CN109183158B - 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酵母单杂交文库构建方法专利申请事宜。该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，包括转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计、制备cDNA模板、PCR扩增、磷酸化处理、连接重组接头、构建全长转录因子的文库质粒、质粒转化并构建文库等步骤。本申请所提供全长转录因子酵母单杂交文库构建方法，是对现有构建方法的进一步综合性改进，具有转录因子阳性筛选率高、筛选准确性高、所构建文库质量高等优点，同时由于对于相关操作步骤有所优化，因而能够节省构建时间和构建成本，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

Description

一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酵母单杂交文库构建方法专利申请事宜。

背景技术

转录因子（transcription factor，TF），也称反式作用因子（trans-actingelement），是一类能够特异性结合真核生物启动子区域中顺式作用元件（cis-actingelement）的蛋白质，其功能是调控基因的开启、关闭及表达量的高低，转录因子的时空表达直接决定了植物的生长发育、逆境反应和次生代谢等生理功能。

酵母单杂交（yeast one hybrid，Y1H）系统是在酵母体内筛选与目的基因的顺式作用元件相互作用的转录因子的一种常用技术方法。主要构建过程是：首先分别构建诱饵载体（含有目的基因启动子区和报告基因）和cDNA文库质粒（用于表达cDNA与GAL4转录激活功能域融合蛋白，cDNA文库包含特定组织和生长发育时期所有蛋白的cDNA序列），然后将这2种质粒转入酵母，若cDNA文库质粒表达的转录因子蛋白能够结合诱饵质粒目的基因启动子区，则能启动诱饵载体报告基因表达，从而筛选到调控该目的基因表达的转录因子。也就是说，在酵母单杂交筛选过程中，特异性转录因子是从所有蛋白中筛选获得的。

多数统计表明，转录因子只占所有基因很小的比例。例如，在拟南芥中，转录因子的数量只占所有基因的5%左右（Riechmann JL, et al. Arabidopsis transcriptionfactors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes . Science，2000，290: 2105-2110）；水稻的转录因子占所有基因的比例则更少，只有2.6%（Xiong Y ，et al.Transcription Factors in Rice: A Genome-wide Comparative Analysis betweenMonocots and Eudicots, Plant Mol Biol 2005, 59: 191-203）；而一些内部统计数据表明，烟草中转录因子占所有基因的比例更是低至只有1%左右。总之，由于cDNA文库中其它基因的数量远远高于转录因子，这一现实情形造成使用酵母单杂交技术筛选和鉴定转录因子时假阳性率太高，结果准确性也大大降低（Mitsuda N, et al. Efficient yeast one-/two-hybrid screening using a library composed only of transcription factorsin Arabidopsis thaliana. Plant and cell physiology, 2010, 51(12): 2145-2151）。

为提高利用酵母单杂交技术筛选转录因子的效率，在现有酵母单杂交系统构建过程中，采用了将转录因子单独建库的方式，也就是所构建cDNA文库只包含特定物种的转录因子。例如：在拟南芥的研究中，使用gateway技术，建立了转录因子单/双杂交文库，并进行了成功筛选，证明使用酵母转录因子单/双杂交文库进行转录因子筛选和鉴定十分高效（Mitsuda N, et al. Efficient yeast one-/two-hybrid screening using a librarycomposed only of transcription factors in Arabidopsis thaliana. Plant andcell physiology, 2010, 51(12): 2145-2151；Pruneda-Paz J L, et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsistranscription factors. Cell reports, 2014, 8(2): 622-632）。

利用gateway技术使用位点特异性重组方式构建转录因子酵母单/双杂交文库时，其主要过程是：首先扩增获得转录因子的cDNA序列；再通过第一次重组（BP重组）构建转录因子入门质粒，形成初级文库；最后通过第二次重组（LR重组），构建转录因子单/双杂交质粒，形成转录因子酵母单杂交文库。但实际操作中，这一技术也有一些较为明显的缺陷，主要是：1，需要经过2次重组，使用2次重组酶，而重组酶价格昂贵，因此使得建库成本高昂；2，Gateway技术本身需经过两次重组，而多一次重组，均一化效果就会被抵消掉一些，而由于摇菌时候的竞争性抑制，会造成低丰度和长片段基因的部分丢失，进而降低了文库质量。总之，为获得更低成本、更高效率、更高质量的转录因子酵母单/双杂交文库，对于现有的构建方法仍有必要进一步研究、改进。

发明内容

本申请目的在于提供一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法，从而能够一定程度上克服现有所构建酵母单杂交文库进行转录因子筛选和鉴定时的假阳性率高、准确性低的问题，以及现有构建过程中构建过程复杂、成本高、文库质量低等问题。

该构建方法主要特点是转录因子cDNA通过1次重组即可成功构建酵母单杂交文库，下面对本申请的技术方案简介如下。

一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法，该方法具体包括下述步骤：

（1）转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计，

依据目的作物基因组信息，筛选全长转录因子及对其对应的全长开放阅读框设计PCR扩增用引物；

全长转录因子的具体筛选原则及操作步骤如下：

第一，从基因组中预测的转录因子中去除ORF不完整的转录因子；

第二，筛选出至少在一种组织或其器官中表达的转录因子；

第三，将高度相似的转录因子进行聚类，得到非冗余的转录因子基因集；

第四，设计引物，并基于基因组数据，对获得的转录因子引物进行ePCR分析，筛选产物唯一的转录因子，作为建库用转录因子；

最后，基于上述操作，最终获得全长转录因子，并依据全长转录因子获得对应的全长开放阅读框，进一步对全长开放阅读框设计对应的PCR扩增用引物；

对全长开放阅读框设计对应的PCR扩增用引物时，具体参考如下原则及要求：

第一，基于全长转录因子CDS（Coding sequence）序列，使用软件对每个转录因子的ORF进行引物设计；

第二，引物长度应在18~28bp之间，PCR扩增时，退火温度在55~65℃之间，引物对之间最大退火温差不超过5度，最终产物长度在200~3000bp范围内；

第三，为了保证读码框准确，在上游引物5' 末端添加1个碱基；具体添加的碱基根据引物含量确定，具体要求为：对于GC含量小于40%的，添加C；GC含量大于50%的添加T；其他情况则随机添加了C或T；下游引物携带终止密码子；

（2）制备cDNA模板

提取目的作物样品的总RNA，并反转录合成第一链cDNA；

（3）PCR扩增

利用平末端DNA聚合酶进行PCR扩增，获得全长转录因子的全长开放阅读框；

PCR扩增时，采用2轮PCR扩增方式进行扩增，具体而言：

第一轮，第一轮PCR扩增时以步骤（2）中所制备第一链cDNA为模板；具体反应程序及反应条件参考设计如下：

第一链cDNA模板，1μL；

2×EasyPfu PCR SuperMix，12.5μL；

forward Primer（正向引物，10μM），1μL；

Reverse Primer（反向引物，10μM），1μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR程序：94℃、3min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、2min，25个循环；72℃、10min，16℃、10min；

第二轮，第二轮PCR扩增时以第一轮扩增产物为模板；具体反应程序及反应条件参考设计如下：

第一轮PCR产物，2μL；

2×EasyPfu PCR SuperMix，25μL；

forward Primer（正向引物，10μM），2μL；

Reverse Primer（反向引物，10μM），2μL；

ddH₂O，19μL；

PCR程序：94℃、3min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、2min，32个循环；72℃、10min，16℃、10min；

需要说明的是，为确保文库构建效果和质量，经2轮PCR后，每个转录因子的产物总量应不小于1μg；

（4）磷酸化处理

对步骤（3）的PCR扩增产物进行5' 端磷酸化；具体磷酸化体系及反应条件可参考设计如下：

PCR产物混合液，43μL；

10×Blunting Kination Buffer，5μL

Blunting Kination Enzyme Mix，2μL

反应条件：37℃、15分钟，70℃、5分钟；

（5）连接重组接头

将步骤（4）中5' 端磷酸化后的PCR扩增产物连接重组接头；具体反应体系及反应条件可参考设计如下：

10× DNA Ligation Buffer，5μL

5' Adapter，1μL

3' Adapter，1μL

步骤（4）磷酸化的PCR产物，42μL

T4 DNA Ligase（NEB），1μL

16℃过夜，65℃、10min；

（6）构建全长转录因子的文库质粒

将步骤（5）中连接有重组接头的5' 端磷酸化PCR扩增产物与酵母单杂交载体进行重组连接，构建获得全长转录因子的文库质粒；

所述酵母单杂交载体，具体例如采用酵母单杂交载体pGADT7-Rec2；

（7）质粒转化并构建文库

将步骤（6）中所构建全长转录因子文库质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选、获得全长转录因子酵母单杂交文库。

本申请所提供全长转录因子酵母单杂交文库构建方法，构建文库过程中所采用cDNA文库由于只包括转录因子，因而转录因子丰度高，用该文库进行酵母单杂交实验筛选和鉴定转录因子时，筛选阳性率高，结果准确性也大大提高；另一方面，构建过程中，采用了直接给转录因子PCR产物连接重组接头的方法，最后仅需经过1次重组，即可成功构建酵母单杂交文库质粒，相较于现有方法，其效果不仅在于减少了1次重组以及减少了相应操作步骤，更重要在于节省了时间和费用，而且大大提高了文库质量。

总体而言，本申请所提供全长转录因子酵母单杂交文库构建方法，是对现有构建方法的进一步综合性改进，具有转录因子阳性筛选率高、筛选准确性高、所构建文库质量高等优点，同时由于对于相关操作步骤有所优化，因而能够节省构建时间和构建成本，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为供试烟草材料提取的总RNA 电泳检测图（Agilent 2100）；

图2为转录因子第二轮PCR扩增结果的电泳检测实例图；

图3为使用载体引物扩增文库时插入片段的电泳检测图；

图4为随机选择20条转录因子引物扩增文库时插入片段的电泳检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请技术方案做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要说明如下。

生物材料：

红花大金元（Nicotiana tabacum），一种常用烟草品种；

相关引物设计及合成，由北京六合华大基因科技有限公司合成；

酵母单杂交载体pGADT7-Rec2，由上海海科生物技术有限公司提供；

实验试剂：

RNA提取试剂（TRIzol™ Reagent），Invitrogen，美国；

反转录试剂（Reverse Transcriptase M-MLV，Recombinant RNase Inhibitor，10mM dNTP Mixture，Oligo(dT)18 Primer），宝日医生物技术(北京)有限公司，中国；

平末端DNA聚合酶Pfu（2×EasyPfu PCR SuperMix），北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司产品；

胶回收试剂盒（Gel Purification Kit），北京密码子生物科技有限公司产品；

实验设备：

PCR合成仪，The Applied Biosystems Veriti® 96，美国；

NanoDrop 2000（RNA浓度测定用），Thermo Scientific，美国；

Agilent 2100 Bioanalyzer（RNA完整性指数，RIN值测定用），Agilent，美国；

GeneChip Scanner 3000 7G System (表达谱芯片分析)，Affymetrix，美国。

实施例

本实施例以红花大金元烟草材料为例，构建了对应的全长转录因子酵母单杂交文库，具体构建过程简介如下。

（一）转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计，

依据目的作物基因组信息，筛选全长转录因子及对其对应的全长开放阅读框设计PCR扩增用引物；全长转录因子的具体筛选原则及操作步骤简介如下。

第一，从基因组中预测的转录因子中去除ORF不完整的转录因子。具体而言，利用拟南芥、水稻等植物已经报道的转录因子，基于同源比对，对普通烟草红花大金元基因组中的转录因子进行预测。根据起始密码子和终止密码子，去除ORF不完整的转录因子。共获的烟草转录因子4661个。

第二，筛选出至少在一种组织或其器官中表达的转录因子。具体而言，通过使用Affymetrix烟草全生育期表达谱芯片（Tobacco Genome Array, Fromat49-7875），分析表达谱数据，按照表达值≥4的标准，筛选出至少在根、茎、叶和花一种组织中表达的转录因子共3244个。

第三，将高度相似的转录因子进行聚类，得到非冗余的转录因子基因集。具体操作上，利用ORTHOMCL V1.4将高度相似的转录因子进行聚类（--pi_cutoff 90，--pmatch_cutoff 80），基于聚类结果，从中得到非冗余的转录因子基因集，共2266个转录因子。

第四，设计引物，并基于基因组数据，对获得的转录因子引物进行ePCR分析，筛选产物唯一的转录因子，作为建库用转录因子。

需要说明的是，对初步获得的转录因子引物进行ePCR分析时，比对的条件为相似性大于等于80%，覆盖度大于等于80%，然后根据ePCR实验结果，筛选产物唯一的转录因子，共1041个。

最后，基于上述操作，最终获得全长转录因子，并依据全长转录因子获得对应的全长开放阅读框，进一步对全长开放阅读框设计对应的PCR扩增用引物；对全长开放阅读框设计对应的PCR扩增用引物时，具体参考如下原则及要求：

第一，基于全长转录因子CDS（Coding sequence）序列，使用Primer3软件对每个转录因子的ORF进行引物设计；

第二，引物长度应在18~28bp之间，PCR扩增时，退火温度在55~65℃之间，引物对之间最大退火温差不超过5度，最终产物长度在200~3000bp范围内；

第三，为了保证读码框准确，在上游引物5' 末端添加1个碱基；具体添加的碱基根据引物含量确定，具体要求为：对于GC含量小于40%的，添加C；GC含量大于50%的添加T；其他情况则随机添加了C或T；下游引物携带终止密码子。

最终筛选获得1041个烟草转录因子基因及其PCR扩增用引物。

部分筛选所得典型性转录因子及其对应具体PCR扩增用引物列举如下：

（1）转录因子Ntab_TF622，

PCR扩增时具体引物序列设计如下：

TF622-正向引物，5’- TATGCCTAAAGCGAAAAGGAGT-3’,

TF622-反向引物，5’- TTATGTCTCCTCAGCCTTGGG -3’；

PCR扩增时，扩增产物1306bp（上游扩增引物前添加C碱基，因此扩增产物比CDS序列多一个碱基），而具体转录因子Ntab_TF622的CDS（Coding sequence）序列包括1305bp，如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGCCTAAAGCGAAAAGGAGTAACGGAAAATCCGACAAAAATGACGGAGACGAGCCGGAGATTTTCGTCGTTCCATCTTCCAGTACCGAATCACAACAAGACGAAAAAGAAGAAGAAGAAAACGACGGCGTAGAAAATGTTCACGAGGAATACGTAAGAGATACGGACGACGAAGAAAAAGAAGAAGAAAATGCCGCAGAGGGCAAAGTTGGTAATAATACTAATCGCCGAGGCAGGAACGAGGAATTGGAAGTACAGAAGAAGGTTTATAGGAGAAAGGGGAAGAAAGGAGATGAAAATAGAGAAATTGAAGCAAAAACGGCAAAGCAAAGTGAGAGTGAAAATTTGAAAATATATATGAGGAAGAAGAAGGTCAAAAATGGGAAGGAAGAAGAAGAGGAGGAGCAGAATGTTGCAAAAACAGCTAAAAGGGAAAAGGATAATGCCGAGAAAAAGATGAAGGAGAAGAATGAAAAGGGAAGAATAAGCAAAAATGCAAAGAGCAATGGAGATTCGACTCGTGGTGGCAAAATTGAGAACAAGAAGAAGAAAAATGAAGAGGAAGGAGGACAAAAAGTAGCCAAAAAGGCGAAGAGCAATGGCGATTCAAGTCGTGGAAGTGAAAATGAGAAGGAGGAGAGTAAGAAGAAGAAGAAAAGGGCAGAAGAAGGAGAAGGAGGAGGAAAAGCAGCAAAAAAGGCTAAGAGCAATGGTGATTCGAGTAGGTCGAAAAAAGAAGAGAAAAAGATGAAGAGAACAGAGAATAAGAAGGAAGGAGATGAAGAAGCCGAAGAAAAGGGAGTGAAAAGGGCAAATAGTAATGGGTCTACAAGTCGAGCTACGAAAGAGAAGATGAAAAGGGAGAAGGAGGAAAACAAGGGTAAAACAAGTAATGGGAAGGTAGAAAATGGAGCAAGGAGCAATGGTGACACCCCTTTGAAGAAATTAAAGGCAAAGAAGAAAAGGGAAGATGATGAAGAGGAGGAAGATGAGAAGAGTGGAAGTGCTCTTTATCAGTTTCCTCATAATCGAATCCATCGAATAATAAAGGACGAAAATTCTGATATGAGGATGTCCCAAGAAGCAACATTTGTAGTTAACAAAGCTACGGAGAAATTTCTTGAAGTATTTTGCAGGGAGGCTTATGCTTGTTCTTTTCTGGATCGTAACAATTATGTTGGATATGACCATCTCTCTTCAGTTGTTTCCAAAAGACACAGATTTGACTTTCTTTCAGATTTTGTTCCGCAAAAAGTAAGAGCCGTAGATGCATTGGCTGAAATCCCCAAGGCTGAGGAGACATAA。

（2）转录因子Ntab_TF626，

PCR扩增时具体引物序列设计如下：

TF626-正向引物，5’- CATGCCAATTGAGTCTGATCGT -3’,

TF626-反向引物，5’- TCATTTATTTTCCTCTTGTATATTCTCA -3’；

PCR扩增时，扩增产物613bp（上游扩增引物前添加C碱基，因此扩增产物比CDS序列多一个碱基），而具体转录因子Ntab_TF626的CDS（Coding sequence）序列包括612bp，如SEQID NO.2所示，具体如下：

ATGCCAATTGAGTCTGATCGTATTCGACATATAGACGTGTACGGTAACAAAAAGCCATGTGAATTATTCCAAGACTTATTAGGGGAGACGAGTACTGATCATGTAAACTATATCTTTACTCAGTTGAAGAAAAAATCTGACGGAGGTAAAAATTATAACAGGTCAATTACTGGAGGTGGATCATGGAAAGGACGAGACACGGGTAAACCGGTTCGCGATAAGGAAGGATCAGTGATTGGGTTGAAGAAAACTTTTCGTTTTGATGAAGAAAGTGACATTGGTAATAATCAAAGAATTGTGTGGAGTATGAAAGAATATTGTCTTAGCGACGCGAGACTAGAGGTGTTAAGACAACGTAGTCAAATCCGACACGAGGACTCAGTTCTGTGTAGCATTGAGAAGAAGGTTAATTTGTGTAAAAATTCTCAGGATATCTCAAGTTCTTCTTCAGCAACGATATATTGTGGGTGGTCGTTGTACACTGAACTAACTAAACTGCCACCATTTGATGGACCGTTTGAGTCGTTGACTGAAGAAGAATTGGCGTTCTTTGATAATCCTGATCCTGGATATTCACATGCTTATGAGAATATACAAGAGGAAAATAAATGA。

（3）转录因子Ntab_TF177，

PCR扩增时具体引物序列设计如下：

TF177-正向引物，5’- CATGAAGAGAGCAACAGGAGGAG -3’,

TF177-反向引物，5’- TCAACAATCAATGGTGAGAATTGGG -3’；

PCR扩增时，扩增产物916bp（上游扩增引物前添加C碱基，因此扩增产物比CDS序列多一个碱基），而具体转录因子Ntab_TF177的CDS（Coding sequence）序列包括915bp，如SEQID NO.3所示，具体如下：

ATGAAGAGAGCAACAGGAGGAGAGATAGTGCAAGTAGAAGGCGGCCATATTCTCCGGTCCACTGGTAAAAAAGACCGCCACAGCAAAGTTTATACTGCAAAAGGTCCCAGAGACCGAAGAGTCCGTTTATCTGCTCACACTGCTATTCAATTCTACGACGTTCAAGACCGATTAGGCTATGACCGGCCTAGTAAGGCGGTCGATTGGCTTATCAAAAAGGCGAAAAACGCCATTGATAAGTTAGATGAGTTGCCTCCTTGGAACCCCAGTACTATTGATGGAGCTGATGGGAGCTCAAGTGGTAATAATATCGTTTTGGAACAACAACAACAACAACAAGAGTTTCAGCTTCAAAGACAATTAGAAGAAAATAACCCAAGTGGTGGTAATTCTTGTAATTCTTATATGATGCAAACGCATAGTACTGGAGGAGAAACACAGTCGCTTGGTGATACTATGAAATCTTTTTTTCCAATGAATTCAGAGACTTCATTGATGAATTTCCAAAACTACCCACATGAGATAATGCCAAGATCAGCTTCATTTCAGAATGAAGATCTTGGCTTATCTCTTCATAGTACTACTTTTCATGACCAGAATTCTAATCATAGGGCTTCTTCAAGTCACGACCACCAAACCATTTTCTCAAGTCAAAATTTTGAAACAAATTATTCAAGAATGGCAGGTTGGATACTACCCCATCATCAGCAAACATTGTACTCCCCACAACCACAAGGTGCTGTATTTCCTCAAAGGGAACCCCTTCAGTCCAATTTTTCACAGTTGATTCATGCTTGGGAAGAGCAGAAATTTCCAACAGACATTTCACTTCAGATTTTCAAATTCCAGCTAGGATTCATGGTGAACATGAGGAGCCTTCCTCTGCTTCTCCCAATTCTCACCATTGATTGTTGA。

（二）制备cDNA模板

（1）采用Trizol法提取烟草样品的总RNA，具体操作步骤可参考如下：

（1）取烟草材料50mg，使用液氮研磨成粉，加入1ml Trizol，涡旋混匀，室温放置5min，使其充分裂解；4℃、12000g 离心10min，收集上清；

（2）加入200μL氯仿，振荡15s，室温放置3min；4℃、12000g 离心15min；

（3）吸取上层水相至一新离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃、12000g 离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底；

（4）加入1ml 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃、8000g离心5min，弃尽上清；在超净台干燥5~10min；

用50μL RNase-free H₂O溶解RNA样品，55~60℃孵育5~10min；

（5）测定RNA浓度和RNA完整性指数（RIN值）。

具体而言，以红花大金元4个组织样品为材料，分别提取了总RNA，并对RNA完整性指数进行了检测，具体样品取样情况及检测结果如下表所示：

。

对所提取总RNA取样进行电泳检测，结果如图1所示，可以看出，电泳条带清晰、无降解；同时由于RIN值均在8以上，这进一步表明所提取RNA质量良好，完全满足建库实验要求。

（2）反转录合成第一链cDNA

将步骤（1）中所提取4份RNA样品等量混合，用于反转录制备第一链cDNA，具体步骤为：

首先，设计30μL合成体系如下：

总RNA，4μg；

Oligo(dT)18 primer，5μL

RNase free H₂O，up to 30μL；

70℃、10min后迅速置冰上5min；瞬时离心，继续设计反应体系如下：

上一步变性液，30μL；

5×M-MLV Buffer，10μL；

dNTP Mixture (10 mM each)，2.5μL；

RNase Inhibitor (40 U/μl)，1.25μL；

RTase M-MLV (200 U/μl)，5μL；

RNase free H₂O，1.25μL；

42℃、1h，70℃、15min后冰上冷却，直接用于后续PCR 扩增用。

（三）PCR扩增

以第一链cDNA为模板，利用平末端DNA聚合酶进行PCR扩增，获得全长转录因子的全长开放阅读框；PCR扩增时，采用2轮PCR扩增方式进行扩增，具体过程简介如下。

第一轮，第一轮PCR扩增时以步骤（2）中所制备第一链cDNA为模板；具体反应程序及反应条件参考设计如下：

第一链cDNA模板，2μL；

2×EasyPfu PCR SuperMix，12.5μL；

forward Primer（正向引物，10μM），1μL；

Reverse Primer（反向引物，10μM），1μL；

ddH₂O，8.5μL；

PCR程序：94℃、3min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、2min，25个循环；72℃、10min，16℃、10min；

第二轮，第二轮PCR扩增时以第一轮扩增产物为模板；具体反应程序及反应条件设计如下：

第一轮PCR产物，2μL；

2×EasyPfu PCR SuperMix，25μL；

forward Primer（正向引物，10μM），2μL；

Reverse Primer（反向引物，10μM），2μL；

ddH₂O，19μL；

PCR程序：94℃、3min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、2min，32个循环；72℃、10min，16℃、10min。

对第二轮PCR扩增产物切胶纯化，测定浓度，为确保文库构建效果和质量，每个转录因子的PCR产物总量应不小于1μg。

最终，从1041个转录因子集中成功克隆到780个（部分转录因子的PCR扩增产物电泳结果如图2所示）。

（四）磷酸化处理

将步骤（三）中扩增获得的所有转录因子的PCR产物进行等量混合，进行DNA的 5'端磷酸化；具体磷酸化体系及反应条件设计如下：

PCR产物混合液，43μL；

10×Blunting Kination Buffer，5μL；

Blunting Kination Enzyme Mix，2μL；

反应条件：37℃、15分钟，70℃、5分钟；再加7.5μL乙酸铵，125μL乙醇，14000rpm离心10min，加1ml 75%乙醇洗涤两次，溶于42μl水中。

（五）连接重组接头

将步骤（4）中5' 端磷酸化后的PCR扩增产物连接重组接头；连接时，接头序列设计如下：

5' Adapter sequence：

5' -CAGATTACGCTCATATG-3'，

3' -GTCTAATGCGAGTATACp-5'；

3' Adapter sequence：

5' -TCATCTGCAGCTCGAGC-3'，

3' -AGTAGACGTCGAGCTCGp-5'；

具体反应体系及反应条件设计如下：

10× DNA Ligation Buffer，5μL；

5' Adapter，1μL；

3' Adapter，1μL；

步骤（4）磷酸化的PCR产物，42μL；

T4 DNA Ligase（NEB），1μL；

16℃过夜，65℃、10min；使用吸附柱（QIAGEN，MinElute PCR Purification Kit），进行产物的纯化，去除多余的接头序列及其它杂质，溶于20μL水中。

（六）构建全长转录因子的文库质粒

将步骤（5）中连接有重组接头的5' 端磷酸化PCR扩增产物与酵母单杂交载体pGADT7-Rec2进行重组连接，构建获得全长转录因子的文库质粒；

具体操作时，重组反应体系设计如下：

步骤（五）中连接有重组接头的5' 端磷酸化PCR扩增产物，14μL；

酵母单杂交载体pGADT7-Rec2 (300ng/μL)，2μL；

5× In-Fusion HD Enzyme Premix（TaKaRa），4μL；

混匀，50℃反应60min后，在反应体系中加入2μL的Proreinase K，37℃、15min；75℃、10min灭活重组酶，补水到100μL，再依次加入：Glycogen (20 μg/μl)、1μL，NH₄OAc（7.5M）、50μL，无水乙醇、375μL；

混合均匀并置于-80℃、1h以上，4℃、16000rpm离心30min，小心去上清；

加入150μl的70%乙醇洗涤1次，4℃、16000rpm离心3min，重复此步骤一次，去尽上清，避免触动DNA沉淀；

在室温下晾干5~10min；用10μL的DEPC水重悬DNA沉淀，用枪吹吸30~40次，瞬时离心2s收集，立即置冰上。

（七）质粒转化并构建文库

将步骤（6）中所构建全长转录因子文库质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选、获得全长转录因子酵母单杂交文库；具体操作为：

首先，将1mm电转杯（Bio-Rad）置于-20℃预冷30min；

其次，在冰上，将5μl连接产物（步骤（六）所制备）和100μl 大肠杆菌DH10B感受态细胞加入预冷后电转杯，混匀，冰浴45min；

第三，使用电转化仪（Bio-Rad）进行电击，电击后迅速向电转杯中加入2mL SOC培养基；

第四，将菌液转移到新的15ml离心管，置于37℃、250rpm培养1h，即为全长转录因子酵母单杂交文库菌液；

取出10μL菌液以备检测使用，剩余的加入甘油至终浓度20%， -80℃保存备用。

（八）所构建文库质量检测

将步骤（七）所取10μL菌液稀释1000倍，取10μL涂布LB平板，37℃培养过夜，第二天计数，计算文库容量。文库容量CFU计算方法如下：

CFU/ml=（平板上的克隆数/10μl）×1000倍×1×10³ μl；

文库总CFU= （CFU/ml）×文库菌液总体积（ml）。

计数及计算结果表明，本实施例所构建全长转录因子文库，其文库容量为5×10⁶/ml，一共有2ml，因此一共为1×10⁷CFU，库容很高。

随机挑取LB平板上所涂布的24个克隆，进一步摇菌扩增后，抽提质粒，用载体引物进行PCR扩增，扩增产物的电泳检测图如图3所示。可以看出，24个克隆都扩增出清晰的条带，说明文库克隆阳性率接近100%。

为了进一步检测所构建的文库的质量，从成功克隆的780个转录因子中，随机挑选20个（具体参见下表），以文库质粒为模板，进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果如图4所示。

随机挑选的20个转录因子：

。

图4中，从左到右依次为gene1-gene20的扩增结果，可见20个基因在文库中均能扩增出目的条带，而且大小正确，说明构建的烟草转录因子酵母单杂交文库质量很高，完全能够用于转录因子酵母单杂交筛选和鉴定实验。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法

<130> none

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgcctaaag cgaaaaggag taacggaaaa tccgacaaaa atgacggaga cgagccggag 60

attttcgtcg ttccatcttc cagtaccgaa tcacaacaag acgaaaaaga agaagaagaa 120

aacgacggcg tagaaaatgt tcacgaggaa tacgtaagag atacggacga cgaagaaaaa 180

gaagaagaaa atgccgcaga gggcaaagtt ggtaataata ctaatcgccg aggcaggaac 240

gaggaattgg aagtacagaa gaaggtttat aggagaaagg ggaagaaagg agatgaaaat 300

agagaaattg aagcaaaaac ggcaaagcaa agtgagagtg aaaatttgaa aatatatatg 360

aggaagaaga aggtcaaaaa tgggaaggaa gaagaagagg aggagcagaa tgttgcaaaa 420

acagctaaaa gggaaaagga taatgccgag aaaaagatga aggagaagaa tgaaaaggga 480

agaataagca aaaatgcaaa gagcaatgga gattcgactc gtggtggcaa aattgagaac 540

aagaagaaga aaaatgaaga ggaaggagga caaaaagtag ccaaaaaggc gaagagcaat 600

ggcgattcaa gtcgtggaag tgaaaatgag aaggaggaga gtaagaagaa gaagaaaagg 660

gcagaagaag gagaaggagg aggaaaagca gcaaaaaagg ctaagagcaa tggtgattcg 720

agtaggtcga aaaaagaaga gaaaaagatg aagagaacag agaataagaa ggaaggagat 780

gaagaagccg aagaaaaggg agtgaaaagg gcaaatagta atgggtctac aagtcgagct 840

acgaaagaga agatgaaaag ggagaaggag gaaaacaagg gtaaaacaag taatgggaag 900

gtagaaaatg gagcaaggag caatggtgac acccctttga agaaattaaa ggcaaagaag 960

aaaagggaag atgatgaaga ggaggaagat gagaagagtg gaagtgctct ttatcagttt 1020

cctcataatc gaatccatcg aataataaag gacgaaaatt ctgatatgag gatgtcccaa 1080

gaagcaacat ttgtagttaa caaagctacg gagaaatttc ttgaagtatt ttgcagggag 1140

gcttatgctt gttcttttct ggatcgtaac aattatgttg gatatgacca tctctcttca 1200

gttgtttcca aaagacacag atttgacttt ctttcagatt ttgttccgca aaaagtaaga 1260

gccgtagatg cattggctga aatccccaag gctgaggaga cataa 1305

<210> 2

<211> 612

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

atgccaattg agtctgatcg tattcgacat atagacgtgt acggtaacaa aaagccatgt 60

gaattattcc aagacttatt aggggagacg agtactgatc atgtaaacta tatctttact 120

cagttgaaga aaaaatctga cggaggtaaa aattataaca ggtcaattac tggaggtgga 180

tcatggaaag gacgagacac gggtaaaccg gttcgcgata aggaaggatc agtgattggg 240

ttgaagaaaa cttttcgttt tgatgaagaa agtgacattg gtaataatca aagaattgtg 300

tggagtatga aagaatattg tcttagcgac gcgagactag aggtgttaag acaacgtagt 360

caaatccgac acgaggactc agttctgtgt agcattgaga agaaggttaa tttgtgtaaa 420

aattctcagg atatctcaag ttcttcttca gcaacgatat attgtgggtg gtcgttgtac 480

actgaactaa ctaaactgcc accatttgat ggaccgtttg agtcgttgac tgaagaagaa 540

ttggcgttct ttgataatcc tgatcctgga tattcacatg cttatgagaa tatacaagag 600

gaaaataaat ga 612

<210> 3

<211> 915

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 3

atgaagagag caacaggagg agagatagtg caagtagaag gcggccatat tctccggtcc 60

actggtaaaa aagaccgcca cagcaaagtt tatactgcaa aaggtcccag agaccgaaga 120

gtccgtttat ctgctcacac tgctattcaa ttctacgacg ttcaagaccg attaggctat 180

gaccggccta gtaaggcggt cgattggctt atcaaaaagg cgaaaaacgc cattgataag 240

ttagatgagt tgcctccttg gaaccccagt actattgatg gagctgatgg gagctcaagt 300

ggtaataata tcgttttgga acaacaacaa caacaacaag agtttcagct tcaaagacaa 360

ttagaagaaa ataacccaag tggtggtaat tcttgtaatt cttatatgat gcaaacgcat 420

agtactggag gagaaacaca gtcgcttggt gatactatga aatctttttt tccaatgaat 480

tcagagactt cattgatgaa tttccaaaac tacccacatg agataatgcc aagatcagct 540

tcatttcaga atgaagatct tggcttatct cttcatagta ctacttttca tgaccagaat 600

tctaatcata gggcttcttc aagtcacgac caccaaacca ttttctcaag tcaaaatttt 660

gaaacaaatt attcaagaat ggcaggttgg atactacccc atcatcagca aacattgtac 720

tccccacaac cacaaggtgc tgtatttcct caaagggaac cccttcagtc caatttttca 780

cagttgattc atgcttggga agagcagaaa tttccaacag acatttcact tcagattttc 840

aaattccagc taggattcat ggtgaacatg aggagccttc ctctgcttct cccaattctc 900

accattgatt gttga 915

Claims (9)

1.一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法，其特征在于，该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，该方法具体包括下述步骤：

（1）转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计

依据目的作物烟草基因组信息，筛选全长转录因子及对其对应的全长开放阅读框设计PCR扩增用引物；

全长转录因子的具体筛选原则及操作步骤如下：

第一，从基因组中预测的转录因子中去除ORF不完整的转录因子；具体操作时：利用拟南芥、水稻中已经报道的转录因子，基于同源比对，对烟草红花大金元基因组中的转录因子进行预测；根据起始密码子和终止密码子，去除ORF不完整的转录因子；

第二，筛选出至少在一种组织或其器官中表达的转录因子；具体操作时：使用Affymetrix烟草全生育期表达谱芯片，分析表达谱数据，按照表达值≥4的标准，筛选出至少在根、茎、叶和花一种组织中表达的转录因子；

第三，将高度相似的转录因子进行聚类，得到非冗余的转录因子基因集；具体操作时，利用ORTHOMCL V1.4将高度相似的转录因子进行聚类，聚类标准：--pi_cutoff90，--pmatch_cutoff 80，基于聚类结果，从中得到非冗余的转录因子基因集；

第四，设计引物，并基于基因组数据，对获得的转录因子引物进行ePCR分析，筛选产物唯一的转录因子，作为建库用转录因子；对获得的转录因子引物进行ePCR分析时，比对的条件为相似性大于等于80%，覆盖度大于等于80%；

基于上述操作，最终获得全长转录因子；

（2）制备cDNA模板

提取目的作物烟草样品的总RNA，并反转录合成第一链cDNA；

（3）PCR扩增

利用平末端DNA聚合酶进行PCR扩增，获得全长转录因子的全长开放阅读框；

（4）磷酸化处理

对步骤（3）的PCR扩增产物进行5' 端磷酸化；

（5）连接重组接头

将步骤（4）中5' 端磷酸化后的PCR扩增产物连接重组接头；

（6）构建全长转录因子的文库质粒

将步骤（5）中连接有重组接头的5' 端磷酸化PCR扩增产物与酵母单杂交载体进行重组连接，构建获得全长转录因子的文库质粒；

（7）质粒转化并构建文库

将步骤（6）中所构建全长转录因子文库质粒转化、筛选，获得全长转录因子酵母单杂交文库。

2.如权利要求1所述全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）中，所述酵母单杂交载体，采用酵母单杂交载体pGADT7-Rec2。

3.如权利要求1所述全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，对全长开放阅读框设计对应的PCR扩增用引物时，设计原则及要求如下：

第一，基于全长转录因子CDS序列，对每个转录因子的ORF进行引物设计；

第二，引物长度在18~28bp之间，PCR扩增时，退火温度在55~65℃之间，引物对之间最大退火温差不超过5℃，最终产物长度在200~3000bp范围内；

第三，为了保证读码框准确，在上游引物5' 末端添加1个碱基；具体添加的碱基根据引物GC含量确定，具体要求为：对于GC含量小于40%的，添加C；对于GC含量大于50%的，添加T；其他情况则随机添加C或T；下游引物携带终止密码子。

4.如权利要求3所述全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法，其特征在于，针对转录因子Ntab_TF622，引物序列设计为：

TF622-正向引物，5’- TATGCCTAAAGCGAAAAGGAGT-3’,

TF622-反向引物，5’- TTATGTCTCCTCAGCCTTGGG -3’；

针对转录因子Ntab_TF626，引物序列设计为：

TF626-正向引物，5’- CATGCCAATTGAGTCTGATCGT -3’,

TF626-反向引物，5’- TCATTTATTTTCCTCTTGTATATTCTCA -3’；

针对转录因子Ntab_TF177，引物序列设计为：

TF177-正向引物，5’- CATGAAGAGAGCAACAGGAGGAG -3’,

TF177-反向引物，5’- TCAACAATCAATGGTGAGAATTGGG -3’。

5.如权利要求1所述全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，PCR扩增时，采用2轮PCR扩增方式：

第一轮，第一轮PCR扩增时以步骤（2）中所制备第一链cDNA为模板；

第二轮，第二轮PCR扩增时以第一轮扩增产物为模板；

经2轮PCR后，每个转录因子的产物总量应不小于1μg。

6.如权利要求1所述全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，磷酸化体系及反应条件为：

PCR产物混合液，43μL；

10×Blunting Kination Buffer，5μL；

Blunting Kination Enzyme Mix，2μL；

反应条件：37℃、15分钟，70℃、5分钟。

7.如权利要求1所述全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，步骤（5）中，具体反应体系及反应条件为：

10× DNA Ligation Buffer，5μL；

5' Adapter，1μL；

3' Adapter，1μL；

步骤（4）磷酸化的PCR产物，2μL；

T4 DNA Ligase（NEB），1μL；

16℃过夜，65℃、10min。

8.利用权利要求1~7任一项所述全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法所构建烟草全长转录因子酵母单杂交文库。

9.如权利要求8所述烟草全长转录因子酵母单杂交文库，其特征在于，含有转录因子Ntab_TF622、转录因子Ntab_TF626、转录因子Ntab_TF177，其碱基序列分别如SEQ ID NO.1~3所示。

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