센스 가닥의 위치 1 및 2, 안티센스 가닥의 위치 2 및 3, 안티센스 가닥의 위치 20 및 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21 및 22 각각에서 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오이에트 연결을 갖는다.
d. 염기 변형
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 핵염기 (본원에서 염기 유사체로도 지칭됨)는 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에서 연결된다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 질소 함유 염기이다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제20080274462호 참조). 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 보편 염기를 포함한다. 그러나 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵염기 (염기성)를 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서, 보편 염기는 변형된 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치, 또는 뉴클레오티드 당 모이어티 치환에서 동등한 위치에 위치한 헤테로사이클릭 모이어티이며, 듀플렉스에 존재할 때, 듀플렉스의 구조를 실질적으로 변경하지 않고 한 가지 유형 이상의 염기 반대편에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 완전히 상보적인 참조 단일-가닥 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 비교하여, 보편 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 상보적 핵산으로 형성된 듀플렉스보다 낮은 Tm을 갖는 표적 핵산과 듀플렉스를 형성한다. 그러나 일부 실시양태에서, 단일 미스매치를 생성하기 위해 보편 염기가 염기로 대체된 참조 단일-가닥 핵산과 비교하여, 보편 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 미스매치 염기를 포함하는 핵산으로 형성된 듀플렉스보다 더 높은 Tm을 갖는 표적 핵산과 듀플렉스를 형성한다.
보편적 결합 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 이노신, 1-β-D-리보푸라노실-5-니트로인돌, 및/또는 1-β-D-리보푸라노실-3-니트로피롤 (미국 특허 공개 번호 제20070254362호; 문헌 [Van Aerschot 등, Nucleic Acids Res., 1995, 23(21):4363-70; Loakes 등, Nucleic Acids Res. 1995, 23(13):2361-6; Loakes 및 Brown, Nucleic Acids Res., 1994, 22(20):4039-43]. 전술한 각각의 염기 변형에 관한 이들의 개시내용이 본원에 참조로 포함됨)을 포함한다.
e. 가역적 변형
표적 세포에 도달하기 전에 생체내 환경으로부터 올리고뉴클레오티드를 보호하기 위한 소정의 변형이 이루어질 수 있지만, 올리고뉴클레오티드가 표적 세포의 세포질에 도달하면 올리고뉴클레오티드의 효능 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 분자가 세포 외부의 바람직한 특성을 유지하도록 가역적 변형이 이루어질 수 있으며, 이는 이후 세포의 세포질 환경에 들어갈 때 제거된다. 가역적 변형은 예를 들어 세포내 효소의 작용 또는 세포 내부의 화학적 조건에 의해 (예를 들어, 세포내 글루타티온에 의한 환원을 통해) 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가역적으로 변형된 뉴클레오티드는 글루타티온-민감성 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 핵산 분자는 사이클릭 디설파이드 모이어티로 화학적으로 변형되어 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결에 의해 생성된 음전하를 차폐하고 세포 흡수 및 뉴클레아제 저항성을 개선한다 (미국 특허 공보 제20110294869호, 국제 특허 공보 WO2015188197호; 문헌 [Meade 등, Nature Biotech., 2014,32:1256-1263]; 국제 특허 공보 WO2014088920호; 이들 각각은 그러한 변형의 그들의 개시내용이 참조로 포함됨). 뉴클레오티드간 디포스페이트 연결의 이러한 가역적 변형은 세포질 (예를 들어, 글루타티온)의 환원 환경에 의해 세포내에서 절단되도록 설계되었다. 초기 예는 세포 내부에서 절단가능한 것으로 보고된 중화 포스포트리에스테르 변형을 포함한다 (문헌 [Dellinger 등, J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:940-950]).
일부 실시양태에서, 이러한 가역적 변형은 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 및 다른 가혹한 환경 조건 (예를 들어, pH)에 노출되는 생체내 투여 (예를 들어, 세포의 혈액 및/또는 리소좀/엔도솜 구획을 통한 통과) 동안 보호를 허용한다. 글루타티온 수준이 세포외 공간에 비해 더 높은 세포의 세포질로 방출되면, 변형이 역전되어 절단된 올리고뉴클레오티드가 생성된다. 가역적이고, 글루타티온에 민감한 모이어티를 사용하면, 비가역적 화학적 변형을 사용하여 이용가능한 옵션과 비교하여 관심 올리고뉴클레오티드에 입체적으로 더 큰 화학 기를 도입할 수 있다. 이러한 더 큰 화학 기는 세포질에서 제거될 수 있으므로 세포의 세포질 내부에 있는 올리고뉴클레오티드의 생물학적 활성을 방해하지 않아야 한다. 그 결과, 이러한 더 큰 화학 기는 뉴클레아제 저항성, 친유성, 전하, 열 안정성, 특이성 및 감소된 면역원성과 같은 다양한 이점을 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부여하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 그의 방출 동역학을 변경하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 뉴클레오티드의 당에 부착된다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 변형된 뉴클레오티드의 당의 2' 탄소에 부착된다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드에 부착될 때 당의 5-탄소에 위치한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 특히 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오티드일 때 당의 3-탄소에 위치한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 설포닐 기를 포함한다 (예를 들어, 국제 특허 공보 WO2018039364호 참조, 이의 내용은 관련 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함됨).
f. 표적화 리간드
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 세포 또는 하나 이상의 기관에 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 전략은 다른 기관에서 바람직하지 않은 효과를 피하는 데 도움이 될 수 있거나 올리고뉴클레오티드로부터 이익을 얻지 못할 세포, 조직 또는 기관에 대한 올리고뉴클레오티드의 과도한 손실을 피할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 특정 조직, 세포 또는 기관의 표적화를 용이하게 하기 위해, 예를 들어 간으로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 간의 간세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드에 접합된 뉴클레오티드를 포함한다.
표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질의 일부 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편) 또는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 압타머이다. 예를 들어, 표적화 리간드는 맥관구조 또는 신경아교종 세포를 표적화는 데 사용되는 RGD 펩티드, 락토페린을 이송하는 종양 맥관구조 또는 기공을 표적화하는 CREKA 펩티드 또는 CNS 맥관구조에서 발현되는 트렌스페린 수용체를 표적화하는 압타머 또는 신경아교종 세포에서 EGFR을 표적으로 하는 항-EGFR 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 하나 이상의 GalNAc 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 뉴클레오티드는 각각 별개의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 2 내지 4개의 뉴클레오티드는 각각 별개의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 표적화 리간드가 칫솔의 강모와 유사하고 올리고뉴클레오티드가 칫솔과 유사하도록 센스 또는 안티센스 가닥의 양쪽 말단에서 2 내지 4개의 뉴클레오티드에 접합된다 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개의 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합됨). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 스템-루프 서열을 포함할 수 있고, 스템 루프의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오티드는 표적화 리간드에 개별적으로 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 GalNAc 모이어티이다. GalNAc는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 대한 고친화성 리단드로, 주로 간세포의 정현파 표면에서 발현되며 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기 (아시알로당단백질)를 함유하는 순환 글리코단백질의 결합, 내재화 및 후속 제거에 중요한 역할을 한다. 올리고뉴클레오티드에 대한 GalNAc 모이어티의 접합 (간접적 또는 직접적)은 이러한 올리고뉴클레오티드를 세포에서 발현되는 ASGPR에 표적화하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 초과의 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다 (즉, 2개, 3개, 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합되고, 3개 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합됨). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc, 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 뉴클레오티드는 각각 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 테트라루프의 2 내지 4개의 뉴클레오티드는 각각 별개의 GalNAc에 접합된다. 일부 실시양태에서, 트리루프의 1 내지 3개의 뉴클레오티드는 각각 별개의 GalNAc에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 GalNAc 모이어티가 칫솔의 강모와 유사하고 올리고뉴클레오티드가 칫솔과 유사하도록 센스 또는 안티센스 가닥의 양쪽 말단에서 2 내지 4개의 뉴클레오티드에 접합된다 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개의 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합됨). 일부 실시양태에서, GalNAc 모이어티는 센스 가닥의 뉴클레오티드에 접합된다. 예를 들어, 4개의 GalNAc 모이어티는 각각의 GalNAc 모이어티가 하나의 뉴클레오티드에 접합되는 센스 가닥의 테트라루프의 뉴클레오티드에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 하기에 묘사된 바와 같이 [ademG-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-구아디닌-GalNAc로 지칭되는 구아디닌 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNAc를 포함한다:
일부 실시양태에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 하기에 묘사된 바와 같이 [ademA-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-아데닌으로 지칭되는 아데닌 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNAc를 포함한다.
이러한 접합의 예는 뉴클레오티드 서열 GAAA (Z = 링커, X = 헤테로원자) 스템 부착 지점을 나타내는 5'에서 3'까지를 포함하는 루프에 대해 하기에 도시된다. 화학식에서, 
는 올리고뉴클레오티드 가닥에 대한 부착 지점을 설명하는 데 사용된다.
적절한 방법 및 화학 (예를 들어, 클릭 화학)은 뉴클레오티드에 표적화 리간드를 연결할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 클릭 링커를 사용하여 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 아세탈-기반 링커는 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 뉴클레오티드에 표적화 리간드를 접합시키는 데 사용된다. 아세탈-기반 링커는 예를 들어, 국제 특허 공보 WO2016100401호에 개시되어 있으며, 이러한 링커에 관한 내용은 참조로 본원에 포함되어 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 불안정한 링커이다. 그러나 다른 실시양태에서, 링커는 안정하다. "불안정한 링커"는 예를 들어 산성 pH에 의해 절단될 수 있는 링커를 지칭한다. "안정한 링커"는 절단될 수 없는 링커를 지칭한다.
GalNAc 모이어티가 아세탈 링커를 사용하여 루프의 뉴클레오티드에 부착되는 뉴클레오티드 GAAA를 5'에서 3'으로 포함하는 루프에 대한 예가 하기에 도시된다. 화학식에서, 
는 올리고뉴클레오티드 가닥에 대한 부착 지점이다.
임의의 적절한 방법 또는 화학 (예를 들어, 클릭 화학)은 뉴클레오티드에 표적화 리간드를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 클릭 링커를 사용하여 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 아세탈-기반 링커는 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 뉴클레오티드에 표적화 리간드를 접합시키는데 사용된다. 아세탈-기반 링커는 예를 들어 국체 특허 출원 공개 번호 WO2016100401호에 개시되어 있으며, 이러한 링커에 관한 이의 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 불안정한 링커이다. 그러나 다른 실시양태에서, 링커는 안정하다. "상당히 안정한 링커"는 절단될 수 없는 링커를 지칭한다.
g. 변형 패턴
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 포스파타제, 뉴클레아제, 및 다른 효소에 대한 저항성을 증가시키고; 혼성화 안정성을 증진시키거나 유지하고; 표적화 특이성을 제공하고; 그리고 적절한 경우 (예를 들어 다이서 또는 아르고너트를 통해) RNA 침묵 처리를 증진시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티, 5'-말단 포스페이트, 뉴클레오시드간 연결, 및 염기의 각각의 변형 및 가역적 변형 및 표적화 리간드를 통한 변형은 정의된 실시양태에서 올리고뉴클레오티드에 통합된다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5'-말단 포스페이트는 포스페이트 유사체, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 4'-포스페이트 유사체로 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1 및 2에서 뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결은 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 4'-포스페이트 유사체로 변형된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5'-말단 포스페이트는 4'-O-메틸 포스포네이트로 변형된다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트 또는 뉴클레오티드간 연결은 예를 들어 포스포로티오에이트로 변형된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1 및 2, 및 2 및 3, 및 선택적으로 위치 3 및 4에서 뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결은 예를 들어 포스포로티오에이트로 변형된다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 7 내지 10, 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 9, 10, 11에서, 2'-F로 변형된 당 모이어티가 있는 하나 이상, 최대 4개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 9, 10, 11에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 전술한 실시양태에서, 센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 14 및 16에서 2'-F로 변형된 당 모이어티가 있는 하나 이상, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개 또는 최대 3개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 5 또는 14, 또는 뉴클레오티드 위치 5 및 14 모두에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 뉴클레오티드 위치 5에서 뉴클레오티드를 갖고, 선택적으로 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 6, 7, 10, 14 및 16에서 뉴클레오티드의 최대 5개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 뉴클레오티드 위치 14에서 뉴클레오티드를 갖고, 선택적으로 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 14 및 16에서, 최대 5개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 뉴클레오티드 위치 5 및 14에서 뉴클레오티드를 갖고, 선택적으로 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 6, 7, 10 및 16에서 최대 4개의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 2, 5 및 14에서 2'-F로 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 전술한 실시양태에서, 안티센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드는 2'-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥의 위치 1-7, 또는 12-36 및/또는 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 9, 11-13, 또는 15-22 위치 중 하나 이상은 2'-O-메틸로 변형되고; 그리고 센스 가닥의 위치 8-11 및/또는 안티센스 가닥의 위치 2, 3, 4, 5, 7, 10, 또는 14 중 하나 이상은 2'-플루오로로 변형된다. 특정 실시양태에서, 센스의 위치 1-7, 또는 12-36 및 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 9, 11-13, 또는 15-22는 2'-O-메틸로 변형되고; 및 센스 가닥의 위치 8-11 및 안티센스 가닥의 위치 2, 3, 4, 5, 7, 10, 또는 14는 2'-플루오로로 변형된다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 서열 S1-L-S2를 추가로 함유하며, L은 트라루프, 펜타루프 또는 트리루프이다. 일부 실시양태에서, S1 및 S2 영역의 하나 이상, 최대 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸로 변형된 당 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, L 서열의 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-O-메틸로의 당 모이어티의 변형을 가지며, L의 나머지 뉴클레오티드는 표적화 리간드를 갖는다. 일부 실시양태에서, L 영역의 모든 뉴클레오티드는 표적화 리간드, 예를 들어, GalNAc를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 듀플렉스를 형성할 때 1 내지 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행, 바람직하게는 2-뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 오버행의 뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트를 갖는다. 예로서 그리고 제한 없이, 길이가 22개의 뉴클레오티드인 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 연결로 변형된 잔기 20 및 21, 및 21 및 22 사이에 뉴클레오시드간 연결을 갖는다.
일부 실시양태에서, 예로서 그리고 제한 없이, 하기 구조의 예시적인 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 36개의 뉴클레오티드의 센스 가닥 및 길이가 22개의 뉴클레오티드의 안티센스, 여기서 센스 가닥은 영역 S1-L-S2를 포함하는 스템-루프 서열을 함유함)의 경우, 뉴클레오티드의 변형 패턴은 하기와 같다:
일부 실시양태에서, 예로서 그리고 제한 없이, 하기 구조의 예시적인 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 36개의 뉴클레오티드의 센스 가닥 및 길이가 22개의 뉴클레오티드의 안티센스, 여기서 센스 가닥은 영역 S1-L-S2를 포함하는 스템-루프 서열을 함유함)의 경우, 뉴클레오티드의 변형 패턴은 하기와 같다:
여기서,
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 당 모이어티의 변형, 5'-말단 포스페이트의 변형, 뉴클레오시드간 연결의 변형, 염기의 변형, 가역적 변형, 및 표적화 리간드를 통한 변형을 포함하는 변형 패턴의 다른 변화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 표 A로부터 선택된 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이다.
표 A: 도 1에 묘사된 올리고뉴클레오티드에 대한 서열 및 변형 정보
표 A의 변형 패턴에서:
"M"은 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"F"는 2'-F 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"S"는 3'-포스포로티오에이트 연결을 갖는 뉴클레오티드를 지칭하고;
"{MS}"는 3'-포스포로티오에이트 연결을 갖는 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"{FS}"는 2'3'-포스포로티오에이트 연결을 갖는 2'-F 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"[adem-GalNAc]"는 2'-GalNAc 접합체 
를 갖는 뉴클레오티드를 지칭하고;
[Me포스포네이트-4O-MS]"는 3'-포스포로티오에이트 연결을 갖는 5'-포스포네이트-4'-옥시-2'-OMe 변형된 뉴클레오티드를 지칭한다:
표 A의 변형된 서열에서:
"[mN]"은 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"[fN]"은 2'-F 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"[mNs]"는 3'-포스포로티오에이트 연결을 갖는 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"[fNs]"는 3'-포스포로티오에이트 연결을 갖는 2'-F 변형된 뉴클레오티드를 지칭하고;
"[ademA-GalNAc]"는 2'-GalNAc 접합체 
를 갖는 A 뉴클레오티드를 지칭하고;
"[Me포스포네이트-4O-mUs]"는 3'-포스포로티오에이트 연결을 갖는 5'-포스포네이트-4'-옥시-2'-OMe 우리딘을 지칭한다:
III. 약제학적 조성물
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 사용을 용이하게 하기 위한 약제학적 조성물로서 제공된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 분해를 최소화하거나, 전달 및/또는 흡수를 용이하게 하거나, 제형 내의 올리고뉴클레오티드에 또 다른 유익한 특성을 제공하는 약제학적 조성물 또는 제형을 사용하여 대상체 또는 세포 환경에 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 적합하게 제형화되어, 표적 세포의 즉각적인 환경 또는 국부화된 영역 또는 기관으로 대상체에게 투여될 때, 또는 전신적으로 투여될 때, 올리고뉴클레오티드의 충분한 부분이 세포로 들어가 표적 RNA 및/또는 상기 표적 RNA에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 감소시킨다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 임의의 다양한 적합한 약제학적 조성물을 사용하여 신경교세포에서 RNA 및/또는 단백질 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 약제학적 조성물은 완충 용액 (예를 들어, 인산염 완충 식염수), 리포솜, 미셀 구조 및 캡시드를 포함한다.
양이온성 지질을 갖는 올리고뉴클레오티드의 제형은 올리고뉴클레오티드의 세포로의 형질감염을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예컨대 리포펙틴, 양이온성 글리세롤 유도체 및 다중양이온성 분자 (예를 들어, 폴리리신)가 사용될 수 있다. 적합한 지질은 올리고펙타민, 리포펙타민 (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.), 또는 FuGene 6 (Roche)을 포함하고, 이들 모두는 제조업체의 지침에 따라 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 제형은 지질 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 리포솜, 지질, 지질 복합체, 마이크로스피어, 마이크로입자, 나노스피어 또는 나노입자를 포함하거나, 이를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직, 기관 또는 신체에 투여하기 위해 달리 제형화될 수 있다 (예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press, 2013 참조).
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 및 적합한 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 활성 성분의 개선된 안정성, 개선된 흡수, 개선된 용해도 및/또는 치료적 증진을 조성물에 부여한다. 일부 실시양태에서, 부형제는 완충제 (예를 들어, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포스페이트, 트리스 염기, 또는 나트륨 하이드록사이드) 또는 비히클 (예를 들어, 완충 용액, 바세린, 디메틸 설폭사이드 또는 광유)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 저장 수명을 연장하기 위해 동결건조된 후 사용 (예를 들어, 대상체에게 투여) 전에 용액으로 만들어진다. 따라서, 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 및 동결보호제 (예를 들어, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈) 또는 붕괴 온도 조절제 (예를 들어, 덱스트란, 피콜 또는 젤라틴)인 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 호환되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피, 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 척수강내, 뇌실내, 사이질, 정맥내, 비강내 또는 설하 투여와 호환되도록 제형화된다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말로 제형화되는 것과 같은 주사용 용도에 적합하다. 예를 들어, 정맥내, 척수강내, 뇌실내 또는 사이질에 대한 주사 투여를 위한 일부 실시양태에서, 적합한 담체 또는 또는 부형제는 예로서 그리고 제한 없이 식염수, 정균수, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J., USA) 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 나트륨 클로라이드를 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 선택된 용매에 필요한 양의 올리고뉴클레오티드를 혼입한 다음 여과 멸균하여 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 적어도 약 0.1%의 치료제 (예를 들어, 신경교세포에서 발현되는 RNA를 표적화하는 올리고뉴클레오티드)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 활성 성분(들)의 백분율은 전체 조성물의 중량 또는 부피의 약 1% 내지 약 80% 이상일 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 유효 기간, 뿐만 아니라 기타 약리학적 고려사항과 같은 인자는 이러한 약제학적 제형을 제조하는 기술 분야의 숙련가에 의해 고려될 것이며, 따라서 다양한 투여량 및 치료 레지멘이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 적절한 용매에서 주사용으로 적합한 것으로 상기 열거된 부형제 또는 담체 중 하나 또는 조합과 함께 혼입한 다음 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 다른 적합한 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 사전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 추가 바람직한 성분을 생성하는 동결 건조이다.
IV. 올리고뉴클레오티드의 용도
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 신경교세포로의 선택적 전달 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에 대한 선택도는 뉴런 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달 방법은 신경교세포를 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 대상체의 신경계에 존재한다. 일부 실시양태에서, 신경계에서 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 신경교세포로의 선택적 전달 방법은 대상체의 신경계에 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 신경교세포로의 선택적 전달 방법은 본원에 추가로 논의된 바와 같이 대상체의 신경 중추신경계 또는 말초신경계에 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소 방법은 신경교세포를 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소 방법은 대상체의 중추신경계 또는 말초신경계에 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 발현을 감소시키는데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 임의의 신경교세포 유형에 적용가능하다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포이다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 신경계에 존재하는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포이다. 일부 실시양태에서, 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 또는 위성세포는 중추신경계에 존재한다. 일부 실시양태에서, 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포는 말초신경계에 존재한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 성상세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 희소돌기교세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 상의 세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 미세교세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 슈반 세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 위성세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 장의 신경교세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 대상체의 중추신경계에서 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 또는 위성세포로의 선택적 전달을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 중추신경계는 뇌 및 척수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 뇌 또는 뇌간의 국부화된 영역에 있는 신경교세포를 포함하는 뇌 또는 뇌간의 신경교세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 전두엽 피질, 선조체, 체감각 피질, 해마, 시상하부 또는 소뇌의 신경교세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 뇌교 또는 수질과 같은 뇌간의 신경교세포로 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 척수의 국부화된 영역을 포함하는 대상체의 척수의 신경교세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 경추 척수, 흉추 척수 또는 요추 척수의 신경교세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다.
일부 실시양태에서, 중추신경계의 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 또는 위성세포이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계에서 성상세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계의 희소돌기교세포에서 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계에서 상의 세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계에서 미세교세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계에서 위성 세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 말초신경계에서 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 말초신경계의 신경교세포는 특히 뇌 신경, 척수 신경 및 말초 신경에 국한된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초신경계의 신경교세포는 특히 슈반 세포, 위성세포, 및 장의 신경교세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 말초신경계에서 슈반 세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 말초신경계에서 위성세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 말초신경계에서 장의 신경교세포로의 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 선택적 전달을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 또는 장의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 성상세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 희소돌기교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상의 세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 미세교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 슈반 세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 위성세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 장의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 신경교세포의 혼합물에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 신경계에서 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계에서 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 중추신경계는 뇌 및 척수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 뇌 또는 뇌간의 국부화된 영역에서 신경교세포를 포함하는, 뇌 또는 뇌간의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 전두엽 피질, 선조체, 체감각 피질, 해마, 시상하부, 또는 소뇌의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 뇌교 또는 수질과 같은 뇌간의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 척수의 국부화된 영역을 포함하는, 대상체의 척수의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 경추 척수, 흉추 척수 또는 요추 척수의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다.
일부 실시양태에서, 중추신경계의 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 또는 위성세포이다. 특정 실시양태에서, 중추신경계의 신경교세포는 성상세포, 상의 세포, 미세교세포, 또는 위성세포이다. 특정 실시양태에서, 신경교세포는 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계의 성상세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계의 희소돌기세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계의 상의 세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계의 미세교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 중추신경계의 위성세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 말초신경계의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 말초신경계의 신경교세포는 특히 뇌 신경, 척수 신경 및 말초 신경에 국한된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초신경계의 신경교세포는 특히 슈반 세포, 위성세포, 및 장의 신경교세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 말초신경계의 슈반 세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 말초신경계의 위성세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 말초신경계의 장의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 감소를 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 신경계의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 발현되는 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소 방법은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체의 신경계로 전달하기 위한 수단에 의한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 신경계의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소 방법은 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 경막내, 뇌실내, 정맥내, 사이질, 설하 또는 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 중추신경계의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소 방법은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 척수강내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포는 대상체의 뇌 또는 척수에 있다.
일부 실시양태에서, 대상체의 중추신경계의 신경교세포에서 표적 RNA 및/또는 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소 방법은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 뇌실내 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 중추신경계의 신경교세포에서 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소 방법은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 사이질 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 중추신경계의 국부화된 영역에 사이질 투여된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 전두엽 피질, 선조체, 체감각 피질, 해마, 시상하부, 또는 소뇌에 사이질 투여된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 경추 척수, 흉추 척수 또는 요추 척수와 같은 척수의 국부화된 영역을 포함하는 척수에 사이질 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체의 중추신경계의 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소 방법은 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 유효량을 대상체에게 비강내 투여하는 단계를 포함한다. 비강내 투여는 후각 및/또는 삼차 신경 경로를 통해 뇌간, 소뇌, 척수, 후각망울 및 피질 및 피질하 구조를 포함하는 중추신경계 영역으로의 수송을 허용한다.
상기 투여 경로 이외에, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 삼차 신경 경로를 통한 중추 신경계로의 전달을 위해 설하 또는 경피 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적절한 경우 정맥내 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액의 주입, 올리고뉴클레오티드에 의해 덮인 입자에 의한 충격, 세포 또는 유기체를 올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물에 노출, 또는 올리고뉴클레오티드의 존재하에 세포막의 전기천공을 비롯한 적절한 핵산 전달 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하기 위한 다른 적절한 방법, 예를 들어 지질-매개 담체 수송, 화학-매개 수송 및 칼슘 포스페이트 등과 같은 양이온성 리포솜 형질감염 등이 사용될 수 있다.
억제 효과는 세포 또는 대상체의 하나 이상의 특성을 평가하기 위한 적절한 검정에 의해, 또는 RNA 발현을 나타내는 분자 (예를 들어, RNA, 단백질)를 평가하는 생화학적 기술에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드가 세포, 조직 또는 기관에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 감소시키는 정도는 발현 수준 (예를 들어, mRNA 또는 단백질 수준)을 적절한 대조군 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 전달되지 않았거나 음성 대조군이 전달된 세포 또는 세포 집단에서의 RNA 발현 수준)과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, RNAi 발현의 적절한 대조군 수준은 대조군 수준이 매번 측정될 필요가 없도록 미리 결정된 수준 또는 값일 수 있다. 미리 결정된 수준 또는 값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미리 결정된 수준 또는 값은 중앙값 또는 평균과 같은 단일 컷-오프 값일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 투여는 신경교세포에서 RNA 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, RNA 발현 수준의 감소는 RNA의 적합한 대조군 수준과 비교하여 1% 이하, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 또는 90% 이하로의 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 발현 수준의 감소는 적어도 50% 이하이다. 일부 실시양태에서, RNA 발현 수준의 감소는 적어도 70% 이하이다. 일부 실시양태에서, RNA 발현 수준의 감소는 적어도 80% 이하이다. 일부 실시양태에서, 적절한 대조군 수준은 본원에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드와 접촉하지 않았거나 음성 대조군 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 무작위 뉴클레오티드 서열)로 처리되지 않은 신경교세포 또는 신경교세포 집단에서의 RNA 발현 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 신경교세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달 효과는 한정된 기간 후에 평가된다. 예를 들어, RNA의 수준은 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입한 후 적어도 8시간, 12시간, 18시간, 24시간; 또는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 14일 후에 분석될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 RNA 및/또는 상기 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소는 또 다른, 아마도 밀접하게 관련되거나 대안적인 형태의 뉴런 세포에서 발현되는 RNA 및/또는 단백질의 수준의 선택적 전달 또는 선택적 감소와 비교된다. 일부 실시양태에서, 선택도 또는 차별적 침묵은 신경교세포 및 뉴런 세포 모두에서 발현되는 표적 RNA의 발현 감소 %의 비교를 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 선택도는 뉴런 세포 특이적 RNA의 발현 감소 %와 비교하여 신경교세포 특이적 RNA의 발현 감소 %의 비교를 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포보다 신경교세포에 대한 선택도는 적어도 1.2; 1.3; 1.4; 1.5; 1.6. 1.7, 1.8; 1.9 또는 2 이상이다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포보다 신경교세포에 대한 선택도는 2 이상; 2.5 이상; 3 이상; 3.5 이상; 4 이상; 4.5 이상; 또는 5 이상이다. 일부 실시양태에서, 선택도는 뉴런 세포와 비교하여 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드를 신경교세포로 전달하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 선택도는 뉴런 세포에서 특이적으로 발현되는 RNA에 비해 신경교세포에서 특이적으로 발현되는 RNA의 감소를 위한 것이다. 다양한 실시양태에서, 뉴런 세포에서 발현되는 RNA 및/또는 단백질은 뉴런 세포 마커에 대해 본원에 기술된 바와 같은 임의의 뉴런 특이적 마커 단백질일 수 있다. 이들 뉴런 특이적 마커는 특히 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE 또는 감마-에놀라제); 뉴런 핵 (NeuN 또는 Fox3); 미세소관-관련 단백질 2 (MAP-2); 튜불린 베타 III (TUBB3); 더블코르틴 (DCX); c-fos; 콜린 아세틸트렌스퍼라제 (ChAT); 및 티로신 하이드록실라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경교세포와 뉴런세포 사이의 선택도를 평가하는 것은 비-뉴런 세포, 예를 들어 간세포에서 신경교세포 특이적 RNA 발현 및 뉴런 세포 특이적 RNA 발현의 유사한 감소 %를 생성하는 siRNA를 사용한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 세포에서 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 이의 센스 및 안티센스 가닥)를 발현하도록 조작된 이식유전자의 형태로 전달된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 조작된 이식유전자를 사용하여 전달된다. 이식 유전자는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스) 또는 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 합성 mRNA)를 사용하여 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식 유전자는 대상체에게 직접 주사될 수 있다.
본원의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에서 발현되는 임의의 RNA를 선택적으로 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 관심 표적 RNA의 발현을 감소시키는데 효과적이다. 상기 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 관심 표적 RNA는 신경교세포에서의 그의 발현이 신경교세포 기능장애를 갖는 질환 또는 장애와 관련된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 다음의 발현된 RNA에 대한 상보성 영역을 포함한다: 알렉산더병 (AxD)과 관련된 GFAP 유전자; 이염성 백질이영양증/크라베병과 관련된 PSAP 유전자; 샤르코마리투드병과 관련된 PMP22 유전자; 성인 발병 백질이영양증과 관련된 LMNB1 유전자; 알츠하이머병과 관련된 APP 유전자 및 TAU (MAPT) 유전자; 헌팅턴병과 관련된 SOD1 유전자, C9orf72 유전자, 및 HTT 유전자; 파킨슨병과 관련된 SNCA 또는 ASYN 유전자 및 LRRK2 유전자; 간질과 관련된 ADK 유전자; 뇌졸중과 관련된 TNFα 유전자 및 ERK5 / MAPK7 유전자; 외상성 뇌 손상 및 축삭 손상과 관련된 TNFα 유전자 및 GFAP 유전자; 자폐증과 관련된 IL- 1R2 유전자; 다발성 경화증과 관련된 CD49d 유전자; 교모세포종 및 신경교세포 암과 관련된 IGF -1 유전자, EGF 유전자, TGF -β 유전자, 및 VEGF 유전자; 근위축성 측삭 경화증 (ALS)과 관련된 SOD1 유전자, C9orf72 유전자, 및 TDP -43 유전자; 신경염증과 관련된 TNFα 유전자 및 CD38 유전자; 척수소뇌성 운동실조증과 관련된 ATXN2 유전자, ATXN3 유전자, 및 ATXN7 유전자; 진행성 핵상 마비와 관련된 TAU (MAPT) 유전자; 원발성 노화 타우병증 (PART)/신경원섬유엉킴 우세 노인성 치매와 관련된 TAU (MAPT) 유전자; 전측두엽 치매 및 17번 염색체에 연결된 파킨슨병 (FTDP-17)과 관련된 TAU (MAPT) 유전자; 및 말초 신경 탈수초화와 관련된 EGR2 유전자.
일부 실시양태에서, 인코딩된 단백질의 돌연변이 형태를 함유하는 유전자의 발현은 발현 감소를 위해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 과발현이 질환 또는 장애의 원인 또는 징후와 관련된 유전자는 발현 감소를 위해 표적화 된다. 일부 실시양태에서, 발현이 질환 또는 질병과 관련된 단백질의 돌연변이 형태를 인코딩하는 유전자(들)는 발현 감소를 위해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 과발현이 질환 또는 장애와 관련된 유전자 또는 돌연변이를 함유하는 유전자는 예로서 그리고 제한 없이 다음에 대한 유전자를 포함한다: GFAP (예를 들어, 문헌 [Rodriguez 등, American Journal of Human GENEtics, 2001, 69(6):1413] 참조); PMP22 (예를 들어, 문헌 [Robaglia-Schlupp 등, Brain, 2002, 125(10):2213-2221; Li 등, Mol Neurobiol., 2013, 47(2):673-98] 참조); LMNB1 (예를 들어, 문헌 [Padiath, Q.S., Cell Dev. Biol., 2019, 7(41):1-6] 참조); APP (예를 들어, 문헌 [Katsurabayashi 등, Physiological Reports, 2016, 4(1):e12665] 참조); TAU/MAPT (예를 들어, 문헌 [Le Guennec 등, Mol Psychiatry., 2017, 22(8):1119-1125] 참조); SOD1 (예를 들어, 문헌 [Massenzio 등, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 2018, 1864(12):3771-3785] 참조), C9orf72 (예를 들어, 문헌 [Balendra 등, Nat Rev Neurol., 2018, 14(9):544-558] 참조), ATXN2 (예를 들어, 문헌 [Ostrowski 등, GNEEs (Basel), 2017, 8(6):157] 참조), ATXN3 (예를 들어, 문헌 [Neves-Carvalho 등, Hum Mol 유전자 t, 2015, 24(1):100-117] 참조), ATXN7 (예를 들어, 문헌 [Lan 등, Mol Cell Biol., 2015, 35(10):1777-1787] 참조); HTT (예를 들어, 문헌 [Shin 등, J Cell Biol., 2005, 171(6):1001-1012] 참조); SNCA / ASYN (예를 들어, 문헌 [Oliveira 등, Cell Death Dis., 2015, 6(11):e1994] 참조); ADK (예를 들어, 문헌 [De Groot 등, Epilepsia, 2011, 53(1):858-66] 참조), TNFα (예를 들어, 문헌 [Welser-Alves 등, Neurochem Int., 2013, 63(1):47-53] 참조); CD49d (예를 들어, 문헌 [Limmroth, V., Neurology, 2014, 83(20):1780-1788] 참조); 또는 TDP -43 (예를 들어, 문헌 [Lu 등, Int J Biol Sci., 2016, 12(9):1140-1149] 참조). 상응하는 질환 또는 장애 및 참조 mRNA는 상기에 기술되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 신경교세포에서 표적 유전자의 발현에 의해 유발되거나 이와 관련된 질환을 앓거나 발병 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 영향을 받을 수 있는 질환 또는 장애는, 예로서 그리고 제한 없이, 다음을 포함한다: GFAP 유전자의 발현과 관련된 알렉산더병 (AxD); PSAP 유전자의 발현과 관련된 이염성 백질이영양증/크라베병; PMP22 유전자의 발현과 B련된 샤르코마리투드병; LMNB1 유전자의 발현과 관련된 성인 발병 백질이영양증; APP 유전자의 발현과 관련된 알츠하이머병; SOD1 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열 NM_000454.4), C9orf72 유전자 (예를 들어, 참조 mRNA 서열: NM_001256054.2; NM_018325.5; NM_145005.6), 및 HTT 유전자의 발현과 관련된 헌팅턴병; SNCA / ASYN 유전자 및 LRRK2 유전자의 발현과 관련된 파킨슨병; ADK 유전자의 발현과 관련된 간질; TNFα 유전자 및 ERK5 / MAPK7 유전자의 발현과 관련된 뇌졸중 및 그 영향; TNFα 유전자 및 GFAP 유전자의 발현과 관련된 외상성 뇌 손상 및 축삭 손상 및 그 영향; IL- 1R2 유전자의 발현과 관련된 자폐증; CD49d 유전자의 발현과 관련된 다발성 경화증; IGF -1 유전자, EGF 유전자, TGF -β 유전자, 및 VEGF 유전자의 발현과 관련된 교모세포종 및 신경교세포 암; SOD1 유전자, C9orf72 유전자, 및 TDP -43 유전자의 발현과 관련된 근측삭경화증 (ALS); TNFα 유전자 및 CD38 유전자의 발현과 관련된 신경염증; ATXN2 유전자, ATXN3 유전자, 및 ATXN7 유전자의 발현과 관련된 척수소뇌성 운동실조증; TAU (MAPT) 유전자와 관련된 진행성 핵상 마비; TAU (MAPT) 유전자의 발현과 관련된 원발성 노화 타우병증 (PART)/신경원섬유엉킴 우세 노인성 치매; TAU (MAPT) 유전자의 발현과 관련된 전측두엽 치매 및 17번 염색체에 연결된 파킨슨병 (FTDP-17); EGR2 유전자의 발현과 관련된 말초 신경 탈수초화.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 올리고뉴클레오티드의 유효량, 즉 바람직한 치료 결과를 생성할 수 있는 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료적으로 허용되는 양은 질환 또는 장애를 치료할 수 있는 양일 수 있다. 임의의 한 명의 대상체에 대한 적절한 투여량은 대상체의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 조성물, 조성물 내의 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 일반 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 특정 인자에 따라 달라진다.
비제한적인 예의 세트로서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 분기별 (3개월마다 1회), 격월 (2개월 마다 1회), 매월 또는 매주 투여될 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 매주 또는 2주 또는 3주 간격으로 매일 투여될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 매일 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료될 대상체는 인간 또는 인간이 아닌 영장류 또는 다른 포유동물 대상체이다. 다른 예시적인 대상체는 개 및 고양이와 같은 길들여진 포유동물; 말, 소, 돼지, 양, 염소 및 닭과 같은 가축; 및 마우스, 랫트, 기니피그 및 햄스터와 같은 다른 포유동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 환자로 지칭된다.
ii. 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA의 선택적 전달 및/또는 선택적 감소를 위한 간섭 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝 방법.
추가 측면에서, 본 개시내용은은 신경교세포 또는 뉴런 세포에 대해 선택적인 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝은 뉴런 세포보다 신경교세포에 대해 선택적인 올리고뉴클레오티드를 식별하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 스크리닝은 신경교세포보다 뉴런 세포에 대해 선택적인 올리고뉴클레오티드를 식별하기 위한 것이다. 다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 감소시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 테스트된 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포와 비교하여 신경교세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 RNA의 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서 올리고뉴클레오티드는 신경교세포와 비교하여 뉴런 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 RNA의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 신경교세포 또는 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝 방법은 다음을 포함한다:
신경교세포 및 뉴런 세포를 후보 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 상기 후보 올리고뉴클레오티드는 신경교세포 및 뉴런 세포 모두에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는, 단계; 및
표적 RNA 발현 수준에 대한 임의의 차등 효과를 결정하기 위해 신경교세포 및 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준을 측정하는 단계.
일부 실시양태에서, 신경교세포 또는 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝 방법은 다음을 포함한다:
대상체의 신경계에 후보 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계로서, 상기 후보 올리고뉴클레오티드는 신경계의 신경교세포 및 뉴런 세포 모두에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는, 단계; 및
표적 RNA 발현 수준에 대한 임의의 차등 효과를 결정하기 위해 신경교세포 및 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준을 측정하는 단계. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이 아닌 포유동물이다.
일부 실시양태에서, 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준의 감소보다 신경교세포에서 표적 RNA의 수준의 더 큰 감소를 나타내는 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에 대해 선택적인 것으로 식별된다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포보다 신경교세포에 대한 올리고뉴클레오티드의 선택도는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 이상이다.
일부 실시양태에서, 신경교세포에서 표적 RNA의 수준의 감소보다 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준의 더 큰 감소를 나타내는 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포에 대해 선택적인 것으로 식별되었다. 일부 실시양태에서, 신경교세포보다 뉴런 세포에 대한 올리고뉴클레오티드의 선택도는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 이상이다.
일부 실시양태에서, 후보 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)을 포함하고, 여기서 dsNA는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 후보 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스를 형성하고, 상기 안티센스은 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 가지며, 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 후보 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드로 변형된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 지질, 펩티드, 또는 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 본원에 상세히 기술된 바와 같이 하나 이상의 GalNAc 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 후보 올리고뉴클레오티드가 대상체의 신경계에 투여되는 경우, 신경교세포 및 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준을 결정하기 위한 측정은 신경계 전체 또는 신경계의 국부화된 영역에 분포하는 신경교세포 및 뉴런세포에서 표적 RNA의 수준을 측정함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 검사된 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 장의 신경교세포, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 신경교세포, 또는 대안적으로 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 간섭 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝 방법은 다음을 포함한다:
신경교세포를 제1 후보 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에서 발현되는 제1 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 표적 RNA 발현 수준을 감소시킬 수 있는, 단계;
뉴런 세포를 제2 후보 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포에서 발현되는 제2 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 표적 RNA 발현 수준을 감소시킬 수 있는, 단계; 및
신경교세포에서 제1 표적 RNA의 수준 및 뉴런 세포에서 제2 표적 RNA의 수준을 측정하고, 제1 표적 RNA 및 제2 표적 RNA에서 임의의 차등 감소를 결정하는 단계.
일부 실시양태에서, 신경교세포, 또는 대안적으로 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝 방법은 다음을 포함한다:
제1 대상체의 신경계에 제1 후보 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계로서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에서 발현되는 제1 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는, 단계;
제2 대상체의 신경계에 제2 후보 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계로서, 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포에서 발현되는 제2 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는, 단계;
제1 대상체 및 제2 대상체의 신경계의 신경교세포에서 제1 표적 RNA의 수준 및 뉴런 세포에서 제2 표적 RNA의 수준을 측정하는 단계로서, 상기 제1 대상체 및 제2 대상체는 동일한 종인, 단계.
일부 실시양태에서, 제1 후보 올리고뉴클레오티드 및 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 각각의 표적 RNA에 대한 상보성 영역에 대해서만 상이하다. 일부 실시양태에서, 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA는 신경교세포에서 특이적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA는 뉴런 세포에서 특이적으로 발현된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "특이적으로 발현되는"은 다른 세포와 비교하여 한 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 RNA를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA는 다른 세포에서의 발현보다 한 세포에서 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10배 이상 특이적으로 발현된다.
후보 올리고뉴클레오티드가 다른 세포 유형보다 하나의 세포 유형에 대해 더 큰 선택도를 나타내는 경우, 다른 세포에서 표적 RNA의 수준의 감소 보다 한 세포에서 표적 RNA의 수준의 더 큰 감소 (예를 들어, 감소%로서)는 표적 RNA의 수준 더 큰 감소가 관찰되어야 한다.
일부 실시양태에서, 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준의 감소보다 신경교세포에서 표적 RNA의 수준의 더 큰 감소를 나타내는 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에 대해 선택적인 것으로 식별된다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포보다 신경교세포에 대한 올리고뉴클레오티드의 선택도는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 이상이다.
일부 실시양태에서, 신경교세포에서 표적 RNA의 수준의 감소보다 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준의 더 큰 감소를 나타내는 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포에 대해 선택적인 것으로 식별된다. 일부 실시양태에서, 신경교세포보다 뉴런 세포에 대한 올리고뉴클레오티드의 선택도는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 이상이다.
일부 실시양태에서, 제1 후보 올리고뉴클레오티드 및 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 후보 올리고뉴클레오티드 및 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)을 포함하고, 여기서 dsNA는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 후보 올리고뉴클레오티드는 제1 센스 가닥 및 제1 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 제1 센스 가닥 및 제2 안티센스 가닥은 제1 듀플렉스를 형성하고, 제1 안티센스 가닥은 신경교세포에서 발현되는 제1 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 가지며 제1 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 제2 센스 가닥 및 제2 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 제2 센스 가닥 및 제2 안티센스 가닥은 제2 듀플렉스를 형성하고, 제2 안티센스 가닥은 뉴런 세포에서 발현된 제2 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 가지며 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드로 변형된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 지질, 펩티드, 또는 이들의 혼합물 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 본원에 상세히 기술된 바와 같이 하나 이상의 GalNAc 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 후보 올리고뉴클레오티드가 대상체의 신경계에 투여되는 경우, 신경교세포 및 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준을 결정하기 위한 측정은 신경계 전체 또는 신경계의 국부화된 영역에 분포된 신경교세포 및 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준을 측정함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 검사된 신경교세포는, 예로서 그리고 제한 없이, 성상세포, 희소돌기교세포, 상의 세포, 미세교세포, 슈반 세포, 위성세포, 장의 신경교세포, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴런 세포는, 예로서 그리고 제한 없이, 운동 뉴런, 감각 뉴런, 중간뉴런 및 이들의 조합을 포함한다.
본원에 기술된 본 발명이 보다 완전히 이해될 수 있도록 하기 실시예가 제시된다. 본 출원에 기술된 실시예는 본 명세서에 제공된 방법, 조성물 및 시스템을 설명하기 위해 제공되며 어떤 식으로든 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 세포-유형-특이적 표적화 siRNA의 식별.
특정 세포 하위집단에서 유전자 침묵의 수준을 평가하기 위해, 뉴런 또는 성상세포-특이적 유전자를 표적으로 하는 GalXC siRNA를 식별하는 것이 필요하였다. Tubb3 및 Gfap mRNA는 이용가능한 RNA-seq 데이터를 포괄적으로 검토한 후에 선택되었다. TUBB3, 또는 튜불린 베타 3 클래스 III는 베타 튜불린 계열의 구성원이며 미세소관 조립에 관여한다. Tubb3 mRNA는 주로 뉴런에서 발현된다. GFAP 또는 신경교 원섬유 산성 단백질은 성숙한 성상세포의 주요 중간 필라멘트 단백질 중 하나이며, 종종 발생 중에 성상세포를 다른 비신경 세포 유형과 구별하기 위한 마커로서 사용된다. 연구를 위해 준비된 siRNA 분자의 서열 및 구조는 도 1에 예시되어 있다. 따라서, 각 표적의 발현은 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이 각각 뉴런 및 성상세포에서 매우 특이적이다.
Gfap mRNA를 표적으로 하는 GalXC-siRNA 분자는 생체내 스크리닝을 수행함으로서 생성되었다 (도 3). Tubb3 mRNA를 표적으로 하는 GalXC-siRNA 분자는 유사한 생체내 스크린을 수행함으로써 생성되었다 (도 4). 예를 들어, 동물은 1일차에 0-3 mg/kg GalXC-TUBB3가 피하 주사되고, 4일차에 Tubb3 mRNA를 발현하는 플라스미드가 정맥 주사되었다 (CD-1, 암컷, 그룹당 n=5). Tubb3 mRNA의 수준은 5일차에 RT-qPCR에 의해 간에서 분석되었다. 각 스크린의 상단 서열은 ~1 mg/kg 범위의 ED50 값을 가졌고 마우스 CNS 및 PNS에서 평가를 위해 선택되었다.
실시예 2: CNS에서 GalXC siRNA에 의한 신경 세포 하위집단의 선택적 표적화.
GalXC-TUBB3 및 GalXC-GFAP에 대한 약리학을 뇌 및 척수의 뉴런 및 성상세포에서 평가하였다. 동등한 용량의 GalXC-TUBB3 또는 GalXC-GFAP를 볼루스 i.c.v. 주사로 투여하고 Tubb3 및 Gfap mRNA의 수준을 CNS를 통해 1주 후에 측정하였다. 두 GalXC siRNA는 화학적 구성이 동일하며 간에서 HDI로 평가한 것과 동일한 상대 ED50를 갖는다. GalXC siRNA는 놀랍게도 Tubb3 mRNA를 표적으로 삼도록 설계된 유사한 화학적 조성의 GalXC siRNA와 비교하여 뇌의 모든 영역에서 훨씬 더 큰 정도로 Gfap mRNA를 침묵시킬 수 있다. 전체 뇌와 척수에 걸쳐 세포 유형 간에 관찰된 예상치 못한 극적인 역가 차이는 GalXC siRNA가 CNS에 주입된 후 성상세포를 선택적으로 표적화할 수 있음을 명백히 보여준다.
전두엽 피질 (도 5): 성상세포에서 특이적으로 발현되는 유전자인 Gfap를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 전두엽 피질에서 최대 90%의 유전자 침묵이 가능하다 (n= 그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). 뉴런에서 특이적으로 발현되는 유전자인 Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 ~10-30% 유전자 침묵만 가능하다 (n= 그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령).
선조체 (도 6): Gfap를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주차에 놀랍게도 선조체에서 최대 80%의 유전자 침묵을 달성할 수 었다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). 한편, Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주 후에 ~0-25% 유전자 침묵만 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령).
체감각 피질 (도 7): Gfap를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 1주차에 체감각 피질에서 최대 75% 유전자 침묵이 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). 반면, Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주 후에 ~0-10% 유전자 침묵이 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령).
해마 (도 8): Gfap를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주차에 해마에서 최대 80% 유전자 침묵이 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주 후 ~0-25% 유전자 침묵만 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령).
시상하부 (도 9): Gfap를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주차에 시상하부에서 최대 80% 유전자 침묵이 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주 후 ~0-25% 유전자 침묵만 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령).
소뇌 (도 10): Gfap를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주차에 소뇌에서 최대 95% 유전자 침묵이 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주 후 ~0-40% 유전자 침묵만 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령).
뇌간 (도 11): Gfap를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주차에 뇌간에서 최대 90% 유전자 침묵이 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주일에 ~0-30% 유전자 침묵만 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령).
척수 (도 12): 뉴런에서 특이적으로 발현되는 유전자인 Tubb3을 표적으로 하는 GalXC siRNA는 우심실에 500 μg의 단일 볼루스 주입 후 1주차에 ~0-25% 유전자 침묵이 가능하다 (n=그룹당 마우스 4마리, CD1, 암컷, 4-6주령). 이 화학적 구성에서, 표적 유전자가 신경교세포와 뉴런 세포 유형 모두에서 발현되더라도 대뇌 척수액으로의 볼루스 주입 후 척수의 뉴런 (운동 뉴런, 중간뉴런 등)에서 유전자 침묵이 예상되지 않는다. 이는 신경교의 질환을 치료할 때 신경 독성 또는 생존가능성에 대한 우려를 완화한다.
실시예 3: GalNAc 표적화 리간드가 결여된 siRNA에 의한 뉴런 세포 하위집단의 선택적 표적화.
이 연구는 siRNA를 뉴런 및 신경교세포로 표적화하는데 있어서 GaNAc 잔기의 역할을 조사하였다. 도 13의 패널 A에서, GalXC-GFAP-1147 (GalNAc)은 3개의 부착된 GalNAc 모이어티가 있는 표준 GalXC 화학인 반면, GalXC-GFAP-1147 (GalNAc 없음)은 동일한 화학을 갖지만 3개의 접합된 GalNAc 당이 결여된 유사한 분자이다. GFAP 특이적 siRNA는 요추 척수강내 주사에 의해 500 μg의 단일 볼루스 주입으로 지주막하 공간에 투여되었다 (n=그룹당 마우스 5마리, C57BL/6, 암컷, 4-6주령). Gfap mRNA를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 투여 후 1주일에 요추 척수의 성상세포에서 최대 70-75% 유전자 침묵이 가능했으며, 이는 siRNA에 GalNAc 모이어티가 없어도 뮤린 뇌에서 이들의 유전자 표적을 침묵시키는 이러한 올리고뉴클레오티드의 능력을 감소시키지 않는다는 것을 입증한다.
도 13의 패널 B에서, GalXC-TUBB3-445 (GalNAc)는 3개의 부착된 GalNAc 모이어티를 갖는 표준 GalXC 화학인 반면, GalXC-TUBB3-445 (GalNAc 없음)는 동일한 화학을 갖지만 3개의 접합된 GalNAc 당이 결여된 유사한 분자이다. TUBB 특이적 siRNA는 척수강내 주사에 의해 500 μg의 단일 볼루스 주입으로 지주막하 공간에 투여되었다 (n=그룹당 마우스 5마리, C57BL/6, 암컷, 4-6주령). Tubb3 mRNA를 표적으로 하는 GalXC siRNA는 투여 후 1주일에 요추 척수의 뉴런에서 최대 30-35% 유전자 침묵이 가능했으며, 이는 GalNAc 모이어티의 부재가 뮤린 뇌에서 이들의 유전자 표적을 침묵시키는 이러한 올리고뉴클레오티드의 능력을 감소시키지 않는다는 것을 입증한다.
뉴런과 비교하여 성상세포에 대한 siRNA의 차등적 표적화의 유지는 siRNA가 GalNAc 모이어티가 있거나 없는 신경교세포에 우선적으로 전달될 수 있음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 서열 목록에 제시된 서열은 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산의 구조를 설명할 때 참조될 수 있음을 인식해야 한다. 이러한 실시양태에서, 실제 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산은 하나 이상의 대체 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 뉴클레오티드의 RNA 대응물 또는 RNA 뉴클레오티드의 DNA 대응물) 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결 및/또는 특정 서열과 본질적으로 동일하거나 유사한 상보적 특성을 유지하면서 특정 서열과 비교하여 하나 이상의 다른 변형을 가질 수 있다.
본 발명을 기술한다는 맥락에서 용어 a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 참조대상의 사용은 본원에 달리 지시되지 않는 한, 또는 문맥에 명백하게 반박되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 아우르는 것으로 해석되어야 함을 이해해야 한다. 용어 "포함하는", "가지는", "포함되는" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한 열린 용어 (득, "포함하지만, 제한되지 않는")로 간주되어야 한다.
또한, 본원에서 값의 범위를 열거하는 것은 본원에서 달리 나타내지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 역할을 하기 위한 것이며, 각각의 별개의 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 실시예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문서는 마치 각 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문서가 개별적으로 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체내용이 참조로 포함된다.
다양한 특정 실시양태가 예시되고 설명되었지만, 본 발명(들)의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> DICERNA PHARMACEUTICALS, INC.
<120> SELECTIVE DELIVERY OF OLIGONUCLEOTIDES TO GLIAL CELLS
<130> 400930-024WO (186214)
<140> PCT/US2021/071785
<141> 2021-10-08
<150> 63/089,406
<151> 2020-10-08
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<170> PatentIn version 3.5
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1 5
Claims (107)
- 간섭 올리고뉴클레오티드를 신경교세포에 선택적으로 전달하는 방법으로서,
신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 신경교세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 올리고뉴클레오티드는 상기 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 상보성 영역은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 상보성 영역은 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 핵산인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 12 내지 58개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스를 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 상기 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고 상기 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 RNA를 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 dsNA를 포함하는, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이가 15 내지 40개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 27개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드인 듀플렉스를 형성하는, 방법.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 별개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 단일 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 듀플렉스를 형성할 때, 길이가 최대 6개의 뉴클레오티드인 3' 오버행을 갖는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 3' 오버행을 갖고, 상기 3'-오버행은 길이가 2개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 영역 S1-L-S2를 포함하는 스템-루프 서열을 추가로 포함하고, 상기 S1은 S2와 상보적이고, L은 S1 및 S2가 듀플렉스를 형성할 때 S1과 S2 사이에 형성되는 루프이고, 상기 스템-루프 서열은 3'-말단에서 상기 센스 가닥에 부착되는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 루프 L은 길이가 4개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드를 추가로 포함하고, 상기 표적화 리간드는 상기 스템-루프 서열의 상기 루프 L 상에 존재하는, 방법.
- 제19항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 GalNAc 모이어티인, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 및/또는 뉴클레아제에 대한 상기 올리고뉴클레오티드의 저항성을 증가시키고, 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나, 생체내 안정성을 향상시키는 수단을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의세포, 미세교세포, 슈반세포, 위성세포, 장의 신경교세포 또는 이들의 혼합물인, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경교세포는 대상체의 신경계에 존재하는, 방법
- 제25항에 있어서, 상기 신경교세포는 대상체의 중추신경계에 존재하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 신경교세포는 전두엽 피질, 선조체, 체감각 피질, 해마, 시상하부, 소뇌, 뇌간 및/또는 척수에 존재하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 신경교세포는 척수에 존재하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 신경교세포는 경추 척수, 흉추 척수 및/또는 요추 척수에 존재하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 신경교세포는 대상체의 말초신경계에 존재하는, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 RNA는 뉴런 세포에 비해 신경교세포에서 특이적으로 발현되는, 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 엑손에 대한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 5' 비번역 영역에 대한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 3' 비번역 영역에 대한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 대립유전자 특이적 서열에 대한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 선택도는 신경 세포보다 신경교세포에 대해 적어도 약 1.5인, 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 세포보다 신경교세포에 대한 선택도는 2 이상; 2.5 이상; 3 이상; 3.5 이상; 4 이상; 4.5 이상; 또는 5 이상인, 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 RNA는 GFAP 유전자, PSAP 유전자, PMP22 유전자, LMNB1 유전자, APP 유전자, TAU (MAPT) 유전자, SOD1 유전자, C9orf72 유전자, HTT 유전자, SNCA 또는 ASYN 유전자, LRRK2 유전자, ADK 유전자, TNFα 유전자, ERK5 / MAPK7 유전자, IL- 1R2 유전자, CD49d 유전자, IGF -1, EGF 유전자, TGF -β 유전자, VEGF 유전자, TDP -43 유전자, CD38 유전자, ATXN2 유전자, ATXN3 유전자, ATXN7 유전자, 또는 EGR2 유전자로부터 발현되는 RNA인, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 신경교세포는 신경교 암 세포이고, 상기 표적 RNA는 상기 신경교 암 세포에서 발현이 증가된 RNA인, 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 신경교 암 세포는 교모세포종인, 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 표적 RNA는 IGF -1 유전자, EGF 유전자, TGF-β 유전자, 또는 VEGF 유전자로부터 상기 신경교 암 세포에서 발현되는 RNA인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 대상체에게 경막내, 뇌실내, 사이질, 설하 또는 비강내로 투여되는, 방법.
- 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 방법으로서,
신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 신경교세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 올리고뉴클레오티드는 상기 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는 것인, 방법. - 제43항에 있어서, 상기 상보성 영역은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 상보성 영역은 길이가 12 내지 30개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 핵산인, 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)인, 방법.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 12 내지 60개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 듀플렉스를 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 상기 신경교세포에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고 상기 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는 것인, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 RNA를 포함하는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 dsNA를 포함하는, 방법.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이가 15 내지 40개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 27개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드인 듀플렉스를 형성하는, 방법.
- 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 별개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 단일 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 듀플렉스를 형성할 때, 최대 6개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 갖는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 안티센스 가닥 상의 상기 3' 오버행은 길이가 2개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 영역 S1-L-S2를 포함하는 스템-루프 서열을 추가로 포함하고, 상기 S1은 S2와 상보적이고, L은 S1 및 S2가 듀플렉스를 형성할 때 S1과 S2 사이에 형성되는 루프이고, 상기 스템-루프 서열은 3'-말단에서 상기 센스 가닥에 부착되는, 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 루프 L은 길이가 4개의 뉴클레오티드인, 방법.
- 제43항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제59항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드를 추가로 포함하고, 상기 스템-루프 서열의 상기 루프 L 상에 존재하는, 방법.
- 제61항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 GalNAc 모이어티인, 방법.
- 제43항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 및/또는 뉴클레아제에 대한 상기 올리고뉴클레오티드의 저항성을 증가시키고, 혼성화 효율을 증가시키고/시키거나, 생체내 안정성을 향상시키는 수단을 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의세포, 미세교세포, 슈반세포, 위성세포, 장의 신경교세포 또는 이들의 혼합물인, 방법.
- 제43항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경교세포는 대상체의 신경계에 존재하는, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 신경교세포는 대상체의 중추신경계에 존재하는, 방법.
- 제68항에 있어서, 상기 신경교세포는 전두엽 피질, 선조체, 체감각 피질, 해마, 시상하부, 소뇌, 뇌간 및/또는 척수에 존재하는, 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 신경교세포는 척수에 존재하는, 방법.
- 제70항에 있어서, 상기 신경교세포는 경추 척수, 흉추 척수 및/또는 요추 척수에 존재하는, 방법.
- 67항에 있어서, 상기 신경교세포는 대상체의 말초신경계에 존재하는, 방법.
- 제43항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 RNA는 뉴런 세포에 비해 신경교세포에서 특이적으로 발현되는, 방법.
- 제43항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 엑손에 대한 것인, 방법.
- 제43항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 5' 비번역 영역에 대한 것인, 방법.
- 제43항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 3' 비번역 영역에 대한 것인, 방법.
- 제43항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상보성 영역은 상기 표적 RNA의 대립유전자 특이적 서열에 대한 것인, 방법.
- 제43항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 선택도는 신경 세포보다 신경교세포에 대해 적어도 약 1.5인, 방법.
- 제43항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 세포보다 신경교세포에 대한 선택도는 2 이상; 2.5 이상; 3 이상; 3.5 이상; 4 이상; 4.5 이상; 또는 5 이상인, 방법.
- 제43항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 RNA는 GFAP 유전자, PSAP 유전자, PMP22 유전자, LMNB1 유전자, APP 유전자, TAU (MAPT) 유전자, SOD1 유전자, C9orf72 유전자, HTT 유전자, SNCA 또는 ASYN 유전자, LRRK2 유전자, ADK 유전자, TNFα 유전자, ERK5 / MAPK7 유전자, IL- 1R2 유전자, CD49d 유전자, IGF -1, EGF 유전자, TGF -β 유전자, VEGF 유전자, TDP -43 유전자, CD38 유전자, ATXN2 유전자, ATXN3 유전자, ATXN7 유전자, 또는 EGR2 유전자로부터 발현되는 RNA인, 방법.
- 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경교세포는 신경교 암 세포이고, 상기 표적 RNA는 상기 신경교 암 세포에서 발현이 증가된 RNA인, 방법.
- 제81항에 있어서, 상기 신경교 암 세포는 교모세포종인, 방법.
- 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 표적 RNA는 IGF -1 유전자, EGF 유전자, TGF-β 유전자, 또는 VEGF 유전자로부터 상기 신경교 암 세포에서 발현되는 RNA인, 방법.
- 제43항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 대상체에게 경막내, 뇌실내, 사이질, 설하 또는 비강내로 투여되는, 방법.
- 신경교세포 또는 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 스크리닝 방법으로서,
신경교세포 및 뉴런 세포를 후보 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 상기 후보 올리고뉴클레오티드는 신경교세포 및 뉴런 세포 둘 모두에서 발현되는 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하는, 단계; 및
표적 RNA 발현의 수준에 대한 차등 효과를 결정하기 위해 신경교세포 및 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 신경교세포 또는 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 스크리닝 방법으로서,
대상체의 중추신경계에 후보 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계로서, 상기 후보 올리고뉴클레오티드는 상기 중추신경계의 신경교세포 및 뉴런 세포 모두에서 발현되는 표적 RNA의 상보성 영역을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 발현을 감소시킬 수 있는 것인, 단계; 및
표적 RNA 발현의 수준에 대한 차등 효과를 결정하기 위해 신경교세포 및 뉴런 세포에서 표적 RNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 포함하는, 방법.
- 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)을 포함하고, 상기 dsNA는 리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제88항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 듀플렉스를 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 상기 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖고, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 발현의 수준을 감소시킬 수 있는 것인, 방법.
- 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제90항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 지질 또는 펩티드를 포함하는, 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 GalNAc 모이어티를 포함하는, 방법.
- 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 중추신경계의 신경교세포 및 뉴런 세포 전체에 분포된 표적 RNA의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
- 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의세포, 미세교세포, 슈반세포, 위성세포, 장의 신경교세포인, 방법.
- 신경교세포 또는 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 스크리닝 방법으로서,
신경교세포를 제1 후보 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에서 발현되는 제1 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 표적 RNA 발현의 수준을 감소시키는 것인, 단계;
뉴런 세포를 제2 후보 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포에서 발현되는 제2 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 표적 RNA 발현의 수준을 감소시키는 것인, 단계; 및
신경교세포의 제1 표적 RNA 및 뉴런 세포의 제2 표적 RNA의 수준을 측정하고, 제1 표적 RNA 및 제2 표적 RNA에서 임의의 차등 감소를 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 신경교세포 또는 뉴런 세포에서 발현되는 표적 RNA의 수준을 선택적으로 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 스크리닝 방법으로서,
제1 대상체의 신경계에 제1 후보 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계로서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드는 신경교세포에서 발현되는 제1 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제1 뉴클레오티드는 상기 제1 표적 RNA 발현의 수준을 감소시킬 수 있는 것인, 단계;
제2 대상체의 신경계에 제2 후보 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계로서, 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 뉴런 세포에서 발현되는 제2 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 표적 RNA 발현의 수준을 감소시킬 수 있는 것인, 단계; 및
상기 제1 대상체 및 상기 제2 대상체의 신경계에서 신경교세포의 제1 표적 RNA 및 뉴런 세포의 제2 표적 RNA의 수준을 측정하는 단계로서, 상기 제1 대상체 및 상기 제2 대상체는 동일한 종인, 단계를 포함하는, 방법. - 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 또는 제2 표적 RNA에 대한 상보성 영역에서만 상이한 것인, 방법.
- 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 신경교세포에서 발현되는 상기 제1 표적 RNA는 신경교세포에서 특이적으로 발현되고, 뉴런 세포에서 발현되는 상기 제2 표적 RNA는 뉴런 세포에서 특이적으로 발현되는, 방법.
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드 각각은 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 (dsNA)을 포함하고, 상기 dsNA는 RNA를 포함하는, 방법.
- 제100항에 있어서,
상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드는 제1 센스 가닥 및 제1 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 제1 센스 가닥 및 상기 제2 센스 가닥은 제1 듀플렉스를 형성하고, 상기 제1 안티센스 가닥은 신경교세포에서 발현되는 제1 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖고 제1 표적 RNA의 수준을 감소시킬 수 있고; 그리고
상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 제2 센스 가닥 및 제2 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 제2 센스 가닥 및 상기 제2 안티센스 가닥은 제2 듀플렉스를 형성하고, 상기 제2 안티센스 가닥은 상기 뉴런 세포에서 발현되는 제2 표적 RNA에 대한 상보성 영역을 갖고 제2 표적 RNA의 수준을 감소시킬 수 있는, 방법. - 제95항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 후보 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 후보 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제102항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 지질 또는 펩티드 또는 이들의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 하나 이상의 GalNAc 모이어티를 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 신경계 전체에 분포된 신경교세포의 제1 표적 RNA 및 뉴런 세포의 제2 표적 RNA의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경교세포는 성상세포, 희소돌기교세포, 상의세포, 미세교세포, 슈반세포, 위성세포, 장의 신경교세포 및 이들의 조합인, 방법.
- 제95항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴런 세포는 운동 뉴런, 감각 뉴런, 중간뉴런 및 이들의 조합인, 방법.
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