KR20120003187A

KR20120003187A - Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ１ 유전자를 이용한 천식 진단 및 천식 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20120003187A
Application number: KR20100063905A
Authority: KR
Inventors: 이형규; 안경섭; 윤유식; 최병휘; 권옥경; 김세미; 김희성; 오세량; 육지은; 장하영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-01-10
Also published as: WO2012002775A2; WO2012002775A3; WO2012002775A4; US20130108652A1; US9078912B2

Abstract

본 발명은 뉴로필린(Neuropilin, NRP) 유전자를 포함하는 천식 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 천식 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 천식 환자 및 집먼지진드기 추출물에 의해서 NRP1의 발현이 증가되며, NRP1의 발현 억제에 의해서 천식과 관련된 MMP9의 mRNA, 단백질 발현, 효소 활성 및 프로모터의 활성이 감소하는 결과를 통해서 NRP1을 천식 치료제 개발을 위한 표적으로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ１ 유전자를 이용한 천식 진단 및 천식 치료제 스크리닝 방법{Method for diagnosing and screening asthma using Neuropilin １}

본 발명은 천식 마커 또는 천식 치료제 개발을 위한 타겟으로서의 NRP1 유전자의 용도에 관한 것이다.

전 세계적으로 그 발병률이 증가하고 있는 알러지성 질환에는 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 및 천식(asthma), 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 및 두드러기(urticaria)가 있다(Wuthrich B. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 90, pp3-10, 1989). 이러한 알러지성 질환 중 천식(asthma)은 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)을 그 특징으로 하는 질환으로 만성 기도염증(chronic airway inflammation)을 일으키며 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들이 나타나는데 이는 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw - Hill, pp97-104, 1999).

일반적으로 천식은 TH2 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도주변 조직으로 이동, 침윤하여 나타나는 만성 염증질환으로 인식되고 있다(Elias JA, et al., J. Clin . Invest ., 111, pp291-297, 2003). 이 경우 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포가 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축작용이 과정에서 중요한 역할을 한다(Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin . Allergy Clin . Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev ., 50, pp515-596, 1998).

따라서 염증세포 활성화에 관여하는 IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인 및 면역글로불린 E의 생산과 이들의 작용으로 호산구 등 염증세포에서 분비되는 시스테인 류코트리엔 생합성 등은 염증 및 알러지 반응과 이로 인한 천식을 유발하는 주요 원인이므로 이들의 생산을 억제하기 위한 약물을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 천식 및 비결막염을 비롯한 알레르기성 질병에 대한 이해는 동물모델을 사용한 연구로부터 많이 얻어지고 있다. 동물모델을 사용한 연구를 통해 알레르기의 바탕인 면역학적 기전에 대한 이해가 가능하게 되었을 뿐만 아니라, 개발중인 치료제의 평가도 가능하게 되었다.

뉴로필린(Neuropilin, NRP)에는 뉴로필린 1과 뉴로필린 2가 있다. 뉴로필린 1 및 뉴로필린 2는 신경세포에서 최초로 발견되었다(Takagi S et al., Dev Biol, 1987). 그 뒤, 뉴로필린 2는 축색돌기(axons)를 피해서 성장 원뿔(growth cones)에서 발현을 억제시키며, 축색돌기 유도(Axon guidance)를 매개하는 세마포린 3A(semaphorin 3A, SEMA3A)의 수용체로써 동정되었다(He Z, Cell, 1997). 곧이어, 뉴로필린은 혈관 생성에 관여하는 수용체로 알려진, 신생혈관생성 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 패밀리의 수용체로서 역할이 알려졌다(Soker S et al., Cell, 1998).

뉴로필린은 130~140kDa이며, 단일 막 관통 당단백질로써, 뉴로필린 1은 약 923개의 아미노산으로 구성되며, 뉴로필린 2는 약 926개의 아미노산으로 구성되고, 공통적으로 유사한 도메인 구조를 갖고 있으며, 전체적으로 44%의 아미노산 상동성을 갖는다고 알려져 있다(Caroline PELLET-MANY et al., Biochem J., 2008).

NRP1과 NRP2는 다양한 종류의 인간 종양 세포주 및 인간 종양(neoplasms)인간 종양(neoplasms)에서 발현되고 있다(Bielenberg, D. R et al, Exp. Cell Res, 2006; Soker, S. et al, Cell, 1998; Ellis, L. M., Cancer Ther, 2006 ). 또한, VEGF 및 세마포린의 암 세포의 증식, 생존 및 이동에 미치는 영향에 관련된다고 알려져 있다(Bachelder, R. E. et al, Cancer Res, 2001; Chabbert-de Ponnat et al, J. Invest. Dermatol., 2006; Miao et al, FASEB J., 2000). NRP1은 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 및 췌장암 환자의 시료에서 생성되나, 정상 상피 조직에서는 생성되지 않는다. 그 외에도, NRP1은 신경아세포종(neuroblastoma), 악성 흑색종(melanoma), 및 성상 세포종(astrocytoma)과 같은 다양한 종양에서 발견되었다. NRP2는 폐암, 신경아세포종, 골육종(osteosarcoma), 취장암 및 방광암에서 발현된다고 보고되었다. NRP1은 그 외에도 골수 유래 선조 세포, 소의 과립막 세포의 혈소판 및 과립막(granulosa) 및 난포막세포(theca cells)를 포함하는 다양한 세포 종류에서 발현된다고 알려져 있다(Caroline PELLET-MANY et al, Biochem J., 2008). NRP1은 나이브 T 세포(naive T-cell) 및 미성숙 수지상 세포(항원제시세포, antigen-presenting cell)에서 발현되며, 이차림프기관(secondary lymphoid organs)에서 최초 면역 반응시기에 반응하는 세포 종류는 항원 제거를 매개하는 항원제시세포와 다시 반응하는, 성숙한 T 세포의 증식 및 분화를 유도하는데 필수적이라고 알려져 있다(Matthies, A. M., et al, Am. J. Pathol., 2002).

NRP1은 조직 상처 반응에 의해서 과발현된다는 보고가 많이 있으며, 이로 인해서 재생과 회복에 관여된다고 추정하고 있다. 제노푸스(Xenopus)에서는 시신경이 손상되어 재생이 필요할 때, NRP1의 발현이 증가하며, 치유된 후에도 NRP1의 발현은 몇 주에 걸쳐 증가된다고 보고되었다(Matthies, A. M., et al, Am. J. Pathol., 2002). 또한, NRP1은 상처로 인한 혈관생성 과정(wound angiogenesis)에서 신생 혈관에서 많은 양이 발견되며, 상처로 인한 혈관 생성이 항-NRP1 항체에 의해서 감소되는 결과를 통해서 NRP1이 혈관생성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다(Elena Geretti1 et al, Cell Adhesion & Migration, 2007).

NRP의 기능을 밝히기 위해서 많은 동물 모델이 사용되었다. NRP1이 신생혈관형성에 관여한다는 것을 나타낸 최초의 문헌에서, 형질전환 마우스에서 NRP1이 과발현되었을 때 태아(embryo)의 상태가 위태로웠으며, 과도한 혈관의 생성, 팽창된 혈관, 출혈 및 비정상적인 심장 및 사지(limbs) 형성의 증상을 보였다(Herzog Y et al., Mech Dev., 2001). NRP1 유전자 결손 마우스에서는 배아는 발생 12.5일 내지 13.5일에 자궁 내에서 사망하였으며, 비정상적인 난황낭, 비정상적인 신경 혈관 신생, 혈관계의 이상, 정상 분지(branching)의 결손, 모세관 네트워크의 결손, 및 기관지 아치(bronchial arches)의 발육 부전, 등대동맥(dorsal aorta)의 이상 및 대동맥궁(aortic arches)을 포함하는 심혈관 이상을 보였다(Yuan L et al, Development, 2002). NRP2 유전자 결손 마우스는 동맥 및 정맥은 정상적으로 발달하나, 림프절 및 미세혈관의 형성이 상당수 감소하였다(Yuan L et al, Development, 2002). NRP1/NRP2 유전자가 동시에 넉아웃(Knockout)된 마우스는 발생 8.5일에 사망하며, NRP1 유전자 결손 마우스에 비하여 무혈성 난황낭, 성장저해, 및 혈관 발달, 모세혈관 형성 및 분지의 결핍과 같은 더욱 심각한 혈관 형성을 보였다(Eichmann A et al, Int J Dev Biol , 2005).

매트릭스 메탈로프로테이나제-9(Matrix metallopeptidase 9, MMP9) 단백질은 배아 발생, 재생 및 조직 리모델링과 같은 정상 생리 작용뿐만 아니라, 관절염 및 전이(metastasis)와 같은 질병 과정에서 세포외벽 매트릭스 분해에 관여한다. 대부분의 MMP는 비활성 프로단백질(proproteins)의 형태로 분비되어, 세포 외부 프로테이나아제(proteinases)에 의해서 쪼개진다. MMP9에 의해서 암호화되는 효소는 콜라겐 IV와 V 종류를 분해한다. 레서스 원숭이(rhesus monkey)를 이용한 연구에의하면, MMP9에 의해서 암호화되는 효소는 IL-8에 의한 골수 유래의 조혈모세포(hematopoietic progenitor cell) 유동성에 관여한다는 것이 보고되었으며, 쥣과 동물을 이용한 연구에 의하면 종양 관련된 조직 리모델링과 연관되어 있다는 결과가 보고되었다.

MMP9는 호흡기 질환 환자의 대식 세포(Welgus HG et al, J Clin Invest, 1990), 호산성 백혈구(hno I et al, Am J Respir Cell Mol Biol., 1997), 대식 세포(Kanbe N, et al., Eur J Immunol, 1999) 및 수지상 세포(Bartholome EJ, J Interferon Cytokine Res, 2001)에서 특정 자극에 의해서 생성된다. MMP9는 염증성 분자로 면역 반응을 지속시키는 역할을 수행하기도 하며(Renckens R. et al, J Immunol, 2006), 동시에 조직의 부상 이후, 재생에 관여하는 기능이 있다. 기도 염증과 직접적으로 관련되어 있어, MMP9 발현이 객담에서 증가되며, 동시에 기도를 두껍게 하는 작용을 수행한다는 보고가 발표된 바 있다(Matsumoto H, et al, Thorax, 2005). 현재 MMP9가 천식과 같은 호흡기 질환과 관련이 있다는 보고는 많이 되어 있으나, 그 정확한 기작에 관련하여서는 밝혀지지 않았다.

이에, 본 발명자들은 천식 마커 또는 천식 치료제 개발을 위한 연구의 결과로써, 천식을 유발한다고 알려진 집먼지진드기(D. pteronissinus) 추출물을 세포에 처리하였을 때, 염증성 사이토카인 및 NRP1의 발현이 증가되며, 천식 환자의 말단 혈액 세포에서 또한 NRP1의 발현이 정상 대조군에 비하여 유의하게 증가하였고, NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의하여 MMP9의 mRNA, 단백질, 효소 활성이 감소되며, 아울러 MMP9의 프로모터 활성이 NRP1 발현 또는 활성 억제제 농도에 의존적으로 감소되는 결과를 통하여, NRP1(neurophilin 1)이 천식 진단용 마커로서 유용하게 이용될 수 있으며, 상기 유전자 마커를 이용하여 천식 치료제를 스크리닝할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

Takagi S, Tsuji T, Amagai T, Takamatsu T, Fujisawa H. Specific cell surface labels in the visual centers of Xenopus laevis tadpole identified using monoclonal antibodies. Dev Biol 1987; 122:90-100. He Z, Tessier-Lavigne M. Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent. Semaphorin III. Cell 1997; 90:739?51. Soker S, Takashima S, Miao HQ, Neufeld G, Klagsbrun M. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform?specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 1998; 92:735-745. Caroline PELLET-MANY, Paul FRANKEL, Haiyan JIA, and Ian ZACHARY.(2008) Neuropilins: structure, function and role in disease(REVIEW ARTICLE) Bielenberg, D. R., Pettaway, C. A., Takashima, S. and Klagsbrun, M.(2006) Neuropilins in neoplasms: expression, regulation, and function. Exp. Cell Res. 312, 584-593 Soker, S., Takashima, S., Miao, H. Q., Neufeld, G. and Klagsbrun, M.(1998) Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 92, 735-745 Ellis, L. M.(2006) The role of neuropilins in cancer. Mol. Cancer Ther. 5, 1099-1107 Bachelder, R. E., Crago, A., Chung, J., Wendt, M. A., Shaw, L. M., Robinson, G. and Mercurio, A. M.(2001) Vascular endothelial growth factor is an autocrine survival factor for neuropilin-expressing breast carcinoma cells. Cancer Res. 61, 5736-5740 Chabbert-de Ponnat, I., Buffard, V., Leroy, K., Bagot, M., Bensussan, A., Wolkenstein, P. and Marie-Cardine, A.(2006) Antiproliferative effect of semaphorin 3F on human melanoma cell lines. J. Invest. Dermatol. 126, 2343-2345 Miao, H. Q., Lee, P., Lin, H., Soker, S. and Klagsbrun, M.(2000) Neuropilin-1 expression by tumor cells promotes tumor angiogenesis and progression. FASEB J. 14, 2532-2539 Fujisawa, H., Takagi, S. and Hirata, T.(1995) Growth-associated expression of a membrane protein, neuropilin, in Xenopus optic nerve fibers. Dev. Neurosci. 17,343-349 Matthies, A. M., Low, Q. E., Lingen, M. W. and DiPietro, L. A.(2002) Neuropilin-1 participates in wound angiogenesis. Am. J. Pathol. 160, 289-296 Elena Geretti1, Michael Klagsbrun Targets for Anti-Angiogenesis Therapies Cell Adhesion & Migration 2007; Vol. 1 Issue 2 Herzog Y, Kalcheim C, Kahane N, Reshef R, Neufeld G. Differential expression of neuropilin-1 and neuropilin-2 in arteries and veins. Mech Dev 2001; 109:115-9. Yuan L, Moyon D, Pardanaud L, Breant C, Karkkainen MJ, Alitalo K, Eichmann A. Abnormal lymphatic vessel development in neuropilin 2 mutant mice. Development 2002;129:4797-4806. Eichmann A, Yuan L, Moyon D, Lenoble F, Pardanaud L, Breant C. Vascular development:From precursor cells to branched arterial and venous networks. Int J Dev Biol 2005;49:259-267.

본 발명의 목적은 NRP1(neurophilin 1) 유전자를 이용하는 천식 진단용 키트 또는 천식 진단 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 NRP1을 이용한 천식 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 NRP1 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 천식 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 NRP1(neurophilin 1) 유전자 또는 그의 상보가닥 분자를 포함하는 천식 진단용 DNA 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 NRP1(neurophilin 1) 유전자 또는 그의 상보가닥 분자를 포함하는 천식 진단용 DNA 마이크로어레이를 포함하는 천식 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 NRP1 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 천식 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다:

1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NRP1의 발현량을 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 NRP1의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NRP1의 발현량을 비교하는 단계; 및

3) NRP1 발현량이 대조군에 비해 증가하는 경우 천식에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 천식 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:

1) 피검 화합물 또는 조성물을 NRP1, 또는 NRP1 및 MMP9를 발현하는 세포주에 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NRP1, 또는 NRP1 및 MMP9의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 NRP1, 또는 NRP1 및 MMP9의 발현량이 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 감소된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 천식 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:

1) 피검 화합물 또는 조성물을 DNA 마이크로어레이를 포함하는 천식 진단용 키트 또는 NRP1 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 천식 진단용 키트에 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 키트에서 NRP1의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 NRP1 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.

아울러, 본 발명은 NRP1 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 천식 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 NRP1 유전자는 천식 유발인자인 집먼지진드기 추출물 처리에 의하여 발현이 증가하며, 천식 환자의 말단 혈액 세포에서 정상인에 비하여 그 발현이 관찰되고, NRP1의 발현 억제에 의하여 천식과 관련된 MMP9의 발현, 효소 활성, 및 프로모터의 활성이 억제되므로, NRP1(neurophilin 1) 유전자를 천식 진단용 키트 및 이를 이용한 천식 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 집먼지진드기(D. pteronissinus) 추출물에 의한 염증성 사이토카인 및 NRP1 유전자의 발현 증가를 확인한 그래프이다:
도 1의 A는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물을 처리한 후, 사이토카인 IL6 mRNA의 발현을 확인한 그래프이다;
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides);
*: p<0.05;
***: p<0.001;
도 1의 B는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물을 처리한 후, 사이토카인 IL8 mRNA의 발현을 확인한 그래프이다;
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides);
**: p<0.01;
***: p<0.001;
도 1의 C는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물을 처리한 후, 사이토카인 MCP1 mRNA의 발현을 확인한 그래프이다;
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides);
***: p<0.001;
도 1의 D는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물을 처리한 후, 사이토카인 IL8 mRNA의 발현을 확인한 그래프이다;
**: p<0.01;
***: p<0.001; 및
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides).
도 2는 집먼지진드기 추출물에 의해 증가된 염증성 사이토카인이 NRP1 siRNA에 의해서 감소된 것을 확인한 그래프이다:
도 2의 A는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물 및 NRP1 유전자의 발현을 감소시키는 NRP1 siRNA을 처리한 후, NRP1 mRNA의 발현 감소를 나타낸 그래프이다;
si-control: 대조군 siRNA;
si-NRP1: NRP1 siRNA;
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides);
***: p<0.001;
도 2의 B는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물 및 NRP1 siRNA을 처리한 후, 사이토카인 IL6 mRNA의 발현 감소를 나타낸 그래프이다;
si-control: 대조군 siRNA;
si-NRP1: NRP1 siRNA;
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides);
*: p<0.05;
**: p<0.01;
도 2의 C는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물 및 NRP1 siRNA을 처리한 후, 사이토카인 IL8 mRNA의 발현 감소를 나타낸 그래프이다;
si-control: 대조군 siRNA;
si-NRP1: NRP1 siRNA;
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides);
**: p<0.01;
***: p<0.001;
도 2의 D는 THP1 세포주에 집먼지진드기 추출물을 및 NRP1 siRNA을 처리한 후, 사이토카인 MCP1 mRNA의 발현 감소를 나타낸 그래프이다;
si-control: 대조군 siRNA;
si-NRP1: NRP1 siRNA;
LPS: 지질다당류(Lipopolysaccharides); 및
***: p<0.001.
도 3은 정상인 대조군 및 천식 환자의 말단 혈액 세포에서의 NRP1 발현을 비교한 그래프이다:
도 3의 A는 대조군 및 천식 환자군 말단 혈액 세포에서의 NRP1 mRNA의 발현을 비교한 그래프이다;
**: p<0.01;
도 3의 B는 천식 환자군 중 투약을 받지 않은 환자와, 투약을 받은 환자군의 말단 혈액 세포에서의 NRP1 mRNA 발현을 비교한 그래프이다; 및
**: p<0.01.
도 4는 정상인 대조군 및 천식 환자의 흡연 양상에 따른 NRP1 발현을 비교한 그래프이다:
도 4의 A는 대조군에서 금연자와 흡연자 말단 혈액 세포에서의 NRP1 mRNA 발현을 비교한 그래프이다;
도 4의 B는 천식 환자군에서 금연자와 흡연자 말단 혈액 세포에서의 NRP1 mRNA 발현을 비교한 그래프이다; 및
**: p<0.01.
도 5는 천식과 관련된 MMP9과 NRP1의 관계를 확인한 그래프이다:
도 5의 A는 MMP9 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 pGL4.14-pMMP9(-670/+3) 벡터를 포함하고 있는 RAW 264.7 세포주에 NRP1-shRNA를 1.5시간 처리한 후의 MMP9 프로모터의 활성을 NRP1-shRNA 농도에 따라 비교한 그래프이다;
WT: 무처리 RAW 264.7 세포주;
vector: 대조군 shRNA;
nrp1: NRP1 shRNA;
도 5의 B는 MMP9 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 pGL4.14-pMMP9(-670/+3) 벡터를 포함하고 있는 RAW 264.7 세포주에 NRP1-shRNA를 3시간 처리한 후의 MMP9 프로모터의 활성을 NRP1-shRNA 농도에 따라 비교한 그래프이다;
WT: 무처리 RAW 264.7 세포주;
vector: 대조군 shRNA;
nrp1: NRP1 shRNA;
도 5의 C는 MMP9 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 pGL4.14-pMMP9(-670/+3) 벡터를 포함하고 있는 RAW 264.7 세포주에 NRP1-shRNA를 6시간 처리한 후의 MMP9 프로모터의 활성을 NRP1-shRNA 농도에 따라 비교한 그래프이다;
WT: 무처리 RAW 264.7 세포주;
vector: 대조군 shRNA; 및
nrp1: NRP1 shRNA.
도 6은 HT1080 세포주에서 TNF-α를 24시간 처리하였을 때, 처리한 TNF-α의 농도에 따른 MMP9의 효소 활성 증가를 젤라틴 자이모그라피(gelatin zymography)를 통해 나타낸 그림이다.
도 7은 HT1080 세포주에서 NRP1 siRNA의 효과를 확인한 그림이다:
도 7의 A는 HT1080 세포주에서 NRP1 siRNA 처리 농도에 따른 NRP1 mRNA의 발현을 확인한 그림이다;
NT: 무처리 HT1080 세포주;
siNC: 대조군 siRNA;
siNRP1: NRP1의 siRNA;
도 7의 B는 HT1080 세포주에서 NRP1 siRNA 처리 농도에 따른 NRP1 mRNA의 발현 베타 액틴(b-actin) mRNA양을 기준을 정량화한 그래프이다;
αNT: 무처리 HT1080 세포주;
siNC: 대조군 siRNA; 및
siNRP1: NRP1의 siRNA.
도 8은 HT1080 세포주에서 NRP1 siRNA 처리에 따른 NRP1 단백질의 발현을 확인한 그림이다:
NT: 무처리 HT1080 세포주;
siNC: 대조군 siRNA; 및
siNRP1: NRP1의 siRNA.
도 9는 NRP1의 발현 억제 후, MMP9의 발현이 감소한 것을 확인한 그림이다:
도 9의 A는 TNF-α 처리에 의해서 증가된 MMP9 mRNA의 발현이, NRP1 siRNA에 의해서 감소하는 것을 나타낸 그림이다;
도 9의 B는 TNF-α에 의해서 증가된 MMP9 mRNA의 발현이, NRP1 siRNA에 의해서 감소한 것을 GAPDH 발현량을 기준으로 정량화한 그래프이다;
NT: 무처리 HT1080 세포주;
siNC: 대조군 siRNA; 및
siNRP1: NRP1의 siRNA.
도 10은 TNF-α에 의해서 증가된 MMP9의 발현이, NRP1 siRNA에 의해서 감소한 것을 웨스턴 블랏을 이용하여 확인한 그림이다:
siNC: 대조군 siRNA; 및
siNRP1: NRP1의 siRNA.
도 11은 TNF-α에 의해 유도된 MMP9의 효소 활성이 NRP1 siRNA의 농도별 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 그림이다:
도 11의 A는 HT1080 세포주에 TNF-α를 24 시간 처리한 후, NRP1 siRNA를 농도별로 처리한 후, MMP9의 효소 활성을 젤라틴 자이모그라피 실험을 통해서 확인한 그림이다;
NT: 무처리 HT1080 세포주;
siNC: 대조군 siRNA;
siNRP1: NRP1의 siRNA;
도 11의 B는 HT1080 세포주에 TNF-α를 24 시간 처리한 후, NRP1 siRNA를 농도별로 처리한 후 나타난 MMP9의 효소 활성을 밀도측정(densitometry)에 의해서 정량화한 그래프이다;
NT: 무처리 HT1080 세포주;
siNC: 대조군 siRNA; 및
siNRP1: NRP1의 siRNA.
도 12는 MMP9 프로모터의 활성을 측정하기 위하여, 루시퍼레이즈 분석(luciferase assay)에 사용된 pGL4.4-pMMP9(-670/+3) 벡터를 나타낸 그림이다.
도 13은 pGL4.4-pMMP9 벡터를 포함하는 HT1080 세포주에 TNF-α 처리 24 시간 후, 증가된 MMP9 프로모터 활성이 NRP1 siRNA의 처리 농도가 증가할수록 감소하는 것을 루시퍼레이즈 분석을 통하여 확인한 그래프이다:
NT: 무처리 HT1080 세포주;
siNC: 대조군 siRNA; 및
siNRP1: NRP1의 siRNA.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 NRP1(neurophilin 1) 유전자의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자를 포함하는 천식 진단용 DNA 마이크로어레이를 제공한다.

상기 NRP1 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 천식 진단용 DNA 마이크로어레이인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 급성 단핵구성 백혈병 유래 세포인 THP1 세포에 천식을 유발한다고 알려진 집먼지진드기 추출물(D. pteronyssinus)을 농도별로 처리한 후, 염증성 사이토카인인 IL6, IL8, MCP1 및 NRP1 mRNA의 발현을 확인하였다. 이에 대한 양성 대조군으로 염증성 사이토카인을 유발시킨다고 알려진 지질다당류(Lipopolysacchardies, LPS)를 처리하였다. 그 결과, 집먼지진드기 추출물 처리 농도가 증가할수록 염증성 사이토카인이 증가하였으며, 이러한 결과는 양성 대조군인 LPS 처리시 염증성 사이토카인이 증가되는 결과와 유사하였다. 또한, 집먼지진드기 추출물에 의해서 NRP1 mRNA가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, THP1 세포에 집먼지진드기 추출물 및 NRP1 siRNA를 처리하였다. NRP1 siRNA가 효과적으로 NRP1의 발현을 억제시키는지 확인하기 위하여, THP1 세포에 집먼지진드기 추출물 및 NRP1 siRNA를 처리한 후 NRP1의 발현을 살펴본 결과, NRP1 siRNA를 처리한 군에서 NRP1 mRNA의 발현이 대조군 siRNA를 처리한 군에 비하여 유의하게 감소함을 관찰함으로써, NRP1 siRNA가 효과적으로 기능함을 확인하였다. 또한, 집먼지진드기 추출물 처리 후 증가되었던 IL6, IL8, 및 MCP1 염증성 사이토카인의 발현이 NRP1 siRNA 처리군에서 대조군 siRNA 처리군에 비하여 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 천식 환자 및 정상인의 말단 혈액 세포에서 NRP1 mRNA 발현을 비교하였다. 그 결과, 대조군 환자에 비하여 천식 환자의 말단 혈액 세포에서 NRP1 발현이 유의하게 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 또한, NRP1의 발현이 천식약을 투여받은 군에서 유의적으로 감소하였다(도 3 참조). 또한, 천식 환자 및 정상인의 말단 혈액 세포에서 측정한 NRP1 발현량을 상기 연구 대상의 흡연 유무와 병력에 따라 비교한 결과, 천식 환자 중 흡연자가 비흡연자에 비하여 NRP1 발현량이 유의하게 증가되는 것이 관찰되었다(도 4 참조). 아울러, 결핵, 알레르기 비염, 아토피 피부염 및 두드러기와 같은 병력에 따라, NRP1 발현량을 비교한 결과 아토피 피부염이 있는 천식 환자의 경우 NRP1 발현량이 증가하는 경향성이 확인되었다(표 1 및 표 2 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, MMP9 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 pGL4.14-pMMP9(-630/+3) 벡터가 포함된 RAW 264.7 세포주에 NRP1 shRNA를 농도별로 처리하여, MMP9 프로모터의 활성을 측정하였다. MMP9의 발현증가는 만성천식의 중요한 병리 현상인 기도개형(airway remodeling)을 일으키는 주요 인자로 알려져 있다. 루시퍼레이즈 분석(luciferase assay)을 통해서 상기 RAW 264.7 세포주에 NRP1 shRNA 처리 시간별, 농도별로 처리한 결과, NRP1 shRNA를 처리한 농도가 및 처리 시간이 1.5시간에서 6시간으로 증가할수록 MMP9의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 또한, HT1090 세포에 NRP1 siRNA를 농도별로 처리한 후, MMP9의 효소 활성 변화를 젤라틴 자이모그래피 실험을 통해서 확인할 결과, NRP1 농도 의존적으로 MMP9의 활성이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, HT1080 세포에서 NRP1 siRNA의 효과를 확인하기 위하여, NRP1 siRNA를 5, 10, 20, 50 nM의 농도로 세포에 처리한 후, NRP1 mRNA 발현량을 관찰하였다. 그 결과, NRP1 siRNA를 처리하였을 때, 이에 대한 음성 대조군 siRNA를 처리한 군에 비하여 확연하게 NRP1의 발현량이 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, NRP1의 발현은 10 nM과 20 nM의 NRP1 siRNA 농도에서 가장 효과적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 7 참조). 또한, NRP1 siRNA가 NRP1 단백질의 발현 역시 효과적으로 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, 도 7에서 확인된 NRP1의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 20 nM 농도의 NRP1 siRNA를 HT1080 세포에 처리한 후, NRP1 단백질의 발현을 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 대조군 siRNA에 비하여 NRP1 siRNA를 처리한 군에서 NRP1 단백질의 발현이 효과적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 8 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, NRP1 siRNA의 천식 치료효과를 확인하기 위하여, HT1080 세포에 NRP1 siRNA를 5 및 20 nM을 처리한 후, TNF-α를 처리하였을 때, TNF-α에 의해서 증가하는 MMP9 및 NRP1의 발현을, NRP1 siRNA가 억제할 수 있는지를 관찰하였다. 그 결과, TNF-α 처리에 의해서 MMP9의 발현이 증가되나, NRP1 siRNA에 의해서 MMP9 발현이 NRP1 siRNA 농도 의존적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 9 참조). 또한, NRP1 siRNA가 TNF-α에 의해 증가되는 MMP9 및 NRP1의 발현을 단백질 수준에서도 감소시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 도 9의 조건과 동일한 조건에서, HT1080 세포에 NRP1 siRNA 및 TNF-α를 처리한 후, MMP9 및 NRP1의 단백질 발현을 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 9의 결과와 동일하게, TNF-α에 의해서 NRP1과 MMP9 단백질 발현이 증가되나, NRP1 siRNA에 의해서 NRP1과 MMP9 단백질의 발현이 감소되며, 이러한 감소는 NRP1 siRNA 처리농도 의존적이라는 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조). 또한, TNF-α에 의해서 증가되는 MMP9의 효소 활성이 NRP1 siRNA에 의해서 감소되는지를 확인하기 위하여, HT1080 세포에 NRP1 siRNA와 TNF-α를 처리한 후, 젤라틴 자이모그라피를 이용하여 MMP9의 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 9 내지 13에 나타난 결과와 마찬가지로, TNF-α에 의해서 증가되는 MMP9의 효소 활성이 NRP1 siRNA의 농도에 의존적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 11 참조).

아울러, NRP1 siRNA에 의해서 MMP9 프로모터 활성 변화를 측정하기 위하여, MMP9의 프로모터 부위를 포함하는 pGL4.14-pMMP(-670/+3) 벡터를 제작하였다(도 12 참조). 상기 pGL4.14-pMMP(-670/+3) 벡터를 포함하는 HT1080 세포에 NRP1 siRNA를 5, 10, 20 nM의 농도로 처리한 후, 루시퍼레이즈 분석(luciferase assay)을 수행하였다. 그 결과, TNF-α에 의해서 증가되는 MMP9 프로모터 활성이, NPR1 siRNA 농도 의존적으로 활성이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 13 참조).

따라서, 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 NRP1과 천식과의 관계가 밝혀졌으며, 보다 구체적으로 NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의하여 MMP9 발현 및 기능이 저해되는 결과를 통하여, NRP1(neurophilin 1)이 천식 진단용 마커 또는 천식 치료제 개발을 위한 타겟으로서 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 NRP1(neurophilin 1) 유전자의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자를 포함하는 천식 진단용 DNA 마이크로어레이를 포함하는 천식 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 실시예에서 NRP1 유전자는 천식 유발인자에 의해서 그 발현이 증가되며, 또한 천식 환자의 말단 혈액 세포에서 정상인에 비하여 그 발현이 증가되는 것이 관찰되었다. 또한, 천식과 관련된 MMP9 유전자의 발현 및 기능이 NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의하여 감소되므로, NRP1 유전자를 포함하는 DNA 마이크로어레이를 천식 진단용 키트로써 유용하게 사용될 수 있다.

상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 염기서열(5’- CCACAGTGGAACAGGTGATG-3') 및 역방향 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열(5’- GCACGTGATTGTCATGTTCC-3')을 갖는 것을 특징으로 하는 천식 진단용 키트인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

NRP1 특이적인 프라이머를 이용한 NRP1 검출시, PCR 증폭반응에 적용되는 경우, 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 NRP1 유전자는 천식 환자의 말단 혈액 세포에서 정상인에 비하여 높은 수준 발현되며, 천식을 유발한다고 알려진 집먼지진드기 추출물에 의하여 그 발현이 증가된다. 또한, 천식에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 MMP9의 발현, 기능이 NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의해 감소되므로, NRP1 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 천식 진단용으로 유용하게 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공하나, 이에 한정되지 않는다:

천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 눈물, 침, 객담, 비분비물, 기관지 분비물, 기관지 세척액, 폐분비물, 및 폐포 세척액으로 구성된 군에서 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법에 있어서, 단계 1)의 NRP1의 발현량은 웨스턴 블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역 조직 화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 자이모그라피에서, NRP1은 천식 환자의 말단 혈액 및 천식 유발인자인 집먼지진드기 추출물 및 TNF-α에 의해서 그 발현이 증가되며, NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의해서 천식에 관여한다고 알려진 MMP9의 발현을 억제시킴을 확인할 수 있었다. 따라서, 천식 진단의 정보를 제공하기 위해서, NRP1의 발현량을 피검체 유래 시료와 대조군 정상 개체와 비교하여, 그 발현량에 따라 천식의 위험성 정도를 판단하는 단백질 검출 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

3) 단계 2)의 NRP1, 또는 NRP1 및 MMP9 발현량이 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 감소된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.

본 발명의 구체적인 자이모그라피에서, NRP1은 천식 환자의 말단 혈액 및 천식 유발인자인 집먼지진드기 추출물 및 TNF-α에 의해서 발현이 증가되며, NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의해서 천식에 관여한다고 알려진 MMP9의 발현 및 기능을 억제시키므로, NRP1 유전자를 천식 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 자이모그라피에서, NRP1은 천식 환자의 말단 혈액 및 천식 유발인자인 집먼지진드기 추출물 및 TNF-α에 의해서 발현이 증가하며, NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의해서 MMP9의 발현 뿐만 아니라 효소 활성 및 프로모터 활성과 같은 기능을 억제하였다. 따라서, NRP1 유전자를 천식 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

상기 NRP1 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 NRP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 작은 간섭 RNA 및 짧은 헤어핀 RNA인 것이 더욱 바람직하며, 짧은 헤어핀 RNA인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 실시예에서 NRP1은 천식 환자의 말단 혈액에서 발현되며, 천식 유발인자인 집먼지진드기 추출물 및 TNF-α에 의해서 그 발현이 증가되고, NRP1 발현 또는 활성 억제제가 MMP9의 발현, 기능을 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, NRP1 유전자와 천식과의 관련성을 확인하였으며, NRP1 발현 또는 활성 억제제에 의하여 천식과 관련된 MMP9의 발현과 기능이 억제되므로, NRP1 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 천식 치료용 약학적 조성물로써 유용할 수 있다.

NRP1 발현 또는 활성 억제제의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본원 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 NRP1 발현 또는 활성 억제제을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.

조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포배양

<1-1> THP1 세포 배양

사람의 마크로파지전구세포인 THP1 세포는 10% FBS, 100 units/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함한 둘베코의 변형된 이글스배지(DMEM, Life Technologies, U.S.A.)에서 배양하였다.

<1-2> HT -1080 세포주 배양

사람의 배아육종세포(human fibrosarcoma cell)인 HT1080 세포주(ATCC CCL121)는 10% FBS, 100 units/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함한 둘베코의 변형된 이글스배지(DMEM, Life Technologies, U.S.A.)에서 배양하였다.

<1-3> RAW 264.7 세포주 배양

쥐 단핵구/대식세포 세포주 RAW264.7는 둘베코의 변형된 이글스배지(DMEM, Life Technologies, U.S.A.)에 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10% FBS, 6 g/ℓ HEPES, 3.7 g/ℓ 탄산수소나트륨를 첨가한 배지를 이용하여, 이산화탄소 항온기(5% 이산화탄소, 95% 상대습도, 37℃)에서 배양하였다.

< 실시예 2> 루시퍼레이즈 분석을 위한 벡터의 제작

MMP-9의 전사활성 검증을 위한 리포터 벡터의 제작을 위해 XhoI과 HindIII 효소가 포함된 올리고 뉴클레오타이드인 GATCCTCGAGCTAGAGGCTGCTACTTGC(서열번호 4)와 GATCAAGCTTTCTGACTGCAGCTGCTGT(서열번호 5)를 합성하여 인간 cDNA를 주형으로 이용하여 MMP-9의 프로모터 부위(-670/+3)를 PCR로 증폭하였다. 전사 리포트(transcription reporter)로는 루시페라제(luciferase)를 발현하는 유전자와 하이그로마이신 내성 유전자(hygromycin B phosphotransferase)를 선택표지(selection marker)로 발현하는 리포트 벡터 pGL4.14(Promega 사에서 구입)를 이용하였다. 리포트 벡터를 XhoI과 HindIII 효소로 절단하여 PCR로 합성된 MMP-9 프로모터 부위(-670/+3)를 연결하여 인간 MMP-9 프로모터 부위를 가지는 리포터 벡터, pGL4.14-pMMP-9-Luc을 제작하였다.

< 실시예 3> 루시퍼레이즈 분석을 위한 세포주 제작 방법

DMEM 배지에서 키우던 HT1080세포 및 RAW264.7 세포를 트랜스펙션(transfection) 하기 하루 전날, 새로운 배지에서 하루 배양한 후 백터 pGL4.14-pMMP-9-Luc DNA를 FuGeneHD(Roche, USA) 트랜스펙션 용액을 이용하여 잘 섞은 후 두 세포 위에 골고루 분주하였다. 6시간 배양 후, 새로운 배지로 갈아주고 2일간 배양하였다. 2일 후에 세포를 1:15의 비율로 항생제 G418이 0.8 ㎎/㎖ 농도로 들어 있는 선택 배지에 옮겨 4일에 한번씩 새로운 배지로 갈아주면서 배양하면서 형성된 콜로니를 다시 분리하여 이들을 계속 배양하여 각 세포들의 일부는 액체 질소에 보관하였다. 항생제 G418이 1 ㎎/㎖의 농도로 함유되어 있는 DMEM에서 죽지 않고 성장하는 세포의 콜로니를 선별하여 HT1080-pMMP9-luc 세포주와 RAW-pGL4-MMP9-luc 세포주를 얻었다.

HT1080 세포인 경우는 TNF-a(5 ng/㎖), Raw 세포인 경우는 LPS(Lipopolysaccharide)(1 ㎍/㎖)를 처리하고, 처리하지 않은 세포와 비교하여 생성된 루시퍼레이즈의 활성정도를 조사하여 높은 활성을 나타내는 세포주를 선별하였다. 선별된 세포주를 대상으로 높은 활성을 나타내는 조건을 찾기 위해 여러 가지 농도의 세포를 사용하여 다시 같은 실험을 진행하였다.

< 실험예 1> 집먼지진드기에 의한 염증성 사이토카인 및 NRP 의 발현 측정

THP1 세포주에 집먼지진드기(D. pteronissinus) 추출물(의용절지동물소재은행(연세대학교 의과대학 소재)에서 구입)을 0, 0.1, 1, 10, 50 ㎍/㎖을 처리한 후, 염증성 사이토카인의 발현을 측정하였다. 또한, 염증성 사이토카인을 발현시킨다고 알려진 지질다당류(Lipopolysaccharides, LPS)를 양성대조군으로 사용하였다. 집먼지진드기 추출물 및 지질다당류를 THP1 세포주에 처리한 후, 인터루킨 6(Interleukin 6, IL6), 인터루킨 8(Interleukin 8, IL8), 단핵구 화학주성단백질(monocyte chemoattractant protein 1, MCP1), 및 뉴로필린 1(Neuropilin 1, NRP1)의 mRNA 발현을 확인하였다.

12 웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 THP1 세포를 2 × 10⁶/㎖의 밀도로 2㎖씩 첨가한 후 24시간 동안 안정화시킨 세포에 대해 천식의 가장 강력한 원인물질인 집먼지 진드기 추출물을 저용량(10 ㎍/㎖) 및 고용량(50 ㎍/㎖)으로 처리하여 48 시간 배양하였다. 양성 대조군으로서 염증유발물질인 LPS(lipopolysaccharide)를 1 ㎍/㎖로 처리하였다. 48 시간 배양 후, RNeasy kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조사 제시된 지시서에 따라 총-RNA(total RNA)를 분리 정제하고, 1 ㎍의 total RNA를 cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사하였다. Real-time PCR은 StepOne(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) 장비를 사용하여 진행하였다. PCR은 TaqMan gene expression master mix, 250 nM TaqMan Probe, 2 uM의 각 프라이머(primer), 2 ㎕의 cDNA의 조성으로 최종 반응 부피를 20 ㎕로 준비하여, 3회 반복하였다. 적정 조성으로 혼합된 PCR tube는 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 95℃에서 15초와 60℃에서 1분으로 구성된 40 cycle을 진행하였다. Real-Time PCR에 사용된 프라이머는 Applied Biosystems사의 assay on demand gene expression 제품을 구매하여 사용하였다(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). 제품번호는 아래와 같다:

IL6 : Hs00174131_m1;

IL8 : Hs99999034_m1;

MCP1 : Hs00234140_m1; 및

NRP1 : Hs00818574_m1.

18s rRNA를 internal control로 이용하였다:

18s rRNA : Hs99999901_s1.

그 결과, 양성 대조군으로 사용한 LPS를 처리하였을 때, 염증성 사이토카인인 IL6, IL8, MCP1의 발현이 모두 증가하였으며, IL6 및 IL8 사이토카인은 집먼지진드기 추출물 처리농도가 증가할수록 그 발현량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1의 A 및 B). MCP1은 0.1 ~ 10 ㎍/㎖의 낮은 농도에서는 집먼지진드기 추출물을 처리하지 않은 군과 발현량의 차이가 보이지 않았으나, 50 ㎍/㎖의 농도에서는 발현량이 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1의 C). 또한, NRP1은 집먼지진드기 추출물 처리농도가 증가함에 따라, NRP1 mRNA의 발현량이 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1의 D). 즉, 집먼지진드기 추출물은 염증성 사이토카인 및 NRP1의 발현을 증가시킨다는 것을 관찰할 수 있었다(도 1).

< 실험예 2> NRP1 siRNA 에 의한 염증성 사이토카인 발현변화 측정

THP1 세포주에 NRP1 siRNA, 및 이에 대한 대조군 siRNA(si-control)을 트랜스펙션시킨 후, 집먼지진드기 추출물(10, 50 ㎍/㎖) 및 LPS 처리한 후, 염증성 사이토카인의 발현 변화를 측정하였다.

THP1 세포주는 12well dish에 2x10⁶ cells/mL로 준비하였다. NRP1 siRNA와 control siRNA는 Santacruz 사에서 구매하였으며 제품번호는 아래와 같다:

NRP1 siRNA : Santacruz, sc-36038; 및

control siRNA : Santacruz, sc-37007.

60 M siRNA의 농도로 Lipofectamin RNAiMAX reagent(Invitrogen, 12778)와 함께 6시간 동안 처리하였다. 그 후, 집먼지진드기 추출물과 LPS를 각 농도에 맞게 처리하여 48시간 배양한 후 real time PCR 분석에 사용하였다.

그 결과, NRP1 siRNA를 트랜스펙션시켰을때, NRP1 mRNA 발현이 대조군 siRNA를 트랜스펙션시킨 군에 비하여 유의하게 감소하며, NRP1 siRNA를 트랜스펙션 시킨 군에 염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 집먼지진드기 추출물을 처리하였을 때, 대조군 siRNA를 처리한 군에 비하여 NRP1의 발현을 유의하게 감소하는 것을 통하여, NRP1 siRNA가 효과적으로 작동하는 것을 확인할 수 있었다(도 1의 A). 염증성 사이토카인 IL6, IL8, 및 MCP1은 상기 <실험예 1>의 결과와 동일하게 집먼지진드기 추출물의 처리농도가 증가할수록, 그 발현이 증가하였으나, NRP1 siRNA를 트랜스펙션시킨 군에서는 대조군 siRNA를 트랜스펙션시킨 군에 비하여 그 발현이 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1의 B, C 및 D).

< 실험예 3> 천식 환자의 말단 혈액 세포에서 NRP1 의 발현 측정

정상인 대조군 환자 및 천식 환자의 말단 혈액 세포로부터 mRNA를 추출하여, NRP1 mRNA의 발현을 비교하였다. 본 발명의 실험에 참여한 환자의 일반적인 특징은 하기 표 1에 나타난 바와 같다(표 1).

천식환자 및 대조군은 중앙대학교부속 용산병원에서 모집되었다. 환자들의 말초혈액 10 cc를 공복상태에서 채취하고 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 백혈구연층(buffy coat)을 분리하였다. 분리된 백혈구연층(buffy coat)은 RiboPure^TM Blood Kit(Ambion)을 이용하여 제조자의 지시서에 따라 총 RNA(total RNA)를 분리 정제한 후, -80℃에 보관하였다. 천식환자의 투약 여부는 말초혈액 채취 시점에서 과거 3개월간의 흡입제(스테로이드, 베타2항진제, 기관지확장제 등) 및 경구제(스테로이드, 테오필린, 류코트리엔조절제, 베타2항진제,항히스타민제 등)의 처방내역을 조사하였다. 병원에 처음 내원환 환자들은 말초혈액을 채취하고 이전에 투약이 되지 않은 환자로 분류하였다.

그 결과, 대조군 환자에 비하여 천식 환자의 말단 혈액 세포에서 NRP1 mRNA의 발현이 유의하게 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 3의 A). 또한, 전체 천식 환자군 중, 천식약을 투여받은 군(64명)은 투여받지 않은 군(8명)에 비하여 NRP1 mRNA 발현이 유의하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3의 B).

또한, 본 발명자들은 흡연 양상에 따른 NRP1의 발현 양상의 차이를 분석하였다. 표 1에 나타난 바와 같이 대조군은 34명 중 6명이 흡연자로서, 18.2 %의 흡연율을 보이며, 천식 환자군은 전체 72명 중 16명이 흡연자로, 22.2 %의 흡연율을 보였다(표 1). 정상인 대조군은 흡연양상과 관계없이 NRP1 mRNA의 발현에 차이가 없었다(도 4의 A). 그러나, 천식 환자의 경우 흡연자의 말단 혈액 세포에서 NRP1의 mRNA 발현이 유의하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(도 4의 B).

아울러, 환자의 병력에 따른 NRP1의 발현 양상을 살펴보았다. 천식 환자군의 병력에는 결핵, 알레르기 비염, 아토피 피부염 및 두드러기가 있었으며, 상기 4가지 질병에서의 NRP1 mRNA 발현을 비교한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 아토피 피부염 병력이 있는 환자에게서 NRP1 발현이 증가하는 경향성을 확인할 수 있었다(P value < 0.1)(표 2).

연구 대상 환자의 일반적인 특징

	대조군 (n=34)	천식 (n=72)	P-value
성비(남성:여성)	22:11	36:36	0.156^b
나이	46.97 ± 2.22^a	52.42 ± 1.77	0.083^c
BMI(㎏/m²)	24.42 ± 0.64	24.36 ± 0.36	0.324^d
FEV1(L)	3.04 ± 0.13	2.47 ± 0.10	0.006^d
FEV1(예상수치%)	90.04 ± 2.07	90.64 ± 2.74	0.030^d
FVC(L)	3.88 ± 0.16	3.58 ± 0.91	0.994^d
FEV1/FVC(%)	78.60 ± 1.26	68.71 ± 1.73	0.000^d
흡연(아니오:예(흡연자 %)	28:6(18.2%)	56:16(22.2%)	0.762^d

a: 평균 ± SE

b: Chi-square test에 의해서 얻어진 P-value임.

c: 성비를 기준으로 한 ANOCOVA에 의해서 얻어진 P-value임.

d: 성비 및 나이를 기준으로 한 ANOCOVA에 의해서 얻어진 P-value임.

천식 환자의 과거 병력에 따른 NRP1 mRNA 발현 수준

병력	무	유	P-value
결핵	57(1.38 ± 0.08)^a	15(1.59 ± 0.29)	0.148^b
알레르기 비염	51(1.42 ± 0.11)	21(1.45 ± 0.16)	0.853
아토피 피부염	65(1.37 ± 0.08)	7(1.93 ± 0.52)	0.098
두드러기	60(1.42 ± 0.09)	12(1.47 ± 0.30)	0.948

a: 평균 ± SE. NRP1 mRNA 수준은 대조군의 평균에 대한 비율로 표시되었음.

b: 성비 및 나이를 기준으로 한 ANOCOVA에 의해서 얻어진 P-value임.

< 실험예 4> NRP1 발현 억제에 의한 MMP9 의 프로모터의 활성 변화 측정

NRP1 유전자에 대한 siRNA 벡터 제작은 다음과 같다. 2종류의 siRNA 타겟 프로그램(http://www.promega.com/siRNADesigner/program; http://www/genscript.com/ssl-bin/app/rnai)을 이용하여 NRP1의 siRNA타겟 프라이머를 디자인하였으며, siRNA타겟 프라이머는 정방향 CTGCACAAATCTCTGAAACTA(서열번호 6)의 서열을 포함하고 GC range가 30 ~ 60%인 21개의 염기로 구성되어 있다. siRNA 타겟 프라이머는 중앙에 루프(loop)를 형성할 수 있도록 정방향과 역방향으로 위치하였으며, 벡터(vector)로 쉽게 클로닝할 수 있도록 양쪽 말단에는 BamHI과 HindIII 제한효소가 삽입되어 있다. 이렇게 정한 siRNA타겟 정방향 프라이머(서열번호 7: 5'-GATCCCGTAGTTTCAGAGATTTGTGCAGTTGATATCCGCTGCACAAATCTCTGAAACTATTTTTTCCAAA-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 8: 5'-AGCTTTTGGAAAAAATAGTTTCAGAGATTTGTGCAGCGGATATCAACTGCACAAATCTCTGAAACTACGG-3')를 바이오니아(bioneer)에서 구매하였다.

마찬가지로 scrambled siRNA 서열은 정방향 GGCGCGCTTTGTAGGATTCG(서열번호 9)를 포함하고 있으며, 중앙에 루프(loop)를 형성할 수 있도록 정방향과 역방향으로 위치하였으며 벡터로 쉽게 클로닝할 수 있도록 양쪽 말단에는 BamHI과 HindIII 제한효소가 삽입되어 있다. 이렇게 정한 scrambled siRNA 정방향 프라이머(서열번호 10: 5'-GATCCCGCGAATCCTACAAAGCGCGCTTGATATCCGGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTTTTTCCAAA-3') 및 scrambled siRNA 역방향 프라이머(서열번호 11: 5'-AGCTTTTGGAAAAAACGAATCCTACAAAGCGCGCCGGATATCAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGCGG-3')를 바이오나이에서 구매하였다. 구매한 서열은 두 서열을 결합시킨 후, BamHI과 HindIII로 자른 pRNAT-U6.1/NEO vector(genescript 사에서 구입) 내로 T4 ligase를 사용하여 클로닝한 후, 결합 반응물을 대장균 균주 DH5a 내로 도입하였다. pRNA-U6/Neo vector에서 서열의 확인이 가능한 정방향과 역방향 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하여 siRNA 타겟이 삽입되어 있는 단일클론을 확보하고 siRNA 타겟이 삽입된 단일균주는 DNA를 분리하여 염기분석을 통해 다시 한번 확인하였다.

MMP9 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 pGL4.14-pMMP9(--670/+3) 벡터가 포함된 RAW 264.7 세포주를 트랜스펙션 하루 전에 96well에 3 X 10⁴ cell/well 로 분주하고 24시간 후 FBS 가 포함되지 않는 DMEM으로 바꾼 후, pRNAT-U6/neo vector, scambled shRNA, NRP1 shRNA를 FuGeneHD(Roche에서 구입) 트랜스펙션 시약의 설명서의 방법에 따라 섞은 후 농도별로 처리하여 시간별로 루시퍼레이즈(luciferase) 발현량을 확인하였다.

그 결과, RAW 264.7 세포주를 배양하는 시간이 길어짐에 따라 MMP9 프로모터의 활성이 증가되는 것이 관찰되나, NRP1 shRNA를 처리한 군에서는 1.5시간, 3시간 및 6시간으로 처리한 시간이 길어짐에 따라 MMP9의 발현이 대조군 vector를 처리한 군에 비하여 유의하게 감소하는 것을 프로모터의 활성을 통해서 간접적으로 확인하였다(도 5).

< 실험예 5> TNF -α에 의한 MMP9 효소의 활성 측정

TNF-α에 의한 MMP-9 효소활성인, 젤라틴 분해활성의 억제효과를 검정하기 위하여, TNF-α를 5, 20, 50, 100 ng/㎖ 처리한 HT1080 세포 배양액으로부터 얻은 조건배지를 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤(glycerol), 2% SDS 및 0.00625%(w/v) 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 함유된 동일한 완충액에 재희석하였다. 그리고 상기 용액을 0.1%(w/v) 젤라틴이 함유된 10% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 가열하지 않고 전기영동시켰다. 전기영동 후에 젤을 실온에서 30분 동안 반응용 완충액[1M Tris-HCL(pH 7.5), 0.1 M NaCl, 2.5% Triton X-100]에 적당량을 사용해 세척한다. 다음으로 반응용 완충액[1 M Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM CaCl₂]에 담긴 젤을 각각의 탱크용기에 담궜다. 이렇게 준비된 TNF-α를 5, 20, 50 ng/㎖을 처리한 젤을 37℃에서 16시간 동안 보온하였다. 효소 활성에 해당하는 흰 밴드가 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) G를 사용한 염색을 통해서 확인할 수 있으며, 염색은 다시 에탄올(ethanol), 아세트산(acetic acid)이 함유된 완충액에서 재희석되었다.

HT1080 세포에 TNF-α를 5, 20, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 24시간 처리한 후, MMP9의 활성을 젤라틴 자이모그라피 실험 방법을 통해서 관찰한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, TNF-α 처리 농도가 증가함에 따라, MMP9의 효소 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6).

< 실험예 6> HT1080 세포주에서 NRP1 siRNA 의 효과 측정

HT1080 세포주에서 NRP1 siRNA의 효과를 검증하기 위하여, NRP siRNA를 농도별로 처리한 뒤, NRP1 mRNA의 발현량을 PCR을 통해서 확인하였다.

HT1080 세포주에 5 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM의 NRP1 siRNA와 이에 대한 음성 대조군 siRNA인 siNC(siRNA n egative c ontrol)을 처리한 뒤, RNA를 추출한 뒤, PCR을 통해서 NRP1의 발현량을 확인하였다. 그 결과, 도 7의 A에 나타난 바와 같이, NRP1 siRNA 처리농도 의존적으로 NRP1의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 A). 또한, 상기 결과를 베타 액틴(beta-actin)의 발현량을 기준으로 NRP1의 발현량을 정량화하여 그래프로 나타낸 결과, 도 7의 B에 나타난 바와 같이, NRP1 siRNA의 처리 농도가 증가할수록 NRP1의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 B).

또한, HT1080 세포주에서 NRP1 siRNA가 NRP1 단백질의 발현을 효과적으로 억제시킬 수 있는 확인하기 위하여, 도 7에서 NRP1 mRNA가 효과적으로 억제시킨 20 nM의 NRP1 siRNA를 HT1080 세포주에 처리한 후, NRP1 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해서 확인하였다. 20 nM NRP1 siRNA를 처리한 HT1080 세포추출액을 조제하고 MMP-9 발현양을 단백질로서 웨스턴블랏(western blot)법으로 검정하였다. 이때 내부 대조군으로는 베타 엑틴(beta-actin)를 사용하였다. 20 nM NRP1 siRNA를 24시간 처리한 세포를 완충액[50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.25% 소듐(Na-deoxycholate), 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, Protease inhibitor cocktail(calbiochem에서 구매)]으로 파쇄하였다. 세포 추출액내 단백질 정량은 Bio-Rad 단백질 정량킷트(Bio-Rad, USA)를 사용하였다. 상기 단백질 추출 완충용액을 사용하여 단백질 추출물을 제조하고, 대조군 및 NRP1 siRNA 처리군의 단백질 추출물을 각각 50 ㎍씩, 변성 폴리아크릴아마이드 젤(SDS-polyacrylamide gel)에 전기영동 하였다. 전기영동한 단백질을 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane)에 흡착시킨 후 5% 탈지유(skim milk)로 2시간 동안 블록킹(blocking)하고 NRP1, 베타엑틴(beta-actin) 항체(Santa Cruz에서 구매)와 반응시켰다. 항체와 결합한 막을 TBST 완충용액으로 세척하고 호스래디뒤 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)로 표지된 2차 항체(santa cruz에서 구매)와 반응시키고, 다시 TBST 완충용액으로 세척한 후 ECL 시스템(ECL system, Amersham Pharmacia Biotec)을 이용하여 단백질을 검출하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 음성 대조군 siNC를 처리한 군에 비하여 현저하게 NRP 단백질의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 8).

< 실험예 7> NRP1 siRNA 에 의한 MMP9 발현 변화 측정

NRP1의 천식 치료 효과를 확인하기 위하여, HT1080 세포에 NRP1 siRNA를 처리한 후, 천식에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 TNF-α를 처리한 후, MMP9 및 NRP1의 발현량을 확인하였다.

HT1080 세포에 NRP1 siRNA를 농도 의존적으로 처리한 후, TNF-α처리에 따라 MMP9 mRNA 발현을 비교하였다. 그 결과, TNF-α처리에 의해서 증가된 MMP9의 발현량이 NRP1 siRNA를 처리하였을 때, 현저하기 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 9의 A). 또한, 상기 결과를 베타 액틴 발현량을 기준으로 MMP9의 발현을 정량화하여 그래프로 나타낸 결과, NRP1 siRNA 처리 농도 증가에 따른 MMP9의 발현 감소 차이 또한 관찰할 수 있었다(도 9의 B).

또한, NRP siRNA에 의해서 MMP9 및 NRP1 siRNA의 단백질 발현량을 감소시킬 수 있는지 확인하기 위하여, HT1080 세포에 NRP1 siRNA를 처리한 군에 TNF-a를 20 ng/㎖ 처리한 후, NRP1 및 MMP9 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다. 베타엑틴(beta-actin) 과 NRP1의 실험방법은 <실험예 8>과 동일한 방법으로 실시하였으며 MMP9의 프로테인 발현은 cell을 키운 배지를 수거 하여 상기 방법과 동일한 방법으로 정량 후 동일한 완충액으로 단백질 추출물을 만들었다. 이 후의 실험 과정은 상기 <실험예 7>과 동일하게 진행하고 MMP9 항체(santa cruze에서 구매)가 사용되었다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, TNF-α처리에 의하여, MMP9 및 NRP1의 단백질 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, NRP1 siRNA 처리 농도에 따라서, MMP9 및 NRP1의 단백질 발현이 모두 현저히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 10).

< 실험예 8> NRP1 siRNA 에 의한 MMP9 효소 활성 변화 측정

HT1080 세포에 NRP1 siRNA를 처리한 후, TNF-α에 의해서 증가되었던 MMP9의 발현이 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 MMP9의 발현뿐만 아니라, 그 기능이 감소되는 것을 확인하기 위하여 젤라틴 자이모그라피(gelatin zymography) 방법을 이용하여, MMP9의 효소 활성을 측정하였다. HT1080 세포에 NRP siRNA 및 이의 음성 대조군인 siNC를 5, 10, 20 nM 농도로 처리한 후, 5 ng/㎖의 TNF-α를 24시간 동안 처리하였다. HT1080 세포 배양액으로부터 얻은 조건 배지를 완충액[62.5mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤(glycerol), 2% SDS 및 0.00625%(w/v) 브로모페놀 블루(bromophenol blue)]에 재희석하여 사용하였으며, 그 단계는 상기 자이모그라피 실험방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, HT1080 세포에서 TNF-α에 의해서 유도된 MMP9의 효소 활성이 NRP1 siRNA의 농도별 처리에 의해, 농도 의존적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 11).

< 실험예 9> NRP1 siRNA 에 의한 MMP9 프로모터 활성 변화 측정

NRP1 발현 또는 활성 억제에 의한 MMP9 프로모터의 활성의 변화를 측정하기 위하여, MMP9 프로모터의 활성을 측정할 수 있는 pGL-MMP9 벡터를 제작하여, 이를 포함하는 HT1080세포주를 이용하여, MMP9 프로모터의 활성을 측정하였다(도 12). 실시예 3에서 만들어진 pGL4.14-pMMP9(--670/+3) 벡터가 포함된 HT1080 세포주 하이그로마이신 B가 0.1 ㎎/㎖이 함유된 DMEM 배지에 배양한 후, 트립신 용액으로 세포를 떼어내어 3×10⁴cells/㎖이 되도록 세포 수를 조정하여 96-웰 화이트 투명 바닥 플레이트(well white with-clear bottom plate)(Costar사로부터 구입)에 100 ㎕씩 넣고 37℃, CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후, PBS로 세척하고 FBS가 첨가되지 않는 DMEM 배지로 바꾼 후, 무처리 대조군, siNC를 처리한 음성 대조군, NRP1 siRNA 5, 10, 20nM 처리한 군으로 나누어, siRNA 및 이에 대한 대조군 siRNA인 siNC를 한 시간 처리한 후, 5ng/㎖ TNF-a 처리 후, 24시간 동안 배양하였다. 배양 상등액을 제거하고 PBS로 세포를 씻은 후, 루시퍼라제 용해 버퍼(luciferase lysis buffer)(Promega 사에서 구입) 40 ㎕를 넣어 세포를 용해시켰다. 세포용해액이 들어있는 96-웰 플레이트(well plate)를 루시퍼라제 검정 시약(luciferase assay reagent)(Promega 사에서 구입)을 이용하여 루미노미터(luminometer)로 측정하여 그 결과를 나타내었다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, MMP9 프로모터의 활성은 MMP9 mRNA 및 단백질 발현과 유사하게, TNF-a에 의해서 증가되는 MMP9 프로모터의 활성이 NRP1 siRNA를 농도의존적으로 5, 10, 20 nM 처리함에 따라 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 13).

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

NRP1 발현 또는 활성 억제제 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

NRP1 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

NRP1 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

NRP1 발현 또는 활성 억제제 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

NRP1 발현 또는 활성 억제제 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 Nrp-1 유전자와 천식과의 관계를 최초로 밝혔으며, Nrp-1 유전자의 발현 또는 활성 억제제가 염증성 사이토카인의 발현및 MMP9의 활성을 감소시키는 효과를 보이므로, 천식 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 천식 치료제 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for diagnosing and screening asthma using Neuropilin 1 <130> 10p-05-05 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 572 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctttgaactt gtggatggtg tgaagttgaa aaaagacaaa ctgaatacac agagtactta 60 ttcggaggca tgaaggcaga cagagatgaa aagacagtca aaggacggaa gtggaaggac 120 gggagtgagc tggggagctg ttgatctttc actatacagg ctgggaagtg tgttgatgac 180 cactgagcca ggcttttctc aggagcttca atgagtatgg ccgacagaca tggacaagga 240 gctgtgttca ccatcggact catgtgcagt cagctttttt cctgttggtt tcatttgaat 300 aatcagatgc tggtgttgag accaagtatg attgacataa tcattcattt cgacccctcc 360 tgcccctctc tctctctctc ctctcccctt tgtggattct ttttggaaac tgagcgaaat 420 ccaagatgct ggcaccaagc gtattccgtg tggccctttg gatggacatg ctacctgaaa 480 cccagtgccc agaatatact agaatcaccg catttcagtg gactcctgaa gttgtacttg 540 tgtataattg cccgcgtcgt gcataggcaa ag 572 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRP1 forward primer <400> 2 ccacagtgga acaggtgatg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRP1 reward primer <400> 3 gcacgtgatt gtcatgttcc 20 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9 forward primer for promoter cloning <400> 4 gatcctcgag ctagaggctg ctacttgc 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9 reward primer for promoter cloning <400> 5 gatcaagctt tctgactgca gctgctgt 28 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 6 ctgcacaaat ctctgaaact a 21 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NRP1 siRNA <400> 7 gatcccgtag tttcagagat ttgtgcagtt gatatccgct gcacaaatct ctgaaactat 60 tttttccaaa 70 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer for NRP1 siRNA <400> 8 agcttttgga aaaaatagtt tcagagattt gtgcagcgga tatcaactgc acaaatctct 60 gaaactacgg 70 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 9 ggcgcgcttt gtaggattcg 20 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for scrambled RNA <400> 10 gatcccgcga atcctacaaa gcgcgcttga tatccggcgc gctttgtagg attcgttttt 60 tccaaa 66 <210> 11 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer for scrambled RNA <400> 11 agcttttgga aaaaacgaat cctacaaagc gcgccggata tcaagcgcgc tttgtaggat 60 tcgcgg 66

Claims

NRP1(neurophilin 1) 유전자 또는 그의 상보가닥 분자를 포함하는 천식 진단용 DNA 마이크로어레이.
제 1항에 있어서, 상기 NRP1 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 천식 진단용 DNA 마이크로어레이.
제 1항의 DNA 마이크로어레이를 포함하는 천식 진단용 키트.
NRP1 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 천식 진단용 키트.
제 4항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 염기서열 및 역방향 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 천식 진단용 키트.
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 NRP1의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 NRP1의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 NRP1의 발현량을 비교하는 단계; 및
3) NRP1 발현량이 대조군에 비해 증가하는 경우 천식에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
제 6항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 눈물, 침, 객담, 비분비물, 기관지 분비물, 기관지 세척액, 폐분비물, 및 폐포 세척액으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 NRP1의 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
1) 피검 화합물 또는 조성물을 NRP1, 또는 NRP1 및 MMP9를 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 NRP1, 또는 NRP1 및 MMP9의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NRP1, 또는 NRP1 및 MMP9 발현량이 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 감소된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 천식 치료제 스크리닝 방법.
1) 피검 화합물 또는 조성물을 제 3항 또는 제 4항의 천식 진단용 키트에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 키트에서 NRP1의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 NRP1 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 천식 치료제 스크리닝 방법.
NRP1 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 천식 치료용 약학적 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 NRP1 발현 또는 활성 억제제는 NRP1 siRNA인 것을 특징으로 하는 천식 치료용 약학적 조성물.