CN111961103B - 用于脑肿瘤治疗的rna纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的主题涉及用于脑肿瘤治疗的RNA纳米颗粒,具体涉及人工RNA纳米结构分子和治疗受试者中的脑肿瘤的方法。更具体地,本发明公开的主题涉及包含多分支RNA纳米颗粒、脑肿瘤靶向模块和有效量的治疗剂的RNA纳米结构。此外,本发明公开的主题涉及使用RNA纳米结构组合物治疗患有脑肿瘤或处于患脑肿瘤风险的受试者的脑肿瘤的方法。
Description
本申请是申请日为2016年3月9日、发明名称为“用于脑肿瘤治疗的RNA纳米颗粒”的中国专利申请号201680015972.5的分案申请。
相关申请
本申请要求于2015年3月9日提交的美国临时专利申请号62/130,459的权益,其全部内容通过引证并入本文。
政府利益
本发明是在由国立卫生研究院授予的CA151648(P.G.)、EB012135(P.G.)、CA152758(C.M.C.)、CA175875(I.N.),CA163205(I.N.),P30NS045758(B.K.),R01064607(B.K.),R01CA150153(B.K.)和P01CA163205(B.K.)下的政府支持下进行。政府对本发明具有一定的权利。
序列表
本申请包含序列表,其已经以ASCII格式电子提交并通过引证将其全部并入本文中。在2016年4月14日完成的所述ASCII副本命名为2935720-000007_SL.txt并且大小为4,758个字节。
技术领域
本发明公开的主题涉及治疗受试者中的脑肿瘤的人工RNA纳米结构分子和方法。更具体地,本发明公开的主题涉及包含多分支RNA纳米颗粒、脑肿瘤靶向模块和有效量的治疗剂的RNA纳米结构。此外,本发明公开的主题涉及使用RNA纳米结构组合物治疗患有脑肿瘤或处于患脑风险的受试者的脑肿瘤的方法。
背景技术
成年人中最常见的原发性脑瘤是成胶质细胞瘤,其也是最致命的癌症之一(1)。对于成胶质细胞瘤,常规治疗涉及手术切除,随后为放射和同时化疗。即使使用这种治疗方案,成胶质细胞瘤患者的中位生存期小于15个月。不良预后主要是由于肿瘤复发,其被认为源自在初级治疗中存活的癌症干细胞的亚组。最近的研究表明成胶质细胞瘤干细胞比治疗应力存活时间长并且当他们复发时变得更具有侵略性,从而发展为抵抗初级化疗。
细菌病毒的phi29 DNA包装RNA(pRNA)分子是phi29 DNA包装马达中的关键组分,并且包含两个功能结构。分子间相互作用区域位于中心区域(碱基23-97),并且在该区域内存在两个环(右手环和左手环),其负责这两个环中的通过四个互补碱基序列的手牵手相互作用。另一个区域是位于5’/3’配对末端的DNA转运结构域。右手环(碱基45-48)和左手环(碱基82-85)允许通过两个互锁环的相互作用通过分子间碱基配对形成pRNA二聚体、三聚体和六聚体环,pRNA分子形成二聚体、三聚体、六聚体和图案化的超结构[7]。这种形成自组装纳米结构的性质使得pRNA是用于自下而上组装的理想构建块。RNA纳米技术作为生物和医学应用的新一代平台迅速发展(2-3)。随着纳米技术的迅速发展,已经进行了许多尝试以使用病毒、脂质体、脂质和基于聚合物的纳米颗粒递送小干扰RNA(siRNA)(4)。
显然,仍然需要改善靶向脑肿瘤细胞和成胶质细胞瘤干细胞的组合物和方法以治疗原发性脑肿瘤并防止肿瘤复发。本发明公开的主题涉及用于脑肿瘤的预防和治疗性治疗的含有RNA纳米颗粒的组合物。
发明内容
当前公开的主题满足一些或所有上述需要,这对于本领域的普通技术人员经过对本文档中提供的信息的研究之后将变得清晰明了。
本发明内容描述了当前公开的主题的若干实施例,并且在许多情况下列出了这些实施例的变型和置换。本发明内容仅仅是众多和变化的实施例的示例。提及给定实施例的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施例通常可以具有或不具有所提及的特征;同样,那些特征可以应用于本公开主题的其它实施例,无论是否在本发明内容中列出。本发明内容没有列出或表明这些特征的所有可能的组合。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供人工RNA纳米结构分子。该分子包括包含至少一个RNA寡核苷酸的多分支RNA连接基序,和脑肿瘤靶向模块,并且该模块与RNA连接基序偶联。在一些实施方案中,所述分子还包括与RNA连接基序偶联的至少一种生物活性剂。生物活性剂的非限制性实例是治疗剂。在一些实施方案中,RNA寡核苷酸长度为至少6个核苷酸。在一些实施方案中,RNA寡核苷酸包括在2’位置的至少一个化学修饰。化学修饰的非限制性实例包括2’-氟、2’-胺基、2’O-甲基或其组合。
在一些实施方案中,多分支RNA包括核苷酸序列5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGGAUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中,多分支RNA包括序列5’-GATAAGCT CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中,多分支RNA连接基序是三分支RNA连接基序。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序包括包装RNA(pRNA)三向连接(3WJ)基序。在本公开的一些实施方案中,RNA分子形成二聚体、三聚体、六聚体和图案化的超结构。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了三分支RNA连接基序的分支包括a3WJ RNA模块。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序的分支包括b3WJ RNA模块。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序的分支包括c3WJ RNA模块。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序包括a3WJ RNA模块、b3WJ RNA模块和c3WJ RNA模块。RNA模块的非限制性实例包括核苷酸序列5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3’(SEQ ID NO:1)、5’-CCC ACAUAC UUU GUUGAUCC-3’(SEQ ID NO:2)和5’-GGA UCAAUC AUG GCAA-3’(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中,分子的直径为至少约40nm或更小。在一些实施方案中,分子的直径为至少约30nm或更小。在一些实施方案中,分子的直径为至少约15nm或更小。
在一些实施方案中,RNA分子具有约-50mV至约50mV的ζ电位。在一些实施方案中,所述分子具有约-25mv至约25mV的ζ电位。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了人工RNA纳米结构分子中的脑肿瘤靶向模块包括结合至至少一种脑肿瘤细胞表面标记物的配体。脑肿瘤表面标记物的非限制性实例包括叶酸受体、EGFR、转铁蛋白受体和RGD。在一些实施方案中,配体包括适体。在一些实施方案中,适体结合至EGFR、PDGFR、叶酸受体或其组合。在一些实施方案中,靶向模块是叶酸。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了包括药物、荧光染料、化学品或其组合的生物活性剂。在一些实施方案中,生物活性剂包括siRNA、miRNA、抗miRNA、核酶RNA和反义RNA、或其组合。在一些实施方案中,生物活性剂针对脑肿瘤标记物。生物活性剂的非限制性实例包括siRNA序列和微RNA序列。在一些实施方案中,微RNA分子的长度为至少3个核苷酸。在一些实施方案中,生物活性剂是编码miR-9、miR-10b、miR-21、miR-17或miR-26的miRNA的抗miRNA分子。在一些实施方案中,生物活性剂是编码let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145或miR-181b的miRNA的miRNA分子。在一些实施方案中,miRNA包括miRNA锁定核酸(LNA)分子。在一些实施方案中,微RNA序列是抗miR-21序列。在一些实施方案中,miRNA序列的非限制性实例包括5’-GATAAGCT-3’、5’-AGCACTTT-3’或5’-ATTTGCAC-3’。在一些实施方案中,miRNA包括miRNA锁定核酸(LNA)分子。在一些实施方案中,生物活性剂包括LNA miRNA分子5’-+G+A+T+A+A+G+C+T-3’。在一些实施方案中,miRNA LNA分子包括序列5’-+A+G+C+A+C+T+T+T-3’。在一些实施方案中,miRNA LNA分子包括序列5’→A+T+T+T+G+C+A+C-3’。
在一些实施方案中,微RNA是锁定核酸(LNA)序列。在一些实施方案中,微RNA是LNA-miR21序列5’-+G+A+T+A+A+G+C+T-3’。在一些实施方案中,siRNA与脑或脊髓中促进肿瘤发生、血管生成、细胞增殖或其组合的基因的mRNA序列结合。在一些实施方案中,siRNA结合至编码包括促肿瘤发生途径蛋白、促血管生成途径蛋白、促细胞增殖途径蛋白、抗细胞凋亡途径蛋白或其组合的蛋白的mRNA分子。在其它实施方案中,mRNA分子编码包括但不限于VEGF途径蛋白、EGFR途径蛋白、MGMT途径蛋白、Raf1途径蛋白、MMP途径蛋白、mTOR途径蛋白、TGFβ途径蛋白或Cox-2途径蛋白或其组合的蛋白质。在一些实施方案中,蛋白质的非限制性实例包括VEGF、EGFR、POK、AKT、AGT、RAF、RAS、MAPK、ERK、MGMT、MMP-2、MMP-9、PDGF、PDGFR、IGF-1、HGF、mTOR、Cox-2和TGFβ1。在一些实施方案中,siRNA结合至编码RAS、cMET、HER2、MDM2、PIK3CA、AKT、CDK4或其组合的mRNA分子。
在本发明公开主题的一些实施方案中,还提供了核酸组合物。所述组合物包含治疗有效量的上述人工RNA纳米结构分子。在一些实施方案中,组合物包括药学上可接受的载体。
另外,在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了纳米颗粒递送系统。递送系统包括如上所述的人工RNA纳米结构分子。在一些实施方案中,纳米颗粒递送系统进一步包括药学上可接受的载体。
在另一方面,在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了治疗患有脑肿瘤或处于发展为脑肿瘤风险的受试者的脑肿瘤的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含本文公开的人工RNA纳米结构分子的组合物。在一些实施方案中,该组合物包括药学上可接受的载体。在一些实施方案中,受试者是哺乳动物或非哺乳脊椎动物。在一些实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,脑肿瘤是成胶质细胞瘤。
此外,在一些实施方案中,本公开提供了预防患有脑肿瘤复发或处于患有脑肿瘤复发的风险的受试者中脑肿瘤复发的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含本文公开的人工RNA纳米结构分子的组合物。在一些实施方案中,该组合物包括药学上可接受的载体。在一些实施方案中,受试者是哺乳动物或非哺乳脊椎动物。在一些实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,脑肿瘤是成胶质细胞瘤。
附图说明
本公开主题的特征在所附权利要求中具体阐述。将通过参考以下详细描述来获得对本公开主题的特征和优点的更好理解,所述详细描述阐述其中使用主题的原理的说明性实施例及其附图。附图最初以彩色出版,通过引证整体并入本文(Tae Jin Lee等(2015)Oncotarget,第6卷,第17期,14766-14776)。本申请的黑白图形对应于公布的彩色图形。
图1中A-D是说明用于成胶质细胞瘤细胞靶向的多功能pRNA-3WJ RNP的构建和表征的图和图像。A,三价FA-Alexa647-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP的构建图,其具有形成以下的三种功能:叶酸(FA)作为靶向配体;Alexa647作为成像模块;和用于基因沉默的荧光素酶siRNA。图1中A以显示顺序分别公开了SEQ ID NO:19、3、2和5。B,原子力显微镜(AFM)图像,显示自组装三价FA-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP的三分支三角结构。C,显示FA-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP的尺寸的动态光散射(DLS)数据。D,FA-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP的ζ电位。C和D中的数据是从三个独立实验获得的。
图2中A-D是显示FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP在体外和体内靶向的FA介导的人成胶质细胞瘤细胞的图和图像。A,对由FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP在体外靶向的FA依赖性人成胶质细胞瘤细胞U87EGFRvIII的流式细胞术分析。将来自用200nM FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP处理的U87EGFRvIII细胞的Alexa647信号与标准化为PBS对照的对照RNP(无FA的Alexa647-pRNA-3WJ RNP)进行比较。通过学生t检验分析细胞种群的百分比(p<0.001,n=4)。B,与对照RNP(无FA的Alexa647-pRNA-3WJ)(顶部)或培养基中1mM游离的叶酸预处理的细胞(底部)相比,通过FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP(中间)体外靶向的FA-依赖性人成胶质细胞瘤细胞U87EGFRvIII的免疫荧光共聚焦显微分析。伪色用于细胞核(蓝色)、细胞骨架(绿色)和Alexa647(红色)。C,由FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP靶向的小鼠中的U87EGFRvIII诱导的脑肿瘤。尾部静脉注射FA或无FA的Alexa647-pRNA-3WJ RNP后,通过MRI(上图中的黄色箭头)测定肿瘤并通过荧光体内成像(下图)可视。显示来自4个中每个组的代表性图像。D,对通过肿瘤体积(mm3)标准化的Alexa647的荧光强度的ANOVA分析,p=0.019(n=4)。
图3中A-E是显示FA-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP在人成胶质细胞瘤细胞和衍生肿瘤中的基因沉默效应的图和图像。A,将宽范围(高达400nM)的FA-pRNA-3WJ-si(Luc)(实心圆)或FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)(阴性对照,空心圆)RNP用U87EGFRvIII-Luc细胞(n=4)体外温育。监测荧光素酶活性相对于RNP浓度的变化。B,总共三次注射后体内FA-pRNA-3WJ-si(Luc)的荧光素酶基因沉默效果。通过平均生物发光强度(n=5),p=0.007比较FA-pRNA-3WJ-si(Luc)(实心圆)或FA pRNA-3WJ-si(Scrm)(空心圆)的荧光素酶活性变化。C.在三次注射后,来自FA-pRNA-3WJ-siRNA(Luc)或FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)的荧光素酶活性的肿瘤体积和生物发光强度的代表性体内MRI图像。D,在异种移植后第13天,从与混杂对照组相比的MRI计算的肿瘤的体积,p=0.468(n=5)。E,使用平均荧光强度除以肿瘤体积(mm3)来标准化测试小鼠之间的变化,p=0.015(n=5)。所有误差棒表示s.e.m.,并且学生t检验用于统计分析。
图4中A-C是显示在动物试验和生物分布中FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP对人成胶质细胞瘤患者衍生的干细胞和衍生的脑肿瘤的FA介导的靶向的图和图像。A.通过用CD44-FITC抗体共同处理的FA-Alexa647-pRNA-3WJ或Alexa647-pRNA-3WJ RNP对人成胶质细胞瘤患者衍生的干细胞1123的体外靶向的流式细胞术分析。PBS和CD44-FITC处理的细胞用作门控对照(gating control)。B,通过MRI评价获自1123细胞的小鼠脑肿瘤的肿瘤大小测定(顶部)。在全身施用FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP后,与不含FA的Alexa647-pRNA-3WJ RNP相比,通过荧光体内成像显示FA-依赖性靶向。C,通过对抗来自与脑一起收集的主要内部器官的Alexa647成像荧光获得FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP的生物分布图。
图5是说明对体外通过FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP靶向的FA介导的人成胶质细胞瘤细胞的流式细胞术分析的图。将人成胶质细胞瘤细胞U87EGFRvIII用1mM游离叶酸在培养基中预处理1小时,然后用含有FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP的培养基温育。将作为从用200nM FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP处理的U87EGFRvIII细胞检测的Alexa647信号强度的函数的事件与对照RNP(无FA的Alexa647-pRNA-3WJ RNP)进行比较。该图代表三个实验。
图6包含显示由FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP体外靶向的FA介导的人成胶质细胞瘤细胞T98G的图像。将多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞系T98G用200nM的FA-Alexa647-pRNA-3WJ或Alexa647-pRNA-3WJ处理1小时,随后进行荧光共聚焦显微镜检查。伪色用于细胞核(蓝色)、细胞骨架(绿色)和Alexa 647(红色)。
图7包括显示来源于人成胶质细胞瘤患者干细胞1123冷冻切片的脑肿瘤的共聚焦荧光成像的图像,证明FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP在脑肿瘤细胞(黄色箭头)中的分布和积累。伪色用于细胞核(蓝色)和Alexa 647(红色)。
图8包括显示利用RNA剂量依赖性(100>20μg/小鼠)方式由FA-Alexa647-pRNA-3WJRNP靶向的源自人成胶质细胞瘤患者干细胞1123的小鼠脑肿瘤的图像。在全身注射RNP后15小时评估携带肿瘤的小鼠脑荧光强度。
图9A是说明三价FA-3WJ-LNA-miR 21的构建图。图9A以显示顺序分别公开了SEQID NO:6、3、2和7。图9B包括说明通过流式细胞术确定的FA介导的体外人成胶质细胞瘤细胞靶向的图。
图10包括显示通过共聚焦荧光显微镜可视化的FR依赖性人成胶质细胞瘤靶向的图像。
图11包括显示共聚焦荧光显微镜分析的图像,其使人成胶质细胞瘤细胞的特定分布可视化。
图12包括显示全身递送的FA-3WJ-LNA-miR21 RNP在体内来源于肿瘤的人成胶质细胞瘤细胞中的抗肿瘤效果的图和图像。
图13是说明通过全身递送的FA-3WJ-LNA-miR21在小鼠肿瘤中内源性miR-21敲低的图。
图14中A和B是显示通过Pten蛋白表达恢复借助于系统递送的FA-3WJ-LNA-miR21诱导的凋亡途径的miR-21下调的图和图像。
图15是显示通过全身递送的FA-3WJ-LNA-miR21改善的携带脑肿瘤小鼠的总体存活在小鼠肿瘤中内源性miR-21敲低的图。
具体实施方式
在本文档中阐述了本发明公开的主题的一个或多个实施例的细节。在研究了本文献中提供的信息之后,本文档中描述的实施例以及其他实施例的修改对于本领域普通技术人员将是显而易见的。本文件中提供的信息,特别是所描述的示例性实施例的具体细节,主要是为了清楚理解而提供,并且不应从中理解不必要的限制。在某些情况下,本文公开的核苷酸和多肽包括在公众可获得的数据库中,例如和SWISSPROT。包括与这些公开可用的数据库中的这些核苷酸和多肽相关的序列和其他信息明确地通过引证并入本文。除非另有说明或显而易见,否则对这种公开可用的数据库的引证是指在本申请的提交日期的数据库的最新版本。
虽然本文使用的术语被认为便于本领域普通技术人员理解,定义以便于解释本发明公开的主题。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与目前所公开的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在实践中或最近公开的主题测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料,但现在还是要描述代表性的方法、装置、和材料。
根据长期专利法惯例,当在本申请(包括权利要求)中使用时,术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个”。因此,例如,提及“一个细胞”包括多个这样的细胞,等等。
除非另有说明,在说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质例如反应条件等的量的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此,除非有相反的指示,否则本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值,其可以根据本发明所公开的主题所获得的期望性质而变化。
如本文所使用的,术语“约”当指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时,意味着包括在一些实施方案中从特定值±20%的变化,在一些实施方案中±10%,在一些实施方案中为±5%,在一些实施方案中为±1%,在一些实施方案中为±0.5%,和在一些实施方案中为±0.1%,因为这些变化适于执行所公开的方法。如本文所使用的,范围可以表示为从“约”一个特定值,和/或至“约”另一个特定值。还应理解,存在本文公开的多个值,并且除了值本身之外,每个值还在本文中被公开为“约”该特定值。例如,如果公开值“10”,则还公开“约10”。还应当理解,还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如,如果公开了10和15,则还公开了11、12、13和14。
本发明公开的主题涉及治疗受试者的脑肿瘤的RNA纳米结构分子和方法。更具体地,本发明公开的主题涉及包含多分支RNA连接基序、脑肿瘤靶向模块的分子。此外,本发明公开的主题涉及使用RNA纳米结构组合物治疗患有脑肿瘤或处于患脑风险的受试者的脑肿瘤的方法。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了人工RNA纳米结构分子。该分子包括包含至少一种RNA寡核苷酸的多分支RNA连接基序和脑肿瘤靶向模块,并且所述模块与RNA连接基序偶联。在一些实施方案中,所述分子还包括与RNA连接基序偶联的至少一种生物活性剂。在一些实施方案中,RNA寡核苷酸的长度为至少约6个核苷酸。
由于最近发现其高热力学稳定性、有利和独特的体内属性(US2014/0179758,通过引证整体并入本文),RNA纳米技术最近已经作为重要领域出现。在本公开的一些实施方案中,如US2014/0179758中所公开的,RNA分子形成二聚体、三聚体、六聚体和图案化的超结构。此外,可以通过形状、尺寸和化学计量的精确控制来制造RNA纳米颗粒,如通过噬菌体phi29 DNA包装电机的包装RNA(pRNA)所证实的,其通过互锁环的手牵手相互作用形成二聚体、三聚体和六聚体。
在一些实施方案中,本发明公开的主题涉及基于RNA纳米颗粒的组合物。这样的纳米颗粒被全身递送并且特异性靶向颅内肿瘤,具有最小毒性。在一些实施方案中,纳米颗粒涉及pRNA三向连接(pRNA-3WJ)。噬菌体phi29 DNA包装电机的pRNA-3WJ可用于制造具有形状、尺寸和化学计量的精确控制的RNA纳米颗粒(RNP)(4-10)。最近报道了形成具有可控形状和限定化学计量的耐沸腾RNP(11)。
术语“RNA”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、具有双链和单链区域的RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA、以及改变的RNA或模拟RNA,其通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而与天然存在的RNA不同。这种改变可以包括添加非核苷酸材料,例如到siRNA的末端或内部,例如在RNA的一个或多个核苷酸。本发明公开主题的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸,例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
在一些实施方案中,RNA纳米颗粒的RNA寡核苷酸包括在2’位置的至少一个化学修饰。化学修饰的非限制性实例包括2’-氟、2’-胺基、2’O-甲基或其组合。在一个实施方案中,具有U和C核苷酸的2’-氟(2’-F)修饰的pRNA-3WJ纳米颗粒使得RNP对RNA酶降解具有抗性,增强它们的体内半衰期,同时保留所结合的模块的真实功能(7,12,13)。此外,pRNA-3WJRNP是无毒的、非免疫原性的、并在小鼠中显示有利的生物分布和药代动力学特征(14)。这些有利的特性使得这种新型平台对于成胶质细胞瘤的siRNA的全身递送具有吸引力。用于成胶质细胞瘤靶向中的纳米颗粒治疗的一种有希望的配体是叶酸,B族维生素家族的天然成员。叶酸是早期神经元发育和分化所必需的(15)。其通过血脑脊液屏障(BCSF)的运输通过脉络丛发生(16)。脉络丛在体内表达最大量的叶酸受体(FR),而在小脑、大脑或脊髓中没有检测到FR表达(17,18)。
在一些实施方案中,多分支RNA包括核苷酸序列5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGGAUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中,多分支RNA包括序列5’-GATAAGCT CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了三分支RNA连接基序的分支包括a3WJ RNA模块。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序的分支包括b3WJ RNA模块。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序的分支包括c3WJ RNA模块。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序包括a3WJRNA模块、b3WJ RNA模块和c3WJ RNA模块。RNA模块的非限制性实例包括核苷酸序列5’-UUGCCA UGU GUA UGU GGG-3’(SEQ ID NO:1)、5’-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3’(SEQ IDNO:2)和5’-GGA UCA AUC AUG GCAA-3’(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中,分子的直径为至少约40nm或更小。直径为至少约35nm或更小,至少约30nm或更小,至少约25nm或更小,至少20nm或更小,至少15nm或更小,至少10nm或更小,至少5nm或更小。
在一些实施方案中,分子具有约-150mV至约150mV范围的ζ电位。RNA分子具有约-140mV至约140mV、约-130mV至约130mV、约-120mV至约120mV、约-110mV至约110mV、约-90mV至约90mV、约-80mV至约80mV、约-70mV至约70mV、约-60mV至约60mV范围的ζ电位。在一些实施方案中,RNA分子具有约-50mV至约50mV的ζ电位。该分子具有范围从约-45mV至约45mV、从约-40mV至约40mV、从约-35mV至约35mV、从约-35mV至约30mV、从约-35mV至约20mV、从约-25mV至约15mV的ζ电位。
在一些实施方案中,RNA纳米结构分子在约2至约13的pH范围内基本上稳定。RNA分子在pH约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13时基本上是稳定的。如本文所用,术语“基本上稳定”可以指物理和/或化学稳定性。本领域普通技术人员将认识到,术语“基本上稳定”可以指相对于初始组合物(即,当最初制备组合物的特定批次时)在某些条件下组合物的稳定性。在这点上,如本领域普通技术人员将认识到的,可以确定组合物的具体实施方案的稳定性的一种方式如下:制备一批该组合物的实施方案,进行组合物样品(对照样品)的初始评估,使组合物的样品经受感兴趣的条件(例如,在特定温度下储存特定时间段)(测试样品),对测试样品进行评估,并将对照样品的评估与测试样品的评估进行比较。可以进行计算以确定测试样品中存在的量是否为对照样品中的量的100%±20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了人工RNA纳米结构分子中的脑肿瘤靶向模块包括结合至至少一种脑肿瘤细胞表面标记物的配体。如本文所使用的,细胞表面标记物包括可以在细胞表面内或表面上检测到的任何细胞成分,或结合或聚集到细胞表面的大分子。因此,细胞表面标记物不限于物理地在细胞表面上的标记物。例如,细胞表面标记可以包括但不限于表面抗原、跨膜受体或共受体、结合到表面的大分子例如结合或聚集的蛋白质或碳水化合物、内部细胞成分等。脑肿瘤表面标记物的非限制性实例包括叶酸受体、EGFR、转铁蛋白受体和RGD。在一些实施方案中,配体包括适体。在一些实施方案中,适体结合EGFR、PDGFR或叶酸受体。在一些实施方案中,靶向模块是叶酸。
在一些实施方案中,脑肿瘤靶向模块偶联至RNA纳米颗粒。靶向模块将纳米颗粒导向脑肿瘤细胞,增强与它们的结合,以增强内化,增强对细胞酶、DNA、RNA、蛋白质、脂质或碳水化合物的靶向。脑肿瘤靶向模块的非限制性实例是抗体、抗体片段、多肽、细胞配体、适体、DNA、RNA、药物、增强靶向脑肿瘤细胞的化合物和增强与脑肿瘤细胞结合的其它基团或材料。
在一些实施方案中,脑肿瘤靶向模块可以是抗体。抗体可以具有识别和特异性结合至肿瘤细胞和组织上的靶的能力。抗体的非限制性实例是配置成特异性结合选自但不限于EGFR、人表皮生长因子(HER)、层粘连蛋白411、胰岛素样生长因子(IGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的蛋白质的抗体。
在一些实施方案中,靶向模块是描述为拮抗剂抗体类别的抗体,其特异性结合至脑肿瘤干细胞标记蛋白并干扰例如配体结合、受体二聚化、脑肿瘤干细胞标记蛋白的表达和/或癌干细胞标记蛋白的下游信号传导。在其它实施方案中,靶向模块是被描述为激动剂抗体类别的抗体,其特异性结合至脑肿瘤干细胞标记蛋白并促进例如配体结合、受体二聚化和/或癌干细胞标记蛋白的信号传导。在进一步的实施方案中,靶向模块是不干扰或促进脑肿瘤干细胞标记蛋白的生物活性的抗体,并且可以代替地通过例如抗体内化和/或通过免疫系统识别起到抑制肿瘤生长的功能。
在一些实施方案中,靶向模块可以包括凝集素或对转铁蛋白受体特异的另一配体。脑肿瘤靶向模块还可以是用于细胞表面受体或抗原的任何数目之一的配体,例如RGD。
靶向模块的另外的实例是在构建与RNA纳米颗粒的缀合中与聚苹果酸共价连接的化学分子、小药物分子或发色团分子、或蛋白质分子或凝集素。
本文所用的术语“叶酸(folate)”可以包括例如明确限定的B维生素化合物类,包括但不限于5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、叶酸(folic acid)和其它叶酸化合物。由于叶酸是高度增殖细胞、许多癌细胞例如脑、卵巢、肺、乳腺、肾、子宫内膜、结肠和骨髓的那些中DNA复制和甲基化期间所需的必需成分,过度表达FR以增加叶酸摄取。氧化型叶酸(FA),叶酸的合成氧化形式,已广泛用作各种癌靶向材料中的配体(20)。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了包括药物、荧光染料、化学品或其组合的生物活性剂。在一些实施方案中,生物活性剂包括成像模块。成像模块的非限制性实例是荧光染料,包括非限制性实例Alexa647。在一些实施方案中,生物活性剂偶联至RNA纳米结构分子。在一些实施方案中,生物活性剂是治疗剂。在一些实施方案中,生物活性剂包括siRNA、miRNA、抗miRNA、核酶RNA和反义RNA,或其组合。在一些实施方案中,生物活性剂针对脑肿瘤标记物。生物活性剂的非限制性实例包括siRNA序列和微RNA序列。
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA实现的导致特定信使RNA(mRNA)降解的多核苷酸序列特异性转录后基因沉默机制,从而减少由mRNA编码的所需靶多肽的表达(参见例如WO 99/32619;WO 01/75164;美国专利号6,506,559;Fire等人,Nature 391:806-11(1998);Sharp,Genes Dev.13:139-41(1999);Elbashir等人Nature 411:494-98(2001);Harborth等人,J.Cell Sci.114:4557-65(2001))。RNAi由下文所述的双链多核苷酸介导,例如双链RNA(dsRNA),其具有对应于编码表达受损的多肽部分的外显子序列。
术语“小干扰RNA”、“短干扰RNA”、“小发夹RNA”、“siRNA”和shRNA可互换使用,是指能够介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默的任何核酸分子。参见例如,Bass,Nature 411:428-429,2001;Elbashir等,Nature 411:494-498,2001a;和PCT国际公开号WO 00/44895、WO01/36646、WO 99/32619、WO 00/01846、WO 01/29058、WO 99/07409和WO 00/44914。在一个实施方案中,siRNA包括包含互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子,其中反义区包含与靶核酸分子(例如,编码BRCAA1的核酸分子)的区域互补的序列。在另一个实施方案中,siRNA包括具有自互补的有义和反义区的单链多核苷酸,其中反义区包含与靶核酸分子的区域互补的序列。在另一个实施方案中,siRNA包括具有一个或多个环结构的单链多核苷酸和包含自互补有义和反义区的茎,其中该反义区包含与靶核酸分子的区域互补的序列,并且其中多核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA。如本文所使用的,siRNA分子不需要限于仅含有RNA的那些分子,而是还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
在一些实施方案中,本公开主题的siRNA分子是结合至单链RNA分子的siRNA分子,所述单链RNA分子是编码至少部分肽或蛋白质的信使RNA(mRNA),其活性促进哺乳动物的脑或脊髓中的肿瘤发生、血管生成、或细胞增殖,或其是活性促进哺乳动物的脑或脊髓中的肿瘤发生、血管生成或细胞增殖的微RNA(miRNA)。在本公开的一些实施方案中,为了干扰肿瘤发生编码基因以复原脑肿瘤生长,RN纳米结构分子沉默癌基因包括但不限于RAS、cMET、HER2、MDM2、PIK3CA、AKT和CDK4。
本文使用的短语“脑肿瘤标记物”是指表征脑癌症中的一些或全部细胞的基因或基因产物(例如,RNA分子或蛋白质)。具有诊断价值的脑癌症标记物可以是在正常非癌性细胞中表达的基因或基因产物,但是其特征在于癌症的类型或分类,例如通过与正常非癌细胞中的其表达相比其过表达或表达不足。具有预后价值的脑肿瘤标记物是基因或基因产物,其中过表达或表达不足赋予关于癌症的未来侵袭性和/或其在诊断时对治疗的反应的预测信息。在癌症样品中,诊断和预后癌症标记物的表达模式允许分别准确地识别和确定疾病的未来病程。脑肿瘤生物标记物的非限制性实例描述于WO2007069882中(通过引证整体并入本文)。
在一个实施方案中,siRNA分子与编码肽或蛋白质的至少一部分的mRNA结合,其活性促进哺乳动物的脑或脊髓中的肿瘤发生、血管生成和细胞增殖、或其组合。当mRNA分子编码促肿瘤发生途径、促血管生成途径、促细胞增殖途径或抗凋亡途径中的蛋白质时,可能是这种情况。例如,蛋白质可以是VEGF途径蛋白、EGFR途径蛋白、MGMT途径蛋白、RAF途径蛋白、MMP途径蛋白、mTOR途径蛋白、TGFβ途径蛋白或Cox-2途径蛋白。在一个实施方案中,蛋白质是以下之一,包括但不限于VEGF、EGFR、PDK、AKT、AGT、RAFl、RAS、MAPK、ERK、MGMT、MMP-2、MMP-9、PDGF、PDGFR、IGF-I、HGF、mTOR、Cox-2或TGFβ1。在另一个实施方案中,蛋白质是VEGF、EGFR、MGMT、MMP-2、MMP-9或PDGF。在另一个实施方案中,蛋白质是RAFl、mTOR、Cox-2或TGFβ1。
在一些实施方案中,本公开提供了生物活性剂是微RNA序列。如本文所使用的,如本文所使用的术语“微RNA(miRNA)”是长度为至少约6个核苷酸的单链或双链非编码RNA,其可以通过降解靶mRNA或抑制其翻译在它们的转录水平调节基因表达(参见例如Bartel,DP,(2004),Cell,116,281-297;Liang Z.,et al.,(2013),J Genet.Genomics,40,141-142)。MiRNA在调节细胞周期、增殖、分化、代谢和凋亡中起重要作用。微RNA和各个微RNA结合序列的纲要可在miRNA登记处获得。(参见例如Griffiths-Jones等(2006)Nucl.Acids Res.34:D140-D144,US20140045709,通过引证以其整体并入本文)。在具体实施方案中,本公开中使用的微RNA和微RNA结合序列与疾病或病症相关,其中对微RNA的拮抗剂或激动剂可用于预防或治疗疾病或病症。miRNA的失调已涉及几种癌症类型中的肿瘤起始、进展和转移(参见,Carlin GA等人,Nat.Rev.Cancer 2006,6,857-866;Di LG等人,Annu.Rev.Pathol.2014,9,287-314;Garzon,R等人,Annu.Rev.Med.2009,60,167-179;Iorio,MV等人,Cancer Res2005,65,7065-7070;Croce,C.M.等人,Cell 2005,122,6-7。)。miRNA具有巨大的癌症治疗潜力,特别是因为一个miRNA可以有效和同时调节广泛的靶基因,因此可以解决癌症的异质性。天然存在的miRNA进一步显示降低的免疫应答和低毒性。已经开发了敲低肿瘤发生miRNA的抗miRNA和上调内源性miRNA的miRNA模拟物作为实现肿瘤消退的治疗策略(Henry,J.等.Pharm Res 2011,28,3030-3042)。然而,主要的限制因素是将这些治疗模块特异性递送至受影响的细胞和组织的能力。纳米技术在这方面具有很大的希望,并且已经研究了几种纳米平台,但仍然缺乏抑制肿瘤进展的有效策略(Grodzinski,P.;Torchilin,V.;(Editors)Adv.Drug Delivery Rev.:Cancer Nanotechnology;Volume 66ed.;Elsevier:2014.)。
在一些实施方案中,微RNA或抗miRNA序列的长度为至少约3个核苷酸。在一些实施方案中,miRNA分子具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多的长度。在一些实施方案中,miRNA分子的抗miRNA或拮抗剂的长度为至少约6个核苷酸。在一些实施方案中,miRNA分子的拮抗剂具有至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多的长度。
在一些实施方案中,为了干扰肿瘤发生miRNA以复原脑肿瘤生长,RNA纳米结构分子含有沉默肿瘤发生miRNA(包括但不限于miR-9、miR-10b、miR-21、miR-17和miR-26)的抗miRNA。在一些实施方案中,为了拯救下调的肿瘤抑制性miRNA,RNA纳米结构引入物包括肿瘤抑制性miRNA,包括但不限于let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145、和miR-181b。miRNA序列如下:
miR-9:5’-UCUUUGGUUA UCUAGCUGUA UG-3’(SEQ ID NO:8)
miR-10b:5’-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’(SEQ ID NO:9)
miR-26a:5’-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’(SEQ ID NO:10)
let-7a:5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’(SEQ ID NO:11)
miR-25:5’-AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG-3’(SEQ ID NO:12)
miR-34a:5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’(SEQ ID NO:13)
miR-124:5’-CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU-3’(SEQ ID NO:14)
miR-145:5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’(SEQ ID NO:15)
miR-181b:5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3’(SEQ ID NO:16)
在一些实施方案中,微RNA包括锁定核酸(LNA)序列。在一些实施方案中,微RNA是LNA-抗miR21序列5’-+G+A+T+A+A+G+C+T CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQID NO:7)(下划线序列是8聚抗miR21 LNA,并且“+”表示LNA序列)。在一些实施方案中,RNA纳米结构含有链LNA17_sph1:5’-+A+G+C+A+C+T+T+TCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGAT-3’(SEQID NO:17)(“+”表示LNA序列)。在另一个实施方案中,RNA纳米结构含有LNA19a_sph 1的链:5’-+A+T+T+T+G+C+A+CCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGAT-3’(SEQ ID NO:18)(“+”表示LNA序列)。
在一些实施方案中,本公开提供了miRNA的抑制剂(例如,抗miR-21)。本文还公开了包含此类抑制剂的组合物和使用此类抑制剂抑制miR-21的方法。任何miRNA抑制剂可以单独使用,或与本领域已知的其他miRNA抑制剂一起使用。在一些实施方案中,miRNA抑制剂包含反义分子。在一些实施方案中,反义分子可以是单链或双链序列。反义分子的实例包括但不限于siRNA、三螺旋形成剂、核酶、RNAi、合成肽核酸(PNA)、抗原(agRNA)、LNA/DNA共聚物、小分子化合物和反义寡核苷酸。
在本公开主题的一些实施方案中,还提供了核酸组合物。所述组合物包含治疗有效量的上述人工RNA纳米结构分子。在一些实施方案中,组合物包括药学上可接受的载体。
另外,在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了纳米颗粒递送系统。递送系统包括如上所述的人工RNA纳米结构分子。在一些实施方案中,纳米颗粒递送系统进一步包括药学上可接受的载体。
在另一方面,在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了治疗患有脑肿瘤或处于发生脑肿瘤风险的受试者的脑肿瘤的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含如上文和本文所公开的人工RNA纳米结构分子的组合物。在一些实施方案中,该组合物包括药学上可接受的载体。
此外,在一些实施方案中,本公开提供了预防患有脑肿瘤复发或处于发生脑肿瘤复发风险的受试者中脑肿瘤复发的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含如上文和本文所公开的人工RNA纳米结构分子的组合物。在一些实施方案中,该组合物包括药学上可接受的载体。
脑肿瘤是非常严重的,并且是最难以治疗的,尽管施用了可获得的最佳治疗,但患者的生存期非常短。与其余人体的癌症相比,由血液-脑脊液屏障(BCFB)分离的脑的非常独特的生物环境明显地促成了该器官中需要替代治疗的一系列位点特异性癌症。治疗主要包括手术切除和放射治疗;也使用化学疗法,但合适的化疗剂的范围是有限的,可能是因为大多数治疗剂不足以穿透血脑屏障以治疗脑肿瘤。使用已知的化学治疗以及手术和放射很少延长生存远超过由手术和单独的放射产生的生存。因此,脑肿瘤需要改善治疗选择。
在一些实施方案中,脑肿瘤是神经胶质瘤。神经胶质瘤是常见类型的脑肿瘤。它们产生于由神经胶质细胞组成的支持性神经组织(因此称为神经胶质瘤),其维持神经元的位置和功能。在一些实施方案中,根据它们类似的神经胶质细胞的类型将神经胶质瘤分类:星形细胞瘤(包括成胶质细胞瘤)类似星形状的星形细胞胶质细胞,少突神经胶质瘤类似少突神经胶质细胞;和室管膜瘤类似于室管膜胶质细胞,其形成脑中流体腔的衬里。在一些实施方案中,肿瘤可以含有这些细胞类型的混合物,并且将被称为混合胶质瘤。
如本文所讨论的,在一些实施方案中,脑肿瘤是成胶质细胞瘤。成胶质细胞瘤是成人中最常见的原发性脑肿瘤,也是最致命的癌症之一(1)。成胶质细胞瘤患者的中位生存期小于15个月。不良预后主要是由于肿瘤复发,其被认为源自在初级治疗中存活的癌症干细胞的亚组。最近的研究表明成胶质细胞瘤干细胞存活时间比治疗应力长,当它们复发时,会变得更具侵略性,从而发展成对初级化疗的抗性。在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了将本文公开的RNA纳米结构组合物施用于脑肿瘤细胞和成胶质细胞瘤干细胞以治疗原发性脑肿瘤并防止肿瘤复发的方法。
在一些实施方案中,本文公开的方法包括给予受试者治疗有效量的组合物。所述组合物包括人工RNA纳米结构分子,其中所述分子包括包含至少一个RNA寡核苷酸的多分支RNA连接基序、偶联于RNA连接基序的脑肿瘤靶向模块和偶联于RNA连接基序的至少一种治疗剂。在一些实施方案中,组合物还包括药学上可接受的载体。在一些实施方案中,生物活性剂包括治疗剂。在一些实施方案中,RNA寡核苷酸在2’位置包含至少一个化学修饰。修饰的非限制性实例包括2’氟、2’胺基、2’O-甲基或其组合。在一些实施方案中,基序是三分支RNA连接基序。三分支RNA连接基序的非限制性实例包括包装RNA(pRNA)三向连接(3WJ)基序。在一些实施方案中,分子的直径为至少约40nm或更小。在一些实施方案中,所述分子具有约-50mV至约50mV的ζ电位。在一些实施方案中,多分支RNA包括核苷酸5’-UUG CCA UGUGUA UGU GGG AUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO:6)。在另一个实施方案中,多分支RNA包含序列5’-GATAAGCT CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ IDNO:7)。在一些实施方案中,三分支RNA连接基序的分支包括a3WJ RNA模块(SEQ ID NO:1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO:2)、或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO:3)中的至少一种。
在一些实施方案中,本公开主题的方法中的脑肿瘤靶向模块包括结合至至少一种脑肿瘤细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中,配体结合至叶酸受体、EGFR、转铁蛋白受体、RGB或其组合。在一些实施方案中,配体包含适体。在一些实施方案中,靶向模块包含叶酸。叶酸的非限制性实例包括氧化型叶酸(folic acid)、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸或其它叶酸化合物。
在一些实施方案中,本公开主题的方法中的治疗剂包括药物、荧光染料、化学品或其组合。此外,治疗剂包括siRNA、miRNA、抗miRNA、核酶RNA、反义RNA、或其组合。在一些实施方案中,治疗剂针对脑肿瘤标记物。在一些实施方案中,治疗剂是siRNA序列或微RNA序列。在一些实施方案中,微RNA序列的长度为至少6个核苷酸。微RNA的非限制性实例是锁定核酸(LNA)序列。LNA序列的实例是本文所述的LNA-miR21序列。在一些实施方案中,siRNA与脑或脊髓中促进肿瘤发生、血管生成、细胞增殖或其组合的基因的mRNA序列结合。在一些实施方案中,siRNA结合至编码包括促肿瘤发生途径蛋白、原促血管生成途径蛋白、促细胞增殖途径蛋白、抗凋亡途径蛋白或其组合的蛋白的mRNA分子。在一些实施方案中,mRNA分子编码包括VEGF途径蛋白、EGFR途径蛋白、MGMT途径蛋白、Raf1途径蛋白、MMP途径蛋白、mTOR途径蛋白、TGFβ途径蛋白或Cox-2途径蛋白或其组合的蛋白。在一些实施方案中,所述蛋白包括VEGF、EGFR、POK、AKT、AGT、RAF、RAS、MAPK、ERK、MGMT、MMP-2、MMP-9、PDGF、PDGFR、IGF-I、HGF、mTOR、Cox-2或TGFβ1。
此外,在所述方法的一些实施方案中,本主题涉及使用FA缀合的pRNA-3WJ RNP靶向和递送治疗性siRNA到脑肿瘤的方法。首先,建立小鼠的颅内肿瘤异种移植模型,然后通过尾静脉系统施用RNP。基于荧光成像,证明pRNA-3WJ RNP有效靶向和通过FR介导的内吞作用内化到脑肿瘤细胞,在相邻的健康脑细胞中很少或没有积累。在荧光素酶基因表达脑肿瘤中也证实了RNP的基因沉默。更重要的是,pRNA-3WJ RNP也能够靶向来源于人类患者的脑肿瘤干细胞。数据表明人工设计的RNP可以特异性靶向脑肿瘤细胞,包括成胶质细胞瘤干细胞,并递送功能性siRNA和治疗性微RNA(miRNA)(21)。
本文所用的术语“治疗”和“预防”应以其最广义的上下文考虑。术语“治疗”不一定意味着对宿主进行治疗直到完全恢复。类似地,“预防”不一定意味着受试者最终不会收缩疾病状况。因此,治疗和预防包括改善特定病症的症状或预防或以其它方式降低发展特定病症的风险。术语“预防”可以被认为是降低特定病症的发作的严重性。“治疗”还可以降低现有病症的严重性。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指与本发明的异二聚体探针一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体并且由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典中或其它公认的药典列出用于动物、更特别是用于人类。这样的药物载体可以是液体,例如水和油,包括石油、动物、植物(vegetable,蔬菜)或合成来源,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。当给予患者时,异二聚体探针和药学上可接受的载体可以是无菌的。当静脉内施用异二聚体探针时,水是有用的载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体,特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂,例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所需的本发明组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。本发明的组合物可有利地采取溶液、乳液、持续释放制剂形式或适合使用的任何其它形式。
本文所用的术语“治疗有效量”是指对已经患有疾病、病症或障碍的患者施用的组合物的量,其足以治愈或至少部分阻止或在一定程度上缓解一种或更多种被治疗的疾病、障碍或病症的症状。这些组合物的有效性取决于包括但不限于以下条件:疾病、障碍或病症的严重性和病程、以前的治疗、患者的健康状况和对药物的反应,以及治疗医师的判断。仅作为实例,治疗有效量可通过常规实验确定,包括但不限于剂量递增临床试验。
任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素,包括所治疗的障碍和障碍的严重程度;所使用的具体组合物;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;给药时间;给药途径;所使用的具体化合物的排泄速率;治疗的持续时间;与所使用的具体化合物组合或同时使用的药物以及医学领域中熟知的类似因素。例如,本领域技术人员熟知的是,以低于实现所需治疗效果所需的水平开始化合物的剂量,并逐渐增加剂量,直至达到所需的效果。如果需要,为了给药的目的,有效日剂量可以分成多个剂量。因此,单剂量组合物可含有这样的量或其约数以构成每日剂量。在任何禁忌症的情况下,剂量可以由个体医生调整。剂量可以变化,并且可以每天一次或多次剂量施用,施用一天或几天。可以在文献中找到针对给定类别的药物产品的适当剂量的指导。在另外的各个方面,制剂可以以“预防有效量”施用;即,有效预防疾病或病症的量。
如本文所用,术语“受试者”是指药物组合物的给药靶标。本文公开的方法的主题可以是脊椎动物,例如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此,本文公开的方法的主题可以是人或非人。因此,根据本发明公开的主题提供兽医治疗用途。因此,本发明公开的主题提供对哺乳动物如人和非人灵长类动物以及由于濒危而重要的哺乳动物如西伯利亚虎的施用;具有经济重要性,例如在农场饲养以供人类消费的动物;和/或对人类具有社会重要性的动物,例如保持为宠物或动物园中的动物。这样的动物的实例包括但不限于:食肉动物如猫和狗;猪类,包括乳猪(pig)、阉猪(hog)和野公猪(boar);反刍动物和/或有蹄动物如牛(cattle)、公牛(oxem)、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼;兔,豚鼠和啮齿动物。还提供了鸟类的治疗,包括治疗那些种类的濒危和/或保存在动物园中的鸟类以及家禽,更特别是驯养的家禽,即家禽,例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等,因为它们对人类也具有经济重要性。因此,还提供了家畜的治疗,包括但不限于驯养的猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)、家禽等。该术语不表示特定的年龄或性别。
根据本发明的方法向受试者施用有效量的组合物的合适方法包括但不限于全身施用、肠胃外施用(包括血管内、肌内、动脉内施用)、口服递送、口腔递送、皮下施用、吸入、气管内安装、手术植入、透皮递送、局部注射和超速注射/轰击。在适用的情况下,连续输注可增强靶位点处的药物积累(参见例如美国专利号6,180,082)。
根据本发明的方法使用的具体的药物给药方式取决于多种因素,包括但不限于所使用的载体和/或药物载体、待治疗的病症的严重程度和给药后药物代谢或去除的机制。
本发明公开的主题通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明。以下实施例可以包括代表在与本公开主题相关的开发和实验过程中的各个时间收集数据的汇编。
实施例1
成胶质细胞瘤是最致命的癌症之一。治疗成胶质细胞瘤患者的系统siRNA施用需要无免疫原性的强大且有效的递送平台。这个实施例报告用于成胶质细胞瘤靶向的基于噬菌体phi29的pRNA 3向连接(3WJ)的RNA纳米技术的应用。构建多价叶酸(FA)缀合的RNA纳米颗粒以收获siRNA。所得的FA-pRNA-3WJ RNA纳米颗粒(RNP)特异性靶向并进入体外人类恶性成胶质细胞瘤和体内颅内成胶质细胞瘤异种移植物。系统注入的FA-pRNA-3WJ RNP成功地靶向并递送siRNA到小鼠的脑肿瘤细胞中,并有效地降低荧光素酶报道基因表达(比对照低4倍)。还证明FA-pRNA-3WJ RNA纳米颗粒靶向源自人类患者的成胶质细胞瘤干细胞(其被认为负责肿瘤起始、抗药性和致命复发)和小鼠模型中的衍生脑肿瘤,而在邻近正常脑细胞中没有积累,在其他主要内脏内也没有积累。这项研究的结果可能承诺pRNA-3WJ RNP用于特定递送治疗剂如siRNA、微RNA和/或化疗药物到成胶质细胞瘤细胞中的成功临床应用,而不对健康组织造成附带损伤。
结果与讨论
该研究是为了评估在小鼠模型系统中pRNA-3WJ RNP用于将治疗性RNA(例如siRNA和miRNA)全身递送至脑肿瘤中的应用。为了将siRNA定向递送到脑肿瘤中,如先前所述(7,12,13,22),使用基于具有轻微修饰的phi29噬菌体的pRNA序列的支架,构建了多功能RNP(参见材料和方法)。体外单独转录或化学合成的三个RNA模块以相等的摩尔比混合并通过一步自组装形成三分支RNP。每个RNA模块设计为携带功能部分:1)FA作为FR靶向配体;2)荧光团Alexa647作为显像剂;和3)荧光素酶siRNA作为基因沉默功能部分或混杂RNA作为阴性对照(图1中A)(7,12,13,22)。所得RNP命名为FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP。在原子力显微镜(AFM)下观察自组装的FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP揭示了在中心具有3WJ芯的均匀三分支结构的形成(图1中B),证实了先前的报道:每个RNA模块上的修改没有取消形状控制自组装以保留对均匀一致RNP形成必不可少的pRNA-3WJ芯结构。动态光散射(DLS)确定FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP的平均流体动力学直径为5.2±1.2nm(图1中C),其小于通过RNA折叠软件基于预期的双链体螺旋参数和三个单独的RNA模块的碱基对长度计算的预计尺寸(10×4×2nm)。DLS测量和计算预测之间的差异意味着由于溶液中纳米颗粒的快速运动,避免了FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP的每个突出分支的平均三维。对于体内成功系统应用纳米颗粒所需要解决的的另一个因素是免于聚集,以避免从身体的快速清除和减少的共轭配体和细胞靶受体之间的特异性相互作用。聚集主要取决于纳米颗粒的表面电荷,并且RNA的表面确实是高度带电的。聚集也将改变与尺寸增加的程度成比例的表面电荷。为了确定聚集程度,对FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP进行ζ电位分析以测量颗粒表面电荷。将在PBS溶液中的FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP的ζ电位测量为在-15.8±5.6mV处的单峰(图1中D),这表明大多数FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP作为单一形式存在,并不聚集。这些物理性质有利于FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP用于全身体内应用。
已知人成胶质细胞瘤细胞过表达FR,而正常脑细胞不显示FR表达(17-19)。为了确定FA-pRNA-3WJ-si(luc)RNP对人成胶质细胞瘤细胞的特异性识别和结合能力,首先与无FA对照RNP(Alexa647-pRNA-3WJ)相比,在体外测试FA-Alexa647-pRNA-3WJ与U87EGFRvIII细胞的联合。流式细胞术分析显示FA-Alexa647-pRNA-3WJ与U87EGFRvIII细胞(63.1±4.5%)比Alexa647-pRNA-3WJ(40.3±3.7%)更高的联合(学生t检验,p<0.001,4)(图2中A)。当在RNP结合前通过用1mM游离叶酸温育1小时培养物来预先屏蔽U87EGFRvIII细胞的FR时,FA-Alexa647-pRNA-3WJ和U87EGFRvIII细胞之间的关联减少到与阴性对照Alexa647-pRNA-3WJ相似的程度(图5),这表明FA-Alexa647-pRNA-3WJ和U87EGFRvIII细胞之间的联合是FR依赖性的。通过在共聚焦荧光显微镜下可视化来自用FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP处理的表面培养的U87EGFRvIII细胞的Alexa647信号,进一步证实了FA-Alexa647-pRNA-3WJ与U87EGFRvIII细胞的FA介导的特异性结合。从用FA-Alexa647-pRNA-3WJ处理的U87EGFRvIII细胞中观察到的Alexa 647染料的荧光强度高于用对照RNP(Alexa647-pRNA-3WJ)观察到的那些(图2中B)。此外,通过用1mM游离叶酸在培养基中预处理U87EGFRvIII细胞消除FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP的FA依赖性联合(图2中B)。还观察到FA-Alexa647-pRNA-3WJRNP与人成胶质细胞瘤之间的FA介导的特异性联合具有包括T98G的其它成胶质细胞瘤系(图6)。总之,FA缀合的pRNA-3WJ RNP具有通过FR识别和结合至人脑肿瘤细胞的能力。
接下来,我们测试了FA-pRNA-3WJ RNP是否可以使用成胶质细胞瘤的正交转移小鼠模型在体内特异性靶向肿瘤细胞。在U87EGFRvIII细胞植入裸鼠脑内后第14天,通过MRI测定小鼠的颅内肿瘤生长(图2中C,顶部),随机分为三组,注射PBS、Alexa647-pRNA-3WJ作为两个阴性对照,FA-Alexa647-pRNA-3WJ作为实验。通过尾静脉(在100μL PBS中的1mg/kgRNP)注射每组小鼠(n=4)。注射后15小时,解剖小鼠脑并进行荧光成像以检测来自RNP的Alexa647信号。在注射FA-Alexa647-pRNA-3WJ的小鼠的脑中观察到比注射对照RNP(Alexa647-pRNA-3WJ)的小鼠脑中的Alexa 647更高的荧光信号(图2中C)。通过其肿瘤体积(Alexa647强度/肿瘤体积)标准化每组(n=4)荧光强度的ANOVA分析证实相比于Alexa647-pRNA-3WJ(1.014±0.279,s.e.m.)(p=0.019)相对于PBS(1.000±0.298,sem),FA-Alexa647-pRNA-3WJ处理的小鼠脑中平均荧光强度的明显增加(2.052±0.416,sem)(图2中D)。将脑肿瘤区域冷冻切片(10μm厚),并在荧光共焦显微镜下进一步检查。其显示FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP主要与复染色的脑肿瘤细胞相关(补充图7)。这些体内数据强烈地表明全身注射的FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP可以传播到脑组织,并通过FA-FR相互作用成功识别和结合人成胶质细胞瘤细胞,而不是随机分布在整个脑组织。
在结合到靶成胶质细胞瘤细胞后,RNP需要内化以递送其货物siRNA,用于成功的靶基因沉默,对于任何纳米颗粒这是最关键的性能,以要求保护其治疗应用。为了测试siRNA加载的FA-3WJ RNP是否能够在全身给药后的小鼠脑中的成胶质细胞瘤中沉默靶基因,我们在小鼠脑中通过植入荧光素酶基因表达U87EGFRvIII细胞(U87EGFRvIII-Luc)建立基于荧光素酶的基因表达报告系统。对于初步体外测试,将U87EGFRvIII-Luc细胞在含有范围为0-400nM的FA-pRNA-3WJ-si(Luc),或混杂RNA-结合的对照FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)RNP的培养基中温育72小时,没有任何转染剂。72小时后,FA-pRNA-3WJ-si(Luc)以浓度依赖性方式明显降低荧光素酶活性。在400nM,用FA-pRNA-3WJ-si(Luc)温育的U87 EGFRvIII-Luc细胞中的平均荧光素酶活性相对于0nM降低约5倍(0.214±0.210,s.e.m.)。然而,与0nM相比,FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)没有显著降低细胞中的荧光素酶活性(0.876±0.056,s.e.m.)。在400nM处FA-pRNA-3WJ-si(Luc)和FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)之间的荧光素酶活性的差异是统计学显著的(p=0.006)(图3中A)。对于体内试验,通过植入U87EGFRvIII-Luc细胞诱导小鼠中的颅内肿瘤。从所得到的脑肿瘤测量的生物发光信号预期与肿瘤生长相关。当在6天内对一组带有脑肿瘤的小鼠(n=5)全身注射FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)(在100μLPBS中1mg/kg)总共三次时,荧光素酶活性随着肿瘤生长快速增加,这表明对照RNP对荧光素酶基因表达没有影响。然而,观察到注射了FA-pRNA-3WJ-si(Luc)的小鼠组(n=5)的荧光素酶活性随时间非常缓慢地增加(图3中B)。3次注射后,注射FA-pRNA-3WJ-si(Luc)的小鼠的荧光素酶活性明显低于注射FA-pRNA-3WJ-is(Scrm)的对照组小鼠的荧光素酶活性(p=0.007)。在肿瘤植入后第13天来自测试小鼠的荧光素酶活性大部分低于来自用FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)处理的小鼠的荧光素酶活性(图3中C)。然而,MRI显示这两组之间的相对肿瘤大小在统计学上不显著(1.160±0.352mm3,s.e.m.相对于阴性对照组中的1.000±0.300mm3)(p=0.468,n=5)(图3中D)。当它们的荧光素酶活性通过肿瘤体积标准化时,来自用FA-pRNA-3WJ-si(Luc)处理的小鼠的肿瘤体积的相对平均的荧光素酶活性(0.255±0.040发光率[p/s/cm2/sr]/肿瘤体积[mm3],s.e.m.)明显低于用FA-pRNA-3WJ-si(Scrm)处理的对照小鼠组(1.000±0.410发光率[p/s/cm2/sr]/肿瘤体积[mm3],s.e.m.)(p=0.015,n=5)(图4中E)。这些数据强烈表明FA-pRNA-3WJ RNP不仅特异性靶向成胶质细胞瘤细胞,而且成功地内化到细胞中并递送货物siRNA。更重要的是,所递送的siRNA在整个系统递送时间内保持功能完整,这证实了FA-pRNA-3WJ RNP的稳定性和治疗功效。该数据成功地证明了作为用于成胶质细胞瘤治疗的siRNA递送系统的治疗可用性。
在临床环境中,成胶质细胞瘤因其在初始治疗后具有增加的侵略性的频繁复发导致差的存活率臭名昭着。已经假设成胶质细胞瘤干细胞倾向于存活比初始治疗更长的时间并且诱导肿瘤复发,这意味着缺乏杀死成胶质细胞瘤干细胞的能力的任何治疗策略不会防止复发(23)。研究了FA-pRNA-3WJ RNP靶向成胶质细胞瘤干细胞及其衍生的肿瘤细胞的潜力。我们使用了人成胶质细胞瘤患者衍生的原代神经球细胞,命名为“1123”,其已经显示具有干细胞样特征,包括高水平的CD44表达、自我更新能力和植入小鼠脑中的致瘤性(24-26)。首先,将维持在无血清球形培养基中的CD44+1123细胞用200nM的FA-Alexa647-pRNA-3WJ或Alexa647-pRNA-3WJ RNP在体外温育。流式细胞术分析显示,与对照RNP(Alexa647-pRNA-3WJ)相比,FA-Alexa647-pRNA-3WJ较高地结合至1123细胞(图4中A)。与PBS处理的1123细胞相比,33.2±0.8%的CD44+1123细胞与FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP呈正相关。然而,Alexa647-pRNA-3WJ对照RNP仅与CD44+1123细胞的12.7±0.4%相关。FA-Alexa647-pRNA-3WJ和Alexa647-pRNA-3WJ之间的差异是统计学显著的(p<0.0001)。
对于全身评估,然后将一组小鼠植入1123个细胞以诱导颅内脑肿瘤。通过MRI确定小鼠具有相似大小的脑肿瘤,然后通过尾静脉在100μLPBS中注射PBS、Alexa647-pRNA-3WJ或FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP。注射后15小时,将脑切开并进行荧光成像。在肿瘤区域观察到FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP的更高积累,而从用对照RNP(Alexa647-pRNA-3WJ)或PBS处理的脑中观察到较少的Alexa647信号积累(图4中B)。当在携带小尺寸肿瘤的小鼠组中测试两种不同剂量的FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP(20或100μg/小鼠)时,荧光信号与注射的RNP的量成比例(补充图8)。这些观察表明FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP也可以通过FA-FR特异性相互作用识别和靶向人成胶质细胞瘤干细胞及其衍生的肿瘤细胞。在这些研究中,也观察到来自用无FA的3WJ-pRNA对照RNP处理组的荧光信号,尽管程度总是低于用FA-3WJ-pRNARNP处理组。这可以通过从人类患者衍生的干细胞样成胶质细胞瘤细胞诱导的肿瘤的性质来解释,其中侵略性超血管将大部分血管留下作为“渗漏”,因为它们在形成BBB的紧密连接之前不良完成,也称为EPR(增强的渗透性和保留)效果(27)。
为了在全身给药后评估整个身体中pRNA-3WJ RNP的生物分布特征,还将主要内部器官,包括心脏、肺、肝脏、脾脏和肾脏与脑一起收集并进行荧光成像。与脑相比,从除肾脏以外的内脏中没有检测到明显的荧光信号(图4中C)。FA-pRNA-3WJ RNP在其全身给药后的生物分布特征与先前的报道一致(28),因为未能靶向肿瘤细胞的FA结合药物通过肾脏从小鼠体内快速清除(t1/2<10分钟),这降低了在血液中循环的未结合的pRNA-3WJ纳米颗粒的安全性担心。
为了pRNA-3WJ RNP用于人成胶质细胞瘤的检测和治疗的成功临床应用,评估其通过将其与相邻正常脑细胞区分开来进入脑肿瘤细胞的能力以及具有有利的生物分布是至关重要的。为了解决这两个目标,最关键的检查点是决定pRNA-3WJ纳米颗粒的药物性,我们在小鼠中使用正交各向异性颅内成胶质细胞瘤模型系统。根据我们的观察,显然FA缀合的FA-pRNA 3WJ RNP可以通过由区分神经胶质瘤细胞与相邻正常脑细胞的FA-FR特异性相互作用介导的内吞作用靶向人成胶质细胞瘤细胞。一系列体外实验表明,这种体内靶向不明显是非特异性积累的结果,原因有两个:1)FA-pRNA-3WJ RNP与成胶质细胞瘤细胞的结合是配体依赖性的;和2)通过FA-FR特异性相互作用介导结合,因为游离叶酸预处理干扰靶向细胞上FA和FR之间的特异性相互作用。这表明FA-pRNA-3WJ RNP可以靶向和积累在FR+成胶质细胞瘤细胞中。综合以下事实,即在注射FA-3WJ RNA纳米颗粒后15小时收集我们的脑成像数据,并且观察到荧光素酶基因沉默效应数天,这些数据表明FA-pRNA-3WJ RNP可以在体内通过保留货物siRNA的化学完整性存活,直到它到达大脑。最重要的是,通过靶向作为报道系统的内源荧光素酶mRNA清楚地证明了FA-3WJ RNA纳米颗粒的治疗递送(图3)。从注射FA-3WJ-pRNA-si(Luc)RNP的小鼠组观察到的降低的荧光素酶活性清楚地回答了FA-3WJ RNP关于以下方面能力的问题:1)特异性靶向脑肿瘤细胞;2)内化进入脑肿瘤细胞;和3)释放功能部分(针对荧光素酶mRNA的siRNA)。此外,通过FA-FR介导的方式,pRNA-3WJ纳米颗粒对脑肿瘤细胞和成胶质细胞瘤干细胞的靶向能力将克服常规脑肿瘤治疗的弱点,常规脑肿瘤治疗常常依赖于连同辐射的手术减灭和较少特异性毒性的药物。总之,我们目前的研究成功地证明了FA结合的pRNA-3WJ RNP作为治疗性基因递送的临床应用的药物性,以满足新策略靶向和杀死成胶质细胞瘤干细胞及其衍生的肿瘤细胞的迫切需要。由于每个RNA模块的修饰的容易性和灵活性,任何药物缀合和siRNA可作为治疗功能剂加载到RNP。最近,已经发现微RNA参与成胶质细胞瘤的病理过程,使它们作为有希望的治疗靶标(29-32)。由于miRNA的尺寸和工作机制与siRNA的尺寸和工作机制类似(21),因此治疗性miRNA也可以被考虑加载到pRNA-3WJ-RNP上。
方法
FA-Alexa647-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP的构建
如前所述(7,12,13,22)稍作修改,制备多官能pRNA-3WJ RNP。简言之,称为a3WJ(5’-UUGCCAUGUGUAUGUGGG-3’(SEQ ID NO:1))、b3WJ(5’-CCCACAUACUUUGUUGAUCC-3’(SEQ IDNO:2))和c3WJ(5’-GGAUCAAUCAUGGCAA-3’(SEQ ID NO:3))的三个RNA模块在体外转录或使用2’-F修饰的核苷酸化学合成,并单独纯化至同质。对于目前的研究,每个RNA模块进一步修改如下:模块a3WJ用荧光素酶siRNA序列有义:5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAUU-3’(SEQ ID NO:4)和反义:5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3’(SEQ ID NO:5),或混杂的作为阴性对照延伸;模块b3WJ在3’端与FA缀合;并且模块c3WJ在3’端与荧光团Alexa647(Alexa647,Invitrogen)缀合。将三个RNA模块以相等的摩尔比混合以形成一步自组装。从6M含尿素的PAGE中纯化自组装的FA-Alexa647-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP,并在PBS中重构后在-80℃下冷冻。为了获得用于每个实验的指定浓度,在使用前将RNP进一步在PBS中稀释。
自组装FA-Alexa647-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP的表征
如前所述通过原子力显微镜(AFM)成像分析自组装FA-Alexa647-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP的最终形式的三维结构和形状7,12,13,22。通过Zetasizer nano-ZS(MalvernInstrument)在25℃下测量PBS缓冲液中的预装配的FA-Alexa647-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP(1.5μM)的表观流体力学尺寸和ζ电位。激光波长为633nm。数据获自三次独立测量。
人成胶质细胞瘤细胞和人患者衍生的成胶质细胞瘤干细胞
从Webster Cavenee博士(Ludwig Cancer Institute,San Diego,CA)获得人成胶质细胞瘤细胞、U87EGFRvIII和U87EGFRvIII-Luc(表达荧光素酶报告基因)。两种细胞都保持在DMEM/10%FBS/青霉素/链霉素中。将人成胶质细胞瘤患者衍生的成胶质细胞瘤干细胞“1123”在补充有B27(1:50)、肝素(5mg/mL)、碱性FGF(bFGF)(20ng/mL)和EGF(20ng/mL)的DMEM/F12中培养。每周两次加入生长因子(bFGF和EGF)。
来自人成胶质细胞瘤细胞和人患者衍生的成胶质细胞瘤干细胞的颅内人成胶质细胞瘤异种移植物
根据由Institutional Review Board批准的俄亥俄州立大学的研究动物护理小组委员会来饲养和处理六周龄的无胸腺雌性nu/nu小鼠(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)。所有小鼠在植入肿瘤前喂食无叶酸饮食(Harlan,Indianapolis,IN)至少两周。如前所述,通过植入人成胶质细胞瘤细胞U87EGFRvIII或人患者衍生的成胶质细胞瘤干细胞(每只小鼠1×105个细胞)诱导颅内人成胶质细胞瘤异种移植肿瘤(33)。在颅内肿瘤植入两周后,通过磁共振成像(MRI)确定植入肿瘤的位置和尺寸。
小鼠中植入脑肿瘤的位置和尺寸的磁共振成像(MRI)
在颅内肿瘤注射手术后的指定天数,通过磁共振成像(MRI)确定植入肿瘤的位置和尺寸。用混合有1L/min卡波金(95%O2和5%CO2)的2.5%异氟烷将小鼠麻醉,然后保持1%异氟烷。使用温水浴保持芯温度,使用Bruker Biospin 94/30磁体(Bruker Biospin,Karlsruhe,Germany)进行成像。通过腹膜内施用使小鼠注射Magnevist,基于钆的造影剂(Bayer Health Care Pharmaceuticals,Wayne,NJ),计量为0.5mmol/kg,然后定位在磁体中。使用序列(TR=3524ms,TE=36ms,稀有因子=8,navgs=2,FOV=20×20mm,0.5mm切片厚度)收集T2加权RARE成像。基于脑和肿瘤组织之间的信号强度的对比,手动描绘感兴趣区域(ROI)。
体外和体内RNP结合的荧光共聚焦显微镜检查
对于pRNA-3WJ RNP的体外靶向测试,将200μL中的2×103个U87EGFRvIII(恶性人成胶质细胞瘤)细胞接种在Lab-TekII 8孔腔室载玻片(Nunc,Rochester,NY)中。第二天,用PBS洗涤细胞,并在CO2培养箱在200μL培养基中在37℃下用200nM的FA-Alexa647-pRNA-3WJRNP或对照RNP(Alexa647-pRNA-3WJ)温育2小时。为了通过游离叶酸阻断细胞FR,在RNP处理之前,将PBS洗涤的细胞在200μL培养基中在37℃下在CO2培养箱中用1mM的游离叶酸预处理1小时。在用PBS洗涤后,将RNP处理的细胞在4%多聚甲醛(PFA)溶液中在4℃固定2小时。固定细胞的细胞骨架通过Alexa Fluor 488鬼笔环肽(Invitrogen,Grand Island,NY)在室温下染色30分钟,并且细胞核在室温下用0.01%DAPI溶液染色10分钟。然后用PBS漂洗细胞3×10分钟,并用PermaFluor Aqueous Mounting Medium(Thermo Scientific)封片。在461nm(对于由DAPI染色的细胞核)、530nm(对于由Alexa Fluor 488Phalloidin染色的细胞骨架)和665nm(对于Alexa647)的波长下使用基于Olympus4-滤光片的FluoView FV1000-滤光片共聚焦显微镜系统(Olympus Corp.)进行荧光显微镜检查。通过Olympus FluoViewViewer软件ver.4.0(Olympus)分析图像。对于体内靶向,将在RNP注射后15小时收集的脑肿瘤异种移植物在4%PFA中用处于PBS中的10%蔗糖在4℃固定过夜并包埋在Tissue-O.C.T化合物(Sakura Finetek USA,Inc.,Torrance,CA)中用于冷冻切片(10μm厚)。切片的样品由具有DAPI(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)的/>GoldAntifade Reagent安装过夜。使用FluoView FV1000-滤光片共聚焦显微镜系统(OlympusCorp.)获得荧光图像。
用于体外RNP结合的流式细胞术
对通过恶性人类成胶质细胞瘤(U87EGFRvIII)和成胶质细胞瘤干细胞(1123)中的pRNA-3WJ RNP体外靶向进行流式细胞术分析。在RNP结合前一天将细胞接种在6孔板中。在用PBS洗涤后,将细胞用200nM的FA-Alexa647-pRNA-3WJ RNP或Alexa647-pRNA-3WJ RNP在200μL培养基中在37℃下在CO2培养箱中温育2小时。为了通过游离叶酸阻断细胞FR,在RNP处理前,将PBS洗涤的细胞在37℃CO2培养箱中用1mM的游离叶酸在200μL培养基中预处理1小时。用PBS洗涤后,通过胰蛋白酶消化收获细胞,并在4%PFA溶液中在4℃固定2小时。在室温下用PBS洗涤细胞3次,然后使用BD FACS Aria-III细胞分选仪进行流式细胞术分析。通过FlowJo 7.6.1软件分析数据。
将RNP全身注射到携带颅内人成胶质细胞瘤异种移植肿瘤的小鼠
基于在RNP注射前一天进行的MRI评估,选择在类似位置具有类似尺寸的肿瘤的一组小鼠用于全身注射RNP。通过小鼠尾静脉注射在100μL PBS中制备的指定量RNP(1mg/kg小鼠体重)。在RNP注射15小时后,将脑切除并进行荧光成像。由MRI计算的肿瘤体积也用于使每只小鼠的荧光强度或荧光素酶活性标准化,如下所述。
人成胶质细胞瘤异种移植小鼠脑肿瘤的荧光成像
为了研究体内pRNA-3WJ RNP的递送,在尾静脉注射到具有脑肿瘤的小鼠中之后进行脑荧光成像研究。在注射后15小时在麻醉下通过颈脱位处死小鼠,从小鼠中解剖出脑。使用IVIS Lumina系列III临床前体内成像系统(Perkin Elmer,Waltham,MA)从解剖的脑中检测荧光信号,激发在640nm,发射在660nm,曝光2分钟。荧光强度表示为平均辐射效率[p/s/cm2/sr]/[μW/cm2],然后通过肿瘤体积(mm3)标准化。PBS注射的小鼠用作荧光阴性对照。收集来自收获小鼠的主要内部器官和脑,并进行荧光成像用于生物分布特性研究的评估。
用于荧光素酶活性的生物发光全身成像
为了研究体内pRNA-3WJ RNP的siRNA递送和沉默效果,将U87EGFRvIII-Luc细胞诱导的脑肿瘤制备至两组小鼠(n=5)。在手术后5、7和9天,将在100μL PBS中的1mg/kg小鼠体重的FA-Alexa647-pRNA-3WJ-si(Luc)RNP(或siScrm作为阴性对照)通过小鼠尾静脉注射。每次注射后,对小鼠进行生物发光全身成像以检测内源荧光素酶表达水平。给小鼠注射75mg/kg荧光素(Perkin Elmer,Waltham,MA),并麻醉。通过安装ZFOV-24变焦透镜的IVISLumina系列III临床前体内成像系统(Perkin Elmer,Waltham,MA)检测来自麻醉小鼠的生物发光。发光强度表示为平均辐射率[p/s/cm2/sr],然后通过肿瘤体积(mm3)标准化。
统计分析
析通过ANOVA或学生t检验进行比较用试验和对照RNP处理的小鼠组的所有统计分。p<0.05被认为是显著的。
实施例2
该研究是为了确定FA-3WJ-LNA-抗miR21 RNA纳米颗粒(RNP)对人成胶质细胞瘤细胞的特异性识别和结合能力(图9A),首先是体外评估与Alexa647荧光染料缀合的FA-3WJ-LNA-miR21和人患者衍生的成胶质细胞瘤细胞GBM30之间的FA特异性结合(图9B)。纳米颗粒含有5’-+G+A+T+A+A+G+C+T CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO:7)(下划线序列是8聚体抗miR 21LNA)。
在RNP结合前一天将铺在6孔板中的细胞用PBS洗涤并用200nM的FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP在37℃下在CO2培养箱中温育2小时。用PBS洗涤三次后,通过胰蛋白酶消化收获细胞,并在4%PFA溶液中在4℃固定2小时,并使用BD FACS Aria-III细胞分选仪进行流式细胞术分析。通过用鬼笔环肽-Alexa488染色肌动蛋白丝来识别细胞。与无FA的对照RNP(3WJ-Alexa647)相比,流式细胞术分析显示在FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647(23.1%)(学生t检验,p<0.001,n=3)中较高的结合。LNA-miR21的额外部分不影响与GBM30细胞的特异性结合,因为FA-3WJ-Alexa647 RNP显示与FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647(23.1%)类似的结合水平(21.4%)。
实施例3
在本研究中,通过在共焦荧光显微镜下可视化来自用FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP处理的表面培养的GBM30细胞的Alexa647信号进一步证实了FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP与GBM30细胞的叶酸受体(FR)-依赖性特异性结合(图10)。对于FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP的体外靶向测试,将200μL中的2×103个GBM30细胞接种在Lab-Tek II 8孔腔室载玻片中。第二天,用PBS洗涤细胞,并在200μL培养基中在37℃下在CO2培养箱中用200nM的FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP或对照RNP(3WJ-Alexa647)温育2小时。通过Alexa Fluor 488鬼笔环肽(Invitrogen,Grand Island,NY)在室温下对固定细胞的细胞骨架染色30分钟,并且在室温下用0.01%DAPI溶液对细胞核染色10分钟。然后用PBS漂洗细胞3×10分钟,并用PermaFluor Aqueous Mounting Medium(ThermoScientific)封片。使用基于Olympus 4-滤光片的FluoView FV1000-滤光片共聚焦显微镜系统(Olympus Corp.)进行荧光显微镜检查。从用FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP处理的GBM30细胞观察到的Alexa647染料的荧光强度高于用缺乏FA的对照RNP(3WJ-Alexa647)所获得的荧光强度。此外,FA依赖性联合不受LNA-miR21序列存在的影响,因为FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP显示与3WJ-Alexa647相当的联合。当在RNP处理之前通过用1mM游离叶酸温育1小时培养物来预先屏蔽GBM30细胞的FR时,FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP和GBM30细胞之间的联合被消除到与阴性对照3WJ-Alexa647 RNP类似的程度。与图9A和9B所示的数据一起,它表明FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP和GBM30细胞之间的联合是由与RNP缀合的FA所介导的FR依赖性的。黄色箭头表示FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP在GBM30细胞中的特异性定位,其在图11中以放大视图呈现。
实施例4
该研究显示通过共聚焦荧光显微镜可视化在温育2小时后GBM30细胞中FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP的分布(图11)。该图显示FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP成功内化进入GBM30细胞并且在细胞质中积累,而在细胞核中积累不多。由于LNA-miR21将在细胞质中对成熟miR-21起作用以显示其小RNA干扰活性,FA-3WJ-LNA-miR21-Alexa647 RNP的细胞质分布保证了成胶质细胞瘤靶向治疗中的药物性。Alexa 647以红伪色表示。固定细胞的细胞骨架通过Alexa Fluor 488鬼笔环肽(Invitrogen,Grand Island,NY)染色,并用0.01%DAPI溶液对细胞核染色。使用基于Olympus 4-滤光片的FluoView FV1000-滤光片共聚焦显微镜系统(Olympus Corp.)在461nm(对于由DAPI染色的细胞核)、530nm(对于由Alexa Fluor 488鬼笔环肽染色的细胞骨架)和665nm(对于Alexa647)的波长下进行荧光显微镜检查。通过Olympus FluoView Viewer软件ver.4.0(Olympus)分析图像。使用FluoViewFV1000-滤光片共聚焦显微镜系统(Olympus Corp.)获得荧光图像。
实施例5
该研究显示了体内全身递送的FA-3WJ-LNA-miR21 RNP在人成胶质细胞瘤衍生的肿瘤的抗肿瘤效应(图12)。为了体内试验,通过植入表达荧光素酶基因的GBM-Luc细胞诱导小鼠中的颅内肿瘤,其使得能够追踪肿瘤尺寸的变化。预期从所得到的脑肿瘤测量的生物发光信号与肿瘤生长相关。为了建立体内小鼠模型,将GBM30-Luc细胞诱导的脑肿瘤制备至两组小鼠(n=5)。在手术后14天,将在100μL PBS中的1mg/kg小鼠体重的FA-3WJ-LNA-miR21RNP(或FA-3WJ-LNA-SC作为阴性对照)通过小鼠尾静脉注射共5次。每次注射后,对小鼠进行生物发光全身成像以检测内源荧光素酶表达水平。给小鼠注射75mg/kg荧光素(PerkinElmer,Waltham,MA),并麻醉。通过安装ZFOV-24变焦透镜的IVIS Lumina系列III临床前体内成像系统(Perkin Elmer,Waltham,MA)检测来自麻醉小鼠的生物发光。发光强度表示为平均辐射率[p/s/cm2;/sr]。当在10天内将一组携带脑肿瘤的小鼠(n=5)全身注射FA-3WJ-LNA-miR21(1mg/kg,在100μLPBS中)5次时,与注射FA-3WJ-LNA-SC对照RNP的小鼠组相比,荧光素酶活性快速下降,这表明FA-3WJ-LNA-miR21的抗肿瘤效果,因为肿瘤生长表明对照RNP对荧光素酶基因表达没有影响。图12中A显示了在五次注射后来自FA-3WJ-LNA-miR21或FA-3WJ-LNA-SC的荧光素酶活性的肿瘤体积和生物发光强度的代表性体内MRI图像。图12中B显示在五次注射后p=0.023(n=5),与混杂对照组相比由平均荧光强度计算的肿瘤体积。
实施例6
该研究通过全身递送的FA-3WJ-LNA-miR21显示敲除小鼠肿瘤中内源性miR-21(图13)。在该研究中,预期与FA-3WJ-LNA-miR21 RNP缀合的LNA-miR21序列沉默由GBM30细胞诱导的小鼠肿瘤中的内源性miR-21。在全身给予FA-3WJ-LNA-miR21 RNP五次后,从小鼠脑中切出肿瘤。根据制造商的方案用Trizol试剂从肿瘤组织提取总RNA。通过TaqMan MicroRNA表达逆转录分析试剂盒测定miR-21的表达水平。SnoRNA U6用作标准化内部对照。非肿瘤脑用于显示正常脑细胞中miR-21的内源水平。GBM30细胞诱导的肿瘤区域显示miR-21相对于非肿瘤区域相对较高的表达。当用FA-3WJ-LNA-miR21 RNP系统处理小鼠肿瘤时,小鼠肿瘤中miR-21的水平比注射阴性对照RNP、FA-3WJ-LNA-SC的小鼠肿瘤明显降低至少两倍以上。其关精密地证明了全身给药后FA-3WJ-LNA-miR21 RNP在体内小鼠模型中的抗miR-21沉默活性。
实施例7
该研究显示通过系统传递的FA-3WJ-LNA miR21诱导的凋亡途径通过恢复Pten蛋白表达来调节miR-21(图14)。在这项研究中,据报道Pten表达在成胶质细胞瘤中下调,并且先前被鉴定为成胶质细胞瘤中过表达的miR-21的主要沉默靶标。图14中的数据成功地证明了FA-3WJ-LNA-miR21 RNP的抗miR-21沉默效果。为了评估下游miR-21靶标中的miR-21沉默效应,对全身注射FA-3WJ-LNA-miR21 RNP后从小鼠肿瘤提取的总蛋白进行western印迹分析。图14中A涉及用FA-3WJ-LNA-miR21 RNP处理的小鼠肿瘤中Pten蛋白表达的Western印迹鉴定的上调。增加的Pten表达导致Akt活性的抑制,Pten途径的主要下游靶标,其活化凋亡途径。显然,Pten表达的拯救导致肿瘤细胞凋亡至肿瘤退缩,如图12所示。本研究中的图像数据由ImageJ软件分析。与用FA-3WJ-LNA-SC RNP处理的那些(p=0.022,n=5)相比,在用FA-3WJ-LNA-miR21 RNP处理的小鼠肿瘤中,Pten表达增加至少超过4倍。
实施例8
该研究通过全身递送的FA-3WJ-LNA-miR21改善的携带脑肿瘤小鼠的总体存活示出了小鼠肿瘤中内源性miR-21的敲低(图15)。在本研究中,经过五次全身给药之后,Kaplan-Meyer存活曲线用于比较用FA-3WJ-LNA-miR21 RNP和阴性对照RNP(FA-3WJ-LNA-SC)处理的两组携带脑肿瘤的小鼠的总存活率。如以上数据所示,通过全身注射的FA-3WJ-LNA-miR21 RNP激活的小鼠脑肿瘤区域的凋亡显著改善了存活率(p=0.0023,n=5)。FA-3WJ-LNA-miR21 RNP处理的小鼠组的中值存活率为23天,而用FA-3WJ-LNA-SC RNP处理的小鼠组的中值存活率为19天。
在本文中,提及了各种参考文献。所有这些参考文献通过引证并入本文,包括以下列出的参考文献:
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Claims (27)
1.一种人工RNA纳米结构分子,其中所述分子包括包含至少一种RNA寡核苷酸的多分支RNA连接基序和脑肿瘤靶向模块,其中所述模块偶联至所述RNA连接基序,其中多分支RNA包含核苷酸序列5’-GATAAGCT CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO:7)。
2.根据权利要求1所述的分子,进一步包括与所述RNA连接基序偶联的至少一种生物活性剂。
3.根据权利要求1所述的分子,其中所述RNA寡核苷酸在2’位置包含至少一个化学修饰。
4.根据权利要求3所述的分子,其中所述修饰包括2’氟、2’胺基、2’O-甲基或它们的组合。
5.根据权利要求1所述的分子,其中所述基序是三分支RNA连接基序。
6.根据权利要求1所述的分子,其中所述分子的直径是至少40nm。
7.根据权利要求1所述的分子,其中所述分子具有-50mV至50mV的ζ电位。
8.根据权利要求5所述的分子,其中所述三分支RNA连接基序的分支包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3;或它们的组合。
9.根据权利要求1所述的分子,其中所述RNA寡核苷酸的长度包含至少6个核苷酸。
10.根据权利要求1所述的分子,其中所述脑肿瘤靶向模块包含结合至至少一种脑肿瘤细胞表面标记物的配体。
11.根据权利要求10所述的分子,其中所述配体结合至叶酸受体、EGFR、转铁蛋白受体、RGD或它们的组合。
12.根据权利要求10所述的分子,其中所述配体包含适体。
13.根据权利要求12所述的分子,其中所述适体结合至EGFR、PDGFR、叶酸受体或它们的组合。
14.根据权利要求1所述的分子,其中所述靶向模块包含叶酸。
15.根据权利要求2所述的分子,其中所述生物活性剂包含药物、治疗剂、荧光染料、化学品、siRNA、miRNA、抗-miRNA、核酶RNA、反义RNA或它们的组合。
16.根据权利要求2所述的分子,其中所述生物活性剂针对脑肿瘤标记物。
17.根据权利要求15所述的分子,其中miRNA序列的长度是至少6个核苷酸。
18.根据权利要求15所述的分子,其中所述生物活性剂是用于包含miR-9、miR-10b、miR-21、miR-17或miR-26的miRNA的抗miRNA分子。
19.根据权利要求15所述的分子,其中所述生物活性剂是用于包含let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145或miR-181b的miRNA的抗miRNA分子。
20.根据权利要求18所述的分子,其中所述抗miRNA分子包含抗miRNA锁定核酸分子。
21.根据权利要求20所述的分子,其中所述抗miRNA锁定核酸分子包含序列5’-GATAAGCT-3’、5’-AGCACTTT-3’或5’-ATTTGCAC-3’。
22.根据权利要求15所述的分子,其中所述siRNA结合至编码蛋白质的mRNA分子,所述mRNA分子编码包括VEGF、EGFR、POK、AKT、AGT、RAF、RAS、MAPK、ERK、MGMT、MMP-2、MMP-9、PDGF、PDGFR、IGF-I、HGF、mTOR、Cox-2或TGFβ1的蛋白质。
23.根据权利要求15所述的分子,其中所述siRNA结合至编码RAS、cMET、HER2、MDM2、PIK3CA、AKT、CDK4或它们的组合的mRNA分子。
24.一种核酸组合物,包含治疗有效量的权利要求1所述的RNA纳米结构分子。
25.根据权利要求24所述的组合物,进一步包含药学上可接受的载体。
26.一种纳米颗粒递送系统,包含权利要求1所述的RNA纳米结构分子。
27.根据权利要求26所述的纳米颗粒递送系统,进一步包含药学上可接受的载体。
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