CZ303494B6 - Zpusob omezení zamorení rostlin škudcem, rostlina obsahující sekvenci DNA ze škudce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škudce - Google Patents

Zpusob omezení zamorení rostlin škudcem, rostlina obsahující sekvenci DNA ze škudce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škudce Download PDF

Info

Publication number
CZ303494B6
CZ303494B6 CZ20010014A CZ200114A CZ303494B6 CZ 303494 B6 CZ303494 B6 CZ 303494B6 CZ 20010014 A CZ20010014 A CZ 20010014A CZ 200114 A CZ200114 A CZ 200114A CZ 303494 B6 CZ303494 B6 CZ 303494B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
promoters
promoter
ssp
dna
pest
Prior art date
Application number
CZ20010014A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ200114A3 (en
Inventor
Plaetinck@Geert
Platteeuw@Christ
Mortier@Katherine
Bogaert@Thierry
Original Assignee
Devgen N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26313977&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ303494(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB9814536.0A external-priority patent/GB9814536D0/en
Application filed by Devgen N. V. filed Critical Devgen N. V.
Publication of CZ200114A3 publication Critical patent/CZ200114A3/cs
Publication of CZ303494B6 publication Critical patent/CZ303494B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Rešení se týká zpusobu omezení zamorení rostlin škudcem, jehož podstata spocívá v tom, že obsahuje: (a) identifikaci sekvence DNA z uvedeného škudce, která je kritická pro jeho prežití, rust a proliferaci, (b) klonování uvedené sekvence ze stupne (a) nebo jejího fragmentu ve vhodném vektoru v takové orientaci vzhledem k promotoru nebo promotorum, že uvedený promotor nebo uvedené promotory iniciují transkripci uvedené DNA na dvouretezcovou RNA po navázání vhodného transkripcního faktoru na uvedený promotor nebo uvedené promotory a (c) vnesení uvedeného vektoru do rostliny, pricemž škudcem je škudce, který se na rostline živí. Rešení se dále týká rostliny obsahující sekvenci DNA ze škudce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škudce.

Description

Způsob omezení zamoření rostlin škůdcem, rostlina obsahující sekvenci DNA ze škůdce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škůdce s Oblast techniky
Vynález se týká způsobu omezení zamoření rostlin škůdcem využívajícího charakterizace nebo identifikace genové funkce pomocí inhibice dvou řetězcovou R.NA (dsRNAi), způsobu identifikace DNA zodpovědná za indukci specifického fenotypu v buňce a způsobu přirazení určité funkce ío známé genové sekvenci. Vynález se dále týká rostliny obsahující sekvenci DNA ze škůdce rostlin, která je kritická pro přežití, růst a proliferaci škůdce rostlin a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škůdce rostlin, které jsou kritické pro jeho přežití, růst nebo proliferaci.
is Dosavadní stav techniky
V Nátuře 391: 806-811, únor 1998, bylo popsáno, že vnesení dvouřetězcové RNA do buňky vede k silnému a specifickému ovlivnění exprese endogenních genů v buňce a tento vliv je v podstatě účinnější než vnesení každého z řetězců RNA jednotlivě, jak se to provádí při tak zvaných technikách anti-sense. Bylo zjištěno, že k tomuto specifickému snížení aktivity genu dochází u červa, resp. hlístíce Caenorhabditis elegans po vnesení RNA do genomu nebo do tělní dutiny. Vynález využívá této techniky pro nový způsob omezení zamoření rostlin škůdcem.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob omezení zamoření rostlin škůdcem, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje:
(a) identifikaci sekvence DNA z uvedeného škůdce, která je kritická pro jeho přežití, růst a proliferaci, (b) klonování uvedené sekvence ze stupně (a) nebo jejího fragmentu ve vhodném vektoru v takové orientaci vzhledem k promotoru nebo promotorům, že uvedený promotor nebo uvedené promotory iniciují transkripci uvedené DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedený promotor nebo uvedené promotory a (c) vnesení uvedeného vektoru do rostliny, přičemž škůdcem je škůdce, který se na rostlině živí.
Výhodně je uvedeným škůdcem hlíst. Výhodněji uvedený hlíst zahrnuje libovolného hlísta ze souboru zahrnujícího Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmanniella ssp.,
Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Helíotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchus ssp. Výhodně uvedená sekvence DNA leží mezi dvěma promotory tak, že navázání transkripčního faktoru na promotory má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA. Výhodně je sekvence DNA v orientaci sense a antisense vzhledem k uvedenému promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promo50 tor má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA. Výhodně jsou uvedený promotor nebo promotory tkáňové specifické promotory. Výhodně jsou uvedené promotory kořenově specifické promotory.
Předmětem vynálezu je rovněž rostlina, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje sekvenci DNA ze škůdce rostlin, která je kritická pro přežití, růst a proliferaci Škůdce rostlin, přičemž sekvence
- 1 CZ 303494 B6
DNA nebo její fragment je klonována ve vhodném vektoru v takové orientaci vzhledem k promotoru nebo promotorům, že uvedené promotory jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkrípcního faktoru na uvedený promotor nebo uvedené promotory, přičemž škůdcům je škůdce, který se živí na rostlině. Výhodně v rostlině leží sekvence DNA mezi dvěma promotory tak, že navázání transkripčního faktoru na promotory má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA. Výhodně v rostlině má sekvence DNA orientaci sense a antisense vzhledem k uvedenému promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promotor má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA. Výhodně jsou uvedené promotoiy tkáňové specifické promotory. Výhodně jsou uvedenými promotory kořenově specifické promotory.
Předmětem vynálezu je rovněž použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škůdce rostlin, která je kritická pro jeho přežití, růst nebo proliferaci, nebo její fragment klonovány v takové orientaci vzhledem k promotoru nebo promotorům, že uvedený promotor nebo uvedené promotory jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedený promotor nebo uvedené promotory, pro omezení napadení rostliny Škůdcem, přičemž škůdcem je škůdce, který se na rostlině živí. Výhodně při použití leží uvedená sekvence DNA mezi dvěma promotory tak, že navázání transkripčního faktoru na promotory má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA. Výhodně je při uvedeném použití uvedená sekvence DNA v orientaci sense a antisense vzhledem k uvedenému promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promotor má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA. Výhodně jsou při uvedeném použití uvedené promotory tkáňově specifickými promotory. Výhodně jsou při uvedeném použití uvedené promotory kořenově specifickými promotory.
Uvedené předměty vynálezu využívají následující aspekty, které jako takové netvoří předmět vynálezu:
První aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu identifikace DNA zodpovědné za vznik určitého fenotypu buňky, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) připraví cDNA nebo genomová knihovna z DNA dané buňky v takové orientaci vzhledem k promotoru (promotorům), aby po navázání vhodného transkripčního faktoru k promotoru (promotorům) byla možná transkripce dané cDNA nebo DNA do dvouřetězcové RNA (dsRNA) a b) tato knihovna se vnese do jedné nebo několika buněk obsahujících vhodný transkripční faktor, a c) identifikuje se a izoluje se požadovaný fenotyp buněk obsahujících knihovnu a identifikuje se fragment cDNA nebo DNA z této knihovny zodpovědný za vznik takového fenotypu.
Ve výhodném provedení vynálezu je ještě před krokem b) knihovna organizována do hierarchických skupin (poolů), jak je podrobněji popsáno v příkladech, zahrnujících např. genové rodiny.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu přiřazení funkce známé sekvenci DNA, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) identifikuje homolog (homology) DNA v buňce, b) z buňky se izoluje relevantní homolog (homology) nebo jeho (jej ich) fragment, c) homolog nebo fragment se klonuje do vhodného vektoru v takové orientaci vzhledem k promotoru (promotorům), aby po navázání vhodného transkripčního faktoru k promotoru (promotorům) byla možná transkripce dané cDNA nebo DNA do dsRNA a d) tento vektor se vnese do jedné nebo několika buněk z kroku a) obsahujících transkripční faktor a e) srovnáním s buňkami divokého typu se identifikuje fenotyp buněk.
V každém aspektu vynálezu nukleotidová nebo DNA sekvence je jak v ..sense” (souhlasně se směrem transkripce) tak i v „anti-sense (proti směru transkripce) orientaci vzhledem kjednotlivému promotoru s vlastnostmi popsanými výše, nebo alternativně je mezi dvěma identickými promotory. Oba případy provedení vynálezu poskytují dsRNA transkripci iniciovanou z promotoru po navázání vhodného transkripčního faktoru.
Buňky podle předkládaného vynálezu mohou býl izolovány z organismu nebo mohou být součástí organismu. Pokud jsou buňky součástí organismu (jsou obsaženy v organismu), organismus může být adaptován tak, aby exprimoval vhodný transkripční faktor. Organismem může být jakýkoliv organismus jako je rostlina, živočich, houba nebo kvasinka, ale výhodně je to hlístice
C. elegans, a sice divoký typ nebo mutanta C. elegans obsahující mutaci nuc-1 nebo pha-ts nebo kombinaci těchto mutací. V alternativním provedení vynálezu je DNA nebo cDNA knihovna nebo DNA fragment nebo jeho fragment vnesen, výhodně transfekcí nebo transformací, do mikroorganismu, jako je např. buňka bakterie nebo kvasinky, kterými je pak výhodně krmena hlístice C. elegans. V tomto provedení předkládaného vynálezu je mikroorganismus adaptován tak, aby exprimoval vhodný transkripční faktor. Výhodně je mikroorganismus E. coli.
V každém aspektu předkládaného vynálezu je DNA knihovna, DNA homolog nebo jeho fragment konstruován ve vhodném DNA vektoru, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující daný transkripční faktor. Alternativně je tento transkripční faktor kódován dalším vektorem.
V dalším alternativním provedení buňka nebo organismus exprimují, nebojsou adaptovány, aby exprimovaiy daný transkripční faktor. Výhodně kterýkoliv vektor použitý ve způsobu podle vynálezu obsahuje selekční markér, což může být např. nukleotidová sekvence kódující gen sup35 nebo jeho fragment. Nukleotidová sekvence je orientována vzhledem k promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promotor iniciuje transkripci DNA do dvouřetězcové RNA. Obr. 10 ilustruje vektory a orientaci sekvencí DNA, které umožňují tvorbu dsRNA v C. elegans. Vjednom provedení vynálezu je DNA lokalizována mezi dvěma promotory ve vektoru schopném exprimovat dsRNA po navázání transkripčního faktoru na tyto promotory. Alternativně obsahuje vektor dvě kopie sekvence DNA uspořádané v sense a anti-sense orientaci vzhledem k promotoru, přičemž jeho markér je selektovatelný, jeli obsažen v mutantě C. elegans pha-1. Výhodně je promotor kterýkoliv z promotorů T7, T3 nebo SP6 a transkripční faktor obsahuje příslušnou polymerázu.
Selekční markér výhodně obsahuje nukleotidovou sekvenci schopnou inhibovat expresi nebo zabránit expresi genu v dané buňce, přičemž jde o gen, který poskytuje známý fenotypu. Tato nukleotidová sekvence je součástí genu neboje identická s genem poskytujícím tento fenotyp, přičemž sama tato sekvence je orientována vzhledem k vhodnému promotoru (promotorům) schopnému iniciovat transkripci dvouřetězcové RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotor (promotory). Alternativně nukleotidová sekvence je součástí genu neboje identická s genem poskytujícím daný fenotyp, přičemž nukleotidová sekvence je taková, že umožňuje integraci tohoto vektoru nebo dalšího vektoru homologní rekombinací do genomu dané buňky, přičemž po této integraci je nukleotidová sekvence schopná inhibovat expresi genové sekvence poskytující daný fenotyp. V takovém provedení vynálezu nukleotidová sekvence obsahuje stop kodony vhodné k zabránění translace nukleotidové sekvence po její integraci do genomu.
Výhodně lze ve způsobech podle vynálezu přidat k buňkám nebo organismům sloučeniny s cílem vyhledávat daný fenotyp (sereening), např. fenotyp rezistence nebo vnímavosti ke sloučenině ve srovnání s divokým typem. Promotory jsou výhodně indukovatelné promotory. Transkripční faktory jsou v některých provedeních vynálezu odvozeny z tágu, jako je např. T7 polymeráza řízená fágovým promotorem. Avšak pokud je užit C. elegans, je výhodný promotor specifický pro červy nebo tkáňové specifický promotor jako jsou např. Iet858, SERCA, UL6, myo-2 nebo myo-3. Výhodně je užit kmen E. coli negativní na RNázu III nebo výhodněji kmen negativní na RNázu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob přípravy transgenního organismu, s výjimkou Člověka, obsahujícího exogenní transkripční faktor a transgen, který obsahuje promotor operativně spojený s fragmentem DNA, který je exprimován po navázání transkripčního faktoru, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) připraví první transgen ní organismus obsahující první konstrukt obsahující DNA kódující exogenní transkripční faktor a druhý transgenní organismus obsahující druhý konstrukt obsahující alespoň jeden promotor operativně spojený s požadovanou sekvencí DNA, která je exprimována po navázání transkripčního faktoru prvního transgenního organismu, a b) kříží první a druhý transgenní organismus a vybere se potomstvo exprimující
- j CZ 303494 B6 požadovanou sekvenci DNA. V jednom provedení vynálezu první a druhý transgenní organismus jsou připraveny vnesením prvního a druhého konstruktu transformaci do mikroorganismů, které jsou užity jako potrava pro požadovaný organismus. Výhodně druhý konstrukt obsahuje požadovanou sekvenci DNA v takové orientaci vzhledem k promotoru, která umožňuje iniciaci transkripce DNA na dsRNA po navázání transkripčního faktoru. V tomto provedení vynálezu druhý konstrukt obsahuje dva promotory obklopující požadovanou sekvenci DNA, přičemž tyto promotory mohou iniciovat transkripci sekvence DNA do dsRNA po navázání transkripčního faktoru na dané promotory. Alternativně je sekvence DNA jak v sense tak i v anti-sense orientaci vzhledem k promotorům, takže poskytuje dsRNA po navázání transkripčního faktoru na promotory. V každém z těchto provedení vynálezu první a/nebo druhý konstrukt výhodně obsahuje reportérovy gen operativně spojený s promotorem, který je schopen iniciovat transkripci reportérového genu po navázání transkripčního faktoru. Výhodně reportérovy gen kóduje některý z genů jako je luciferáza, zelený fluorescenční protein, β-galaktosidáza nebo β-laktamáza.
Předkládaný vynález se také týká způsobu ověření klonů identifikovaných ve kvasinkovém dvouhybridním vektorovém experimentu, kteréžto experimenty jsou odborníkovi dobře známy a byly poprvé navrženy v publikaci Chien et ai„ 1991 pro detekci interakce proteinprotein. Způsob podle vynálezu obsahuje kroky, kdy se poskytne konstrukt obsahující DNA kódující protein identifikovaný v kvasinkovém dvouhybridním vektorovém experimentu, kterýžto konstrukt je takový, že DNA je ve vhodné orientaci vzhledem k jednomu nebo více promotorům schopným zahájit transkripci dané DNA do dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na dané promotory, konstruktem se transformuje buňka, jako je např. bakteriální buňka, nebo alternativně organismus obsahující požadovaný transkripční faktor, a identifikují se fenotypové změny v dané buňce nebo organismu, přičemž organismem může být C. elegans nebo podobný organismus, a srovnají se s divokým typem. Výhodně transkripční faktor je indukovatelný v buňce nebo organismu. Sekvence DNA může být lokalizovaná mezi dvěma promotory, a to jak v sense tak i v anti-sense orientaci vzhledem k jednotlivému promotoru, jak bylo již popsáno výše. Výhodně je promotorem fágový promotor polymerázy a transkripčním faktorem je RNA polymeráza, výhodně T7 RNA polymeráza. Předmětem předkládaného vynálezu jsou také vektory vhodné pro transformaci buněk nebo organismů a pak samotné buňky nebo organismy.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje selekční systém pro identifikaci transformace buněk nebo organismů, kterýžto systém obsahuje vektor, kde selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci schopnou inhibovat nebo zabránit expresi genu v buňce nebo organismu, kterýžto gen je zodpovědný za vytvoření známého fenotypu. Výhodně tato nukleotidová sekvence odpovídá Části neboje celá shodná s genem vytvářejícím známý fenotyp, a přitom je tato nukleotidová sekvence sama lokalizována mezi dva shodné promotory orientované tak, že jsou schopné iniciovat transkripci sekvence DNA lokalizované mezí nimi na dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na tyto promotory. Alternativně nukleotidová sekvence obsahuje sekvenci, která je částí neboje zcela shodná se sekvencí genu, který vytváří daný fenotyp buňky nebo organismu, a která je taková, že po integraci vektoru homologní rekombinací v chromosomu dané buňky nebo organismu inhibuje expresi dané genové sekvence vytvářející uvedený známý ťcnotyp. Výhodně podle tohoto provedení vynálezu nukleotidová sekvence obsahuje stop kodony dostatečné ktomu, aby zabránily translaci nukleotidové sekvence po integraci do chromosomu. Výhodně sekvence známého genu obsahuje gen sup-35 nebo jeho fragment, který jc selektovatelný identifikací potomstva rostoucího při teplotě vyšší než 25 °C po vnesení do mutanty C. elegans pha-1 a 123ts.
Ještě další aspekt vynálezu poskytuje způsob přiřazení funkce sekvenci DNA v mnohabunéčném organismu, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) konstrukt obsahující daný fragment DNA klonovaný mezi dva promotory schopné iniciovat transkripci v daném mnohabuněčném organismu se vnese do rnnohabuněčneho organismu schopného iniciovat transkripci z daného promotoru a b) identifikuje se fenotyp mnohabuněčného organismu ve srovnání s divokým typem.
-4 CZ 303494 B6
Předkládaný vynález je dále vysvětlen formou příkladů, které mají pouze ilustrativní funkci, a připojených obrázků.
Popis obrázku
Obr. 1 je nukleotidová sekvence plazmidu PGN1 podle předkládaného vynálezu.
Obr. 2 je nukleotidová sekvence plazmidu PGN100 podle předkládaného vynálezu.
Obr. 3 je schematické znázornění vektorů a transformačních režimů použitých ve způsobech podle vynálezu.
Obr. 4 je schéma expresního vektoru použitého podle vynálezu.
Obr. 5 je schematické znázornění expresního vektoru T7 RNA polymerázy pro transkripci C. elegán s.
Obr. 6 je schéma plazmidu PGN1.
Obr. 7 je schematické znázornění zlepšeného vektoru pro inhibici dsRNA kódujícího sup-35 dsRNA.
Obr. 8 je schéma expresního vektoru použitého k integraci do genomu C. elegans.
Obr. 9 je schéma znázorňující pozici sekvence (sekvencí) DNA vzhledem k vhodnému promotoru schopnému iniciovat z dané sekvence DNA expresi dsRNA.
Obr. 10 znázorňuje plazmid pGN 108.
Obr. 11 znázorňuje plazmid pGN105.
Obr. 12 znázorňuje plazmid pGN400.
Obr. 13 znázorňuje plazmid pGN401.
Obr. 14 znázorňuje plazmid pGNl 10.
Obr. 15 je schéma plazmidu pAS2 s přímým a zpětným promotorem T7/T3/SP6.
Obr. 16 je schéma plazmidu pGAD424 s přímým a zpětným promotorem T7/T3/SP6.
Obr. 17 je schéma plazmidu „pAS2-cyh2-HA+, both T7-final“.
Obr. 18 je schéma plazmidu „pGAD424-without-hTJLL ICF. -BOTH-T7“.
Obr. 19 a) je schéma plazmidu pGN2O5 a b) je schéma plazmidu pGN207.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad A
Konstrukce uspořádané a hierarchicky seskupené cDNA knihovny a její použití
Použitý vektor byl vektor pro E. coli nesoucí dva promotory T7 s vícečetným klonovacím místem (MCS) ležícím mezi nimi. Promotory byly orientovány navzájem směrem proti sobě v blízkosti MCS. V přítomnosti T7 RNA polymerázy, exprimované v E. coli, C. elegans nebo jiném organismu, dochází k produkci RNA zobou T7 promotorů. Jelikož jsou promotory orientovány navzájem opačně, z DNA vložené (klonované) do MCS mezi oba promotory se tvoří obě vlákna RNA a vzniká tak dvouřetězcová RNA (dsRNA) po navázání T7 polymerázy.
cDNA knihovna C. elegans byla připravena odborníkovi známým standardním způsobem a vložena do MCS. Pak byla transformací vnesena do E. coli a výsledné E. coli byly kultivovány a uschovány na 96jamkových destičkách. V tomto stadiu může být plazmidová DNA izolována a uskladněna také na 96jamkových destičkách organizovaných odpovídajícím způsobem jako kolonie E. coli. Přibližně 100 000 kolonií E. coli bylo testováno. Při tomto postupu knihovna obsahuje 5 x celkovou exprimovanou cDNA z C. elegans, což poskytuje značnou možnost, že v knihovně jsou přítomny i sekvence s nízkou hladinou exprese. Výsledkem bylo 1041 destiček s 96 jamkami. Destičky byly hierarchicky seskupeny podle potřeby. Pro seskupení klonů byly uspořádány do matice 10 x 100. Jestliže hierarchické seskupování je po 8 nebo 12 (což je nejpoío hodlnější, neboť destička představuje mřížku 8 x 12), pak dostaneme asi 87 destiček čili 8352 jamek. Jestliže hierarchické seskupování je po 96 jamkách, což je právě plná destička, pak to vede k 11 destičkám a tudíž 1041 jamkám. V kterémkoliv stádiu hierarchického seskupování lze izolovat plazmidovou DNA, což je méně pracné a spotřebuje se méně destiček, ale na druhé straně to vede ke ztrátě komplexity, ačkoliv to neplatí pro případ seskupování po 12. Seskupování lze také provádět s původní DNA. Následující pokusy ukazují, jak bylo provedeno seskupování jak DNA tak E. coli knihovny.
Uspořádaná knihovna pro RNAi technologii nesoucí všechny geny z genomu C. elegans a její použití
Jelikož už je dokončován projekt sekvencování celého genomu, lze využít tyto informace pří aplikacích T7 RNA inhibiční technologie. Každý gen z genomu C. elegans může být tudíž klonován pomocí PCR techniky. Výhodně lze klonovat exony s nejmenší délkou 500 bp. Pokud jsou exony příliš malé, menší fragmenty lze izolovat pomocí PCR, nebo dokonce i částí intronů a sousední exony lze izolovat užitím PCR, takže je klonována alespoň dostatečná část transtatovaného úseku. Pro tento účel bylo potřeba provést alespoň 1700 jednotlivých PCR reakcí. Tato kolekce PCR produktů pak byla klonována do T7 vektoru jak byl popsán (obsahuje 2 promotory orientované navzájem proti sobě a mezi nímí vícečetné klonovací místo). Každý PCR produkt byl klonován nezávisle, nebo byl využit ke generování náhodné knihovny, analogické popsané ío cDNA knihovně. Když se každý PCR produkt klonoval jednotlivě, je možné pak seskupovat výsledné bakterie a plazmidovou DNA různými způsoby. Za prvé, kolekci jednotlivě klonovaných PCR produktů ve vektoru T7 je možné seskupit náhodně, jak je popsáno pro náhodnou knihovnu. Seskupení je také možné provést racionálnějším způsobem. Tak např. je možné geny C. elegans analyzovat moderními nástroji bioinformatiky (tzv. biologie in silico). Různé geny z genomu patří do nějaké genové rodiny nebo mají v genomu homology. Takže se seskupí členy genové rodiny nebo homologní členové. Tímto způsobem se počet 1700 klonů zredukoval na podstatně přijatelnější počet. Taková knihovna se pak může užít pro screening fenotypu způsobem podle vynálezu. Výsledný fenotyp poskytuje funkční popis genu nebo genové rodiny nebo homologních genů z genomu C. elegans. Jelikož knihovna sestává z alespoň části každého genu, tento způsob umožňuje popis celého genomu ve funkčně-fenotypovýeh termínech. Pro tento účel je třeba do červa, resp. hlístice vnést dvou řetězcovou RNA (dsRNA). Toto vnesení klonů ať už samotných nebo seskupených klonů, ať už náhodným nebo racionálním způsobem, lze provést několika různými způsoby, jakje zde popsáno.
Příklad vektoru pro expresi dvouřetězcovou RNAi
Pro tento účel se může užít jakýkoliv vektor obsahující promotor T7 a vícečetné klonovací místo (existuje mnoho komerčně dostupných vektorů těchto vlastností). Byly navrženy oligonukleotidové primery obsahující T7 promotor a reverzní komplementární řetězec, oba s vhodným zakon50 cením. Tyto primery mohou být hybridizovány, a pokud byly dobře navrženy, klonovány do vybraného vektoru. Minimální sekvence promotoru T7 je následující:
T AAT AC GAC T CAC T ATAGG GC G A
-6CZ 303494 B6
Ačkoliv může být pro konstrukci T7 expresního vektoru užit jakýkoliv vektor, následující příklady ukazují, jak lze dojít k tomuto cíli s vektorem pGEM-3zf(+).
- vektor pGEM-3zf(+) (Promega) byl naštěpen restrikčními enzymy HindlII a Sáli,
-primery oGNl a oGN2 byly smíchány ve finální koncentraci l pg/30 μΐ, přivedeny do varu a ponechány zchladnout na teplotu místnosti,
- primery byly ligovány do vektoru standardním postupem ligace. Výsledným vektorem byl io pGNl (uvedený na obr. 1), který obsahuje dva promotory T7 orientované proti sobě navzájem a mezi nimi leží vícečetné klonovací místo.
Sekvence oligonukleotidových primerů oGNl a oGN2 byly následující:
oGNl: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT oGN2: TCG AAA GCT TCT CGC ΑΤΑ ATA GTG AGT CGT ATT AC
Příklad konstrukce knihovny
RNA může být izolována z každého organismu, který je vnímavý na RNAi. Obecně shrnuto, izo20 lovaná RNA se kopíruje do dvouretězcové cDNA a poté se připraví vhodný vektor pro klonování. Existuje řada postupů a také souprav pro molekulární biologii, které jsou komerčně dostupné od mnohých firem, jako je např. Promega, Clontech, Boehringer Mannheim, BRL atd., které umožňují:
- izolovat RNA,
- případně izolovat polyA RNA (několik souprav je k dispozici),
- syntetizovat první řetězce cDNA pomocí AMV reverzní transkriptázy, náhodných hexamerů jako primerů a/nebo oligo(dT) primerů,
- syntetizovat druhý řetězec cDNA pomocí Rnázy H, DNA polymerázy Ϊ,
- zarovnat konce pomocí T4 DNA polymerázy,
- připojit adaptor pomocí T4 DNA li gázy,
- případně ošetřit produkt T5 polynukleotidylkinázou a
- klonovat DNA do vektoru.
Výsledná ligační směs je považována za cDNA knihovnu. Lígační směs obsahuje všechny cDNA vzniklé v proceduře ligované do požadovaného vektoru. Pro uspořádání knihovny je potřeba ji transformací vnést do buněk E. coli.
Aplikace E. coli knihovny nebo DNA knihovny
T7 RNA produkční kmen:
-standardním kmenem je BL21 (DE3): F-ompT(lon)hsds(r-m) a kmen Β E. coli λ (DE3). Případně lze užít variantu BL21 (DE3), např. byla užita BI.21 (DE3)pLysS.
-kterýkoliv jiný kmen E. coli, který tvoří T7 RNA polymerázu, který lze podle potřeby zkonstruovat. Připraví se snadno užitím fága, který je komerčně dostupný, v tomto případě by! užit vektor ZCE6 (dostupný od formy Promega). Téměř každý kmen E. coli může být transfekován tímto fágem a vytváří pak T7 RNA polymerázu.
- mutanta RnázalII E. coli'.
v principu jsou dostupné různé kmeny, pro první experimenty byl vybrán kmen AB3O1-1O5:
rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, hís95, rnc-105, relAl, spoTl, metBl (Kinder et al., Mol. Gen.
Genet. 126: 53), ale existují i vhodnější kmeny. Tento kmen byl infikován XCE6 a byla tak zkonstruována varianta produkující T7.
Hlístice C. elegans divokého typu lze pěstovat na shlucích bakterií. Bakterie exprimují T7 RNA io polymerázu. To vede ktomu, že ve střevu C. elegans se nachází velké množství dsRNA, která difunduje do celého organismu a vede k inhibici exprese. Tato knihovna se pak může užít pro screening několika fenotypů. Tato technika má výhodu, že detekovat relevantní geny v určité metabolické dráze je mnohem rychlejší než užitím dosud známé technologie užívající C. elegans.
Navíc, pokud se najde zajímavý fenotyp, geny za něj zodpovědně se mohou snadno klonovat.
Pomocí hierarchického seskupování je možné snadno najít při druhém screeningu relevantní klon ve shluku (poolu). DNA inzert v tomto klonu se pak sekvencuje. Tento experiment tak poskytuje současně jak biochemické tak i genetické informace.
Kmen divokého typu C. elegans se může kombinovat s různými sloučeninami pro screening fenotypů rezistence k léčivům a vnímavosti k léčivům. Kmen C. elegans může být mutovaný kmen a screening může být na zlepšený fenotyp, redukovaný fenotyp nebo nový fenotyp. Kmen C. elegans může být mutovaný kmen a screening knihovny se může kombinovat se sloučeninami. Takže se může screenovat na rezistenci k léčivům, vnímavost k léčivům, zlepšený fenotyp, redu25 kovaný fenotyp nebo nový fenotyp. Kmen E, coli může být jakýkoliv kmen exprimující T7 RNA polymerázu, např. kmen BL21 (DE3), ale tvorba dsRNA může být zvýšena užitím zvláštního kmenu E. coli, který je negativní na Rnázu III. Rnáza III rozpoznává specifickou kličku ve struktuře dsRNA. Může být také užit kmen E. coli, kde jsou odstraněny jiné Rnázy než Rnáza III nebo kmen E. coli, kde je odstraněna jedna nebo více Rnáz. Exprese T7 RNA polymerázy v nejzná30 mějších kmenech E. coli a konstrukty, kteréjsou k dispozici pro vytvoření kmenů E. coli produkujících T7 RNA polymerázu, obecně obsahují indukovatelný promotor. Tímto způsobem je tvorba T7 RNA polymerázy regulována, a tudíž je regulována i produkce dsRNA. Výhodně je možné tuto vlastnost využít k pulznímu nakrmení hlístic C. elegans ve specifickém růstovém stadiu. Hlístice se pěstují na neindukovaných kmenech E. coli. Když dosáhnout požadovaného sta35 dia, indukuje se v bakteriích tvorba T7 RNA. To dovoluje zkoumat funkce jakéhokoliv genu v libovolném okamžiku životního cyklu živočicha.
Prohledávání knihovny na existenci homologních nebo domněle zajímavých lidských genů a přiřazení funkce těmto genům
Stovky genů byly izolovány v různých projektech sekvencování genomů, expresních studiích, hybridizačních studiích a pod. Popsaná cDNA knihovna poskytuje způsob, jak ověřit nebo vůbec přiřadit funkci těmto genům rychlým a účinným způsobem. Tak nejdříve je třeba pomocí bioinformatiekých nástrojů (in silico biologie) identifikovat homolog nebo homology genu v C. ele45 gans. Připraví se PCR primery a pomocí PCR se pak izolují fragmenty DNA. PCR se může provádět po hierarchickém seskupení. Pozitivní shluk nebo jednotlivá jamka obsahující bakterie poskytující pozitivní signál se pak poskytne jako potrava C. elegans a vyhodnocuje se požadovaný fenotyp.
PCR se také může provádět na DNA izolované z C. elegans. Výsledná DNA se může klonovat do
Γ7 vektoru a transformací vnést do kmenu E. coli produkujícího T7 RNA polymerázu, který je pak jako potrava poskytnut C. elegans. V závislosti na tom, co je rychlejší a spolehlivější se vybere vhodný způsob.
-8CZ 303494 B6
Pokud gen patří do genové rodiny, poskytne se směs bakterií jako potrava C. elegans. Každá z bakterií nese část člena genové rodiny, přitom kmeny E. coli, růstové podmínky, kombinace sloučenin jsou stejné jak byly popsány výše.
Pokud se užije racionálně uspořádaná knihovna, kde jsou klonovány všechny geny C. elegans a organizovány strukturovaným způsobem, homology C. elegans a případně další homology, ortology a členy genové rodiny lze vystopovat snadno v této knihovně užitím přístupu biologie in silico. V takovém kroku se neužívá PCR a izolují se bakterie nebo přímo DNA, na kterých se pak pěstuje C. elegans.
Následující série experimentů byla provedena k otestování RNAi vektorů a různých kmenů E. coli, které byly připraveny
1. Konstrukce testovacího plazmidu
Lze použít jakoukoliv cDNA, která poskytuje jasný fenotyp, když je vyřazena u C. elegans nebo použita pří RNAÍ experimentu. Je známo, že např. unc-22 je dobrý kandidát, ale mnoho dalších genů je také vhodných. V tomto pokusu byl vybrán citlivý systém, který je možné užít ještě v pozdějších stadiích. Systém byl testován se sup-35 na pozadí pha-l.Exon 5 genu sup35 byl izolován pomocí PCR a byl klonován do vektoru pGNl a promotorem T7. Výsledný vektor byl označen pGN2. Mutanta pha-1 (e2123) C. elegans netvoří potomstvo při teplotě vyšší než 25 °C, což je způsobeno vývojovou poruchou v embryogenezi. Když je vyřazen (systémem „knock— out“) nebo inhibován gen sup-35 u tohoto kmenu, vytváří se potomstvo i v této teplotě. Kombinace mutanty pha-1 a sup-35 RNAi je tedy dobrý testovací systém.
2. Testování RNAi pomocí kmenu E. coli produkujícího dsRNA
- pGN2 byl vnesen do E. coli BL21 (DE3) a byla indukována T7 RNA polymeráza pomocí IPTG. Kmen C. elegans phal (e2l23) byl inokulován na tyto bakterie a pěstován při teplotě 25 °C. Jelikož jde o mutantu s embryonální poruchou při této teplotě, nedochází ke vzniku potomstva. Kdyžje gen sup-35 účinně inhibován dsRNA přítomnou v E. coli, potomstvo vzniká.
- pGN2 byl vnesen do E. coli kmenu AB3O1-1O5 (DE3) a byla indukována T7 RNA polymeráza pomocí IPTG. C. elegans kmen pha-1 (a2123) byl inokulován na tyto bakterie a pěstován při teplotě 25 °C. Jelikož jde o mutantu s embryonální poruchou při této teplotě, nedochází ke vzniku potomstva. Kdyžje gen sup-35 účinně inhibován dsRNA přítomnou v E. coli, potomstvo vzniká.
3. Zlepšení kmenu C. elegans, aby lépe přijímal dsRNA
Před i noku lácí C. elegans na bakterie E. coli, které produkují dvou řetěze o vou sup-35 RNA, byla provedena mutageneze C. elegans pomocí EMS (ethyl methy Isulfonová kyselina) a potomstvo takto mutovaných C. elegans bylo inokulováno na bakterie. C. elegans živené těmito bakteriemi poskytly větší potomstvo, které obsahovalo mutaci, vedoucí ke zlepšenému příjmu dsRNA, a které bylo vhodné pro použití v dalších experimentech.
Trvalá integrace vektoru produkujícího dsRNA do genomu C. elegans tvořící T7 RNA polymerázu
Byl zkonstruován vektor pro E. coli nesoucí následující znaky: dva promotory T7 orientované proti sobě navzájem, a restrikční místo nebo vícečetné klonovací místo ležící mezi těmito promotory. Navíc tento vektor může obsahovat genomovou DNA sup35 z C. elegans upravenou tak, že obsahuje několik stop kodonů v různých intervalech, takže ze sup35 genomového fragmentu nemůže být tvořen protein plné délky, jak je znázorněno na obr. 8. Jakákoliv cDNA nebo fragment cDNA mohou být klonovány do vícečetného klonovacího místa mezi dva promotory T7.
- 9 CZ 303494 B6
Když je tento vektor vnesen do kmenu C. elegans, který exprimuje T7 RNA polymerázu, cDNA nebo její fragment se transkribuje a vytváří dsRNA.
Tento vektor je navržen pro použití s mutantou C. elegans pha-I (e2123), která exprimuje T7 RNA polymerázu. Exprese T7 RNA polymerázy tnůže být konstitutivní, regulovaná, všeobecná nebo tkáňově specifická. Tyto mutanty C. elegans phal (e2123) netvoří potomstvo při teplotě vyšší než 25 °C vzhledem k vývojovým problémům v embryogenezi. Když je gen sup-35 účinně inhibován nebo vyřazena jeho funkce („knock-out“), pak potomstvo vzniká.
Když se vektor vnese do C. elegans, integruje se homologní rekombinací (integrací Campbellova typu). Bylo prokázáno, že k homologní rekombinací u C. elegans dochází, i když s nízkou frekvencí (Plasterk a Gronen, EMBO J. 11: 287-290, 1992). Homologní rekombinace v genu sup35 povede k vyřazení funkce genu, neboť dva vzniklé geny sup35 ponesou stopkodony. Výsledné organismy C. elegans ajejich potomstvo, pokud k této rekombinací dojde ve vajíčku, budou mít kopii vektoru integrovanou ve svém genomu. Selekce se provádí tím, že pouze organismy s vyřazenou funkcí sup35 mají potomstvo pri teplotě vyšší než 25 °C. Kromě toho výsledné C. elegans trvale produkují dsRNA z fragmentu DNA klonovaného mezi dva promotory T7. Tento kmen C. elegans lze považovat za transgenní kmen s redukovanou funkcí genu, jehož fragment byl klonován mezi dva promotory T7.
DNA lze přenést do C. elegans různými způsoby, včetně injekce, balistickou transformací, inkubací v roztoku DNA nebo podáváním bakterií v potravě. Také lze uvažovat o nových metodách, které zvyšují účinnost transformace.
Cílový kmen C. elegans může navíc obsahovat i další mutace kromě pha-1 mutace (e2123) a exprimovat i jiné geny než T7 RNA polymerázu.
Příklad B
Kvasinkový dvouhybridní vektor pro RNAÍ
Může být zkonstruován kvasinkový dvouhybridní RNA i vektor nesoucí dva promotory T7. Takové vektory jsou určeny pro replikaci jak v kvasinkách tak v E. coli. Obecně cDNA knihovny pro kvasinkový dvouhybridní systém se připravují ve vektorech Gal4 nebo LexA. Knihovna se konstruuje ve vektoru, který má aktivační doménu jednoho z těchto genů. Může se zkonstruovat takový vektor, který je vhodný pro dvouhybridní screening a který také obsahuje dva promotory T7 orientované proti sobě s vícečetným klonovacím místem mezi nimi. Uspořádání sekvencí v plazmidu pak bude „kostra plazmidu, (Gal4-T7), MCS, T7, kostra“. cDNA knihovna C. elegans konstruovaná s tímto vektorem může být použita jako standardní kvasinková dvouhybridní knihovna v experimentu, jehož cílem je izolovat protein interagující s daným proteinem. Jakmile je jednou klon izolován, plazmid může být vnesen do buněk kmenu E. coli produkujícího T7 RNA polymerázu, a který tudíž bude produkovat dsRNA z klonovaného fragmentu. Bakterie produkující dsRNA se pak podá jako potrava C. elegans a vyhodnotí se výsledný fenotyp. Stejně jako v předchozích příkladech, tato ověřovací procedura pro nově izolovaný dvouhybridní kvasinkový klon je podstatně kratší než standardní postup, který vyžaduje PCR a/nebo klonovací kroky, experimenty s RNA a/nebo „knock-out experimenty. Ve většině případů jsou izolované klony nejdříve sekvencovány, a na základě sekvence se rozhodne, zda se bude pokračovat s dalšími experimenty. Každý klon izolovaný v popisovaném experimentu může být snadno vnesen do vhodných buněk E. coli a pak podán jako potrava C. elegans. Ověření se pak provede analýzou fenotypu.
Pro aplikaci tohoto postupu byl připraven kvasinkový dvouhybrid se známým genem jako „návnada a nově konstruovaná knihovna jako „cíl. Proteiny kódované cílovými klony (tj. klony z knihovny), které interagují s ná vnado vým proteinem, vedly k pozitivním kvasinkovým klonům
- 10CZ 303494 B6 exprimujícún reportérovou molekulu, jako je např. LacZ pozorovatelná po obarvení X gal. Plazmid kódující cílový protein je izolován přímo z kvasinkového kmenu a vnesen do E. coli. E. coli je přitom kmen E. coli produkující T7 RNA polymerázu. V takovém případě se pak z DNA klonované do klonovacího místa ve vektoru tvoří dsRNA. Pokud se tato dsRNA jako potrava poskytne C. elegánu způsobem popsaným výše, dojde k inhibici genu C. elegans a výsledkem je určitý fenotyp.
- Tento kvasinkový dvouhybridní vektor se může výhodně použít ke konstrukci uspořádané a hierarchicky seskupené knihovny, jak bylo popsáno v předchozím příkladu.
- Může být zkonstruován kvasinkový kmen, který podmíněně produkuje T7 RNA polymerázu. Po experimentech s kvasinkovým dvouhybridním systémem může být indukována exprese T7 RNA polymerázy, což vede k produkci dsRNA v kvasinkách. Následně pak lze podat kvasinky jako potravu pro C. elegans. Bylo prokázáno, že C. elegans se může živit kvasinkami.
Konstrukce kmenu produkujícího T7 RNA polymerázu a jeho aplikace
Může být připraven kmen C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu. Exprese může být všeobecná a konstitutivní, ale také může být regulovaná tkáňově specifickým promotorem, indukovatelným promotorem nebo časově specifickým promotorem, indukovatelným promotorem nebo časově specifickým promotorem, a nebo promotorem, který nese jednu z těchto charakteristik a nebo kombinuje více těchto charakteristik. DNA se vnese do kmene C. elegans. To se provede buďto injekcí, vstřelením mikročástic, elektroporací nebo jak bylo popsáno výše zkrmením vhodných bakterií nebo kvasinek. Pokud je DNA plazmid, jaký byl popsán v předchozích příkladech, tj. plazmid nesoucí klonovaný fragment DNA nebo PCR fragment mezi dvěma promotory T7, pak se v buňce nebo celém organismu tvoří dsRNA z této DNA nebo PCR fragmentu, což vede k utlumení odpovídajícího genu. Vnesená DNA se může projevit dočasným utlumením genu. Vnesená DNA může vytvořit extrachromosomální strukturu, která může vést ke katalytickému vyřazení genu nebo redukcí funkčního fenotypu. Plazmid se také může integrovat do genomu organismu, což vede ke stejnému vyřazení genu nebo redukci funkčního fenotypu, ale tyto změny jsou trvale přenosné.
-Plazmidová DNA nesoucí cDNA nebo její část nebo EST fragment nebo PCR fragment z C. elegans klonovaný mezi dva promotory T7, jak bylo popsáno v příkladech A a B, může být vnesena standardním způsobem do C. elegans bez Γ7 RNA polymerázy a pak se analyzují fenotypy.
- DNA z uspořádané nebo seskupené knihovny jako v příkladu A může byt vnesena standardním způsobem (injekcí, vstřelením mikročástic) do C. elegans bez T7 RNA polymerázy a pak se analyzují fenotypy. S hierarchickým uspořádáním lze snadno najít původní klon.
- Stejný postup lze užít s mutantou C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu. Pak se provádí sereening na rozšířený, redukovaný nebo nový fenotyp.
- Postup lze užít k provádění sereeningu sloučenin. Sereening se provádí buďto s kmenem divokého typu nebo s mutovaným kmenem na rozšířený nebo nový fenotyp.
- DNA lze vnést do C. elegans novým způsobem. Jedním z nich je vnesení prostřednictvím E. coli. V takovém případě je jako potrava pro C. elegans podána hierarchicky uspořádaná knihovna. Aby se zabránilo strávení E. coli DNA ve střevu hlístice, je výhodné užít kmen C. elegans deficitní na Dnázu, jako je např. kmen nuc-1 (e 1392). Tato metoda se jeví jako velmi zajímavá, neboť je nezávislá na transformační účinnosti jiných metod a je obecně rychlejší a méně pracná.
2) Předpokládané zlepšení metody
- Byl navržen vektor nesoucí cDNA sup-35 nebo její část, klonovanou mezi dva T7 promotory, přičemž zbytek vektoru je stejný, jak byl popsán v příkladech A a B. Tento vektor může být vnesen do mutanty C, elegans phalts. V takovém případě pak existuje teplotní selekční systém a jedině ty C. elegans, které přijaly cDNA a tudíž exprimují dsRNA sup35, přežívají za restriktivní teploty. Hierarchicky uspořádaná knihovna je vnesena kterýmkoli v z výše popsaných způsobů.
-Vektor může být užit ke konstrukci knihovny, která je pak vnesena do E. coli exprimující T7 RNA polymerázu. V tomto případě jde o stejný screening jako v příkladu A s dodatečným screeningem na C. elegans, kde dsRNA sup-35 je aktivní.
- DNA a/nebo dsRNA sup-35 mohou být vneseny na různých plazmidech. Jak pri krmení DNA (příklad C) tak i při krmení dsRNA (příklady A a B), tyto dva plazmidy jsou přítomny v jedné bakterii nebo se C. elegans krmí směsí bakterií, z nichž jedna nese konstrukt sup-35.
Příklad konstrukce C. elegans produkující T7 RNA polymerázu
Existuje několik možností přípravy T7 RNA polymerázy v C. elegans. T7 RNA polymeráza může být exprimována pomocí různých promotorů, ať už konstitutivních, indukovatelných, všeobecných, tkáňově specifických nebo jejich kombinací. K příkladům takových promotorů patří promotor proteinu tepelného šoku hsp-16, střevní promotor gesl, promotor cet858, ale také promotor dpy7 a promotorový element GATA1. V tomto příkladu je T7 RNA polymeráza exprimována pod kontrolou promotoru hsp-16, který je dostupný ve vektoru pPD49.78. T7 polymeráza je izolována pomocí PCR užitím oligonukleotidových primerů GN3 a GN4.
Výsledný PCR produkt je štěpen restrikčními enzymy Nhel a Ncol stejně jako vektor, do kterého se má klonovat, což je vektor Fire pPD49.78. Vzniklý vektor je pGNIOO ilustrovaný na obr. 2. Sekvence primerů byly následující:
oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC,
0gn4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG.
Vektor byl vnese do C. elegans standardním postupem, tj. mi kro injekcí.
Takto byly připraveny následující kmeny:
- divoký typ (pGN 100)
-nuc-1 (el392) (pGNIOO)
-pha-1 (e2123) (pGNIOO)
-pha-1,nuc-1 (pGNIOO)
Všechny tyto kmeny jsou schopny produkovat 17 RNA polymerázu po teplotní indukci nebo alternativně po indukci těžkými kovy jako např. po aplikaci těžkého kadmia nebo rtuti. Procedura teplotní indukce je jednoduše přenesení C. elegans do teploty 30 až 33 °C alespoň na 1 hodinu a pak zpět do standardní teploty (15 až 25 °C).
Kmen divokého typu produkující T7 RNA polymerázu může být použit k produkci jakékoliv
RNA v elegans. Konkrétně řečeno, plazmidy z výše popsaných knihoven se vnesou do C. elegans a pak se vyhodnotí fenotypy.
- 12CZ 303494 B6
Mutanta nuc-1 C. elegans se užívá tak, Že se DNA vnáší prostřednictvím bakterií, které jsou potravou pro C. elegans. Jelikož mutanta nuc-1 neštěpí DNA, plazmid může projít střevní stěnou. Pokud se dostane do buněk, které tvoří T7 RNA polymerázu, produkuje se dsRNA, která inhibuje gen, z něhož je RNA transkribována.
Mutantní kmen pha-l C. elegans, který tvoří T7 RNA polymerázu, může být použit ke zlepšení postupů popsaných výše. DNA může být vnesena vstřelením, injekcí nebo podáním v potravě. Konkrétně se tento kmen užívá s vektory, které tvoří dsRNA z genu sup-35 a požadovaného genu, kterým je PCR produkt, cDNA nebo knihovna, jak byla výše popsána.
Mutanta pha-1,nuc-1 produkující T7 RNA polymerázu se užívá pro vnášení DNA prostřednictvím bakterií. DNA je výhodně plazmid, který produkuje dsRNA ze sup-35 a požadovaného genu. Tento kmen tvoří T7 RNA polymerázu především v trávicím traktu. K přenosu DNA výhodně dochází, když se C. elegans podává jako potrava bakterie nesoucí uvedený plazmid.
Aplikace RNAi technologie na rostlinách
Hlístice (nematoda) zodpovídají za značnou část škod na rostlinách a zejména na zemědělských plodinách. Postupy RNAi technologie podle vynálezu mohou být využity na rostlinách, aby se zabránilo poškozování rostlin parazitickými hlístícemi. V prvním kroku se z hlístice parazitující na rostlině izoluje fragment DNA, který je kritický pro přežití nebo růst červa nebo pro jeho výživu či proliferaci. Jakýkoliv gen, jehož exprese je esenciální, je vhodný pro tento účel.
Část tohoto genu, exon nebo cDNA se klonují. Fragment DNA se klonuje tak, aby byl řízen tká25 ňově specifickým promotorem, výhodně kořenově specifickým promotorem. Klonovaná DNA řízená kořenově specifickým promotorem se pak vnese do požadované rostliny, a sice postupy technologie transgenních rostlin. Pro každou parazitickou hlísticí se může užít jiný úsek DNA a podobně pro každý druh rostliny je potřebný jiný promotor.
Kořen rostliny pak produkuje RNA nebo dsRNA z vneseného klonovaného úseku DNA, pokud byl užit kořenově specifický promotor. Jelikož hlístice parazituje na rostlině, RNA nebo dsRNA je spolknuta a/nebo strávena hlísticí. RNA nebo dsRNA se pak dostane do buněk hlístice. kde zahájí své inhibiční působení na cílové DNA. V závislosti na povaze klonovaného úseku DNA z hlístice, hlístice bud’ není schopna přežití, výživy, množení atd., což zabrání dalšímu parazito3? vání hlístice na rostlině a ochrání rostlinu.
Konstrukce C. elegans produkující T7 RNA polymerázu
Aby bylo dosaženo produkce T7 RNA polymerázy nebo jiné RNA polymerázy u živočicha, případně hlístice, a konkrétně C. elegans, je možné zvolit několik přístupů. T7 RNA polymeráza může být exprimována pomocí různých promotorů. K takovým promotorům patří indukovatelné promotory, konstitutivní, všeobecné a tkáňově specifické promotory nebo jejich kombinace.
Příklad 1
Konstrukce základního vektoru pro expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans
Kódující sekvence T7 RNA polymerázy byla amplifikována pomocí PCR z XCE6 (Novagen,
Madison, USA) užitím oligonukleotidových primerů:
oGN2 5 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) a oGN4 6 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) standardním postupem PCR (viz „PCR, A Practical Approach, Ed. J. McPherson et al„ IRL Press, 1993). Výsledný fragment DNA kódující T7 RNA polymerázu byl štěpen restrikčními enzymy Agel a EcoRI a vložen do vektoru Fire pPD97.82 naštěpeného před tím také Agel a EcoRI. Výsledný konstrukt kódoval otevřený čtecí rámec pro T7 RNA polymerázu fúzovaný s jaderným lokalizačním signálem (NLS) velkého T antigenu SV40 s aminokyselinovou sekvencí MTAPKKKRKVPV. Sekvence jaderného lokalizačního signálu je potřebná pro přemístění T7 RNA polymerázy z cytoplazmy do jádra, kde je pak schopna vázat se na svůj specifický promotor, tj. T7 promotor. Směrem „upstream“ (proti směru transkripce) od kódující sekvence fúzního proteinu T7 polymerázy leží minimální promotor (myo-2), před kterým je ještě víceěetné klonoio vací místo (MCS), do kterého lze vložit promotory pro C. elegans. Tento plazmid (pGN 105 uvedený na obr. 11) je základní plazmid s T7 RNA poíymerázou, který umožňuje expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans. Různé deriváty tohoto plazmidu, kde do víceěetné ho klonovacího místa jsou vloženy promotory, dovolují indukovatelnou, konstitutivní, všeobecnou nebo tkáňově specifickou expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans, neboť exprese je pak regulována promotorem klonovaným do vícečetného klonovacího místa.
Následující promotory jsou známy tím, že indukují expresi v uvedených tkáních (přičemž tento výčet rozsah předkládaného vynálezu nijak neomezuje):
let—858 (všudypřítomná exprese), myo-2 (exprese v hltanu), myo-3 (exprese ve svaloví ně tělní stěny), eg 1-1 5 (exprese v děložním svalu) a unc-119 (ve všech neuronech).
Příklad 2
Konstrukce vektoru pro expresi T7 RNA polymerázy ve svalové tkání C. elegans
Kódující sekvence T7 RNA polymerázy byla amplifikována pomocí PCR z XCE6 užitím oligonukleotidových primerů:
oGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) a oGN4 4 (CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) a pak naštěpena restriktázami Agel/Spel a vložena do vektoru pGK13 předem naštěpeného také Agel/Speí. Tento vektor obsahuje silný promotor SERCA, který řídí expresi v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny. Jaderný lokalizační signál (NLS) z velkého T antigenu SV40 byl vložen před kódující sekvenci T7 RNA polymerázy vložením dvou překrývajících se oligonukleotidů:
oGN4 5 (CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) a
OGN4 6 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) do restrikčních míst Sacl/Agel. Výsledný konstrukt byl označen pGN108 a je uveden na obr. 10. Vnesení tohoto plazmidu do C. elegans vedlo k expresi T7 RNA polymerázy v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny.
Pro otestování exprese a funkčnosti T7 RNA polymerázy v C. elegans řízené promotorem SERCA, byl plazmid pGN108 kódující T7 RNA polymerázu pod kontrolou SERCA promotoru inj i kován do C. elegans. Současně byl inj i kován testovací vektor. Tento testovací vektor kódoval GFP řízenou T7 promotorem (vektor pGN401 na obr. 13). Plazmid pGN401 byl zkonstruován vložením dvou překrývajících se oligonukleotidů:
- 14CZ 303494 B6
OGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) a OGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) do vektoru Fire pPD97.82 naštěpeného Sacl/Agel, čímž se vytvořil T7 promotor. Dále byl současně vnesen selekční markér pro selekci transformant (roló, pRF4). Tento selekční vektor je odborníkům dobře znám. Transgenní rostliny generace Fl pak mohou být snadno selektovány, neboť projevují fenotyp roló. Transgenní C. elegans exprimují GFP v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny. Tyto údaje jasně ukázaly, že T7 RNA polymeráza byla funkčně exprimována z promotoru SERCA a že exprimovaná T7 RNA polymeráza se vázala na T7 promotor přítomný ve vektoru pGN401 a iniciovala tak transkripci genu GFP, který byl funkčně exprimován, což vedlo k fluorescenci ve svalové tkáni, kde promotor SERCA indukoval expresi T7 RNA polymerázy.
Příklad 3
Konstrukce vektoru pro všudypřítomnou expresí T7 RNA polymerázy v C. elegans
Fúzní gen NLS-T7 RNA polymeráza byl izolován z pGN108 vyštěpením XmaI/Bsp201 a klonován do vektoru Fire pPD103.05 naštěpeného také XmaI/Bspl201. Tím byl připraven vektor, kde T7 RNA polymeráza byla klonována tak, že její exprese je řízena promotorem Iet858. Tento specifický promotor umožňuje expresi T7 RNA polymerázy ve všech tkáních. Výsledný plazmid byl pojmenován pGNl 10 (je uveden na obr. 14).
Příklad 4
Konstrukce vektoru pro expresi DNA fragmentů, genů a cDNA řízenou T7 promotorem a zprostředkovanou T7 RNA polymerázou
Vektor Fire pPD97.82 byl štěpen restriktázami Sacl/Agel a sekvence T7 promotoru byla vytvořena vložením překrývajících se oligonukleotidů:
OGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) a
OGN4 2 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) do restrikčního místa Sacl/Agel. Konstrukt (pGN400 na obr. 12) obsahuje otevřený čtecí rámec pro GFP klonovaný mezi restrikční místa Sací a EcoRI, řízený promotorem T7. Do místa vzniklého vyjmutím genu GFP jakožto Agel/SacI fragment lze klonovat do vektoru jakýkoliv požadovaný fragment DNA nebo cDNA. Výhodně je požadovaný fragment DNA připraven pomocí amplifíkace v PCR, kdy jsou místa Sacl/Afel vložena do oligonukleotidových primerů. Fragment po PCR je naštčpen a gen GFP z pGN400 je nahrazen amplifikovaným fragmentem. Jakýkoliv vektor, který obsahuje Γ7 promotor, může být použit pro expresi indukovanou T7 RNA polymerázou v C elegans, např. komerčně dostupné vektory pGEM a pBluescrípt. To bylo demonstrováno pomocí vektoru pGN401, který vedl k expresi GFP pod kontrolou T7 promotoru v transgenní C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu.
Použití vektoru pGN400 mělo tu výhodu, že vektor obsahuje 3TJTR fragment (netranslatovaný fragment 3'-konce) z unc-54, který' zvyšuje transkripční stabilitu RNA.
- 15 CZ 303494 B6
Příprava permanentní tkáňově specifické „pseudo knock-out“ RNA i linie C. elegans
V současnosti se linie s vyřazenou funkcí genu, tzv. knock-out u elegans získávají po náhodné inutagenezi ve velkém rozsahu a následnou selekcí pomocí PCR. Tato metoda je velmi rozsáhlá, časově náročná a zdlouhavá. Bylo popsáno, že vnesení dvouřetězcové RNA do buňky vede k silnému a specifickému narušení exprese endogenního genu. U C. elegans může být exprese potlačena injekcí RNA do tělní dutiny, nebo inkubací C. elegans v roztoku obsahujícím dsRNA nebo tak, že se jako potrava pro C. elegans podává E. coli exprimující dsRNA odpovídající požadované DNA. Buňky C. elegans mají schopnost přijímat dsRNA z extracelulámí ho prostředí. Bylo popsáno, že mRNA je cílem tohoto genetického zásahu, zprostředkovaného dsRNA (Montgomery a Fire, 1998). Bylo také navrženo, že cílová RNA je degradována v jádru ještě před tím, než dojde k translaci. Ačkoliv snížení genové exprese zprostředkované RNAi se může přenášet na následující generace, dědičnost je špatná a účinek se rychle ztrácí v průběhu dalších generací. To je způsobeno pravděpodobně postupným snižováním zásoby dsRNA. V popisovaném experimentu je navržena metoda, jak zkonstruovat linii C. elegans s permanentním dědičným RNAi fenotypem. Tato metoda obsahuje vytvoření transgenní linie C. elegans vnesením plazmídu obsahujících fragmenty cDNA cílového genu v sense a antisense orientaci pod kontrolou promotoru C. elegans nebo transkripční invertované repetice cDNA z jediného konstruktu. Alternativně je dsRNA transkribována z vektoru nesoucího cDNA obklopenou dvěma T7 promotory v kmenu C. elegans, který exprimuje T7 polymerázu. Výsledkem je transgenní C. elegans se stálým dědičným „pseudo knock-out“ fenotypem. Exprese cDNA nebo T7 RNA polymerázy může být všeobecná a konstitutivní nebo může být regulovaná tkáňově specifickým promotorem. Proti RNAi indukované externí dsRNA (vnesené injekcí, inkubací v roztoku nebo potravou) tato metoda umožňuje získat podmíněnou, tkáňově specifickou inhibici genové exprese.
Inhibice exprese unc-22 pomocí RNA vede ke „škubajícímu“ („twitching“) fenotypu
Unc22 cDNA (exon 22) byla klonována v sense a antisense orientaci do vektoru pPD103.05 (A.Fire Č. L2865) obsahujícího promotor let858, který je schopen exprimovat sekvence RNA ve všech tkáních. Výsledné plazmidy byly označeny pGN205 (viz obr. 19a) a pGN207 (viz obr. 19b). Tyto konstrukty byly vneseny do C. elegans společně se selekčním markérem (ro!6,GFP). Transgenní jedinci generace F1 (exprimující rol-6 nebo GFP) projevovali „škubající“ („twitching“) fenotyp, což ukazuje, že RNAi může být zprostředkována endogenní transkripcí RNA z transgenní DNA. Fenotyp RNAi kosegregoval se selekčním markérem v dalších generacích. Tak byla vytvořena linie C. elegans s permanentním RNAi fenotypem.
Příprava stabilní linie s T7 RNA polymerázou a dvojitě transgenní C. elegans
Expresní systém v C. elegans založený na exogenní RNA polymeráze vyžaduje dva plazmidy. Jeden kóduje RNA polymerázu pod kontrolou specifického promotoru, zatímco druhý kóduje fragment DNA, který má být exprimován, pod kontrolou T7 promotoru. V případě semi stabilní RNAi nazývané také „pseudostabilní knock-out“ je požadovaná DNA klonována mezi dva T7 promotory, takže je pak produkována dsRNA.
Jelikož expresní systém T7 RNA polymerázy je znám tím, že jde o systémem s vysokou expresí, vznikají problémy při vytváření dvojitě transgenních organismů. Když je gen, který má být exprimován v hlístici C. elegans toxický, má letální účinek a důsledkem je konstrukce C. elegans bez vysoce regulované stabilní exprese požadovaného genu. Pokud je požadovaný gen esenciální pro přežití organismu, RNAi s fragmentem DNA z tohoto genu vede také k letálnímu účinku, takže pseudostabilní knock-out není možný.
K překonání uvedeného problému původci předkládaného vynálezu navrhli systém sestávající ze dvou transgenních organismů. První organismus je transgenní na Γ7 RNA polymerázu, přičemž tato T7 RNA polymeráza může být exprimována ve všech buňkách nebo jen ve specifických buň- lóCZ 303494 B6 kách nebo tkáních, jak bylo ukázáno v předchozích příkladech. Druhý transgenní organismus je transgenní na požadovaný fragment DNA. To může být cDNA spojená s T7 promotorem, nebo pokud je cílem provedení RNAi, pak DNA fragment příslušného genu klonovaný mezi dva T7 promotory.
Oba dva transgenní organismy byly životaschopné a neprojevovaly žádné aberantní fenotypy. A to proto, že T7 RNA polymeráza exprimováná v prvním organismu není toxická pro tento organismus, dokonce ani tehdy, je-li exprimována ve vysoké hladině. V druhém transgenním organismu požadovaný gen není exprimován nebo dsRNA není produkována, jelikož tento organismus neobsahuje T7 polymerázu.
Exprese požadovaného genu nebo cDNA nebo RNAi s fragmentem DNA může pak být dosaženo spářením dvou transgenních organismů. Takové potomstvo je pak dvojitě transgenní a exprimuje požadovaný gen nebo exprimuje dsRNA z fragmentu požadované DNA.
Pro vytvoření dostatečného počtu samců pro takové páření, jeden z transgenních organismů je samčí mutanta C. elegans s fenotypem upřednostňujícím vznik samců. Příkladem takové mutanty je mutanta him-5. Výhodně je tato mutanta užita k přípravě transgenní C. elegans s T7 RNA polymerázou, zatímco hermafroditní C. elegans nese DNA fragment kontrolovaný T7 promotorem.
Pro účinnou selekci dvojitě transgenní ho potomstva může být do druhého organismu vnesen druhý transgen. Tento transgen obsahuje reportérový gen pod kontrolou Γ7 promotoru. Reportérovým genem může být GFP, luciferáza, β-galaktoztdáza nebo [3-laktamáza. Příkladem takových transgenů jsou vektory pGN400 a pGN401.
Pro získání indukovatelné, tkáňově specifické exprese transgenů v C. elegans byla připravena zásoba samců (tj. him-5) nesoucích konstrukt T7 RNA polymerázy pod kontrolou různých promotorů C. elegans, které umožňují tkáňově specifickou expresí. Tito samci pak byli pářeni s hermafrodity nesoucími požadovaný gen pod kontrolou T7 promotoru.
Dále mohou být transgeny integrovány do genomu organismu. V odborné literatuře byly popsány metody pro dosažení stabilní integrace plazmidu do genomu (Methods in Cell Biology, Vol. 48, 1995, ed. Epstein a Shake, Academie Press) ajejich součástí je ozařování organismů. Tak lze ošetřit oba typy organismů, ale výhodně se ošetřují organismy exprimující T7 RNA polymerázu. Tím se připraví kolekce hlístic C. elegans, které trvale exprimují T7 RNA polymerázu pod kontrolou různých promotorů. K příkladům takových promotorů patří myo-2 (exprese v hltanu), myo-3 (exprese ve svalovině tělní stěny), egl-15 (exprese v děložním svalu), iinc-1 19 (ve všech neuronech), let—858 (všechny buňky) a ges-1 (střevo).
Konstrukce kvasinkového dvouhybridního vektoru s promotorem T7 pro RNAi pGAD424 s přímým a zpětným promotorem T7/T3 a/nebo Sp6
Ve většině dvouhybridních experimentů je cDNA knihovna klonována do plazmidu pGAD424 (viz obr. 16), který byl opatřen dalšími restrikcními místy ve vícečetném klonovacím místě (polylinkeru) jako je např. Ncol (C lontech). Tato knihovna pak umožňuje screening vazebných proteinů v kvasinkovém dvouhybridním experimentu. Byl zkonstruován nový kvasinkový dvouhybridní vektor se stejnými možnostmi pro provádění dvouhybridního experimentu, který navíc obsahuje dva dodatečné T7 promotory, takže tento vektor může být použit pro pseudostabilní knock-out indukovaný T7 RNA polymerázou. Pro tento účel byl vložen přímý T7 promotor pomocí T7linkeru (obsahujícího následující oligonukleotidové primery:
- 17 CZ 303494 B6 aattcttaatacgactcactatagggcc a catgggccctatagtgagtcgtattaag) do místa EcoRI-NcoI v pGAD424. Výsledný vektor byl označen pGAD424-without — FULLlCE-both-I'7. Pečlivě byly eliminovány stop kodony a byly užity maximálně kompatibilní aminokyseliny. Stejná strategie byla použita pro zpětný T7 (sestávající ze dvou oligonukleotidových primerů:
gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca a gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) s místem BamHI a Pstk Aby se zabránilo ztrátě míst Sall, bylo toto místo vloženo do primerů.
Místo Sall je důležité, neboť většina knihoven se klonuje právě do tohoto místa a adaptery jsou dostupné. To činí nově zkonstruovaný vektor kompatibilním s již existujícími vektory. pAS2 s přímým a zpětným promotorem T7/T3 a/nebo Sp6
Analogický kvasinkový dvouhybridní vektor byl zkonstruován na základě pAS2 (Clontech). Parciálním štěpením EcoRV bylo možné odstranit značnou část genu cyh2. Správný konstrukt byl izolován a ověřen restrikČním štěpením BglII. Toto restrikční místo je přítomno ve fragmentu EcoRV, který bylo třeba z pAS2 eliminovat. Tím byl odstraněn gen cyh2, který je slabě toxický a podílí se na růstové retardaci. Tento gen není esenciální k provádění RNA i a kvasinkového dvouhybrídního experimentu. Po eliminaci EcoRV fragmentu se restrikční místo EcoRI lokalizované mezi DNA sekvencí kódující GAL4DB a HA (epitop) stalo jedinečným místem v ptazmidu a lze ho užít k substituci HA linkerem obsahujícím T7 promotor. Tím je zajištěno setrvání všech restrikčních míst, dovolujících klonování ve shodě se čtecím rámcem a kompatibilitu s předchozími vektory a pGAD424. Byl použit linker (oligonukleotidové primery:
gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatag tgagtcgtattaag a gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) s místy BamHI a Pstl. Aby se zabránilo ztrátě místa Sall, bylo vloženo do primerů. Výsledný vektor byl nazván „pAS2-cyh2-HA+both T7-final“.
Přítomnost T7 promotoru (nebo alternativního T3 nebo SP6 promotoru) v pGAD424 dovoluje rychlý přechod od interagujícího proteinu k RNAi a přiřazení funkce izolovanému fragmentu DNA. Další výhodou je schopnost dosáhnout in vitro transkripce svázané s in vitro translací (ATG je v souhlasném Čtecím rámci jak s GAL4DB tak i GAL4AD) značeného proteinu, který může být užit pro in vitro kontroly (např. testy „pull-down“) interakcí proteín-protein.
Sekvence plazmidů a polymerázy T3 a SP6 jsou uvedeny v následujícím seznamu sekvencí.
- 18 CZ 303494 B6
SEZNAM SEKVENCÍ
SP6 DNA-dependentní RNA polymeráza: SEKVENCE ID. Č. 1
Přístupové č.v databázi SWISPROT: P0622I
Sekvence proteinu:
nqdlhaiqlq leeenfnggi rrfeadqqrq iaagsesdta wnrrllseli apmaegiqay keeyegkkgr apralaflqc venevaayit mkvvmdmlnt datlqaiams vaeriedqvr
121 fskleghaak yfekvkkslk asrtksyrha hnvavvaeks vaekdadfdr weawpketql
181 qigttlleil egsvfyngep vfmramrtyg gktiyylqts esvgqwisaf kehvaalspa
241 yapcvipprp wrtpfnggfh tekvasrirl vkgnrehvrk Itqkqmpkvy kainalqntq
301 wqinkdvlav ieevirldlg ygvpsfkpli dkenkpanpv pvefqhlrgr elkemlspeq
361 wqqfinwkge carlytaetk rgsksaavvr mvgqarkysa fesiyfvyam dsrsrvyvqs
421 stlspqsndl gkallrfteg rpvngvealk wfcinganlw gwdkktfdvr vsnvldeefq
431 dmcrdiaadp ltftqwakad apyeflawcf eyaqyldlvd egradefrth Ipvhqdgscs
541 giqhysamlr deygakavnl kpsdapqdiy gavaqvvikk nalymdadda ttftsgsvtl
601 sgtelramas awdsigitrs ltkkpvmtlp ygstrltcre svidyivdle ekeaqkavae
661 grtankvhpf eddrqdyltp gaaynymtal iwpsisevvk apivamkmir qlarfaakrn
721 eglmytlptg fileqkimat emlrvrtclm gdikmslqve tdivdeaamm gaaapnfvhg
781 hdashliltv celvdkgvts iavihdsfgt hadntltlrv alkgqmvamy idgnalqkll
841 eehevrwmvd tgievpeqge fdlneimdse yvfa
T3 DNA-dependentní RNA polymeráza: SEKVENCE ID. Č. 2
Přístupové č. v databázi SWISPROT: P07659
Sekvence proteinu:
mniienieka dfseielaai pfntladhyg salakeclal ehesyelger rflknlerqa kageiadnaa akpllatllp klttrivewl eeyaskkgrk psayaplall kpeasafitl
121 kvilasltst nmtticaaag mlgkaiedea rfgrirdlea khfkkhveeq lnkrhgqvyk
181 kafmqvvead migzgllgge awsswdkett nhvgirliem liestglvel qrhnagnags
241 dhealqlaqe yvdvlakrag alagispmfq pcvvppkpwv aitgggywan grrplalvrt
301 hskkglmrye dvynpevyka vnlaqntawk inkkvlavvn eivnwkncpv adipslerqe
361 lppkpddidt neaalkewkk aaagiyrldk arvsrrisle fmleqankfa skkaiwfpyn
421 mdwrgrvyav pmfncqgndm tkglltlakg kpigeegfyw Ikihgancag vdkvpfperi
481 afiekhvddi lacakdpinn twwaeqdspf cflafcfeya gvthhglsyn cslplafdgs
541 csgiqhfsam Irdevggrav nllpsetvqd iygivaqkvn eilkqdaing tpnemitvtd
601 kdtgeisekl klgtstlacq wlaygvtrsv tkrsvmtiay gskefgfrqq vlddtiqpai
661 dsgkglmftq pnqaagymak liwdavsvtv vaaveamnwl ksaakllaae vkdkktkeil
721 rhrcavhwt: pdgf?vwqey rkplqkridm iflgqfrlc? cintlkdsgi dahkcesgia
791 pnfvhsqdgs hlrmtvvyah ekygiesfal ihdsfgtioa dagklfkavr etmvityenn
341 dvladfysqf adqlhetqld kmpplpkkgn lnladilksd fafa
- 19CZ 303494 B6
SEKVENCE ID. Č. 3 pGN108:
gttgtcgtaaagagatgrnnamtacrruqaccgggtcctctctctctgccagcaczgctcagignggctgtgtgctcgggcicctgccaccggqgg ccttaicttcttcttcttcttctctcctgctctcgcttatcacttcttcattcancrianccmtcatcatcaaactagcatttcnacrttanttttrtmcaarmca atitieagataaaaccaaactacrtgggrtaeagccgteaacagatecccgggacxggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaaigatactaacataa catagaacatrttcaggaggacccngcnggagggtaccggargactgctccaaagaagaagcgtaagctcatgaacacganaacatcgct2agaa cgacttctctgacatcgaaciggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgrttagctcgcgaacagrtggcccíigagcatgag tcttacgagatgggtgaagcacgcxiccgcaagatgttxgagcgtcaacxtaaagctggtgaggngcggataacgctgccgccaagcctcXcarcact accctactccctaagatgangcacgcaicaacgactggKtgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgccegacagccnccagxxccxgcaag aaatcaagccggaagccgugcgtacatcaccattaagaccactcrggertgcctaaccagtgcigacaatacaaccgttcaggctgxagcaagcgc aatcggtcgggccatlgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagcuagcacttcaagaaaaacgrtgaggaacaactcaaciag cgcgtagggcacgtctacazgaaagcatnatgcaagngtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcncgtggca taaggaagacictancatgtaggagucgctgcatcgagatgctcattgagxcaaccggaatggtiagcttacaccgccaaaaigetggegtagtagg tcaagactctgagactatcgaacícgcacctgaaiacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgcíggctggcatctcttcgatgnccaaccttg cgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggxcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagxaagaaagc actgatgcgctacgaagacgnxacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcg gtcgccaacgtaatcaccaagiggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgaTtgagcgtgaagaactcccgatgaaaqcggaagacaicgac aigaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgeaagacaaggctcgcaagtctcgcegtatcagccngagncaig cttgagcaagccaataagmgcxaaccaXaaggccatcxggttcccxtacaacatggactggcgcggncgxgRtacgctgtgtcaatgttcaacccgc aaggtaacgatatgaccaaaggicgtcitacgctggcgaaagguaaccaaEcggtaaggaaggructacíggctgaaaatccacggxgcaaactg tgcgggtgtegataaggttícgmcctgagcgcatcaagncangaggaaaaccacgagaacatcatggertgcgctaagtctccactggagaacac ttggtggíjctgagcaagattctccgncígcrtccrtgcgncrgcmgagtacgcxggggucagcaccacggcctgagcuuacigctcccncegc tggcgtttgacgggtcrtgcíctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggUggtggtcgcgcggnaacngcncctagxgaaaccgt tcaggacatctacgggattgngcxaagaaagxcaacgagarxcxgcaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagxagrtaccgtgacegat gagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaalggctggcnacggtgmcícgcagtgtgactaagc gTtcagtcargacgctggctiacgggtccaaagagncggcnccgtcaacaagtgctggaagaiaccartcagccagctattgartccggcaagggtc xgatgxtcactcagccgaatcaggctgcxggatacatggcxaagctgattxgggaaxccgtgagcgtgacggxggugctgeggrtgaagcaaigaac tggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagancncgcaagcgngcgctgtgcangggtaictcct gatggmccctgtgtggcaggaatacaagaagcctancagacgcgcttgaacctgatgnccicggTcagrtccgcnacagcctaccanaacacca acaaagatagcgagangatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaacrngtacacagccaagacggtagccaccncgtaagactgtagtg tgggeacacgagaagtacggaatcgaatcrmgcactgancacgactccttcggtaccartccggctgacgctgcgaacctgrtcaaagcagtgqgi;
gaaacxatggxtgacacataígagtcngtgaigxactggcxgamctacgzccagxicgctgaccagngcacgagxcrcaanggacaaaatgccagc acttccggcuaaggtaacttgaacctccgxgacatctugagtcggacxxcgcgncgcgtaagggcccactagicggccgxac3ggccctncgtc:
cgcgcgxxtcggtgaigacggtgaaaacctcígacacatgcagctcccggagacggtcacagctigictgxaagcggatgccgggagcagacaagc
Ccgtcagggcgcgtcagcgggtgnggcgggxgtcggggctggcrtaacxatgcggcatcagagcagatíguctgagagtgcaccataigcggxgx gaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcaxcaggcggccttaagggcctcgigatacgccxatmtaraggttaatgxcaxgataataat ggntcttagacgtcaggiggcacnttcggggaaatgtgcgcggaaccccíantgtrtarttrtctaaatacattcaaatatgxatccgcicaigaeacaat aaccctgaEaaaigcttcaataatangaaaaaggaagagtatgagtancaacarticcgtgtcgcccttattcccrmngc3gcamtgccnccxgttu ígctcacccagaaacgctggtgaaagxaaaagaxgctgaagatcagngggtgcacgagtgggttacatcgaactgga:cicaacagcgguagatc crígagagttttcgccccgaagaacgmxccaatgatgagcacmtaaagnctgctatgtggcgcggtanatcccgtartgacgccgggcaagagca actcgstcgccgcatacactanctcagaatgacRggtxgagtaclcaccagXcacagaaaagcatcttacggatggcaigacagxaagagaatuig cagtgctgccataaccatgagxgat2acacigcggccaacttacttetgacaacgatcggaggaccgaaggagcxaaccgcrKmgcacaacatgg gggaícatgtaacicgccngaícgngggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgagcaatggcaa caacgngcgcaaactattaa'cxggcga3ctacaactctagcxxcccggcaacaatuatagaciggatggaggcggataaagngc3ggaccacnc tgcgctcggcccxtccggctggciggxnangctgaíaaaíctggagccggtgagcgtgggtctcgcggutcattgcagcactggggccagatggí aagcccEcccgtatcgtagrxaictacacgacggggagtcaggcaactaxggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggrgccxcacigatua gcatiggxaactgtcagaccaagxnacxcaxatatacmagattgattxaaaacncamnaamaaaaggaxctaggtgaagaxccrRRgauatctca tgaccaaaatcccrxaacgigagrxncgtxccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcrtcttgagatccmrmctgcgcgxaaíctg ctgcngcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggxngtttgccggaxcaagagcxaccaactctmxccgaaggtaacxggcncagcagagc gcagataccaaatactgtccnctagigxagccgtagttaggccaccacncaagaactctgtagcaccgccacatacctcgctctgctaaxcctgKac cagiggcígctgccagtggcgataagtcgtgtcruccgggrtggactca2gacgatagrxaccggaxaaggcgcagcggtcgggctgaaeggggg gncgxgcacacagcccagcngsascgaacgacctacaccgaactgagaíacctacagcgtgagcafxgagaaagcgccacgcxxcccgaaggg agaaaggcggacaggutccggUagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcňccagggggaaacgcctggtatcRUUgtc ctgtcgggtncgccacctctgacrtgagcgtcgatxmgxgaigcxcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccrrxruc ggtxcctggccrtttgcxggccrxxxgctcacatgncmccigcgrurccccxgancigtggataaccgtarttccgccmgagigagctgaaccgctc gccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgccEctccccgcgcgnggccg arxcattaatgcagctggcacgacaggXTXcccgacEggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgxgagttagctcacicaxxaggcacccca ggctttacacnraxgcnccggctcgtaEgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagcutgaccaigatxacgccaagctgt aagmaaacatgatctucuacuacíancicarnaaatmcagagcnaaaaatggcígaaauactcacaacgaTggaucgcxaacaacnggaa aigaaataagcttgcatgcctgcagagcaaaaaaatactgcmtccrtgcaaaaTXCggtgcmcncaaagagaaactnxgaagtcggcgcgagcat
-20CZ 303494 B6 nccRctttgacttctetcmccgccaaaaageciageatrtnangataarngattacacacactcagagnctícgacatgataaagtgtncattggeac tcgccctaacagtacatgacaaeggcggattartatcgatcgatangaagacaaactccaaaigtgtgctcanttggagccccgTgtggggcagctg ctctcaatatattactagggagacgaggagggggaccnatcgaacgtcgcatgagccanctncttcmaigcactctcncactctctcacacattaat cgancaUgactcccataRccngatgaaggtgtgggtnnagcnnTttcccgatttgíaaaagga3gaggctgacgatgrtaggaaaaagag3acg gagccgaaaaaacatccgtagxaagicncctrcuagccgacacttmagacagcattcgccgctagtmgaagtttazattKaaaaaataaaaatUg títcaaímmtaattactaaataggcaaaagtmncaagaactcugaaaaactagctuartcatgggtaciagaaaaancttgmtaaatnaatama tcrtaagatgtaattacgagaagcRttngaaaanctcaanaaaagaatngccgamagaataaaagtcncagaaatgagtaaaagctcaaanaga agíHgttrttaaaggaaaaacacgaaaaaagaaeactatTtatctmcctccccgcgtaaaartagrtgttgTgataaugtgatccgctgtctatngcact cggctctrcacaccgtgcttcctcicacngacccaacaggaaaaaaaaacateacgtctgagacggtgaangccttatcaagagcgtcgictcrttca cccagtaacaaaaaaaantggRXcmacmatatttatgtaggtcacaaaaaaaa3gtgatgcagttttgtgggtcggngtctccacaccacctccgc ctccagcagcacacaatcatcncgtgtgtxctcgacgaRccttgtaigccgcggtcgtgaatgcaccacattcgacgcgcaactacacaccacactc acRtcggtggtattactacacgicatcgngttcgtagtcicccgctcRtcgtccccacicactcetcananccccrtggtgtangamtmuaatggu caccactcctgacgrnctaccncngrmccgtceanugatttíatetggaaattnmaaaamtaggccagagagttctagtícngttctaaaagxcía ggxcagaeaUcaRTtctarncTcateaaaaaaaaagngataaagaaaactggttancagaaagagxgtgtctcgngaaanganeaaaaaaaaatt cccacccctcgcttgmcícaaaaiaigagatcaacggatmnccnctcgancaamtttgctgcgcictgTctgccaaagtgígtgtgtccgagcaaa agatgagagaatnacaaacagaaargaaaaaaagnggccaaauatgaagnrtatccgagattgatgggaaagatattaaígncmacggntgga ggggagagagagatagarracgca:caaac:ccgcctmacatgtcrTttagaatctaaaatagacmtctcatcatmtaatagaaaaTcgagiaatu cagiaatncgcaattncngccaaaaatacacgaaatrtgtgggtctcgccacgatctcggtcttagtggncarnggmaaaagmataaaamcaaa ttctagtgxttaatttccgcataarizgacctaaaatgggtmtgtcatcamuaacaagaaatcgtgaaaatcctgttgtRcgcaattrtctmcaaaaata cacgaaataiaíggtaatrtcccgaaaíangagggtctcgccacgatncagtcacagtggccaggartiatcacgaaaaaagttcgcctagtcicacac
Hccggaaaaccgaatctaaactagrrtmgtcaicatmgaacaaaaaatcgagacatccctatagtttcgcaattncgtcgcrmctctccaaaaatga cagtctagaattaaaancgcÍggaactgggaccatgatatcKttctccccgtmtcatrtuttttítattacactggatrgactaaaggtcaccaccaccg ccagtgtgtgccatatcacacaeacacacacacacaa.tgtcgagaRnatgtgTtatccctgcttgamcgnccgtigtctcictctctctancatcrmg agccgagaagctceagagaatggagcacacaggatcccggcgcgcgatgtcgxgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatca gggaagatcgtctgamctcctcggaigccaccicatcrctcgagmctccgcctgttactcccígccgaacctgatatnccc
- 21 CZ 303494 B6
SEKVENCE ID. Č. 4 pGN!05:
aagcttgcatgcctgcaggccnggtcgacictagacactmcagcucctagatacatggatatccccgccicccaatccacccacccagggaaaaa
Saagggctcgccgaaaaalcaaagrtatctccaggctcgcgcaícccaccgagcggngacttctctccaccacttttcatmsacccicggggtacg ggattggccaaaggacccaaagg:atgmcgaargaraciaacataacatagaacatntcaggaggacccttgcnggagggtaccgagci.cagaa aaaatgactgctccaaagaagaagcgtaaggtaccgguatgaacacgartaacalcgctaagaaegacctctctgacatcgaacrggctgctatccc gttcaacactctggctgaccattacggtgagcgmagcicgcgaacagrtggcccttgagcatgagtcnacgagatgggtgaagcacgcttccgcaa gatgrttgagcgtcaacitaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctcrcatcactaccctactccctaagatgatigcacgcatcaa cgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccrtccagttcctgcaagaaatcaagccggzagccgtagcgtaeatca ccatuagaccactctggcngcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgeaatcggtcgggccattgaggacgaggctcg cncggtcgiatccgtgaccngaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaaeaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcanxa tgcaagrtgicgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcrtcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgct gcatcgagatgctcangagtcaaccggaategnagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggicaagactctgagactatcgaactcgcacct gaatacgctgaggciatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgnccaaccrtgcgtagttcctectaagccgtggactggcatt aciggtggtggctattgggctaacggtcgicgtcctctggcgctggtgcgtactcacagiaagaaagcactgatgegctacgaagacgtrtacatgcct gaggtgtacaaagcgaRaacangcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcct3gcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcat tgtccggtcgaggacatcccigcgangagcgtgaagaactcccgaigaaaccggaagacatcgacatgaaicctgaggctcicaccgcgtggaaa cgtgctgccgctgctgtgUccgcaaggacagggcícgcaagtctcgccgtatcagccrtgagttcatgcttgagcaagccaataagmgctaaccac aaggccatctggncccttaeaacatggactggegcggtcgígrctacgccgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcn acgctggcgaaaggtaaaccaaccggtaaggaaggttactaciggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgtrccctg agcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtcrccactgg3gaacacttggtgggctgagcaagatictccgttct gcnccttgcgttcígcmgagtacgctggggtaeagcaccacggcctgagctaiaactgctcccnccgctggcgtttgacgggtctigcictggcatc cagcacnctccgegatgctccgagatgaggaggtggrcgcgcggnaacngcrtcciagtgagaccgttcaggacatctacgggangngctaag aaagtcaacgaganctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatcíctgagaaa gtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcícacggtgnacícgcagigtgactaagcgttcagtcatgacgctggcnacgggtc caaagagttcggcnccgtcaacaagigctggaagaraccattcagccagctattganccggcaagggtccgatgncacicagccgaatcaggctg ctggaiacatggcuagctgamgggaatcigigagcgtgacggTggtagctgcggngaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctgg ctgctgaggtcaaagaiaagaagaciggagagancncgcaagcgttgcgctgtgcartgggtaactcctgatggtrtcccigtgtggcaggaataca agaagccTattcagacgcgcngaaccigatgttccTcggtcagnccgcnacagcciaccanaacaccaacaaagatagcgagangatgcacaca aacaggagic:ggtaicgctccU3cmgíac3cagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcaeacgagaagtacggaatcga arcnrtgcacTgancacgactccncggtaccanccggctgacgctgcgaacctgncaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacataigagtcn gígatgtactggctgatnctacgaccagrtcgctgaccagngcacgagicícaanggacaaaatgccagcacitccggcíaaaggtaactígaacct ccgtgacatcrtagagtcggacncgcgrtcgcgiaagaaRecaactgagcgccggtcgcíaccartaccaacngictggtgtcaaaaauataggg gccgctgtcatcagagtaagmaaacígagnctactaactaacgagtaaiamaaatrttcagcatcicgcgcccgtgcctctgacncuagrccaan actcncaacatccctacatgctcmcicccigtgctcccaccccctantttgttattatcaaaaaaactícttcnaatncmgtrrrnagcncmiaagica cc:ctaacaaígaaangtgtagancaaaaatagaanaancgtaaaaa3agtcgaaaaaaangtgctccctccccccattaaraaciattc^tccca aaatciacacaatgnctgtgtacacncnatgtmrtttacnctgataaatmmtgaaacatcatagaaaaaaccgc2cacaaaataccttatcatargtt acgmcagttíaigaccgcaatTmamcncgcacgtcrgggccicTcatgacgicaaarcatgcicatcgtgaaaaagTmggagtartntggaartrn caatcaagtgaaagtnargaaanaairncctgcrrngcnmgggggtttcccctangmgtcaagagttrcgaggacggcgttmcngctaaaatca caagiaítgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggmgggmgaggctcagtggaaggtgagtagaagrtgataamgaaagtggagu gtgtctatggggtnngcctttaatgacagaaíacaítcccaatataccaaacateactgittcctactagtcggccgtacgggcccrrtcgtctcgcgcg mcggigatgaeggtgaaaacctcigacacatgcagctcccggagacggtcacagcrtgtctglaagcggatgccgggagcagacaagcccgtca gggcgcgtcagcgggtgtiggcgggtgtcggggctggcrtaactatgcggcatcagagcagangtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaau ccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccttaagggccrcgtgatacgcctamnataggtiaatgtcaigataataatggrRctt agacgtcaggtggcactttxcggggaaaigtgcgcggaacccctatttgtRattTOctaaatacancaaatatgtatccgctcatgagacaataaccct gaiaaatgcticaaraatattgaaaaaggaagagtatgagtancaacamccgtgtcgcccnancccinmgcggcanngccrtcctgtratgcíca cccagaaacgcíggtgaaagiaaaagatgcigaagatcagngggtgcacgagtgggnacatcgaactggatcicaacagcggteagatccngag agtracgccccgaagaacgnnccaatgatgagcacmt2aagttc:gctatgtggcgcggtaHatcccgtangacgccgggcaagagcaacicg gtcgccgcattcactatxctcagaatgacnggRgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaanatgcagtg ctgccataaccaigagígataacacigcagccaacrt2cnctgacaacga[cggagg3CCgaaggagcUaccgcRrntgcacaacatgggggat catgraactcgccrtgatcgngggaaccggagccgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccaegatgcctgtagcaatggcaacaacg
KgcgcaaactattaactggcgaactacnactctagcncccggcaacaanaategactggatggaggcggataaagtigcaggaccacncÍgcgct cggcccnccggcTggctggmangctgataaatctggagccggtgagcgtgggtcícgcggtatcartgcagcactggggccagatggtaagccc tcccgtatcgtagrratctacacgacggggagrcaggcaactatggaigaacgaaaíagacagatcgctgagataggtgcctcactganaagcang giaacigtcagaccaagtnactcatttaiacttttgangatnaaaacrtcantttaatnaaaaggatctaggtgaagatccntttgataatctcatgacca aaatcccttaacgtgagtrncgnccacigagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcrtcngagatccnntnctgcgcgtaaictgctgctt gcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtngmgccggaicaagagctaccaacxctrtnccgaaggtaactggcncagcagagcgcaga taccaaatactgtccnctagigiagccgtagrraggccaccacrtcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtg gctgcigccagtggcgataagxgtetcnaccgggEiggactcaagacgatagnaccggaiaaggcgcagcggicgggcigaacggggggncg
tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcangagaaagcgccacgctícccgaagggagaa aggcggacaggtatccggtaagcggcagggícggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatcmaiagtcctgtc gggtttcgccacctctgacttgagegtcgamngtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccageaacgcggccmnacggnc ctggccttngcrggccmtgctcacatgttcmcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccg cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgatica ttaatgcagctggcacgacaggmcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctt tacactttatgcttccggctcgtatgngtgtggaattgtgagcggataacaatncacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagnx aaacatgatcttactaactaactanctcatttaaarmcagagcttaaaaatggctgaaatcactcacaacgatggaucgctaacaacnggaaatgaa at
- 23 CZ 303494 B6
SEKVENCE ID. Č. 5 pGN400:
aagcttgcatgcctgcaggccttggtcgacíciagacacnnc3gctacqt4gatacatggataiccccgcctcccaatcc3CCCacccagggaaaM gaagggcicgccgaaaaatcaaagnaTctccaggctcgcgcatcccaccgagcggngacnctctccaccacttncatntaaccctcggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtatgmegaatgataciaacataacatagaaeartncaggaggacccttgcttggagggtaccgagctcccgg ganaaucgactcactataccggtagaaaaaatgagtaaaggagaagaactnteactggagngtcccaancngngaattagatggtgatgnaatg ggcacaaatrRctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacrtacccttaaarttatttgcaciactggaaaactacctgnccatgg gtaagtttaaacatatatatactaacta&ccctganantaaatTncagccaacacngtcactacmctgnarggtgncaatgcRctcgagaczcceag alcatatgaaacggcatgacrTrncaagagrgccatgcccgaaggttatgUcaggaaagaactatatmtcaaagatgacgggaaciacaagacac gtazgtnaaacagttcggtactaactaaccatacatatnaaanncaggtgctgaagtcaagtRgaaggtgatacccngnaatigaatcgagttaaa aggtaRganctaaagaagategaaacancnggacacaaanggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaat ggaatcaaagngtaagtnaaacatgannactaactaactaatctgatttaaattncagaacncaaaanagacacaacattgaagatggaagcgttca actagcagaccattitcaacaaaatactccaauggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatc ccaacgaaaagagagaccacatggrccrtcngagtrtgtaacagetgctggganacacatggcatggatgaactatacaaatagcattcgtagaartc caactgagcgccggtcgctaccattaccaacttgtctggtgtcaaaaataataggggccgcrgtcarcagagtaagTnaaacTgagttctactaactaa cgagtaatarttaaarTrtcagcatctcgcgcccgtgcctcigacnctaagtccaattacTcrtcaacatccctacatgctctttctccctgígctcccaccc cctatTtttgttattatcaaaaaaacncncnaafficmgnnnagcnctnxaagtcacctctaacaatgaaartgtgtagancaaaaacagaaKaancg [aaiaaaaagtcgaaaaaaangtgctccctccccccattaataataattctatcccaaaatctacacaargactgtgtacacttcííatgtttttRtacttctg ataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaattccnatcaiatgctacgtncagmatgaccgeaatcRtatttcitcgcacgtctgggc ctctcatgacgtcaaatcatgctcaccgtgaaaaagtmggagtatmtggaantncaatcaagtgaaagmatgaaattaamtcctgcmigctttTtg ggggWcccctaftgrngtcaagagncgaggacggcgtttTTcrÍgctaaaatcacaagungargagcacgalgcaagaaagatcggaagaagg mgggrngaggctcagtggaaggtgagtagaagngataamgaaagtggagtagtgtcíatggggtmtgccttaaatgacagaatacancccaat ataccaaacataactgmcctoctagtcggccgtacgggccctttcgtctcgcgcgmcggtgatgacggtgaaaaccrctgacacatgcagctcccg gagacggtcacagcrtgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgtiggcgggtglcggggciggcrta actatgcggcatcagageagattgtacigagagigcaccaiaigcgg^gtgaiataccgcacagargcgtaaggagaaaataccgearcaggcggc cnaagggcctcgtgatacgcctainnataggTtaatgtcaEgataaiaatggtncttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacc cctantgntamttctaaatacancaaatatgtatccgcícatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatangaaaaaggaagagtargagtatt caacattíccgtgtcgccctíattccciríntgcggcaítrtgccncctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgcígaagatcagtt gggigcacgagtgggciacatcgaactggatcTcaacagcggtaagatccrtgagagtntcgccccgaagaacgnRccaatgargagcacnTtaaa gttctgciatgtggcgcggtanatcccgtartgacgccgggcaagagczacícggicgccgcaiacactancícagaatg2cnggngagtactcac cagTcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgcígccataaccatgagtgataacactgcggccaactacnctga caacgatcggaggaccgaaggagciaaccgcnnngcacsacatgggggarcatgEaactcgccrtgatcgrtgggaaccggagcigaatgaagc cataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgccrgtagcaatggcaacaacgtigcgcaaaciattaacTggcgaactacnacictagcncccggc aacaaR2atagactggatggaggcgg2taaagngc3ggaccacnctgcgcicggcccítccggclggciggmatigctgaiaaatctggagccg gtgagcgtgggictcgcggtatcangcagcacrggggccagatggtaagcccicccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactat ggatgaacgaaatagacagatcgCTgagataggtgcctcacrgartaagcattggUactgtcagaccaagmactcataiaractttagattgatnaaa acRcamnaamaaaaggaictaggtgaagaiccnmgataatctcaigaccaaaatcccnaacgtgagtmcgttccacígagcgtcagaccccg tagaaaagatcaaaggatcncngagatccntrmctgcgcgtaatctgctgcrtgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggmgTrgccgg atcaagagciaccaactcttmccgaaegíaaciggcrtcagcagagcgcagataccaaatactgíccrtctagtgtagccgiagnaggccaccacn caagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctcigctaatcctgRaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttoccgggttggactca agacgatagttaccggaíaaggcgeagcggtcgggcígaacggggggttcgtgcacacagcceagcnggagcgaacgacctacaccgaactga gatacctaC2gcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggag agcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggatcmatagtcctgtcgggtttcgccicctctgacttgagcgtcgatmtgtgatgctegtc 2SgSggScgg3gcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctnitacggRcctggcctrrtgctggccrtttgctcacatgncRtcclgcgttatccc ctganctgtggataaccgtattaccgcctngagtgagctgauccgcícgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaag cggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctciccccgcgcgrtggccgancattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggc agígagcgcaacgcaanaalgtgagttagctcactcaRaggcaccccaggcttíacacmaTgcnccggctcgtatgKgtgrggaattgtgagcgg ataacaatttcacacaggjaacagc(atgaccatgaKacgccaagctguagtnaaacatgatcrtactaactaactattctcat«aaatmcigagcrt aaaaaíggctgaaatcacicacaacgaxggaíacgccaacaacnggxaatgaaat
- 24 CZ 303494 86
SEKVENCE ID. č. 6 pGN401 gatcccggcgcgcgaigtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatcagggaagatcgtctgantctcctcggatgccacct catcíctcgagmctccgcctgnaetccclgccgaacctgatamcccgngtcgtaaagagatgtnnamtacmacaccgggtcctctctctctgcc agcacagctcagtgrtggcigtgtgctcgggctcctgccaccggcggcetcatcrtcnctíctícnctcíccígctctcgcttarcacttcrícartcatTcrt attccnttcatcatcaaactagcamcttacmatttattnntcaatmcaatmcagataaaaccaaactacrtgggttacagccgtcaacagatccccg ggattggccaaaggacecaaaggtatgmcgaatgatactaacataacatagaacarmcaggaggacccrtgcttggagggtaccggtagaaaaa atgagtaaaggagaagaactmcactggagngtcccaaKcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaarntctgtcagtggagagggtga ag8Tgatgcaacatacggaaaacnacccnaaamamgcactactggaaaact2cctgrtccatgggtaagtttaaacatatatatactaactaaccct gattamaaattttcagccaacacrtgtcact2ctttctgttatggtgttcaatgcncicgagaiacccagatcatalgaaacggcatgacttmcaagagt gccatgcccgaaggrtatgtacaggaaagaaetatanmcaaagatgacgggaactacaagacacgtaagTttaaacagttcggtactaactaaccat acaiattt aaa rtncaggtgctgaagtcaagtttgaa ggtg atacccttgttaatagaatcgagTtaaaaggtartgatmzaagaagaíggaaacartcn ggacaeaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttgíaagmaaacnggacttac taactaacgganatamaaattncagaacncaaaattagacacaacangaagatggaagcgncaactagcagaccatiatcaacaaaatactccaa ttggcgatggccctgtcctraaccagacaaccartacctgtccacacaatctgcccttlcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttci tgagmgtaacagctgctgggarucacatggcatggatgaacutacaaatagcattcgtagaattccaactgagcgccggtcgctaccanaccaac ttgtctggtgtcaaaaataataggggccgctgtcatcagagtaagmaaaclgagrtctactaactaacgagtaatanxaaattttcagcatctcgcgccc gtgccictgacticttagxccaatucxncaacaícccttcargcÍcnxcxccctgígctcccaccccctatnngnanatcaaaaaaacrtcncttaan tctngntmagctrcrmaagtcacctctaacaatgaaangtgtagattcaaaaatagaaRaartcgtaataaaaagtcgaaaaaaattgfgctcccrcc ccccaruataataanctaccccaaaatctacacaatgnctgtgtacacttcrtatgtmrtttacttctgataaatmttttgaaacatcatagaaaaaaccg cacacaaaaiaccnatcatatgnacgntcagtnatgaccgcaasnurocttcgcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcatgctcaicgtgaaa aagtntggagtarmtggaarKttcaatcaagtgaaagmatgaaatxaatntcctgcttngctnttgggggmcccctattgtttgtcaagagtttcgag gacggcgtttttcttgcíaaaatcacaagtattgaigagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggrngggtttgaggctcagtggaaggtgagtag aagtigitaatrtgaaagtggagtagtgtctatggggttrrtgccrtaaatgacagaatacancccaatataccaaacataaetgtrtcctacUgtcggcc gucgggcccggtacccagcnngncccxragtgagggnaangcgcgcnggcgtaatcatggtcatagctgtttccrgtgtgaaangrutccgct cacaaríccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaacxacanaattgcgttgcgctcactgc ccgctnccagtcgggaaaccígtcgtgccagctgcanaatgaatcggccaacgegcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcrtccgcrtcc tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgncggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata acgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgngctggcgtnnccauggctccgcccccct gacgagcateacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctnctcccttcgggaagcgtggcgcmetcatagctcacgctgíaggtatcicag ttcggtgtaggtcgncgctccaagcrgggctgtgígcacgaaccccccgncagcccgaccgctgcgccTtatccggtaactatcgtcngagtccaa cccggtaagacacgacrtatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgciacagagttcttgaagtg gtggcctaactacggctacactagaaggacagtatrtggtaicígcgcrctgctgaagccagnaccttcggaaaaagagttggtagctcngatccgg caaacaaaecaccgctggtagcggtggtrnntgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatccmgaicrmctacg gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggatrrtggtcafgagartatcaaaaaggatcncacctagatcctmaaattaaaaafgaag nraaaxaatcttaagtaatatgagiaaacttggtctgacaguaccaatgctttatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtcttmcgitcatccat agngcctgactccccgtcgtgtagaraactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgatacegcgagacccacgctcaccg gciccagatnatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagíggtcctgcaacttUl€cgcctccaiccagtctanaangttgc cgggaagctagagtaagtagncgccagnaaiagrttgcgcaacgttgttgccartgctacaggcaicgtggtgtcacgctcgtcgrttggtatggctte artcagcíccggrtcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcegttagctccrtcggtcctccgatcgrtgtcagaagt aagttggccgcagtgretcactcaíegnatggcagcactgcataattcícttactgtcatgccalccgtaigatgcmtctgtgactggigagucícaa ccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcngcccggcgtcaaucgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtg ctcatcartggaaaacgttctfcggggcgaaaactclcaaggatcKaccgctgngagatccagttcgatguacccactcgtgcacccaacrgatcttc agcatcmtacttícaccagcgmc;gggigagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgngaata ctcatactcttccnntcaatarungaagcatnatc3gggnartgtctcatgagcggaiacatatttgaatgtacttaga2aaataaacaaataggggnc cgcgcacamccccgaaaaetgccacctaaattgtaagcgiTaaratmgnaaaartcgcgTtaaanttígnaaatcagcícartTntzaccaaíaggc cgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggngagtgngnccagmggaacaagagtccacUKaaagaacgtgga ctccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccc2ctacgtgaaccatcaccctaatcaagrtnttggggtcgagg:gccgtaaa gc3c:aaatcggaaccct2aagggagcccccgatnagagcngacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaaggg22gaaagcga3 agSa3c2g3cgct2gggcgctzgc3agigagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcctaatgcgccgcUca2ggcgcgtc ccancgccattcaggctgcgc2actgttgggaagggcgatcggtgcgggccicncgctana:gccagctggcgaaagggggaígtgc:gcaag gcgaxiagngggtaacgccaggsrmcccagtcacgacgngiaaaacgacegccagtgagcgcgcguatacgactcactatagggcgaang gagctccaccgcggiggcggccgcictagaactagtg
- 25 CZ 303494 B6 pGNllO: SEKVENCE ID. Č. 7 garcctccaaa2tcgtcttccgctc[gaa3aacgaaagtggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaattgagcmngggtcgaaaa aaatgctmagaatgctgagaacacgnaaacacgaagatcautnamtgagacccggatgctctgaaaatgtctgacaugarnaaaaaagcatat atatartmcactrtcaacgtgaaagnrtgtgcaacmaiagaatctcctanggcacangtttntatnaactgaggcagrtingaacacctttttgaaacct tgaatcictncaagtatactztczaaaagactcacrteaeczttczaaatsccasaagaaaactaTatngaatctcgcgetaaanzagaaaiKcaacc gcgciccactggacaartggaaaaaaaaniattcggaggcgacaacggtatTttcgaaangattttctgtgtattttctcatttmaua3rtcrtcttTgatit atcgttcgtttgtgagaaanuangtancaaactttmatagtaagataccggtggtaccgciagccgtacgaacccgggattggccaaaggaceca aaggtatgmcgaatgatacEaacataacatagaacaímcaggaggacccrtgcttggagggtaccggatgacTgcrccaaagaagaagcgtaagc tcatgaacacgattaacatcgcaagaacgacttctctgacatcgaactggcigctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgmagct cgcgaacagttggcccttgagcatgagtcrtacgagatgggtgaagcacgcnccgcaagatgrtigagcgtcaactuaagctggtgaggngcgga taacgcigccgccaagcctcicatcactaccctactccctaagatgattgcacgcaicaacgactggtngaggaagtgaaagctaagcgcggcaag cgccegacagccttccagnccrgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccacíctggcttgcctaaccagtgctgaca atacaaccgrtcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccartgaggacgaggctcgcrtcggtcgtarccgtgaccttgaagctaagcacrtcaa gaaaaacgngaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggcigacatgctctcuagggtcta ctcggtggcgaggcgtggtcncgtggcataaggaagactctancatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagícaaccggaatggttag cnacaccgccaaaatgctggc gtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcaectgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcg
Ctggctggcatctctccgatgnccaaccngcgtágnccicctaagccgtggactggcanactggtggtggctangggctaacggtcgtcgtcctct ggcgctggtgcgtactcacagiaagaaagcactgatgcgctacgaagacgniacaigcctgaggtgiac3aagcgattaacattgcgcaaaacacc gcatggaaaatcaacaagaaagtcciagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcatigrccggtcgaggacatccctgcgartgagcgtgaa gaactcccgaigaaaccggaagacaicgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaagacaaggctc gcaagtctcgccgtatcagccngagncatgcrtg3gcaagccaataagtngctaaccataaggccatctggncccttacaacatggactggcgcg gttegrgnxacgctgtgtcaatgTtcaacccgcaaggtaacgaratgaccaaaggacgtcnacgctggegaaaggtaaaccaarcggtaaggaagg ttactactggctgaaaarccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggmcgntcctgagcgcatcaagrtcattgaggaaaaccacgagaacat catggcngcgctaagtctccactggagaacacnggtgggctgagcaagatrctccgttctgcrtccttgcgttctgctngagtacgctggggtacagc accacggcctgagciataactgcicccttccgctggcgmgacgggtcrtgctctggcatccagcacttctcegcgatgctccgagatgaggtaggtg gtcgcgcggnaacngcncctagigaaaccgticaggacatctacgggartgttgctaagaaagtcaacgagartctgcaagcagacgcaaícaatg ggaccgataacgaagtagnaccgEgaccgatgagaacactggtgaaaicicigagaaagtcaagctgggcacíaaggcaciggciggtcaatggct g gerta cggtgttactc gcag-rg tgac taagcgncagtcatgacgctggcnacgggtccaaagagttcggcrtccgtcaac aagtgctggaa ga ta c cancagccagctattganccggcaagggtcigatgncactcagccgaatcaggctgciggatacatggciaagctgatrtgggaatccgtgagcgt gacggrggtagctgcggngaagcaalgaactggcctaagtctgctgctaagctgcíggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcnc gcaagcgrtgcgctgtgcartgggraactcctgatggmccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcngaacctgaigncctcgg tcagttccgcnacagcctaccartaacaccaacaaagat2gcgagartgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactngucacagcca agacggtagccaccncgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcnngcacígancacgactccttcggtacc2ttccggc tgacgctgcgaacctgtrcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacaratgagtctígtgatgractggctgacnctacgaccagncgctgaccag ngcacgagtcicaanggacaaaatgccagcacttccggctaaaggraacngaacctccgtgacatcttagagtcggaencgcgrtcgcgtaaggg ccctcgrcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggmgamt ctttctggteaaaaagatgaaattartgarntcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtcrgcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgc gggaagrgagccaagaggtatgrmtcaaaaaícaataactgatcaaamtiangrttggtgaamaagaaaataatattcgaaaartcctctgaattat caagarrgcagtattaarctcgagaaaaangagatattcatagagcrangtaaatntcrtgarncagactgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaa agaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagcíaragaagccgggaaacrtcaccagctccaaaaaggtcc2aggagaccag grrtgtcaaaagcrtcctgcganaanctcatttcaatnttcagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggttcgttcaagatctcccagaaggtcttca geacgnccccgicacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccgaagagccagcacegctaccagagaaaaaga agaaagagccgctggatatictacgaacaagaaceggaggagcatatattccacccgccaaacrtcgacrtatgcaacaacagartagtgataagca aagtgaacagtatcagagaatgaattggga22gaatgaagaaaaagatícacggattggttaacagagtcaacgcgaagaatcttgttcaaangtca gagaacTtcttcaagagaatgtgancgncaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaattaamaamncaggggactxctctgccgtg acartancaagctcaggcmctcaccagganctctaacgtctatgcagctrtggcggcagttatcaactcgaaanccctcatgrcggtgaacncnctc cgtcgtcrgattgtacagncaaaagaagcttccgtagaaargacagasgcgtcacggtgaacgtgatcaaartcatcgcacatrtganaatcaacaag rtgctcacgaagncttgcgctggaaatcatgaKctgatgcngaagaaccaacigacgancagrtgaagicgccangcgrtcctgaaagagtgtgga gcaaagcttctggagattgctccaecagcrcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaartctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcacrggaic gaegtencagtatatgangagacigcaatgcagattcgaaaggacaaantgcggtaaggtagaatatauaatagttunagaaaaaaataaanag aauamaaaltcctactagccaatcaggcgacctmtgcgcaragrtctartangaaaaamggagaatttctcatanctcgctcggaaatctggaatt cgacgagatcttcíggcnctgtgcagctgcatcgcrttgtgctcccmctcgcngtcrtctgigtacaccaagaaccngttgagncatcaactgaatct gtgactggcttgngctcactggargcacíag2cgactgancícgagaaatcagattgagngcgattagggtgaccagaaangggaat3a'jcgaa cmgaaaatattcaggaggatTaaaaaaattanctcgacaaiccracaaamacnangcaccatgttgctccaacattmcattaaaagrtaatgaaaa aargtagaaaatcggaaartggcaamtcagaccantnaagcarmcaaaaaaaaattgcagctgaaataaatgtcattncagaraaatcgagcgan ttctgngtctgacaciagrnTtagrmaaaaaatgnggaagaacatggtgcaataggtaamcatagaatnccatgtgtmtmcaanaaccaartaíc caaatcnccaaactcacanngcggagctgggctatcaagaatctgctgcagtirtataagacgagcatctctgatatcactgaaaattaattntaatca aaacttgaatatc3acuaacccacnanaacmctcgatcnctgtcgttcegtacgargacggtgaagaagccaangt2gtagtigamggnc3agt
-26CZ 303494 B6 cctttcggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctatrugrutaacnaggcctaagancaatttaatgaagtgirtaaamgRcíctgaacctettaaga tgarcmtggattagaaacatauagacaggtttacctatctattaaaaaacagatcaaaatagatacgaccaaateggataatceatgccta«tggcat ctaggaacglgttcrtagaagamcttacgízatcgtatgaagaaataacaarrtgatcgtiggccagcaaaaatagggnrcaagtgggaugtgTintat tagcteaccggaaaattnatagtmtmtgcaagiaaccactgaaaaccccctaartgtatacattrtnggagcagcttctggtcttrttgagcaaeaaaat tcgaiaaaacagaatrtaagtgtaaartgttcacatttagmctatmatcaaattttgngctcaaaaacattcgaagctgctctaaaaaaatgcattaaaaa aggggttttcagtggWttcacanaaiaaagctaattnaactaaaaatccatcatattueaacnigtcacaacaataaaatgctggtcaaaatgígttcg aaaaaatgtnttttttnaatntataatnaaaaatagrtttctncgcígggacacatacacrtttgggcgtaaattttcagncaaatnccamtucaaccat aatcataaagctacgtctgatctcictcgcacnacctgcgcctgaRcgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagttgt ggtagtggacgncatcacgcaaiactgaccaatggtcgtggggtctcacntccgtactattgagagaggggagactgaagaíggcaattgaggaca gtgtcttcgacgcacgcatgcitccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcttgtttctaagcccctcccRtgtaatacataeaca tacet aataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgRgctgtagttgccaaggcatcatcgatgaaataactgaaagaaagaattaaataattatigc aggcgiaiccggcggtcangzagacRggacttgangaggaggaggatcagatcaiccatacactta3tRggaggatgcggRgatccggaxaatg ggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcaRaamaataaattgaaRccatRcagatgtgrtcaaactagaiccagaattcgaaaagaacga ggaggtRatgaggagatccgtaaggaaatcaRggaaacgccgatatrtcggatgaggatggtggcgacgagttggatgatgaagaagagggtagt gatgtggaagaggctccgaagaagactacagaganangataatactgatcagaartgactgcrttcagaaggtattcartttgagttngggceggcaa atctgtaagRgccggttgccgaaaaRtgctgaatttgccggaaaaaaaaaRccggaatRatRaaaaactttttgtaaaaattaaattaaaRtgcaacR rtcagagaagtctacctgaeaatgcaatcatctRggactaccaagaagctgctczcaaattgcigaaaatgaagattccagacagcatgcaggtcagc gatgtigcaaagaaaaattncgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaartiaaaaaaaaactcegRrttRcttmttttatacgagaaaaaccaaaaaa atgtattrttgccaaaRctaaaatactatccccgaáaRRcaatannctctRcagaacgaaetctgcgcgatgcttgtcgattgttgcgctcaacagcgta cctajegagcgattctacggaatgctcatcgzacgmctgccgacRcgcctcgaataccagcaatacRtgaaaagctctgceaggacacgtaRccac gattcaccgaangacatcaeaaaactgcggaamggctcgcctiartgctcatRgctctcgacggatgctaRgactggaagaRRggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacncnctggcagaatctataruaatatatattuatgaacttgtggaggegatgggaatggttaaacttcattcgagag
R2ctgatccgtgagtttcctagagagagRgRRcgtancaatntcectatmcagaactnggctcartgctttgttgganatteccacgaactaatccg aaeagcgcacgartncgatcaacttcttcacaatganggangggcggnigacgnggaacRcgtgaatggctggcaaagggtctcaagaagaaga agggaatgctggatcagRgaaegccgaaícaagctcagaRcatcgtcglcRcggancgtcagactcgtctgaRcRcgganctgacgancatcc gactcgtettcagattcetcaicRCRcagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagRccaaaaagaag gaaaaagagaatattggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgateaaagtgtggagaacaaggacaaggaícgtcgacg tc3ccaggattctgacgaaaaicgccggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagac:cggatgaígagg aicggaaaggtcgtgaacgícgggaagancaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgtgaccgaagcaaegatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgccatgactctgatgatgategtaaaactcgícgggatagaagt gaagagcgaggaggaegtcgtcgígaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgitgaattTtcaaanttaaatactgaatamgttrnraccurt atttatttattctctttgtgttttttncitgCTtt«aaaaaattaa«caatecaaatc»aacatgagcggRtrctnctcmccgtetcccaattcgattccgct cctetcatctgaacacaatgtgcaagmamatcrtctcgctttcatttcanaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacacacaaaaggaíg atggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacaRcaaRcagaaatatggaggaaggntaaaagaaaacataaaaatatatagaggaggaa ggaaaactagtaaaaaaiaagcaaagaaaRaggcgaacgatgagaangtcctcgcRggcaaatgegaatccgtatggagaggcacgtRggcga aggcaaatgttcggtatggagaicígEaaaaannxaagngaaatttggtgrtgctctmacaaaattttccgattttcgcRgaaanacggrgccaggtct cgacacgtcRccaatttticaaaRcaaaagagcctrtaatgggcTgtagiTgcLaamctcgtffitgaaaartntertccgrttaatcgaaaffigatgtarn tatttatgatmcaataaatncaaagaaactggtgaaaactcggaaaangtgaactacagtaaíccaatccRaaaggcgcacaccnnaaatgrccgc cccaatacgatatmtKaagancgcUgagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccc:aiagtgagtcgtattacaattcactggccgícgt macaacgtcgtgactggg2aaaccctggcgtxacccaacnaatcgccttgcagcacatccccccttcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgUgcggcgcatiaagcgcggcgggtgtggtggRacgc gcagcgtgaccgctacacRgccagcgccctagcgcccgctccrttcgctttcncccríccrttctcgccacgttcgccggcmccccgtcaagctcta aaicgggggctccctnagggnccgatRagtgctttacggcacctcgaccceaaaaaacRgaRagggtgatggRcacgtagtgggccatcgccct gatagacggttmcgccčttfgacgRggagtccacgRcmaatagtggactcrtgrtccaaactggaacaacactcaaccctatctcjgtcunctRt gatnataagggaRTtgccgamcggcctaRggrtaaaaaatgagctgatRaacaiaaatttaacgcgaattrtaacaaaatattaacgrtUcaaRtca ggcggcacttttcggggaaatgcgcgcggaacccctatngRtatRttctaaatacaRcaaaiatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgc ttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacamccgtgtcgccctttrtcccrttmgcggcamtgccttcctgttrngctcacccagaaac gctegtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggRacatcgaactggacctcaacagcggtaagatccRgagagmtcgcc ccgaagaacgttttccaatgatgagcactRuaagnctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggicgccgcat acactaRctcagaatgacttggRgagtactcaccagtcacagaaaagcatcRacggaíggcatgacagtaagagaattatgcagtgeígccataag catgagtgataacactgcggccaacRacRctgacaacgatcggaggaccgaaggagetaaccgcRtnTtcacaacatgggggatcatgtaactcg ccrtgatcgngggaaccggagctgaargaagccacaccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaact aRaactggcgaactacttactctagcRcccggcaacaattaatagactggatggaggcggacaaagngcaggaccacttctgcgctcggcccrtce
SgetggctggtRangctgataaaictggagccggtgagcgtgggtctcgcggUtcangcagcacíggggccagatggtaagccctcccgtaccgt agnatc tacacgacgggcagtcaggcaacutggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcaRggtaactgteag accaagntactcatatatacrttagattgamaaaacrtcatxtttaamaaaaggacctaggtgaagatccmngataatctcatgaccaaaatcccttaa cgtgagnttcgnccactgagcgtcagaccccgtágaaaagatcaaaggatcncttgagatccttttmctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa aaaceaccgctaccagcggtggRxgmgccggatcaagagctaccaaccctRnccgaaggtaactggcReageagagcgcagataccaaatact gtccnctagtgtagccgtagttagEccaccacncaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctcígcíaatcctgtiaccagtggctgctgccag tggcgataagtcgtgtcttaccgggnggaetcaagaegatagnaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggRcgtgcacaeagcc cagcrtggagcgaacgacctacaecgaactgagatacctacagcgtgageartgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacagg
Utccggiaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcctggtatctnaiagtcctgtegggmcgccac ctctgacttgagcgtcgatmtgtgatgctcgtcaggggggccgzgcctatggaaaaacgccagcaacgcggccttntacggttcctggccrrttgct ggcctmgctcaealgttctttccigcgnatcccctganctgtggataaccgtatuccgcctrtgagtgagcrgacaccgctcgccgczgccgaacga ccgagcgcagcgagtcagígagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctg gcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttaccícactcatuggcaccccaggcmacacmatgct
Eccggctcctatgttgtgtggaangtg2gcggataacaatncacacaggaaacagcUtgaccatganacgccaagctcggaatiaaecc[cactaa agggaacaaaagctgggggg
-28 CZ 303494 B6 pAS2-cyh2'HA^bothT7-fmal
SEKVENCE ID. Č. 8 garccgtcgacagatcTCCCíatagigagxgtatuctgcagccaagctaanccgggcgaamctutgamatganTRananaaataagnataaaaaaa ataagtgutacaaaimaaagtgactcnaggnnaaaacgaaaancngncngag:aactcRtcctguggtcaggngcrnc:caggtatagcargaggt cgctcttartgaccacaccTCiaceggcargcaagcnggcgUatcatggicziagctgmcctgtgigaaangnatccgctcacaanccacicaacatac gagccggaagcataaagtgíaaagcctggggtgcctaaígagtgaggiaactcacattaattgcgngcgctcactgcccgcraccagicgggaaacctgt egtgccagctggituitgaaccggccaacgcgcggggagaggcggtRgegtangggegctctteegcnectcgctHctgactcgctgegctcggteg tTCggcigcggcgagcggtatcagcicacKaaaggcggtaaacggnatccacagaatcaggggauacgcaggaaagaacatgtgagcaaiaggcc agcaaaaggccaggaaccstaaaaaggccgcgrtgctggcgTOtccataggctccgcccccctgicgagcaicacaaaaatcgacgctcaagtcagag giggcgaaacccgacaggacuuaagataccaggcgtttcccactggazgctccctcgtgcgctctccignccgacactgccgcnaccggatacctgx cgccnxctcccrtcgggaagcgtggcgcmctcaugctcacgcigtagsuictcagncggtgtaggtcgttcgcíccaagctgggctgtgtgcacgaac cccccgncagcccgaccgctgc3cctxatccggtaactattgtcngagtccaacccgguagicacgacnatcgccactggcagcagccactggtaaca gganagcagagegaggtitguggcggigcttcagagncr.gxzgiggiggccuacacggctacaciagiaggacagtaínggtatctgcgctctgct gaagccagruccncggaaaiigagnggtagctcngacccggciaacaaaccaccgctggtagcggtggtmngntgcaagcagcaganacgcgc agaaaaaaaggaíctcaag3aga:ccíTtgatcm:ctacggggKrgacgcicagtggaacgaaaactcacgttaagggatmggicatgaganatcaaa aaggatcncac=ugatccftrtaaartaaiaatgaagtnuaatcaatctaaagiaiatatgagtaaacrtggtctgaúigtaccaatgct!aatc3gigaggc acctatctcagcgatcígtctatncgncatccaiagttgcctgac:ccccgtcgtgTagataacaegaacgggagggcnaccaictggccccagtgctgc aatgaaccgcgagacccacgctcaecgg«ccagaraatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaacnatcc gccíceatccagtctatuangngccgggaagcíagagtaagtagncgccagTUaUgttígcgcaacgttgcígccartgcíacaggcatcgtggtgtca cgctcgtcgraggtatggcncartcagctccggttcccaacgitciaggcgagflacatgatcceccalgttgtgcaaaaaagcggttagcxcscggrcct ccgatcgngtcagaaglaagnggccgcagxgttatcactcatggrtatggcagcactgcataartctcractgtcatgccaiccgtaagatgcrrrcrgtgac tggtgagtactcaaccaagtcancigagaat2g:gtaigcggcgaccgagngcícngcccggcgTcaaucgggataacaccgcgc«catagcagaac tnaiaagtgctcatcanggaaaacgncncggggcgaaaactct(;aaggaicnaccgctgrtg3gaiccagTXcgaTgaacccacicgtgcacccaacig atcttcagcatctmactncaccagcgmctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaaigngaac acicattetcttcctítrtcaatattangaagcaíttaicagggnattgtctcatgagcggatacatamgaatgtamagaaaaitaaaeaaataggggKcegc
SCacamceccgiaaaglgccaccigaacgaagcaíctgtgcUcatmgttgaacaaaaaxgcaacgcgagagcgcuatrTXcaaacaiagaaíctga gcTgcamTUcagaacagaaatgcaacgcgaaagcgcttttnaesaacgaagaaEetgtgcncaitmgmiacaaaaatgcaacgcgagagcgctaa tniícaaacaaagaatcigagcígcarTmacagaacagaaaxgcaacgcgagagcgctarmaccaacaaagaatctaiacítcmTngrtúiacaaaaatg catcccgagagcgcianrncaacaaagcaTCKagaKacrnsacxcctngtgcgctctotaatgcagtctcagauacitmgcacxgtaggtccgnaag gaagaagaaggctacntggtgtctinncxeneeataaaaaaagccrgactccacncecgcgtttictgatucÍagcgaagcxgcgggtgcittnttcaag aaaaggcaiccccgattata«cutaccga:gTggangcgcattcmgtgaacagaaagtgaiagcgngatga«cneanggtcagaaaaBatgaacg gmcrtctarntgtcrcíacaiaciacgtataggaaatgrnacarmcgutígnnegattcacrctatgaatagrtcrtactaczatnnngtctaaagagtaauc
Tagagataaacataaaaaatgiagaggicgagniagatgcaagncaaggagegaaaggtggatgggtaggtuíitagggaraiagcacagagatatata gcaaagagatocmigagcwtgmgtgg3agcggtattcgcaa:acaagagc:cgnacagtccggtgcgtrngginragaaagtgcgtcnc2gagc gctntggnttcaaaagcgctctgzagnccaucrttcagagiauggaa«tcggaauggaacneaaagcgKTccgaiaacgagcgcnccgaaaar gcaacgcgagcigcgcacatacagctcaetgncacgtcgcacciautctgcgtgngcstgatatatatatacatgagaagaacggcaugrgcgtgtttat gcnaaaigcgtacnatatgcgKunmguggatgaaaggsgtctagtaccTcctgtgatanatcccanccatgcggggtaicgiaigcttcctícagca cMeccnag«gncaatgctgccactcctcaaKgganigtc^aiccncaatgctatcatttccnigaUKggateaiaBaagaaaccana£tatcatga canaacctataaaaataggcgtaxacgaggcccnTcgtcxgcgcgtncggtgatgacggigaaaacctcigacacatgcagcxccggagacggica cagcngtctgtaagcggargccgggagcagacaagcccgícagggcgcgxcagcgggtgnggcgggtgicggggcxggcttaacutgcggcatcag agcagattgtoctgagagtgcaccatagatciacgacanacaaaataaataggaagcaRxaaagacagcalcgaataatgtgncntgcagSatg acgccagatggcagugtggaagauncTOngaaaaatagcngtcaccttacgtacaatcítgitccggagcTmcmratgccgaiuagaattaancg gtcgaaaaaagaaaaggagagggccaagagggagggcanggtgactattgagcacgtgagtaacgtgaiíaagcacacaaaggcagcttggagurg ictgttatuatttcacaggtagnctggtccanggtgaaagmgcggcttgcagagcaca gag gcc gca gaatgrgc:«ag attc cgatgcrgacngctg ggtanataígtgtgcccaaugaaagagaacaangacccggnangcaaggaaaamcaagicngtaaaagcauiaaaaatagncaggcacíccgaa aacstggttggcgtgracgttaiciaccttaggaggatgirrtggctctggtcaaxgattacggcaKgatotcgtecaacxgcatggagaigigtcgtggca agaataccaagagttec:cggn:gccagRaRaaaagactcgtaRtccaaaagactgcaacaacacieag:gc2gcRcaeagaaacc!caRcgrnati cccngnigancagaagcagg[gggacaggtgaacnngganggaactcgamctgacTgggnggaaggcaagagagccccgaaagcnacatmaE gnagciggiggactgacgccagaaaatgnzgtgatgcscrjgaRaaarggcgranggTgngatgtaagcggaggrgtggagacaaatggtgtaaaa gactcaacaaaatagcaaarncgtcaaaaatgcaagaaaaggMnactgagagutnainaagtaRgntgtgcactxgccgatcUlgcggtgtgaa aíaccgcacagatgcgtaaggagaaaaíaccgcatcaggaaangtaaacgnaaiatmgtuaaancgcgRaaatTTngnaaatcagctcacrmtaacc aa:aggccgaaatcggcaaaaxcc:naíaaatcaaaagaaugaccgagaiagggngagtgngnccagraggaacaagagtccactatiaaag3acgt ggactccaacgteiaagggcgiaaaacGg:ctatcagggcga:ggcccactacgtgaaccatcaccctaaicaagrtRRggggicgagg(gcQg:aaag cactaaatcggaactxtiaagggagcccccgamagagcttgacggggaaagccggcgaacgiggcgagaaaggaagggaagiaagcgaaaggag cgggcgctagggcgctggcaagxgugcggteacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcRaatgcgccgctacagggegcgtcgcgccaRCg ccancaggcigcgcaactgttggzaaeggcgatcggtgcgggcctcncgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcganaagtx
- 29 CZ 303494 B6 gggtaacgccagggmtcccagteacgacgngtaaaacgacggccagtegtccaagcmcgcgagctcgagatecegagctttgcaaanaaagcctte gagcgtcccaaaaccnctcaagcaaggnncagtataatgttacaigcgucacgcgtctgtacagaaaaaaaagaaaaatngaaatauaataacgncn aaÍactaacaiaactataaaaaaauaatagggacctagacncaggngtctaactccrtccttrteggrtagagcggaigTggggggagggcgigaatgtaa gcgigacataactaanacatgataicctrngngmccgggtgtacaatatggacttcctctrnctggcaaccaaacccaiacatcgggancctataataccrt cgnggtctcccuacatguggtggcggaggggagatatacaatagaacagataccagacaagacataatgggcuaacaagacxacaccaattacactg cctcangatggtggtacataacgaactaauctgtagcccugacttgaugccatcaicatatcgaagmcactacccmtrccatttgccatctangaagta ilgCAÁC u CHTÍC uumučmi^tctutč^íJLCgiíyugLúíč^CCiíaECCgCiďtgdC^iajiaaaaĚgaíggaiijj 4G4t-l444^244A aaattaacgacaaagacagcaccaacagatgtcgttgttecagagctgatgagggguicncgaacacacgaaacnmccnccttcancacgcacacta ctctciaatgagcaacggtatacggccttccrtccagttacttgaatttgaaataaaaaaagtngccgcmgctttcaagutaaatagaccigcaatta.ttaatc tttTgtrtcctcgtcangnctcgnccctncttcctígtttcrtttíctgcacaatatrtcaagctataccaagcatacaatcaactccaagcrtgaagcaagcctcct gaaagatgaagcxactgtcttctategaacaagcatgcgatatrtgccgactiaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagrgcgccaagtgictga agaacaactgggagtgtcgctactcrcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaaea gctatitctactgamticctcgagaagaccrtgacatgattttgaaaatggattcrttacaggautaaaagcattgtiaacaggartarngtacaagataatgtg aataaagatgccgtcacagatagartggcncagtggagactgatatgcctctaacartgagacagcatagaataaglgcgacatcaicatcggaagagagt agtaacaaaggtcaaagacagneactgtatcgccggaancnaatacgactcacucagggcatatggccatggaggccccggg
- 30 CZ 303494 B6
SEKVENCE ID. Č. 9 pGAD424-without-FULL'ICE*BOTH-T7 gatccgtcgacagatcíccciaugígagtcgtattactgcagagatctaigaatcgtagatacigaaaaaccccgcaagtícacttcaactgtgcatcgtgca ccatctcaamcmcarnaíacaicgtmgccncttttatgtaactatactcctciaagmcaatcrtggccatgtaacctctgaictaugaatntttaaatgacu gaattaatgcccaícnrmnggaccíaaancncatgaaaatatattacgagggcnattcagaagctttggacttcrtcgccagaggmggtcaagtctccaa tcaaggttgtcggcttgtctaccttgccagaaatnacgaaaagatggaaaagggtcaaatcgttggtagatacgngttgacacrtctaaataagcgaatttctt atgarrtatgatrmattanaaaiaagrtataaaaaaaataagtgtatacaaaímaaagtgactctuggtmaaaacgaaaancngttcngagtaactcrrtcc tgtaggtcaggttgcmctcaggtatagcatgaggtcgctcttaitgaccacacctctaccggcatgcccgaaattcccctacccatgaacaUrtccatmgt aamcgtgtcgmctattatgaatttcatnaUaagtttatgtacaaaiatcaUaaaaaagagaatcntnaagcaaggatrttcrtaacticítcggcgacagca tcaccgacncggtgguctgnggaaccacctaaatcaccagttctgatacctgcatccaaaaccttttuactgcatcttcaatggícttaccncncaggcaa gttcaatgacaatttcaacarcangcagcagacaagatagtggcg3iagggtca3cctlancmggcaaatctggagcagaaccgtggcatggncgtaca aaccaaatgcggtgncttgicrggeaaagaggccaaggacgcagatggcaacaaacccaaggaacctgggataacggaggcttcatcggagatgatatc accaaacatgttgctggtganataataccamaggtgggttgggncnaactaggatcatggcggcagaaicaatcaangatgttgaaccttcaatgtagga aattcgncttgatggtttcctccacagttmctccataatcttgaagaggccaaaacatugctrtatccaaggaccaaauggcaatggtggclcatgttgtag ggccatgaaagcggccancngtgaKcmgcacttctggaacggtgtattgncaciatcccaagcgacaccatcaccatcgtcRcctncícnaccaaagt aaatacctcccacttanctctgacaacaacgaagtcagtaccmagcaaattgtggcttgartggagataagtctaaaagagagtcggatgcaaagttacat ggtctuagttggcgtacaangaagncniacggatnttagtaa2ccttgttcaggtciaacactacctguccccatnaggaccacccaeagcaccuacaa aacggcatcaaccttcttggaggcttccagcgcctcatctggaagtgggacacctgtagcatcgaíagcagcaccaccaanaaatgamtcgaaatcgaac ttgacattggaacgaacatcagaaaugcmaagaaccnaatggcttcggc:gtgamcrtgaccaacgtggtcacctggcaaaacgacgatcncrtaggg gcagacattagaatggtataiccttgaaatautatataíatígctgaaatgíaaaaggtaagaaaagttagaaagtaagacgartgctaaccacctartggaaa aaacaauggtcctiaaataaiattgtcaacncaagtangígatgcaagcarttagica[gaacgcttctctanctatatgaaaagccggnccggcctctcac cmccmnctcccaattmcagtrgaaaaaggtatatgcgtcaggcgacctctgaaattaacaaaaaamccagtcatcgaatnganctgtgcgatagcgc ccctgtgtgttctcgrtatgttgaggaaaaaaaraatggttgctaagagaitcgaactcrtgcatcrtacgatacctgagtartcccacagrtggggatctcgactc tagctagaggatcaancgtaatcalggtcaagctgtttcctgtgtgaaangnatcqgctcacaaRccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaa agcctggggtgcctaatgagTgaggiaacicacattaattgcgngcgcxactgcccgcmccagtcgggaaacctgtcgtgccagctggatttatgaatc ggccaacgcgcggggagaggcggmgcgtatTgggcgctcnccgcttcctcgcícactgactcgctgcgctcggtcgncggctgcggcgagcggtatc agcicacícaaaggeggtaatacggtiatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacaígtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgta aaaaggccgcgttgctggegmrtccauggccccgccccccígacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggiggcgaaacccgacaggact ataaagataccaggcgtnccccctggaagctccctcgtgcgcíctcctgrtecgaccctgccgcKaccggaraccigtccgccmcteecRcgggaagcg tggcgcmctcaíagctcacgctgtagguictcagttcggtguggtcgttcgciccaagctgggcígtgtgcacgaaccccccgncagcccgaccgcrg cgcctttíccggiaactaícgtcttgagJccaacccggtaagacaegacKatcgccactggcagcagccacíggtaacaggattagcagagcgaggtatgt aggcggtgctacagagncRgaagtggiggcctaactacggciacacíagaaggacagíatttggtatctgcgcíctgctgaagccagraccRcggaaaa agagnggiagctcngaíccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtmtttgtngcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaa gatccRtgatcmtctacggggtctgacgcicagtggascgaaaactcacgttaagggarrttggtcatgagatiaicaaaaaggatcrícacctagarccmt aaaRaaaaatgaagnTta3aicaatctaaagtatatatgagtaaacTtggtc:gacagttaccaatgenaatcagtgaggcaccUtcicagcgatclglcian tcgncatccatagttgcctgactccccgicgigTagatoactacgatacgggagggcnaccatctggccccagtgcigcaatgauccgcgagacccacg ctcaccggctccagarrtatcagcaaíaaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaacrttatccgcctccatccagtctattaangt tSccSSgsagcugagtaagiagncgccagnaatagtngcgcaacgttgttgccangctacaggcatcgtggtgtcacgcTcgtcgmggtaiggcnca rtcagctecggttcccaacgaicaaggcg2gttacatgaícccccatgttgtgcaaaaaagcggrtagctccncggtcctccgatcgttgtcagaagtaagtt ggccgcagtgRatcactcatggnatggcagcactgcataattctcnactgtcatgccatccgtaagatgctrnctgtgactggtgagteCTeaaccaagtcat tctgagaatagtgtatgcggcgaccgagngctcngcccggcgtcaaracgggataataccgcgccacatagcagaactrmaagtgctcatcattggaaa acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagucgatgtaacccaetegtgcacccaactgitcttcagcatcttttactncacc agcgtnctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcnccrtmcaatatt angaagcarnaicagggnattgictcatgagcggatacatarrrgaargtatnagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacaKtccccgaaaagtgcc acctgacgtctaagaaaccananaicatzacanaacctataaaaataggcgtatcacgaggcícmcgtctcgcgcgíRcggtgatgacggtgaaaacc:
cígacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtclgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggt gtcgggSCtESCttaaciaigcggcaicagagcagattgtacígagagtgcaccataacgcacttaagcataaacacgcacíaígccgttcttclcatgtatat atatatacaggcaacacgcagatataggtgesacgtgaacagtgagctgtacgtgcgeagctcgcgngcanttcggaagcgctcgnrtcggaaacgcm gaagttcctanccgaagnccunctctaactagaaagtataggaacncagagcgctTttgaaaaccaaaagcgctctgaagacgcacrncaaaaaacci aaaacgcaccggactguacgagctac:aaaauttgcgaataccgcRccacaaacangctcaaaagutctctttgcautatctctgtgctatatcc«ata taacctacccatccacctncgctccngaacRgcatctaaactcgacctctacattartatgrtt3tctctagtaKactcRíagaca2aaaaartgtagtaagaac iaftcaagagigaatcgaaaacaaracgaaaatgtaaacatncctatacgtagtataiagagacaaaatagaagaaaccgttcaaattnctgaccaatgaa gaatcatcaacgcQtcacmc:gncacaaagtttgcgcaatccacatcggtatagaataiaatcggggatgccmatcRgaaaaaatgcacccgcagcR cgctagtaatcagtaaacgceggaagtggagtcaggctííírrtatggaagagaaaacagacaccaaagtagccttcúcuaccnaacggacctacagtgc aaaaagtutcaagagactgcanat3gagcgcacaaaggagaaaaaaag^a;ctaagaigctttgttagaaaaaiagcgctcícgggatgcanKtgtaga acaaaaaagaag[atagancmgnggtaaaatagcgctcicgcgngcatttcígttctgiaaaaatgí:agctcagattcrtgmgaaa3art3gcgctctc3
- j cgngeamttgttttacaaaaatgaagcacagartcrtcgnggtaaaatagegctttcgcgngcarnctgnctgtaaaaatgcagctcagattctttgtttgaa aaartagcgctctcgcgttgcatrmgrtctacaaiatgaagcacagatgcncgrrgcngcatgciacttctrttcantttttctmctctctcccccgttgjtgtct c accata tccgcaatgacaaaaa aaatga tggaagacactaaagg aaa aaa ttaacgacaaagaczgcaccaacagatgtcgngttc ca gagctgatga ggggtatcrtcgaacacacgaaactmtccttccttcatteacgcacactictctctaatgagcaacggtatacggccttcctíccagttacttgaatttgaaataa aaaaagtttgccgctttgctatcaagtataaacagacctgciattattaatcttttgtttcctcgtcartgttctcgnccctttenccrtgtactrtrtctgcaciatatn caagctataccaagcat3caatcaactccaagctngcaaagatggataaagcggaattaattcccgagcctccaaaaaagaagagaaaggtcgaaitggg
Laccgccgccaattnaatcaaagtgggaatattgctgatagcicattgtccttcacntcactaacagiagcaacggttcgaaccrcataacaactcaaaciaa nctcaagcgctncacuccaattgcctcctctaacgrtcalgataacttcatgaataatgaaatcacggctagtaaaattgatgatggtaataattcaaaaccac tg[cacctggttggacggaccaaactgcgtataacgcgtnggaatcactacagggatgntaataccactacaatggatgatgtatataactatctattcgatga tgaagataccccaccaaacccaaaaaaagagatcgaattcttaatacgactcactatagggcccatggacgaagaatccagttcattcttatgtacctatgctg agaatcgtgccaataagaagccaatacttccttagatgatgcaataaatattaaaataaaacaaaacagaaggctg
- 32 CZ 303494 B6
SEKVENCE ID. Č. 10 pGN205:
ccggtggtaccgggcccccccicgaggzcgacggtaicgataagcntcgtcangaaaagaaggaUagaatggacgaígggaagaagctctcgrtt gttccaggagatcagaaaacagcuctgnccawctuaggagggagaagaatatcaattcagaattíctgctcgtaacaaggctggaactggaga tccttctgatccttctgatcgtgngngcgaagccaagaaaccttgctccaagaattcatcgtgaagztcmctgatacaactgtcaaggtcggagccac tctcaagttcattgttcatangatggtgagccagcaccagatgtaacatggtcattcaatggaaaaggaatcggagagagcaaggctcaaattgaaaa tgagccatacatctcgagatttgctngccaaaggcacrtcguagcaaagtggaaaatataccatcacTgcaaceaacattaaíggaactgacagtgtc actatcaatatcaagguaaaagcaagccaacgaaaccaaagggaccaatcgaggtaactgatgicticgaagatcgtgCiactcttgactggaaac caccagaggatgacggaggagagccaartgagnctatgaaattgaaaagatgaacaccaaggacggaatctgggttccatgtggacgtagtggag atacccacttcacagtcgancacicaacaagggagatcattacaagRccgtgtcaaggctgtcaacagcgaaggaccttctgatccattggaaactg aaaccgautmggctaaaaaiccatttga:cgtccagaragaccaggtcgtccagagccaacigattgggattctgatcatgttgatctcaagtgggat ccactagttccagaagcgctgctaagggggcccicgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaaga agaaaaagagtcatctgaacaggrngattncmctggTcaaaaagatgaaanangatTttcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagíct gcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcgggaagtgagccaagaggtatgtrttícaaaaatcaataacigatcataatnnattgmggtgaant aagaaaataatattcgaaaancctc:tgaarcateaagaftgcagtaaaatttcgagaaaaatTgagatancatagagctanguaattncnga.mcag actgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaaagaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttc accagctccaaaaaggtccaaggagaccaggtttgtcaaaagCTícctgcgattaattctcattrcaarrmcagagaatcagagtctcctgaaaaatcc ccggtícgncaagatcícccagaaggtcra:agcacgnccccgtúacgatc:cctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagca2íccg aagagccagcaccgctaccagagaaaaagaagaaagagccgctggaiattctacgaacaagaaccggaggagcatatattccacccgccaaacxt cgacttaigcaacaacaganagigaiaagcaaagtgaacagtatcagagaatgaattgggaaagaatgaagaaaaagattcacgganggttaacag agtcaacgcgaagaatcttgncaaattgtcagagaacrtcttcaagagaatgtgancgncaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaac taafrtaaíttttcaggggacncicrgccgtgacanancaagcrcaggctttctcaccaggattcíctaacgtctargcagctnggcggcagttarcaac tcgaaanccctcatgtcggtgaacncnctccgtcgtctgangracagttcaaaagaagmccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgigai caaattcatcgcacatngartaaicaacaagttgctcacgaagrícngcgctggaaatcaiganctgatgcttgaagaaccaactgatgaKcagnga agxcgccattgcgrtcctgaaagagtgtggagczaagcnctggagattgctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaattcxcatg gaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcgaegtatxcagutatgattgagactgcaatgcagartcgaaaggacaaatrtgcggtaaggtagaa tatataaatagatattagaaaaaaataaaeugaataatítaazncctactagccaatcaggcgaccntngcgcatagTtctartattgaazaamggag aatactcatattctcgcicggaaaiciggaancgacgagaícnrtggcrtctgtgcagctgcatcgcmgtgctcccmctcgctigtcrtctgtguca ccaagaacctigngagncatcaactgaatctgtgaetggcttgngcteactegatgcactagacgactgattcTcgagaaatcagangagrtgcgaa agggtgaccagaaattgggaaizatacgaaccmgaaaaancaggaggatxaaaaaaanattctcgacaatcctacaaam3crtangcaccatgt igctccaacamncattaaaagTtaaígaaaaaatgtagaaaarcggaaattggcaattrtcagaccartmaagcatmcaaaaaaazangcagcíga aataaatgtcattncagataaatcgagcgatmctgngíctgacaciagtmtagttrtaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaacncatag aarttccatgtgtttmttcaattaaccaattaTccaaatcttccaaactcacamtgcggagcigggctaTcaagaatctgcígcagttnataagacgagC atctctgatatcactgaaaanaanrnaatcaaaacngaatatcaacíaaacccacttattaactttctcgatcttctgtegttcggtacgatgacggtgaa gaagccaangtagtagngamggncaagtccmcggtgrtgacgxcagtgtcctgcaatgctamagttataacttaggcctaagattcaamaaig aagtgacuaatngnctctgaacctcnaagaigatctmggaragaaacatauagacaggtnacctatcunaaaaaacagaícaaaaiagatacg accaaaícggataatccatgccíacctggcatcTaggaacgtgrtcrtagaagamcrucgtaaicgtatgaagaaaiaacaamgatcgnggccag caaaaatagggnttaagtgggaagtgttRtanagctaaccggaaaattnatagtKmntgcaagaaaccacígaaaaccccctaattgtatacatnt nggagcagcnctggtcttmgaecaataaaancgaiaaaacagaatruagtgaaattgncacamagrrtctatmaxcaaattttgttgctcaaaaa cartcgsagctgctcuaaaaaargeanaaaaaaggggmtcagrggnmcacactaaaaaagcttanrtaactzaaaaiccatcatarctccaacrrtg tcacaacaataaaatgctggicaaaatgTgncgaaaaaatgnrnnKnaattrtutaamaaaaaugrmctrccgctgggacacataearrrrtgggc gtaaatnxcagttcaaarnccarmtacaaccaíaaícatz2agciacgtctgatctc:ctcgcacnacc:gcgcctgarrcgaaagaacaaccgiagc caaaagaacaagaagaacaagcacgtagRgiggtagxggacgncatcacgcaaUctgaccaatggtcgiggggtctcacrňccgtacrzttgaga gaggggagactgaagatggcaartgaggacagtgtcttcgacgcacgcaígcatccataagcataaxcaggagggatggagagaaaaaURgrti ctaagcccctccctrtgtaatacaiacacatatctaataccgaagaatggcuattgaatggacgtcagctgttgctgtagttgccaaggcatcatcgatg aaataactgaaagaaagaatuaaiaartattgcaggcgtatccggcggtcattgaagacnggacttgangaggaggaggaícagatcatccaíaca ctuatrtggaggatgcggrtgatccggaaaargggcn3gxaagtgactgaccacacgcggggggcaRaantaaíaaattgaatTccattícagaigt gttcaaactagatccagaartcgaaaagaacgaggaggntaigaggagatccgtaaggaaatcanggaaacgccgatatrtcggatgaggatggig gcgacgagttggatgatgaagaagazggugtgatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattangataatactgatcagaatrgactgctt :cagaaggtattcafmgagtm2zzccggcaaatctgtaagtleccggttgccgaaaatrtgcigaamgccggaaaaaaaaartcc33aattutna aaaactmtgtaaaaaruaanaaarngcaacnttcagagaagtctacctgacaatgcaatcatcmggacraccaagaagctgctcacaaangctg aaaatgaaganccagacagcatgcazgícagcgatgngcaaagaaaaatmcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaanuaaaaaaaactcc gnttntcnnrtmatacgagaaaiaccaaaaaaaigíanrngccaaattcttaaatactatccccgaaattncaatattnctctttcagaacgaactcig cgcgatgctigtcgangngtgctcaacagcgtacctacgagcganccacggaatgctcatcgaacgmctgccgacrtcgcctcgaataccagcaa lactttgaaaagcTctgccaggacacgtanccacgaticaccgaangacatcacaaaactgcggaarttggcxcgccttattgctcamgctctcgacg g3tgctattgactggaagattrtggccgaiatgaaaatgaccgaag2ggacacaacttcttc:ggcagaatetatactaaatatatatrtaaígaacttgtg gaggcgatgggaarggtíaaacncancgagagKactgatccgtgagmcciagagagagttgrmcgtancaarmccctattncagaacrtiggct caRgcíttgnggartattcccacgazcraatccgaacagcgcacgatmcgatcaacncrtcacaatgattggattgggtggmgacgrtggaacítc gtgaatggctggcaaagggictcaagaagaagaagegaatgctggatcagttgaaggccgaatcaagctcagattcatcgtcgtcrtcggancgtca gactcgtctgartcRcggancTeacgancatccgactcgtcrtcagatxcctcatcncncagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaa
- J3' g«gaacagtgaagagagttccaaaaagaaggaaaaagagaauttggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaa gtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacgtegccaggittctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagitgaccgcaaggalcggagtaa agitcgtcgtcgtcaagactcggatgatgaggaícggaaaggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgac gtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccgtgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctg atgatgitcgtaa2actcgtcgggatagaagtgaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgngaatnt caaattrtaaataetgaaumgrrmTttcctartatttatttanctctngígnrtttncttgctrtcUaaaaattaancaatecaaatctaaacatgagcggtt trtrttcictttccgtrtrccísncgtanccgctcctctcatCigaacacaaígtgcasgrnatttatctícícgcítlcaTtícaKaggacgtggggggaarí ggtggaaggSggaaacacaciaaaggacgatggaaalgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaartcagaaatatggaggaaggtrtaa aagaazacataaaaatatatagaggaggaaggaaaactagtaaaaaatzagcaaagaaattaggcgaacgatgzgaaitgtcctcgcttggcaaatg cgaatccgtatggagaggcacgmggcgaaggcaaatgncggtarggagatctgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctcttttacaaaatrn ccgattttcgcttgzaattacggtgccaggtctcgacacgtcttccaatttttcaaattcaaaagagcctnaatgggctgtagttgctaaractcgtttnga aaatttttcttccgtttaategaaamgatgtanttatttatgartttcaataaatttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactaczgtaatcca atccnaaaggcgcacacctmaaatgtccgccccaatacgatatunnaagancgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccct atagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccngcagcacatccccc crtcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccrtcccaacagttgcgtagccrgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcg gcgcattaagcgcggcgggtgtggtggxtacgcgcagcgtgaccgctacacngccagcgcccugcgcccgctcctttcgcíncrtcccttccTOct cgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctzaatcgggggctccctnagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaecccaaaaaacrtgat kgSStgatggttcaegtagtgggccatcgccctgatagacggtnncgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcTtgttccaaact ggaacaacae tcaaec ctaíeteggtcta ttctrttgattta taa ggga ttttg cc ga trtcggcctartggrtaaaaaatgagc tg a maacaaaa attta a cgcgaattttaacaaaatattaacgntacaamcaggtggcactrrtcggggaaatgtgcgcggaacccct2tttgmarrtttcraaatacancaaatat gtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcctcaataatangaaaaaggaagagtatgagtancaacatttccgtgtcgcccruttccctrntTg cggcattttgccttcctgtmtgctcacccagzaacgctggtgiaagtaaaagatgctgaagatcagngggtgcacgagtgggnacatcgaacígga tctcaacagcggíaagatccngagagtmcgccccgzagaacgnnccaacgatgagcactntaaagttctgctatgtggcgcggtattaicccgtart gacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattetcagaatgacnggttgagtactcaccagtcac3gaaazgcatcttaeggatggcat gacagtaagagaattatgcagtgctgccataagcatgagtgaiaacactgcggccaacttacnctgacaacgatcggaggaccgaaggagciaacc gcmtntcacaacatgggggaicatgtazcícgccttgatcgttgggaaceggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgťgaczccacgat gcctgtagcaatggcaacaacgttgc3caaactattaactggcgaact2crtactctagcncccggcaacaattaatagactggatggaggcggata aagttgcaggaccacnctgcgctcggcccttccggctggctggtnattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtcícgcggtatcartgcag cactggggccagarggíaagcccicccgtatcgtagnatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcsctgagat aggtgcctcactganaagcanggtaacígtcagaccaagrnactcatatatactúUgangaRtaaaacttcarmiaatnaaaaggatctaggtgaa gatccrnngataatctcatgaccazaatcccttaacgtgagtmcgttccacrgagcgtcagaccccgtagaaaagaíeaaaggatcncttgagatcc tOTmctgcgcgtaatctgctgcngcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggmgmgccggatcaagagctaccaactcnrnccgaaggi aactggcttc2gcagagcgcagataccaaauctgtccnctagtgtagccgtagitaggccaccacrtcaagaactctgtagc3ccgcctacaucct cgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcnaccgggnggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagc ggtcgggctgaacggggggncgrgcacac3gcccagcttggagcgaacgacctacaccg2actgagatacctacagcgtgagcartgagaaag cgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggratccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggg aacgcctggtatctnatagtcctgtcgggnxcgccacctctgacttgagcgtcgatrtttgtgaigctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacg ccagcaacgcggcctttnacggncctggccttrígctggcctmgctcacatgttcntcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcct sgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgc ctctccccgcgcgnggccgancanaatgcagctggcacgacaggíttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaart3atgtgagRa cctcactcanaggcaccccaggctnacactttatgcttccggctcctatgrtgtgtggaangtgagcggataacaantcacacaggaaacagctatg accatganacgccaagctcggaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagt ggacetrtgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaa:tgagcrmtgggtcgaaaaaaatgnmagaatgctgagaacacgttaaacacgaag atcatatttattítgagacccggatgctcigaaaatgtctgacatagarttaaaaaagcatatatatamncatracaacgtgaaagttttgtgcaactrtaía gaatcícctattggcacattgtmnarnaactgaggcagtTmgaacacctTmgzaactrtgaatctcrngaagtatactgtcg2aaagactgacttga gcgttcgaaatgccagaagaaaactataragaatctcgcgcíaaattgagaaatgcaaccgcgcíccaciggacaatiggaaaaaaa3tttancgga ggcgacaacggTatmcgaaaRgatTRCígtgtarmctcatttmataaattcttctítgattTatcgrtcgrrtgtgagaaatttaartgtaRcaaacttírtt atagtaagata
-34CZ 303494 B6
SEKVENCE ID. č. 11 pGN2O7;
ccggtggtaccgctagccgtacgaacccgggttctagaacugtggatcccacttgagatcaacatgatcagaatcccaatcagttggctctggacga cctggtcutciggacgatcaaatggarnnagccaaaatatcggtncagmccaatggatcagaaggtccttcgctgrtgacagccttgacicggaa crtgtaatgatctcccngttgagEgaatcgacrgtgaagtgggtatctceactacgtccacatggaacccagatfccgtccrtggtgttcatcíHtcaam catagaactcaattggctcicctccgtcatcctctggtggntccagtcaagagngcacgaicncgaagacaicagnacctcganggtcccitiggnt cgttggcttgcrttttaccngaaRgatagigacactgtcagnccartaatgnggTtgcagígatggtatatmccactngcttacgaagígccmggca aagcaaatctcgagatgtatggctcanttcaatttgagccngctctctccganccmtccangaatgiccatgttacatctggtgctggcteaccatca atatgaacaatgaacngagagTggciccgaccttgacagttgUtcagaaagatcncacgatgaattcrtggagcaaggrncttggcttcgcaacaac acgatcagaaggatcagaaggatcTccagncC3gccngRacgagcagaaanctgaattgatancnctccctccnaagatttggaacagttgctgt trtctgatcKctggaacaacgagagcttcttcccatcgtccattcttatccttctrttcaatgacgaaagctratcgataccgtcgacctcgagggggggc ectcgtcgagtcggtcacaaicacctgaaactccaaaggcagceagtgaggaacglgaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggmgatmct ttctggtcaaaaagatgaaattangatrncagccagauctcccaaaactagcagcgagaagKtgcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcg ggaagtgagccaagaggtaígrnncaaaaaicaataacfgatcataaímiattgtnggtgaatTUagaaaataataRcgaaaattcctctgaattatc aagattgcagtatuantcgagaaaaangagatattcatagagcungtaaattncttgatncagactgaaacrtcggaaaaícaagagaiaatcaaa gaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacncaccagetccaaaaaggtccaaggagaccaggt tígtcaaaagcttcctgcgaraanctcamcaarnncagagaalcagagtctcctgiaaaatccccggRcgttcaagatctcccagaaggtcttcag cacgjtccccgtcacgatctccíagacggcgccgagaaagaagetcagaaagaaageaarccgaagagccagcaccgctaccagagaaaaagaa gaaagagccgctggatattctacgaacaagaaccggaggagcatatanccacccgccaaacncgacttatgcaacaacagatugígaUagcaa agtgaacagtatcagagaatgaangggaaagaatgaagaaaaagartcacggaRggttaacagagtcaacgcgaagaatcngttcaaattgtcag agaacttcKcaagagaatgtgattcgttcaaagtgagtgagaaaategaaggaaaaggaaagaanaantaatrmcaggggacttctctgccgtgac aitancaagctcaggctnctcaccaggattctctaacgtctatgcagctttggcggcagtíaícaactcgaaattcccicatgtcggigaacRcttctcc gtcgictgattgtacagncaaaagaagmccgiagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgaicaaancatcgcacarngattaatcaacaagrt gcicacgaagncttgcgctggaaatcatgattctgaigcngaagaaccaactgatgattcagítgaagtcgccattgcgncctgaaagagtgtggag caaagcnctggagattgctccagcagcTcnaacagtgtctacgaccgtcncg:gcaaRctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcg acgtHttcagtautgangagactgcaatgcagancgaaaggacaaatngcggtaaggtagaalatataaatagEnattagaaaaaaataaattaga ataaraaaancciactagccaaícaggcgacctnngcgcaugnctanartgaaaaamggagaatncicataitctcgctcggaaatciggaanc gacgagaicttctggcttctgtgcagctgcatcgctrtgtgcicccractcgcttgicRctgtgtacaccaagaacctigngagrtcatcaactgaa;ctgt gacrggcttgngctcactggatgcactagacgactganctcgagaaatcagarígagttgcgartagggtgacctagaaangggaataaticgaact mgiaaatattcaggaggattaaaaaaattanctcgacaatcctacaaantacttangcaccatgngetccaacarancanaaaagíteaígaaaaa atgugsaaarcggaaanggcaatmcagaccantnaagcatmcaaaaaaaaangcagctgaaaraaatgtcairacagataaaicgagcgarm ctgttgtctgacactagtrtRagmnaaaaatgnggaagaacatggtgcaauggtaaincatagaantccaTgtgnnmtcaattaaccaattatcc aaatcttecaaactcacatmgcggagctgggciatcaagaatctgcigcagtmataagacgagcaictctgatatcacigaaaatiaatRnaatcaa a3cttgaatatcaaciaaacccacttan3acmctcgatcttctgtcgrtcggtacgatgacggtgaagaagccaarígtagtagngamggrtcaag:c crttcggtgttgiacgteagtgtcctgčaatgctaíttagttataacttaggcctaagztícaamaatgasgtganaaamgitctctgaacctcnaagat gatcitTtgganagaaacatataagacaggmaccxaictattaaaaaacagatcaaaaíagaiacgaccaaatcggataiEccatgcctacctggcat ctaggaacgtgtxcnagaagatňctxacgtaatcgtatgaagaaataacaatitgatcgnggccagcaaaaatagggraaagtgggaugtgntttat tagctaaccggaaaatmatagttttnKigeiagaaaccactgaaaaccccctaattgutacarntRggagcagcttttggtctttRgagcaataaaat icgataaaacagaanxaagtgtaaartgnc3catttagmcTaímatcaaatmgngcicaaaaacancgaagctgctctaaaaaaatgcartaaaaa aggggtnTcagrggiREcacanaaaaaagctaatmaacraaaaatccatcaiamccaacítigtcacaacaataaaargctggtcazaatgtgrtcg aaaaaatgrmnttmaatmtauamaaaaatagtmcmcgctgggacacatacatmtgggcgtaaarmcagttcaaantccarrmacaaccai latcataaagcttcgtctgatctctctcgcacrtacctgcgcctgattcgaaagaacaaccgTagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagttgt ggtagtggacgttcatcacgcaattctgaccaatggtcgtggggtctcactnccgtactangagagaggggagactgaagatggcaaagigg3ca gtgtcttcgacgcacgcatgčatccataagcauatccaggagggatggagagaaaaaícngmcuagcccctcccmgtaatacaUcacataEct aataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgttgctgtagngccaaggcatcatcgatgaaataactgaaagaaagaattaaataatuttgc aggcgtatccggcggtcangaagacnggactigattgaggaggaggatcagatcatceatacacnaantggaggaigcggttgatccggaaaatg ggcttagtaagtgacrgaccacacgcggggggcatUamaaíaaaRgaattccatncagatgtgtxcaaactagatccagaattcgaaxagaacga ggaggrnatgaggagatccgtaaggaaatcanggaaacgccgaumcggatgaggatggtggcgacgagtxggatgatgaagaagagggtagt g2tgtggaagaggctccgaagaagactacagaganangataatactgatcagaangactgcmcagaaggwncatmg3gnTtgggccggcaa atctgtaagttgccggngccgaaaaRtgctgaatttgccggaaaaaaaaattccggaamatnaaaaactrntgtaaaaattaiatxaaamgcaaen
Rcagagaagtctacctgacaatgcaatcatcmggactaccaagaagctgcicacaaangctgiaaargaaganccagacagcatgcaggícagc gatgttgcaaagaaaaarmcgaccaaaaaaaccaaccaatcat3aaatRaaaaaaaaactccgttiOTctmttmaiacgagaaaaaccaaaaaa atgcatnngccaaattctaaaatacta:ccccgaaattttcaatattttctctncagaacgaac:ctgcgcgatg«tgtcgaRgttgtgctcaacagcgta cctacgagcgattctacggaatgctcatcg2acgrttctgccgacttcscctcgaauccagcaaacmgaaaagcíctgccaggacacgttttccac gartcaccgaartgacatcacaaaacEgcggaamggctcgcctxartgctcaíttgctctcgacggatgcíattgactggaagamtggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacttcítctggcagaatctatattaaatatatamaalgaacngtggaggcgatgggaalggttaaacttcaxícgagag «actgatccgtgagtttcctagagagagrtgttttcgtancaatmccctaímcagaacmggcteangcntgngganaticccacgaactaatccg aacagcgcacgatntcgatcaacncncacaatganggartgggtggmgacgrtggaacncgigaaíggctggcaaagggtcuaagaagaaga agggaatgcíggatcagngaaggccgaatcaagctcagancatcgtcgtcttcggancgtcagacícgtctgattcncggattctgacgattcatcc gacicgtcncagancctcatcncncagaaEcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagttccaaaaagaag
- 35 CZ 303494 B6 gaaaaagagaatartggtcgacgggaicgtggagaeaagagagctgaacgtcatcgtgaicaaagtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacg tcgccaggatíctgacgiaaatcgrcggccagaacgaggagatgiccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagactcggargacgagg aicggaaaggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgalcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagztcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgicgtcatgactctgatgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgrcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgttgaatrrtcaaattttaaatactgaatatrtgttttitncctart amarttattctctttgtgtnmncngcmeUaaaaartaattcaatccaaatctaaacatgagcggnttttttctcEnccgtctcccaactcgtattccgct ccTcfciíCígzacacaaígígcaagrnaínaícttcícgcttícartuaíísggacgtggggggaaííggíggsagggggaiíCíCiciaisggďíg atggaaatgaaataaggacacic3autgcaacaacancaattcagaaatatggaggaaggttuaaagaaaacaaaaaatatatagaggaggaa ggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaaKgtcctcgcttggcaaatgcgaatccgtatggagaggcacgtttggcga aggcaaatgrtcggtttggigitctgtaaaaattmaagttgaaatttggtgtrgctcrrttacaaaattttcegattttcgcngaaattacggtgccaggtct cgacacgtcrtccaamncaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagrtgctaatnctcgttmgaaaarttttcttccgniaatcgaaarrtgatgtaCTt tartutgaKttcaataaatttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagtaatccaatccrtaaaggcgcacaccttttaaatgtccgc cccaatacgatatttrtnaagancgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgt rnacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaarcgccrtgcagcacatccccccncgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccttcccaacagngcgiagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggtucgc gcagcgtgiccgciacacrtgccagcgccctagcgcccgctcctttcgcRtcttcccrrcctiictcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctclA aatcgggggctccctttagggnccgamagtgcrrtacggcacctcgaccccaaaaaacngartagggigatggttcacgtagtgggccatcgccct gatagacggmttcgccctttgacgnggagtccacgrtcrnaatagTggactcngttccaaactggaacaacactcaaccciatctcggtcíaticrrn gatttataagggantTgccgaíRcggcctanggnaaaaaatgagctgatnaacaaaaatttaacgcgaarmaacaaaatattaacgttíacaamca ggtggcacixncggggaaaigrgegcggaacccctatngrttarrmctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgigacaataaccctgaUaatgc
RcaataatattgaaaaaggaagagtttgagtirtcaacantccgtgtcgcccrtancccnnngcggcarogccttcctgttKtgcJcacccagaaac gdggtgaaagíaaaagatgctgaagatcagngggtgcacgagtgggnacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccRgagagtrncgcc ccgaagaacgrmccaatgargagcactrLteaagttctgctatgtggcgcggtanatcccgungacgccgggcaagagcaacrcggtcgccgcat acacíattctcagaatgacnggngaguctcaccagtcacagaaaagcatcrtacggatggcatgacagtaagagaarcaígcagigctgccataag catgagtgaiaacactgcggccaacrucnctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctnnncacaacatgggggatcatgaactcg
Ccngatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgccigtagcaatggcaacaacgngcgcaaact attaactggcgaactacrtactcugcrtcccggcaacaattaatagactggatggaggcggaraaagRgcaggaccacitctgcgctcggcccrrcc ggctggcrggrnattgctgataaaictggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcangcagcactggggccagaíggtaagcccícccgtaícgt agnatc tacacgacgggcastcaggcaactatggargaacgaaatagacagatcgcígagaraggtgcctcactgartaagcanggtaactgtcag aecaagtttactcantattcrnagatxgamaaaactrcatmtaamaaaaggaicaggtgaagatcctttrtgataatctcatgaccaaaatcccttaa cgTgagmtcgrtccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggarcncngagatcctntmctgcgcguatcigctgcngcaaacaaaa aaaccaccgcuccagcggtggmgmgccggaícaagagcaccaacictnttccgaaggeaciggcttcagcagagcgcagaiaccaaatact gicettctagtgtagccgtagRaggccaccacttcaagaactctgTagcacegcctacatacctcgctcigctaatcergrraccagtggctgctgccag tggcgaíaagicgtgECRaccgggnggactcaagacgatagnaccggataaggcgcagcggicgggctgaacggggggttcgrgcacacagcc cagcrtggagcgaacgacctacaccgaactgagaíaccíacagcgtgagcarrgagaaagcgccacgcncccgaagggagaaaggcggacagg totccggtaagcggcagggteggaacaggagagcgcacgagggagcRccaggggggaacgccxggtatctnatagtcctgtcgggnKgccac ctctgactigagcgtcgamTtgigatacícgtcaggggggccgagccTaíggaaaaacgccagcaacgcggccmrttcggncctggccrmgct ggcctrngctcacatgncmccigcgnatcccctgattctgtggataaccgunaccgcctngagtgagcígataccgctcgccgcagccgaacga ccgagcgcagcgagtcagigagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctcrccccgcgcgRggccgancaríaatgcagctg gcacgacaggtRcccgacíggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaanaatgtgagraccTcactcanaggcaccccaggemacacmatgct tccggcicctatgngigiggi2ng!gagcggataacaamcacacaggaaacagciaEgaccatganacgccaagc:cggaattaaccc:cacíaa agggaacaaaagctgggggggaicctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagiggacctngacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatga aattgagctttngggtcgaaaaaaa(giTOiagiatg«gagaacacgttaaacacgaagaKatottttňrtgagacccggatgctctgaaaatgteig acatagatttaaaaaagcafataíatanRtcatrtreaacgrgaaagttngtgcaacmatagaatctccartggcacaKgttmtatnaactgaggcag tTmgaacacctttngaaacmgaaxtcrrcgaagtaucigicgaaaagactgacttgagcgttcgaaatgccagaagaaaactatarrtgaatctcgc gctaaittgagaaatgcaaecgegctccactggacaattggaaaaaaaatttatteggaggcgacaacggtattttcgaaattgatRtctgtgfantíct catTrxataaancítctngaftíaicgttcgmgígagaaattiaartgtancaaacRTmatagtaagaía

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Způsob omezení zamoření rostlin škůdcem, vyznačený tím, že obsahuje:
    (a) identifikaci sekvence DNA z uvedeného škůdce, která je kritická pro jeho přežití, růst a proliferaci, io (b) klonování uvedené sekvence ze stupně (a) nebo jejího fragmentu ve vhodném vektoru v takové orientaci vzhledem k promotoru nebo promotorům, že uvedený promotor nebo uvedené promotory iniciují transkripci uvedené DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedený promotor nebo uvedené promotory a
    15 (c) vnesení uvedeného vektoru do rostliny, přičemž škůdcem je škůdce, který se na rostlině živí.
  2. 2. Způsob podle nároku I, vyznačený tím, že uvedeným škůdcem je hlíst.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že uvedený hlíst zahrnuje libovolného hlís20 ta ze souboru zahrnujícího Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadínaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmanniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchus ssp.
  4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačený tím, že uvedená sekvence DNA leží mezi dvěma promotory tak, že navázání transkripčního faktoru na promotory má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA.
    30 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že sekvence DNA je v orientaci sense a antisense vzhledem k uvedenému promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promotor má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA.
    6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že uvedený promotor
    35 nebo promotory jsou tkáňově specifické promotory.
    7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že uvedené promotory jsou kořenově specifické promotory.
    40 8, Rostlina obsahující sekvenci DNA ze škůdce rostlin, která je kritická pro přežití, růst a proliferaci škůdce rostlin, přičemž sekvence DNA nebo její fragment je klonována ve vhodném vektoru v takové orientaci vzhledem k promotoru nebo promotorům, že uvedené promotory jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedený promotor nebo uvedené promotory, přičemž škůd45 cem je škůdce, který se živí na rostlině,
    9. Rostlina podle nároku 8, kde sekvence DNA leží mezi dvěma promotory tak, že navázání transkripčního faktoru na promotory má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA.
    50 10, Rostlina podle některého z nároků 8 nebo 9, kde sekvence DNA má orientaci sense a antisense vzhledem k uvedenému promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promotor má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA.
    11. Rostlina podle nároků 8, 9 nebo 10, kde uvedené promotory jsou tkáňově specifické proino55 tory.
    - 37 CZ 303494 B6
    12. Rostlina podle nároku 11, kde uvedenými promotory jsou kořenově specifické promotory.
    13. Použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škůdce rostlin, která je kritická pro jeho
  5. 5 přežití, růst nebo proliferaci, nebo její fragment klonovány v takové orientaci vzhledem k promotoru nebo promotorům, že uvedený promotor nebo uvedené promotory jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedený promotor nebo uvedené promotory, pro omezení napadení rostliny škůdcem, přičemž škůdcem je škůdce, který se na rostlině živí.
    14. Použití podle nároku 13, při kterém uvedená sekvence DNA leží mezi dvěma promotory tak, že navázání transkripčního faktoru na promotory má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA.
    15 15. Použití podle nároku 13 nebo 14, při kterém je uvedená sekvence DNA v orientaci sense a antisense vzhledem k uvedenému promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promotor má za následek transkripci DNA na dvouřetězcovou RNA.
    16. Použití podle nároků 13, 14 nebo 15, při kterém jsou uvedené promotory tkáňově specific20 kými promotory.
    17. Použití podle nároku 16, při kterém jsou promotory kořenově specifickými promotory.
CZ20010014A 1998-07-03 1999-07-02 Zpusob omezení zamorení rostlin škudcem, rostlina obsahující sekvenci DNA ze škudce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škudce CZ303494B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9814536.0A GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-07-03 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GBGB9827152.1A GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1998-12-09 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200114A3 CZ200114A3 (en) 2001-06-13
CZ303494B6 true CZ303494B6 (cs) 2012-10-24

Family

ID=26313977

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20010014A CZ303494B6 (cs) 1998-07-03 1999-07-02 Zpusob omezení zamorení rostlin škudcem, rostlina obsahující sekvenci DNA ze škudce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škudce
CZ2012-309A CZ304897B6 (cs) 1998-07-03 1999-07-02 Způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA a neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2012-309A CZ304897B6 (cs) 1998-07-03 1999-07-02 Způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA a neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky

Country Status (27)

Country Link
US (3) US20030061626A1 (cs)
EP (5) EP2045336A3 (cs)
JP (3) JP4353639B2 (cs)
KR (4) KR20040066200A (cs)
CN (3) CN1657620A (cs)
AT (2) ATE433500T1 (cs)
AU (1) AU769223B2 (cs)
BR (1) BR9911802A (cs)
CA (2) CA2332619C (cs)
CY (2) CY1108920T1 (cs)
CZ (2) CZ303494B6 (cs)
DE (5) DE1093526T1 (cs)
DK (2) DK1197567T4 (cs)
ES (2) ES2320527T5 (cs)
GB (4) GB9827152D0 (cs)
HU (1) HU230602B1 (cs)
IL (3) IL140467A0 (cs)
IN (2) IN2001DE00006A (cs)
IS (1) IS2816B (cs)
MX (1) MX234065B (cs)
NO (1) NO327729B1 (cs)
NZ (1) NZ509182A (cs)
PL (3) PL201425B1 (cs)
PT (2) PT1484415E (cs)
RU (1) RU2240349C2 (cs)
WO (1) WO2000001846A2 (cs)
ZA (1) ZA200007653B (cs)

Families Citing this family (256)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
DK1624060T3 (da) * 1998-03-20 2012-04-10 Commw Scient Ind Res Org Kontrol af genekspression
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
EP1147204A1 (en) * 1999-01-28 2001-10-24 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
BR0009884A (pt) * 1999-04-21 2002-01-08 American Home Prod Processos e composições para a inibição da função das sequências de polinucleotìdeos
US6924109B2 (en) * 1999-07-30 2005-08-02 Agy Therapeutics, Inc. High-throughput transcriptome and functional validation analysis
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1235842A4 (en) 1999-10-15 2003-04-23 Univ Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
GB9930691D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
WO2002094185A2 (en) 2001-05-18 2002-11-28 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
IL151781A0 (en) 2000-03-16 2003-04-10 Genetica Inc Methods and compositions for rna interference
EP2028278B1 (en) 2000-03-30 2014-03-19 Whitehead Institute For Biomedical Research RNA sequence-specific mediators of RNA interference
GB2362383B (en) * 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
GB0012233D0 (en) * 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Vector constructs
US7083947B2 (en) 2000-05-19 2006-08-01 Devgen Nv Assay techniques using nematode worms
GB0012229D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Lipid uptake assays
WO2001096584A2 (en) * 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
CZ302719B6 (cs) 2000-12-01 2011-09-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
CN100475974C (zh) * 2001-01-25 2009-04-08 VIRxSYS股份有限公司 用于鉴定基因功能的方法和组合物
JP4454934B2 (ja) 2001-01-26 2010-04-21 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 組換えクローニングを用いて効率のよいサイレンシング構築物を作製する方法および手段
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
EP1364066A2 (en) * 2001-02-02 2003-11-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for identifying functional nucleic acids
WO2003070972A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003102131A2 (en) * 2002-04-22 2003-12-11 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US7517864B2 (en) 2001-05-18 2009-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1412371B1 (en) 2001-07-12 2016-02-24 University of Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
WO2003018808A1 (fr) 2001-08-31 2003-03-06 Riken Systeme vegetal permettant une analyse approfondie de fonctions geniques a l'aide d'adnc pleine longueur
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US20030150017A1 (en) * 2001-11-07 2003-08-07 Mesa Jose Ramon Botella Method for facilitating pathogen resistance
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
DE60337040D1 (de) 2002-02-01 2011-06-16 Life Technologies Corp Oligonukleotid-Zusammensetzungen mit verbesserter Wirksamkeit
WO2003064621A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1472265A4 (en) * 2002-02-20 2005-06-15 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE MEDIA INHIBITION OF THE EXPRESSION OF THE POLYCOMB GROUP EZH2 PROTEIN GENE USING A SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc INTERFERENCE MEDIATION INHIBITION OF GENE RNA FROM MAP KINASE
AU2003211058A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
AU2003216255A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
AU2003213057A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Incoporated Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
WO2003095652A2 (de) * 2002-05-08 2003-11-20 Xantos Biomedicine Ag EXPRESSIONSKONSTRUKTE ZUR HERSTELLUNG VON DOPPELSTRANG (ds) RNA UND DEREN ANWENDUNG
AU2003239706A1 (en) * 2002-05-23 2003-12-12 Devgen Nv Method for determining the influence of a compound on cholesterol transport
CN1662652B (zh) * 2002-06-21 2011-05-25 北京诺赛基因组研究中心有限公司 随机化的dna文库和双链rna文库,其用途及生产方法
WO2004005485A2 (en) * 2002-07-10 2004-01-15 Kansas State University Research Foundation Compositions and methods for controlling parasitic nematodes
US7655790B2 (en) 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
SI2258847T1 (sl) 2002-08-05 2017-08-31 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
AU2003261449A1 (en) 2002-08-07 2004-02-25 Compositions for rna interference and methods of use thereof
CA2497892A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-18 Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided T Rinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Compositions and methods for tissue specific or inducible inhibition of gene expression
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2004050839A2 (en) 2002-11-27 2004-06-17 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
EP1597361A2 (en) * 2002-12-23 2005-11-23 Devgen NV Kinase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases and nucleotide sequences encoding such kinase sequences
EP1622572B1 (en) 2003-04-30 2017-12-20 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
IL155783A (en) 2003-05-05 2010-11-30 Technion Res & Dev Foundation Multicellular systems of multi-potential embryonic human stem cells and cancer cells and their use
JP4884224B2 (ja) 2003-05-09 2012-02-29 ディアデクサス インコーポレーテッド Ｏｖｒ１１０抗体組成物および使用方法
AU2005212433B2 (en) 2003-05-23 2010-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sINA)
WO2004113519A2 (en) * 2003-06-17 2004-12-29 Devgen Nv Alcohol dehydrogenase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases
US9394565B2 (en) 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
ATE526407T1 (de) * 2003-11-17 2011-10-15 Commw Scient Ind Res Org Insektenresistenz durch inhibierung von genexpression
CN1922332B (zh) 2003-12-31 2013-06-12 宾夕法尼亚州研究基金会 预测并克服对卵巢癌化疗的抗性的方法及预测结肠癌发生的方法
WO2005078848A2 (en) 2004-02-11 2005-08-25 University Of Tennessee Research Foundation Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase dnazymes
US7622301B2 (en) * 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
US9249456B2 (en) 2004-03-26 2016-02-02 Agena Bioscience, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
CN1964740A (zh) 2004-04-02 2007-05-16 加利福尼亚大学董事会 治疗和预防与αVβ5整联蛋白有关的疾病的方法和组合物
PL1818405T3 (pl) 2004-04-09 2015-11-30 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby do zwalczania inwazji szkodników u roślin
EP1747022A4 (en) 2004-04-23 2010-03-31 Univ Columbia INHIBITION OF HAIRLESS PROTEIN MRNA
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
ATE501252T1 (de) 2004-06-22 2011-03-15 Univ Illinois Verfahren zur inhibierung von tumorzellwachstum mit foxm1 sirns
US7968762B2 (en) 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
EP2484780A1 (en) 2004-07-23 2012-08-08 The University of North Carolina At Chapel Hill Methods and materials for determining pain sensibility and predicting and treating related disorders
EP1786905B1 (en) 2004-08-18 2011-08-03 Lorus Therapeutics Inc. Small interfering rna molecules against ribonucleotide reductase and uses thereof
WO2006036739A2 (en) * 2004-09-24 2006-04-06 J.R. Simplot Company Gene silencing
US20060247197A1 (en) 2004-10-04 2006-11-02 Van De Craen Marc Method for down-regulating gene expression in fungi
AU2005295796B2 (en) * 2004-10-13 2010-07-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Nematode resistant transgenic plants
US8148604B2 (en) 2004-10-21 2012-04-03 Venganza Inc. Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants
EP1807520B1 (en) 2004-10-25 2012-07-25 Devgen NV Rna constructs
US8772254B2 (en) 2004-10-25 2014-07-08 Devgen N.V. Method and constructs for delivering double stranded RNA to pest organisms
JP2008526883A (ja) 2005-01-07 2008-07-24 ディアデクサス インコーポレーテッド Ｏｖｒ１１０抗体組成物および使用方法
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
US7427605B2 (en) 2005-03-31 2008-09-23 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US7417072B2 (en) 2005-05-12 2008-08-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Blockade of Pin1 prevents cytokine production by activated immune cells
CA2610644A1 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Devgen Nv Rnai for control of insects and arachnids
WO2007011702A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of egfr inhibitors to prevent or treat obesity
EP2439278B1 (en) 2005-09-16 2016-11-09 Monsanto Technology LLC Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
CA2622671C (en) 2005-09-16 2020-12-22 Devgen Nv Methods for controlling pests using rnai
PT2275562E (pt) 2005-09-16 2016-01-26 Devgen Nv Métodos com base em plantas transgénicas para infestações em plantas utilizando arn de interferência¿
EP1931789B1 (en) 2005-09-20 2016-05-04 BASF Plant Science GmbH Methods for controlling gene expression using ta-siran
US9286469B2 (en) * 2005-12-16 2016-03-15 Cisco Technology, Inc. Methods and apparatus providing computer and network security utilizing probabilistic signature generation
WO2007087153A2 (en) * 2006-01-06 2007-08-02 University Of Georgia Research Foundation Cyst nematode resistant transgenic plants
US8906876B2 (en) 2006-01-12 2014-12-09 Devgen Nv Methods for controlling pests using RNAi
WO2007080126A2 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Devgen N.V. Dsrna as insect control agent
EP2374462A3 (en) 2006-01-12 2011-12-14 deVGen N.V. Methods for controlling pests using RNAi
US20080022423A1 (en) * 2006-02-03 2008-01-24 Monsanto Technology Llc IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI
EP2044109B1 (en) 2006-02-10 2014-05-21 Monsanto Technology, LLC Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
CN105385679B (zh) * 2006-02-13 2020-05-26 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
US20100068172A1 (en) * 2006-03-16 2010-03-18 Devgen N.V. Nematode Control
WO2007123777A2 (en) 2006-03-30 2007-11-01 Duke University Inhibition of hif-1 activation for anti-tumor and anti-inflammatory responses
PL216037B1 (pl) * 2006-06-09 2014-02-28 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu
CA2657319C (en) 2006-07-11 2016-06-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Mg53 compositions and methods of use
CA2658786A1 (en) 2006-07-28 2008-01-31 Children's Memorial Hospital Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells
EP2104513B1 (en) 2006-11-27 2015-05-20 diaDexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
CN101195821A (zh) * 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
WO2008094370A2 (en) 2006-12-22 2008-08-07 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
BRPI0806436A2 (pt) 2007-01-26 2011-09-06 Univ Lousville Res Foundation Inc modificação de componentes exossomais para uso como uma vacina
US20080184391A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Kuppuswamy Subramaniam Pathogen resistant transgenic plants, associated nucleic acids and techniques involving the same
AU2008218813B2 (en) 2007-02-20 2014-04-17 Monsanto Technology, Llc Invertebrate microRNAs
PL2129680T3 (pl) 2007-03-21 2015-10-30 Brookhaven Science Ass Llc Łączone kompozycje cząsteczek antysensownych o strukturze spinki do włosów oraz sposoby modulacji ekspresji
EP2152903A2 (en) 2007-04-26 2010-02-17 Ludwig Institute for Cancer Research, Ltd. Methods for diagnosing and treating astrocytomas
US20100291042A1 (en) 2007-05-03 2010-11-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
US20110111496A1 (en) * 2007-06-29 2011-05-12 Chiang Li BACTERIA-MEDIATED GENE MODULATION VIA microRNA MACHINERY
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2009012263A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
CN101932708A (zh) 2007-08-14 2010-12-29 联邦科学工业研究组织 改进的基因沉默方法
KR101142209B1 (ko) 2007-09-22 2012-05-04 재단법인서울대학교산학협력재단 섭취 ＲＮＡｉ를 이용한 꼬마선충에서 두 유전자의동시발현 억제방법
US7968525B1 (en) 2007-12-03 2011-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control
EP2283133A2 (en) 2008-04-04 2011-02-16 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of epas1 inhibitors
WO2009126896A2 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for root knot nematode control
GB0807018D0 (en) 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
EP2727996A1 (en) 2008-11-06 2014-05-07 The Johns-Hopkins University Treatment of chronic inflammatory respiratory disorders with NP1 inhibitors
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
EP2379722B1 (de) 2008-12-16 2016-09-07 c-LEcta GmbH Expressionsvektor
WO2010074783A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
EP2379076B1 (en) 2008-12-23 2014-11-12 The Trustees of Columbia University in the City of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
EP2408458A1 (en) 2009-03-19 2012-01-25 Merck Sharp&Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 6 (STAT6) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2010107952A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR (CTGF) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
JP2012520685A (ja) 2009-03-19 2012-09-10 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
US20120016010A1 (en) 2009-03-19 2012-01-19 Merck Sharp & Dohme Corp RNA Interference Mediated Inhibition of BTB and CNC Homology 1, Basic Leucine Zipper Transcription Factor 1 (BACH1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP2411019A2 (en) 2009-03-27 2012-02-01 Merck Sharp&Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 1 (STAT1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20120004282A1 (en) 2009-03-27 2012-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp, RNA Interference Mediated Inhibition of the Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US20120010272A1 (en) 2009-03-27 2012-01-12 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Apoptosis Signal-Regulating Kinase 1 (ASK1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
JP2012521762A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた神経成長因子β鎖（ＮＧＦβ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
JP2012521764A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
US20100257634A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Venganza Inc. Bioassay for gene silencing constructs
US8283332B2 (en) 2009-04-17 2012-10-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PFKFB4 inhibitors and methods of using the same
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
US20120107243A1 (en) 2009-07-14 2012-05-03 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated non-covalent delivery of active agents across the blood-brain barrier
EP2456460A4 (en) 2009-07-24 2013-02-20 Univ California METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING AND PREVENTING DISEASES ASSOCIATED WITH AVB5 INTEGRIN
MX2012002548A (es) 2009-08-28 2012-04-10 Du Pont Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos.
US9163240B2 (en) 2009-12-07 2015-10-20 The Johns Hopkins University SR-BI mutation as a predictor of low progesterone levels and poor fetal viability during pregnancy
EP3434773A3 (en) 2009-12-09 2019-04-17 Nitto Denko Corporation Modulation of hsp47 expression
WO2011072243A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
US10640457B2 (en) 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
AU2010332881B2 (en) 2009-12-18 2015-01-22 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat HSF1-related diseases
SG10201407996PA (en) 2009-12-23 2015-01-29 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
CA3101636A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 National Jewish Health Diagnosis and prognosis of idiopathic interstitial pneumonia by rs35705950 snp in muc5b gene promoter
IN2012DN06588A (cs) 2010-02-10 2015-10-23 Novartis Ag
CA2800065A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Peptimed, Inc. Reagents and methods for treating cancer
GB201009601D0 (en) 2010-06-08 2010-07-21 Devgen Private Ltd Method for down-grading gene expression in fungi
WO2011163466A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (nrg-1)
AU2011285909B2 (en) 2010-08-02 2016-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of catenin (cadherin-associated protein), beta 1 (CTNNB1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP4079856A1 (en) 2010-08-17 2022-10-26 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
KR20130137160A (ko) 2010-08-24 2013-12-16 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
CN108404115A (zh) 2010-10-15 2018-08-17 纽约市哥伦比亚大学理事会 肥胖症-相关的基因和它们的蛋白和其用途
EP3766975A1 (en) 2010-10-29 2021-01-20 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
CN103313730B (zh) 2010-11-01 2016-06-01 佩普蒂梅德股份有限公司 用于治疗癌症的肽靶向系统的组合物
HUE045869T2 (hu) 2010-11-02 2020-01-28 Univ Columbia Módszerek hajhullásos rendellenességek kezelésére
US9198911B2 (en) 2010-11-02 2015-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
WO2012078536A2 (en) 2010-12-06 2012-06-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
US9150926B2 (en) 2010-12-06 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483
CA2822621C (en) 2010-12-22 2020-12-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase modulators and uses thereof
CA2828002A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
BR112014005104A2 (pt) 2011-09-02 2017-07-04 Salk Inst For Biological Studi inibidores camkii, ip3r, calcineurin, p38 e mk2/3 para tratar atar distúrbios metabólicos de obesidade
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
TW201321414A (zh) 2011-10-14 2013-06-01 Genentech Inc 抗－ＨｔｒＡ１抗體及其使用方法
EP3960726A1 (en) 2011-10-18 2022-03-02 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Amine cationic lipids and uses thereof
BR112014010769B1 (pt) 2011-11-03 2021-08-03 Quark Pharmaceuticals, Inc Uso de um composto de rna de fita dupla para preparar um medicamento para tratar doença de ménière
JP6212107B2 (ja) 2012-03-29 2017-10-11 ザ トラスティース オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 脱毛障害を処置するための方法
BR112014025983A2 (pt) 2012-04-20 2018-07-03 Futuragene Israel Ltd molécula de ácido ribonucleico, dsrna, vetor, célula hospedeira, tecido vegetal, ácido nucleico e métodos de produção de plantas e de inibição de infestação de pragas
US20150082490A1 (en) 2012-04-23 2015-03-19 Futuragene Israel Ltd. Glycaspis Brimblecombei Control Agents
EP2844261B1 (en) 2012-05-02 2018-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
DK2877494T3 (da) 2012-07-23 2020-09-21 La Jolla Inst Allergy & Immunology PTPRS og proteoglycaner i autoimmun sygdom
US20150259701A1 (en) 2012-10-03 2015-09-17 Futuragene Israel Ltd. Gall wasp control agents
ES2776029T3 (es) 2012-10-08 2020-07-28 St Jude Childrens Res Hospital Terapias basadas en el control de la estabilidad y función de las células T reguladoras por medio de un eje neuropilina-1:semaforina
US9920316B2 (en) 2013-03-14 2018-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
AU2014236947A1 (en) 2013-03-15 2015-09-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
JP6896420B2 (ja) 2013-07-03 2021-06-30 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 抗癌組成物
WO2015054451A1 (en) 2013-10-09 2015-04-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Detection of hepatitis delta virus (hdv) for the diagnosis and treatment of sjögren's syndrome and lymphoma
EP3068407A1 (en) 2013-11-11 2016-09-21 Sirna Therapeutics, Inc. Systemic delivery of myostatin short interfering nucleic acids (sina) conjugated to a lipophilic moiety
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
EP3088001B1 (en) 2013-12-27 2020-02-12 National University Corporation Kochi University Anti-lipolysis stimulated liporotein receptor antibodies for treatment of ovarian cancer
ES2949172T3 (es) 2014-07-16 2023-09-26 Novartis Ag Método de encapsulamiento de un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas
WO2016059187A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Universite De Strasbourg Method of capturing and identifying novel rnas
WO2016077624A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
WO2016105517A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
US10584144B2 (en) 2015-03-09 2020-03-10 University Of Kentucky Research Foundation RNA nanoparticles for brain tumor treatment
CN107429251A (zh) 2015-03-09 2017-12-01 肯塔基大学研究基金会 用于治疗乳腺癌的miRNA
WO2016145003A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Rna nanoparticle for treatment of gastric cancer
US11279768B1 (en) 2015-04-03 2022-03-22 Precision Biologics, Inc. Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof
WO2016168784A2 (en) 2015-04-17 2016-10-20 University Of Kentucky Research Foundation Rna nanoparticles and method of use thereof
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
US10669528B2 (en) 2015-06-25 2020-06-02 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
US10072065B2 (en) 2015-08-24 2018-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of immunoglobulins across the blood-brain barrier
EP3702470A3 (en) 2015-09-09 2020-10-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
US11285142B2 (en) 2015-09-29 2022-03-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for identifying and treating dystonia disorders
CR20180296A (es) 2015-10-30 2018-08-10 Genentech Inc ANTICUERPOS ANTI-HtrA1 Y MÉTODOS DE USO
US10358647B2 (en) 2015-12-13 2019-07-23 Nitto Denko Corporation siRNA structures for high activity and reduced off target
US11072777B2 (en) 2016-03-04 2021-07-27 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and compositions for ex vivo expansion of very small embryonic-like stem cells (VSELs)
EP4049665B1 (en) 2016-03-15 2025-03-12 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
US10883108B2 (en) 2016-03-31 2021-01-05 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent
EP3516062A1 (en) 2016-09-21 2019-07-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Myostatin irna compositions and methods of use thereof
CN107858405B (zh) * 2017-10-12 2021-09-24 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法
US20210162007A1 (en) 2018-04-09 2021-06-03 President And Fellows Of Harvard College Modulating nuclear receptors and methods of using same
CN109183158B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法
CN109266677B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法
US20210393740A1 (en) 2018-09-19 2021-12-23 La Jolla Institute For Immunology Ptprs and proteoglycans in rheumatoid arthritis
US11708575B2 (en) 2018-11-16 2023-07-25 Nitto Denko Corporation RNA interference delivery formulation and methods for malignant tumors
EP3907504A4 (en) * 2019-01-04 2022-11-30 Kyoto University TEST METHOD FOR UC AND PRIMARY SCLEROSING CHOLANGITIS
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
CN110229839B (zh) * 2019-06-04 2021-06-08 中国农业大学 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法
CN110746497A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 维塔恩(广州)医药有限公司 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
CN110804088A (zh) * 2019-11-18 2020-02-18 维塔恩(广州)医药有限公司 巨细胞病毒相关抗原短肽及其应用
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
US20230279394A1 (en) 2019-12-18 2023-09-07 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP4076650B1 (en) 2019-12-18 2024-02-28 Novartis AG 3-(5-methoxy-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2021142191A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
US20210222128A1 (en) 2020-01-22 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Inducible tissue constructs and uses thereof
US11642407B2 (en) 2020-02-28 2023-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Identification of variable influenza residues and uses thereof
CN113638055B (zh) * 2020-05-22 2023-07-07 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种制备双链rna测序文库的方法
WO2022147480A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma, Inc. Oncolytic virus encoding sialidase and multispecific immune cell engager
US20250127809A1 (en) 2021-06-23 2025-04-24 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP4381069A1 (en) 2021-08-02 2024-06-12 Universite De Montpellier Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22
CN113533007B (zh) * 2021-08-06 2023-11-24 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 一种抗体染色标记装置及其方法
KR20240099259A (ko) 2021-10-14 2024-06-28 아스널 바이오사이언시스, 인크. 공동 발현된 shrna 및 논리 게이트 시스템을 갖는 면역 세포
PE20251319A1 (es) 2022-09-13 2025-05-16 Arsenal Biosciences Inc Celulas inmunitarias que coexpresan arnhc de tgfbr
EP4587570A2 (en) 2022-09-16 2025-07-23 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations
US12257304B2 (en) 2023-03-03 2025-03-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting PSMA and CA9

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015111A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 President And Fellows Of Harvard College A binary genetic system to control expression of a transgene in a transgenic animal
EP1093526A2 (en) * 1998-07-03 2001-04-25 Devgen N.V. Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589801A (en) * 1897-09-07 woltereck
DE3650756T2 (de) 1985-03-21 2001-10-04 Cornell Research Foundation, Inc. Vom parasit abgeleiteter widerstand
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5017488A (en) * 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
US4970168A (en) * 1989-01-27 1990-11-13 Monsanto Company Virus-resistant plants
WO1990014090A1 (en) * 1989-05-19 1990-11-29 Hem Research, Inc. SHORT THERAPEUTIC dsRNA OF DEFINED STRUCTURE
HUT57265A (en) 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5837848A (en) * 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
US5831011A (en) * 1990-07-27 1998-11-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins
US5459252A (en) * 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
EP0631629B1 (en) 1992-03-20 2003-12-03 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Fungus-responsive chimaeric gene
DE4234131C2 (de) * 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
CA2088379A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 University Of British Columbia Biological systems incorporating stress-inducible genes and reporter constructs for environmental biomonitoring and toxicology
IL104830A (en) * 1993-02-23 2001-01-28 Yissum Res Dev Co A chimeric plasmid containing a non-structural gene for the protease of the potato virus and its various uses
DE4317845A1 (de) * 1993-05-28 1994-12-01 Bayer Ag Desoxyribonukleinsäuren
US5482845A (en) * 1993-09-24 1996-01-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for construction of normalized cDNA libraries
WO1995034680A1 (en) * 1994-06-15 1995-12-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to identify tumor suppressor genes
US5691140A (en) * 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
GB9510944D0 (en) * 1995-05-31 1995-07-26 Bogaert Thierry Assays and processes for the identification of compounds which control cell behaviour,the compounds identified and their use in the control of cell behaviour
DK0832207T3 (da) * 1995-06-02 2000-11-06 M & E Biotech As Fremgangsmåde til identifikation af biologisk aktive peptider og nukleinsyrer
US5679551A (en) * 1995-10-31 1997-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Unique double-stranded RNAS associated with the Trichomonas vaginalis virus
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
DK0937155T3 (da) * 1996-08-09 2005-01-31 Keygene Nv Resistens over for nematoder og/eller bladlus
WO1998012335A1 (de) * 1996-09-18 1998-03-26 Dlo-Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproductie Onderzoek (Cpro-Dlo) Nematodenresistenzgen
JP4073960B2 (ja) 1996-10-03 2008-04-09 肇 加藤 炭化水素の水蒸気改質方法
EP0946638B1 (en) 1996-12-18 2001-05-23 Exxon Chemical Patents Inc. Compatibilized polymer blends formed using a multifunctional agent
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP2267139B1 (en) * 1998-04-08 2017-03-22 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) * 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-09-02 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
EP2439278B1 (en) 2005-09-16 2016-11-09 Monsanto Technology LLC Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015111A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 President And Fellows Of Harvard College A binary genetic system to control expression of a transgene in a transgenic animal
EP1093526A2 (en) * 1998-07-03 2001-04-25 Devgen N.V. Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fire a kol., 1998 Nature 391, 806-811 *
Timmons a Fire, 1998 East Coast Worm Meeting, abstract 180 *

Also Published As

Publication number Publication date
GB9827152D0 (en) 1999-02-03
HUP0103571A2 (hu) 2002-01-28
ES2320527T3 (es) 2009-05-25
CY1109324T1 (el) 2014-07-02
JP2014058514A (ja) 2014-04-03
PT1484415E (pt) 2009-07-27
ATE419383T1 (de) 2009-01-15
US20040133943A1 (en) 2004-07-08
EP2045336A2 (en) 2009-04-08
US20030061626A1 (en) 2003-03-27
GB2349885A (en) 2000-11-15
AU769223B2 (en) 2004-01-22
HK1029142A1 (en) 2001-03-23
IL181727A0 (en) 2007-07-04
ES2327334T3 (es) 2009-10-28
HUP0103571A3 (en) 2006-01-30
EP1197567B1 (en) 2008-12-31
NZ509182A (en) 2004-01-30
MXPA00012955A (es) 2002-04-10
EP1197567B2 (en) 2015-10-07
DK1197567T4 (en) 2015-12-07
KR20070041607A (ko) 2007-04-18
GB0020485D0 (en) 2000-10-11
GB2362885B (en) 2002-07-31
EP1093526A2 (en) 2001-04-25
DE69940219D1 (de) 2009-02-12
CN1657620A (zh) 2005-08-24
DE1093526T1 (de) 2001-10-11
EP2045336A3 (en) 2009-06-10
CA2332619C (en) 2012-12-11
JP4353639B2 (ja) 2009-10-28
CN1198938C (zh) 2005-04-27
KR100563295B1 (ko) 2006-03-27
BR9911802A (pt) 2002-01-22
KR20040066200A (ko) 2004-07-23
EP1197567A3 (en) 2003-01-02
AU4907999A (en) 2000-01-24
WO2000001846A3 (en) 2000-06-15
EP1484415B1 (en) 2009-06-10
CY1108920T1 (el) 2014-07-02
CA2332619A1 (en) 2000-01-13
DE29924299U1 (de) 2002-09-12
IL181727A (en) 2015-08-31
CZ200114A3 (en) 2001-06-13
EP1484415A2 (en) 2004-12-08
PL201425B1 (pl) 2009-04-30
RU2240349C2 (ru) 2004-11-20
EP2374901A1 (en) 2011-10-12
CZ304897B6 (cs) 2015-01-07
JP2009112311A (ja) 2009-05-28
EP1197567A2 (en) 2002-04-17
MX234065B (es) 2006-02-01
IN2001DE00006A (cs) 2007-02-09
EP1484415A3 (en) 2008-02-13
IS2816B (is) 2012-11-15
IN2006DE03568A (cs) 2007-08-31
PL216779B1 (pl) 2014-05-30
NO20010019D0 (no) 2001-01-02
CN1900319A (zh) 2007-01-24
CA2789083C (en) 2016-03-15
IL140467A0 (en) 2002-02-10
PL347978A1 (en) 2002-05-06
CA2789083A1 (en) 2000-01-13
ATE433500T1 (de) 2009-06-15
DK1484415T3 (da) 2009-10-12
GB0206600D0 (en) 2002-05-01
GB2370275A (en) 2002-06-26
PT1197567E (pt) 2009-04-09
DE29924298U1 (de) 2002-09-12
NO327729B1 (no) 2009-09-14
PL213379B1 (pl) 2013-02-28
ES2320527T5 (es) 2015-11-16
KR20060071438A (ko) 2006-06-26
CN1323354A (zh) 2001-11-21
GB2370275B (en) 2002-11-27
KR20010074639A (ko) 2001-08-04
GB2362885A (en) 2001-12-05
NO20010019L (no) 2001-03-05
US20040187170A1 (en) 2004-09-23
US8114980B2 (en) 2012-02-14
JP2002519072A (ja) 2002-07-02
JP5847776B2 (ja) 2016-01-27
ZA200007653B (en) 2002-09-19
DK1197567T3 (da) 2009-05-04
IL140467A (en) 2007-07-04
HU230602B1 (hu) 2017-02-28
GB2349885B (en) 2003-01-29
IS5802A (is) 2001-01-02
WO2000001846A2 (en) 2000-01-13
GB0118514D0 (en) 2001-09-19
DE69940984D1 (de) 2009-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ303494B6 (cs) Zpusob omezení zamorení rostlin škudcem, rostlina obsahující sekvenci DNA ze škudce a použití vektoru, ve kterém jsou sekvence DNA ze škudce
CN116590257B (zh) VI-E型和VI-F型CRISPR-Cas系统及其用途
Merritt et al. Transgenic solutions for the germline
KR20040072643A (ko) ｓｉＲＮＡ 발현시스템 및 이것을 이용한 기능유전자넉다운 세포 등의 생산방법
Johnson et al. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome
JP2007502129A (ja) 短鎖干渉ｒｎａライブラリーならびに合成および使用の方法
US7005423B1 (en) Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition
AU2004200852B2 (en) Characterisation of gene function using double stranded RNA inhibition
Peng Understanding the Genetic Basis for piRNA Silencing in the Soma and Germline of Caenorhabditis elegans
PONSARD THESIS/THÈSE
Han Systemic RNAi in Caenorhabditis elegans
Li A recessive genetic screen to discover components in miRNA pathways using piggyBac-mediated insertional mutagenesis in Blm-deficient mouse embryonic stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20170702