KR20130103562A - 암을 치료하기 위한 펩티드 표적화 시스템의 조성물 - Google Patents

암을 치료하기 위한 펩티드 표적화 시스템의 조성물 Download PDF

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KR20130103562A
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KR
South Korea
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polypeptide
cells
sirna
domain
cell
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토마스 프리미아노
베이-디흐 창
제레미 하이델
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펩타임드, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 siRNA 또는 기타 다른 약물을 종양으로 표적화하는 단백질 나노입자 시스템을 기술한다. 단백질 시스템의 기반은, 일단 siRNA의 핵산에 노출되면 자가 조립하는 엘라스틴 유사 펩티드이다. 특이적인 표적화 펩티드는 표준 유전 공학 기법에 의해 코어 ELP 구조에 융합된다. 이러한 표적화 펩티드는 종양 세포 표면 상의 수용체에 나노입자의 특이적 결합이 일어나게 하여 종양 세포로 나노입자의 흡수가 가능하게 한다.

Description

암을 치료하기 위한 펩티드 표적화 시스템의 조성물{COMPOSITIONS OF A PEPTIDE TARGETING SYSTEM FOR TREATING CANCER}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2010년 11월 1일자로 출원된 미국 가출원 제61/436,127호의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
발명의 기술분야
본 발명은 대체로 의약 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치료용 분자의 운반을 위한 폴리펩티드 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
암, 대사성 및 감염성 질환, 그리고 기타 다른 질환은 특이적 유전자의 부적절한 활성에 의해 야기된다. RNA 간섭(RNAi)을 통하여 선택적으로 유전자를 침묵시키는 능력은, 세포로부터 특이적인 유전자 산물 또는 단백질을 제거하는 것을 목적으로 하는 새로운 부류의 약물을 형성함으로써, 질환 및 병을 치료하는 방법을 혁신할 수 있는 잠재력을 제공한다. RNAi는 종양학, 인플루엔자, 간염, 당뇨병, 황반변성, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 심각한 미충족 의료 요구의 수많은 기타 다른 분야의 전임상 모델에 있어서 설득력 있게 입증되어 왔다.
짧은 간섭 RNA(siRNA) 이중나선의 사용에 기초하여, RNA 간섭은 효과적인 치료제의 신속한 개발을 위한 장점을 많이 가진다. 표적 단백질에 대한 mRNA 서열에 기초하여, siRNA 치료제는 (종래의 소분자 약물을 합성하고 스크리닝하는데 필요한 시간에 비하여) 상대적으로 신속하게 설계될 수 있다. 또한, siRNA 기반 치료제는 관심의 표적 mRNA에 대하여 큰 특이성을 가지도록 설계될 수 있다.
siRNA를 종양으로 표적화하는 여러 가지 전달 수단이 임상 시험 중에 있지만, 아직 FDA에 의해 승인되지 않았다(Castanotto and Rossi, 2009, Nature 457: 426-33; Zimmermann et al., 2006, Nature 441: 111-4). 이들 시험에서, 비표적화 나노입자를 이용한 siRNA의 전신 투여는 용량 의존적 종양 축적 및 표적 유전자 발현의 침묵을 일으킬 수 있었다(Juhasz et al, 2006, Oncol Rep. 15: 1299-304.). 이러한 고무적인 데이터에도 불구하고, 비록 많은 종양 세포에서보다 더 낮은 수준이기는 하지만 이러한 siRNA에 의해 표적화되는 유전자는 모든 정상적인 세포에서 발현된다(Cerqueira et al., 2005, Curr Med Chem. 12: 1283-94; Heidel et al, 2007, Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 5715-21). 비표적화 나노입자를 사용하는 것에 대한 보다 공통적인 결점은 간, 신장 및 비장에서의 상당한 축적이며, 이는 잠재적인 오프 타겟 효과(off-target effect)로 이어지고 기타 다른 장기로 탑재되는 치료제의 효과적인 용량을 감소시킨다.
RNA는 신체 내 RNA 뉴클레아제에 의해 신속하게 분해되고, siRNA 약물은 나노입자에 캡슐화시킴으로써 순환하는 혈액에 있어서 뉴클레오티드의 농도를 증가시킬 수 있는 이러한 효소로부터 보호되어야 한다. siRNA 사용의 단점은 순환에 있어서 뉴클레아제에 의한 신속한 분해이다. 포유동물에서 치료제로서 siRNA의 사용에 대한 주요 난제는 표적 유전자를 발현하는 특이적인 조직 및 장기로의 온전한 siRNA의 세포 내 전달이다. 2가지 중요한 요인, 즉 (1) 특정 질환의 촉진을 이끌어내는 특이적 유전자 표적을 선택하는 것, 및 (2) 병에 걸린 세포로 직접적으로 siRNA를 표적화하는 방법은 질환을 치료하는 siRNA의 성공적인 사용에 필수적이다. 암 치료에 있어서, 예를 들어 siRNA 표적으로서 특이적 발암유전자를 선택하는 것과 종양 세포로 siRNA를 직접적으로 표적화하는 방법.
그러나, 이들 필수적인 표적화 요인은 아직 달성되지 않았다. 따라서, 치료 효과를 개선하기 위하여, 세포, 특히 암 세포로 siRNA(및 기타 다른 약물 분자)의 표적화된 전달을 위한 시약 및 방법에 대한 필요성이 여전히 당업계에 남아 있다.
본 발명은 치료용 조성물치료용 분자펩티드 전달 수단을 제공함으로써 종래 기술에서의 결함을 극복한다. 본 발명의 폴리펩티드 전달 수단은 일반적으로 치료용 분자와 함께 복합체로 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)를 포함한다. 예를 들어, 이와 같은 ELP 조성물은 치료용 소분자, 폴리펩티드 또는 핵산과 복합화된 ELP를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, ELP는 치료용 분자에 공유적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, ELP 조성물은 소분자와 공유적으로 연결된 ELP 도메인 또는 펩티드 결합에 의해 치료용 폴리펩티드에 연결된 ELP(즉, ELP 융합 단백질)를 포함할 수 있다. 몇몇 추가 경우에서, ELP는 치료용 분자에 결합하는 폴리펩티드와 융합될 수 있다. 마찬가지로, ELP는 핵산 앱타머, 예를 들어 치료용 분자와 결합하는 앱타머와 함께 복합체로 존재하거나 상기 앱타머에 공유적으로 접합될 수 있다.
상이한 약물 결합 또는 세포 표적화 펩티드 서열이 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술에 의해 분자 구조 내로 용이하게 도입될 수 있다는 점에서, 기술된 나노입자 시스템의 모듈식 성질은 현재의 리포좀 또는 나노입자 약물 전달 시스템에 대하여 유리한 유연성을 제공한다. 비제한적인 예에서, 본 발명에 따라서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 나노입자 폴리펩티드를 제조하는데 사용되는 플라스미드 벡터로 클로닝될 수 있는데, 여기에서 특정 표적화 서열은 이의 특정 실시형태로 도입될 수 있다. 다른 이점은 제조의 간단함이며, 여기에서 재조합 벡터 또는 발현 작제물(expression constuct)은 적절한 세포 유형(예컨대, 박테리아 세포로 도입된 나노입자 폴리펩티드에 대한 DNA 서열을 가지는 플라스미드)으로 도입될 수 있고, 이때 폴리펩티드는 다량으로 생산되며 특이적 결합, 특히 DNA 친화성 컬럼을 사용하여 정제된다.
도 1은 ELP 약물 전달 나노입자의 구조 및 도메인을 도시한 도면. 본 명세서에 제공된 바와 같이 ELP 약물 전달 시스템은 조립 도메인(assembly domain, AD), 약물-결합 도메인(drug-binding domain, DBD), 뉴클레오티드 결합 도메인(nucleotide binding domain, NBD), 및 표적화된 세포의 생물학적 분자와 상호작용하는 세포 표적화 도메인(cell targeting domain, CTD)을 포함한다.
도 2는 용액 중 ELP -나노입자의 조립체를 도시한 도면. 각각의 폴리펩티드의 AD는 조립체를 거대 미셀로 만든다.
도 3은 샘플 입자의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 도시한 도면. ELP1-60; K8 서열(밑줄, 굵은 활자체); L1CAM 서열(밑줄, 굵은 활자체, 기울임체)
도 4는 수 중 K8ELP (1-60)-나노입자의 정제를 도시한 도면. ELP-함유 나노입자를 분리하기 위한 역전이 사이클링(inverse transition cycling) 절차 동안 정제된 분획의 SDS-PAGE 분석. 레인 1 STD, 레인 2 BLR, 레인 3 BLR+K8ELP1-60, 레인 4 세포 파괴 후, 레인 5 PEI 후, 레인 6 핫 스핀 수프(Hot Spin Sup), 레인 7 핫 스핀 펠릿(Hot Spin pellet). 정제된 K8-ELP(1-60)은 크기가 25kDa 근처임을 나타낸다.
도 5는 siRNA 의 K8ELP (1-60)-나노입자로의 응축을 도시한 도면. 나노입자에 결합된 siRNA의 겔 지연 분석. siRNA(100p㏖)는 나노입자의 계열 희석물과 혼합시키고 주위 온도에서 30분 동안 항온처리한다. 생성물은 1× TAE 완충액 중 1% 아가로스 겔 상에서 30분 동안 120V에서 전기영동 분리를 한다. 겔은 siRNA의 시각화를 위하여 브롬화 에티듐을 함유하였다. 레인 1 래더, 레인 2 siRNA(100p㏖), 레인 3 siRNA + 1:320 K8ELP1-60, 레인 4 siRNA + 1:160 K8ELP1-60, 레인 5 siRNA + 1:80 K8ELP1-60, 레인 6 siRNA + 1:40 K8ELP1-60, 레인 7 siRNA + 1:20 K8ELP1-60, 레인 8 1:10 K8ELP1-60. 레인 8은 K8ELP(1-60) 1.33㎍을 포함한다.
도 6은 표지된 siRNA 를 포함하는 나노입자의 종양으로의 국소화는 전신 생체발광 영상화에 의하여 실행됨을 나타내는 도면. 2마리 마우스 각각은 대조군으로서 표지된 네이키드(naked) siRNA(Dy677-siEVI1)와 처치군으로서 K8ELP(1-60)(Dy677-ELP-siEVI1) 중 표지화 siRNA로 주입하였으며, 비히클 군과 함께 표시되어 있다. 생체발광 영상화는 포화되지 않은 영상을 생성하는 노출 시간으로 실행된다. 배경 자가형광을 낮추기 위한 분광 불혼합(spectral unmixing)은 Cy5.5에 대한 매개변수를 사용하여 실행되며, Cy5.5에 대한 매개변수는 Dy677에 따라 매우 유사한 Ex/Em을 가진다. 모든 시점(0.5, 4 및 24시간)에 대하여 모든 형광 및 BLI 영상이 동일한 비율로 배치되어 시점 중에서의 직접적인 비교가 가능하다. 표지화 siRNA를 함유하는 기본 K8ELP(1-60) 나노입자는 4시간 이내에 종양에 특이적으로 국소화하는 것으로 확인되며, 종양에 의해 대사되어 신호가 24시간까지 감소한다.
당업자에게 잘 알려진 종래 기술은 올리고뉴클레오티드 합성, 또는 화학적 폴리펩티드 합성에 사용되었다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라서 또는 당업계에서 일반적으로 성취되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 실행되었다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라서 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐서 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 실행되었다. 예컨대, 문헌[Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 및 Benoiton, N.L., Chemistry of Peptide Synthesis, 1st Ed, CRC Press (August 12, 2005)]을 참조하며, 이들 참조문헌은 본 명세서에 임의의 목적을 위하여 참조로 포함된다. 구체적인 정의가 제공되어 있지 않다면, 본 명세서에 기술된 분자 생물학, 유전 공학, 분석 화학, 유기 합성 화학, 및 의약 및 약품 화학과 관련되어 사용되는 명명법, 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 및 환자의 치료에 사용될 수 있다.
문맥에 의해 달리 요구되지 않는다면, 단수 용어는 복수를 포함할 것이며 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
본 개시 내용에 따라서 이용되는 바와 같이, 달리 명시되어 있지 않는다면, 다음 용어는 다음과 같은 의미를 가지는 것으로 이해될 것이다.
1. 폴리펩티드
하나의 측면에서, 본 발명은 핵산 결합 도메인(NBD), 조립 도메인(AD), 및 세포 표적화 도메인(CTD)을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 기술한다. 다른 실시형태에서, 분리된 폴리펩티드는 약물 결합 도메인(DBD)을 추가로 포함한다. 임의의 실시형태에서, 분리된 폴리펩티드는 AD, CTD, NBD, 및 DBD 분절을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 도메인은, 당업자에게 용이하게 명백한 바와 같이 임의의 순서일 수 있다. 본 발명은 다수의 AD, CTD, NBD, 및/또는 DBD 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드를 추가로 기술한다.
임의의 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 폴리펩티드, 예를 들어 엘라스틴 유사 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "폴리펩티드"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 다수의 아미노산을 가지는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 분자를 말한다. 단백질은 하나 초과의 폴리펩티드, 예를 들어 이량체 또는 삼량체 또는 기타 다른 3차 구조를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단백질은 3개 이상의 아미노산을 가지는 폴리펩티드 또는 3 내지 100개 아미노산의 펩티드를 말한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호호환적으로 사용된다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 크기는 최대 또는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 이상의 아미노 분자 잔기, 그리고 여기에서 유도가능한 임의의 범위이거나 이를 포함할 수 있다. 게다가, 폴리펩티드의 크기는 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드, 예를 들어 엘라스틴 중합체 유래의 이와 같은 길이의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 임의의 기술, 예를 들어 표준 분자 생물학 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원 유래의 폴리펩티드의 분리, 또는 폴리펩티드의 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 대한 뉴클레오티드 및 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 서열은 이전에 개시되었으며, 당업자에게 알려진 컴퓨터화된 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 이와 같은 데이터베이스의 하나는 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information)의 Genbank 및 GenPept 데이터베이스(월드 와이드 웹 상의 ncbi.nlm.nih.gov/)이다. 이러한 공지된 유전자에 대한 암호화 영역은 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 알려져 있을 기술을 사용하여 증폭되고/증폭되거나 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드의 다양한 상업적 제조물은 당업자에게 알려져 있다.
임의의 실시형태에서, 폴리펩티드는 정제될 수 있다. 일반적으로 "정제된"은 분별 처리되어 다양한 기타 다른 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 제거한 특이적인 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 조성물을 말할 것이며, 특이적이거나 원하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 대하여 당업자에게 알려져 있을, 예를 들어 단백질 분석법에 의하여 평가될 수 있는 바와 같이, 상기 조성물은 실질적으로 활성을 유지한다.
몇몇 실시형태에서, 단백질, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 단백질 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 기술은 하나의 수준으로, 폴리펩티드 및 비폴리펩티드 분획으로 세포 환경의 조물질 분별(crude fractionation)을 수반한다. 폴리펩티드를 기타 다른 단백질과 분리하여, 관심의 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제되어 부분적 또는 완전한 정제(또는 균일하게 정제)를 달성할 수 있다. 순수한 펩티드 또는 폴리펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 등전점 전기 영동이다. 펩티드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 고속 단백질 액체 크로마토그래피 또는 심지어 HPLC이다. ELP 조성물의 경우에서, 단백질 정제는 또한 미국 특허 제6,852,834호에 기술된 바와 같이 ELP 도메인의 열전이 특성에 의해 도움을 받을 수 있다.
단백질 또는 펩티드의 정제도를 수량화하는 다양한 방법은 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 알려져 있을 것이다. 이는, 예를 들어 활성 분획의 비활성(specific activity)을 측정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 비활성과 비교하여 순도를 계산하는 것이다. 활성량을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 물론 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부 및 정제에 따라 선택되는 특정 분석 기술에 따를 것이다.
단백질 정제에서의 사용에 적당한 다양한 기술은 당업자 잘 알려져 있을 것이다. 이는, 예를 들어 황산 암모늄, PEG, 항체 등을 이용한 침전 또는 열 변성 후의 원심분리; 크로마토그래피, 예를 들어 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 등전점 전기 영동; 겔 전기 영동; 및 이와 같은 기술 및 기타 다른 기술의 조합을 포함한다. 당업계에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나, 또는 여전히 임의의 단계가 생략될 수 있고, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조에 적당한 방법을 초래할 수 있다고 여겨진다.
2. 폴리뉴클레오티드 및 유전자 발현
본 발명의 폴리펩티드는 종래의 분자 생물학 기술에 의해 제조될 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명은 약물 결합 도메인(DBD), 조립 도메인(AD), 및 세포 표적화 도메인(CTD)을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 분리된 폴리뉴클레오티드를 기술한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 조합을 의미하며, 이의 공급원으로 인하여 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) "분리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 부분과 관련되어 있지 않고, (2) 자연에서 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드와 연결되며, (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생되지 않는다.
달리 명시되어 있지 않다면, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3' 방향으로의 첨가는 전사 방향으로서 지칭되며; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 가닥 상의 서열 영역으로서 RNA 전사체의 5' 말단에 대한 5'인 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되고; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 가닥 상의 서열 영역으로서 RNA 전사체의 3' 말단에 대하여 3'인 서열 영역은 "하류 서열"로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 적어도 10개 염기인 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 임의의 실시형태에서, 염기는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중 어느 하나의 유형의 변형된 형태일 수 있다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA의 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 발생되는 뉴클레오티드, 및 자연적으로 발생 및/또는 비자연적으로 발생되는 올리고뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결되는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 임의의 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60개 뉴클레오티드이다. 임의의 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 30 내지 40개 염기이다. 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 안티센스 RNA로서의 사용을 위한 단일 가닥, 또는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 작은 (또는 짧은) 헤어핀 RNA(shRNA)로서 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 표지, 예를 들어 방사능 표지, 형광 표지, 항원 표지 또는 합텐을 포함할 수 있다.
용어 "자연적으로 발생하는 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당 기(sugar group) 등을 가지는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 연결"은 올리고뉴클레오티드 연결, 예를 들어 포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예컨대, 문헌[LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design 6: 539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, (F. Eckstein, ed.), Oxford University Press, Oxford England, pp. 87-108; Stec et al., 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews 90: 543]을 참조하며, 이들 참조문헌 각각의 개시 내용은 본 명세서에 임의의 목적을 위하여 참조로 포함된다.
다양한 측면에서, 본 발명은 조립 도메인(AD), 세포 표적화 도메인(CTD), 및 약물 결합 도메인(DBD)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 작제물을 기술한다.
용어 "재조합 발현 작제물"은 암호화 정보를 숙주 세포 또는 표적 세포로 이동시키는데 사용되는 분자(예컨대, 핵산, 플라스미드, 또는 바이러스)를 말하는데 사용된다. 용어 "재조합 발현 작제물" 및 "벡터"는 상호호환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 적당한 바이러스 벡터는, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 레트로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 또는 백시니아 바이러스로부터 유래되는 것들을 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포 또는 표적 세포의 형질전환에 적당한 벡터를 말하며, 삽입된 핵산 서열의 발현을 지시하고/지시하거나 제어하는 제어 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 용어 "발현"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 인트론이 존재한다면 전사 및 RNA 스플라이싱과 같은 과정을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 제어 서열에 작동적으로 연결된 암호화 서열을 가지는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "제어 서열" 또는 "제어 요소"는 결찰되는 암호화 서열의 발현 및 가공에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 이와 같은 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라서 상이할 수 있다. 임의의 실시형태에 따라서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리프레서, 작동유전자, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열 및 안티센스 mRNA를 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에 따라서, 진핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 서열, 또는 단백질 분해, mRNA 분해, 핵 위치, 핵 유출(nuclear export), 세포질 유지(cytoplasmic retention), 단백질 인산화, 단백질 아세틸화, 단백질 수모화(sumolation), 또는 RNA 저해(RNAi)를 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, "제어 서열"은 선도 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. "제어 서열"은, "제어 서열"이 결찰된 암호화 서열의 발현 및 가공에 영향을 미칠 경우 암호화 서열에 "작동적으로 연결"된다.
전형적으로, 숙주 세포 또는 표적 세포에서 사용되는 발현 벡터는 벡터 유지 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 서열을 포함한다. 임의의 실시형태에서 "측접 서열"(flanking sequence)로서 일괄적으로 지칭되는 이와 같은 서열은 전형적으로 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위를 포함하는 완전한 인트론 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 신호 서열, 발현된 siRNA를 암호화하는 핵산의 삽입을 위한 하나 또는 복수의 제한 효소 부위를 포함하는 폴리링커 영역, 및 선택가능한 마커 요소를 포함할 것이다.
측접 서열은 상동성(즉, 숙주 세포 또는 표적 세포와 동일한 종 및/또는 균주 유래), 이종성(즉, 숙주 세포 또는 표적 세포 종 또는 균주 이외의 종 유래), 혼성체(즉, 하나 초과의 공급원 유래의 측접 서열의 조합), 합성 또는 천연일 수 있다. 이와 같이, 측적 서열이 숙주 세포 또는 표적 세포 기구에서 기능성이고, 숙주 세포 또는 표적 세포 기구에 의해 활성화될 수 있다면, 측접 서열의 공급원은 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있다.
본 발명의 벡터에 유용한 측접 서열은 당업계에 잘 알려진 여러 가지 방법들 중 임의의 것에 의해 얻을 수 있다. 전형적으로, 본 명세서에서 유용한 측접 서열은 이전에 맵핑 및/또는 제한 효소 소화에 의해 확인될 것이며, 따라서 적절한 제한 효소를 사용하여 적절한 조직 공급원으로부터 분리될 수 있다. 몇몇 경우에서, 측접 서열의 전체 뉴클레오티드 서열은 알려져 있을 수 있다. 또한 측접 서열은 핵산 합성 또는 클로닝에 대하여 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
측접 서열의 전부 또는 일부만이 알려진 경우, 측접 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 시험관내 증폭 방법을 사용하고/사용하거나 동일 또는 다른 종 유래의 적당한 올리고뉴클레오티드 및/또는 측접 서열 단편을 이용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 측접 서열이 알려져 있지 않은 경우, 측접 서열을 포함하는 DNA의 단편은, 예를 들어 암호화 서열 또는 심지어 다른 유전자 또는 유전자들을 포함할 수 있는 DNA의 더 큰 부분으로부터 분리될 수 있다. 분리는 제한 효소 소화에 의해 이루어져서 적절한 DNA 단편을 제조한 다음, 이후 아가로스 겔 정제, 퀴아젠(Qiagen) 컬럼 크로마토그래피(미국 캘리포니아주 챗스워스 소재), 또는 당업자에게 알려진 기타 다른 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 이러한 목적을 달성하는데 적당한 효소의 선택은 당업자에게 용이하게 명백하다.
전사 종결 서열은 전형적으로 폴리펩티드-암호화 영역의 말단으로 3'에 위치하며, 전사를 종결시키는 역할을 한다. 보통, 원핵 세포에서 전자 종결 서열은 G-C 풍부 단편이며, 뒤이어 폴리-T 서열이 이어진다. 서열은 라이브러리로부터 용이하게 클로닝되거나 심지어 벡터의 일부로서 상업적으로 구매되는 한편, 본 명세서에 기술된 방법과 같은 핵산 합성 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 진핵 생물은 전사 종결 신호와 엔도뉴클레아제 절단이 일어나고 뒤이어 폴리 A 잔기(보통 약 200개의 A 잔기로 이루어짐)의 첨가에 필요한 폴리 A 신호 둘 다로 작용하는 서열을 가진다.
본 발명의 발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 유전자를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 제어하는, 구조 유전자(일반적으로 약 100 내지 1000bp 이내)의 출발 코돈에 대하여 상류(즉, 5')에 위치하는 전사되지 않는 서열이다. 프로모터는 통상적으로, 유도성 프로모터와 구성 프로모터의 2가지 부류 중 하나로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서 일부 변화, 예를 들어 영양분의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 대응하여 자체의 제어 하에서 증가된 수준의 DNA로부터의 전사를 개시한다. 반면에 구성 프로모터는 연속적인 유전자 생성물 생성을 개시하며; 즉, 유전자 발현에 대하여 제어가 거의 없거나 실험적인 제어가 없다. 다양한 잠재적인 숙주 세포 또는 표적 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터는 잘 알려져 있다.
포유동물 세포와 함께 사용하기에 적당한 프로모터는 잘 알려져 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 진핵생물 바이러스, 예를 들어 폴리오마바이러스, 계두바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소유두종바이러스, 조류육종바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, B형간염바이러스 및 가장 바람직하게는 유인원바이러스 40(Simian Virus 40, SV40)의 게놈으로부터 얻어지는 것들을 포함한다. 기타 다른 적당한 포유동물 프로모터로는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 열충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다
본 발명의 재조합 발현 벡터의 실시에 있어서 유용한 특정 프로모터로는 이에 제한되는 것은 아니지만 SV40 초기 프로모터 영역(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-10); CMV 프로모터; 라우스육종바이러스의 3' 긴 말단 반복순서(long terminal repeat)에 포함된 프로모터(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-97); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45); 및 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42)을 포함한다. 또한 조직 특이성을 나타내고 형질전환 동물에서 이용되었던 다음의 동물 전사 제어 영역이 관심이 있는 것이다: 최장 선방세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역(Swift et al., 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quaint. Biol. 50: 399409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역(Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); 고환, 유방, 림프계 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 제어 영역(Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95); 골수성 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-12); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역(Sani, 1985, Nature 314: 283-86); 시상하부에서 활성인 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬 유전자 제어 영역(Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78); 및 가장 특히 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-58; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 1436-44).
바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터의 프로모터는 표적 또는 숙주 세포가 유래하는 조직에서 활성이다. 예를 들어, 세포가 간 세포이면, 유리하게 알부민 유전자 제어 영역(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76); 알파태아단백 유전자 제어 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell Biol. 5: 1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); 또는 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-71)이 사용될 수 있으며, 이들 제어 영역은 모두 간에서 활성이다.
본 발명의 벡터는 또한 고등 진핵 세포에서 전사를 증가시키는 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스 작용(cis-acting) 요소이고, 보통 길이가 약 10~300bp이며, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시킨다. 인핸서는 비교적 방향 독립성 및 위치 독립성이다. 인핸서는 인트론뿐만 아니라 전사 단위에 대한 5' 및 3'의 수 킬로베이스 이내에서 발견되었다. 포유동물 유전자로부터 이용가능한 몇 가지 인핸서 서열(예컨대, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파태아단백, 인슐린, 트랜스타이레틴, 및 HNF-6 유전자 유래의 인핸서)이 알려져 있다. 또한 바이러스 유래의 인핸서가 유전자의 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다. SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마바이러스 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 향상 요소이다. 인핸서는 핵산 분자에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있는 한편, 전형적으로는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
본 발명의 발현 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터와 같은 편리한 출발 벡터로부터 구성될 수 있다. 이와 같은 벡터는 원하는 측접 서열을 모두 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 본 명세서에 기술된 측접 서열 중 하나 이상이 이미 벡터에 존재하지 않는 경우, 상기 측접 서열은 개별적으로 얻어지고 벡터로 결찰될 수 있다. 각각의 측접 서열을 얻는데 사용되는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
벡터가 구성되고, 예를 들어 기술된 ELP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 벡터의 적절한 부위로 삽입된 후, 완성된 벡터는 적당한 숙주 세포 또는 표적 세포로 삽입될 수 있다. 기술된 ELP 폴리펩티드를 암호화하는 모든 발현 벡터의 선택된 숙주 세포 또는 표적 세포로의 도입은 잘 알려진 방법, 예를 들어 형질감염, 감염, 염화칼슘, 전기천공법, 미세주입법, 리포펙션, DEAE-덱스트란 법, 또는 상기 기술된 바와 같은 기타 다른 알려진 기법과 같은 방법에 의해 이루어질 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용될 숙주 세포 또는 표적 세포의 유형의 작용일 것이다. 이러한 방법 및 기타 다른 적당한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 설명되어 있다.
용어 "형질감염"은 세포에 의해 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 말하는데 사용되며, 외인성 DNA가 세포 내로 도입될 때 세포는 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 개시되어 있다. 예컨대, 문헌[Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Elsevier); 및 Chu et al., 1981, Gene 13: 197]을 참조한다. 이와 같은 기법은 외인성 DNA를 적당한 숙주 세포로 도입하는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는, 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포를 제공한다.
3. 조립 도메인( AD )
임의의 실시형태에서, AD는 단백질 기반 중합체이다. 다른 실시형태에서, AD는 엘라스틴 유사 폴리펩티드(elastin-like polypeptide, ELP)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "엘라스틴 유사 폴리펩티드" 또는 "엘라스틴 유사 반복단위"(ELP)는 상호호환적으로 사용된다. ELP는 온도에 의존적인 형태 변화를 겪는 아미노산 중합체의 부류를 말한다. 온도를 증가시킴으로써 ELP는 매우 용해성인 연장된 사슬로부터 용해성이 크게 감소된 단단하게 접힌 조립체로 변화한다(미국 특허 제6,852,834호 참조). 예를 들어, ELP는 상전이가 일어나는 온도 중앙값으로 정의될 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에서, ELP는 상전이 온도 중앙값이 약 37℃ 초과일 것이다. 몇몇 추가 실시형태에서, ELP는 상전이 온도 중앙값이 생리학적 범위, 예를 들어 전이 온도가 약 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃ 또는 46℃일 수 있다. 몇몇 경우에서, ELP는 또한 상전이가 일어나는 온도에 걸치는 온도 범위에 기초하여 정의될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에서, 상전이는 약 5℃ 미만의 온도 범위에 걸쳐서 일어날 것이다. 예를 들어, 상전이는 약 4℃, 3℃, 2℃, 1℃ 이하의 온도 범위에서 일어날 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체적인 실시형태에서, ELP 도메인은 자신의 아미노산 서열에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어 ELP 도메인은 아미노산 서열 VPGXG(서열번호 57)의 다수의 반복단위를 포함할 수 있는데, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 예를 들어, 본 발명의 ELP는 VPGXG 서열의 10 내지 500개 반복단위를 포함할 수 있다. 몇몇 훨씬 더 구체적인 경우에서, 본 발명의 ELP는 50 내지 300개 또는 80 내지 200개 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, ELP에서 "X" 잔기는 모두 동일한 아미노산일 것이지만, 임의의 다른 경우에서 ELP는 중합체 도처의 X 위치에서 다양한 상이한 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에서, 10개의 VPGXG 반복단위를 포함하는 ELP와 같이, X는 알라닌, 발린 또는 글리신 잔기일 수 있되, 제1의 5개 반복단위에 대하여 X=Val이고, 다음 2개 반복단위에 대하여 X=Ala이며, 나머지 3개 반복단위에 대하여 X=Gly이다(V5:A2:G3로 나타냄).
ELP와 같이 단백질 기반 중합체는 생물 의학 적용의 폭넓은 범위에 대하여 유리한 특성을 가지는 그러한 중합체의 한 부류이다. ELP는 인간 트로포엘라스틴으로부터 유래한 (Val-Pro-Gly-X-Gly)(서열번호 57) 반복단위로 구성된 인공적인 펩티드 중합체인데, 여기에서 "게스트 잔기"로서 알려진 X는 프롤린을 제외한 아미노산의 임의의 혼합물 일 수 있다. (Urry, D. W. Prog. Biophys. Mol. Biol. 57: 23-57, 1992.). 유용한 감열성 생체 재료로서 ELP의 중요성은 원래 (D. T. McPherson, J. Xu, and D. W. Urry. Protein Expr. Purif. 7:51-57 (1996))에 의해 제안되었다.
ELP는 여러 가지 이유로 AD로서 유용하다. 첫째, ELP는 특징적인 전이 온도(Tt)에서 수용액 중에서 역 상전이를 겪으며, 상기 온도 초과에서 ELP는 탈용매화되고 상은 벌크물(bulk water)로부터 분리된다(Urry D.W., 1997, Journal of Physical Chemistry B 101:11007-11028..). 재조합 ELP 블록 공중합체에 대하여, 이러한 상전이 거동은 나노구조로의 자기 조립을 촉진하고, 이는 하나의 블록의 선택적인 탈용매화에 의해 구동된다(Yamaoka et al., 2003, Biomacromolecules 4:1680-1685; Cappello et al., 1998, Journal of Controlled Release 53:105-117; Dreher et al., 2008, J Am Chem Soc 130:687-694). 이는 폴리펩티드/약물 혼합물에 충분한 양친매성을 부여하여 나노입자 내로 자체의 자가 조립을 추진시키는 ELP의 능력을 설명할 수 있다(Wright et al., 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:1057-1073; Megeed et al., 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 1075-1091). 둘째, ELP는 유용한 생체고분자이며, 이는 비독성(Urry et al., 1991, Journal of Bioactive and Compatible Polymers 6:263-282; Liu et al., 2006, J Control Release 116:170-178)이고, 생분해성이며, 양호한 약동학을 나타낸다(Chilkoti et al., 2002, Adv Drug Deliv Rev 54: 1093-1111). 셋째, ELP는 유전자 공학을 통하여 제조될 수 있으므로, ELP의 조성, 분자량 및 다분산성은 정확하게 제어될 수 있다. 넷째, ELP는 대장균(E. coli)에서 고수율(약 100~200㎎/ℓ)로 제조될 수 있으며, 자신의 상전이 거동을 활용함으로써 용이하고 신속하게 정제될 수 있어서(Meyer and Chilkoti, 1999, Nature Biotechnology 17:1112-1115), 고순도의 임상 등급 물질이 용이하고 저렴하게 얻어진다. 구조의 단순함은 나노입자 생산 및 siRNA 제형에 일관성, cGMP 제조 및 품질 관리를 위한 주요 관심사를 제공한다. ELP의 유용성과 안전성은 당뇨병의 치료에 대한 I상 임상 평가로 입증되었다(PhaseBio Pharmaceuticals, Inc.).
본 발명의 추가 측면에서, ELP 도메인의 서열은 변형되어, 예를 들어 ELP의 상전이 특징, ELP 조성 또는 나노입자를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에서, ELP 도메인은 서열(Val-Pro-Gly-X-Gly)(서열번호 57)를 포함하는데, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 포함한다. X 위치에서 상이한 아미노산을 치환함으로써 ELP 도메인의 특징은 변형될 수 있다. 예를 들어, 더 낮은 전이 온도가 바람직한 경우에, 더 소수성인 잔기는 X에서 치환될 수 있다. 역으로, 전이 온도를 높이기 위하여, 덜 소수성인 잔기는 X 위치에서 치환될 수 있다. 단백질에 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 소수성 또는 수치 요법 아미노산 색인의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol . Biol. 157: 105-132). 아미노산의 비교적 수치 요법 특정은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 결국 단백질과 기타 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 한정한다는 것이 인정된다.
미국 특허 제4,554,101호에 상술된 바와 같이, 다음의 친수성 수치는 아미노산 잔기로 정해졌다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 티로신(2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 따라서, 위치 X에서 아미노산이 높은 친수성 수치를 가질 때 ELP 전이 온도는 상승될 수 있는 반면, 전이 온도를 낮추기 위하여 친수성 수치가 더 낮은 아미노산이 사용될 수 있다.
임의의 실시형태에서, 분리된 폴리펩티드는 반복적인 방향성 결찰(recursive directional ligation; RDL)을 기반으로 한 재조합 DNA 클로닝 기술, 즉 종래의 박테리아 배양 발현(14)에 의해 달성되는 용이한 생합성 경로를 통한 유전자 전달을 위해 설계되고 합성된다. 임의의 실시형태에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열(Val-Pro-Gly-X-Gly)n(서열번호 57)을 포함하는데, 여기에서 X는 Val, Ala 및 Gly을 포함하는 펩티드이고; n은 1 이상의 정수이다. 다른 실시형태에서, n은 2, 5, 10, 20, 50, 100 이상이다. 보다 특정한 실시형태에서, X는 약 5:2:3의 비율로 Val, Ala 및 Gly을 포함하는 펩티드이다. 특정 실시형태에서, n은 60이고, ELP(1-60)로 언급된다. ELP(1-60)은 문헌[Chen et al. 2007, Pharm . Res. 25: 683-691]에 기술되어 있으며, 문헌[Meyer & Chilkoti, 1999, Nat . Biotech. 17, 1112-1115]에 기술된 바와 같이 ELP(1-30)로부터 유래하고, 이들 문헌은 각각 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 기타 다른 블록 공중합체는 반복적인 방향성 결찰을 이용한 이전 연구에 따라서 합성될 수 있다.
또한 ELP 도메인, ELP 조성물 또는 나노입자의 전이 온도는 ELP 도메인 내 엘라스틴 유사 반복단위의 수를 변경시킴으로써 변화될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, ELP 도메인에 의해 부여되는 전이 온도를 상승시키기 위하여 ELP 반복단위의 수는 감소될 수 있다. 역으로, ELP 도메인 내 ELP 반복단위의 수를 증가시키는 것은 일반적으로 ELP 도메인, ELP 조성물 또는 나노입자의 전이 온도를 감소시킬 것이다.
임의의 실시형태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 참조 서열 또는 참조 서열의 특정 영역과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 특정 폴리펩티드의 영역 내의 아미노산 서열에 대하여 적어도 또는 최대로 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100%의 동일성을 가진다. 몇몇 경우에서, ELP 도메인 서열은 인간 엘라스틴 도메인의 서열과 보다 근접하게 일치하도록 변형될 수 있다. 이와 같은 변형은 예를 들어 ELP 도메인, 또는 ELP 조성물(예컨대, ELP 융합 단백질)의 면역원성을 추가로 감소시키도록 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 몇몇 실시형태에서, ELP 도메인은 인간 엘라스틴 반복 서열과 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 동일한 것으로 한정될 수 있다.
4. 세포 표적화 도메인( CTD )
유리한 특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 세포 표적화 도메인(CTD)을 포함한다. 통상적인 유전 공학 기법, 예를 들어 재조합 DNA를 사용하여, 상이한 세포 표적화 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열이 포함되어 폴리펩티드 또는 나노입자의 표적화에 대한 영향을 측정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 AD 및 CTD를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있고, 추가의 경우에서 이와 같은 융합 단백질은 또한 NBD를 포함할 수 있으며, 추가의 경우에서 이와 같은 융합 단백질은 또한 DBD를 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 이의 특이적 결합 부분, 리간드, 사이토카인, 케모카인 또는 핵산 앱타머인 CTD를 포함한다. "특이적 결합 부분"은 항원과 상호작용하는 항체의 펩티드 도메인으로 한정된다. 이와 같은 도메인은 본 발명의 ELP 조성물과 접합될 수 있다. 세포 표적화 항체는 이에 제한되는 것은 아니지만 다중클론 항체, 단일클론 항체, 단일 사슬 항체, 항체 단편, 또는 인간화 항체를 포함한다. 다른 예에서, 세포 표적화 리간드는 VEGF 또는 수용체 결합을 매개하는 것 유래의 아미노산일 수 있다. CTD는 세포의 임의의 부류, 예를 들어 면역 세포, 암 세포, 또는 특정 조직 또는 혈통 유래의 세포와 우선적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에서, CTD는 또한 ELP 기반 조성물의 내재화를 매개할 수 있다.
본 발명의 임의의 실시형태에서, CTD는 표적 세포의 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, CTD는 표적 세포의 외부 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, CTD는 표적 세포의 내부 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, CTD는 세포 외부에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, CTD는 세포 내부에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용할 수 있다. 나노입자는 나노입자가 세포막을 투과성이 되도록 응축할 수 있다. 이와 같은 대안적인 실시형태에서, 나노입자는 세포 내부의 생물학적 분자와 접촉할 수 있다.
다른 실시형태에서, 생물학적 분자는 수용체 분자를 포함한다. 임의의 실시형태에서, 생물학적 분자는 세포 부착 분자를 포함한다. 다른 구체적인 실시형태에서, 생물학적 분자는 피브로넥틴 또는 라미닌을 포함한다. 임의의 실시형태에서, 생물학적 분자는 표적 세포의 외부 표면에 존재하며, 이는 생물학적 분자의 임의의 부분이 전체 또는 부분적으로 세포의 외부에 노출된다는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 암 세포의 표면 상의 암 생체지표와 결합하는 CTD를 포함하는 폴리펩티드를 기술한다.
CTD는 임의의 특정 폴리펩티드 서열로 제한되지 않는다. CTD는 임의의 원하는 생물학적 분자를 표적화하도록 설계될 수 있다. 구체적인 특정 실시형태에서, 생물학적 분자는 원하는 세포 유형으로 특이적으로 발현된다. 비제한적인 예로서, CTD는 종양 세포에서 발현되지만 비종양 세포에서 발현되지 않는 생물학적 분자를 표적화하도록 설계되었다. 임의의 실시형태에서, 폴리펩티드의 CTD는 종양 세포에 대하여 특이적인 펩티드 리간드를 포함한다. 종양 특이적 CTD 폴리펩티드 서열의 비제한적인 예는 표 1에 표시되어 있다. 하나의 실시형태에서, CTD는 L1 세포 부착 분자(L1CAM)에 결합하는 펩티드 리간드를 포함한다. 특이적 종양 세포를 표적화하는 것은 종양-탐색 ELP 나노입자로 전달되는 약물의 특이적인 표적화에 의한 암 치료법의 부작용의 감소로 인하여 유리하다. 특이적인 표적화는 더 낮은 농도의 약물 제제를 사용하면서 치료법의 효능을 유지하거나 향상시킬 수 있다. 하나의 실시형태에서, CTD는 펩티드 서열(GSQRKHSKRHIHKDHV)(서열번호 19)을 포함한다.
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본 발명의 다른 측면에서, 표적 세포에 대해 약물 제제를 표적화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 조립 도메인(AD), 약물 결합 도메인(DBD), 및 세포 표적화 도메인(CTD)을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 사용하는 단계; 약물 제제를 하나 이상의 폴리펩티드의 DBD와 접촉시키는 단계; 하나 이상의 폴리펩티드의 AD를 조립하여 조립된 폴리펩티드를 생성하는 단계; 조립된 폴리펩티드를 표적 세포와 접촉시키는 단계; 및 조립된 폴리펩티드의 CTD를 표적 세포의 외부에 존재하는 생물학적 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 용어 "얻음"은 생리학적 표본을 물리적으로 취득하는 것을 의미한다. 물질이 획득되는 방식은 임의의 구체적인 공정으로 제한되지 않는다. 임의의 실시형태에서, 조립된 폴리펩티드는 약물 제제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조립된 폴리펩티드는 응축되어 나노입자를 형성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 조립된 폴리펩티드는 약물 제제와 응축되어 나노입자를 형성할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 약물 제제를 원하는 세포로 표적화한다. 임의의 세포는 표적화를 위해 선택될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 표적 세포는 진핵 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포이며, 가장 바람직하게는 설치류 또는 인간 세포이다. 특정 실시형태에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 본 발명에 의해 고려되는 종양 세포의 비제한적인 예는 인간 방광 세포, 인간 유방 세포, 인간 결장 세포, 인간 간 세포, 인간 폐 세포, 인간 신경아세포종 세포, 인간 난소 세포, 인간 췌장 세포, 인간 전립선 세포, 또는 인간 피부 세포를 포함한다. 추가적으로, 표적 세포는 본 발명의 방법에 의해 치료되어야 하는 환자가 이환된 질환 또는 병태에 기초하여 선택될 수 있다.
5. 약물 결합 도메인( DBD )
본 발명의 임의의 측면에서, 폴리펩티드는 약물 결합 도메인(DBD)을 포함한다. DBD는 약물 제제에 결합하는 임의의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 용어 "제제" 또는 "약물 제제"는 본 명세서에서 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타내는데 사용된다. 약물 제제는 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 식물체 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 및 기타 다른 항종양제를 포함한다. 기타 다른 약물 제제는 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 보르테조밉(Bortezomib), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에포틸론(Epothilone), 에포토시드(Etoposide), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 범주화를 필요로 하는 하이드록시우레아(Hydroxyurea requires categorization), 이다루비신(Idarubicin), 이마티닙(Imatinib), 메클로레타민(Mechlorethamine), 머캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉시드(Pemetrexed), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Tioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 및 비노렐빈(Vinorelbine)을 포함한다.
임의의 실시형태에서, DBD는 종래 또는 임상시험용 약물에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, DBD는 항종양 약물에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 폴리펩티드는 다수의 DBD를 포함한다.
임의의 실시형태에서, DBD는 치료제에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 치료제는 생물학적으로 활성인 단백질이다. 적당한 단백질로는 의학, 농업 및 기타 다른 과학 및 산업 분야에서 관심의 것들, 특히 예를 들어 에리스로포이에틴, 인터페론, 인슐린, 단클론 항체, 혈액 인자, 콜로니 자극 인자, 성장 호르몬, 인터루킨, 성장 인자, 치료용 백신, 칼시토닌, 종양 괴사 인자(TNF), 및 효소와 같은 치료용 단백질을 포함한다. 이와 같은 치료용 단백질의 구체적인 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 대체 요법에서 이용되는 효소; 동물에서의 성장, 또는 세포 배양에서의 세포 성장을 촉진하는 호르몬; 및 다양한 적용, 예컨대 생명공학 또는 의학 진단에서 사용되는 활성 단백질계 물질을 포함한다. 구체적인 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 과산화물제거효소, 인터페론, 아스파라기나제, 글루타마제, 아르기나제, 아르기닌 디아미나제, 아데노신 디아미나제 리보뉴클레아제, 트립신, 크로모트립신, 파핀(papin), 인슐린, 칼시토닌, ACTH, 글루카곤, 소마토신, 소마트로핀, 소마토메딘, 부갑상선 호르몬, 에리스로포이에틴, 시상하부 방출 인자, 프로락틴, 갑상선 자극 호르몬, 엔도르핀, 엔케팔린, 및 바소프레신을 포함한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, DBD는 치료용 폴리펩티드 도메인을 포함한다. 본 발명의 임의의 측면에서, DBD는 ELP 도메인에 화학적으로 접합될 수 있지만, 임의의 경우에서 ELP 및 치료용 폴리펩티드 도메인은 융합 단백질에 포함될 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 치료용 폴리펩티드는 이에 제한되는 것은 아니지만 사이토카인, 케모카인, 혈관형성 인자, 항혈관형성 인자를 포함한다. 몇몇 구체적인 예에서, 치료용 폴리펩티드는 인터페론(IFN), 종양 괴사 인자(TNF), HIF-1, 혈관 내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), NF-kB 억제 서열, 컨센서스 인터페론 서열, 인터루킨(IL)-2, IL-12, IL-4, IL-8 또는 단일 사슬 항체 서열(scFv) 예를 들어 VEGF 특이적 scFv일 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에서, 치료용 폴리펩티드는 수용체 단백질, 예를 들어 VEGF 수용체(VEGFR)-1(Flt-1), VEGFR-2(Flk-1/KDR) 또는 VEGFR-3의 세포 밖 도메인을 포함할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 제제는 진단용 또는 영상화 제제이다. 본 발명은 영상화 또는 치료를 위하여 정확한 표적화가 가능하게 한다. 용어 "영상화 제제"는 포유동물에서 특정 생리학 또는 병태생리학을 표적화하도록 설계된 화합물을 의미하며, 이는 생체내 또는 시험관내에서 투여 후에 검출될 수 있다. 영상화 제제의 비제한적인 예는 형광 표지이다. 기타 다른 표지는 당업계에 잘 알려져 있다.
임의의 실시형태에서, DBD는 핵산 결합 부(moiety)를 포함한다. 임의의 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 핵산에 결합하는 양이온성 도메인을 포함하는 DBD 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산은 siRNA 분자이다. 다른 실시형태에서, 약물 제제는 siRNA 분자이다.
6. 핵산 결합 도메인( NBD )
본 발명의 임의의 측면에서, 폴리펩티드는 핵산 결합 도메인(NBD)를 포함한다. 임의의 실시형태에서, 폴리펩티드는 DBD와 NBD를 둘 다 포함한다. 몇몇 실시형태에서, DBD와 NBD는 둘 다 핵산에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, NBD는 siRNA 결합 도메인을 포함한다. 임의의 경우에서, NBD는, 예를 들어 공유적인 화학 접합을 통해 ELP에 접합될 수 있다. 폴리펩티드의 NBD 및 나머지 도메인은 스페이서 펩티드에 의해 분리될 수 있다. 몇몇 다른 경우에서, NBD를 포함하는 폴리펩티드는 NBD, AD 및 CTD를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
당업계에 알려진 임의의 핵산 결합 폴리펩티드는 본 발명의 NBD에 대하여 사용될 수 있다. 예를 들어, NBD는 특이적인 핵산 서열, 예를 들어 철 조절 단백질(IRP) 1 또는 2의 RNA 결합 도메인에 결합할 수 있다. 임의이 추가적인 경우에서, NBD는 핵산 비특이적으로, 예를 들어 양이온성 잔기가 풍부한 아미노산 중합체에 결합할 수 있다. 예를 들어, NBD는 생리적인 pH에서 양으로 하전된 잔기, 예를 들어 리신이 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 포함될 수 있다. 임의의 예에서, NBD는 아미노산 서열 VK 또는 VKG의 반복단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열은 4 내지 100개의 VK 또는 VKG 반복단위 또는 이의 혼합물, 예를 들어 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96 또는 100개의 VK 또는 VKG 반복단위가 있는 핵산 결합 도메인을 가질 수 있다. 따라서, GA와 같은 약물은 본 발명에 따라서 NBD와 복합화될 수 있다.
임의의 실시형태에서, NBD는 올리고리신 도메인을 포함하며, 이는 순차적인 순서로 다수의 리신 잔기를 포함한다. 올리고리신 도메인은 핵산에 결합한다. 임의의 실시형태에서, NBD는 아미노산 서열(Kn)을 포함하며, 여기에서 n은 4 초과의 정수이다. 바람직한 실시형태에서, n은 8이다. 특정 실시형태에서, NBD는 아미노산 서열(K8)(서열번호 58)을 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 올리고리신 도메인은 아미노산 서열 Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-(K8; 서열번호 58)을 포함한다.
다른 실시형태에서, NBD는 올리고아르기닌 도메인을 포함하며, 이는 순차적인 순서로 다수의 아르기닌 잔기를 포함한다. 임의의 실시형태에서, NBD는 아미노산 서열(Rn)을 포함하며, 여기에서 n은 4 초과의 정수이다. 특정 실시형태에서, n은 9(R9; 서열번호 59)이다.
특정 실시형태에서, 분리된 폴리펩티드는 올리고리신(K8) 또는 올리고아르기닌(R9) 및 60개의 반복 펜타펩티드 단위가 있는 ELP 블록((Val-Pro-Gly-X-Gly)60 또는 (VPGXG)60로 표현되며, 여기에서 X는 5:2:3 비율의 Val, Ala 및 Gly임)으로 구성된다.
특정 실시형태에서, 약물 제제는 siRNA 분자를 포함한다. 임의의 실시형태에서, 약물 제제는 발암유전자로부터 발현된 RNA의 부분을 인식하는 서열이 있는 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 약물 제제는 EVI1 유전자로부터 발현된 RNA의 부분을 인식하는 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함한다. 세포 내 EVI1의 발현의 억제는 세포의 분열의 차단 및/또는 아포토시스의 활성화를 일으킨다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 뉴클레오티드는 EVI1 유전자 서열에 상보성인 ?슨-크릭 서열에 의해 결합하여 자체의 발현을 차단한다. 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA수준에서 EVI1 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오티드는 RNA 가공 메커니즘와 관련하여 EVI1의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)일 수 있다. 이러한 dsRNA는 대략 20개 염기쌍의 작은 간섭 RNA(siRNA)일 수 있다.
임의의 실시형태에서, 본 출원은 이중 가닥 RNA(dsRNA) 및 RNAi 작제물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "dsRNA"는 RNA 간섭(RNAi)이 가능한 이중 가닥 RNA분자, 예를 들어 siRNA를 말한다. 추가적으로, RNAi는, 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 특이적인 후전사 방식으로 유전자 발현을 차단하는 식물 및 벌레에서 관찰되는 현상에 처음 적용되는 용어이다. RNAi는 시험관내 또는 생체내에서 유전자 발현을 억제하거나 감소시키는 유용한 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "짧은 간섭 RNA", "siRNA" 또는 "짧은 간섭 핵산"은 세포에 의해 적절하게 가공될 때 침묵하는 RNAi 또는 유전자를 매개할 수 있는 임의의 핵산을 말한다. 예를 들어, siRNA는 자기 상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자일 수 있는데, 여기에서 안티센스 영역은 표적 유전자에 대한 상보성을 포함한다. siRNA는 자기 상보성 센스 및 안티센스 영역을 가지는 단일 가닥 헤어핀 폴리뉴클레오티드일 수 있는데, 여기에서 안티센스 영역은 표적 유전자에 대한 상보성을 포함한다. siRNA는 자기 상보성 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 줄기 및 2개 이상의 루프 구조를 가지는 원형의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있는데, 여기에서 안티센스 영역은 표적 유전자에 대한 상보성을 포함하며, 원형의 폴리뉴클레오티드는 생체내 또는 시험관내에서 가공되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siRNA를 생성할 수 있다. 또한 siRNA는 표적 유전자에 대한 상보성을 가지는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 여기에서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 말단 인산기, 예를 들어 5'-인산염, 또는 5',3'-이인삼염을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, siRNA는 표적 핵산에 결합하는 비효소적 핵산이며 표적 핵산의 활성을 변경시킨다. siRNA의 결합 및/또는 활성은 하나 이상의 단백질 또는 단백질 복합체, 예를 들어 RNA 유도 침묵 복합체(RNA Induced Silencing Complex, 또는 RISC)와의 상호작용에 의해 용이하게 될 수 있다. 임의의 실시형태에서, siRNA는 siRNA분자의 하나의 가닥의 단일 인접 서열을 따라 표적 서열에 대한 상보적인 서열을 포함한다.
선택적으로, 본 출원의 siRNA는 생리적 조건 하에서(예컨대, 세포 환경에서) 억제될 유전자("표적" 유전자)에 대한 mRNA 전사체의 적어도 일부분의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이중 가닥 RNA는 단지 RNAi를 매개하는 능력을 가지는 천연 RNA와 충분히 유사할 것을 필요로 한다. 따라서, 본 출원은 유전적 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화적 분기로 인하여 예상될 수 있는 서열 변화를 용인할 수 있는 이점을 가진다. 표적 서열 및 siRNA 서열 사이의 용인된 뉴클레오티드 불일치의 수는 5개 염기쌍에서 1개 이하, 또는 10개 염기쌍에서 1개 이하, 또는 20개 염기쌍에서 1개 이하, 또는 50개 염기쌍에서 1개 이하이다. siRNA 이중나선의 중심에서의 불일치는 매우 중요하며 표적 RNA의 절단을 본질적으로 없앨 수 있다. 그에 반해서, 표적 RNA에 대하여 상보성인 siRNA 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오티드는 표적 인식의 특이성에 상당하게 영향을 주지 않는다. 서열 동일성은 당업계에 알려진 서열 비교 및 정렬 알고리즘, 및 예를 들어 디폴트 매개변수를 사용하여 베스트피트(BESTFIT) 소프트웨어 프로그램에서 실행되는 바와 같이 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘에 의해 뉴클레오티드 서열 사이의 차이 백분율을 계산함으로써 최대화될 수 있다. siRNA와 표적 유전자의 일부분 사이에서의 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과 서열 동일성, 또는 심지어 100% 서열 동일성이 바람직하다. 대안적으로, RNA의 이중나선 영역은 엄격한 조건(예컨대, 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 12~16시간 동안의 50℃ 또는 70℃ 혼성화; 이후 세척) 하에서 표적 유전자 전사체의 일부분과 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열로서 기능적으로 한정될 수 있다.
dsRNA의 이중 가닥 구조는 단일 자기 상보성 RNA 가닥, 2개의 상보성 RNA 가닥, 또는 DNA 가닥 및 상보성 RNA 가닥에 의해 형성될 수 있다. 선택적으로, RNA 이중나선 형성은 세포 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다. RNA는 세포당 적어도 하나의 복사체의 전달을 가능하게 하는 양으로 도입될 수 있다. 이중 가닥 물질의 더 높은 용량(예컨대, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000개 복사체)은 더 효과적인 억제를 가져오는 반면, 더 낮은 용량은 또한 특정 적용에 유용할 수 있다. RNA의 이중나선 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열이 억제를 위하여 표적화된다는 점에서 억제는 서열 특이적이다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 개체 siRNA는 길이가 약 19 내지 30개 뉴클레오티드, 길이가 약 21 내지 27개 뉴클레오티드, 길이가 약 21 내지 25개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 21 내지 23개 뉴클레오티드인 이중나선 영역을 포함한다. siRNA는 뉴클레아제 복합체를 보충하며 특이적인 서열과 쌍을 형성함으로써 표적 유전자 전사체에 대한 복합체를 안내하는 것으로 이해된다. 결과적으로, 표적 유전자 전사체는 단백질 복합체에서 뉴클레아제에 의해 분해된다. 임의의 실시형태에서, siRNA 분자는 3' 수산기를 포함한다. 임의의 실시형태에서, siRNA 작제물은, 예를 들어 효소 다이서의 존재 하에서 더 긴 이중 가닥 RNA의 가공에 의해 생성될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 시험관내 시스템에서 초파리가 사용된다. 이러한 실시형태에서, dsRNA는 초파리 배아로부터 유래한 가용성 추출물과 합쳐지고, 이에 의하여 조합물을 생성한다. 조합물은 dsRNA가 약 21 내지 약 27개 뉴클레오티드의 RNA 분자로 가공되는 조건 하에서 유지된다. siRNA 분자는 당업자에게 알려진 다수의 기법을 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동은 siRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 비변성 방법, 예를 들어 비변성 컬럼 크로마토그래피는 siRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 크로마토그래피(예컨대, 크기 배제 크로마토그래피), 글리세롤 구배 원심분리법, 항체를 이용한 친화력 정제가 siRNA를 정제하는데 사용될 수 있다.
개체 dsRNA(예컨대, siRNA)의 생성은 화학적 합성 방법 또는 재조합 핵산 기법에 의해 수행될 수 있다. 처치되는 세포의 내인성 RNA 중합효소는 생체내 전사를 매개할 수 있거나, 클로닝된 RNA 중합효소는 시험관내 전사에 대하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 본 출원의 dsRNA 또는 siRNA 분자는 단지 RNA를 포함하는 분자로 제한될 필요는 없지만, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 예를 들어, dsRNA는 인산염-당 골격 또는 뉴클레오시드에 대한 변형을 포함하여, 예컨대 세포 뉴클레아제에 대한 민감성을 감소시키고, 생물학적 이용 가능성을 개선시키고, 제형 특징을 개선시키고/개선시키거나 기타 다른 약동학 특성을 변경시킬 수 있다. 예시를 위하여, 천연 RNA의 인산다이에스터 연결은 변형되어 적어도 하나의 질소 또는 황 헤테로원자를 포함할 수 있다. RNA 구조에서의 변형은 dsRNA에 대한 일반적인 반응을 피하면서 특이적인 유전적 억제를 가능하게 하도록 조정될 수 있다. 마찬가지로, 염기는 아데노신 디아미나제의 활성을 차단하도록 변형될 수 있다. dsRNA는 효소적으로 또는 부분적/전체적 유기 합성에 의해 생성될 수 있으며, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 시험관내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. RNA 분자를 화학적으로 변형하는 방법은 dsRNA를 변형하기 위해 조정될 수 있다. 단지 예시하기 위하여, dsRNA 또는 siRNA의 골격은 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 포스포다이티오에이트, 키메라 메틸포스포네이트-포스포다이에스터, 펩티드 핵산, 5-프로피닐-피리미딘 함유 올리고머 또는 당 변형(예컨대, 2'-치환 리보뉴클레오시드, a-배열)으로 변형될 수 있다. 임의의 경우에, 본 출원의 dsRNA는 뉴클레오타이드를 함유하는 2'-하이드록시 (2'-OH)가 없다. 임의의 실시형태에서, siRNA 분자는 포스포로티오에이트 센스 가닥을 포함한다. 임의의 실시형태에서, siRNA 분자는 포스포다이에스터 안티센스 가닥을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, siRNA 분자의 적어도 하나의 가닥은 길이가 약 1 내지 약 10개 뉴클레오티드, 길이가 약 1 내지 5개 뉴클레오티드, 길이가 약 1 내지 3개 뉴클레오티드, 길이가 약 2 내지 4개 뉴클레오티드인 3' 돌출부(overhang)를 가진다. 임의의 실시형태에서, siRNA는 3' 돌출부를 가지는 하나의 가닥을 포함할 수 있으며, 나머지 가닥은 3' 말단에 평활 말단(blunt-ended)이 있다(예컨대, 3' 돌출부를 가지지 않는다). 다른 실시형태에서, siRNA는 양쪽 가닥 상에 3' 돌출부를 포함할 수 있다. 돌출부의 길이는 각각의 가닥에 대하여 동일하거나 상이할 수 있다. siRNA의 안정성을 추가로 향상시키기 위하여, 3' 돌출부는 분해에 대하여 안정화될 수 있다. 하나의 실시형태에서, RNA는 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함하는 것에 의하여 안정화된다. 대안적으로, 피리미딘 유클레오티드의 변형된 유사체에 의한 치환, 예컨대 2'-데옥시티미딘에 의핸 우리딘 뉴클레오티드 3' 돌출부의 치환은 용인되고 RNAi의 효율에 영향을 미치지 않는다. 2' 수산기의 부재는 조직 배양 배지에서 돌출부의 뉴클레아제 저항성을 상당히 향상시키며 생체내에서 유익할 수 있다.
다른 구체적인 실시형태에서, 개체 dsRNA는 또한 긴 이중가닥 RNA의 형태일 수 있다. 예를 들어, dsRNA는 적어도 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개 염기이다. 몇몇 경우에서, dsRNA는 길이가 400 내지 800개 염기이다. 선택적으로, dsRNA는 세포 내에서 소화되어, 예컨대 세포에서 siRNA 서열을 생성한다. 그러나, 생체내 긴 이중 가닥 RNA의 사용은 항상 현실적인 것은 아니며, 그 이유는 아마도 서열 독립적인 dsRNA 반응에 의해 일어날 수 있는 유해한 영향 때문이다. 이와 같은 실시형태에서, 인터페론 또는 PKR의 영향을 감소시키는 국소적 전달 시스템 및/또는 제제의 사용이 바람직하다.
추가의 구체적인 실시형태에서, dsRNA 또는 siRNA는 짧은 헤어핀 구조(shRNA)의 형태이다. shRNA는 외인성으로 합성될 수 있거나 생체 내에서 RNA 중합효소 III 프로모터로부터 전사함으로써 형성될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같은 shRNA는 세포 또는 동물에서 조작되어 표적 유전자의 지속적이고 안정적인 억제를 보장한다. siRNA가 세포 내 헤어핀 RNA를 가공함으로써 제조될 수 있음은 당업계에 알려져 있다.
임의의 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 약물 제제는 짧은 간섭 RNA(siRNA)의 종이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 예를 들어 문헌[Bass, 2001, Nature 411:428-429; Elbashir et al, 2001, Nature 411:494-498; 및 Kreutzer et al., 국제 PCT 공개 제WO 00/44895호; Zernicka-Goetz et al., 국제 PCT 공개 제WO 01/36646호; Fire, 국제 PCT 공개 제WO 99/32619호; Plaetinck et al., 국제 PCT 공개 제WO 00/01846호; Mello and Fire, 국제 PCT 공개 제WO 01/29058호; Deschamps-Depaillette, 국제 PCT 공개 제WO 99/07409호; 및 Li et al., 국제 PCT 공개 제WO 00/44914호]에 개시된 바와 같이 RNA 간섭 또는 "RNAi"를 가능하게 하는 이중 가닥 핵산 분자를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 siRNA 분자는 단지 RNA를 포함하는 분자로 제한될 필요는 없지만, RNAi 능력 또는 활성을 가지는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
RNA 간섭은 짧은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 매개되는 동물에서 침묵하는 서열 특이적인 후전사 유전자의 공정을 말한다(Fire et al., 1998, Nature 391:806). 세포 내 긴 dsRNA의 존재는 "다이서"로서 지칭되는 리보뉴클레아제 III 효소의 활성을 자극한다. 다이서는 긴 dsRNA의 siRNA로의 가공에 수반되며, siRNA는 dsRNA의 짧은 부분이다(Berstein et al., 2001, Nature 409:363). 다이서 활성으로부터 유래하는 짧은 간섭 RNA는 전형적으로 길이가 약 21 내지 23개 뉴클레오티드이며 약 19개 염기쌍 이중나선을 포함한다. 다이서는 또한 번역 제어에 연루된 보존된 구조의 전구체 RNA로부터 21 및 22개 뉴클레오티드의 작은 일시적 RNA(small temporal RNA; stRNA)의 절제에 연루되었다(Hutvagner et al., 2001, Science 293:834). RNAi 반응은 또한, 일반적으로 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)로 지칭되는 siRNA를 포함하는 엔도뉴클레아제 복합체를 특징으로 하며, 이는 siRNA와 상동성인 서열을 가지는 단일 가닥 RNA의 절단을 매개한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 이중나선의 가이드 서열에 대하여 상보성인 영역의 중간에서 일어난다(Elbashir et al., 2001, Genes Dev. 15:188).
짧은 간섭 RNA 매개 RNAi는 다양한 시스템에서 연구되어 왔다. Fire 등은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 RNAi를 처음 관찰하였다(1998, Nature 391:806). Wianny 및 Goetz는 마우스 배아에서 dsRNA에 의해 매개된 RNAi를 기술하였다(1999, Nature Cell Biol. 2:70). Hammond 등은 dsRNA로 형질감염된 초파리 세포에서의 RNAi를 기술하였다(2000, Nature 404:293). Elbashir 등은 배양된 포유동물 세포, 예를 들어 인간 배아 신장 및 HeLa 세포에서의 합성 21-뉴클레오티드 RNA의 이중나선의 도입에 의해 도입된 RNAi를 기술하였다(2001, Nature 411:494).
초파리 배아 용해물에 있어서의 최근 연구는 효율적인 RNAi 활성을 매개하는데 필수적인 siRNA 길이, 구조, 화학 조성, 및 서열에 대한 임의의 필요요건을 밝혔다. 이러한 연구는, 2개의 뉴클레오티드 3'-돌출부를 포함할 경우 21개 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 이중나선이 가장 활성적임을 나타내었다. 또한, siRNA 가닥의 하나 또는 둘 다의 2'-데옥시 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드로의 치환은 RNAi 활성을 없애는 반면, 3'-말단 siRNA 뉴클레오티드의 데옥시 뉴클레오티드로의 치환은 용인되는 것으로 나타났다. siRNA 이중나선의 중심에서 불일치 서열은 또한 RNAi 활성을 없애는 것으로 나타났다. 추가적으로, 이들 연구는 또한 표적 RNA에서 절단 부위의 위치가 3'-말단보다 siRNA 가이드 서열의 5'-말단에 의해 한정됨을 나타낸다(Elbashir et al., 2001, EMBO J. 20:6877). 기타 다른 연구는 siRNA 이중나선의 표적-상보성 가닥 상 5'인산염은 siRNA 활성에 필요하며, ATP는 세포 내에서 이용되어 siRNA 상의 S'-인산염 부를 유지함을 나타내었다(Nykanen et al., 2001, Cell 107:309). 그러나, 외인성으로 도입될 때 5'-인산염이 없는 siRNA 분자는 활성이며, 이는 siRNA 작제물의 5'-인산화는 생체내에서 일어날 수 있다.
본 발명의 약물 제제는 자기 상보성 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자일 수 있는 한편, 안티센스 영역은 뉴클레오티드 서열의 일부분에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하고 센스 영역은 핵산 서열 또는 이의 일부분에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. siRNA 분자는 2개의 분리된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있는데, 하나의 가닥은 센스 가닥이고 다른 하나의 가닥은 안티센스 가닥이며, 여기에서 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 자기 상보성이다. siRNA는 또한 핵산 기반 또는 비핵산 기반 링커에 의해 연결된 자기 상보성인 센스 및 안티센스 영역을 가지는 단일 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다. siRNA 분자는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 실질적으로 대칭적인 이중나선, 비대칭적인 이중나선, 헤어핀, 또는 비대칭적인 헤어핀 2차 구조를 형성할 수 있다. siRNA 분자는 또한 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 가지는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 여기에서 안일 가닥 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 문헌[Martinez et al., 2002, Cell 110:563-574 및 Schwarz et al., 2002, Molecular: Cell 10:537-568]에 개시된 바와 같이 5',3'-이인산염 또는 5'-인산염과 같은 말단 인산기를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 본 발명에 따라서 siRNA 분자 및 기타 다른 약물 제제는 개체에의 투여를 위한 운반 수단, 예를 들어 리포좀 및 나노입자; 담체 및 희석제 및 이의 염을 포함할 수 있으며; 약학 조성물에 존재할 수 있다. 특히, siRNA는 본 발명에 따라서 ELP 나노입자와 관련하여 운반된다. 핵산 분자의 전달 방법은 예를 들어 문헌[Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio. 2:139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol. 16:129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol, 137:165-192; 및 Lee et al., 2000, ACS Symp . Ser. 752:184-192]에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다. Beigelman 등의 미국 특허 제6,395,713호 및 Sullivan 등의 PCT 제WO 94/02595호는 세포 및 조직으로의 핵산 분자의 전달을 위한 일반적인 방법을 추가로 기술한다. 이들 프로토콜은 세포로 사실상 임의의 핵산 분자의 전달을 위해 이용될 수 있다. 핵산 분자는 당업자에게 알려진 다양한 방법, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 리포좀 내 캡슐화, 이온토포레시스에 의해, 또는 기타 다른 전달 수단, 예를 들어 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생접착성 마이크로스피어로의 통합에 의해, 또는 단백질 벡터(예를 들어, O'Hare and Normand, 국제 PCT 공개 제WO 00/53722호 참조)에 의해 세포로 투여될 수 있다.
대안적으로, 핵산/운반 수단 조합은 직접적인 주사 또는 주입 펌프에 의해 국소적으로 전달될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자의 직접적인 주사는 피하, 근육내, 또는 피내인지와 상관없이 표준 바늘 및 주사기 방법을 사용하여, 또는 무바늘 방법, 예를 들어 문헌[Corny et al., 1999, Clin. Cancer Res. 5:2330-2337 및 Barry et al., 국제 PCT 공개 제WO 99/31262호]에 기술된 방법에 의해 일어날 수 있다. 당업계에서의 많은 예는 삼투 펌프(문헌[Chun et al., 1998, Neuroscience Letters 257:135-138, D'Aldin et al., 1998, Mol. Brain Research 55:151-164, Dryden et al., 1998, J. Endocrinol. 157:169-175, Ghirnikar et al., 1998, Neuroscience Letters 247:21-24] 참조), 또는 직접적인 주입(Broaddus et al., 1997, Neurosurg. Focus 3, article 4)에 의한 올리고뉴클레오티드의 전달 방법을 기술한다. 기타 다른 전달 경로는 이에 제한되는 것은 아니지만 경구 전달(예를 들어 정제 또는 환제 형태) 및/또는 척추 강내 전달(Gold, 1997, Neuroscience 76:1153-1158)을 포함한다. 핵산 전달 및 투여의 보다 상세한 기술은 문헌[Sullivan 등의 PCT 제WO 94/02595호, Draper 등의 PCT 제W093/23569호, Beigelman 등의 PCT 제WO99/05094호, 및 Klimuk 등의 PCT 제WO99/04819호]에 제공되어 있으며, 상기 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 진핵생물의 프로모터로부터 세포 내에서 발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Izant and Weintraub, 1985, Science 229:345; McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:399; Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev. 2:3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol. 66:1432-41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol. 65:5531-4; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:4581-9; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:2259; Good et al., 1997, Gene Therapy 4:45] 참조). 당업자는 임의의 핵산이 적절한 DNA/RNA 벡터를 사용하여 진핵 세포에서 발현될 수 있음을 인식할 것이다. 이와 같은 핵산의 활성은 효소적 핵산에 의한 1차 전사체로부터의 방출에 의해 증가될 수 있다(Draper 등의 PCT 제WO 93/23569호, 및 Sullivan 등의 PCT 제WO 94/02595호; Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser. 27:15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21:3249-55; Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:25856).
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 DNA 또는 RNA 벡터로 삽입되는 전사 단위(예를 들어, 문헌[Couture et al., 1996, TIG 12:510] 참조)로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터를 발현하는 siRNA는 이에 제한되는 것은 아니지만 아데노연관바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 알파바이러스에 기초하여 구성될 수 있다. 다른 실시형태에서, pol III 기반 작제물은 본 발명의 핵산 분자를 발현하는데 사용된다(예를 들어, Thompson의 미국 특허 제5,902,880호 및 제6,146,886호 참조). siRNA 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 상기 기술된 바와 같이 전달될 수 있으며, 표적 세포에서 계속될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자의 일시적인 발현을 제공하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이와 같은 벡터는 필요에 따라 반복적으로 투여될 수 있다. 일단 발현되면, siRNA 분자는 표적 mRNA와 상호작용하여 RNAi 반응을 생성한다. 벡터를 발현하는 siRNA 분자의 전달은, 예를 들어 정맥내 또는 근육내 투여에 의한, 개체로부터 외식된 표적 세포로의 투여 후 개체로의 재도입에 의한, 또는 원하는 표적 세포로의 도입을 가능하게 할 임의의 기타 다른 수단에 의한 침투성일 수 있다(검토를 위하여, 문헌[Couture et al., 1996, TIG. 12:510] 참조).
다른 측면에서, 본 발명은, a) 전사 개시 영역(예컨대, 진핵생물 pol I, II 또는 III 개시 영역); b) 전사 종결 영역(예컨대, 진핵생물 pol I, II 또는 III 종결 영역); 및 c) 본 발명의 siRNA 분자의 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공하는데, 여기에서 상기 서열은 siRNA 분자의 발현 및/또는 전달을 가능하게 하는 방식으로 상기 개시 영역 및 상기 종결 영역에 작동적으로 연결된다. 벡터는 선택적으로 본 발명의 siRNA를 암호화하는 서열의 5' 측면 또는 3'-측면 상에서 작동적으로 연결된 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF); 및/또는 인트론(개재 서열)을 포함할 수 있다.
siRNA 분자의 전사는 진핵 RNA 중합효소 I(pol I), RNA 중합효소 II(pol II), 또는 RNA 중합효소 III(pol III)에 대한 프로모터로부터 구동될 수 있다. pol II 또는 pol III 프로모터로부터의 전사체는 모든 세포에서 높은 수준으로 발현되며; 주어진 세포 유형에서 주어진 pol II 프로모터의 수준은 근처에 존재하는 유전자 조절 서열(인핸서, 사일렌서(silencer) 등)의 성질에 따라 다르다. 원핵생물 RNA 중합효소가 적절한 세포에서 발현된다면, 원핵생물 RNA 중합효소 프로모터가 또한 사용된다(Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6743-7; Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res. 21:2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol. 217:47-66; Zhou et al., 1990, Mol Cell Biol. 10:4529-37). 여러 연구자들은 이와 같은 프로모터로부터 발현된 핵산 분자가 포유동물 세포에서 작용할 수 있음을 입증하였다(예컨대, Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev. 2:3-15; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:4581-9; Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J. 11:4411-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 90:8000-4; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:2259; Sullenger and Cech, 1993, Science 262: 1566). 보다 구체적으로, U6 소형 핵(snRNA), 운반 RNA(tRNA) 및 아데노바이러스 VA RNA를 암호화하는 유전자로부터 유래된 것과 같은 전사 단위는 세포 내 siRNA와 같은 원하는 RNA 분자의 고농도를 생성하는데 있어서 유용하다(Thompson et al., 1995, Nucleic Acids. Res. 23:2259; Couture et al., 1996, TIG 12:510, Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res. 22:2830; Noonberg et al., 미국 특허 제5,624,803호; Good et al., 1997, Gene Ther. 4:45; Beigelman et al., 국제 PCT 공개 제WO 96/18736호). 상기 siRNA 전사 단위는 포유동물 세포로의 도입을 위해 다양한 벡터, 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니지만 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 또는 아데노연관 바이러스 벡터), 또는 바이러스 RNA 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 또는 알파바이러스 벡터)로 통합될 수 있다(검토를 위하여, 문헌[Couture et al., 1996, TIG 12:510] 참조).
본 발명의 실시에 유용한 발현 벡터로는 헤어핀 루프를 포함하는 siRNA 분자의 발현을 가능하게 하는 방식으로 작은 뉴클레오티드 스페이서 서열에 의해 분리되는 siRNA 분자의 2개의 상보성 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 a) 전사 개시 영역; b) 전사 종결 영역; 및 c) 작은 뉴클레오티드 스페이서 서열에 의해 분리되는 2개의 상보성 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는데; 여기에서 서열은 작은 헤어핀 루프를 포함하는 siRNA 분자의 발현 및/또는 전달을 가능하게 하는 방식으로 개시 영역 및 종결 영역에 작동가능하게 연결된다.
임의의 실시형태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 애주번트와 함께 본 명세서에서 제공되는 바와 같이 치료적 유효량의 폴리펩티드, 나노입자 또는 약물 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특히, siRNA 및 기타 다른 약물 제제는 본 발명에 따른 ELP 나노입자와 함께 전달된다.
허용가능한 제형 물질은 바람직하게 이용되는 투여량 및 농도로 수용자에게 비독성이다. 약학 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 삼투질 농도, 점성, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해율 또는 방출률, 흡착 또는 침투성을 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함할 수 있다. 적당한 제형 물질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제(예를 들어, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 기타 다른 유기산); 팽화제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 단당류, 이당류, 및 기타 다른 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 착향제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온(예를 들어, 나트륨); 방부제(예를 들어, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르빈산 또는 과산화수소); 용매(예를 들어, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜); 당알코올(예를 들어, 만니톨 또는 솔비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제(예를 들어, 플루로닉(pluronic) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 솔비탄에스터, 폴리솔베이트(polysorbate), 예를 들어, 폴리솔베이트 20 및 폴리솔베이트 80, 트리톤(Triton), 트라이메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 또는 틸록사팔(tyloxapal)); 안정성 향상제(예를 들어, 수크로스 또는 솔비톨); 긴장성 향상제(tonicity enhancing agent)(예를 들어, 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨, 또는 솔비톨); 운반 수단; 희석제; 부형제 및/또는 약학 애주번트를 포함한다. 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.sup.th Edition, (A. R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company]을 참조한다.
7. 나노입자
다른 측면에서, 본 발명은 조립 도메인(AD) 및 세포 표적화 도메인(CTD)뿐만 아니라 핵산-결합 도메인(NBD), 및/또는 약물 결합 도메인(DBD)을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 나노입자를 기술한다. 임의의 실시형태에서, 나노입자는 약물 제제를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 siRNA 분자를 추가로 포함한다.
나노입자는 전형적으로 뉴클레오티드 또는 약물 제제를 잡아매고 혈액 중 분자를 안정화시키는 셸 구조에 화학적으로 기반을 둔다. 나노입자는 종종 당, 엑스트란, 인산칼슘, 키노산, 펩티드 및/또는 플라스틱 중합체를 포함한다. 암 약물 전달을 위한 약물 제제-부하 나노입자는 바람직하게 다음의 특성을 가진다: 1) 수율과 순도가 높은 몇 단계로 합성하기 용이함; 2) 크기가 100㎚ 미만인 단분산 약물-부하 나노입자로 조립함; 3) 다양한 약물의 캡슐화를 가능하게 함; 4) 유리한 약동학 및 종양 축적을 나타냄; 5) 반응속도론이 제어되고 조정가능한 약물을 방출; 6) 치료 반응을 일으킴; 7) 비독성 성분으로 분해되어 불리한 독성이 없이 신체로부터의 소거를 가능하게 함. 수많은 상이한 나노규모 전달 시스템이 암 치료법에 대하여 제안되었지만, 대부분은 이들 기준을 만족하지 않으며, 이는 임상적인 실시로 이러한 시스템을 이동시키는 것이 중요하다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 약물 부착시 거의 단분산이고 100㎚ 미만 크기의 나노입자로 조립하는 폴리펩티드 나노입자의 첫번째 예를 기술하며, 상기 폴리펩티드 나노입자는 생분해성이고, 표적화 펩티드를 사용하여 종양 세포로 siRNA를 전달함으로써 뮤린 종양 모델에서 양호한 약동학과 종양 축적, 낮은 독성, 생체내에서의 우수한 효험을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 siRNA, 올리고(리신)/siRNA(코어) 및 ELP/항-수용체 펩티드(셸)와 혼합시 코어-셸 나노임자를 형성할 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 용액 중에서 용이하게 조립되며 나노입자를 형성한다. 용어 "조립"은 입자가 형성되도록 일괄해서 함께 합치거나 수집하는 것으로 한정된다. 용액은 임의의 유형일 수 있다. 용액은 수성일 수 있다. 본 발명의 ELP 폴리펩티드는 가역적인 역 온도 전이를 겪는다: 상기 ELP 폴리펩티드가 전이 온도(Tt) 미만에서 구조적으로 고르지 않게 되고 수 중에서 매우 가용성이지만, 온도가 Tt 초과로 상승될 경우 날카로운(2 내지 3도) 무질서에서 질서로의 상 전이를 나타내며, 이는 폴리펩티드의 탈용매화 및 조립으로 이어진다. 충분한 크기에 도달할 경우 ELP 조립체는 원심분리에 의해 용액으로부터 용이하게 제거되고 분리될 수 있다. 중요하게도, 이와 같은 상 전이는 가역적이며, 온도가 ELP의 Tt 미만으로 되돌아갈 경우, 분리된 ELP 조립체는 완충 용액에서 완전히 재가용화될 수 있다.
조립에 의해 제조된 본 발명의 나노입자는 블록 반복단위(약 50 내지 100㎚)의 수에 따라서, 서브유닛을 한정된 크기의 미셀로 조직화 시킨다(도 2). 예를 들어 세포 표적화 리간드를 포함하는 상이한 도메인 서열이 ELP를 제조하는데 사용되는 플라스미드 벡터로 용이하게 클로닝될 수 있다는 점에서, 나노입자 폴리펩티드의 모듈식 성질은 현행 리포좀 또는 나노입자 약물 전달 시스템에 대하여 유연성의 이점을 제공한다.
임의의 실시형태에서, 나노입자는 단일 폴리펩티드를 포함한다. 이는 자신의 AD(분자내 조립체)와 상호작용하는 단일 폴리펩티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 복수의 펩티드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 폴리펩티드의 AD는 상이한 폴리펩티드의 AD 도메인(분자간 조립체)과 상호작용한다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 키메라이다.
본 발명의 몇몇 추가 측면에서, 나노입자는 본 발명의 폴리펩티드와 복합화하는 치료용 약물을 포함하는데, NBD는 핵산과 복합화된다. 예를 들어, 본 발명의 나노입자는 치료용 핵산과 복합화되는 NBD를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 나노입자는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 나노입자에 사용될 수 있는 핵산은 이에 제한되는 것은 아니지만 DNA 발현 벡터, RNA 발현 벡터, siRNA, miRNA, 앱타머 및 리보자임을 포함한다. 나노입자 핵산은 몇몇 경우에서 유전자 치료에 사용될 수 있는 치료용 핵산일 수 있다. 예를 들어, 치료용 핵산은 암 세포에서 아토포시스를 유도할 수 있거나 돌연변이 유전자의 기능을 회복하여 유전 장애를 고칠 수 있다. 본 발명의 몇몇 측면에서 결합된 핵산을 포함하는 나노입자는 나노입자에 대하여 전이 온도 초과의 온도에서 결합된 핵산의 적어도 20, 30 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% 이상을 방출할 것임이 당업자에 의해 이해될 것이다.
또 추가의 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 핵산 분자와 혼합하는 단계를 포함하는 나노입자 제조 방법이 제공된다. 몇몇 경우에서, 가용성 나노입자는 세포를 핵산으로 감염시키는데 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 그러나, 본 발명의 임의의 측면에서, 나노입자는 세포를 감염시키기 위하여 불용성 형태로 전이될 수 있다. 나노입자는 세포를 나노입자와 접촉시키기 전 또는 후에 불용성 형태(즉, 응집체)로 전이될 수 있다. 몇몇 구체적인 경우에서, 나노입자는 열의 적용에 의해(즉, 나노입자의 온도를 증가시킴으로써)불용성 형태로 전이될 수 있다. 나노입자 제형은 문헌[Merisko-Liversidge, et al., Toxicol Pathol (2008) 36: 43]에 일반적으로 기술되어 있다.
임의의 실시형태에서, 나노입자는 약물 제제와 관련하여 크기가 100㎚ 미만이다. 수많은 연구가 이 크기 범위 내 대상체가 고체 종양 내에 축적되는 것을 나타내었으므로, 임상적으로 승인된 약물을 나노크기 운반 수단(10 내지 100㎚ 직경)으로 포장하는 것은 암 치료법에 대하여 특히 관심있는 것이다. 이는 향상된 투과도 및 보유(enhanced permeability and retention, EPR) 효과로 인하여 일어나는 것으로 생각되며, 이는 비정상적인 종양 혈액 및 림프 혈관 구조(lymphatic vasculature)로부터 생긴다.
본 발명은 ELP-나노입자로 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 실시형태는, (1) 뉴클레오티드 분자를 운반할 수 있고, (2) 종래의 화학요법제를 운반할 수 있거나 운반하지 않을 수 있고, (3) 특이적인 종양 유형을 표적화하거나 종양 전이를 차단하는 펩티드 분자를 수용할 수 있는 리포좀, 폴리덱스트란, 또는 기타 다른 중합체를 이용할 수 있다.
리포좀 조성물은 조직으로의 전달을 위한 추가적인 물질을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 실시형태에서, 지질 또는 리포좀이 혈구응집성 바이러스(HVJ)와 연관될 수 있다. 이는 세포막과의 융합을 용이하게 하고 리포좀-캡슐화 DNA의 세포 유입을 촉진하는 것으로 나타났다(Kanada et al;., 1989, Science 243: 375-378). 다른 예에서, 지질 또는 리포좀은 핵 비히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 함께 복합화되고 이용될 수 있다(Kato et al., 1991, J. Biol. Chem., 266:3361-3364). 또 다른 실시형태에서, 지질은 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 함께 복합화되거나 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 약물 제제는 혈액 순환에 있어서 약물 제제를 보호하고 표적화된 조직에서 약물 제제를 농축시킬 수 있는 리포좀 또는 나노입자에 캡슐화된다. 임의의 실시형태에서, 약물 제제는 뉴클레오티드이다. 리포좀은 뉴클레오티드를 둘러싸는 층을 형성하는 지질 표면 분자이다. 전형적으로, 양이온성 리포좀은 음으로 하전된 뉴클레오티드를 캡슐화하는데 사용된다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 추가적인 표적화 리간드는 약물 제제를 포함하는 리포좀 또는 나노입자와 연관되고, 이는 아포토시스 파괴에 대하여 지정된 종양 세포 상의 수용체를 표적화한다. 리포좀은 또한 폴리에틸렌글리콜로 코팅되어(즉, 페길화(PEGylated)되어)) 순환에 있어서 리포좀의 수명을 연장시킬 수 있다. 유사하게, 나노입자는 그렇게 코팅될 수 있다.
분자를 표적화하는 것은 표적 세포의 표면 상의 수용체에 특이적으로 결합하는 앱타머를 지칭하는 유기 화학적 링커일 수 있다. 앱타머는 나노입자의 리포좀 또는 중합체의 지질과 공유적으로 연결될 수 있다. 리포좀 또는 나노입자를 종양 세포에 대하여 표적화하는데 사용될 수 있는 기타 다른 분자는 종양 세포의 표면 상의 특이적인 수용체로 보내지는 펩티드, 단백질 또는 항체이다.
본 발명의 임의의 측면은 세포를 나노입자와 접촉시킴으로써 세포로 약물의 전달을 위한 방법에 관한 것이다. 이와 같은 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 핵산 운반을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 몇몇 경우에서, 본 발명의 나노입자는 인간에게 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학 조성물"은, 환자에게 적절하게 투여될 때 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 본 명세서에 기술된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제 및 화학적 화합물, 펩티드, 또는 조성물을 말한다.
용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 치료 반응을 생성하는 것으로 결정된 본 발명의 스크리닝 방법에서 확인된 본 발명의 약학 조성물 또는 화합물의 양을 말한다. 이와 같은 치료적 유효량은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 당업자에게 용이하게 확인된다.
본 명세서에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 (즉, 조성물에서 임의의 다른 개별 종보다 풍부한 몰 농도에 근거하여) 우세하게 존재하는 종인 대상 종을 의미한다. 임의의 실시형태에서, 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 농도를 근거로 하거나 중량 또는 숫자에 근거함)를 포함하는 조성물이다. 임의의 실시형태에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과를 포함할 것이다. 임의의 실시형태에서, 대상 종은 필수적인 동질성으로 정제되며(여기에서 오염 종은 종래의 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음), 여기에서 조성물은 필수적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다.
용어 "환자"는 인간 및 동물 개체를 포함한다.
최적의 약학 조성물은, 예를 들어 투여의 의도된 경로, 전달 포맷 및 원하는 투여량에 따라서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기와 동일]을 참조한다. 이와 같은 조성물은 본 발명의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출률 및 생체내 소거율에 영향을 미칠 수 있다.
약학 조성물에서 1차 운반 수단 또는 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만 주사용 증류수, 생리적 식염수 또는 인공 뇌척수액을 포함할 수 있으며, 가능하게는 비경구 투여에 대하여 조성물에서 공통적인 기타 다른 물질로 보충된다. 중성으로 완충된 염분 또는 혈청 알부민과 혼합된 염분은 추가적인 예시적 비히클이다. 약학 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5인 트리스 완충액, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5인 아세트산염 완충액을 포함할 수 있으며, 이는 솔비톨 또는 이에 대한 적당한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 원하는 순도인 선택된 조성물을 선택적인 제형 제제와 혼합함으로써(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기와 동일) 저장용으로 제조될 수 있다. 또한, 나노입자는 수크로스와 같은 적절한 부형테를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
제형 성분은 투여 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 완충액은 유리하게 생리적인 pH로 또는 약간 더 낮은 pH로, 전형적으로는 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 조성물을 유지하는데 사용된다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구적으로 전달될 수 있다. 비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에서의 사용을 위한 치료용 조성물은 발열 물질이 없는, 본 발명의 원하는 나노입자를 포함하는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 제조는 제제, 예를 들어 이후에 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 제품의 제어 또는 지속된 방출을 제공할 수 있는, 주사용 마이크로스피어, 생체침식성 입자, 중합성 화합물(예를 들어 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 함께 원하는 분자의 제형을 수반할 수 있다. 히알루론산이 있는 제형은 순환에 있어서 지속된 기간을 촉진하는 효과가 있다. 이식가능한 약물 전달 장치는 원하는 분자를 도입하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 소화관을 통해, 예를 들어 경구로 전달될 수 있다. 이와 같은 약학적으로 허용가능한 조성물의 제조는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 이러한 방식으로 투여된 나노입자는 고체 투여 형태의 조제, 예를 들어 정제 및 캡슐에 관습적으로 사용된 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 생물학적 이용 가능성이 최대화되고 전전신성(pre-systemic) 분해는 최소화되는 경우 캡슐은 위장관 내 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 추가적인 제제는 본 명세서에 개시된 나노입자의 흡수를 용이하게 하도록 포함될 수 있다. 희석제, 착향제, 저융점 왁스, 식물성 기름, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제, 결합제가 또한 이용될 수 있다.
약학 조성물은 정제의 제조에 적당한 비독성 부형제와의 혼합물에 본 명세서에 개시된 효과적인 양의 나노입자를 포함할 수 있다. 멸균수, 또는 다른 적절한 비히클에 정제를 용해시킴으로써, 용액은 단위-용량 형태로 제조될 수 있다. 적당한 부형제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 탄산수소나트륨, 락토스, 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크를 포함한다.
추가적인 약학 조성물, 예를 들어 지속된 전달 또는 제어된 전달 제형에 본 발명의 나노입자 또는 화합물을 포함하는 제형은 당업자에게 명백하다. 다양한 기타 다른 지속된 전달 또는 제어된 전달 수단, 예를 들어 리포좀 담체, 생체침식성 마이크로입자 또는 다공성 비트 및 데포 주사를 제형화하는 기법은 또한 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, PCT 출원 제PCT/US93/00829호를 참조하며, 이는 약학 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 마이크로입자의 제어된 방출을 기술한다. 지속된 방출 제조물은 형상화된 물품의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐, 폴리에스터, 하이드로겔, 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호 및 EP 제058,481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-556), 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트)(Langer et al., 1981 , J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., id.) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시뷰티르산(EP 제133.988호)을 포함할 수 있다. 지속된 방출 조성물은 또한 리포좀을 포함할 수 있으며, 이는 당업계에 알려진 여러 가지 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌[Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692; EP 제036,676호; EP 제088,046호 및 EP 제143,949호]을 참조한다.
생체내 투여에 사용될 약학 조성물은 전형적으로 멸균되어 있다. 임의의 실시형태에서, 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 사용하는 멸균은 동결건조 및 재구성화 이전 또는 이후에 수행될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액 중에 저장될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 포함하는 용기, 예를 들어 피하 주사기 주사 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼(stopper)를 포함하는 정맥주사용 용액 백 또는 바이알에 위치된다.
일단 본 발명의 약학 조성물이 제형화되었다면, 약학 조성물은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서 멸균 바이알 내에, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 저장될 수 있다. 이와 같은 제형은 즉시 사용가능한(ready-to-use) 형태 또는 투여 전에 재구성되는 형태(예컨대, 동결건조된 형태)로 저장될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로 또는 기타 다른 치료제와 조합하여, 특히 기타 다른 암 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 제제는 일반적으로 방사선 요법 또는 화학요법을 포함한다. 예를 들어, 화학요법은 다음의 제제 중 하나 이상을 이용한 치료를 수반할 수 있다: 안트라사이클린, 택솔, 타목시펜, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 및 당업계에 알려진 기타 다른 약물.
본 발명의 나노입자의 세포로의 도입은 당업계에 알려진 임의이 방법을 사용하여 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 달성될 수 있다. 예를 들어, 나노입자의 국소적 전달은 직접적 주입에 의해 달성될 수 있다. (Hefti, 1994, Neurobiology 25:1418-35.)
실시예
하기 실시예는 상기 기술된 방법 및 유리한 결과의 임의의 측면을 예시한다. 하기 실시예는 예시로서 나타내어져 있으며 제한으로서 나타낸 것이 아니다.
본 명세서에 기술된 방법에 있어서, 종양 특이적 수용체에 대한 리간드를 포함하는 ELP 기반 나노입자로의 siRNA의 제형을 기술하는 실시예가 제공된다. siRNA 부하가 있는 나노입자와 없는 나노입자 둘 다의 물리화학적 특정을 평가하는 일련의 분석법을 실행하여 입자 크기 및 제타 전위(표면 전하), siRNA 포집 효율, 및 혈청 안정성을 측정한다. 본 명세서에 기술된 기본적인 나노입자는 60개의 펜타머 반복단위를 가지도록 조작되었으며, 이 때 게스트 잔기 Xaa는 Val:Ala:Gly[5:2:3]이었다. 이러한 나노입자는 Tt = 60℃인 친수성 중합체(MW=24.5kD)이어서 체온에서 높은 용해성을 나타내고 농도-시간 곡선 하의 면적(AUC)에 의해 보여지는 바와 같이 혈장 순환이 길다(13). 올리고리신(K8; 서열번호 58) 또는 올리고아르기닌(R9; 서열번호 59) 분절은 나노입자의 N-말단에서 첨가되어 siRNA 부착 부위를 제공하고 중합체에 충분한 양친매성을 부여한다. 이러한 분절은 리신 또는 아르기닌 잔기의 8개 또는 9개 약물 부착 지점을 제공하였으며, 정중하게 나노입자의 N-말단에서 무리를 이루었다.
실시예 1. 배양된 인간 암 세포에서 siRNA 가 부하된 수용체 표적화 , ELP 기반 나노입자의 제조 및 물리화학 및 시험관내 특징.
mRNA(qPCR) 및 단백질(웨스턴 블롯) 수준에서 표적 유전자를 하향 조절하는 siRNA의 능력이 또한 이들 세포주에서 시험된다. siRNA가 부하될 ELP-포함 나노입자의 능력은 뉴클레아제 분해로부터 보호하고, 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 난소암 세포에 의한 흡수를 용이하게 하며, 하기 연구에 의해 확인된다.
이하의 구성: (i) siRNA 응축에 대한 올리고(리신); (ii) 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP) 블록-(VPGXG)n(서열번호 57)(비크로마토그래피 정제에 대한 X 치환 비율이 V5:A2:G3)을 가지는 모듈식 양이온성 트라이-블록 생체고분자의 작은 라이브러리와 나노입자 안정성은 난소, 유방, 전립선, 결장, 폐 및 피부암 세포 표적화에 대하여 유전자 조작되었다. 이는 플라스미드 K8ELP(1-60)/pET25b를 형성하였다. 이러한 재조합 접근법은 종래의 합성 중합체에 비하여 손쉬운 모듈식 교환이 있고 해로운 유기 용매의 사용이 없는 생체고분자 구조 및 분자량에 대한 정확한 제어를 제공하였다. 재조합 생체고분자는 siRNA, 올리고(리신)/siRNA(코어) 및 ELP/항-수용체 펩티드(셸)와 혼합 시 코어-셸 나노입자를 형성하였다.
인간 L1CAM 단백질(NM_000425.3)의 항-L1CAM 서열(GSQRKHSKRHIHKDHV)(서열번호 19)은 K8ELP(1-60)/pET25b+ 박테리아 발현 플라스미드의 XbaI/HindIII 부위에서 클로닝되었다. 적절한 배향인 클로닝은 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. 이는 LK8ELP 플라스미드를 형성하였으며, 발현된 펩티드는 LK8ELP으로 명명하였다. 이러한 발현 플라스미드는 대장균 내로 도입하여 밤새 성장시켰다. 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)(1mM)는 단백질 생성을 자극하기 위해 첨가하였다. 나노입자를 포함하는 ELP는 ELP의 열-민감성을 활용한 비크로마토그래피 ITC 기법을 통해 정제되었다. 생체고분자의 순도는 예측 크기가 25kDa인 단일 단백질 밴드를 만드는 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다(도 4, 레인 7 확인).
종양-특이적인 CTD 펩티드를 발현하는 추가적인 뉴클레오티드는 또한 K8ELP(1-60)/pET25b+ 박테리아 발현 플라스미드로 클로닝된다. 이들 추가적인 CTD 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 표 5에 표시되어 있다. 생성된 폴리펩티드의 각각은 LK8ELP에 대하여 기술된 바와 같이 시험된다.
실시예 2: 나노입자 물리화학적 응축 분석
정제된 K8ELP 폴리펩티드에 대한 siRNA의 정전식 응축은 겔 지연 분석법 및 스캐차드 유형 분석법(Scatchard type analysis)에 의해 확인하였다. siRNA는 세포 수송 연구를 위하여 DY547(다마콘(Dharmacon)) 또는 기타 다른 적당한 형광 표지가 있는 5' 센스 가닥에서 표지된다. 표지된 siRNA는 0.2~2N/P(생체고분자로부터의 양이온성 리신 아민과 siRNAd의 음이온성 인산기의 몰 비율)로 혼합하였으며, 1× 트리스 염기, 아세트산 및 EDTA(TAE), 5% 글루코스 완충액 중에서 30분 동안 항온처리하였다. 생체고분자/siRNA 나노입자는 마이크로콘-100(Microcon-100) 스핀 원심분리에 의해 유리 siRNA로부터 분리되었다. 유리 및 응축한 siRNA의 농도는 형광 분광광도 분석법에 의해 정량화하였다. 혼합물은 마이크로콘-100을 통하여 원심분리를 하여 나노입자와 결합된 siRNA는 유지하지만, 유리 siRNA는 관류할 수 있게 하였다. 유리 및 결합된 siRNA의 농도는 형광 분광광도기 및 DY547 siRNA(Ex/Em 547/574)의 알려진 농도의 표준 곡선을 사용하여 결정하였다. siRNAd에 대한 생체고분자의 친화성 상수(Kd)는 스캐차드 플롯 분석에 의해 계산하였으며, 낮은 마이크로몰 범위가 얻어졌다. 이러한 제조는 CTD가 있는 K8ELP 폴리펩티드 모두에 대하여 실행한다.
K8ELP(1-60) 나노입자의 물리화학 특징은 나노입자에 결합된 siRNA의 겔 지연 분석법에 의해 분석하였다. 이러한 분석법에서 siRNA(100p㏖)은 나노입자의 계열 희석물과 혼합시키고 주위 온도에서 30분 동안 항온처리하였다. 생성물은 1× TAE 완충액 중 1% 아가로스겔 상에서 30분 동안 120V에서 전기영동 분리를 하였다. 겔은 siRNA의 시각화를 위하여 브롬화 에티듐을 포함하였다. K8ELP(1-60) 나노입자에 의해 응축된 siRNA는 웰에 남아 있는다(도 5, 레인 8). 이러한 겔 지연 분석법은 또한 CTD가 있는 모든 K8ELP 폴리펩티드에 대하여 실행하였다. K8ELP(1-60) 나노입자의 물리화학 특징은 또한 동적 광산란법 및 주사 전자 현미경에 의해 평가하였으며, 이는 평균 크기가 100㎚ 미만이며 좁은 분포를 가지는 것으로 나타내었다. 모든 K8ELP) 나노입자의 물리화학 특징은 또한 제타 전위 및 RNA 분해효소(RNAase) 보호에 의해 평가된다.
100% 인간 혈청에서 나노입자의 안정성은 또한 siRNA의 나노입자로부터의 방출에 대하여 겔 이동, SDS-PAGE, 및 형광 분광분석법에 의해 평가한다.
실시예 3. 세포 표적화 도메인 결합 분석
종양 세포에 결합하는 LK8ELP의 L1CAM 펩티드의 능력은 면역침강 분석법을 통해 시험한다. CTD를 포함하는 다른 K8ELP 펩티드 모두를 평가한다. 단백질 G(Protein G)로 사전 코팅한 단백질 G 마그나바인드 비드(Protein G MagnaBind Bead)(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록퍼드 소재, 카탈로그 번호 21356)는 반응성 친화성 표적의 정제를 위한 즉시 사용가능한 수단을 제공하였다. 단백질 G와 항체 사이의 고친화성 상호작용은 매우 가혹한 조건, 예를 들어 SDS-PAGE용 샘플 로딩 완충액 또는 8M 구아니딘ㆍHCl에서 끓이는 것을 제외하고 효율적으로 분리하지 않으며, pH 1.5의 자성 비드는 침전물 중 나노입자의 임의의 비특이적 포함을 피하는 원심분리 또는 중력법을 통해 선택된다.
항-수용체 항체는 노랑 염소에서 표준 다중클론 항체 제조법에 의해 제조한다(베틸 라보라토리즈(Bethyl Laboratories), 몽고메리(Montgomery) TX). 수용체-결합 펩티드는 키홀 림펫 단백질에 접합하고 반복적으로 염소로 주입된다. 항-혈청은 8주 후에 염소로부터 분리되고 항종양 세포 결합은 종양 세포로부터 분리된 단백질을 표적화하는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인한다.
ELP 나노입자(샘플당 0.75㎎)를 10㎍ 염소 항-인간 수용체 항체와 함께 및 상기 항체 없이 4℃에서 밤새 항온처리한다. 단백질 G 마그나바인드 비드를 96 딥-웰 플레이트에 첨가한다(웰당 0.5㎎ 또는 0.25㎎). 자성 비드를 사용하여, 비드를 0.1% 트윈(Tween)-20을 포함하는 트리스-완충 염수로 세척하고 나노입자 샘플/항체 혼합물과 함께 1시간 항온 처리하였으며, 3회 세척한 다음, 샘플 완충액을 감소시킨 SDS-PAGE를 이용하여 10분 동안 96℃에서 용리시켰다. 용리액은 SDS-PAGE에 의해 분해하고 항-수용체 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
실시예 4. 나노입자의 종양으로의 국소화 .
종양의 크기 및 위치는 전체-동물 생체발광 영상(bioluminescence imaging, BLI)을 통하여 비침습적으로 모니터링한다. 형광(Dy677)으로 표지한 siRNA를 포함하는 2가지 상이한 나노입자 제형(하나는 종양 특이적 수용체에 대한 리간드(LK8ELP(1-60)를 포함하는 것이고, 나머지 하나는 이러한 펩티드 K8ELP(1- 60)이 없는 것임)를 제조하였다. 종양을 가지는 마우스의 그룹(n=3)은 3가지 용량 수준(siRNA에 대하여 1, 3, 또는 10㎎/㎏) 중 하나로 각각의 나노입자 제형의 단일 정맥 주사를 받았다. 3가지의 투여 후 시점(0.5, 4, 및 24시간)에서, K8ELP(1-60) 나노입자 둘 다의 종양 국소화를 전체-동물 생체발광 영상을 통하여 측정하였다.
마우스(20g)에 활액낭 사이로(intrabursally) 100,000개의 SKOV3ip2.luc-D3 전이성 인간 난소 종양 세포를 일방적으로 왼쪽 난소에 주입하였다. 기타 다른 암을 표적화하는 CTD 펩티드에 대하여, 난소 종양 세포보다 해당하는 종양 세포주를 주입한다(표 2 참조). 주사 부위는 또한 테스트할 암의 유형에 기초하여 변경할 것이다(예컨대, 폐, 결장, 뇌로 주사). 종양의 존재는 IVIS 스펙트럼 상에서 BLI 영상화에 의해 주사하고 1주일 후에 확인하였다. 형광 영상화는 다음의 여기/방출 필터를 사용하고 자동 노출에 의하여 실행하였다: EX: 605㎚; EM: 640, 660, 680, 700, 720, 740, 760, 780㎚; 그리고 EX: 675; EM: 720, 740, 760, 780㎚.
Figure pct00002
2마리 마우스 각각은 대조군으로서 표지된 네이키드 siRNA(Dy677-siEVI1)와 처치군으로서 K8ELP(1-60)(Dy677-ELP-siEVI1) 중 표지화 siRNA로 주입하였으며, 결과는 도 6에 비히클 군과 함께 표시되어 있다. 생체발광 영상화는 포화되지 않은 영상을 생성하는 노출 시간으로 실행된다. 배경 자가형광을 낮추기 위한 분광 불혼합은 Cy5.5에 대한 매개변수를 사용하여 실행되며, Cy5.5에 대한 매개변수는 Dy677에 따라 매우 유사한 Ex/Em을 가진다. 모든 시점(0.5, 4 및 24시간)에 대하여 모든 형광 및 BLI 영상이 동일한 비율로 배치되어 시점 중에서의 직접적인 비교가 가능하다. 표지화 siRNA를 함유하는 기본 K8ELP(1-60) 나노입자는 4시간 이내에 종양에 특이적으로 국소화하는 것으로 확인되며, 종양에 의해 대사되어 신호가 24시간까지 감소한다(도 6 참조).
실시예 5. siRNA 의 종양으로의 전달.
mRNA(qPCR) 및 단백질(웨스턴 블롯) 수준에서 표적 유전자를 하향 조절하는 siRNA의 능력이 또한 표 2에 따라서 암 세포주에서 시험된다. RNA 간섭의 확인은 5' RACE 기법에 의해 측정된다. 원리의 증명에 사용되는 siRNA는 발암유전자 전사 인자 EVI1의 것이다. 마우스 유래의 종양은 부검시 절제되며 구아니디늄 아이소티오시아네이트 트리졸(TRIZol) 용액 중에 냉동하여 저장된다. 총 RNA는 제조자의 지시에 따라서 트리졸(TRIZol) 절차(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 인비트로젠사(Invitrogen))를 사용하여 마우스 종양으로부터 분리된다. PCR은 무작위 프라이머 및 AMV-역전사 효소를 사용하여 역전사 후에 실행된다.
중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석법: PCR 분석법은 본 명세서에 기술된 siRNA 시약의 존재하에 EVI1 유전자 발현에 있어서의 변화를 검출하기 위하여 실행된다. 이들 분석법에 있어서, 사용된 PCR 반응 조건은 95℃의 융해 온도에서 60초; 열순환이 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 25~30 사이클, 신장이 72℃에서 60초이다.
이들 분석법에서, 총 RNA는 트리졸(TRIZol)을 사용하여 마우스 종양으로부터 분리된다. 정량적 PCR(qPCR)은 인테그레이디트 DNA 테크놀러지스(미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 입수한 표적 특이적 탐침 및 프라이머를 사용하여 수행되었다. EVI1 및 β-액틴 mRNA에 대한 프라이머 및 리포터는 클론매니저(CloneManager) 프로그램(Sci-Ed 소프트웨어)을 사용하여 설계되고, 정방향 및 역방향 프라이머의 서열은 하기에 제시되어 있다. PCR 주형 cDNA는 서모피셔 베르소 cDNA 합성 키트(ThermoFisher Verso cDNA synthesis kit)를 사용하여 제조되었다. 모든 qPCR 시약은, 총 RNA로부터 제조한 cDNA를 사용하여, 핵산 농도의 3 로그 범위에 걸쳐서 샘플 농도와 증폭 반응속도 사이의 선형 관계를 보임으로써 입증된다. 태크맨 유니버설 마스터 믹스(Taqman Universal Master Mix)(퍼맨타스(Fermentas))는 PCR 반응에 사용되며 증폭 데이터는 ABI 프리즘 7900 서열 검출기(ABI Prism 7900 Sequence Detector)를 사용하여 수집되고 서열 검출 시스템(Sequence Detection System) 소프트웨어(SDS V2.0)(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 사(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 제품을 사용하여 분석하였다. 달리 언급되어 있지 않다면, mRNA 존재도(abundance)는 β-액틴에 대한 정규화에 의해
Figure pct00003
을 계산하고 미처리 종양 세포에서 mRNA 존재도에 대하여 보정한다(
Figure pct00004
).
암 세포에서 EVI1 mRNA 존재도는 β-액틴에 대하여 정규화되고 HFC 세포에 대하여 보정된다. QPCR 결과에 대한 통계 분석은 시그마 스태트(Sigma Stat)의 만-휘트니 순위 합(Mann-Whitney Rank Sum) 해석 함수를 사용하여 수행하였다.
Figure pct00005
5'-RLM-RACE: 5'-RLM-RACE는 인비트로젠 진레이서(Invitrogen GeneRacer) 매뉴얼에 따라서 변형을 가하여 실행한다. 1시간 동안 37℃에서 T4 RNA 리가제(5 단위)를 사용하여 2 내지 8마이크로그램의 총 RNA를 250ng의 진레이서 RNA 어댑터(5'-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3')(서열번호 64)에 직접적으로 결찰시켰다. 페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 정제된 결찰 생성물을 슈퍼스크립트III(SuperScriptIII; 인비트로젠) 및 EVI1 유전자 특이적 역전사 프라이머(5'-TAGTCATCCTCAGGGTTTCC-3')(서열번호 61)를 사용하여 55℃에서 45분 동안 역전사시킨 다음 70℃에서 불활성화시켰다. 5'-RLM-RACE-PCR은 진레이서 5' 프라이머(5'- CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3')(서열번호 66) 및 EVI1 유전자 특이적 역전사 프라이머(5'-TAGTCATCCTCAGGGTTTCC-3')(서열번호 61)를 사용하여 실행한다. PCR은, 95℃에서 3분(1 사이클), 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분(40 사이클), 72℃에서 10분(1 사이클)의 PCR 조건을 사용하여, ABI 프리즘 7900 서열 검출기를 사용하여 실행되고 서열 검출 시스템 소프트웨어(SDS V2.0)(ABI 제품)를 사용하여 분석하였다.
그 다음 네스티드(nested) PCR의 제2 라운드를 진레이서 5' 네스티드 프라이머(5'-GG ACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3')(서열번호 66) 및 EVI1 유전자 특이적 네스티드 프라이머(5'-TAGTCATCCTCAGGGTTTCC-3')(서열번호 61)를 사용하여 실행한다. PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 상에서 수행하고, 1㎍㎕-1의 브롬화 에티듐을 사용하여 염색한다. PCR 생성물은 겔로부터 절제하고 직접 서열결정하여 RACE 밴드의 정체를 확인한다. 세포 배양물 RACE 실험에 있어서, 500,000개 HT-144 흑색종 세포는 리포펙타민 RNAi맥스(Lipofectamine RNAiMax; 인비트로젠)을 사용하여 20nM의 EVI1 siRNA로 형질감염시킨다. RNA는 앞서 기술한 바와 같이, 형질감염시키고 48시간 후 RLM-RACE에 대하여 추출한다.
웨스턴 블롯: 마우스 종양 유래의 단백질 제조물(80ng/레인)을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고 면역블롯을 표준 방법에 의해 전개한다. OVCAR3 세포주는 L1CAM 면역블롯에 대한 양성 대조군으로서 사용한다. 면역블롯은, 비스클로로인돌릴포스페이트/나이트로블루 테트라졸륨 기질 시스템과 결합된 염소 항-인간 수용체(1/50), 토끼 항-염소 알칼리성 인산가수분해효소(1/2000)를 사용하여 전개된다. L1CAM에 대한 농도계의 면적은 6000d.p.i.의 해상도에서 엡손(Epson) 스캐너를 사용하여 획득하고, 데이터는 맥BAS(MacBAS) v2.0 정량화 소프트웨어(후지 사(Fuji Inc.), 미국 코네티컷주 스탬퍼드 소재)에 의해 분석한다. CTD를 포함하는 각각의 펩티드는 테스트 siRNA 분자로서 EVI1을 사용하여 기술된 바와 같이 테스트한다.
본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 과학 논문 및 기타 다른 출처 및 참조문헌은, 이들 전문이 명백히 본 출원에서 설명된 것처럼 이들의 교시 내용의 전체 범위에 대하여 명백히 본 명세서에 참조로 포함된다.
상기한 개시 내용은 본 발명의 임의의 구체적인 실시형태를 강조하는 것이며, 이에 대한 모든 변형 또는 이와 동등한 대안이 첨부된 특허청구범위에 기재된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범주 내에 있음이 이해되어야 한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
인용된 참조문헌
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> Primiano, Thomas NanoOncology, Inc. <120> Compositions of a peptide targeting system for treating cancer <130> 10-1380-WO <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Cys Ser Asn Arg Asp Ala Arg Arg Cys 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Val Ser Gln Thr Met Arg Gln Thr Ala Val Pro Leu Leu Trp Phe Trp 1 5 10 15 Thr Gly Ser Leu 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Met Thr Val Cys Asn Ala Ser Gln Arg Gln Ala His Ala Gln Ala Thr 1 5 10 15 Ala Val Ser Leu 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Arg Gly Asp Leu Ala Thr Leu Arg Gln Leu Ala Gln Glu Asp Gly Val 1 5 10 15 Val Gly Val Arg 20 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Asp Met Pro Gly Thr Val Leu Pro 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Arg Leu Val Ser Tyr Asn Gly Ile Ile Phe Phe Leu Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Val His Leu Gly Tyr Ala Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Cys Pro Ile Glu Asp Arg Pro Met Cys 1 5 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Arg Gly Asp 1 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Thr Ala Cys His Gln His Val Arg Met Val Arg Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Tyr Ile Gly Ser Arg Ala 1 5 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Val Ser Gln Thr Met Arg Gln Thr Ala Val Pro Leu Leu Trp Phe Trp 1 5 10 15 Thr Gly Ser Leu 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic <400> 13 Met Thr Val Cys Asn Ala Ser Gln Arg Gln Ala His Ala Gln Ala Thr 1 5 10 15 Ala Val Ser Leu 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Arg Gly Asp Leu Ala Thr Leu Arg Gln Leu Ala Gln Glu Asp Gly Val 1 5 10 15 Val Gly Val Arg 20 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Cys Gly Lys Arg Lys 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Cys Asp Thr Arg Leu 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 17 Asn Gly Xaa Gly Xaa Xaa 1 5 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Val Pro Trp Met Glu Pro Ala Tyr Gln Arg Phe Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Gly Ser Gln Arg Lys His Ser Lys Arg His Ile His 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<220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Leu Asn Asn Ile Val Ser Val Asn Gly Arg His Xaa 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Lys Ile Lys Met Val Ile Ser Trp Lys Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Cys Ser Arg Pro Arg Arg Ser Glu Cys 1 5 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 tgctctaacc gtgacgcgcg tcgttgc 27 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 gtttctcaga ccatgcgtca gaccgcggtt ccgctgctgt ggttctggac cggttctctg 60 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 atgaccgttt gcaacgcgtc tcagcgtcag gcgcacgcgc aggcgaccgc ggtttctctg 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgtggtgacc tggcgaccct gcgtcagctg gcgcaggaag acggtgttgt tggtgttcgt 60 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 gacatgccgg gtaccgttct gccg 24 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 cgtctggttt cttacaacgg tatcatcttc ttcctgaaa 39 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 gttcacctgg gttacgcgac c 21 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 tgcccgatcg aagaccgtcc gatgtgc 27 <210> 36 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 cgtggtgac 9 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 accgcgtgcc accagcacgt tcgtatggtt cgtccg 36 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 tacatcggtt ctcgtgcg 18 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 gtttctcaga ccatgcgtca gaccgcggtt ccgctgctgt ggttctggac cggttctctg 60 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 atgaccgttt gcaacgcgtc tcagcgtcag gcgcacgcgc aggcgaccgc ggtttctctg 60 <210> 41 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 cgtggtgacc tggcgaccct gcgtcagctg gcgcaggaag acggtgttgt tggtgttcgt 60 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 tgcggtaaac gtaaa 15 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 tgcgacaccc gtctg 15 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 aacggtnnng gtnnnnnn 18 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 gttccgtgga tggaaccggc gtaccagcgt ttcctg 36 <210> 46 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 ggttctcagc gtaaacactc taaacgtcac atccacaaag accacgtt 48 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 gacggtnnng gtnnnnnn 18 <210> 48 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 aaagcggcg 9 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 gacccgcgtg cgaccccggg ttct 24 <210> 50 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 atcgcgggtc tggcgacccc gggttggtct cactggctgg cgctg 45 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (28)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 gacaaccgta tccgtctgca ggcgaaannn nnn 33 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 ctgaacaaca tcgtttctgt taacggtcgt cacnnn 36 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 aaaatcaaaa tggttatctc ttggaaaggt 30 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 tgctctcgtc cgcgtcgttc tgaatgc 27 <210> 55 <211> 999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 atgagcgggc cgggcgtggg taaaaaaaag aaaaaaaaaa agaaaggcgt gggtgttccg 60 ggcgtgggtg ttccgggtgg cggtgtgccg ggcgcaggtg ttcctggtgt aggtgtgccg 120 ggtgttggtg tgccgggtgt tggtgtacca ggtggcggtg ttccgggtgc aggcgttccg 180 ggtggcggtg tgccgggcgt gggtgttccg ggcgtgggtg ttccgggtgg cggtgtgccg 240 ggcgcaggtg ttcctggtgt aggtgtgccg ggtgttggtg tgccgggtgt tggtgtacca 300 ggtggcggtg ttccgggtgc aggcgttccg ggtggcggtg tgccgggcgt gggtgttccg 360 ggcgtgggtg ttccgggtgg cggtgtgccg ggcgcaggtg ttcctggtgt aggtgtgccg 420 ggtgttggtg tgccgggtgt tggtgtacca ggtggcggtg ttccgggtgc aggcgttccg 480 ggtggcggtg tgccgggcgt gggtgttccg ggcgtgggtg ttccgggtgg cggtgtgccg 540 ggcgcaggtg ttcctggtgt aggtgtaccg ggtgttggtg ttccgggtgt tggtgtacca 600 ggtggtggtg ttccgggtgc aggcgttccg ggtggcggtg tgccgggcgt gggtgttccg 660 ggcgtgggtg ttccgggtgg cggtgtgccg ggcgcaggtg ttcctggtgt aggtgtgccg 720 ggtgttggtg tgccgggtgt tggtgtacca ggtggcggtg ttccgggtgc aggcgttccg 780 ggtggcggtg tgccgggcgt gggtgttccg ggcgtgggtg ttccgggtgg cggtgtgccg 840 ggcgcaggtg ttcctggtgt aggtgtgccg ggtgttggtg tgccgggtgt tggtgtacca 900 ggtggcggtg ttccgggtgc aggcgttccg ggtggcggtg tgccgggcgg atctcagcgc 960 aaacactcaa aacgtcatat tcacaaggac catgtataa 999 <210> 56 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 Met Ser Gly Pro Gly Val Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly 1 5 10 15 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala 20 25 30 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 35 40 45 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 50 55 60 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 65 70 75 80 Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 85 90 95 Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly 100 105 110 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly 115 120 125 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 130 135 140 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro 145 150 155 160 Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 165 170 175 Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 180 185 190 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly 195 200 205 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 210 215 220 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 225 230 235 240 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly 245 250 255 Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 260 265 270 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly 275 280 285 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 290 295 300 Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Ser Gln Arg 305 310 315 320 Lys His Ser Lys Arg His Ile His Lys Asp His Val 325 330 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid except proline <400> 57 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 Val Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 Val Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly 1 5 10 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 aaggcatgtt cgcaacatcc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 tagtcatcct cagggtttcc 20 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 gggaaatcgt gcgtgacatt aag 23 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 tgtgttggcg tacaggtctt tg 22 <210> 64 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 cgacuggagc acgaggacac ugacauggac ugaaggagua gaaa 44 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 cgactggagc acgaggacac tga 23 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 ggacactgac atggactgaa ggagta 26

Claims (39)

  1. 조립 도메인(assembly domain, AD), 세포 표적화 도메인(cell targeting domain, CTD), 및 핵산 결합 도메인(nucleic acid binding domain, NBD)을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 약물 결합 도메인(drug binding domain, DBD)을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 결합 도메인(NBD)은 siRNA 분자에 결합되는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분리된 폴리펩티드는 서열번호 56을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 NBD는 양이온성 도메인을 포함하는 것인 펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 NBD는 올리고 리신 도메인을 포함하고, 상기 올리고 리신 도메인은 아미노산 서열(Val-Gly-LysK-Gly)을 포함하며, K는 1 초과의 정수인 것인 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 K는 8인 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 NBD는 올리고아르기닌 도메인을 포함하고, 상기 올리고아르기닌 도메인은 아미노산 서열(Val-Gly-ArgR-Gly)을 포함하며, R은 1 초과의 정수인 것인 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 R은 9인 것인 폴리펩티드.
  10. 제2항에 있어서, 상기 DBD는 종래 또는 임상시험용 약물에 결합되는 것인 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 AD는 엘라스틴 유사 폴리펩티드(elastin-like polypeptide, ELP)를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 ELP는 아미노산 서열(Val-Pro-Gly-X-Gly)N(서열번호 57)을 포함하고, X는 Val, Ala 및 Gly을 포함하는 펩티드이며, N은 1 이상의 정수인 것인 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, N은 60인 것인 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, X는 약 5:2:3의 비로 Val, Ala 및 Gly을 포함하는 펩티드인 것인 폴리펩티드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 CTD는 표적 세포의 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용하는 것인 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, 상기 CTD는 표적 세포의 외부 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용하는 것인 폴리펩티드.
  17. 제1항에 있어서, 상기 CTD는 표적 세포의 내부 표면 상에 존재하는 생물학적 분자와 상호작용하는 것인 폴리펩티드.
  18. 제1항에 있어서, 상기 CTD는 서열번호 19를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  19. 제15항에 있어서, 상기 생물학적 분자는 세포 부착 분자를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  20. 제15항에 있어서, 상기 생물학적 분자는 수용체 분자를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 상기 세포 부착 분자는 피브로넥틴 또는 라미닌을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  22. 제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 55를 포함하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 작제물(recombinant expression constuct).
  25. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제1항에 따른 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 나노입자로서, 상기 나노입자는 용액 중에서 조립되는(assemble) 것인 나노입자.
  27. 제26항에 있어서, 약물 제제를 추가로 포함하는 것인 나노입자.
  28. 제27항에 있어서, 상기 약물 제제는 siRNA 분자인 것인 나노입자.
  29. 제26항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 56을 포함하는 것인 나노입자.
  30. 약물 제제를 표적 세포에 대해 표적화하는 방법으로서,
    응집 도메인(aggregation domain, AD), 뉴클레오티드 결합 도메인(nucleotide binding domain, NBD) 및 세포 표적화 도메인(CTD)을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 얻는 단계;
    약물 제제를 상기 하나 이상의 폴리펩티드의 NBD와 접촉시키는 단계;
    상기 하나 이상의 폴리펩티드의 AD를 응집시켜 조립된 폴리펩티드를 생성하는 단계;
    상기 조립된 폴리펩티드를 상기 표적 세포와 접촉시키는 단계; 및
    상기 조립된 폴리펩티드의 상기 CTD를 상기 표적 세포의 외부에 존재하는 생물학적 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  31. 약물 제제를 표적 세포에 대해 표적화하는 방법으로서,
    응집 도메인(AD), 약물 결합 도메인(DBD), 및 세포 표적화 도메인(CTD)을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 얻는 단계;
    상기 약물 제제를 상기 하나 이상의 폴리펩티드의 DBD와 접촉시키는 단계;
    하나 이상의 폴리펩티드의 AD를 응집시켜 조립된 폴리펩티드를 생성하는 단계;
    상기 조립된 폴리펩티드를 상기 표적 세포와 접촉시키는 단계; 및
    상기 조립된 폴리펩티드의 상기 CTD를 상기 표적 세포의 외부에 존재하는 생물학적 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리펩티드는 서열번호 56을 포함하는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 생물학적 분자는 상기 표적 세포의 내부에 존재하는 것인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 약물 제제는 siRNA 분자를 포함하는 것인 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 종양 세포는 인간 방광 세포, 인간 유방 세포, 인간 결장 세포, 인간 간 세포, 인간 폐 세포, 인간 신경아세포종 세포, 인간 난소 세포, 인간 췌장 세포, 인간 전립선 세포 또는 인간 피부 세포인 것인 방법.
  37. 제30항에 있어서, 상기 생물학적 분자는 세포 부착 분자를 포함하는 것인 방법.
  38. 제30항에 있어서, 상기 생물학적 분자는 수용체 분자를 포함하는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 세포 부착 분자는 피브로넥틴 또는 라미닌을 포함하는 것인 방법.
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