PL201425B1 - Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia - Google Patents

Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia

Info

Publication number
PL201425B1
PL201425B1 PL347978A PL34797899A PL201425B1 PL 201425 B1 PL201425 B1 PL 201425B1 PL 347978 A PL347978 A PL 347978A PL 34797899 A PL34797899 A PL 34797899A PL 201425 B1 PL201425 B1 PL 201425B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
promoter
ssp
dna
vector
promoters
Prior art date
Application number
PL347978A
Other languages
English (en)
Other versions
PL347978A1 (en
Inventor
Geert Plaetinck
Christ Platteeuw
Katherine Mortier
Thierry Bogaert
Original Assignee
Devgen Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26313977&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL201425(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB9814536.0A external-priority patent/GB9814536D0/en
Application filed by Devgen Nv filed Critical Devgen Nv
Publication of PL347978A1 publication Critical patent/PL347978A1/xx
Publication of PL201425B1 publication Critical patent/PL201425B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Sposób lagodzenia zaka zenia ro slin nicieniami, znamienny tym, ze a) identyfikuje si e sekwencj e DNA ze wspomnianego nicienia; b) klonuje si e wspomnian a sekwencj e z etapu a) lub jej fragment w odpowiednim wektorze w takiej orientacji wzgl edem promotora(rów), ze wspomniany promotor(y) zdolny jest do inicjacji transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po zwi azaniu odpowiedniego czynni- ka transkrypcyjnego ze wspomnianym promotorem(ami) i c) wprowadza si e wspomniany wektor do ro sliny. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 347978 (11) 201425 (13) B1
f||P (22) Data zgłoszenia: 02.07.1999 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01)
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 02.07.1999, PCT/EP99/04718 C12N 15/63 (2006.01)
Urząd Patentowy (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
Rzeczypospolitej Polskiej 13.01.2000, WO00/01846 PCT Gazette nr 02/00
Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia
(30) Pierwszeństwo: 03.07.1998,GB,9814536.0 (73) Uprawniony z patentu: DEVGEN N.V.,Gent-Zwijnaarde,BE
09.12.1998,GB,9827152.1 (72) Twórca(y) wynalazku: Geert Plaetinck,Zwijnarde,BE Christ Platteeuw,Zwijnarde,BE
(43) Zgłoszenie ogłoszono: Katherine Mortier,Zwijnarde,BE
06.05.2002 BUP 10/02 Thierry Bogaert,Zwijnarde,BE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (74) Pełnomocnik:
30.04.2009 WUP 04/09 Elżbieta Pietruszyńska-Dajewska, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.
(57) 1. Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami, znamienny tym, że
a) identyfikuje się sekwencję DNA ze wspomnianego nicienia;
b) klonuje się wspomnianą sekwencję z etapu a) lub jej fragment w odpowiednim wektorze w takiej orientacji wzglę dem promotora(rów), że wspomniany promotor(y) zdolny jest do inicjacji transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego ze wspomnianym promotorem(ami) i
c) wprowadza się wspomniany wektor do rośliny.
PL 201 425 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami, zwłaszcza za pomocą inhibicji dwuniciowym RNA (dsRNAi) i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia będącego szkodnikiem roślinnym.
Ostatnio opisano w Nature, tom 391, str. 806-811, luty 98, że wprowadzanie dwuniciowego RNA do komórki powoduje silną i specyficzną ingerencję w ekspresję endogennych genów w komórce, która to ingerencja jest istotnie bardziej wydajna niż dostarczanie pojedynczych nici RNA, jak to się proponuje w technice antysensu. Ta specyficzna redukcja aktywności genu została także stwierdzona u nicienia Caenorhabditis elegans (C. elegans), gdy RNA wprowadzano do genomu lub jamy ciała robaka.
Twórcy wynalazku zastosowali tę technikę i użyli jej także do rozwinięcia nowych sposobów przypisywania funkcji genom lub fragmentom DNA, które zostały zsekwencjonowane w różnych projektach, takich jak przykładowo, projekt poznania ludzkiego genomu i którym nie przypisano dotychczas określonej funkcji oraz do zastosowania w identyfikowaniu DNA odpowiedzialnego za nadawanie określonego fenotypu.
Przedmiotem wynalazku jest sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami, polegający na tym, że
a) identyfikuje się sekwencję DNA ze wspomnianego nicienia;
b) klonuje się wspomnianą sekwencję z etapu a) lub jej fragment w odpowiednim wektorze w takiej orientacji względem promotora(rów), że wspomniany promotor(y) zdolny jest do inicjacji transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego ze wspomnianym promotorem(ami); i
c) wprowadza się wspomniany wektor do rośliny.
Korzystnie wspomniany nicień żeruje na tej roślinie.
Korzystnie wspomniany nicień obejmuje dowolnego z Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchulus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmaniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconerrtella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchs ssp.
Korzystnie wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się pomiędzy dwoma promotorami tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorami wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
Korzystnie wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się w orientacji sensownej i antysensownej względem wspomnianego promotora tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
Korzystnie jako promotor(y) stosuje się promotor(y) tkankowo-specyficzny.
Korzystniej jako promotor(y) stosuje się promotor(y) specyficzny dla korzeni.
Korzystnie wspomniany sposób stosuje się go do łagodzenia zakażenia roślin pasożytniczymi nicieniami.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie sekwencji DNA z nicienia będącego szkodnikiem roślinnym, przy czym sekwencja DNA lub jej fragment jest klonowana w odpowiednim wektorze w takiej orientacji względem promotora(rów), że wspomniany promotor(y) zdolny jest do inicjacji transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego z promotorem(ami), do łagodzenia zakażenia roślin nicieniami.
Korzystnie wspomniana sekwencja DNA dostarczona jest pomiędzy dwoma promotorami tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorami wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
Korzystnie wspomniana sekwencja DNA dostarczona jest w orientacji sensownej i antysensownej względem wspomnianego promotora tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
Korzystnie jako promotor(y) stosuje się promotor(y) tkankowo-specyficzny.
Korzystniej jako promotor(y) stosuje się promotor(y) specyficzny dla korzeni.
Zatem, opisano tutaj sposób identyfikowania DNA odpowiedzialnego za nadawanie pewnego fenotypu w komórce, który obejmuje:
a) konstruowanie biblioteki cDNA lub genomowej z DNA tej komórki w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego cDNA lub DNA do dwuniPL 201 425 B1 ciowego (ds) RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów,
b) wprowadzanie wspomnianej biblioteki do jednej lub więcej komórek zawierających wspomniany czynnik transkrypcyjny oraz
c) identyfikowanie i izolowanie danego fenotypu wspomnianej komórki zawierającej wspomnianą bibliotekę i identyfikowanie fragmentu DNA lub cDNA ze wspomnianej biblioteki odpowiedzialnego za nadawanie danego fenotypu.
Biblioteka może być zorganizowana w zbiory hierarchiczne, co opisano szczegółowo w opisanych przykładach przed etapem b) tak, aby obejmowała przykładowo rodziny genów.
Opisano tutaj również sposób przypisywania funkcji znanej sekwencji DNA, który obejmuje:
a) identyfikowanie homologu lub homologów wspomnianej sekwencji DNA w komórce,
b) izolowanie odnośnego homologu lub homologów DNA lub jego fragmentu z komórki,
c) klonowanie wspomnianego homologu lub jego fragmentu do odpowiedniego wektora w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego cDNA lub DNA do dwuniciowego (ds) RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów,
d) wprowadzanie wspomnianego wektora do wspomnianej komórki z etapu a) zawierającej wspomniany czynnik transkrypcyjny oraz
e) identyfikowanie fenotypu wspomnianej komórki w porównaniu z typem dzikim.
Sekwencja nukleotydowa lub DNA mogą być dostarczana w orientacji sensownej i antysensownej wobec pojedynczego promotora, którego cechy zdefiniowano powyżej, lub alternatywnie może być umieszczana pomiędzy dwoma identycznymi promotorami. dsRNA dostarczany jest w wyniku transkrypcji inicjowanej przez promotor po związaniu z odpowiednim czynnikiem transkrypcyjnym.
Komórka może pochodzić z organizmu lub może być zawarta w organizmie. Gdy komórka zawarta jest w organizmie, organizm może być przystosowany do ekspresjonowania odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Organizmem może być dowolna roślina, zwierzę, grzyb lub drożdże, a dogodnie jest to nicień C. elegans, który może być typu dzikiego, może być mutantem C. elegans nuc-1 lub pha-ts, lub kombinacją tych mutacji.
Biblioteka DNA lub cDNA lub homologu DNA lub jego fragmentu, może być, dogodnie, transfekowana lub transformowana do mikroorganizmu, takiego jak komórka bakteryjna lub drożdżowa, która może stanowić pokarm dla organizmu, którym jest dogodnie nicień C. elegans. Mikroorganizm może być przystosowany do ekspresjonowania odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Dogodnie mikroorganizmem jest E. coli.
Biblioteka DNA, homologu DNA lub fragmentu DNA może być skonstruowana w odpowiednim wektorze, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą wspomniany czynnik transkrypcyjny. Alternatywnie, wspomniany czynnik transkrypcyjny może być kodowany przez dodatkowy wektor. Ewentualnie komórka lub organizm może ekspresjonować lub może być przystosowana do ekspresji wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Dogodnie, dowolny wektor stosowany w sposobie według wynalazku zawiera marker selekcyjny, którym może być przykładowo sekwencja nukleotydowa kodująca sup-35 lub jej fragment. Sekwencja nukleotydowa może być zorientowana względem promotora w taki sposób, ż e wiązanie czynnika transkrypcyjnego do promotora inicjuje transkrypcję DNA w dwuniciowy RNA.
Figura 10 prezentuje wektory i orientację sekwencji DNA, która umożliwia produkcję dwuniciowego RNA w C. elegans. DNA może być umieszczony pomiędzy dwoma promotorami w wektorze zdolnym do ekspresji dsRNA poprzez wiązanie odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów.
Alternatywnie, wektor zawiera dwie kopie sekwencji DNA zorganizowane w sensownej i antysensownej orientacji względem promotora i którego marker może być selekcjonowany, gdy znajduje się w mutancie pha-1 C. elegans. Dogodnie promotory stanowią dowolny z promotorów T7, T3 lub SP6, a czynnik transkrypcyjny odpowiednią polimerazę.
Dogodnie marker selekcyjny obejmuje sekwencję nukleotydową zdolną do inhibicji lub zapobiegania ekspresji genu we wspomnianej komórce, przy czym gen ten jest odpowiedzialny za nadawanie znanego fenotypu. Ta sekwencja nukleotydowa może być częścią wspomnianego genu lub może być identyczna ze wspomnianym genem nadającym wspomniany fenotyp, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest w orientacji wobec odpowiedniego promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację
PL 201 425 B1 transkrypcji dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub wspomnianych promotorów.
Alternatywnie ta sekwencja nukleotydowa może być częścią lub może być identyczna ze wspomnianą sekwencją genu nadającą wspomniany fenotyp, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest taka, że pozwala na integrację wspomnianego odpowiedniego lub dodatkowego wektora poprzez rekombinację homologiczną z genomem wspomnianej komórki i po wspomnianej integracji wspomniana sekwencja nukleotydowa jest zdolna do inhibicji ekspresji wspomnianej sekwencji genu nadającej wspomniany fenotyp.
Sekwencja nukleotydowa zawiera kodony stopu wystarczające do zapobiegania translacji wspomnianej sekwencji nukleotydowej po jej integracji ze wspomnianym genomem.
Dogodnie w sposobie tym mogą być dodawane do wspomnianej komórki lub organizmu związki w celu poszukiwania pożądanych fenotypów, takich jak przykł adowo oporność na antybiotyki lub wra ż liwość na związek w porównaniu z typem dzikim. Promotory są dogodnie indukowalne. Czynnik transkrypcyjny może w pewnych realizacjach być pochodzenia fagowego, tak jak przykładowo polimeraza T7 kontrolowana przez promotor fagowy. Jednakże, gdy stosowany jest C. elegans mogą zostać użyte promotory specyficzne dla robaków lub szczególnej tkanki, takie jak przykładowo Iet858, SERCA, ULG, myo-2 lub myo-3. Dogodnie, szczep E. coli jest negatywny względem RNAzy III, a dogodniej jest to szczep negatywny pod względem RNAzy.
Opisano tutaj również sposób wytwarzania transgenicznego organizmu nie-człowieka obejmującego egzogenny czynnik transkrypcyjny i trasngen zawierający promotor operacyjnie związany z fragmentem DNA, ekspresjonowany po przyłączeniu do niego tego czynnika transkrypcyjnego, który to sposób obejmuje:
a) dostarczenie pierwszego organizmu transgenicznego zawierającego pierwszy konstrukt zawierający DNA kodujący egzogenny czynnik transkrypcyjny i drugiego organizmu transgenicznego zawierającego drugi konstrukt zawierający przynajmniej jeden promotor operacyjnie związany z pożądaną sekwencją DNA, która jest ekspresjonowana po przyłączeniu do niego czynnika transkrypcyjnego z pierwszego organizmu transgenicznego,
b) krzyżowanie wspomnianego pierwszego i drugiego organizmu transgenicznego i selekcjonowanie potomstwa ekspresjonującego wspomnianą pożądaną sekwencję DNA.
Pierwszy i drugi organizm transgeniczny może być wytworzony poprzez transformowanie wspomnianego pierwszego i drugiego konstruktu do odpowiednich mikroorganizmów służących następnie do karmienia odpowiedniego organizmu.
Dogodnie wspomniany drugi konstrukt zawiera pożądaną sekwencję DNA w orientacji wobec wspomnianego promotora pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego DNA do dsRNA po związaniu do niego wspomnianego czynnika transkrypcyjnego.
Wspomniany drugi konstrukt zawiera dwa promotory flankujące wspomnianą pożądaną sekwencję DNA, które to promotory mogą inicjować transkrypcję wspomnianej sekwencji DNA do dsRNA po związaniu wspomnianego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów.
Alternatywnie wspomniana sekwencja DNA jest dostarczana w orientacji sensownej lub antysensownej wobec wspomnianego promotora w celu uzyskiwania produkcji dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotora.
Pierwszy i/lub drugi konstrukt mogą być dogodnie wyposażone w gen reporterowy operacyjnie związany z promotorem, który jest zdolny do inicjacji transkrypcji wspomnianego reportera po związaniu do niego wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Dogodnie wspomniany gen reporterowy zawiera dowolną spośród sekwencji kodujących lucyferazę, białko zielonej fluorescencji, β galaktozydazę lub β-laktamazę.
Opisano tutaj także sposób oceny klonów zidentyfikowanych w eksperymencie z dwuhybrydowym wektorem drożdżowym, które to eksperymenty są dobrze znane fachowcom i które to eksperymenty zostały po raz pierwszy zaproponowane przez Chien i wsp. (1991) w celu wykrywania oddziaływań białko-białko.
Sposób ten obejmuje dostarczanie konstruktu zawierającego DNA kodujący białko zidentyfikowane w eksperymencie z dwuhybrydowym wektorem drożdżowym, przy czym konstrukt ten jest taki, że wspomniany DNA jest w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, transformowanie komórki, takiej jak komórka bakteryjna lub alternatywnie transformowanie organizmu zawierającego wspomniany czynnik tranPL 201 425 B1 skrypcyjny wspomnianym konstruktem i identyfikowanie zmian fenotypowych we wspomnianej komórce lub organizmie, którym może być C. elegans lub podobny, w porównaniu z typem dzikim.
Dogodnie, czynnik transkrypcyjny jest indukowalny w komórce lub organizmie. Ponownie, sekwencja DNA może być umieszczana pomiędzy dwoma promotorami lub może być w orientacji sensownej, jak i antysensownej wobec pojedynczego promotora, jak opisano poprzednio.
Dogodnie, promotor jest promotorem fagowej polimerazy, a wspomniany czynnik transkrypcyjny jest polimerazą RNA, zwłaszcza polimerazą RNA T7. Ujawniono tutaj również wektory stosowane do transformowania wspomnianych komórek lub organizmów i komórki lub organizmy jako takie.
Sposób łagodzenia ataku szkodników roślinnych według wynalazku obejmuje:
a) identyfikowanie sekwencji DNA ze wspomnianego nicienia, która jest kluczowa dla jego przetrwania, wzrostu, rozmnażania,
b) klonowanie wspomnianej sekwencji z etapu a) lub jej fragmentu do odpowiedniego wektora w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów oraz
c) wprowadzanie wspomnianego wektora do rośliny.
Zatem, korzystnie, sposób według wynalazku dostarcza szczególny mechanizm selekcyjny do łagodzenia ataku szkodników, a w pewnych przypadkach ataku pasożytów roślinnych, w którym szkodniki żerujące na roślinie zjadają ekspresjonowane w roślinie dsRNA i w ten sposób roślina inhibituje u szkodnika ekspresję DNA, który jest kluczowy dla jego wzrostu, przetrwania, rozmnażania lub reprodukcji.
W korzystnej realizacji wynalazku, nicieniem może być Tylenchulus ssp. Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmaniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Parartichodorus ssp., Aphelenchs ssp. Sekwencja DNA lub jej fragment zgodnie z tym aspektem wynalazku może być wklonowana pomiędzy dwa tkankowo-specyficzne promotory, takie jak promotory specyficzne dla korzeni.
Wektor ekspresyjny stosowany w dowolnym sposobie według wynalazku do konstruowania wspomnianej biblioteki może zawierać dwa identyczne promotory w orientacji wobec wspomnianej sekwencji DNA pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Sekwencja DNA może, przykładowo, obejmować miejsce wielokrotnego klonowania. Dogodnie, wektor ekspresyjny zawiera dodatkowo sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny.
Wspomniana sekwencja nukleotydową kodująca wspomniany marker selekcyjny może być umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotorów. Dogodnie marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sup-35, do wprowadzania do C. elegans posiadającego mutację pha-1.
Dogodnie, czynnik transkrypcyjny zawiera polimerazę fagową wiążącą się z odpowiednim promotorem lub promotorem specyficznym dla C. elegans, dogodniej polimerazę RNA T7.
Dogodnie, wektor zawiera miejsce wielokrotnego klonowania pomiędzy wspomnianymi identycznymi promotorami.
Opisano również wektor ekspresyjny do ekspresji odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do stosowania w sposobie według wynalazku, który to wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą wspomniany czynnik transkrypcyjny operacyjnie związany z odpowiednimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję.
Dogodnie, sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują promotory które są indukowalne, konstytutywne, ogólne lub tkankowo-specyficzne, lub ich kombinacje.
Dogodnie czynnik transkrypcyjny obejmuje polimerazę fagową, a dogodnie polimerazę RNA T7, T3 lub SP6.
Opisano również system selekcyjny do identyfikowania transformacji komórki lub organizmu wektorem tutaj opisanym, który to system zawiera wektor tutaj opisany, w którym marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową zdolną do inhibicji lub zapobiegania ekspresji genu we wspomnianej komórce lub organizmie, który to gen jest odpowiedzialny za nadawanie znanego fenotypu.
PL 201 425 B1
Dogodnie wspomniana sekwencja nukleotydową odpowiada części wspomnianego genu lub jest identyczna ze wspomnianym genem nadającym wspomniany znany fenotyp i która to sekwencja nukleotydową jest umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dwuniciowego RNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów.
Alternatywnie, sekwencja nukleotydową zawiera sekwencję nukleotydową, która jest częścią lub jest identyczna z sekwencją wspomnianego genu, który nadaje znany fenotyp wspomnianej komórce lub organizmowi i która to sekwencja nukleotydowa pozwala na integrację wspomnianego wektora poprzez rekombinację homologiczną z chromosomem wspomnianej komórki lub organizmu i po wspomnianej integracji wspomniana sekwencja nukleotydowa jest zdolna do inhibicji ekspresji wspomnianej sekwencji genu nadającej wspomniany znany fenotyp.
Dogodnie sekwencja nukleotydową zawiera kodony stopu wystarczające do zapobiegania translacji sekwencji nukleotydowej po jej integracji ze wspomnianym genomem.
Dogodnie sekwencja znanego genu zawiera gen sup-35 lub jego fragment, który może być selekcjonowany poprzez identyfikowanie potomstwa wzrastającego w temperaturze powyżej 25°C po wprowadzeniu do genomu mutanta pha-1 et123ts robaka C. elegans.
Wspomniana sekwencja znanego genu może zawierać gen sup-35 lub jego fragment, który może być selekcjonowany poprzez identyfikowanie potomstwa wzrastającego w temperaturze powyżej 25°C po wprowadzeniu wspomnianego wektora do genomu mutanta pha-1 et123ts robaka C. elegans.
Opisano tutaj także sposób przypisywania funkcji sekwencji DNA z organizmu wielokomórkowego, który to sposób obejmuje
a) dostarczanie (i) konstruktu zawierającego fragment DNA sklonowany pomiędzy dwoma promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji w tym organizmie wielokomórkowym z tego promotora;
b) identyfikowanie fenotypu wspomnianego organizmu wielokomórkowego w porównaniu z typem dzikim.
Niniejszy wynalazek może stać się łatwiej zrozumiany w świetle poniższych przykładów, które są jedynie przykładami odnoszącymi się do załączonych figur, na których:
Figura 1 jest sekwencją nukleotydową plazmidu PGN1 tutaj opisanego.
Figura 2 jest sekwencją nukleotydową plazmidu PGN100 tutaj opisanego.
Figura 3 przedstawia schematycznie zastosowane wektory i drogę transformacji wykorzystaną w sposobach tutaj opisanych.
Figura 4 przedstawia wektor ekspresyjny zastosowany zgodnie z wynalazkiem.
Figura 5 przedstawia schemat wektorów ekspresyjnych polimerazy RNA T7 zastosowanych do transformacji C. elegans.
Figura 6 przedstawia plazmid PGN1.
Figura 7 przedstawia diagram prezentujący wzmocniony wektor do inhibicji dsRNA kodujący dsRNA sup-35.
Figura 8 przedstawia wektor do integracji z genomem C. elegans.
Figura 9 przedstawia pozycję sekwencji DNA względem odpowiedniego promotora inicjującego ekspresję dsRNA z sekwencji DNA.
Figura 10 przedstawia plazmid pGN108.
Figura 11 przedstawia plazmid pGN105.
Figura 12 przedstawia plazmid pGN400.
Figura 13 przedstawia plazmid pGN401.
Figura 14 przedstawia plazmid pGN110.
Figura 15 przedstawia plazmid pAS2 z promotorami T7/T3/SP6, zgodnym i odwrotnym.
Figura 16 przedstawia plazmid pGAD424 z promotorami T7/T3/SP6, zgodnym i odwrotnym.
Figura 17 przedstawia plazmid pAS2-cyh2-HA+, obydwa T7-końce.
Figura 18 przedstawia plazmid pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7.
Figura 19 (a) przedstawia plazmid pGN205, a (b) przedstawia plazmid pGN207.
P r z y k ł a d A. Konstruowanie uporządkowanej i hierarchicznie pogrupowanej biblioteki cDNA i jej zastosowania
Losowo uporządkowana i pogrupowana biblioteka
Wektorem jest wektor E. coli posiadający dwa promotory T7, z miejscem wielokrotnego klonowania (MCS) pomiędzy nimi. Obydwa promotory są skierowane do siebie i do MCS. W obecności
PL 201 425 B1 polimerazy RNA T7, ekspresjonowanej w E. coli, C. elegans lub dowolnym innym organizmie, produkowane będzie RNA, startując z promotorów T7. Ze względu na to, że są one ukierunkowane w przeciwnych sensach, obydwie nici RNA będą produkowane z DNA wbudowanego (sklonowanego) w MCS pomię dzy dwoma promotorami, co powoduje wytworzenie dwuniciowego RNA (dsRNA) po związaniu do niego polimerazy RNA T7.
Biblioteka cDNA C. elegans jest konstruowana w MSC za pomocą typowych technik biologii molekularnej. Biblioteka transformowana jest do E. coli, a uzyskane E. coli namnażane w hodowlach i przechowywane w 96-studzienkowych płytkach. Na tym etapie, DNA plazmidowy może być izolowany i przechowywany na 96-studzienkowych płytkach odpowiadającym koloniom E. coli. Zebranych jest około 100000 kolonii.
Dzięki temu biblioteka odpowiada w przybliżeniu 5-krotnej całkowitej ekspresji różnorodności cDNA z C. elegans, co daje możliwość obecności w bibliotece słabo ekspresjonowanych sekwencji. Uzyskuje się w wyniku tego około 1041 96-studzienkowych płytek. Gdy jest to konieczne, płytki grupowane są hierarchicznie.
W celu pogrupowania klonów dzielone są one w zakresach od 10 do 100. Gdy grupowanie hierarchiczne następuje co 8 lub co 12 (liczby te są najbardziej odpowiednie, ponieważ płytki 96-studzienkowe posiadają 8 na 12 rzędów), daje to około 87 płytek kilku-studzienkowych i około 8352 studzienek. Gdy grupowanie hierarchiczne następuje co 96 studzienek, co odpowiada pełnej płytce, daje to około 11 płytek i około 1041 studzienek. W dowolnym etapie grupowania hierarchicznego, plazmidowy DNA może być izolowany, co jest tym mniej pracochłonne, im mniej płytek jest zastosowanych, lecz może zaowocować utratą kompleksowości, pomimo, że nie powinno to nastąpić przy grupowaniu co 12. Grupowanie DNA może być także prowadzone z oryginalnym DNA.
Eksperymenty poniżej opisują jak powinno być przeprowadzone hierarchiczne grupowanie, zarówno w przypadku biblioteki E. coli, jak i DNA.
Uporządkowana biblioteka do techniki RNAi, z każdym genem z genomu C. elegans, wraz z jej zastosowaniami
Jako że projekt sekwencjonowania genomu ma się ku końcowi, informacje te mogą być zastosowane do stosowania techniki inhibicji RNA T7. Każdy gen z genomu C. elegans może być sklonowany za pomocą PCR. Dogodnie, klonowane są egzony o minimalnej długości 500 pz. Jeśli egzon jest zbyt mały, mniejsze fragmenty będą izolowane za pomocą PCR lub nawet części intronów i sąsiednich egzonów będą izolowane techniką PCR, dzięki czemu przynajmniej wystarczająca część regionu genu ulegającego translacji będzie sklonowana. W tym celu należy przeprowadzić przynajmniej 17000 reakcji PCR.
Taka kolekcja produktów PCR zostanie sklonowana w wektorze T7 zgodnie z opisem (dwa promotory T7 ukierunkowane do siebie z miejscem wielokrotnego klonowania pomiędzy nimi). Każdy produkt PCR jest klonowany niezależnie lub może być stosowany do generowania losowej biblioteki, analogicznie do opisanej biblioteki cDNA. Gdy każdy produkt PCR jest klonowany niezależnie, uzyskiwane bakterie i plazmidowy DNA mogą być grupowane różnymi sposobami. Po pierwsze, kolekcja niezależnie sklonowanych produktów PCR w wektorze RNA T7 i może być grupowana losowo, jak to opisano dla biblioteki losowej.
Grupowanie można także prowadzić w bardziej racjonalny sposób. Przykładowo, geny z genomu C. elegans mogą być analizowane narzędziami bioinformatycznymi (biologia in silico). Różne geny z genomu mogą należeć do rodziny genów lub posiadać homologi w genomie. Można zatem grupować członków rodziny genów lub grupować członków będących homologami. W ten sposób całkowita liczba około 17000 klonów jest zredukowana do bardziej użytecznej ilości. Biblioteka ta może być zastosowana do poszukiwania fenotypów.
Uzyskany fenotyp dostarcza funkcjonalnego opisu genu lub rodziny genów lub homologów genu z genomu C. elegans. Jako że biblioteka stanowi część wszystkich genów z genomu, sposób ten umożliwia opisanie pełnego genomu cechami funkcjonalno-fenotypowymi. W tym celu konieczne jest wprowadzenie dwuniciowego RNA (dsRNA) do robaków. Takie wprowadzenie pojedynczych klonów, lub klonów pogrupowanych, pogrupowanych losowo lub racjonalnie może być przeprowadzone kilkoma opisanymi metodami.
Przykład wektora do ekspresji dwuniciowego RNAi
Dowolny wektor zawierający promotor T7 może zostać wykorzystany, zwłaszcza zawierający miejsce wielokrotnego klonowania (wiele z nich jest dostępnych komercyjnie). Zaprojektowano startery zawierające promotor T7 i starter z odwrotną nicią komplementarną, obydwa z odpowiednimi końcami.
PL 201 425 B1
Startery te mogą hybrydyzować i gdy są dobrze zaprojektowane, być wklonowane do wybranego wektora. Minimalną sekwencją promotora T7 jest TAATACGACTCACTATAGGGCGA.
Pomimo tego, że do konstruowania wektora ekspresyjnego T7 może być zastosowany dowolny wektor, poniżej podano przykład wykorzystujący w tym celu wektor pGEM-3zf(-).
- Wektor pGEM-3zf(+) (PROMEGA) trawiono Hindlll i Sali.
- Startery oGN1 i oGN2 mieszano wspólnie w ostatecznym stężeniu 1 μ g/30 μ l, gotowano i schł adzano powoli do temperatury pokojowej.
- Starter ligowano do wektora stosują c standardową procedurę ligacyjną . Uzyskano tak wektor pGN1 (pokazany na figurze 1), który zawiera dwa promotory T7 skierowane do siebie, otaczające leżące pomiędzy nimi miejsce wielokrotnego klonowania.
Sekwencje oGN1 i oGN2 są następujące:
- oGN1: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
- oGN1: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC
Przykład konstruowania biblioteki
RNA może być izolowany z każdego, wrażliwego względem RNAi organizmu. Ogólnie, wyizolowany RNA jest następnie kopiowany w postaci dwuniciowego cDNA, a następnie umieszczany w odpowiednich wektorach do klonowania. Istnieje kilka procedur oraz zestawów, produkowanych przez różne firmy, włączając Promega, Clontech, Boehringer Mannheim, BRL, itp., stosowanych w biologii molekularnej i pozwalających na:
- izolację RNA,
- ewentualnie możliwość wyizolowania RNA polyA (dostępnych jest kilka technik oraz zestawów),
- syntezę pierwszej nici za pomocą odwrotnej transkryptazy AMV, losowych heksamerowych starterów i/lub starterów oligonukleotydowych (dT),
- syntezę drugiej nici za pomocą RNAzy H, Polimerazy DNA I,
- przygotowanie „tępych” końców za pomocą Polimerazy DNA T4,
- dodatek adaptera za pomoc ą ligazy DNA T4,
- ewentualną obróbkę za pomocą kinazy polinukleotydowej T4,
- klonowanie cDNA do wektora.
Otrzymana mieszanina ligacyjna może być rozumiana jako biblioteka cDNA. Ligacja obejmuje wszystkie cDNA stosowane w procedurze ligacji do odpowiedniego wektora. W celu uporządkowania biblioteki, wymagane jest transformowanie produktu ligacji do szczepów E. coli.
Zastosowanie tych szczepów E. coli lub biblioteki DNA
Szczep produkujący RNA T7
- Standardowym szczepem jest BL21 (DE3): F-ompT[lon]hsds (r-m-; oraz szczep E. coli B) λ (DE3). Ewentualnie mogą być zastosowane warianty BL21, mimo zastosowania BL21(DE3) pLys.
- Powinien być skonstruowany jakikolwiek inny, dostę pny szczep E . coli, produkują cy polimerazę RNA T7. Można to wykonać w prosty sposób, stosując handlowo dostępny preparat faga, w tym wypadku wykorzystano wektor λCE6 (dostarczany przez Promega). Prawie każdy szczep E. coli może być transfekowany za pomocą tego faga i będzie produkował polimerazę RNA T7.
Mutant RNAzy III E. coli
Z pośród rożnych, dostępnych początkowo szczepów, do zastosowania w pierwszym eksperymencie wybrano szczep AB301-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relA1, spoT1, metB1 (Kinder i wsp., 1973, Mol. Gen. Genet 126: 53), ale inne szczepy mogą lepiej nadawać się do tego celu. Szczep ten zainfekowano XCE6, co pozwoliło na uzyskanie wariantu produkującego polimerazę RNA T7.
Dziki typ robaków C. elegans może być hodowany na podłożu bakteryjnym. Bakterie ekspresjonują polimerazę RNA T7. Powoduje to powstanie dużych ilości dwuniciowego RNA w jelicie C. elegans, który dyfunduje następnie w organizmie i wywołuje inhibicję ekspresji. Biblioteka ta może być wykorzystana do skriningu kilku fenotypów. Technika ta jest zalecana ze względu na większą szybkość wykrycia istotnych genów, biorących udział w pewnych ścieżkach, niż znana, stosowana w badaniach C. elegans, technologia. Ponadto, w przypadku znalezienia interesującego fenotypu, umożliwia ona łatwe sklonowanie odpowiedzialnego genu.
Zastosowanie hierarchicznie uporządkowanej metody pozwala na łatwe wykrycie w drugim skriningu istotnego dla eksperymentu klonu z całego zbioru. DNA, jaki uległ insercji w tym klonie może
PL 201 425 B1 być następnie sekwencjonowany. Eksperyment ten dostarcza w jednym etapie dane genetyczne i biochemiczne.
Dziki typ szczepów C. elegans może być stosowany w połączeniu ze związkami służącymi do skriningu fenotypu, oporności na leki i/lub wrażliwości na leki. Szczep C. elegans może być szczepem zmutowanym, o wzmocnionym fenotypie, zredukowanym fenotypie lub nowym fenotypie. Szczep C. elegant może być szczepem zmutowanym, a w skriningu biblioteki wykorzystywane różne związki. Dlatego też, skrining może być wykonany pod kątem oporności na leki, wrażliwości na leki, wzmocnionego fenotypu, zredukowanego fenotypu lub nowego fenotypu. Szczep E. coli może być jakimkolwiek ekspresjonującym polimerazę RNA T7 szczepem, jak na przykład, BL21(DE3), ale tworzenie dwuniciowego RNA może być wzmocnione dzięki użyciu specjalnego szczepu E. coli, negatywnego pod względem RNAzy III.
RNAza III rozpoznaje specyficzne pętle w dwuniciowym RNA. Ostatecznie, możliwe jest zastosowanie szczepu E. coli, w którym nastąpiła delecja RNAz, innych niż RNAza III lub szczepu E. coli charakteryzującego się delecją jednej lub więcej RNAz. W większości znanych szczepów E. coli i konstruktów, zdolnych do generowania szczepów E. coli produkujących polimerazę RNA T7, ekspresja polimerazy RNA T7 ogólnie obejmuje indukowany promotor. Tym sposobem regulowana jest produkcja polimerazy RNA T7, zatem też produkcja dwuniciowego RNA.
Dogodnie, właściwość ta może być wykorzystana do „pulsowego” karmienia robaków C. elegans podczas specyficznych etapów ich wzrostu. Robaki hodowane są na nie indukowanych szczepach E. coli. W momencie, gdy osiągają odpowiednie stadium, indukuje się w bakteriach produkcję RNA T7. Pozwala to na badanie działania jakiegokolwiek genu, w jakimkolwiek punkcie cyklu życiowego zwierzęcia.
Skrining biblioteki pod kątem homologii z przypuszczalnie interesującymi genami ludzkimi i przypisywanie funkcji tym genom
Podczas realizacji różnorodnych projektów, będących projektami genomowymi, ekspresjonowania różnicującego, analiz hybrydyzacyjnych itp., wyizolowano setki genów. Opisana biblioteka cD-NA może dostarczać sposób na ocenę i /lub przypisanie funkcji tym genom w szybki i skuteczny sposób. Przede wszystkim, homologi z robaka lub homologi czy geny powinny być zidentyfikowane metodami bioinformatycznymi (biologia in silico).
Przygotowywane są startery PGR oraz wyizolowane fragmenty cDNA przy użyciu technologii PCR. Reakcja PCR może być wykonana na hierarchicznie uporządkowanym zbiorze. Pozytywne zbiory lub pojedyncze studzienki zawierające bakterie posiadające odpowiedni cDMA są dostarczane jako karma dla C. elegans i odczytywany jest fenotyp.
PCR może być wykonany na cDNA wyizolowanym z C. elegans. Otrzymany DNA może być klonowany do wektora T7 i transformowany w produkujących dwuniciowy RNA E. coli, które następnie podawane są z karmą robakom C. elegans. Odpowiednią metodę należy wybrać zależnie od jej szybkości i wiarygodności.
W przypadku, jeżeli gen należy do rodziny genów, może zaistnieć potrzeba karmienia robaków mieszaniną bakterii. Każda z nich obejmuje część członków rodziny genów. Szczepy E. coli, warunki wzrostu, stosowanie dodatkowych związków można opracować zgodnie z opisem powyżej.
Zastosowanie odpowiedniej biblioteki, w której wszystkie geny C. elegans są wklonowane w zorganizowany i określony sposób pozwala na łatwe wykrycie w tej bibliotece, za pomocą metod biologii in silico, homologów C. elegans i możliwie innych homologów, ortologów i członków rodziny genowej. Etap ten nie obejmuje PCR i umożliwia izolację obecnych podczas wzrostu robaków bakterii i/lub DNA.
Przykłady
Założenie serii eksperymentów miało na celu przetestowanie zarówno wektora RNAi, jak i różnych, skonstruowanych szczepów E. coli.
1) Konstrukcja testowego plazmidu
W eksperymencie tym moż na zastosować jakikolwiek cDNA wywoł ujący wyraźny fenotyp robaków, w przypadku inaktywacji genu lub użyty w eksperymencie RNAi. Wiadomo, że odpowiednim kandydatem jest unc-22, ale możliwe jest zastosowanie innych genów. Wykorzystano system wrażliwości, możliwy do wykorzystania na etapie późnego stadium. System testowano za pomocą sup-35 i tł a pha-1. Egzon 5 pochodzą cy z sup-35 wyizolowano za pomocą PCR i wklonowano do wektora pGN1 z promotorem T7.
PL 201 425 B1
Tak otrzymany wektor oznaczono jako pGN2. Mutanty robaków pha-1 (e2123) nie są zdolne do produkcji potomstwa w temperaturach wyższych niż 25°C. Wynika to z zakłóceń rozwojowych na etapie embriogenezy. W przypadku, gdy sup-35 ulega inaktywacji lub inhibicji w takim szczepie, potomstwo może rosnąć w tej temperaturze. Połączone zastosowanie mutantów robaków pha-1 oraz sup-35
RNAi jest dobrym systemem do oceny różnych opcji.
2) Testowanie RNAi za pomocą szczepu E. coli, produkującego dwuniciowy RNA
- pGN2 został wprowadzony do szczepu E. coli BL21(DE3), a następnie za pomocą IPTG indukowano polimerazę RNA T7. Robaki C. elegans (pha-1 (e2123)) inokulowano do tych bakterii i hodowano w restrykcyjnej temperaturze 25°C. Ponieważ w takiej temperaturze hodowane są mutanty embrionowe, nie obserwuje się podczas takiej hodowli pojawiania się potomstwa. Natomiast w sytuacji skutecznej inhibicji genu sup-35 przez dwuniciowy RNA obecny w E. coli, zaobserwuje się obecność potomstwa.
- pGN2 został wprowadzony do szczepu E . coli AB301-105 (DE3), a nastę pnie za pomocą IPTG indukowano polimerazę RNA T7. Robaki C. elegans (pha-1 (e2123)) inokulowano do tych bakterii i hodowano w restrykcyjnej temperaturze 25°C. Ponieważ w takiej temperaturze hodowane są mutanty embrionowe, nie obserwuje się podczas takiej hodowli pojawiania się potomstwa. Natomiast w sytuacji skutecznej inhibicji genu sup-35 przez dwuniciowy RNA obecny w E . coli, zaobserwuje się obecność potomstwa.
3) Udoskonalenie szczepu robaków w celu lepszego pobierania dwuniciowego RNA
Przed rozpoczęciem hodowli C. elegans pha-1 na płytkach, w obecności szczepu E. coli, produkującego dwuniciowy RNA sup-35, robaki poddano mutagenezie za pomocą EMS (metanosulfonian etylu). Potomstwo tak zmutowanych robaków umieszczano na płytkach z bakteriami. Robaki wzrastające na tych bakteriach dawały większe ilości potomstwa, charakteryzującego się mutacją, co powodowało zwiększone pobieranie dwuniciowego RNA i pozwalało na zastosowanie w kolejnych eksperymentach.
Stabilne włączenie wektora odpowiedzialnego za produkcję dwuniciowego RNA do genomu robaków produkujących polimerazę RNA T7.
Wektor E. coli skonstruowano tak, by posiadał następujące właściwości: dwa promotory T7, skierowane ku sobie i pomiędzy tymi dwoma promotorami miejsce restrykcyjne lub miejsce wielokrotnego klonowania. Ponadto, wektor może zawierać genomowy DNA C. elegans sup-35, skonstruowany tak, by zawierał kilka kodonów „stop” w różnych obszarach tak, by nie było ekspresji pełnej długości białka z fragmentu genomowego DNA sup35, jak przedstawiono na figurze 8. W miejscu wielokrotnego klonowania, pomiędzy dwoma promotorami T7, może być klonowany jakikolwiek cDNA lub fragment cDNA.
Gdy taki wektor wprowadzany jest do szczepu C. elegans, ekspresjonującego polimerazę RNA T7, to cDNA lub fragment cDNA wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7, ulega transkrypcji, generując z wklonowanego fragmentu dwuniciowy RNA.
Wektor zaprojektowany jest do zastosowania w przypadku mutantów pha-1 (e2123) robaków, ekspresjonujących polimerazę RNA T7. Ekspresja polimerazy RNA T7 może mieć charakter konstytutywny lub podlegać regulacji, zachodzić ogólnie lub tkankowo-specyficznie. Robaki pha-1 (e2123) nie mogą wytwarzać potomstwa w temperaturze wyższej niż 25°C, co wynika z zakłóceń rozwojowych podczas embriogenezy. Natomiast, w przypadku, gdy sup-35 ulega inhibicji lub inaktywacji w tym szczepie, możliwy jest wzrost potomstwa w tej temperaturze.
Po wprowadzeniu do robaków wektora, może on ulec integracji w wyniku homologicznej rekombinacji (integracja typu Campbell). Wykazano, że taka homologiczna rekombinacja zachodzi u C. elegans, jednak z niską częstotliwością (Plasterk i Groenen, EMBO J. 11: 287-290, 1992). Homologiczna rekombinacja w obrębie genu sup-35 daje w wyniku jego inaktywację, jako że dwa otrzymane geny sup-35 zawierają kodony „stop”. W rezultacie, robak i jego potomstwo, jeżeli taka rekombinacja zaszła w jajeczkach, posiada zintegrowaną w swoim genomie kopię wektora. Dzięki temu może być przeprowadzona na podstawie posiadania potomstwa w temperaturze wyższej niż 25°C selekcja robaków z inaktywowanym sup-35.
Ponadto, taki robak trwale produkuje dwuniciowy RNA, pochodzący z fragmentu DNA wklonowanego uprzednio pomiędzy dwoma promotorami T7. Tak scharakteryzowany typ robaka można uważać za trwale transgeniczny szczep organizmu o zredukowanej funkcji genu, z którego fragment został wcześniej wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7.
PL 201 425 B1
DNA może być dostarczany do organizmu robaków za pomocą kilku technik, włączając iniekcję, transformację balistyczną, moczenie w roztworze DNA, dodatek do karmy bakterii. Można rozważyć nowe i inne metody zwiększające wydajność transformacji.
Docelowy szczep C. elegans może, dodatkowo, zawierać inne mutacje niż mutację pha-1 (e2123) i ekspresjonować inne geny niż polimerazę RNA T7.
P r z y k ł a d B. Drożdżowy wektor dwuhybrydowy RNAi
Drożdżowy wektor dwuhybrydowy skonstruowany został tak, by zawierał dwa promotory T7. Wektory takie zaprojektowano tak, by ulegały replikacji, zarówno w drożdżach, jak i w E. coli. Ogólnie, biblioteki cDNA w przypadku drożdżowego systemu dwuhybrydowego konstruowane są w wektorach Gal4 lub LexA. Biblioteka konstruowana jest w wektorach posiadających domenę aktywacyjną jednego z tych genów. Wektor można skonstruować w taki sposób, aby wciąż przeprowadzać skrining, ale żeby również zawierał on te dwa promotory T7, zorientowane ku sobie i obejmował miejsce klonowania pomiędzy nimi. Ułożenie sekwencji w plazmidzie będzie zatem miało postać: „szkielet plazmidu, (GAL4-T7), MCS, T7, szkielet”.
Biblioteka cDNA C. elegans skonstruowana w takim wektorze może być zastosowana jako standardowa drożdżowa, dwuhybrydowa biblioteka w eksperymencie izolacji białek oddziałujących z danym białkiem. Po wyizolowaniu klonu, plazmid może być wprowadzany do szczepu E. coli ekspresjonującego polimerazę RNA T7, w wyniku czego uzyska się produkcję dwuniciowego RNA, pochodzącego od wklonowanego fragmentu. Bakterie produkujące taki dwuniciowy RNA mogą być włączone do pokarmu robaków i można oceniać fenotypy.
Jak w poprzednim przykładzie, taka procedura oceny dla nowo wyizolowanego drożdżowego dwuhybrydowego klonu jest znacznie krótsza niż standardowa procedura, wymagająca PCR i/lub etapów klonowania, eksperymentów z wykorzystaniem RNA i/lub eksperymentów inaktywujących gen. W większości przypadków, wyizolowane klony są na początku sekwencjonowane, a na podstawie sekwencji podejmowana jest decyzja czy eksperyment powinien być dalej kontynuowany. Każdy wyizolowany klon może być łatwo wprowadzony do odpowiedniego szczepu E. coli i dostarczony robakom. Ocenę przeprowadza się następnie przez analizę fenotypową.
W celu zastosowania tej procedury przygotowano drożdżowe podwójne hybrydy, wykorzystując znany gen jako przynętę oraz nowo skonstruowaną bibliotekę jako cel. Docelowe białka kodowane przez klony oddziaływały z białkiem dając w rezultacie pozytywne klony drożdżowe, ekspresjonujące cząsteczkę reporterową, tak jak obserwowane, to jest w przypadku LacZ oznaczanego za pomocą X-gal. Plazmid kodujący docelowe białko izolowano bezpośrednio ze szczepu drożdży i wprowadzono do E. coli. Szczep E. coli był szczepem produkującym polimerazę RNA T7. W tym przypadku, dwuniciowy RNA produkowany jest z DNA wklonowanego w miejscu wielokrotnego klonowania wektora. Po wprowadzeniu takiego dwuniciowego RNA, wraz z karmą do organizmu robaków, za pomocą opisanych uprzednio metod, gen ulega inhibicji u tych organizmów, co skutkuje określonym fenotypem.
- Taki drożdżowy dwuhybrydowy wektor może być dogodnie zastosowany do konstruowania uporządkowanej i hierarchicznie pogrupowanej biblioteki, jak opisano w poprzednim przykładzie.
- Możliwe jest skonstruowanie szczepu drożdży warunkowo produkującego polimerazę RNA T7. W wyniku zastosowania w eksperymentach drożdżowych podwójnych hybryd, można uzyskać indukcję ekspresji polimerazy T7, co wywołuje w rezultacie produkcję dwuniciowego RNA v; komórkach drożdżowych. Konsekwentnie, drożdże mogą być dostarczane w pokarmie robakom. Wykazano, że robaki C. elegans mogą otrzymywać w karmie drożdże.
Konstrukcja szczepu produkującego polimerazę RNA T7 i jego zastosowania
Możliwe jest skonstruowanie szczepu C. elegans tak, by produkował on polimerazę RNA T7. Ekspresja może mieć charakter konstytutywny i ogólny, ale możliwe jest też uzyskanie jej regulacji pod tkankowo-specyficznym promotorem, promotorem ulegającym indukcji lub promotorem czasowym, lub promotorem posiadającym jedną z tych właściwości, lub też ich kombinację. Do tak przygotowanego szczepu C. elegans może być wprowadzany DNA. Wprowadzenie DNA uzyskuje się w wyniku iniekcji, czy wstrzeliwania cząsteczek, dzięki zastosowaniu elektroporacji lub, jak wcześniej wspomniano, poprzez dostarczenie wraz z karmą.
W przypadku, gdy DNA ma postać plazmidu, jak opisano w poprzednich przykładach, np. jest plazmidem zawierającym wklonowany fragment cDNA lub fragment otrzymany w wyniku PCR, pomiędzy dwoma flankującymi promotorami T7, w komórkach lub w całym organizmie powstaje dwuniciowy RNA, pochodzący od tego cDNA lub fragmentu PCR, co wywołuje inhibicję odpowiedniego genu. Tak wprowadzony DNA może wydajnie pośredniczyć w przejściowej inhibicji. Wprowadzony DNA
PL 201 425 B1 może tworzyć struktury pozachromosomalne, które mogą powodować w rezultacie więcej katalitycznych inaktywacji lub redukcji funkcji fenotypowych. Plazmid może również ulec integracji z genomem organizmu, powodując takie katalityczne inaktywacje lub redukcję funkcji fenotypowych, ale w postaci utrwalonej i stabilnie przenoszonej.
- W wyniku zastosowania standardowych metod możliwe jest wprowadzenie do organizmu robaka produkującego polimerazę RNA T7, plazmidu DNA, zawierającego cDNA lub część cDNA, lub EST, lub fragment PGR pochodzący z C. elegans, wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7, jak opisano w przykładach A) oraz B). Możliwa jest analiza fenotypów - DNA, pochodzący z uporządkowanej biblioteki, jak w Przykładzie A) może być wprowadzony do organizmu robaków, produkujących polimerazę RNA T7, w wyniku zastosowania standardowych technik (iniekcja, wstrzeliwanie). Możliwa jest analiza fenotypów. Wyjściowy klon może być łatwo odnaleziony przy użyciu metody hierarchicznego uporządkowania.
- Taka sama procedura może być zastosowana w przypadku mutantów robaków ekspresjonujących polimerazę RNA T7. Możliwy jest skrining dla wzmocnionego, zredukowanego lub nowego fenotypu.
- Procedura moż e być zastosowana w celu przeprowadzenia skriningu związków. Skrining, zarówno dla dzikiego szczepu, jak i dla zmutowanego możliwy jest dla wzmocnionego lub nowego fenotypu.
- DNA moż e być wprowadzony do organizmu robaków w wyniku zastosowania nowych metod. Jedną z nich jest dostarczenie DNA poprzez E. coli. W tym przypadku, hierarchicznie uporządkowana biblioteka jest dostarczana jako karma zwierzęciu. W celu zapobiegnięcia trawieniu DNA E. coli w jelicie nicienia, dogodnie stosuje się C. elegans z niedoborem DNAzy, taki jak nuc-1 (e1392). Procedura ta jest jedną z najbardziej interesujących ze względu na brak zależności od wydajności transformacji, jaka występuje w przypadku innych technik i, ogólnie, pozwala na szybsze i mniej pracochłonne wykonanie eksperymentu.
2) Przypuszczalne wzmocnienie metody
- wektor projektowany jest tak, by zawierał cDNA sup-35 lub część tego cDNA, wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7. Pozostała część wektora jest taka jak opisano w przykładzie A) i B). Taki wektor może być wprowadzony do mutanta pha-1ts C. elegans. W tym przypadku stosuje się system selekcji oparty na temperaturze, wskazujący robaki, które posiadają zdolność przeżycia w restrykcyjnej temperaturze dzięki uprzedniemu pobraniu DNA i ekspresji dwuniciowego RNA sup-35. Możliwe jest otrzymanie hierarchicznej uporządkowanej biblioteki poprzez zastosowanie jakiejkolwiek metody opisanej powyżej.
- do konstrukcji biblioteki wprowadzonej do ekspresjonującej polimerazę RNA T7 E. coli może być zastosowany wektor. W tym przypadku możliwy jest analogiczny skrining, jak w części A), wraz z dodatkowym skriningiem robaków, u których aktywny jest dwuniciowy RNA sup-35.
- DNA i/lub dwuniciowy RNA sup-35 mogą być dostarczone za pomocą odrębnych plazmidów. W przypadku karmienia, zarówno DNA dostarczanym z karmą (przykład C), jak i dwuniciowym RNA dostarczanym z karmą przykład A) i B), możliwe jest dostarczenie dwóch plazmidów, obecnych w jednej bakterii lub dostarczenie z karmą mieszaniny bakterii, z których jedna zawiera konstrukt sup-35.
Przykład konstrukcji C. elegans produkującego RNA T7
W celu uzyskania produkcji polimerazy RNA T7 w organizmie robaka, dostępnych jest kilka możliwości. Polimeraza T7 może być ekspresjonowana pod kontrolą różnych promotorów, promotorów ulegających indukcji, promotorów konstytutywnych, ogólnych i tkankowo- (komórkowo) specyficznych lub promotorów będących kombinacją wyżej wymienionych.
Przykładami takich promotorów są promotor szoku cieplnego hsp-16, promotor jelitowy gęsi, promotor pochodzący z cet858, jak również promotor z dpy7 oraz element promotorowy GATA1. W powyż szym przykł adzie polimeraza RNA T7 ekspresjonowana jest pod kontrolą promotora hsp16, dostępnego w wektorze pPD49.78. Polimeraza RNA T7 izolowana jest jako produkt PGR z użyciem starterów GN3 oraz GN4.
Otrzymany w wyniku reakcji PGR produkt trawiony jest za pomocą enzymów Nhel oraz Ncol, jak wektor, który ma być użyty do klonowania, wektor Fire pPD49.78. Otrzymany wektor jest wektorem pGNIOO, przedstawionym na figurze 2 i obejmuje oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC, oGN4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG.
Wektor wprowadzany jest do organizmu robaka za pomocą standardowych technik, na przykład mikroiniekcji.
PL 201 425 B1
W kolejnym etapie konstruowane są nastę pujące szczepy:
- Dziki typ (pGN100)
- nuc-1 (e1392) (pGN100)
- pha-1 (e2123) (pGN100)
- pha-1; nuc-1 (pGN100)
Wszystkie wymienione szczepy są zdolne do produkcji polimerazy RNA T7 pod wpływem indukcji temperaturowej lub, alternatywnie, w wyniku indukcji uzyskanej dzięki obecności metali, takich jak zastosowanie metali ciężkich, jak kadm lub rtęć. Procedura indukcji za pomocą temperatury polega na podwyższeniu temperatury dla zwierzęcia do 30-33°C przez przynajmniej godzinę, a następnie powrót do standardowej temperatury (15-25°C).
W celu uzyskania produkcji jakiegokolwiek RNA w organizmie robaka moż e być zastosowany dziki typ szczepu produkującego polimerazę RNA T7. Bardziej specyficznie, do organizmów robaków mogą być wprowadzone plazmidy pochodzące z opisanych bibliotek, a następnie może być przeprowadzana ocena fenotypowa.
Mutant nuc-1 robaka może być wykorzystany w eksperymencie wprowadzenia DNA przez bakterie, poprzez dostarczanie bakterii z pokarmem. Ze względu na to, że mutant nuc-1 nie posiada zdolności trawienia DNA, plazmidowy DNA może przejść poprzez ściany jelita. Jeżeli jest on pobrany przez komórki produkujące polimerazę RNA T7, możliwa jest produkcja dwuniciowego RNA i przez to inhibicja genu, z którego ten RNA uległ transkrypcji.
Szczep mutanta pha-1, produkujący polimerazę RNA T7 może być zastosowany do wzmocnienia procedury, jak opisano powyżej. DNA może być wprowadzony w wyniku wstrzeliwania, mikroiniekcji lub karmienia. Bardziej specyficznie, szczep ten może być wykorzystany dla wektorów produkujących dwuniciowy RNA pochodzący z sup-35 i z będącego przedmiotem zainteresowania genu, którym może być produkt PGR, cDNA lub biblioteka, zgodnie z tym, jak opisano powyżej.
Mutant pha-1; nuc-1 produkujący polimerazę RNA T7 może być wykorzystany w eksperymencie opartym na bakteryjnym dostarczeniu DNA. DNA dogodnie jest plazmidem, produkującym dwuniciowy RNA pochodzący z zarówno sup-35, jak i genu będącego przedmiotem zainteresowania. Mutant ten będzie preferencyjnie produkował polimerazę RNA T7 w jelicie. Dostarczenie będzie preferencyjnie zachodziło dzięki wzrostowi robaka w obecności bakterii posiadających plazmid.
Zastosowanie technologii RNAi u roślin
Nicienie powodują znaczną część szkód występujących u roślin, w szczególności dotyczy to roślin uprawnych. Zgodnie z wynalazkiem, procedury RNAi mogą być zastosowane w przypadku roślin w celu uniemożliwienia dłuż szego żerowania pasożytniczych nicieni. W pierwszym etapie, izolowany jest z pasożytującego na roślinie nicienia krytyczny dla przeżycia lub wzrostu, bądź też dla odżywiania lub proliferacji fragment DNA. Odpowiedni do tego celu jest jakikolwiek gen, którego ekspresja jest ważna do przeżycia.
Następnie poddaje się klonowaniu część, egzon lub cDNA tego genu. Taki fragment DNA może być wklonowany pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora, korzystnie, promotora specyficznego dla korzenia, a nawet korzystniej, pomiędzy dwoma, specyficznymi dla korzenia promotorami. DNA wklonowanego genu pod kontrolą promotora specyficznego dla korzenia wprowadza się do docelowej rośliny za pomocą technologii transgenicznych roślin. Możliwe jest uzyskanie dla każdego pasożytniczego nicienia odmiennych fragmentów DNA i podobnie dla każdej odmiany roślinnej istnieje potrzeba zastosowania różnego promotora.
W ten sposób, w przypadku wykorzystania specyficznego dla korzenia promotora, korzeń produkuje RNA lub dwuniciowy RNA pochodzący z wprowadzonego fragmentu DNA. Ze względu na to, że nicienie odżywiają się na roślinach, RNA i/lub dwuniciowy RNA jest spożywany lub przyjmowany przez nicienie. Umożliwia to dostarczenie RNA i/lub dwuniciowego RNA do komórek nicieni, a następnie jego inhibujące działanie względem docelowego DNA.
W zależnoś ci od charakteru wklonowanego fragmentu DNA, nicienie są niezdolne do przeżycia, odżywiania się, proliferacji, itd., w każdym przypadku uniemożliwia to dalsze żerowanie zwierzęcia na roślinie i przez to zapewnia tej roślinie ochronę.
Konstrukcja C. elegans produkującego polimerazę RNA T7
Istnieje kilka możliwości uzyskania produkcji polimerazy RNA T7 lub innych polimeraz RNA u zwierzą t, a szczególnie u nicieni, zwł aszcza w przypadku C . elegans. Polimeraza RNA T7 moż e ulegać ekspresji pod kontrolą różnych promotorów.
PL 201 425 B1
Promotory te mogą mieć charakter indukowany lub konstytutywny, ogólny, bądź tkankowospecyficzny, lub też być kombinacją wyżej wymienionych promotorów.
P r z y k ł a d 1. Konstrukcja podstawowego wektora służącego do ekspresji polimerazy T7 u C . elegans
Dzięki zastosowaniu PCR dokonano, zgodnie z standardowymi procedurami, amplifikacji sekwencji kodującej polimerazę T7 z λ CE6 (Novagen, Medison, USA), przy czym w reakcji tej wykorzystano następujące startery:
oGN2 6 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) oraz oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) (PCR, A practical approach, 1993, Ed. J. McPherson i wsp., IRL Press).
Otrzymany fragment DNA, kodujący polimerazę RNA T7 trawiono enzymami Agel oraz Eco RI, a następnie wstawiano do wektora Fire pPD97.82, trawionego Agel i Eco RI.
Tak otrzymany konstrukt kodował otwartą ramkę odczytu dla polimerazy RNA T7, w połączeniu z białkiem sygnałowym lokalizacji jądrowej dużego antygenu T SV40 (NLS) o sekwencji aminokwasowej MTAPKKKRKVPV. Taka sekwencja sygnałowa lokalizacji jądrowej konieczna jest do translokacji polimerazy RNA T7 z cytoplazmy do jądra, gdzie możliwe jest wiązanie ze specyficznymi dla niej promotorami, określonymi jako promotory T7. Powyżej sekwencji kodującej białko fuzyjne polimerazy T7 znajduje się minimalny promotor (myo-2), poprzedzony przez miejsce wielokrotnego klonowania (MSC), w którym możliwe jest wstawienie kilku promotorów C. elegans.
Plazmid ten (pGN105, przedstawiony na figurze 11) jest podstawowym plazmidem polimerazy RNA T7 umożliwiającym ekspresję polimerazy T7 u C. elegans. Pochodne tego plazmidu zawierają wklonowane w miejscu wielokrotnego klonowania promotory, zapewniające indukowaną, konstytutywną, ogólną lub też tkankowo-specyficzną ekspresję polimerazy RNA T7 u C. elegans, ponieważ ekspresja ta podlega kontroli i regulacji, zależnie od wklonowanego, w miejscu wielokrotnego klonowania promotora.
Znana jest indukcja ekspresji wymienionych promotorów w następujących tkankach: let-858 (ogólna ekspresja), myo-2 (ekspresja w gardzieli), myo-3 (mięśnie ciała), eg1-15 (mięśnie sromowe), unc-119 (pan-neurony), ale te promotory nie stanowią ograniczenia.
P r z y k ł a d 2. Konstrukcja wektora do ekspresji polimerazy RNA T7 w tkance mięśniowej
C. elegans
Dzięki zastosowaniu PCR dokonano amplifikacji sekwencji kodującej polimerazę T7 z λ CE6 (Novagen, Medison, USA), przy czym w reakcji tej, wykorzystano następujące startery:
OGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) oraz oGN44 (CACTAGTGGGCCCTTAC--GCGAACGCGAAGTCCG).
Następnie trawiono za pomocą enzymów Agel/Spel i wstawiano do wektora pGK13, trawionego Agel/Spel.(Wektor ten zawierał silny promotor SERCA, kierujący ekspresją w gardzieli, mięśniach sromowych, mięśniach ogona i ciała).
Sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) dużego antygenu T SV40 wstawiono z przodu sekwencji kodującej polimerazę T7 poprzez wstawienie w miejscach restrykcyjnych SacI/Agel dwóch, zachodzących oligonukleotydów:
oGN45 (CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) oraz oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC).
Otrzymany konstrukt, przedstawiony na figurze 10, nazwano pGN108. Wprowadzenie tego plazmidu do C. elegans wywoływało ekspresję polimerazy RNA T7 w mięśniach gardła i sromu oraz mięśniach ogona i ciała.
W celu sprawdzenia ekspresji i działania polimerazy RNA T7, pod kontrolą i regulacją promotora SERCA u C. elegans, wstrzykiwano do jego organizmu pGN108, kodujący polimerazę RNA T7, pod kontrolą promotora SERCA. Jednocześnie wstrzykiwano testowy wektor, kodujący GFP, pod kontrolą promotora T7 (pGN401 na figurze 13). Plazmid pGN401 skonstruowano poprzez wstawienie w miejscu SacI/Agel otwartego wektora FIRE pPD97.82 dwóch zachodzących oligonukleotydów:
OGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) oraz oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGG-AGCT), tworząc promotor T7.
Ponadto, wraz z plazmidami wstrzyknięto marker selekcyjny, pozwalający na określenie stopnia transformacji (ro16, pRF4). Specjalistom w dziedzinie dobrze znany jest ten ostatni wektor selekcyjny pRF4. Transgeniczne F1 mogą być łatwo uzyskane ze względu na pojawiający się fenotyp ro16. Tak uzyskane transgeniczne C. elegans, wszystkie ekspresjonują GFP w gardzieli, mięśniach sromowych,
PL 201 425 B1 mięśniach ogona i ciała. Zatem dane te jasno wskazują na to, że polimeraza RNA T7 jest funkcjonalnie ekspresjonowana pod kontrolą promotora SERCA. Tak ekspresjonowana polimeraza RNA T7 wiąże się z promotorem T7, obecnym w pGN401 i inicjuje transkrypcję genu GFP, który jest następnie funkcjonalnie ekspresjonowany, co wywołuje pojawienie się fluorescencji w tkankach mięśni, w których promotor SERCA indukuje ekspresję polimerazy RNA T7.
P r z y k ł a d 3. Konstrukcja wektora niespecyficznej ekspresji polimerazy T7 u C. elegans
Z pGN108 izolowano gen fuzyjny NLS-polimerazy RNA T7 za pomocą XmaI/Bspl201 i klonowano do wektora Fire pPD103.05, trawionego XmaI/Bspl20I. W rezultacie otrzymano wektor, w którym polimeraza RNA T7 znajduje się pod kontrolą promotora Iet858. Ten specyficzny promotor umożliwia ekspresję polimerazy RNA T7 we wszystkich tkankach. Tak otrzymany plazmid nazwano pGN110 (figura 14).
P r z y k ł a d 4. Konstrukcja wektora do ekspresji fragmentów DNA, genów i cDNA, zależnej od polimerazy RNA T7 pod kontrolą promotora T7
Wektor Fire pPD97.82 trawiono za pomocą SacI/Agel i poprzez wstawienie w miejscach restrykcyjnych SacI/Agel dwóch zachodzących oligonukleotydów:
oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) oraz oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) generowano sekwencję promotora T7. Konstrukt ten (pGN400, figura 12) zawierał otwartą ramkę odczytu GFP, wklonowaną pomiędzy miejscami restrykcyjnymi endonukleaz SacI i EcoRI pod kontrolą promotora T7.
Do takiego wektora, w wyniku dokonania delecji genu GFP w postaci fragmentu Agel/SacI i wklonowaniu do wektora interesują cego fragmentu DNA, moż e być wklonowany jakikolwiek gen, cDNA lub fragment DNA. Dogodnie, interesujący fragment DNA można uzyskać za pomocą reakcji amplifikacji PGR, poprzez wstawienie miejsca SacI/Afel w startery. Tak otrzymany po amplifikacji PCR fragment DNA jest trawiony i gen GFP w pGN400 zastępowany amplifikowanym fragmentem DNA.
W celu uzyskania indukowanej ekspresji polimerazy RNA W T7 u C . elegans możliwe jest użycie jakiegokolwiek wektora zawierającego promotor T7, takiego jak handlowo dostępne wektory pGEM i pBluescript. Wykazano to jasno na przykł adzie wektora pGN401, ekspresjonują cego GFP pod kontrolą promotora T7 u transgenicznych C. elegans, ekspresjonujących polimerazę RNA T7.
Zastosowanie pGN400 ma zaletę związaną z tym, że wektor ten zawiera fragment 3'UTR, pochodzący z unc-54, powodujący wzmocnienie transkrypcji lub stabilności RNA.
Wytwarzanie trwałych, tkankowo-specyficznych „pseudo inaktywacji” RNAi linii C. elegans
Inaktywacja genu u C. elegans uzyskiwana jest obecnie w wyniku losowych, przeprowadzanych na dużą skalę mutagenez i opartej na PCR sib-selekcji. Metoda ta jest niewygodna, czasochłonna oraz mało interesująca. Wykazano, że wprowadzenie dwuniciowego RNA do komórki wywołuje silne i specyficzne oddziaływanie na ekspresję endogennych genów. W przypadku C. elegans moż na uzyskać zahamowanie ekspresji genu poprzez wstrzyknięcie RNA do jamy ciała robaka, moczenie robaka w roztworze zawierają cym dwuniciowy RNA lub karmienie bakteriami E . coli, ekspresjonują cymi odpowiadający badanemu genowi, dwuniciowy RNA.
Komórki C. elegans posiadają zdolność pobierania dwuniciowego RNA z ich zewnątrzkomórkowego środowiska. Stwierdzono, że mRNA jest celem genetycznych oddziaływań, w których pośredniczy taki dwuniciowy RNA (Montgomery i Fire, 1998). Sugerowano również, że degradacja docelowego RNA ma miejsce w jądrze, przed możliwą translacją. Mimo że mediowana poprzez RNAi redukcja ekspresji genu może zostać przekazana następnym pokoleniom, dziedziczność jest słaba i efekt ten jest szybko tracony u kolejnego potomstwa.
Zjawisko to wywołane jest prawdopodobnie w wyniku stałego obniżania ilości dwuniciowego RNA. W niniejszym eksperymencie zaproponowano metodę stworzenia linii C. elegans o stałym, dziedzicznym fenotypie RNAi. Metoda ta obejmuje wytwarzanie transgenicznych linii C. elegans poprzez wprowadzenie plazmidów zawierających fragmenty cDNA docelowego genu w sensownej i antysensownej orientacji, pod kontrolą promotora pochodzącego z tych robaków lub też poprzez transkrypcję cDNA o odwrotnie powtórzonej sekwencji z pojedynczego konstruktu. Alternatywnie, możliwe jest uzyskanie transkrypcji dwuniciowego RNA z wektora zawierającego cDNA, flankowanego przez dwa promotory T7 w ekspresjonującym polimerazę T7 szczepie C. elegans.
W wyniku tego otrzymuje się transgeniczny organizm o dziedzicznie stabilnym „pseudo inaktywowanym” fenotypie. Ekspresja cDNA lub polimerazy T7 może mieć charakter ogólny i konstytutywny, ale też może podlegać regulacji pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora. W przeciwieństwie do RNAi indukowanego poprzez pochodzący z zewnątrz dwuniciowy RNAi (wstrzykiwany, wchłaniany
PL 201 425 B1 poprzez moczenie lub podawany jako pożywienie), metoda ta umożliwia uzyskanie warunkowej, tkankowo-specyficznej inhibicji ekspresji genu.
Inhibicja ekspresji unc-22 poprzez zakłócenia RNA wywołujące pojawienie się „kurczącego się” fenotypu cDNA unc-22 (egzon 22) wklonowano w sensownej i antysensownej orientacji w pPD103.05. (A. Fire nr L2865), zawierającym zdolny do ekspresji sekwencji RNA we wszystkich tkankach, promotor let 858. Otrzymane plazmidy nazwano pGN205 (figura 19a) oraz pGN207 (figura 19b). Konstrukty te wprowadzono do C. elegans wraz z markerem selekcyjnym (rol-6; GFP). Transgeniczne osobniki F1 (ekspresjonujące rol-6 lub GFP) wykazywały „kurczący się” fenotyp, wskazując, że RNAi mogłaby być zależna od endogennej transkrypcji RNA z transgenicznego DNA. Fenotyp RNAi przenoszony był wraz z markerem selekcyjnym do kolejnego potomstwa. W ten sposób otrzymano linie C. elegans o stał ym fenotypie RNAi.
Produkcja stabilnych linii polimerazy RNA T7 oraz podwójnie transgenicznych robaków
System ekspresji u C. elegans oparty na egzogennej polimerazie RNA wymaga obecności dwóch plazmidów. Jeden z plazmidów powinien kodować polimerazę RNA pod kontrolą specyficznego promotora, podczas gdy drugi, mający ulec ekspresji fragment DNA, pod kontrolą promotora T7. W przypadku częściowo stabilnego RNAi zaprojektowano również pseudo-stabilne inaktywacje genu i DNA bę dą cy przedmiotem zainteresowania klonowano pomiędzy dwoma promotorami T7, wywo ł ują c tym produkcję dwuniciowego RNA.
Ze względu na to, że system ekspresji polimerazy RNA T7 jest systemem wysokiej ekspresji wywołuje to problemy związane z otrzymaniem podwójnie transgenicznych zwierząt. Jeżeli mający ulec ekspresji w nicieniu C. elegans gen jest toksyczny, powoduje to efekt letalny i w skutek tego w konstrukcie C. elegans brak silnie regulowanej, stabilnej ekspresji interesującego genu. Jeżeli będący przedmiotem zainteresowania gen jest istotny dla przeżycia organizmu, RNAi wraz z fragmentem DNA z tego genu wywołuje również letalny efekt, tak wię c nie są moż liwe pseudo-stabilne inaktywacje genu.
W celu ominięcia tego problemu opracowano zgodnie z wynalazkiem system obejmujący dwa transgeniczne zwierzęta.
Pierwsze jest transgeniczne ze względu na polimerazę RNA T7, która może ulegać ekspresji we wszystkich komórkach lub specyficznych komórkach, bądź też w tkankach, jak wykazano w poprzednich przykładach.
Drugie zwierzę jest transgeniczne ze względu na będący przedmiotem zainteresowania fragment DNA. Gen ten lub cDNA związany jest z promotorem T7 lub, w celu uzyskania RNAi, fragment DMA takiego genu wklonowany jest pomiędzy dwa promotory T7.
Oba transgeniczne zwierzęta są żywotne i nie wykazują jakiejkolwiek nieprawidłowości fenotypowej. Uzyskano ten efekt dzięki temu, że w przypadku pierwszego transgenicznego organizmu, ekspresjonowana polimeraza RNA T7 nie jest toksyczna, nawet jeśli poziom ekspresji jest wysoki. W przypadku drugiego transgenicznego organizmu, interesujący gen nie ulega ekspresji lub też nie jest produkowany dwuniciowy RNA, ze względu na to, że zwierzęta te nie posiadają polimerazy RNA T7.
Ekspresję genu lub interesującego cDNA, czy też RNAi z fragmentem DNA można obecnie uzyskać poprzez skrzyżowanie dwóch transgenicznych zwierząt. Tak uzyskane potomstwo jest podwójnie transgeniczne i ekspresjonuje interesujący gen lub też ekspresjonuje dwuniciowy RNA interesującego fragmentu DNA.
W celu uzyskania odpowiedniej liczby osobników męskich w wyniku takiej krzyżówki, jeden z takich transgenicznych osobników może być mutantem C. elegans o fenotypie sprzyjającym powstawaniu potomstwa męskiego. Przykładem takiego mutanta jest him-5. Preferencyjnie taki mutant umożliwi otrzymanie transgenicznych pod względem polimerazy RNA T7 C. elegans, gdzie hermafrodyty zawierają fragment DNA pod kontrolą promotora T7.
W celu dokonania skutecznej selekcji podwójnie transgenicznego potomstwa moż liwe jest wprowadzenie transgenu do drugiego transgenicznego zwierzęcia. Taki transgen powinien zawierać gen reporterowy pod kontrolą promotora T7. Genem reporterowym może być GFP, lucyferaza, beta-galaktozydaza lub beta-laktamaza.
Przykładem takiego transgenu są wektory pGN400 oraz pGN401.
W celu uzyskania indukowanej, tkankowo-specyficznej ekspresji transgenu C. elegans wykorzystuje się stado osobników męskich (np. him-5) posiadających konstrukt polimerazy T7 pod kontrolą różnych promotorów C. elegans, umożliwiających tkankowo-specyficzną ekspresję. Osobniki takie krzyżuje się z hermafrodytami, przenoszącymi interesujący gen pod kontrolą promotora T7.
PL 201 425 B1
Ponadto, wprowadzane geny mogą ulec integracji z genomem zwierzęcia. Metody pozwalające na trwałą integrację plazmidu z genomem zwierzęcia zostały opisane (Methods in Cell Biology, Vol. 48,
1995, ed. Epstein i Shakes, Academic Press) i obejmują napromieniowanie zwierzęcia. Metody te mogą być zastosowane względem obu zwierząt, lecz zalecane jest poddać takim działaniom zwierzęta ekspresjonujące polimerazę T7.
Pozwala to otrzymać kolekcję nicieni C. elegans trwale ekspresjonujących polimerazę RNA T7 pod kontrolą różnych promotorów. Przykładami takich promotorów są myo-2 (ekspresja w gardzieli), myo-3 (mięśnie ciała), eg1-15 (mięśnie sromowe), unc-119 (pan-neurony), SERCA (mięśnie), Iet858 (wszystkie komórki), ges-1 (jelito).
Konstrukcja drożdżowych wektorów dwuhybrydowych RNAi z promotorem T7 pGAD424 posiadający zgodny i odwrotny T7/T3 oraz/lub Sp6
Większość eksperymentów związanych z systemem podwójno hybrydowym opiera się na wklonowaniu biblioteki cDNA do plazmidu pGAD424 (figura 16), zaprojektowanego tak, by zawierał dodatkowe miejsca restrykcyjne w obrębie sekwencji polilinkerowej, takiej jak miejsce Ncol (Clontech). Biblioteka ta umożliwia skrining białek wiążących w eksperymentach wykorzystujących podwójne drożdżowe hybrydy.
Skonstruowano nowy drożdżowy, dwuhybrydowy wektor o takich samych możliwościach drożdżowego systemu dwuhybrydowego, ale zawierający dodatkowo dwa promotory T7, pozwalające na wykorzystanie polimerazy RNA T7 do indukowanych, pseudo stabilnych inaktywacji genów.
W tym celu wstawiono zgodny T7, stosując sekwencję łącznikową T7 (składającą się z następujących starterów: aattcttaatacgactcactatagggcc oraz catgggccctatagtgagtcgtattaag), w miejscu EcoRI-NcoI wektora pGAD424.
Otrzymany w ten sposób wektor oznaczono jako pGAD424-without-FULL-ICE-both-T7. Zwrócono uwagę na wyeliminowanie kodonów „stop” oraz zastosowanie sekwencji polilinkerowej o maksymalnie zgodnych aminokwasach.
Taką samą strategię obrano w przypadku odwrotnego T7 (składającego się z obu starterów:
gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca oraz gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg), za pomocą
BamHl oraz Pstl. W celu uniknięcia utraty miejsca SalI włączono to miejsce w sekwencję startera.
Miejsce SalI jest istotne ze względu na to, że większość bibliotek klonowanych jest w tym miejscu, a sekwencje adaptacyjne są dostępne. Czyni to nowo skonstruowany wektor zgodnym z istniejącymi wektorami.
pAS2 zawierający zgodny i odwrotny T7/T3 i/lub Sp6
W oparciu o pAS2 (Clontech) skonstruowano analogiczny drożdżowy, dwuhybrydowy wektor. Częściowe trawienie za pomocą EcoRV spowodowało usunięcie znacznej części genu cyh2. Prawidłowy konstrukt można wyizolować i sprawdzić poprzez trawienie restrykcyjne Bglll. To miejsce restrykcyjne występuje we fragmencie EcoRV PAS2, do eliminacji. Wyklucza to słabo toksyczny gen cyh2, uczestniczący w procesie opóźniania wzrostu.
Gen ten nie jest istotny do przeprowadzania RNAi oraz eksperymentów związanych z drożdżowymi podwójnymi hybrydami. Po usunięciu fragmentu EcoRV, miejsce restrykcyjne EcoRI, zlokalizowane pomiędzy sekwencjami DNA kodującymi GAL4DB oraz HA (epitop), pozostaje jedynym w plazmidzie i może być wykorzystane do podstawienia HA promotorem T7, zawierającym sekwencję łącznikową. Zapewnia to utrzymanie wszystkich miejsc klonowania, pozwalając obu na klonowanie w ramce i zgodność z poprzednimi wektorami oraz pGAD424.
Zastosowano, wykorzystując miejsca klonowania EcoRI oraz Ndel, następującą sekwencję łącznikową (startery: aattcttaatacgactcactatagggca oraz tatgccctatagtgagtcgtattaag).
Taką samą strategię obrano w przypadku odwrotnego T7 (startery: gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatagtgagt cgtattaag oraz gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg), stosując BamHl oraz Pstl. W celu uniknięcia utraty SalI miejsce to zostało włączone do sekwencji startera. Tak otrzymany wektor nazwano pAS2-cyh2-HA+both T7-final.
Obecność promotora T7 (lub alternatywnie, T3, lub promotora SP6) w pGAD424 pozwala na szybkie przejście z oddziaływania białkiem do RNAi i przypisanie funkcji wyizolowanemu fragmentowi DNA. Dodatkową zaletą jest możliwość uzyskania in vitro transkrypcji, połączonej z translacją in vitro (obecność w ramce ATG zarówno GAL4DB, jak i GAL4AD) znakowanego białka, które może być wykorzystane jako kontrola in vitro (np. testy grupujące podzbiory) oddziaływań typu białko-białko.
Sekwencje otrzymanych plazmidów oraz polimerazy T3 i SP6 określono w wykazie sekwencji, przedstawionym poniżej:
PL 201 425 B1
SP6 DNA-zależna polimeraza RNA: Sekw. Id. Nr 1 numer dostępu swissprot P06221 sekwencja białka:
mqdlhaiqlq leeemfnggi rrfeadqqrq iaagsesdta wnrrllseli apmaegiąay keeyegkkgr apralaflqc venevaayit rnkwiadmlnt datlqaiams vaeriedqvr
121 fskleghaak yfekvkkslk asrtksyrha hnvawaeks vaekdadfdr weawpketql
131 ąigttlleil egsvfyngep vfmramrtyg gktiyyląts esvgqwisaf kehvaqlspa
241 yapcvipprp wrtpfnggfh tekvasrirl vkgnrehvrk ltqkqmpkvy kainalqntq
301 wqinkdvlav ieeviridlg ygypsfkpli dkenkpanpv pvefqhlrgr elkemlspeą
361 wqqfinwkge carlytaetk rgsksaawr mvgqarkysa fesiyfvyam dsrsrvyvqs
421 stlspąsndl gkallrfteg rpvngvealk wfcinganlw gwdkktfdvr vsnvldeefq
431 dmcrdiaadp ltftqwakad apyeflawcf eyaqyldlvd egradefrth lpvhqdgscs
541 giąhysamlr devgakavnl kpsdapqdiy gavaqvvikk nalymdadda ttftsgsvtl
601 sgtelramas awdsigitrs ltkkpvmtlp ygstrltcre svidyivdle ekeaqkavae
661 grtankvhpf eddrądyltp gaaynymtal iwpsisewk apivamkmir ąlarfaakrn
721 eglmytlptg fileąkimat emlrvrtclm gdikmslqve tdivdeaanun gaaapnfvhg
781 hdashliltv celvdkgvts iavihdsfgt hadntitlrv alkgqmvamy idgnaląkll
841 eehevrwmvd tgievpeqge fdlneimdse yvfa
T3 DNA-zależna polimeraza RNA: Sekw. Id. Nr 2 numer dostępu swissprot P07659 sekwencja białka:
mniieniekn dfseielaai pfntladhyg salakeąlal ehesyelger rflkmlerąa kageiadnaa akpllatllp klttrivewl eeyaskkgrk psayaplqll kpeasafitl
121 kvilasltst nmttiąaaag mlgkaiedea rfgrirdlea khfkkhveeq lnkrhgqvyk
131 kafmąwead migrgllgge awsswdkett mhvgirliem liestglvel ąrhnagnags
241 dhealqlaqe yvdvlakrag alagispmfą pcvvppkpwv aitgggywan grrplalvrt
301 hskkglmrye dvympevyka vnlaqntawk inkkvlawn eivnwkncpv adipslerąe
361 lppkpddidt neaalkewkk aaagiyrldk arvsrrisle frnleąankfa skkaiwfpyn
421 mdwrgrvyav prafnpągndm tkglltlakg kpigeegfyw Ikihgancag vdkvpfperi
481 afiekhvddi lacakdpinn twwaeądspf cflafcfeya gvthhglsyn cslplafdgs
541 csgiąhfsam lrdevggrav nllpsetvqd iygivaqkvn eilkqdaing tpnemitvtd
601 kdtgeisekl klgtstlaqq wlaygvtrsv tkrsvmtlay gskefgfrqq vlddtiqpai
661 dsgkglmftą pnąaagymak liwdavsvtv vaaveamnwl ksaakllaae vkdkktkeil
721 rhrcavhwtt pdgfpvwqey rkplqkrldm iflgqfrlqp tintlkdsgi dahkąesgia
781 pnfvhsqdgs hlrmtwyah ekygiesfal ihdsfgtipa dagklfkavr etmvityenn
841 dvladfysqf adqlhetqld kmpplpkkgn Inlgdilksd fafa
PL 201 425 B1
Sekw. Id. Nr 3 pGN108:
gitgtcguaagagatgttmattnacitucaccgggtccictcictcigccagcacagctcagtgttggctgtgtgcicgggctcctgccaccggcgg cctcatcrtcttcttcttcttctcrcctgctctegęnatcacttcttcaKcanciuticctfficatcatcaaactagcamcttacntatitaOTtttcaaKttea anRcagataaaaccaaactacngggRacagccgtcaacagatccccggganggccaaaggacccaaaggtatgtRcgaatgatactaacataa catagaacattttcaggaggacccngcnggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagctcatgaacacgattaacatcgetaagaa cgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccanacggtgagcgmagctcgcgaacagttggcccttgagcatgag tcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaactuaagctggtgaggttgcggataacgcTgccgccaagcactcatcaci accctactccdaagaigaRgcacgcaicaacgactggrttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccRccagRcctgcaag aaatcaagccggaagccgugcgtacatcaccattaagaccactcTggcngcciaaccagtgctgacaaiacaaccgncaggctgtagcaagcgc aatcggicgggccattgaggacgaggctcgeRcggtcgtatccgtgaccRgaagctaageacRcaagaaaaacgRgaggaacaactcaacaag cgcgtagggcacgtctacaagaaagcacnatgcaagagtcgaggctgacatgcictctaagggtctactcggtggcgaggcgiggtcttcgtggca taaggaagactctattcatgiaggaglacgctgcatcgagaigctcaRgagtcaaccggaatggRagctucaccgccaaaatgctggcgtagtagg tcaagac!ctgagactatcgaactcgcacctgaaacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatc:ctccgatgnccaacctlg cgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggcaacggtcgttguctctggcgctggtgcgucrcacaguagaaagc actgaigcgctacgaagacgRtacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacaRgcgcaaaacaccgcatggaaaaicaacaagaaagTcctagcg gtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggscgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgac aigaatcctgaggctctcaccgcgtggaaaegigctgccgctgctgtgtaccgcaagacaaggctcgcaagicicgccgtaicagccngagttcatg cttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggRCCctiacaacatggaciggcgcggitcgrgtnacgctgtglcaatgttcaacccgc aaggtaacgatatgaccaaaggacgtctiacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactaetggctgaaaatccacggtgcaaactg tgcgggtgtcgataaggtttcgtncctgagcgcateaagttcaRgaggaaaaccacgagaacatcatggcRgcgctaagtctccaciggagaacac
RggtgggctgagcaagattciccgRctgcnecRgcgttctgcRtgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccRccgc tggcgRtgacgggtcRgctetggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgegcggnaacRgcttcctagtgaaaccgt tcaggacatctacgggangRgctaagaaagicaacgagattcigcaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagRigRaccgtgaccgaŁ gagaacactggtgaaatcictgagaaagKaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggciggctiacggtgRactcgcagtgtgactaagc gRcagtcatgacgctggcRacgggrecaaagagttcggcnccgtcaacaagtgciggaagataccatKagccagctangattccggcaagggtc tgatgRcactcagccgaatcaggctgctggasacaiggcttagctgatRgggaatccgtgagcgtgacggtggtagctgęggRgaagcaatgaac tggcRaagtctgctgciaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcncgcaagcgRgcgcigtgcangggtaactcer gatggRtccctgtgtggcaggaatacaagaagcctaRcagacgcgcRgaacctgatgttcctcggtcagRccgcRacagcctaccaRaacacca acaaagatagcgagangatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactrtgtacaeagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtg tgggcacacgagaagtacggaatcgaatcKRgcactgaRcacgactccRcggtaceaRccggctgacgctgcgaacctgncaaagcagtgcgc gaaactatggRgacacautgagicngtgatgtactggcigaRtctacgaccagRcgctgaecagRgcacgagtetcaaRggacaaaatgccagc acRccggctaaaggtaacRgaacctccgtgacaicttagagtcggactregcgttcgegtaagggcccactagtcggccgtacgggcccRKgtct cgcgcgRtcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggteacagCRgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagc ccgtcagggcgcgtcagcgggtgnggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcaicagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgt gaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccRaagggccicgtgatacgcctaRtttataggnaaigtcatgataataat ggmcttagacgtcaggtggcacnncggggaaatgtgcgcggaaccecatttgtttaKtttctaaatacattcaaatatgatccgcicatgagaeaat aaccctgataaatgcRcaataaiaRgaaaaaggaagagtatgagtaRcaacatttccgtgtcgcccttattceetRtRgcggcanRgccncctgntt tgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagRgggtgcacgagtgggRacatcgaactggatctcaacagcggtaagatc cagagagitttcgcccegaagaacgRttccaaigatgagcacttR3aagRctgctatgtggcgcggtattatcecgtaRgacg«gggcaagagca actcggtcgccgcatacacttRcicagaatgacttggRgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggeatgacagtaagagaaaatg cagtgctgccataaccaigagtgataacactgcggccaacRacRctgacaacgalcggaggaccgaaggagctaaccgcRRRgcacaacatgg gggatcatgiaactcgccttgatcgRgggaaccggagctgaa!gaagccaaccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgagcaa!ggcaa caacgsgcgcaaactattaactggcgaactactUctGtagcttcccggcaacaattaatagacrggatggaggcggataaagRgcaggaccacRc tgcgctcggcccttecggciggctggtttattgetgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcangcagcactggggccagatggt aagccctcccgatcgtagtutcacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaaagacagatcgctgagaUggigcęicactgaRaa gcaRggtaactgtcagaccaagRtactcatatatactRagattgatttaaaacRcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagaiccRtttgataatctca tgaccaaaatocctuacgtgagRRcgRCcactgagcgtcagaccccgugaaaagatcaaaggatcttcRgagatccRtttRctgcgcgaatctg ctgcRgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtngccggatcaagagcaccaactcnmccgaagguacrggcRcagcagagc gcagataccaaatactgiccnctagtgugccgiagttaggccaccacRcaagaactctgtagcaccgcciacataccicgctctgctaatcctgRac cagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgaiagttaccggataaggcgcageggtcgggctgaacggggg gttcgtgcacacagcccagcnggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgigagcattgagaaagcgccacgcRcccgaaggg agaaaggcggacaggtaiccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcnccagggggaaacgcctggtatcRtatagtc ctgtcgggRtcgccaccictgacngagcgicgattttigtgatgctcgtcaggggggcggagccaiggaaaaacgccagcaacgcggcctRRac ggRcctggccttttgctggccnttgctcacatgttctttcctgcgttaicccctgattctgiggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgcte gccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaaacgcaaaccgcciciccccgcgcgRggccg aRcaRaatgcagctggcacgacaggtRcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaartaatgtgagtiagctcactcaRaggcacccca ggctttacacittatgcttccggctegiatgRgigiggaangtgagcggataacaatRcacacaggaaacagctatgaccatgaRacgccaagctgt aagRtaaacatgatcRacaacuactanctcaEttaaaKncagagctiaaaaatggcigaaatcactcacaacgatggaiacgctaacaacRggaa atgaaataagcRgcatgcctgcagagcaaaaaaatac£gcnnccngcaaaaRcggtgctRcRcaaagagaaa«Rtgaagtcggcgcgagcat
PL 201 425 B1 ttccttctttgacttctctctttccgccaaaaagcctagcatttttattgataatttgattacacacactcagagttcttcgacatgataaagtgmcanggcac tcgccctaacagtacatgacaagggcggatiattatcgatcgauttgaagacaaactccaaatgtgtgctcatmggagccccgtgtggggcagctg ctctcaatatattactagggagacgaggagggggaccttatcgaacgtcgcatgagccattctttcttctttatgcactctcttcactctctcacacattaat cgattcatagactcccaiattccngatgaaggtgtgggttntagctmtttcccgatttguaaaggaagaggctgacgatgttaggaaaaagagaacg gagccgaaaaaacatccgtagmgtcttccttttaagccgacactttttagacagcaticgccgctagttttgaagtttaaattttaaaaaataaaaattag tttcaattttttttaattactaaataggcaaaagtttmcaagaactctagaaaaactagctuattcatgggtactagaaaaaftcttgmtaaatttaauttta tcnaagatgtaattacgagaagctntngaaaattctcaanaaaagaatngccgamagaataaaagtcncagaaaigagtaaaagctcaaattaga agtttgtttttaaaggaaaaacacgaaaaaagaacactatttatcttttcctccccgcgtaaaattagttgttgtgataatagtgatccgctgtctatttgcact cggctcttcacaccgtgcttcctcjcacttgacccaacaggaaaaaaaaacaicacgictgagacggtgaattgccttatcaagagcgtcgtctcntca cccagtaacaaaaaaaatttggmcmactttatatttatgtaggtcacaaaaaaaaagtgatgcagttttgtgggtcggttgtctccacaccacctccgc ctccagcagcacacaatcatcttcgtgtgttctcgacgattccttgtatgccgcggtcgtgaatgcaccacattcgacgcgcaactacacaccacactc acntcggtggtanactacacgtcatcgttgttcgtagtctcccgctctttcgiccccactcactcctcattattccccttggtgtattgatttttinaaatggta caccactcctgacgrttctacctTcngmtccgtccatttagattttatctggaaatmtttaaaattttaggccagagagttctagttcttgttctaaaagtcta ggtcagacatacarmctamctcatcaaaaaaaaagttgauaagaaaactggnancagaaagagtgrgtctcgttgaaattgattcaaaaaaaaatt cccaccccicgcttgmctcaaaatatgagatcaacggatttrrtccttctcgattcaatmrtgctgcgctctgtctgccaaagtgtgtgtgtccgagcaaa agatgagagaatnacaaacagaaatgaaaaaaagttggccaaataatgaagttttatccgagattgatgggaaagatattaatgttctttacggtttgga gggg3gag&pg3£agamtcgcatcaaac£ccgc€tmacatgtcttttagaa£c!33aatagatttttctc3tcatmtaatagaaaatcg3gaaatta cagtaatttcgcaattttcttgccaaaaatacacgaaatttgtgggtctcgccacgatctcggtcttagtggttcatttggtttaaaagrttataaaatttcaaa ttctagtgrtiaatttccgcataanggacctaaaatgggtttttgtcatcattttcaacaagaaatcgtgaaaatcctgttgtncgcaattttcttrtcaaaaata cacgaaatatatggtaatttcccgaaatattgagggtctcgccacgatttcagtcacagtggccaggatttatcacgaaaaaagncgcctagtctcacac ttccggaaaaccgaatctaaattagnnngtcatcattttgaacaaaaaatcgagacatccctatagtttcgcaattttcgtcgcttttctctccaaaaatga cagtcugaatuaaattcgctggaactgggaccatgatatcttttctccccgtmtcatmattttnattacactggattgactaaaggicaccaccaccg ccagtgtgtgccatatcacacacacacacacacacaatgtcgagattttatgtgtiatccctgcttgatttcgrtccgttgtctctctctctctattcatcttrtg agccgagaagctccagagaatggagcacacaggatcccggcgcgcgatgtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatca gggaagatcgtctgattTctcctc2gargcc3Ccrcatctctcgagtttctccgcctgttactccctgccgaacctgatatttccc
PL 201 425 B1 pGN105:
Sekw. Id. Nr 4 aagcttgcatgcctgcaggccnggtcgacTctagacacnncagctacctagatacatggataiccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggctcgcegaaaaatcaaagnatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggrtgacttctctccaccacttncatrttaaccctcggggtacg gganggccaaaggacccaaaggtatgrttcgaatgatactaacaiaacatagaacatrncaggagg3c:cttgcrtggagggtaccgagctcagaa aaaatgaętgctccaaagaagaagcgtaaggtaccggtaatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggętgctatccc gttcaacactctggctgaccattacggtgagcgmagcicgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcnccgcaa gatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggtlgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaa cgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatca ccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcg cttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcactrcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgttgggcacgtctacaagaaagcattta tgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcncgtggcataaggaagactctattcatgtaggagucgct gcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggnagcttacaccgccaaaatgciggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacct gaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgnccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcart actggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcct gaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaaicaccaagtggaagcat tgtccggtcgaggacatccctgcgangagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaa cgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacagggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgciaaccat aaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgccgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgctt acgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgnccctg agcgcatcaagncangaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttct gcrtccttgcgttctgctngagucgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccnccgciggcgmgacgggtcrtgctctggcatc cagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgagaccgncaggacatctacgggattgngctaag aaagtcaacgaganctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagnaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaa gicaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggctcacggtgttactcgcagtgtgactaagcgrtcagtcatgacgctggcnacgggtc caaagagttcggcttccgtcaacaagigctggaagataccattcagccagctangattccggcaagggtccgatgttcactcagccgaatcaggctg ctggatacatggctaagctgatngggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctgg ctgctgaggtcaaagataagaagactggagagaticncgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggmccctgtgtggcaggaataca agaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccanaacaccaacaaagatagcgagangaigcacaca aacaggagtctggtatcgctcctaacmgtacacagccaagacggtagccaccttcgiaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcga atcmtgcactgancacgactccncggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcn gtgatgtactggctgamctacgaccagttcgctgaccagngcacgagtctcaanggacaaaatgccageacnccggctaaaggtaacttgaacct ccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaagaattccaactgagcgccggtcgctaccattaccaacngtctggtgtcaaaaataataggg gccgctgTcatcagagtaagtttaaactgagnctactaactaacgagtaatattuaattttcagcatctcgcgcccgtgcctctgacnctaagtccaan actcttcaaęatccctacatgctcntctccctgtgctcccaccccctarttttgttanaccaaaaaaacncttctuatnctngnnttagcncmtaagtca cctctaacaatgaaangtgtagattcaaaaatagaattaancgtaataaaaagtcgaaaaaaattgtgctccctccccccattaataataattcutccca aaatctacacaatgttctgtgtacacncnatgttttttttacttctgataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaataccRatcaiatgtt acgmcagtnatgaccgcaatttttatrtcncgcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaaaagmtggagtarttttggaattttt caatcaagtgaaagtttatgaaanaatmcctgcttttgctttttgggggmcccctattgtngtcaagagtttcgaggacggcgmncngctaaaatca caagtangatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggmgggtttgaggctcagtggaaggtgagtagaagttgataatttgaaagtggagta gtgtctatggggmttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaacataactgtttcctactagtcggccgtacgggccctttcgtctcgcgcg tttcggtgatgacggtgaaaacctcigacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtca gggcgcgtcagcgggtgtlggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagangtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaata ccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccttaagggcctcgtgatacgcctatttttataggnaatgtcatgataataatggtttctt agacgtcaggtggcacttncggggaaaigtgcgcggaacccctatngtttatttnctaaatacancaaatatgtatccgctcatgagacaataaccct gataaatgcncaaiaatattgaaaaaggaagagtatgagtancaacatttccgtgtcgccctuncccrttrngcggcattttgccttcctgntttgctca cccagaaacgciggtgaaagtaaaagatgcrgaagatcagttgggtgcacgagtgggnacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgag agnncgccccgaagaacgtmccaatgatgagcacmtaaagttctgctatgtggcgcggtanatcccgtangacgccgggcaagagcaactcg gtcgccgcatacactattctcagaaigacrtggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtg ctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacnacrtctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcnnngcacaacatgggggat catgiaactcgccngatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacg ngcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagngcaggaccacttctgcgct cggcccitccggctggctggtnangctgataaatctggagccggtgagcgtgggtclcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccc tcccgtatcgtagrtatciacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactganaagcattg gtaactgtcagaccaagtttactcatatatactnagattgatttaaaacncantttaamaaaaggatctaggtgaagatcctragataatctcatgacca aaatcccnaacgtgagtrttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcrtg3gatccttttmctgcgcgtaatctgctgcn gcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtngTttgccggatcaagagctaccaactcrnnccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga taccaaatactgtccttctagtgtagccgtagrtaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgtuccagtg gctgctgccagtggcgataagtcgtetcnaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggrtcg
PL 201 425 B1 tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagataccUcagcgtgagcangagaaagcgccacgcttcccgaagggagaa aggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtc gggtttcgccacctctgacngagcgtcgatmrgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctnnacggttc ctggccttttgctggccnngctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggaiaaccgtattaccgcctngagtgagctgataccgctcgccg cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgnggccgattca naatgcagctggcacgacaggtncccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagnagcttactcattaggcaccccaggctt tacacmatgcttccggctcgtatgttgtgtggaangtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagtn aaacatgatcttactaactaactattctcatttaaattttcagagcnaaaaatggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaacttggaaatgaa at
PL 201 425 B1 pGN400:
Sekw. Id. Nr 5 aagcttgcatgcctgcaggccttggtcgactctagacacitttcagciacctagatacatggatatccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggctcgccgaaaaatcaaagnatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggttgacttctctccaccactmcattttaaccctcggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaalgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgcttggagggtaccgagctcccgg gattaatacgactcactataccggtagaaaaaatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcngttgaattagaiggtgatgrtaatg ggcacaaantictgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacaiacggaaaacttacccttaaatnatttgcactactggaaaactacctgttccatgg gtaagtttaaacatatatatactaactaaccctganamaaattttcagccaacacngtcactactttctgttatggtgttcaatgcttctcgagatacccag atcatatgaaacggcatgactwtcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacac gtaagtttaaacagttcggtaciaaciaaccatacatatttaaattttcaggtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaa aggtattgattttaaagaagatggaaacartcttggacacaaanggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaat gg3atcaaagngtaagtnaaacatgannactaactaactaatctgamaaanncagaacncaaaanagacacaacangaagatggaagcgnca actagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccanacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatc ccaacgaaaagagagaccacatggtccncngagntgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatagcattcgtagaattc caactgagcgccggtcgctaccattaccaacrtgtctggtgtcaaaaataataggggccgctgtcatcagagtaagtttaaactgagttctactaactaa cgagtaatatttaaattttcagcatctcgcgcccgtgcctctgacttctaagtccaattactcttcaacatccctacatgctctttctccctgtgctcccaccc cctattfttgttattaicaaaaaaacrtcrtcrtaatTtcntgttrtttagcttcttnaagtcacctctaacaatgaaattgrgtagattcaaaaatagaattaartcg taataaaaagtcgaaaaaaattgtgctccctccccccattaataataattctatcccaaaatctaeacaatgactgtgtacacttcttatgttttttttacttctg ataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaataccttatcatatgttacgtttcagtttatgaccgcaatttttatttcttcgcacgtctgggc cictcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaaaagmtggagtatttttggaatttttcaatcaagtgaaagtTtatgaaattaattttcctgcttttgctttttg ggggtttcccctattgtttgtcaagagttlcgaggacggcgtttttcttgctaaaatcacaagtattgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaagg tngggtttgaggctcagtggaaggtgagtagaagttgataatttgaaagtggagtagtgtctatggggtttttgccttaaatgacagaatacattcccaat ataccaaacataactgtttcctactagtcggccgtacgggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccg gagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggctta actatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcicagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggc crtaagggcctcgtgatacgcctatttitataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttrtcggggaaatgtgcgcggaac:
cctatttgtttatttttctaaatacancaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcticaataatangaaaaaggaagagtatgagtan caacatttccgtgtcgcccttaticccmtngcggcattttgccttcctgntttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagn gggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttrtcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcactntaaa gttctgctatgtggcgcggtatTatcccgTangacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggTtgagtactcac cagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaartatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctga caacgaccggaggaccgaaggagcraaccgcmtngcacaacatgggggatcatgtaactcgccngatcgttgggaaccggagctgaatgaagc cataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagęitcccggc aacaanaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttaKgctgataaatctggagccg gtgagcgigggtctcgcggtatcatigcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactat ggatgaacgaaatagacagatcgcigagataggtgcctcactgattaagcattggtaacrgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaa acttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttUgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagtntcgttccactgagcgtcagaccccg tagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccgg atcaagagctaccaactcrttttccgaaggtaaciggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagnaggccaccacn caagaactctgtagcaccgcctacataccrcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactca agacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggncgigcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactga gatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggag agcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttngtgatgctcgtc aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatccc ctganctgtggataaccgtattaccgccmgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaag cggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgaciggaaagcgggc' agtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcgg ataacaatrtcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagtttaaacatgatcttactaactaactattctcatttaaattttcagagctt aaaaatggctgaaatcactcacaacgaiggatacgctaacaacctggaaatgaaat
PL 201 425 B1 pGN40l Sekw. id. Nr 6 galcccggcgegcgatgtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatcagggaagarcgtctgatttctcatcggatgccacct catctctcgagractccgccTgnac:ccctgccgaaccJgatamcccgngtcgtaaagagatgrttttattttactttacaccgggtcctcrctc:cigcc agcacagctcagtgttggctgtgtgctcgggctcctgccaccggcggccrcaicncticncncnctctcctgctctcgcttatcacttcttcattcartcti anccttttcatcatcaaactagcamcttactttatttatttmtcaamicaanncagacaaaaccaaactacngggnacagccgtcaacagatccccg ggattggccaaaggacccaaaggtatgtncgaatgatactaacataacatagaacaratcaggaggacccttgctlggagggtaccggtagaaaaa atgagtaaaggagaagaacrmcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgnaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtga aggtgatgcaacatacggaaaacTtacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgnccalgggtaagtttaaacatatatatactaactaaccct gattatttaaattttcagccaacacttgTcacuctttctgttatggtgttcaatgcrtctcgagatacccagatcatatgaaacggcatgacttntcaagagt gccatgcccgaaggnatgtacaggaaagaactatatttrtcaaagatgacgggaactacaagacacgtaagntaaacagKcggtactaactaaccat acatatttaaattttcaggtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccngnaatagaarcgagnaaaaggiattgattttaaagaagatggaaacanctt ggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcalggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagTtgtaagtttaaacttggacttac taactaacggattatatnaaamtcagaacrtcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgrtcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaa nggcgatggccctgtcctrttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttct tgagmgtaacagctgctggganacacatggcatggatgaacraracaaatagcattcgtagaattccaactgagcgccggtcgctaccatiaccaac ttgtctggtgtcaaaaataataggggccgctgtcatcagagtaagtnaaactgagnctactaactaacgagtaatatttaaattttcagcatctcgcgccc gtgcctctgacttctaagtccaattac:cttcaacatccctacatgctctnctccctgxgctcccaccccctattmgttattatcaaaaaaacttcttctaan tctrtgttttttagcttctttUagtcacctctaacaatgaaattgtgtagattcaaaaatagaattaattcgtaataaaaagtcgaaaaaaaKgtgctccctcc ccccattaataataattctatcccaaaarcacacaatgttctgtgtacacttcttatgttttttttacitctgataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccg cacacaaaataccttatcatatgttacgtttcagtttatgaccgcaatttttatttcttcgcacglctgggcctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaa aagrtttggagtatttttggaattrncaatcaagtgaaagtltatgaaattaattncctgcttttgctttttgggggtttcccctangtrtgtcaagagtttcgag gacggcgtttttcttgctaaaatcacaagtattgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggnrgggrttgaggctcagtggaaggtgagtag aagngataamgaaagtggagtagtgtctatggggmttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaacataactgtttcctactagtcggcc gtacgggcccggtacccagctmgncccmagrgagggraangcgcgctiggcgtaatcatggtcatagctgraccigtgtgaaattgnatccgct cacaattccacacaacataegagccggaagcataaagtgtaaagcctggggTgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgc ccgctnccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcanaatgaatcggccaaegcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcc tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggrtatccacagaatcaggggata acgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccct gacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccKcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcag ttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaa cccggtaagacacgacratcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtg gtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagrtggtagctctlgatccgg caaacaaaccaccgctggtagcggtggtTtttngtTtgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatc:caagaagatcctngatcnttcucg gggtctgacgcrcagtggaacgaaaactcacgttaagggannggicatgaganatcaaaaaggatcncacctagatcctmaaartaaaaatgaag tttmatcaatctaaagtatatatgagiaaacnggtctgacagnaccaatgcttaaicagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccat agngcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatętggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccg gctccagattutcagcaataaaccagccagccggaagggcegagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgc cgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttc attcagctccggttcccaacgatcaaggcgagrtacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagt aagttggccgcagtgttatcactcatggnatggcagcactgcataattctcnactgtęatgccatccgtaagaigcmtctgtgactggtgagtactcaa ccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaacntaaaagtg ctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggaictiaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttc agcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaata ctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtartiagaaaaataaacaaataggggttc cgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaatTgtaagcgrtaatamtgttaaaattcgcgttaaattttigrtaaatcagctcattrtnaaccaataggc cgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggngagtgttgttccagtrtggaacaagagiccactattaaagaacgtgga ctccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtcTatcagggcgatggcccaciacgigaaccatcaccctaatcaagttrotggggtcgaggcgccgtaaa gcactaaatcggaaccciaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaa aggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtc ccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcrtcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaag gcgattaagngggtaacgccagggrrncccagicacgacgngcaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaataęgactcactatagggcgaang gagctccaccgcggtggcggccgcicugaactagtg
PL 201 425 B1 pGNltO: Sekw. Id. Nr 7 gatcctccaaaatcgtcttccgcictgaaaaacgaaagtggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaangagcmngggtcgaaaa aaatgmnagaatgctgagaacacgnaaacacgaagatcautttamtgagacccggatgctctgaaaatgtctgacatagatnaaaaaagcatat atatanmcattncaacgtgaaagtTttgtgcaactttatagaatctcctattggcacangmmatnaactgaggcagntrtgaacaccntttgaaactt tgaatctcmgaagUtactgtcgaaaagactgacttgagcgttcgaaatgccagaagaaaacTatantg3atctcgcgctaaangagaaatgcaaca gcgctccactggacaanggaaaaaaaatnattcggaggcgacaacggtattttcgaaangamtctgtgtanttctcanttttataaattcttctngatn atcgttcgtttgtgagaaatnaangtancaaacttttttatagtaagataccggtggtaccgctagccgtacgaacccgggattggccaaaggaccca aaggtatgtncgaatgatactaacataacatagaacarmcaggaggacccttgcrtggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagc tcatgaacacganaacatcgctaagaacgacnctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccatucggtgagcgmagct cgcgaacagnggcccttgagcatgagicnacgagatgggtgaagcacgcnccgcaagatgmgagcgtcaacttaaagctggtgaggngcgga taacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggmgaggaagtgaaagctaagcgcggcaag cgcccgacagccrtccagncctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccanaagaccactctggcngcctaaccagtgctgaca atacaaccgncaggctgtagcaagcgcaatcggTcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccngaagctaagcacttcaa giaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcamatgcaagrtgtcgaggctgacatgctctctaagggtcta ctcggtggcgaggcgtggtcncgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggnag cnacaccgccaaaatgcTggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcg ctggctggcatctctccgatgtlccaaccngcgtagncctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctc!
ggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacacc gcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacguatcaccaagtggaagcangtccggtcgaggacatccctgcgangagcgtgaa gaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgcigctgtgtaccgcaagacaaggctc gcaagtctcgccgtatcagccngagncatgcttgagcaagccaataagtngctaaccataaggccatctggncccnacaacatggactggcgcg gncgtgmacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggacgtcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaagg
Kactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggmcgtncctgagcgcaicaagttcattgaggaaaaccacgagaacat caiggcngcgctaagtctccactggagaacacnggtgggctgagcaaganctccgnctgcttccngcgttctgcmgagtacgctggggucagc accacggcctgagctauacigcicccttccgctggcgrrtgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtg gtcgcgcggrtaacngcnccugtgaaaccgncaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctgcaagcagacgc33tc3atg ggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggct ggcnacggtgrtactcgcagTgigactaagcgttcagtcatgacgctggcrtacgggtccaaagagrtcggcttccgtcaacaagtgctggaagatac cattcagccagctanganccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgciggatacatggctaagctgatngggaatccgtgagcgt gacggtggtagctgcggttgaagcaaigaactggcnaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagaganccic gcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctancagacgcgcttgaacctgatgncecgg tcagttccgcnacagcctacc3naac3ccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacac3gcca agacggtagccaccncgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatctmgcactgattcacgactccttcggtaccattccggc tgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactttggttgacacatatgagtcngtgatgtactggctgamctacgaccagncgctgaccag ngcacgagictcaanggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaaggg ccctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggrngatrn cntctggtcaaaaagatgaaattangatmcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtctgcaagtcgttcacagtcgaccagagaatcgc gggaagtgagccaagaggtatgnmcaaaaatcaataactgatcataatrtttattgtttggtgaatttaagaaaataatancgaaaancctctgaattat caagactgcagtanaatrtcgagaaaaattgagatancatagagctangtaaattttcngatncagactgaaacncggaaaatcaagagaaaatcaa agaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacncaccagctccaaaaaggtccaaggagaccag grttgtcaaaagcttccigcgattaanctcarttcaarttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggncgttcaagatctcccagaaggicrtca gcacgrtccccgtcacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccgaagagccagcaccgctaccagagaaaaaga agaaagagccgctggatanctacgaacaagaaccggaggagcatatattccacccgccaaacncgacratgcaacaacagattagtgataagca aagtgaacagtatcagagaatgaangggaaagaatgaagaaaaagattcacggattggttaacagagtcaacgcgaagaatcttgncaaangtca gagaacttcncaagagaatgtgancgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaattaatttaatttncaggggacnctctgccgtg acattancaagctcaggctnctcaccagganctctaacgtctatgcagctttggcggcagnatcaactcgaaanccctcatgtcggtgaacttcttctc cgtcgtctgattgtacagrtcaaaagaagrttccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgatcaaattcatcgcacatttganaatcaacaag ngctcacgaagnctrgcgctggaaatcatgattctgatgcngaagaaccaactgatgancagrtgaagtcgccangcgncctgaaagagtgtgga gcaaagcnctggagangctccaęcagctcnaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaanctc3tggaaactgaaagatcggaaaatgcactggatc gacgtattcagtatatgattgagactzcaatgcagattcgaaaggacaaaKtgcggtaaggugaatatataaatagtttattagaaaaaaataaanag aauatnaaattcctactagcca3tcaggcgacctttttgcgcaugttcunangaaaaatttggagaatttctcauttctcgctcggaaatctggaan
Cgacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgctttgtgctccctnctcgcngtcttctgtgtacaccaagaaccttgttgagttcatcaactgaatct gtgactggcHgngcicacfggatgcactagacgactganctcgagaaatcagattgagttgcganagggtgacctagaaangggaauatacgaa crmgaaaatancaggagganaaaaaaattattctcgacaatcctacaaatttacRartgcaccatgttgctccaacatnncanaaaagttaatgaaaa aatgtagaaaatcggaaattggcaamtcagaccatnnaagcattttcaaaaaaaaangcagctgaaataaatgtcattncagataaatcgagcgan ttctgtigtctgacactagttntaennaaaaaatgnggaagaacatggtgcaataggtaamcatagaarnccatgtgrtrttrttcaanaaccaanatc caaatcttccaaactcacatmgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagnnataagacgagcatctctgatatcactgaaaanaamnaatca aaacttgaatatcaactaaacccacrtanaacmctcgatcttctgtcgttcggtacgatgacggtgaagaagccaattgtagtagngatnggncaagt
PL 201 425 B1 ccrncggtgRgtacgtcagtgtcdgcaatgcjamagnataacRaggcctaagattcaatttaatgaagtgartaaatngnctctgaacctcnaagi tgatcttttggattagaaacataiaagacaggmacctatctattaaaaaacagatcaaaacagatacgaccaaatcggataarccatgcctacctggcat ctaggaacgtgncnagaagamcnacgtaatcgtargaagaaataacaamgatcgttggccagcaaaaatagggttttaagtgggatagtgtttltat tagcuaccggaaaatntaLigtmtnKgcaagaaaccactgaaaaccccctaangtatacatmnggagcagcTtctggtctmigagcaataaaat tcgataaaacagaatrtaagigtaaangttcacatttagtttcattnatcaaattngngctcaaaaacatrcgaagctgCTClaaaaaaatgcattaaaaa aggggtntcagtggttttlcacanaaaaaagctaatmaacuaaaatccatcatatttccaacrttgtcacaacaataaaatgcrggtcaaaatgtgncg laaaaatgttttmttttaarttttataaKUaaaatagttrtcttlcgctgggacacatacaKtttgggcgtaaattttcagncaaamccatttttacaaccat aatcataaagctacgtcrgatctctctcgcacttacctgcgcctgaKcgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagttgt ggtagtggacgncatcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtctcactttccgtactattgagagaggggagactgaagatggcaattgaggaęa gtgtcttcgacgcacgcargcaiccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcrtgtttctaagcccciccctitgtaatacatacacatatct aa{accgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgngctgtagttgccaaggcatcatcgatgaaataactgaaagaaagaattaaataattattgc aggcgUlccggcggtcartgaagacttggacttgattgaggaggaggatcagatcatccatacacttaatRggaggatgcggngatccggaaaa{g ggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcatiaamaataaartgaanccatncagatgtgncaaactaga:ceagaattcgaaaagaacga ggaggtttatgaggagatccgTaaggaaatcaRggaaacgccgatatttcggatgaggatggtggcgacgagnggatgatgaagaagagggtagt gatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattangataaiactgaicagaattgactgctttcagaaggtancattngagttttgggccggcaa atctgtaagttgccggttgccgiaaatngctgaatttgccggaaaaaaaaattccggaatttatttaaaaactttttgtaaaaaruaaRaaamgcaacR ncagagaagtctacctgacaatgcaatcatctngga£taccaagaagctgctcacaaattgctgaaaaigaaganccagacagcatgcaggtcagc gatgttgcaaagaaaaattncgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaaRtaaaaaaaaactccgtRttttcttttrtrnatacgagaaaaaccaaaaaa atgtatttttgccaaaRctaaaatactatccccgaaattttcaatattJtctcrttcagaacgaactctgcgcgatgcrtgKgattgttgtgctcaacagcgta cc:acgagcgaRctacggaatgctcatcgaacgtttctgccgacRcgcctcgaataccagcaa£actitgaaaagctcigccaggacacgianccac gancaccgaattgacatcacaaaacrgcggaatnggctcgccttattgctcatttgctctcgacggatgctattgaciggaagaRttggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacttcttctggcagiatctatanaaatatatarnaatgaacngtggaggcgatgggaatggttaaacttcaRcgagag nactgatccgtgagtttcctagagagagRgttttcgtaRcaattnccctaRttcagaacttIggctcattgctttgRggatiancccacgaaciaatccg aacagcgcacgarntcgatcaacttcncacaatgaRggaRgggiggRrgacgnggaacttcgigaatggctggcaaagggTctcaagaagaaga agggaatgctggatcagttgaaggccgaatcaagctcagartcarcgtcgtcttcggancgtcagactcgtctgaRcRcggaRctgacgancatcc gactcg[ctlcagancctcatencticagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagttccaaaaagaag gaaaaagagaataRggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgigatcaaagtgtggagaacaaggaciaggatcgtcgacg :cgccaggattctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagacxcggatgatgagg atcggaaaggtcgtgaacgtcgggaagancaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctgargatgarcgtaaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgrtgaattncaaartrtaaatactgaatatttgtmtmcctatt antatttattctcmgtgtttmttcRgctRctaaaaaattaattcaatccaaaicuaacatgagcggmnmctcmccgtctcccaattcgtattccgct cctctcatcigaacacaatgtgcaagtttatRatcrtctcgctRcatttcanaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacacacaaaaggatg atggaaatgaaataaggacacacaata.tgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaaaagaaaacataaaaatatatagaggaggaa ggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaangtcctcgcnggcaaatgcgaatccgtatggagaggcacgtttggcga aggcaaatgKcggtatggagatctgtaaaaatttttaagngaaanrggigrtgctcttttacaaaarcttccgatmcgcttgaaattacggTgcaaggtct cgacacgtcttccaatttttcaaancaaaagagccmaatgggcigtagttgctaatttetegtttttgaaaatttttcttccgttUatcgaaatttgatgtatrt tamatgattttcaataaamcaaagaaacrggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagtaatccaatccttaaaggcgcacacattttaaargtccgc cccaatacgatatttnttaagaRcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacaaRcactggccgtcgt rcacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccccttcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccttatcacccttcccaacasttecstaacctsaateffceaaiasffacaceccctfftaffceffcacattaaBczeffirco-fffftfftPfitPotrAt-ai'
-- v w w w w w wo 9 - - ’ 9 -9----9 “9 - 99 9--------9 9” OO ~ 999 '9 OO'OQ’~— O- gcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgcrtrcTtccettcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctcta aatcgggggctcccrttagggRccgatttagtgcrttacggcacctcgaccccaaaaaacttgaRagggtgatggtteacgtagtgggccatcgccct gatagacggtttncgcęcrtigacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattctttt gatttataagggattngccgaRtcggcctattggnaaaaaaigagctgantaacaaaaatttaacgcgaatittaacaaaatatiaacgtttacaatttca ggtggcacttncggggaaaigtgcgcggaacccctatitgmatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataacccrgataaatgc ttcaataatangaaaaaggaagagtacgagtancaacaniccgtgtcgcccttartcccttttttgcggcattttgccRcctgmttgctcacccagaaac gctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagngggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccRgagagcmcgcc ccgaagaacgttttccaatgatgagcacttnaaagttctgctatgtggcgcggtaRaKccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat acactaRctcagaatgacRggRgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggaiggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccacaag catgagtgataacactgcggccaacttacrtctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttntcacaacatgggggatcatgtaactcg ccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact attaactggcgaaclacRactctagcncccggcaacaaRaaiagactggatggaggcggataaagngcaggaccacnctgcgctcggcccttcc
Sgctggctggmangctgataaatctggagccggtgagcgtgggtcicgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtarcgt agnatetacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcag accaagtttactcatatatacntagangatnaaaacttcaRtnaatnaaaaggatctaggtgaagatcctrtngataatctcatgaccaaaatcccttaa cgtgagRncgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcRgagarccmttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa aaaccaccgciaccagcggtggmgnTgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaacsggcttcagcagagcgcagataccaaatact grccnctagtgtagccgtagHaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgrtaccagtggcigctgccag tggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagnaecggataaggcgcagcggicgggctgaacggggggRcgtgcacacagcc
PL 201 425 B1 cagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacagg tatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccac ctctgacctgagcgtcgattmgtgatgctcgtcaggggggccgagccutggaaaaacgccagcaacgcggccttntacggttcctggccttttgct ggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacga ccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctg gcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattaggcaccccaggctttacacntatgct tccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaamcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaa agggaacaaaagctgggggg
PL 201 425 B1 pAS2-cyh2-HA+boihT7-final Sekw. Id. Nr 8 gatccgtcgacagatctccctatagtgagrcgtaRactgcagccaagctaaRccgggcgiaRTCRatgantatgaRRtaRaRaaataagRataaaaaaa ataagtgutacaaatmaaagtgacicrtaggttnaaaacgaaaartcngncngagtaactctttcctgtaggtcaggttgcmcicaggtatagcatgaggt cgctcnangaccacacctctaccggcaigcaagcnggcgtaatcatggtcatagcigmcctgtgtgaaaRgnatccgctcacaaRccacacaacatac gagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgaggtaactcacaRaaRgcgRgcgctcactgcccgcRtccagtcgggaaacctgt cgtgccagctgganaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtngcgtartgggcgctcttccgcncctcgctcactgactcgctgcgctcggtcg ncggctgcggcgagcggtatcagcicactcaaaggcggtaatacggRatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggcc agcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgRgctggcgRRtccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaarcgacgctcaagtcagag gtggcgaaacccgacaggaciataaagauccaggcgRtccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgnccgaccctgeegcnaecggataccigTC cgccRtctcccRcgggaagcgtggcgcntctcatagetcacgctgtaggtatctcagncggtgtaggtcgRcgctccaagctgggctgtgtgcacgaac cccccgncagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcngagtccaacccggtaagacacgacnatcgccactggcagcagccactggtaaca ggaRagcagagcgaggtatgtaggcggtgcucagagncRgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtantggtatctgcgctctgct gaagccagRaccncggaaaaagagnggtagctcngatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggRRTRgRtgcaagcagcagaRacgcgc agaaaaaaaggatc:caagaagaKcnxgatctntcucggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggatmggtcatgagatuicaaa aaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcnaatcagtgaggc acctatctcagcgatctgtctamcgRcatccatagRgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcRaceatctggccccagtgctgc aatgataccgcgagacccacgcscaccggctccaganutcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatcc gcctccatccagtctattaatigRgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtrtgcgcaacgttgttgccartgctacaggcatcgtggtgtca cgętcgtcgRtggutggcRcaRcagctccggRcccaacgatcaaggcgagaacatgatcccccatgngtgcaaiaaagcggnagctccttcggtcct ccgatcgttgtcagaagtaagnggccgcagtgnatcactcatggnatggcagcictgcauattctcRactgtcatgccaKcgtaagitgctmctgtgac tggtgagtactcaaccaagtcanctgagaatagtgtatgcggcgaccgagngctcngcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaac ntaaaagtgctcatcanggaaaacgncncggggcgaaaactctcaaggatcnaccgctgrtgagatccagKCgatgtaacccactcgtgcacccaactg atcRcagcatcHttacRtcaccagcgntctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgngaat actcatactcttcetrtncaaunangaagcatnatcagggtungtctcatgagcggatacatatngaatgtatttagaaaaataaacaaaraggggnccgc gcacatnceccgaaaagtgccacctgaacgaagcatctgxgcncanngtagaacaaaaatgciacgcgagagcgcuanmcaaacaaagaatctga gctgcatnnacagaacagaaatgcaacgcgaaagcgctannaccaacgaagaatctgtgcncamttgtaaaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaa tmtcaaacaaagaatcigagctgcanTttacagaacagaaatgcaacgcgagagcgctatntaccaacaaagaatctatacnctrtmgitctacaaaaatg catcccgagagcgcianmcuicaaagcaKtugaracnntnctcctngtgcgctcuGŁ3igC3gtctcttgataactttngcactgtaggtccgnaag gttagaagaaggctactnggtgrctatmctcttccataaaaaaagcctgactccacttcccgcgttttctganactagcgaagctgcgggtgcattttttcaag ataaaggcatccccganatanciataccgatgtggangcgcatacrng:gaacagaaagtgatagcg«gatgancncanggtcagaaaanatgaacg gtncttctattttgtctctatatacucgtataggaaatgtnacatmcguttgtmcgancactcutgaatagncnactacaamtmgtctaaagagtaacac tagagataaacacaaaaaatgugaggtcgagraagatgcaagttcaaggagcgaaaggtggatgggtaggttautagggatatagcacagagatatata gcaaagagatacnngagcaatgmgtggaagcggtancgcaatacntagtagctcgttacagtccggtgcgnntggtttmgaaagtgegtcncagagc gcRRggRRcaaaagcgctctgaagRcctttacRtctagagaataggaacRcggaaUggaacRcaaagcgRtccgaaaacgagcgCRccgaaait gcaacgcgagctgcgcacatacagctcactgtKacgtcgcacctautctgcgrgngcctgtautatatattcatgagaagaacggcatagtgcgtgmat gcrtaaaigcgtacnatatgcgtctatnatguggatgaaaggtagtctagtacctcctgtgatanatcccattccatgcggggtatcgtatgcnccttcagca ctacccRttgctgRctatatgctgccactcctcaaRggaRagtctcatccRcaatgctaicaRrccRtgataRggatcataRaagaaaccaRaRatcatga caRaacctataaaaataggcgutcacgaggcccnrcgtctcgcgcgmcggtgaigacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca cagcRgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgicagcgggtgnggcgggigicggggctggcRaactatgcggcatcag agcagaRgtactgagagtgcaccałagatcaacgacaRacUtautataataUggaagcantaatagacagcatcgtaatautgtgtacRtgcagRatg acgccagatggcagtagtggaagatanctRaRgaaaaatagcRgtcaccRacgtacaatcRgatccggagcRRcnntrtgccgaRaagaaRaaRcg gtcgaaaaaagaaaaggagagggccaagagggagggcanggtgactangagcacgtgagtatacgtgaRaagcacacaaaggcagcRggagtatg tctgRanaaRtcacaggtagnctggtccaRggtgaaagRTgcggcRgcagagcacagaggccgcagaacgtgctcuganccgatgctgacRgctg ggtaHatatgtgtgcccaaiagaaagagaacaaRgacccggRaRgcaaggaaaaRtcaagtcngtaaaagcatataaaaatagRcaggcactccgaa atacnggnggcgtgmcgtaiicaacctaaggaggatgnnggctctggtcaatgaRacggcaRgaiatcgtccaactgcatggagatgagtcgtggca agaataccaagagRcctcggRigccagRaRaaaagactcgURTccaaaagactgcaacatactactcagtgcagcRcacagaaacctcaRcgniaR cccRgRtgaRcagaagcaggtgggacaggtgaacRRggaRggaactcgantctgactgggnggaaggcaagagagccccgaaagcRacaRRat gnagctggtggactgacgccagaaaatgnggtgatgcgcnagaRaaatggcgRanggtgngatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaa gactctaacaaaatagcaaantcgtcaaaaatgcttagaaattggRaHactgagtagtaRtaRtaagtaRgntgtgcacRgcegatctatgcggtgtgaa ataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggaaangtaaacgRaauRngRaaaaRcgcgRaaaRtngRaaatcagctcaRtmaacc aataggccgaaatcggcaaaatcccnataaatcaaaagaatagaccgagatagggRgagtgngnccagmggaacaagagtccactanaaagaacgt ggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccuatcaagRnnggggtcgaggtgccgtaaag cactaaatcggaaccctaaagggigcccccgaRUgagcngacggggaaagecggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggag cgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcnaatgcgccgctacagggcgcgtcgcgccancg ccaRcaggctgcgcaactgngggaagggcgatcggtgcgggcctcRcgctaRacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgaRaagR
PL 201 425 B1 gggtaacgccagggttncccagtcacgacgngtaaaacgacggccagtcgtccaagctttcgcgagctcgagatcccgagctngcaaanaaagccttc gagcgtcccaaaaccrtctcaagcaaggnncagtataatgnacatgcgtacacgcgtctgtacagaaaaaaaagaaaaatttgaaatauaataacgttctt aaactaacataactataaaaaaataaatagggacctagacttcaggttgtctaactccttccttttcggttagagcggatgtggggggagggcgtgaacgtaa gcgtgacataactaanacatgatatcctrngttgrttccgggtgtacaatatggacttcctcrtnctggcaaccaaacccatacatcgggattcctataataccrt cgnggtctccctaacatgtaggtggcggaggggagatatacaatagaacagataccagacaagacauatgggctaaacaagactacaccaanacactg cctcattgatggtggtacataacgaactaatactgtagccctagacttgatagccatcatcatatcgaagtncactaccctttttccatttgccatctattgaagta ataataggcgcatgcaacttcttnctnttttttcttttctctctcccccgttgttgtctcaccatatccgcaatgacaaaaaaaatgatggaagacactaaaggaaa aaattaacgacaaagacagcaccaacagatgtcgttgttccagagctgatgaggggtatcttcgaacacacgaaactttttccttccttcartcacgcacacta ctctctaatgagcaacggtttacggccttccttccagttacttgaatttgaaataaaaaaagtttgccgctttgctatcaagtataaatagacctgcaattattaatc ttttgtttcctcgtcangnctcgnccctncttccttgtttctttttctgcacaatantcaagctataccaagcatacaatcaactccaagcttgaagcaagcctcct gaaagatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatrtgccgacrtaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctga agaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaaca gctatttctactgantncctcgagaagaccngacatgattttgaaaatggattctnacaggatataaaagcartgttaacaggattantgtacaagataatgtg aataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacangagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagt
3gtaacaaaggtcaaagacagngactgtatcgccggaattcrtaatacgactcactatagggcatatggccatggaggccccggg
PL 201 425 B1 pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7 Sekw. Id. Nr 9 gatccgtcgacagatctcectatagtgagtcgtaRactgcagagatctatgaatcgtagatactgaaaaaccccgcaagncacncaactgtgcatcgtgca ccatctcaantcRtcaRtatacatcgRRgccRcRRatgtaactatactcctctaagRtcaatcRggccatgtaacctcJgatctatagaaRRRaaatgacta gaanaatgcccatctmnnggacetaaattcncatgaaaatatanacgagggcttattcagaagctttggacttcncgceagaggmggtcaagtctccaa tcaaggttgtcggcngtctacettgccagaaatnacgaaaagatggaaaagggtcaaattgrtggtagatacgttgngacacttctaaataagcgaatttctt atgatnatgatttnattattaaataagnataaaaaaaataagtgtatacaaartttaaagtgactcnaggnnaaaacgaaaattcttgttcttgagtaactctttcc tgtaggtcaggttgcntctcaggetagcatgaggtcgctcRangaccacacctcuccggcatgcccgaaattcccctaccctatgaacatattccamtgt aatncgtgtcgtttctanatgaatttcantataaagtttatgtacaaatatcataaaaaaagagaaicntaaagcaaggatmcnaacncncggcgacagca tcaccgacncggtggtactgnggaaccacctaaatcaccagRctgatacctgcatccaaaaccRRtaactgcatcRcaatggccRaccRcRcaggcaa gttcaatgacaatttcaacatcattgcagcagacaagatagtggcgatagggtcaaccnattctrtggcaaatctggagcagaaccgtggcatggRcgtaca aaccaaatgcggtgRCRgtctggcaaagaggccaaggacgcagatggcaacaaacccaaggaacctgggataacggaggcRcatcggagatgatatc accaaacatgttgctggtganataataccatnaggtgggngggttcnaactaggatcatggcggcagaatcaatcaangatgttgaaccttcaatgtagga aattcgttcttgatggntcctccacagttntctccataatcttgaagaggccaaaacattagctnatcaaaggaccaaataggcaatggtggctcatgngtag ggccatgaaagcggccancngtg3ttctngcacnctggaacggtgtattgttcactatcccaagcgacaccatcaccaccgrcncctttctcttaccaaagt aaatacctcccactaaRctctgacaacaacgaagtcagtacctnagcaaaRgtggcngattggagataagtcuaaagagagtcggatgcaaagttacat ggtcRaagRggcgtacaaRgaagncRtacggaRtttagtaaaccRgncaggtctaacactacctgtaccccataaggaccacccacagcacctaacaa aacggcatcaaccttcttggaggcttccagcgcctcatctggaagtgggacacctgagcatcgatagcagcaccaccaattaaatgattttcgaaatcgaac
RgacaRggaacgaacatcagaaatagcRtaagaaccRaatggcRcggctgtganTcttgaccaacgtggtcacctggcaaaacgacgatcncnaggg gcagacattagaatggtatatccngaaatatatatatatattgctgaaatgtaaaaggtaagaaaagttagaaagtaagacgattgctaaccacctattggaaa aaacaataggtccnaaataataRgtcaacRcaagtaRgtgatgcaagcantagtcatgaacgcRctctaRctatatgaaaagccggRccggcctctcac cRtccntncrcccaaRmcagRgaaaaaggtatatgcgtcaggcgacctctgaaaRaacaaaaaaRiccagKatcgaantgaRctgtgcgatagcgc ccctgtgtgttctcgttatgttgaggaaaaaaataatggttgctaagagancgaactcngcatcttacgatacctgagtancccacagttggggatctcgactc tagctagaggatcaaRcgtaatcatggtcatagctgRtcctgtgtgaaangoatccgctcacaaRccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaa agcctggggtgcctaatgagtgaggtaactcacattaattgcgttgcgcKactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctggattaatgaatc ggccaacgcgcggggagaggcggtngcgtangggcgctcnccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgncggctgcggcgagcggtatc agctcactcaaaggcggtaatacggRatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccg!a aaaaggccgcgRgctggcgRRtccataggcKCgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact ataaagataccaggcgtnccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgnccgaccctgccgcnaccggatacctgtccgcctttctcccncgggaagcg tggcgctncteatagctcacgctgtaggTatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgncagcccgaccgctg cgecnatccgguactatcgtcRgagtccaacccggtaagacacgacnatcgccactggcagcagccactggtaacagganagcagagcgaggtatgt aggcggtgctacagagRcRgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtantggtatctgcgctctgctgaagccagnaccncggaaaa agagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtntmgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaa gatccRtgatcRRctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgRaagggaRRggtcatgagaRatcaaaaaggatcRcacctagatccRR aaattaaaaatgaagttnaaatcaatctaaagtatatatgagiaaacrtggtctgacagttaccaatgcKaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctart tcgRcatccatagRgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcRaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacg ctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaangt igccgggaagctagagtaagtagncgccagnaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcnca
RcagctccggRcccaacgatcaaggcgagRacatgatcccccatgRgtgcaaaaaagcggnagctccRcggtcctccgatcgRgtcagaagtaagtt ggccgcagtgnatcactcaiggtlatggcagcactgcataanctcttactgtcatgccatccgtaagatgctntctgtgactggtgagtactcaaccaagtcat tctgagaatagtgtatgcggcgaccgagRgctcRgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccac3tagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcnaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcacc agcgntctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaacgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcncctmtcaatatt attgaagcatttatcagggnaRgtctcatgagcggatacatatngaatgtatttagaaaaataaacaaaaggggttccgcgcacatnccccgaaaagtgc:
acctgacgtctaagaaaccattattatcatgaeattaacetataaaaataggcgtatcacgaggccctnegtctcgcgcgtncggtgatgacggtgaaaaect ctgacacatgcagctcccggagacggteacagcRgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgRggcgggt
8,cggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaecataacgcatttaagcataaacacgcactatgccgttcttctcatgtatat atatatacaggcaacacgcagataiaggtgcgacgtgaacagtgagctgtatgtgcgcagctcgcgttgcaRRcggaagcgctcgRRcggaaacgctR gaagRcctanccgaagRcctaRctctagctagaaagtataggaacRcagagcgcRRgaaaaccaaaagcgctctgaagacgcacntcaaaaaacca aaaacgcaccggactgtaacgagctactaaaataRgcgaataccgcRccacaaacaRgctcaaaagtatctcntgctatatatctctgtgctatatccctata taacctacccatccaccRtcgctccRgaacRgcatctaaactcgacctctacaRttRatgRtatctcagtanactcRtagacaaaaaaaRgtagtaagaac taRcatagagtgaatcgaaaacaatacgaaaatgtaaacaRtcctatacgcagtatatagagacaaaatagaagaaaccgRcataaRnctgaccaatgaa gaatcatcaacgctatcacRtctgRcacaaagtatgcgcaatcaacatcggtatagaatataatcggggatgccRtatcngaaaaaatgcacccgcagcR cgctagtaatcagtaaacgcgggaagtggagtcaggcntttttatggaagagaaaatagacaccaaagtagccttcnctaaccnaacggacctacagtgc aaaaagRatcaagagactgcanatagagcgcacaaaggagaaaaaaagtaatctaagatgcRtgnagaaaaatagcgctctcgggatgcaRRtgtaga acaaaaaagaagtatagaRCRTgRggtaaaatagcgctctcgcgRgcaRtctgRctgtaaaaatgcagctcagancRtgRtgaaaaanagcgctctcg
PL 201 425 B1 cgrtgcatttttgttttacaaaaatgaagcacagattcttcgttggtaaaatagcgctttcgcgttgcatttctgttctgtaaaaatgcagctcagattctttgtttgaa aaartagcgctctcgcgttgcatttttgtlctacaaaatgaagcacagatgcttcgttgcngcatgcaacttcttttcttttttmcttttctctctcccccgttgttgtct caccalatccgcaatgacaaaaaaaatgatggaagacactaaaggaaaaaattaacgacaaagacagcaccaacagatgtcgttgttccagagctgatga ggggtatcttcgaacacacgaaactttttccttccttcancacgcacactactctctaatgagcaacggtaucggccttccttccagttacttgaatttgaaataa aaaaagtttgccgctttgctatcaagtataaaugacctgcaattattaatcttttgtttcctcgtcattgttctcgttccctttcnccttgtttctttttctgcacaatattt caagctataccaagcatacaatcaactccaagctttgcaaagatggataaagcggaattaattcccgagcctccaaaaaagaagagaaaggtcgaattggg taccgccgccaattttaatcaaagtgggaatattgctgatagctcattgtccttcactttcactaacagtagcaacggtccgaacctcattacaactcaaacaaa ttctcaagcgctttcacaaccaattgcctcctctaacgttcatgataacttcatgaataatgaaatcacggctagtaaaattgatgatggtaataattcaaaaccac tgtcacctggttggacggaccaaactgcgtataacgcgtttggaatcactacagggatgtttaataccactacaatggatgatgtatataactatctattcgatga tgaagataccccaccaaacccaaaaaaagagatcgaattcttaatacgactcactatagggcccatggacgaagaatccagttcattcttatgtacctatgctg agaatcgtgccaataagaagccaatacttccttagatgatgcaataaatattaaaataaaacaaaacagaaggctg
PL 201 425 B1
PGN205: Sekw. Id. Nr 10 ccggrggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcmcgtcattgaaaagaaggataagaatggacgatgggaagaagctctcgtt gttccaggagatcagaaaacagcaactgttccaaatcttaaggagggagaagaatatcaattcagaatnctgctcgtaacaaggctggaacTggaga tccttctgatccttctgatcgtgttgttgcgaagccaagaaaccttgctccaagaattcatcgtgaagatctttctgatacaactgtcaaggtcggagccac tctcaagttcattgttcatattgatggtgagccagcaccagatgtaacatggtcattcaatggaaaaggaatcgg3gagagcaaggctcaaattgaaaa tgagccatacatctcgagatttgcmgccaaaggcacncglaagcaaagtggaaaatataccatcactgcaaccaacattaatggaactgacagtgtc aclatcaatatcaaggtaaaaagcaagccaacgaaaccaaagggaccaatcgaggtaactgatgtcttcgaagatcgtgcaactcttgactggaaac caccagaggatgacggaggagagccaattgagttctatgaaartgaaaagaigaacaccaaggacggaatctgggttccatgtggacgtagtggag atacccacttcacagtcgattcactcaacaagggagatcattacaagttccgtgtcaaggctgicaacagcgaaggaccttctgatccartggaaactg aaaccgatattttggctaaaaatccatngaKgrceagatagaccaggtcgtccagagccaactgattgggattctgatcatgttgatctcaagtgggat ccactagttctagaagcgctgctaagggggccctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaaga agaaaaagagtcatctgaacaggtngatroctttctggTcaaaaagatgaaattartgattttcagccagatactcccaaaflctagcagcgagaagtct gcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcgggaagtgagccaagaggtatgttntcaaaaatcaataaclgatcataatartartgrttggtgaattt aagaaaataatattcgaaaattccxctgaattatcaagattgcagtatlaatttcgagaaaaangagatancatagagctattgtaaattttcttgatncag actgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaaagaaaaggatgacggggatgatcagccrggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttc accagctccaaaaaggtccaaggagaccaggtttgtcaaaagcttcctgcgattaanctcatttcaatttticagagaatcagagtctcctgaaaaatcc ccggncgttcaagatctcccagaaggtcttcagcacgttccccgtcacgatcrectagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccg aagagccagcaccgctaccagagaaaaagaagaaagagccgctggatattctacgaacaagaaccggaggagcatatattccacccgccaaactt cgacttatgcaacaacagattagtgataagcaaagtgaacagUtcagagaatgaattgggaaagaatgaagaaaaagartcacggattggttaacag agtcaacgcgaagaatcngttcaaattgtcagagaacttcttcaagagaatgtgattcgttcaaagrgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaat taatttaatttncaggggacttcTcigccgtgacanartcaagctcaggctttctcaccaggattctctaacgtctatgcagctttggcggcagttatcaac tcgaaattccctcatgtcggtgaacncnctccgtcgtctgatrgtacagttcaaaagaagmccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgat caaaRcatcgcacaTttganaatcaacaagttgctcacgaagttcttgcgctggaaatcatgattctgatgcttgaagaaccaacigatgaKcagttga agtcgccattgcgttcctgaaagagtgtggagcaaagcttctggagattgctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaaKctcatg gaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcgacgtattcagtatatgatlgagactgcaatgcagancgaaaggacaaatngcggtaaggtagaa tatataaatagtttattagaaaaaaataaattagaataatttaaattcctactagccaatcaggcgacctttttgcgcatagttctattattgaaaaatttggag aatttctcatattctcgctcggaaatctggaancgacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgctttgtgctccctttctcgcttgtcttctgtgtaca ccaagaaccttgngagticatcaactgaatctgtgactggcRgttgctcactggatgcactagacgactgatictcgagaaatcagartgagttgcgan a2SgtgaccCaga4attgggaataaUcgaactttigaaaataticaggaggattaaaaaaartattctcgacaatcctacaaai«acttattgcaccatgt tgctccaacattmcattaaaagRaatgaaaaaatgtagaaaatcggaaanggcaamtcagaccarttrtaagcatnicaaaaaaaaattgcagctga aataaatgTcarotcagataaatcgagcgartttctgngtctgacactagtttttagttttaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaatttcatag aatttccatgtgttttttttęaattaaccaatratccaaatcttccaaactcacatmgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagttttataagacgagc atctctgatatcactgaaaattaatrmaatcaaaacngaatatcaactaaacccacttattaactttctcgatcttctgtcgncggtacgatgacggtgaa gaagccaattgtagtagttgatnggttcaagtcctttcggtgtigtacgtcagtgtcctgcaatgctatttagttataacttaggcctaagancaamaatg aagtgattaaatttgttctctgaacctcnaagatgatcttttgganagaaacatataagacaggtttacctaictattaaaaaacagatcaaaatagatacg accaaatcggataatccatgcetacctggcarcTaggaacgtgttcttagaagatttcttacgtaatcgtatgaagaaataacaatttgatcgnggccag caaaaatagggnnaagtgggaiagtgtttttanagctaaccggaaaattttatagtttttttttgcaagaaaccactgaaaaccccctaartgtatacatnt ttggagcagcttctggtcttmgaecaataaaattcgataaaacagaatttaagtgtaaattgrtcacatttagtttctattttatcaaattttgttgctcaaaaa cattcgaagctgctctaaaaaaatgcatiaaaaaaggggttttcagtggtttttcacattaaaaaagctaattttaactaaaaatccatcatatttccaactng tcacaacaataaaatgctggtcaaaatgrgttcgaaaaaatgttttnnmaattinataamaaaaatagnnctncgctgggacacatacamngggc gtaaattttcagttcaaatttccatTtrtacaaccataatcataaagctacgtctgatctctctcgcacttacctgcgcctgartcgaaagaacaaccgtagc caaaagaacaagaagaacaagcacgtagrtgtggtagtggacgttcatcacgcaatactgaccaatggtcgTggggtctcactttccgtactattgaga
JPggggagactgaagatggcaattgaggacagtgtcttcgacgcaęgcatgcaKcataagcaraarccaggagggatggagagaaaaatcttgnr ctaagcccctccctttgtaatacatacacaatctaataccgaagaaiggcuattgaatggacgtcagctgttgctgtagttgccaaggcatcatcgatg aaataactgaaagaaagaattaaaaanangcaggcgtatecggcggtcattgaagacnggacttgattgaggaggaggatcagaicatccataca ctttaraggaggatgcggttgaiccggaaaaEgggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcattaaKtaataaangaattccatUcagatgt gttcaaactagatccagaattcgaaaagaacgaggaggtnatgaggagatccgtaaggaaatcartggaaacgccgatatttcggatgaggatggtg gcgacgagttggargatgaagaagagggtagtgatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaattgactgcti tcagaaggtattcartrrgagttRgggccggcaaatctgtaagttgccggttgccgaaaatrtgctgaaragccggaaaaaaaaattccggaarKattta aaaactttttgtaaaaattaaatiaaatngcaacnncagagaagtctacctgacaatgcaatcatctrtggactaccaagaagcigctcacaaattgctg aaaatgaagattccagacagcatgcaggtcagcgatgttgcaaagaaaaamtcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaactcc gtttttttctttrtttttatacgagaaaaaccaaaaaaatgtarttttgccaaanctaaaatactatccccgaaattttcaatanttctctttcagaacgaactctg cgcgatgcttgtcgattgttgtgcicaacagcgłacctacgagcgattc&cggaatgctcatcgaacgtttctgccgacttcgcctcgaacaccagcaa tactrtgaaaagctctgccaggacacgtanccacgancaccgaattgacatcacaaaactgcggaatttggctcgccłttttgcteatttgctcicgaeg gaigctattgactggaagartrtggccgatatgaaaatgaccgaagaggacacaacttcttciggcagaatctatattaaatatatatttaatgaacttgtg gaggcgatgggaatggnaaacncartcgagagttactgatccgtgagtttcctagagagagngnrtcgtattcaattttccctattttcagaactttggct cattgctttgttggattattcccacgaactaatccgaacagcgcacgattncgatcaacttcttcacaatgattggattgggtggtttgacgttggaacttc gtgaatggctggcaaagggtcicaagaagaagaagggaatgctggaicagttgaaggccgaatcaagctcagancatcgtcgtcttcggartcgtca gactcgtctgatrcttcggattctgacgattcatccgactcgtcttcagattcctcatcttcitcagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaa
PL 201 425 B1 gaagaacagtgaagagagttccaaaaagaaggaaaaagagaatattggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaa gtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacgtcgccaggattctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaa agatcgtcgtcgtcaagactcggatgatgaggatcggaaaggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgac gtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccgtgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcaigactctg atgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagtgaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgngaatm caaattttaaatactgaatatttgttmtttcctattatttattttttctctttgtgttttttitcttgctttctaaaaaattaattcaatccaaatctaaacatgagcggtt ttttttctctttccgtctcccaattcgtattccgctcctctcatctgaacacaatgtgcaagtttatttatcttctcgctttcatttcattaggacgtggggggaatt ggtggaagggggaaacacacaaaaggatgatggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtrtaa aagaaaacataaaaatautagaggaggaaggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaattgtcctcgcttggcaaatg cgaatccgtatggagaggcacgtnggcgaaggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaattttUagttgaaatttggtgttgctctttlacaaaanTt ccgattttcgcttgaaattacggtgccaggtctcgacacgtcnccaatttttcaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagttgctaattictcgttttiga aaattracttccgtttaatcgaaatRgatgtarrttaKtatgattncaataaatttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagttatcęa atccttaaaggcgcacacctntaaatgtccgccccaatacgatattrttttaagancgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccct atagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccc cttcgccagctggcgtaatagcgaagaggęccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgugcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcg gcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgcccugcgcccgctcctttcgctttcncccttcctttc:
cgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgat tagggtgatggrtcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtnttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaact ggaacaacactcaaccctatctcggtctanctmgarttataagggattttgccgatttcggcctattggnaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaa cgcgaattttaacaaaatattaacgmacaatttcaggtggcactntcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgntattntctaaatacancaaatat gtatccgctcatgagacaataacccrgataaatgcttcaataatangaaaaaggaagagtatgagtancaacatnccgtgtcgcecttattccctnTRg cggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgga tctcaacagcggtaagatccttgagagnttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttnaaagttctgctatgtggcgcggtanatcccgtan gacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggngagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcat gacagtaagagaattatgcagtgctgccataagcatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaacc gctrtnncacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgat gcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcncccggcaacaattaatagactggatggaggcggata aagngcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggmattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggiatcattgcag cactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagat aggtgcctcactgatuagcangguactgtcagaccaagtttactcatautactttagattgattuaaacttcatttnaatnaaaaggatctaggtgaa gatcctrtttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcngagatcc tttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggt aactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacct cgctctgctaatcctgnaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagc ggtcgggctgaacggggggncgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcangagaaag cgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggg aacgcctggtatctttaragtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacg ccagcaacgcggcctttttacggttcctggccmtgctggccnngctcacatgttctncctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcct ttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgc ctctccccgcgcgnggccgattcartaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttt cctcactcattaggcaccccaggetnacactttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatncacacaggaaacagctatg accatgatlacgccaagctcggaattaaccctcacuaagggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcnccgctctgaaaaacgaaagt ggaccmgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaattgagctttttgggtcgaaaaaaatgtttttagaatgctgagaacacgttaaacacgaag atcatatttatttTgagacccggatgctctgaaaatgtctgacatagarttaaaaaagcatatatatartntcattttcaacgtgaaagttttgtgcaactttata gaatctcctanggcacattgtnmamaactgaggcagttmgaacacctttttgaaactttgaatctctttgaagtatactgtcgaaaagactgacttga gcgttcgaaatgccagaagaaaactatatttgaatctcgcgcuaattgagaaatgcaaccgcgctccactggacaattggaaaaaaaaraattcgga ggcgacaacggtattttcgaaattgaKnctgtgtannctcattttttataaancttctttgatttatcgncgtttgtgagaaantaattgtattcaaactmn atagtaagata
PL 201 425 B1 pGN207;
Sekw. Id. Nr 11 ecgStggtaccgctagccgtacgaacccgggttctagaactagtggatcccacrtgagatcaacatgatcagaatcccaateagRggctctggacga cctggtctatctggacgaicaaatggatttttagccaaaatatcggtttcagtttccaatggatcagaaggtccttcgcigttgacagccngacacggaa crtgtaatgałctccctigttgagtgaatcgactgtgaagtgggtatctccac£acgtccacatggaacccagattccgtccnggtgttcatcnttcaattt catagaactcaattggetctcctccgtcatcctctggtggtttccagtcaagagngcacgatctKgaagacatcagnacctcgattggtccctttggttt cgttggcttgctttttaccttgatattgatagtgacactgtcagttccattaatgttggrtgcagtgaiggtatattttccactttgcttacgaagtgccmggca aagcaaatctcgagatgtatggctcamtcaatitgagcctrgcrctctccgaHccttttccaEtgaatgaccatgttacatctggtgctggcKaccatca atatgaacaatgaacagagagtggctccgaccRgacagngtatcagaaagatęttcacgatgaaRcRggagcaaggRtcnggcRcgcaacaac acgatcagaaggatcagaaggatctccagttccagccRgRacgagcagaaafictgaaRgatattciictccctccRaagaRtggaacagttgctgt tttctgatctcctggaacaacgagagcttcttcccatcgtccattetutccttcttttcaatgacgaaagcttatcgataccgicgacctcgagggggggę cctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggttigatmc!
ttctggtcaaaaagatgaaattattgattttcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtctgcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcg ggaagtgagccaagaggtatgtttttcaaaaatcaataactgarcataantttattgmggtgaatttaagaaaataatattcgaaaattcctctgaattatc aagattgcagtattaatttcgagaaaaattgagatattcatagagctartgtaaattttcttgatttcagactgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaaa gaaaaggatgacggggatgaccagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttcaccagctccaaaaaggtccaaggagaccaggt ttgtcaaaagcttcctgcganaattclcatttcaatttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggttcgttcaagatctcccagaaggtcttcag cacgttccccgtcacgaictcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccgaagagccagcaccgctaccagagaaaaagaa gaaagagccgctggataRctacgaacaagaaccggaggagcatatattccacccgccaaacncgacttatgcaacaacagaRagtgataagcaa agtgaacagtatcagagaatgaangggaaagaacgaagaaaaagattcacgganggttaacagagtcaacgcgaagaauttgttcaaangtcag agaacttcttcaagagaatgtgattcgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaaRaatttaatttttcaggggacttctctgccgtgac attancaagctcaggctttctcaccaggartctctaacgtctatgcagctttggcggcagttatcaactcgaaattccctcatgtcggtgaacttcttctcc gtcgtctgattgtacagncaaaagaagntecgUgaaaCgacagaggcgtcacggtgaacgtgatcaaattcatcgcacarttganaatcaacaagti gctcacgaagRcRgcgciggaaatcatgattctgatgcngaagaaccaactgatgartcagRgaagtcgccaRgcgRcctgaaagagtgtggag caaagcttctggagattgctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcglgcaattctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcg acgtattcagtatatgattgagactgcaatgcagaticgaaaggacaaatttgcggtaaggtagaatatataaatagtttattagaaaaaaataaattaga ataarttaaancctactagccaatcaggcgacctttttgcgcatagttctattattgaaaaatttggagaatrtctcatancKgctcggaaatctggaaKc gacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgctttgtgctccctttctcgcttgtcttctgtgtacaccaagaaccttgttgagttcatcaactgaatctgt gaciggcttgttgctcactggatgcacugacgactgattctcgagaaatcagangagttgcgattagggtgacctagaaangggaataatacgaact tngiaaatattcaggaggattaaaaaaattactctcgacaatectacaaaRtacttattgcaccatgttgctccaacatttttcattaaaagttaatgaaaaa atgtagaaaatcggaaattggcaattttcagaccatttttaagcattttcaaaaaaaaangcagctgaaataaatgtcaniicagataaaccgagcgatttt cigngtctgacactagtttitagtttaaaaaatgttggaagaacatggigcaataggtaatncatagaatttccatgtgtuttatcaatuaccaattatcc aaatcttccaaactcacamtgeggagctgggctatcaagaatctgctgcagtffialaagacgagcatctctgatatcactgaaaattaatttttaatcaa aacttgaatalcaactaaacccacttattaacRtctcgatcttctgtcgttcggtacgaigacggtgaagaagccaaflgagtagngatnggticaagtc cntcggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctatttagttataacnaggcetaagattcaatttaatgaagtgatuaatngKctctgaacctcttaagat gatcttttggat&gaaacatataagacaggtttacctatctattaaaaaacagatcaaaatagatacgaccaaatcggataatccatgcctacctggcat ctaggaacgtgttcttagaagatncnacgtaa£cgtatgaagaaataacaatngalcgttggccagcaaaaatagggRttaagtgggatagtgtttttat tagctaaccggaaaattttatagtttttnngcaagaaaccactgaaaaccccctaattgtatacamtttggagcagcttctggtctttttgagcaataaaat tcgaGaaacagaatttaagtgtaaattgttcacatttagtttctatttiatcaaattttgttgctcaaaaacaticgaagctgetctaaaaaaatgcattaaaaa aggggnucagtggtttttcacattaaaaaagctaattttaactaaaaatccatcatartKcaactttgtcacaacaataaaatgctggtcaaaatgtgttcg aaaaaatgtttttttttttaanmataatttaaaaatagttttctttcgetgggacacatacatttttgggcgtaaattttcagtttaaamccatttttacaaccat aatcataaagctacgtctgatcictętcgcacttacctgcgcctgartcgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagngt ggtagtggacgttcatcacgcaatactgaccaatagtcgtggggtctcacRtccgtactaRgagagagggzagactgaagatggcaaRgaggaca gtgtcRcgacgcacgcatgćatccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcRgRtctaagcccctcccRtgtaatacatacacatttct aataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgttgctgtagttgccaaggcatcatcgatgaaataactgaaagaaagaattaaataattattgc aggcgtacccggcggtcangaagacnggacttgattgaggaggaggatcagatcatccatacacttaatttggaggatgcggttgatceggaaaatg ggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcattaatttaataaattgaaRccatttcagatgtgRcaaactagatccagaattcgaaaagaacga ggaggtttatgaggagatccgtaaggaaatcanggaaacgccgautttcggatgaggatggtggcgacgagttggaigatgaagaagagggtagt gatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattattgataaGctgatcagaatTgactgctncagaagg&ttcattngagttttgggccggcaa atctgtaagttgccggtlgccgaaaattigctgaatttgccggaaaaaaaaattccggaatttatttaaaaactrtttgtaaaaattaaattaaimgcaactt
RcagagaagtctacctgacaatgcaatcatcRtggactaccaagaagctgctcacaaaRgctgaaaatgaagaRccagacagcatgcaggtcagc gatgttgcaaagaaaaattttcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaacEccgtttnttctttttttttaiacgagaaaaacęaaaaaa atgtatttttgccaaattctaaaataetacccecgaaattttcaatattttctcntcagaacgaactctgcgcgatgengtcgattgttgtgctcaacagcgta cctacgagcgaactacggaaigctcatcgaacgRtctgccgacttcgcctcgaataccagcaatacRigaaaagcKtgccaggacacgtaaccac gaRcaccgaaRgacatcacaaaactgcggaatHggctcgccRattgctcatRgctctcgacggatgctattgactggaagattRggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacRCRCtggcagaatctatattaaatacauntaatgaacttgtggaggcgatgggaatggttaaacttcattcgagag
RactgatccgtgagntcctagagagagRgRttcgCattcaattRccctantKagaactnggctcaRgctttgRgganaRcccacgaaętaatccg aacagcgcacgaRttcgatcaacttcRcacaatgaKggattgggtggRtgacgttggaacRcgtgaatggctggcaaagggtctcaagaagaaga agggaatgctggatcagRgaaggccgaatcaagctcagaRcatcgtcgtcRcggaRcgtcagactcgtctgaRcttcggattctgacgattcatcc gactcgtcRcagaRcctcatcncRcagaaccagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagRccaaaaagaag
PL 201 425 B1 gaaaaagagaatattggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaagtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacg tcgccaggatictgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagactcggatgatgagg atcggaaaggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctgatgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgagaattRcaaattttaaatactgaatatttgtttntttcctati atttatttattctctttgtgtmttncngctttGtaaaaaattaattcaatccaaatctaaacatgagcggtmttttctctttccgtcteccaattcgtattccgct cctcteatctgaacacaatgtgcaagKtatttatcKctcgctncatttcattaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacacacaaaaggatg atggaaatgaaataaggacaeacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaaaagaaaacataaaaatatatagaggaggaa ggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaattgtcctcgcttggcaaatgcgaatccgtatggagaggcacgtttggcga aggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttttaagrtgaaatrtggtgrtgctcttttacaaaattttccgattttcgcttgaaattacggtgccaggtct cgacacgtcnccaatttttcaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagttgctaatttetcgtttttgaaaatttttcttccgtttaatcgaaałttgatgtattt tattUtzattncaaiaaamcaaazaaacizetzaaaacicaaaaaaKstBaactacafftaatccaatecttaaaoo^arai-arcttttaaaffftfCCTc ~ w WW w w W GF - 451--...........
cccaatacgatatttttttaagattcgctagagcggccgccaecgcggtggagctccaattegccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgt tttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttaeccaacttaatcgccngcagcacatcccccettcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagccigaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgc gcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttccntctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctcta aatcgggggctccctttagggticcgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacngattagggtgatggncacgtagtgggccatcgccct gatagacggtttttcgccctngacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgKccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattctitt gattta taagggatmgccgatncggccattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaattiaacgcgaat«taacaaaaUttaacgtttacaantca ggjggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgc ttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttntgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaac gctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcc ccgaagaacgttttccaatgatgagcacOttaaagTtctgctatgtggcgcggtanatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat acactattctcazaatzacttzzttzazactcacc3Ztcaca2aaaazcatcttaczzatzecatzacastaasazaattatzca!nzctBceataap w w w w w w w w W * 90 MW W * * O * * 9'G>-------9 ~ catgagtgataacactgcggccaacrtacttctgacaacgaicggaggaccgaaggagctaaccgctttttttcacaacatgggggatcatgtaactcg ccttgatcgngggaaccggagcTgaaEgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact attaactggcgaactactuctctagcncccggcaacaattaaugactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttcc ggctggctggtttattgctgataaatctggagccggigagcgtgggtctcgcggtaEcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgc agttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcag accaagtttactcatatatacatagattgatnaaaacttcatttnaatnaaaaggatctaggtgaagatcctmtgataarctcatgaccaaaatcccttaa cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttmtctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa aaaccaccgcUccagcggtggrngTttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggmctggcacagcagagcgcagataccaaatact gtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccag tggcgataagtcgtgtcttaccgggrEggactcaagacgatagnaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcc cagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacagg tatecpfftaapcffocafftffftcffffaacaffffacrapeffcaepaffasyafrcttrraauaatfCFaaetfcetfffftatefttafafftrcfiytriFaattftOfrar -------- σσ o-ga—oaa~aa ~aa~o~Q~i3’~-o-oao~a—'—οσοοοβ' β οσ — ctctgacngagcgtcgatmtgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccTOtacggttcctggccttttgct ggcctmgctcacatgnctncctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacga ccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctg geacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaatuatgtgagttacctcactcattaggcaccccaggcmacactnatgct iccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaa agggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagtggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatga aattgagcttrtrgggtcgaaaaaaatgtttttagaatgctgagaacacgnaaacacgaagatcatatttattttgagacccggatgctctgaaaatgtctg acatagatttaaaaaagcafatatatarttttcattttcaacgtgaaagttttgtgcaactttatagaatctcctattggeacattgttmuttuactgaggcag tttttgaacacctmtgaaaęmgaatctctttgaagtatactgtcgaaaagactgacttgagcgttcgaaatgccagaagaaaactatamgaatctcgc gctaaangagaaatgcaaccgcgctccactggacaattggaaaaaaaatttattcggaggcgacaacggtattttcgaaattgattttctgtgtattttct catttmataaancttcmgantatcgtrcgtttgtgagaaattuattgtaKcaaacttttnatagtaagata
PL 201 425 B1

Claims (13)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami, znamienny tym, że
    a) identyfikuje się sekwencję DNA ze wspomnianego nicienia;
    b) klonuje się wspomnianą sekwencję z etapu a) lub jej fragment w odpowiednim wektorze w takiej orientacji względem promotora(rów), że wspomniany promotor(y) zdolny jest do inicjacji transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego ze wspomnianym promotorem(ami) i
    c) wprowadza się wspomniany wektor do rośliny.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e wspomniany nicień żeruje na tej roślinie.
  3. 3. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e wspomniany nicień obejmuje dowolnego z Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchulus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Macobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmaniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchs ssp.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się pomiędzy dwoma promotorami tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorami wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się w orientacji sensownej i antysensownej względem wspomnianego promotora tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jako promotor(y) stosuje się promotor(y) tkankowo-specyficzny.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, ż e jako promotor(y) stosuje się promotor(y) specyficzny dla korzeni.
  8. 8. Sposób wedł ug zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, ż e stosuje się go do ł agodzenia zakażenia roślin pasożytniczymi nicieniami.
  9. 9. Zastosowanie sekwencji DNA z nicienia bę dą cego szkodnikiem roś linnym, przy czym sekwencja DNA lub jej fragment jest klonowana w odpowiednim wektorze w takiej orientacji względem promotora(rów), że wspomniany promotor(y) zdolny jest do inicjacji transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego z promotorem(ami), do łagodzenia zakażenia roślin nicieniami.
  10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że wspomniana sekwencja DNA dostarczona jest pomiędzy dwoma promotorami tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorami wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
  11. 11. Zastosowanie według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że wspomniana sekwencja DNA dostarczona jest w orientacji sensownej i antysensownej względem wspomnianego promotora tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
  12. 12. Zastosowanie według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że jako promotor(y) stosuje się promotor(y) tkankowo-specyficzny.
  13. 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że jako promotor(y) stosuje się promotor(y) specyficzny dla korzeni.
PL347978A 1998-07-03 1999-07-02 Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia PL201425B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9814536.0A GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-07-03 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GBGB9827152.1A GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1998-12-09 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL347978A1 PL347978A1 (en) 2002-05-06
PL201425B1 true PL201425B1 (pl) 2009-04-30

Family

ID=26313977

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384205A PL213379B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym
PL390495A PL216779B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu
PL347978A PL201425B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384205A PL213379B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym
PL390495A PL216779B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu

Country Status (27)

Country Link
US (3) US20030061626A1 (pl)
EP (5) EP2045336A3 (pl)
JP (3) JP4353639B2 (pl)
KR (4) KR20070041607A (pl)
CN (3) CN1900319A (pl)
AT (2) ATE419383T1 (pl)
AU (1) AU769223B2 (pl)
BR (1) BR9911802A (pl)
CA (2) CA2332619C (pl)
CY (2) CY1108920T1 (pl)
CZ (2) CZ303494B6 (pl)
DE (5) DE1093526T1 (pl)
DK (2) DK1484415T3 (pl)
ES (2) ES2320527T5 (pl)
GB (4) GB9827152D0 (pl)
HU (1) HU230602B1 (pl)
IL (3) IL140467A0 (pl)
IN (2) IN2001DE00006A (pl)
IS (1) IS2816B (pl)
MX (1) MX234065B (pl)
NO (1) NO327729B1 (pl)
NZ (1) NZ509182A (pl)
PL (3) PL213379B1 (pl)
PT (2) PT1484415E (pl)
RU (1) RU2240349C2 (pl)
WO (1) WO2000001846A2 (pl)
ZA (1) ZA200007653B (pl)

Families Citing this family (257)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CA2513336A1 (en) 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd. Control of gene expression in a non-human eukaryotic cell, tissue or organ
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AU776150B2 (en) * 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
KR20070118315A (ko) * 1999-04-21 2007-12-14 와이어쓰 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 조성물
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US6924109B2 (en) * 1999-07-30 2005-08-02 Agy Therapeutics, Inc. High-throughput transcriptome and functional validation analysis
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
HK1047109A1 (zh) 1999-10-15 2003-02-07 University Of Massachusetts 作为指定基因干预工具的rna干预轨迹基因
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
GB9930691D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
JP2003526367A (ja) 2000-03-16 2003-09-09 ジェネティカ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の方法とｒｎａ干渉組成物
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
KR101215789B1 (ko) 2000-03-30 2012-12-26 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체
GB0012233D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Vector constructs
US7083947B2 (en) 2000-05-19 2006-08-01 Devgen Nv Assay techniques using nematode worms
GB2362383B (en) * 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
GB0012229D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Lipid uptake assays
WO2001096584A2 (en) * 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
SI1407044T2 (en) 2000-12-01 2018-03-30 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Rna interference mediating small rna molecules
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
ATE455863T1 (de) * 2001-01-25 2010-02-15 Virxsys Corp Methoden und zusammensetzungen zur identifikation von gen-funktion
WO2002059294A1 (en) 2001-01-26 2002-08-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research O Rganisation Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
CA2369944A1 (en) 2001-01-31 2002-07-31 Nucleonics Inc. Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
WO2002063037A2 (en) * 2001-02-02 2002-08-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for identifying functional nucleic acids
US7517864B2 (en) 2001-05-18 2009-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070887A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
EP3231445A1 (en) 2001-05-18 2017-10-18 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
ES2566561T3 (es) 2001-07-12 2016-04-13 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN pequeños de interferencia que median el silenciamiento génico
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
DE60236095D1 (de) 2001-08-31 2010-06-02 Riken Wako PFLANZENSYSTEM ZUR UMFASSENDEN GENFUNKTIONSANALYSE UNTER VERWENDUNG EINER VOLLÄNGEN-cDNA
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US20030150017A1 (en) * 2001-11-07 2003-08-07 Mesa Jose Ramon Botella Method for facilitating pathogen resistance
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
ATE443133T1 (de) 2002-02-01 2009-10-15 Life Technologies Corp Oligonukleotidzusammensetzungen mit verbesserter effizienz
WO2003064621A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
AU2003219833A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003070966A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc INTERFERENCE MEDIATION INHIBITION OF GENE RNA FROM MAP KINASE
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003216255A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
AU2003213057A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Incoporated Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003228667A1 (en) * 2002-04-22 2003-12-19 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
WO2003095652A2 (de) * 2002-05-08 2003-11-20 Xantos Biomedicine Ag EXPRESSIONSKONSTRUKTE ZUR HERSTELLUNG VON DOPPELSTRANG (ds) RNA UND DEREN ANWENDUNG
WO2003100094A2 (en) * 2002-05-23 2003-12-04 Devgen Nv Method for determining the influence of a compound on cholesterol transport
US20100009856A1 (en) * 2002-06-21 2010-01-14 Sinogenomax Sompany LTD. Randomized dna libraries and double-stranded rna libraries, use and method of production thereof
WO2004005485A2 (en) * 2002-07-10 2004-01-15 Kansas State University Research Foundation Compositions and methods for controlling parasitic nematodes
US7655790B2 (en) 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
KR101201664B1 (ko) 2002-08-05 2012-11-15 사일런스 테라퓨틱스 아게 신규한 형태의 간섭 ｒｎａ 분자
WO2004014933A1 (en) 2002-08-07 2004-02-19 University Of Massachusetts Compositions for rna interference and methods of use thereof
WO2004022782A2 (en) * 2002-09-04 2004-03-18 Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Compositions and methods for tissue specific or inducible inhibition of gene expression
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2507189C (en) 2002-11-27 2018-06-12 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
WO2004056982A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-08 Devgen Nv Kinase sequences
EP1622572B1 (en) 2003-04-30 2017-12-20 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
IL155783A (en) 2003-05-05 2010-11-30 Technion Res & Dev Foundation Multicellular systems of multi-potential embryonic human stem cells and cancer cells and their use
US7619068B2 (en) 2003-05-09 2009-11-17 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
EP1644494A2 (en) * 2003-06-17 2006-04-12 Devgen NV Alcohol dehydrogenase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases
US9394565B2 (en) 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
ES2374529T3 (es) * 2003-11-17 2012-02-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Resistencia a insectos usando inhibición de la expresión génica.
EP2395112B1 (en) 2003-12-31 2017-02-15 The Penn State Research Foundation Methods for predicting and overcoming resistance to chemotherapy in ovarian cancer and for predicting colon cancer occurrence
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
WO2005078848A2 (en) 2004-02-11 2005-08-25 University Of Tennessee Research Foundation Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase dnazymes
US7622301B2 (en) * 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
WO2006074418A2 (en) 2005-01-07 2006-07-13 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
CN101233240A (zh) 2004-03-26 2008-07-30 斯昆诺有限公司 与质量分析结合的甲基化特异性扩增产物的碱基特异性切割
CA2562038C (en) 2004-04-02 2017-04-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with .alpha.v.beta.5 integrin
AR048685A1 (es) 2004-04-09 2006-05-17 Monsanto Technology Llc Metodos para el control de infestaciones de insectos en plantas.
WO2005105157A2 (en) 2004-04-23 2005-11-10 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York INHIBITION OF HAIRLESS PROTEIN mRNA
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2006009575A1 (en) 2004-06-22 2006-01-26 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois METHODS OF INHIBITING TUMOR CELL PROLIFERATION WITH FOXM1 siRNA
US7968762B2 (en) 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
US20100132058A1 (en) 2004-07-23 2010-05-27 Diatchenko Luda B Methods and materials for determining pain sensitivity and predicting and treating related disorders
ATE518954T1 (de) 2004-08-18 2011-08-15 Lorus Therapeutics Inc Kleine interferierende rna-moleküle gegen ribonukleotidreduktase und ihre verwendungen
US7713735B2 (en) * 2004-09-24 2010-05-11 J.R. Simplot Company Gene silencing
US20060247197A1 (en) 2004-10-04 2006-11-02 Van De Craen Marc Method for down-regulating gene expression in fungi
MX2007004310A (es) * 2004-10-13 2007-06-18 Univ Georgia Res Found Plantas transgenicas resistentes a nematodos.
ES2444001T3 (es) 2004-10-21 2014-02-21 Venganza Inc. Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas
US8772254B2 (en) 2004-10-25 2014-07-08 Devgen N.V. Method and constructs for delivering double stranded RNA to pest organisms
EP2330203A3 (en) 2004-10-25 2011-10-05 Devgen NV Rna constructs
US8519225B2 (en) 2006-02-10 2013-08-27 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
EP1866414B9 (en) 2005-03-31 2012-10-03 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
CA2605508A1 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Blockade of pin1 prevents cytokine production by activated immune cells
EP1907546A2 (en) 2005-05-31 2008-04-09 Devgen N.V. Rnai for control of insects and arachnids
US8703769B2 (en) 2005-07-15 2014-04-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of EGFR inhibitors to prevent or treat obesity
ES2557512T3 (es) 2005-09-16 2016-01-26 Devgen N.V. Métodos basados en plantas transgénicas para plagas de plantas usando ARNi
ES2568933T3 (es) 2005-09-16 2016-05-05 Devgen N.V. ARNbc como agente de control de insectos
PL2431473T3 (pl) 2005-09-16 2017-05-31 Monsanto Technology Llc Sposoby genetycznej kontroli inwazji owadów u roślin i kompozycje do tego przeznaczone
US9708619B2 (en) 2005-09-20 2017-07-18 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-siRNA
US9286469B2 (en) * 2005-12-16 2016-03-15 Cisco Technology, Inc. Methods and apparatus providing computer and network security utilizing probabilistic signature generation
EP1974041A2 (en) 2006-01-06 2008-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cyst nematode resistant transgenic plants
US8906876B2 (en) 2006-01-12 2014-12-09 Devgen Nv Methods for controlling pests using RNAi
EP2347759B1 (en) 2006-01-12 2017-10-18 deVGen N.V. Methods for controlling pests using RNAi
EP2377939A3 (en) 2006-01-12 2012-01-18 deVGen N.V. Transgenic plant-based methods for plant pests using RNAi
US20080022423A1 (en) * 2006-02-03 2008-01-24 Monsanto Technology Llc IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI
CN105385679B (zh) * 2006-02-13 2020-05-26 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
US20100068172A1 (en) * 2006-03-16 2010-03-18 Devgen N.V. Nematode Control
WO2007123777A2 (en) 2006-03-30 2007-11-01 Duke University Inhibition of hif-1 activation for anti-tumor and anti-inflammatory responses
PL216037B1 (pl) * 2006-06-09 2014-02-28 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu
CN103275980B (zh) 2006-07-11 2015-09-09 罗格斯新泽西州立大学 抗体、融合蛋白以及组合物
US7666423B2 (en) 2006-07-28 2010-02-23 Children's Memorial Hospital Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells
CA2670696A1 (en) 2006-11-27 2008-06-05 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
CN101195821A (zh) * 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
WO2008094370A2 (en) 2006-12-22 2008-08-07 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
CA2676143A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
US20080184391A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Kuppuswamy Subramaniam Pathogen resistant transgenic plants, associated nucleic acids and techniques involving the same
EP2115141A4 (en) 2007-02-20 2010-08-04 Monsanto Technology Llc miRNA FROM INVERTEBRATES
BRPI0809130A8 (pt) 2007-03-21 2021-11-03 Brookhaven Science Ass Llc Composições combinadas hairpin-antissenso e métodos para modulação da expressão
EP2377952A1 (en) 2007-04-26 2011-10-19 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for diagnosing and treating astrocytomas
WO2008137115A1 (en) 2007-05-03 2008-11-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
US20110111481A1 (en) * 2007-06-29 2011-05-12 Chiang Li ENABLING THE USE OF LONG dsRNA FOR GENE TARGETING IN MAMMALIAN AND OTHER SELECTED ANIMAL CELLS
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2009012263A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
ES2651911T3 (es) 2007-08-14 2018-01-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Métodos mejorados de silenciamiento génico
KR101142209B1 (ko) 2007-09-22 2012-05-04 재단법인서울대학교산학협력재단 섭취 ＲＮＡｉ를 이용한 꼬마선충에서 두 유전자의동시발현 억제방법
US7968525B1 (en) 2007-12-03 2011-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control
JP2011516065A (ja) 2008-04-04 2011-05-26 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｅｐａｓ１阻害剤の組成物および使用
WO2009126896A2 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for root knot nematode control
GB0807018D0 (en) 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
US9289475B2 (en) 2008-11-06 2016-03-22 The Johns Hopkins University Treatment of chronic inflammatory respiratory disorders
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
DK2379722T3 (da) 2008-12-16 2017-01-02 C-Lecta Gmbh Ekspressionsvektor
WO2010074783A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
EP2379076B1 (en) 2008-12-23 2014-11-12 The Trustees of Columbia University in the City of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
WO2010107952A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR (CTGF) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EA201171144A1 (ru) 2009-03-19 2012-04-30 Мерк Шарп Энд Домэ Корп. ОПОСРЕДОВАННОЕ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЕЙ ИНГИБИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ГОМОЛОГА 1 BTB И CNC, ОСНОВНОГО ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ С ЛЕЙЦИНОВОЙ МОЛНИЕЙ 1 (Bach1) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАЛОЙ ИНТЕРФЕРИРУЮЩЕЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (миНК)
US20120029054A1 (en) 2009-03-19 2012-02-02 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of GATA Binding Protein 3 (GATA3) Gene Expression Using Short Intefering Nucleic Acid (siNA)
US20120035247A1 (en) 2009-03-19 2012-02-09 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP2411520A2 (en) 2009-03-27 2012-02-01 Merck Sharp&Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF THE THYMIC STROMAL LYMPHOPOIETIN (TSLP) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2010111468A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF THE NERVE GROWTH FACTOR BETA CHAIN (NGFß) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA)
US20120022142A1 (en) 2009-03-27 2012-01-26 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Signal Transducer and Activator of Transcription 1 (STAT1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
AU2010229847A1 (en) 2009-03-27 2011-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2010111464A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF APOPTOSIS SIGNAL-REGULATING KINASE 1 (ASK1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20100257634A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Venganza Inc. Bioassay for gene silencing constructs
US8283332B2 (en) 2009-04-17 2012-10-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PFKFB4 inhibitors and methods of using the same
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
HUE026708T2 (en) 2009-07-14 2016-07-28 Mayo Foundation Peptide-mediated, non-covalent delivery of active substances in blood glucose
CN102481347A (zh) 2009-07-24 2012-05-30 加州大学董事会 治疗和预防整合素αvβ5相关疾病的方法及组合物
MX2012002548A (es) 2009-08-28 2012-04-10 Du Pont Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos.
EP2509628B1 (en) 2009-12-07 2017-10-25 The Johns Hopkins University Sr-bi as a predictor of human female infertility and responsiveness to treatment
ES2562499T3 (es) 2009-12-09 2016-03-04 Nitto Denko Corporation Modulación de la expresión de HSP47
JP6093180B2 (ja) 2009-12-10 2017-03-08 トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性化剤及びその使用
US10640457B2 (en) 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
BR112012014760A2 (pt) 2009-12-18 2016-06-14 Novartis Ag "composições orgânicas para tratar doenças relacionadas a hsf1, bem como seu uso"
SG10201407996PA (en) 2009-12-23 2015-01-29 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
WO2011094345A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 National Jewish Health Methods and compositions for risk prediction, diagnosis, prognosis, and treatment of pulmonary disorders
IN2012DN06588A (pl) 2010-02-10 2015-10-23 Novartis Ag
EP3190187A1 (en) 2010-05-21 2017-07-12 Peptimed, Inc. Reagents and methods for treating cancer
GB201009601D0 (en) 2010-06-08 2010-07-21 Devgen Private Ltd Method for down-grading gene expression in fungi
US9168297B2 (en) 2010-06-23 2015-10-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (NRG-1)
US8518907B2 (en) 2010-08-02 2013-08-27 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of catenin (cadherin-associated protein), beta 1 (CTNNB1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP3587574B1 (en) 2010-08-17 2022-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
US9243246B2 (en) 2010-08-24 2016-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. Single-stranded RNAi agents containing an internal, non-nucleic acid spacer
US9233997B2 (en) 2010-08-26 2016-01-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of prolyl hydroxylase domain 2 (PHD2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
BR112013009196A2 (pt) 2010-10-15 2020-08-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York usos de polipeptídeo para redução da aquisição de ácido graxo e da ingestão de alimento, bem como para promoção de saciedade relacionados à obesidade
DK2632472T3 (en) 2010-10-29 2018-03-19 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA)
WO2012061443A2 (en) 2010-11-01 2012-05-10 NanoOncology, Inc. Compositions of a peptide-based system for cell-specific targeting
US9198911B2 (en) 2010-11-02 2015-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
KR101913293B1 (ko) 2010-11-02 2018-10-30 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 탈모 질환의 치료 방법
US9150926B2 (en) 2010-12-06 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483
WO2012078536A2 (en) 2010-12-06 2012-06-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
US9969677B2 (en) 2010-12-22 2018-05-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase modulators and uses thereof
US9205100B2 (en) 2011-03-03 2015-12-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
EP2750767A4 (en) 2011-09-02 2015-10-14 Univ Columbia CAMKII, IP3R, CALCINEURIN, P38 AND MK2 / 3 INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF METABOLISM DISORDER IN CONNECTION WITH ADIPOSITAS
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
CN108373506A (zh) 2011-10-14 2018-08-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗HtrA1抗体及使用方法
EP3597644B1 (en) 2011-10-18 2021-09-29 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Amine cationic lipids and uses thereof
AU2012332517B9 (en) 2011-11-03 2017-08-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
ES2694681T3 (es) 2012-03-29 2018-12-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Métodos para tratar trastornos de pérdida capilar
CN104395474A (zh) 2012-04-20 2015-03-04 富优基尼以色列股份有限公司 青铜蝽防治剂
US20150082490A1 (en) 2012-04-23 2015-03-19 Futuragene Israel Ltd. Glycaspis Brimblecombei Control Agents
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
ES2817897T3 (es) 2012-07-23 2021-04-08 La Jolla Inst Allergy & Immunology PTPRS y proteoglicanos en enfermedad autoinmune
CN104903449A (zh) 2012-10-03 2015-09-09 富优基尼以色列股份有限公司 瘿蜂防治剂
CA2886120A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 St. Jude Children's Research Hospital Therapies based on control of regulatory t cell stability and function via a neuropilin-1:semaphorin axis
US9920316B2 (en) 2013-03-14 2018-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
AU2014236947A1 (en) 2013-03-15 2015-09-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
KR20160027971A (ko) 2013-07-03 2016-03-10 시티 오브 호프 항암 병용제
WO2015054451A1 (en) 2013-10-09 2015-04-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Detection of hepatitis delta virus (hdv) for the diagnosis and treatment of sjögren's syndrome and lymphoma
WO2015070158A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Sirna Therapeutics, Inc. Systemic delivery of myostatin short interfering nucleic acids (sina) conjugated to a lipophilic moiety
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
EP3088001B1 (en) 2013-12-27 2020-02-12 National University Corporation Kochi University Anti-lipolysis stimulated liporotein receptor antibodies for treatment of ovarian cancer
JP6778175B2 (ja) 2014-07-16 2020-10-28 ノバルティス アーゲー 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
WO2016059187A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Universite De Strasbourg Method of capturing and identifying novel rnas
AU2015346281B2 (en) 2014-11-12 2021-12-02 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
EP3925979A3 (en) 2014-12-23 2022-03-23 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fgfr-tacc fusion proteins and methods thereof
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
US10584144B2 (en) 2015-03-09 2020-03-10 University Of Kentucky Research Foundation RNA nanoparticles for brain tumor treatment
US11085044B2 (en) 2015-03-09 2021-08-10 University Of Kentucky Research Foundation miRNA for treatment of breast cancer
WO2016145003A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Rna nanoparticle for treatment of gastric cancer
US11279768B1 (en) 2015-04-03 2022-03-22 Precision Biologics, Inc. Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof
WO2016168784A2 (en) 2015-04-17 2016-10-20 University Of Kentucky Research Foundation Rna nanoparticles and method of use thereof
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
EP3313420B1 (en) 2015-06-25 2024-03-13 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
US10072065B2 (en) 2015-08-24 2018-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of immunoglobulins across the blood-brain barrier
EP3702470A3 (en) 2015-09-09 2020-10-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
US10857145B2 (en) 2015-09-29 2020-12-08 Duke University Compositions and methods for identifying and treating dystonia disorders
BR112018007703A2 (pt) 2015-10-30 2018-11-06 Genentech Inc anticorpos, ácido nucleico isolado, métodos de produção de um anticorpo e de tratamento de um distúrbio, composição farmacêutica, terapia de combinação e uso do anticorpo
CA3005937C (en) 2015-12-13 2021-11-09 Nitto Denko Corporation Sirna structures for high activity and reduced off target
EP3423568A4 (en) 2016-03-04 2019-11-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. METHOD AND COMPOSITIONS FOR EX-VIVO REPRODUCTION OF VERY SMALL EMBRYONAL STEM CELLS (VSELS)
WO2017161001A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
WO2017173327A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent
US10933081B2 (en) 2016-09-21 2021-03-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Myostatin iRNA compositions and methods of use thereof
CN107858405B (zh) * 2017-10-12 2021-09-24 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法
US20210162007A1 (en) 2018-04-09 2021-06-03 President And Fellows Of Harvard College Modulating nuclear receptors and methods of using same
CN109183158B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法
CN109266677B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法
CN113015746A (zh) 2018-09-19 2021-06-22 拉荷亚免疫研究所 在类风湿性关节炎中的ptprs和蛋白聚糖
JP7667077B2 (ja) 2018-11-16 2025-04-22 日東電工株式会社 Ｒｎａ干渉送達製剤及び悪性腫瘍のための方法
US20220091135A1 (en) * 2019-01-04 2022-03-24 Kyoto University Test method for ulcerative colitis and primary sclerosing cholangitis
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
CN110229839B (zh) * 2019-06-04 2021-06-08 中国农业大学 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法
CN110804088A (zh) * 2019-11-18 2020-02-18 维塔恩(广州)医药有限公司 巨细胞病毒相关抗原短肽及其应用
CN110746497A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 维塔恩(广州)医药有限公司 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
WO2021123920A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
AR120773A1 (es) 2019-12-18 2022-03-16 Novartis Ag Derivados de 3-(5-metoxi-1-oxoisoindolin-2-il)piperidin-2,6-diona como reductor de la actividad de la proteína wiz
EP4087652A1 (en) 2020-01-08 2022-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
US20210222128A1 (en) 2020-01-22 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Inducible tissue constructs and uses thereof
WO2021173965A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Identification of variable influenza residues and uses thereof
CN111560651B (zh) * 2020-05-22 2021-09-07 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种制备双链rna测序文库的方法
WO2022147481A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma Inc. Combination therapy of an oncolytic virus delivering a foreign antigen and an engineered immune cell expressing a chimeric receptor targeting the foreign antigen
EP4359527A2 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Novartis AG Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2023012165A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Universite De Montpellier Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22
CN113533007B (zh) * 2021-08-06 2023-11-24 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 一种抗体染色标记装置及其方法
AU2022366987A1 (en) 2021-10-14 2024-05-16 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems
WO2024059618A2 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
CA3265690A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. COMBINED GENE DISTURBANCES IMMUNE CELLS
WO2024186656A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting psma and ca9
WO2025199338A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting slc34a2 and tmprss4 and methods of use thereof

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589801A (en) * 1897-09-07 woltereck
JPS62502863A (ja) 1985-03-21 1987-11-19 ステフェン・エー・ジョンストン 寄生体由来抵抗性
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
NZ219472A (en) 1986-03-28 1990-08-28 Calgene Inc Regulation of phenotype in plant cells using dsdna constructs
US5017488A (en) * 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
US4970168A (en) * 1989-01-27 1990-11-13 Monsanto Company Virus-resistant plants
EP0473576A4 (en) * 1989-05-19 1993-03-10 Hem Research, Inc. Short therapeutic dsrna of defined structure
HUT57265A (en) 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5837848A (en) * 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
WO1991015111A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 President And Fellows Of Harvard College A binary genetic system to control expression of a transgene in a transgenic animal
US5831011A (en) * 1990-07-27 1998-11-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins
US5459252A (en) * 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
ATE255639T1 (de) 1992-03-20 2003-12-15 Max Planck Gesellschaft Auf fungus reagierendes chimaeres gen
DE4234131C2 (de) * 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
CA2088379A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 University Of British Columbia Biological systems incorporating stress-inducible genes and reporter constructs for environmental biomonitoring and toxicology
IL104830A (en) * 1993-02-23 2001-01-28 Yissum Res Dev Co A chimeric plasmid containing a non-structural gene for the protease of the potato virus and its various uses
DE4317845A1 (de) * 1993-05-28 1994-12-01 Bayer Ag Desoxyribonukleinsäuren
US5482845A (en) * 1993-09-24 1996-01-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for construction of normalized cDNA libraries
EP0770143A4 (en) * 1994-06-15 1999-09-01 Univ Columbia METHOD FOR IDENTIFYING TUMOR SUPPRESSOR GENES
US5691140A (en) * 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
GB9510944D0 (en) * 1995-05-31 1995-07-26 Bogaert Thierry Assays and processes for the identification of compounds which control cell behaviour,the compounds identified and their use in the control of cell behaviour
KR19990022157A (ko) * 1995-06-02 1999-03-25 앰앤드이 바이오테크 아/에스 생물학적으로 활성인 펩티드 및 핵산을 확인하는 방법
US5679551A (en) * 1995-10-31 1997-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Unique double-stranded RNAS associated with the Trichomonas vaginalis virus
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
DK1493817T3 (da) * 1996-08-09 2011-03-28 Keygene Nv Resistens over for planteskadegørere
JP2001503972A (ja) * 1996-09-18 2001-03-27 ユング，クリスチャン 線虫抵抗性遺伝子
JP4073960B2 (ja) 1996-10-03 2008-04-09 肇 加藤 炭化水素の水蒸気改質方法
US6294613B1 (en) 1996-12-18 2001-09-25 Exxonmobil Chemical Patents Inc. Compatibilized polymer blends formed using a multifunctional agent
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
SI1068311T1 (sl) * 1998-04-08 2011-07-29 Commw Scient Ind Res Org Postopki in sredstva za pridobivanje modificiranih fenotipov
AR020078A1 (es) * 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-09-02 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
PL2431473T3 (pl) 2005-09-16 2017-05-31 Monsanto Technology Llc Sposoby genetycznej kontroli inwazji owadów u roślin i kompozycje do tego przeznaczone

Also Published As

Publication number Publication date
EP1197567B1 (en) 2008-12-31
CN1198938C (zh) 2005-04-27
US20030061626A1 (en) 2003-03-27
GB0118514D0 (en) 2001-09-19
HU230602B1 (hu) 2017-02-28
HK1029142A1 (en) 2001-03-23
WO2000001846A3 (en) 2000-06-15
JP2002519072A (ja) 2002-07-02
WO2000001846A2 (en) 2000-01-13
HUP0103571A2 (hu) 2002-01-28
CA2332619C (en) 2012-12-11
IL181727A0 (en) 2007-07-04
IL140467A (en) 2007-07-04
GB2349885A (en) 2000-11-15
ZA200007653B (en) 2002-09-19
CZ200114A3 (en) 2001-06-13
ES2320527T3 (es) 2009-05-25
CN1323354A (zh) 2001-11-21
PT1197567E (pt) 2009-04-09
EP1197567A3 (en) 2003-01-02
CA2789083C (en) 2016-03-15
NO20010019L (no) 2001-03-05
AU4907999A (en) 2000-01-24
EP2045336A3 (en) 2009-06-10
EP2374901A1 (en) 2011-10-12
KR100563295B1 (ko) 2006-03-27
DE69940219D1 (de) 2009-02-12
CA2332619A1 (en) 2000-01-13
DE29924298U1 (de) 2002-09-12
US8114980B2 (en) 2012-02-14
AU769223B2 (en) 2004-01-22
MX234065B (es) 2006-02-01
ATE419383T1 (de) 2009-01-15
GB2362885A (en) 2001-12-05
JP4353639B2 (ja) 2009-10-28
HUP0103571A3 (en) 2006-01-30
DK1197567T3 (da) 2009-05-04
EP1093526A2 (en) 2001-04-25
GB2370275A (en) 2002-06-26
IN2001DE00006A (pl) 2007-02-09
EP1197567A2 (en) 2002-04-17
JP2009112311A (ja) 2009-05-28
EP1197567B2 (en) 2015-10-07
PL216779B1 (pl) 2014-05-30
JP5847776B2 (ja) 2016-01-27
IL140467A0 (en) 2002-02-10
KR20010074639A (ko) 2001-08-04
EP1484415A2 (en) 2004-12-08
IL181727A (en) 2015-08-31
GB0020485D0 (en) 2000-10-11
GB2362885B (en) 2002-07-31
NZ509182A (en) 2004-01-30
GB2349885B (en) 2003-01-29
US20040187170A1 (en) 2004-09-23
CZ304897B6 (cs) 2015-01-07
US20040133943A1 (en) 2004-07-08
IS2816B (is) 2012-11-15
CZ303494B6 (cs) 2012-10-24
NO20010019D0 (no) 2001-01-02
CY1108920T1 (el) 2014-07-02
ES2327334T3 (es) 2009-10-28
MXPA00012955A (es) 2002-04-10
PL347978A1 (en) 2002-05-06
CN1657620A (zh) 2005-08-24
ATE433500T1 (de) 2009-06-15
EP1484415B1 (en) 2009-06-10
DE29924299U1 (de) 2002-09-12
DE69940984D1 (de) 2009-07-23
CY1109324T1 (el) 2014-07-02
EP2045336A2 (en) 2009-04-08
EP1484415A3 (en) 2008-02-13
DE1093526T1 (de) 2001-10-11
NO327729B1 (no) 2009-09-14
KR20070041607A (ko) 2007-04-18
RU2240349C2 (ru) 2004-11-20
KR20060071438A (ko) 2006-06-26
IS5802A (is) 2001-01-02
DK1197567T4 (en) 2015-12-07
IN2006DE03568A (pl) 2007-08-31
JP2014058514A (ja) 2014-04-03
BR9911802A (pt) 2002-01-22
KR20040066200A (ko) 2004-07-23
GB9827152D0 (en) 1999-02-03
PT1484415E (pt) 2009-07-27
GB2370275B (en) 2002-11-27
ES2320527T5 (es) 2015-11-16
GB0206600D0 (en) 2002-05-01
CN1900319A (zh) 2007-01-24
CA2789083A1 (en) 2000-01-13
DK1484415T3 (da) 2009-10-12
PL213379B1 (pl) 2013-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL201425B1 (pl) Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia
Ryder et al. Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila
US20050229272A1 (en) Compositions and methods for gene silencing
Johnson et al. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome
US7005423B1 (en) Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition
AU2004200852B2 (en) Characterisation of gene function using double stranded RNA inhibition
Rich et al. High-efficiency targeted integration of extrachromosomal arrays in C. elegans using PhiC31 integrase
Geurts Sleeping Beauty transposon system-based applications for mouse germline mutagenesis